JP3511027B2 - 植物、真菌および微生物中で直鎖型α−１，４グルカンの合成を促進することができる酵素をコードするＤＮＡ配列 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミロスクラーゼ
（amylosucrase）活性を示すタンパク質を細胞内または
細胞外で発現することができ、ショ糖からの直鎖型α-
1,4グルカンの合成を触媒することができる植物および
微生物を産生するための組換えDNA技術に関する。

【０００２】さらに本発明は、植物ゲノムへ組み込まれ
た後、または微生物（特に細菌または真菌）へ形質転換
された後、ショ糖からの直鎖型α-1,4グルカンの合成を
触媒する酵素を発現するDNAを含有する新しいDNA配列お
よびプラスミド、ならびに上記DNA配列を含有するトラ
ンスジェニック生物（すなわち、植物、真菌および微生
物）に関する。

【０００３】

【従来の技術】直鎖型α-1,4グルカンは、グルコースモ
ノマーから構成される多糖であり、グルコースモノマー
はα-1,4グリコシド結合でのみ互いに結合している。最
も多く存在する天然α-1,4グルカンは、植物デンプンの
一成分であるアミロースである。最近、直鎖型α-1,4グ
ルカンの商業的使用がますます重視されている。その物
理化学的性質のために、アミロースは、無色無臭で香り
がなく、毒性がなくかつ生物学的に分解可能なフィルム
を製造するのに使用することができる。すでに今日、例
えば食品産業、繊維産業、ガラス繊維産業および紙の製
造の分野で、応用の可能性が数多くある。天然のセルロ
ース繊維と性質が同様である繊維をアミロースから製造
し、紙の製造において部分的にまたは完全に両者を置き
換えることに成功している。アミロースは直鎖型α-1,4
グルカンの最も重要な代表的物質であるため、錠剤製造
の結合剤として、プリンやクリームの増粘剤として、ゼ
ラチン代替物として、防音壁パネル製造の接合材とし
て、そして蝋質油の流動性を改良するために特に使用さ
れている。最近ますます注目されているα-1,4グルカン
の別の性質は、その分子がらせん構造のため有機化合物
と包接化合物を形成する能力を有することである。この
性質のために、α-1,4グルカンは広範囲の用途に使用で
きる。現在は、ビタミン、薬剤化合物および芳香物質の
分子的カプセル化のための使用、ならびに固定化直鎖型
α-1,4グルカンによる物質の混合物のクロマトグラフィ
ー的分離のための使用が考えられている。アミロースは
また、いわゆるシクロデキストリン（シクロアミロー
ス、シクロマルトースとも呼ばれる）製造の出発物質と
なる。シクロデキストリンはまた、製薬産業、食品加工
技術、化粧品産業、および分析分離技術において広く使
用されている。これらのシクロデキストリンは、6〜8個
の単糖単位からなる環状マルトオリゴ糖であり、これは
水に自由に溶解するが、包接化合物を形成するために利
用できる疎水性の間隙を有する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】現在、直鎖型α-1,4グ
ルカンは、デンプンからアミロースの形で得られる。デ
ンプン自体は2つの成分からなる。1つの成分は、α-1,4
結合グルコース単位の非分岐鎖としてのアミロースを形
成する。他の成分は、α-1,4結合以外にグルコース鎖が
α-1,6結合で分岐することもできる、グルコース単位か
らなる高度に分岐したポリマーであるアミロペクチンを
形成する。これらの2つはその構造の違いとそれに由来
する物理化学的性質の違いにより、異なる分野でも使用
される。個々の成分の性質を直接利用できるようにする
ためには、これらを純粋な形で得ることが必要である。
両成分ともデンプンから得られるが、数段階の精製が必
要であり、多大な時間および費用がかかる。したがっ
て、デンプンの両成分を均一に得る可能性を見いだすこ
とが緊急に必要とされている。このために、これまで、
改変されたアミロース/アミロペクチン比率を有するデ
ンプンを産生するために、デンプン産生植物が交配また
は遺伝子操作により改変されてきた。トウモロコシデン
プンの通常のアミロペクチンの割合は、例えば70％であ
るが、交配によってほとんど100％のアミロペクチンよ
りなるデンプンを有するトウモロコシ変種（ワクシーメ
イズ（waxy maize））の確立に成功している（Akatsuka
and Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241:2280-228
5）。

【０００５】さらにアミロース含量が増加した（60〜70
％）いくつかのトウモロコシ変種（例えば、アミロース
エクステンダー（amylose extender）変種およびアミロ
ースダル（amolose dull）変種）が、交配により製造さ
れている（Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:
1654-1659; Boyer et al., 1976, Die Starke: 28:405-
410）。アミロペクチンの形で均一なデンプンを合成す
る他の変種［例えば、コメ（Sano, 1984, Theor. Appl.
Genet. 68:467-473）およびオオムギ（Shannon and Ga
rwood, 1984, Whistler, Bemiller, Paschall, Starch:
Chemistry andTechnology中、アカデミックプレス（Ac
ademic Press）、オーランド（Orlando）、第2版：25-8
6）、または高度にアミロースを含有するデンプン（例
えば、エンドウ（peas））を合成する変種］を得るため
に他の植物が使用されている。上記の古典的な交配以外
に、デンプン産生植物の遺伝子操作に基づく方法が報告
されている。

【０００６】例えば、「Visser et al. （1991, Mol. G
en. Genet. 255:289-296）」は、デンプン顆粒結合デン
プン合成酵素をコードする遺伝子のアンチセンス阻害に
より得られる、実質的に純粋なアミロペクチンデンプン
を合成するジャガイモ変種を開示している。国際公開第
92/14827号（WO92/14827）は、分岐酵素の発現のアンチ
センス阻害のために、アミロース／アミロペクチン比の
増加したデンプンを産生するジャガイモの生産を開示し
ている。しかし、国際公開第92/14827号に記載の植物
は、高度にアミロースを含有するデンプンを産生しな
い。

【０００７】これまで、数多くの試みおよび様々な方法
にもかかわらず、純粋なアミロースデンプンを産生する
植物を得ることはまだ成功していない。またこれまで、
他の方法、例えば遺伝子操作した微生物を用いて、高度
に純粋なアミロースまたは純粋な直鎖型α-1,4グルカン
を製造できる可能性は開示されていない。

【０００８】さらに、植物、真菌、微生物、またはイン
ビトロで直鎖型α-1,4グルカンの合成を触媒することが
できる酵素をコードするDNA配列はまだ、見いだされて
いない。したがって、本発明の目的は、直鎖型α-1,4グ
ルカンを合成することができる植物、真菌および微生物
の製造を可能にするDNA配列および方法を提供すること
である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、本発明
の請求の範囲により特徴付けられる態様の提供によって
達成される。したがって、本発明は、アミロスクラーゼ
の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に
関する。特に、本発明は、配列番号1に記載のアミノ酸
配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、およ
びそれをコードする配列番号1に記載のDNA配列に関す
る。さらに本発明は、上記の本発明の配列とハイブリダ
イズし、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク
質をコードするDNA配列、ならびに上記の本発明のDNA配
列と比較して遺伝コードにより縮重しているDNA配列に
関する。

【００１０】本明細書において「ハイブリダイゼーショ
ン」という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件
下でのハイブリダイゼーション、好ましくは、例えばサ
ムブルック（Sambrook）ら（1989、分子クローニング:
実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual）、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory
Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spri
ng Harbor）、ニューヨーク）に記載のような厳密な条
件下でのハイブリダイゼーションを意味する。

【００１１】別の態様において、本発明は、以下の段階
からなる方法により得られる、アミロスクラーゼの酵素
活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する: （a）生物の細胞のゲノムDNAまたはmRNAに基づき、ゲノ
ムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する
段階; （b）段階（a）で構築されたライブラリーで適当な宿主
を形質転換する段階; （c）形質転換された細胞をヨウ素蒸気に曝す段階; （d）青色に染色された細胞を同定する段階; （e）段階（d）で同定された細胞を単離し、培養する段
階;および （f）形質転換された細胞からゲノムDNA挿入配列または
cDNA挿入配列を単離する段階。段階（b）に記載の適当
な宿主は、例えば大腸菌（E. coli）である。

【００１２】

【発明の実施の形態】好適な実施態様において本発明
は、微生物、特にグラム陰性微生物、好ましくはナイセ
リア（Neisseria）種の細菌（特に好ましくはナイセリ
ア・ポリサッカレア（Neisseria polysaccharea））由
来のアミロスクラーゼをコードするDNA配列に関する。

【００１３】本発明のDNA配列はまた、発現されるタン
パク質のある性質を改変するために、突然変異、または
挿入、欠失、置換もしくは組換えによる配列改変により
修飾することもできる。

【００１４】これらの修飾の1つは、特に酵素の分泌を
担うシグナル配列を欠失させ、他のシグナル配列または
移動ペプチドをコードするDNAを挿入して、発現される
タンパク質の局在に影響を与えることである。

【００１５】本発明のDNA配列、特に配列番号1に示され
る本発明のDNA配列またはその部分を、相同DNA配列があ
る生物中に存在するか、または発現しているかを決定す
るために使用することができる。これを行うためには、
各生物のDNAまたはmRNA試料を、従来の方法で適当なハ
イブリダイゼーション条件下で本発明のDNA配列にハイ
ブリダイズさせる。

【００１６】また、本発明のDNA配列を用いることによ
り、標準的方法を用いて、種々の生物のゲノムから、ア
ミロスクラーゼまたは類似の性質を有する酵素を同様に
コードする相同配列を単離することができる。本明細書
において、相同性とは、少なくとも40％〜60％、好まし
くは60％を超える、特に80％を超える、さらに好ましく
は95％を超える配列同一性を意味する。相同性とはま
た、各ＤＮＡ配列またはコードされるアミノ酸配列が、
機能的におよび／または構造的に同等であることを意味
する。本発明の配列に相同であって、1つまたはそれ以
上の位置で本発明のDNA配列またはそれによりコードさ
れるアミノ酸配列とは異なる配列は、通常、同じ機能を
有する修飾物である該配列の変種である。これらは、天
然に存在する変種、他の生物の同様の配列、または突然
変異体であってもよい。これらの突然変異は、天然に存
在するものであっても、または特定の突然変異誘発によ
り達成されるものであってもよい。さらに、これらの変
種は、合成的に産生された配列でもよい。これらのDNA
配列はすべて、同様に本発明に包含される。

【００１７】本発明のDNA配列の種々の変種によりコー
ドされるタンパク質は、特定の共通の特徴（例えば、酵
素活性、免疫学的反応性、コンフォメーションなど）、
および物理的性質（例えば、電気泳動的移動度、クロマ
トグラフィーでの挙動、沈降係数、可溶性、分光学的性
質、安定性など）を共有する。

【００１８】関連するDNA配列を決定するためには、生
物の遺伝子の内容、または該生物中の、もしくは該生物
のある組織の遺伝子の発現を代表する、試験される生物
の遺伝子ライブラリーを得なければならない。前者のタ
イプはゲノムライブラリーであり、後者はcDNAライブラ
リーである。

【００１９】このようなライブラリーからの相同DNA配
列の同定および単離は、標準的な方法（例えば、サムブ
ルック（Sambrook）ら、1989、分子クローニング：実験
室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al）、第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス（Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニューヨークを参照）でハイブリダイゼーシ
ョンすることにより行われる。ハイブリダイゼーション
プローブとして、配列番号1に記載のDNA配列またはその
一部と正確にまたは実質的に同じDNA配列を示すDNA分子
が使用できる。ハイブリダイゼーションプローブとして
使用されるDNA断片はまた、DNA合成の従来法により調製
され、本発明の配列と実質的に同一である。本発明のDN
A配列にハイブリダイズする遺伝子が同定され単離され
たら、配列を決定し、その配列によってコードされるタ
ンパク質の性質を解析する必要がある。

【００２０】アミロスクラーゼ（ショ糖：1,4-αグルカ
ン4-α-グルコシルトランスフェラーゼ、E.C.2.4.1.4.
とも呼ばれる）は、以下の反応式を行うと考えられてい
る酵素である： ショ糖＋（α-1,4-D-グルコシル）_ｎ −−−→D-フル
クトース+（α-1,4-D-グルコシル）_ｎ＋１ この反応はトランスグルコシル化である。この反応の生
成物は、直鎖型α-1,4グルカンおよびフルクトースであ
る。補因子は不要である。アミロスクラーゼ活性は、こ
れまでほんのわずかの細菌種でのみ見いだされており、
その1つが特にナイセリア種（Neisseria）（Mackenzie
et al, 1978, Can. J. Microbiol. 24:357-362）であ
り、この酵素はその酵素活性についてのみ調べられてい
る。オカダ（Okada）らによると、ナイセリア・ペルフ
ラバ（Neisseria perflava）から部分精製された酵素を
ショ糖に加えると、ある程度分岐しているグリコーゲン
様多糖が合成される（Okada et al., 1974, J. Biol. C
hem. 249:126-135）。同様にナイセリア・ペルフラバ
（Neisseria perflava）およびナイセリア・ポリサッカ
レア（Neisseria polysaccharea）の細胞内または細胞
外で合成されるグルカンは、ある程度の分岐を示す（Ri
ou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32:909-911）。
これらの分岐がアミロスクラーゼにより導入されるもの
か、または精製アミロスクラーゼ調製物中に混在物質と
して存在する別の酵素により導入されるものかは、まだ
解明されていない。分岐を導入する酵素がまだ解明され
ていないため、重合反応と分岐反応の両方がアミロスク
ラーゼにより触媒されると考えられている（Okada et a
l., 1974, J. Biol. Chem. 249:126-135）。

【００２１】ナイセリア（Neisseria）中で構成的に発
現される酵素は、非常に安定であり、重合生成物に非常
に強く結合し、そして生成物であるフルクトースにより
競合的に阻害される（Mackenzie et al, 1977, Can. J.
Microbiol. 23:1303-1307）。ナイセリア（Neisseri
a）種であるナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria p
olysaccharea）は、アミロスクラーゼを分泌する（Riou
et al., 1986, Can. J.Microbiol. 32:909-911）が、
他のナイセリア（Neisseria）種ではアミロスクラーゼ
は細胞内にとどまる。

【００２２】アミロスクラーゼ活性を示す酵素は、微生
物でのみ見いだされている。アミロスクラーゼを有する
植物は知られていない。

【００２３】本発明により、アミロスクラーゼにより触
媒される反応の生成物は、これまで推定されていたよう
に分岐していない直鎖型α-1,4グルカンであることが証
明できた（前述）。

【００２４】アミロスクラーゼの酵素活性の検出は、実
施例3で後述されるように合成したグルカンを検出する
ことにより行われる。検出は、一般にヨード染色により
行われる。例えばヨウ素蒸気で処理して、アミロスクラ
ーゼを発現する細菌コロニーを同定することができる。
直鎖型α-1,4グルカンを合成するコロニーが、青色に染
色される。

【００２５】精製された酵素の酵素活性は、例えばショ
糖含有アガロースプレート上で検出できる。このような
プレートにタンパク質を適用し37℃で1時間またはそれ
以上インキュベートすると、該タンパク質はアガロース
中に分散し直鎖型グルカンの合成を触媒する。直鎖型グ
ルカンは、ヨウ素蒸気での処理により検出できる。さら
にタンパク質は、未変性ポリアクリルアミドゲル中で検
出できる。未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
ゲルをクエン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH6.5）で平
衡化させ、ショ糖溶液（クエン酸ナトリウム緩衝液中５
％）中で一晩インキュベートする。次にゲルをルゴール
溶液（Lugol's solution）で染色すると、直鎖型α-1,4
グルカンの合成のためアミロスクラーゼ活性を有するタ
ンパク質が局在している領域が青色に染色される。

【００２６】本発明のDNA配列を利用して、純粋なアミ
ロースデンプン、すなわち直鎖型α-1,4グルカンを産生
すること、およびデンプンの高収率と同時に高いアミロ
ース／アミロペクチン比率が得られるようにデンプン産
生植物を修飾することが可能である。本発明のDNA配列
は、ショ糖からの直鎖型α-1,4グルカンの合成を触媒す
る酵素を産生することができる微生物および真菌（特
に、酵母）を製造するのに使用できる。

【００２７】さらに本発明のDNA配列またはそれにより
コードされるタンパク質を利用して、低い製造コストで
純粋なフルクトースシロップを製造することができる。

【００２８】別に態様において本発明は、組換えDNA分
子、例えば本発明のDNA配列またはその部分を含有する
ベクター、特にプラスミド（例えば、DSM No.9196で寄
託されたプラスミドpNB2）に関する。本発明は特に、微
生物、真菌または植物中でアミロスクラーゼ活性を有す
るタンパク質の発現を担う配列に、本発明のDNA配列が
結合した組換えDNA分子、例えば（a）下流のコード配列
を微生物中で転写させる、微生物中で活性のある適当な
プロモーター、および（b）アミロスクラーゼ活性を示
すポリペプチドをコードし、ポリペプチドに翻訳可能な
RNAの形成を可能にするようにプロモーターに結合したD
NA配列、を含有するプラスミド、または、（a）下流の
コード配列を、トランスジェニック植物の成長の適当な
時間もしくは適当な段階で、またはトランスジェニック
植物のある種の組織中で転写する、植物中で活性のある
適当なプロモーター、および（b）アミロスクラーゼ活
性を示すポリペプチドをコードし、ポリペプチドに翻訳
可能なRNAの形成を可能にするようにプロモーターに結
合したDNA配列、を含有するプラスミドに関する。

【００２９】本発明のさらなる目的は、本発明の組換え
DNA分子を含有する微生物、真菌および植物である。

【００３０】本発明のさらに別の目的は、本発明のDNA
配列の1つによりコードされるアミロスクラーゼの酵素
活性を有するタンパク質であり、特に微生物由来のも
の、好ましくはグラム陰性微生物、具体的にはナイセリ
ア（Neisseria）属、特に好ましくはナイセリア・ポリ
サッカレア（Neisseria polysaccharea）由来のもので
ある。本発明の目的はさらに、ゲル電気泳動で63±20キ
ロダルトン、好ましくは63±15キロダルトンおよび最も
好ましくは63±10キロダルトンの分子量を有するアミロ
スクラーゼである。

【００３１】本発明のさらなる目的は、特に配列番号1
に記載のアミノ酸配列を示す、アミロスクラーゼの酵素
活性を有するタンパク質である。本発明はさらに、配列
番号1に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列、または1つまたはそれ以上の位置で該配列とは異
なるアミノ酸配列を示すタンパク質に関する。この差異
は好ましくは、保存的なアミノ酸置換であり、タンパク
質はアミロスクラーゼの酵素活性を有する。すなわち、
本発明はさらに、そのアミノ酸配列が配列番号1に示す
アミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸配列、特に少
なくとも70％の相同性、好ましくは80％を超える相同
性、さらに好ましくは90％を超える相同性、そして特に
好ましくは少なくとも99％の相同性を示す、アミロスク
ラーゼに関する。

【００３２】さらなる態様において本発明は、本発明の
DNA配列の使用、ならびに原核細胞または真核細胞の形
質転換のため、および原核細胞または真核細胞中のアミ
ロスクラーゼの発現のための、本発明のDNA配列を含有
するDNA分子、特にプラスミドの使用に関し、また本発
明の組換えDNA分子を含有する微生物を適当な栄養物質
中で培養することにより、本発明のタンパク質を製造す
る方法にも関する。

【００３３】特に、本発明の目的は、植物細胞中での発
現および形質転換された細胞からの完全な植物を再生を
担うDNA配列に結合した、アミロスクラーゼの酵素活性
を有するタンパク質をコードする領域からなる本発明の
DNA配列を、植物細胞中に導入することを特徴とする、
直鎖型α-1,4グルカンを合成することができる植物の製
造方法である。

【００３４】さらに本発明は、以下の段階を含む、直鎖
型α-1,4グルカンを合成することができる植物細胞およ
び植物の製造方法に関する。 （a）以下の部分配列: （i）植物中で活性があり、各標的組織または標的細胞
中でRNAを生成するプロモーター; （ii）アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質
をコードし、センス配向でプロモーターに融合してい
る、少なくとも1つのDNA配列; （iii）RNA分子の転写終止およびポリアデニル化に関し
て植物中で機能するシグナル、を有する発現カセットを
産生する段階; （b）発現カセットを植物細胞中に導入する段階;および （c）形質転換された植物細胞から完全な植物を再生す
る段階。

【００３５】有用なプロモーターとは、カリフラワーモ
ザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターのように植
物のすべての組織で、遺伝子を構成的に発現するプロモ
ーター、ならびに植物の特定の器官またはその成長のあ
る期間だけ発現させるプロモーターである。ジャガイモ
植物の塊茎中で特異的発現を行うプロモーター、例えば
B33プロモーター（Liu et al, 1990, Mol. Gen. Genet.
223:401-406）、またはテンサイの根で特異的発現を行
うプロモーターが公知である。さらに、葉においてその
下流のDNA配列の光依存性および組織特異的発現を可能
にするDNA配列が記載されている（Orozco and Ogren, 1
993, Plant Mol. Biol. 23:1129-1138）。

【００３６】製造段階（a）（ii）に記載のDNA配列は、
基本的にアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク
質をコードするコード領域を含む任意のDNA配列であ
る。有用なDNA配列は、微生物、好ましくはグラム陰性
微生物（具体的には、ナイセリア（Neisseria）属で、
特にナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacc
harea））由来のDNA配列である。

【００３７】本発明の方法の好適な態様において、配列
番号1に記載のアミノ酸配列または実質的にこれと同一
のアミノ酸配列を示すタンパク質とともに、アミロスク
ラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
配列を使用する。

【００３８】配列番号1に示すDNA配列と高度の相同性を
示し、アミロスクラーゼをコードするDNA配列を使用す
ることが好ましい。またその酵素活性が損なわれない限
り、置換、挿入、または欠失により該配列から得られた
DNA配列を使用することができる。

【００３９】本発明の方法の特に好適な態様は、配列番
号1に示すヌクレオチド配列もしくはその一部（その一
部は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質
をコードするのに充分なだけ長い）を示すDNA配列の使
用に関する。本発明によれば、アミロスクラーゼをコー
ドするDNA配列は、センス配向でプロモーターに結合し
ている（プロモーターの3'末端が、コード配列の5'末端
に結合）。この配列は、必要に応じて、以下に詳述する
ポリペプチドの性質もしくはその局在を変更するため
に、転写調節因子（プロモーターおよび終止シグナル）
との結合の前または後に修飾してもよい。配列番号1に
示すDNA配列は、例えば細胞外アミロスクラーゼをコー
ドする。分泌は、配列番号1に記載の配列のヌクレオチ
ド939〜986によりコードされる、16個のN末端アミノ酸
残基よりなるシグナル配列が担う。このような原核生物
シグナル配列は通常、植物細胞中でもタンパク質の分泌
を引き起こすため、配列番号1に記載のDNA配列を使用す
る場合は、発現されるタンパク質は植物のアポプラスト
（apoplast）に輸送される。

【００４０】植物細胞の細胞質ゾルで酵素を発現させる
ために、分泌を行うシグナル配列を除去しなければなら
ない。発現される酵素がある種の亜細胞コンパートメン
ト（例えば、葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア
または液胞）に指向させるには、分泌を行うシグナル配
列を、シグナル配列、または発現されるタンパク質を各
コンパートメントに輸送する輸送ペプチドをコードする
配列で置換しなければならない。そのような配列は公知
である。プラスチドへの輸送のために、例えばジャガイ
モ由来のリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ
（RUBISCO）の小サブユニットの前駆体タンパク質（Wol
ter et al., 1988, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:846
-850）、またはアシル担体タンパク質（ACP）の輸送ペ
プチドが有用である。液胞への輸送のために、例えばパ
タチン（patatin）のシグナル配列が使用できる（Sonne
wald et al., 1991, Plant J. 1:95-106）。使用される
配列は、酵素をコードするDNA配列にインフレームで融
合しなければならない。製造段階（a）で構築された発
現カセットの植物中の移動は、好ましくはプラスミド、
例えばバイナリープラスミドを用いて行われる。発現カ
セットが、形質転換された植物細胞のゲノム中に安定に
組み込まれることを確実にする技術を用いることが好ま
しい。

【００４１】本発明の方法は、基本的にいかなる植物種
にも適用できる。単子葉および双子葉植物も目的対象と
なる。形質転換法はすでに、種々の単子葉および双子葉
植物について開示されている。

【００４２】本発明のDNA配列は、アミロスクラーゼの
酵素活性を有するタンパク質を発現するように植物を修
飾し、それにより植物中で直鎖型α-1,4グルカンの合成
を可能にする。直鎖型α-1,4グルカンはその化学構造が
植物で合成されるアミロースと同一であるため、純粋な
アミロースを合成する植物を製造し、デンプン産生植物
がアミロース比率の増加したデンプンを合成するよう
に、該植物を修飾することができる。

【００４３】ほとんどの植物において、光合成の過程で
生成する光同化物は、糖、より具体的には主にショ糖の
形で植物内の各標的器官に輸送される。アミロスクラー
ゼの重合反応の基質はショ糖であるため、上記の方法は
基本的に、アミロスクラーゼ発現に関してすべての植物
（単子葉および双子葉植物の両方）を修飾することを可
能にする。好適な植物は、穀物植物（例えば、トウモロ
コシ、コメ、コムギ、オオムギ、テンサイ、サトウキ
ビ、タバコ、ジャガイモ、または カッサバ）、ならび
にフルーツおよび野菜、例えば、リンゴ、プラム、ニン
ジンまたはトマトである。

【００４４】植物におけるアミロスクラーゼ活性の発現
は、特に直鎖型α-1,4グルカンの合成により植物から得
られる抽出物の粘度を変化させるのに使用される。本明
細書においては、トマトが目的対象である。トマトでの
アミロスクラーゼの発現により、直鎖型α-1,4グルカン
が合成され、こうしてこの果実から得られた抽出物の粘
度が上昇する。

【００４５】アミロスクラーゼの発現はさらに、多量の
ショ糖を貯蔵する植物の器官において特に有益である。
そのような器官には、例えばテンサイの根、またはサト
ウキビの茎がある。これらの植物は通常検出できるほど
のデンプンを合成しないため、アミロスクラーゼにより
合成される直鎖型α-1,4グルカンはこれらの植物から純
粋な形で単離される。

【００４６】植物細胞中のショ糖の生合成の場所は、細
胞質ゾルである。しかし、貯蔵の場所は液胞である。テ
ンサイまたはジャガイモの貯蔵組織への輸送中または種
子の内胚乳への輸送中に、ショ糖はアポプラストを通過
しなければならない。したがって、3つのすべてのコン
パートメント、すなわち細胞質ゾル、液胞およびアポプ
ラストが、直鎖型グルカンの合成のためのアミロスクラ
ーゼの発現について考慮することができる。

【００４７】デンプン合成およびデンプン貯蔵が通常ア
ミロプラストで行われるデンプン産生植物、例えばジャ
ガイモまたはトウモロコシでは、アポプラスト、細胞質
ゾル、または液胞でのアミロスクラーゼの発現により、
これらのコンパートメントにおいてグルカンがさらに合
成され、収率が大幅に上昇する。

【００４８】ジャガイモは、デンプンの単離の間、アミ
ロプラストで合成されたデンプンを、アポプラスト中、
細胞質ゾル中、または液胞中でアミロプラストで合成さ
れた直鎖型α-1,4グルカンから分離することを可能にす
るため、デンプンおよび直鎖型α-1,4グルカンの両方を
得るために同植物を使用することができる。

【００４９】さらにアンチセンス構築体によるADPグル
コースピロリン酸ホスホリラーゼの阻害のために、それ
ぞれ塊茎および穀粒中でデンプン合成が完全に阻害され
ている、トランスジェニックジャガイモ植物およびトウ
モロコシ植物が知られている。その代わりに例えばジャ
ガイモでは、可溶性糖、特にショ糖およびグルコースが
塊茎中に蓄積される（Muller-Rober et al., 1992, EMB
O J. 11:1229-1238; EP-A-0455316）。細胞質ゾル中で
アミロスクラーゼが発現されることにより、これらの植
物の液胞またはアポプラスト、すなわち分岐酵素が存在
しないコンパートメントでは、高度にアミロースを含有
するデンプン（すなわち、主に直鎖型α-1,4グルカンか
らなるデンプン）の合成が行われる。アミロスクラーゼ
により触媒される反応の機序は、グルコース残基がショ
糖から直鎖型グルカンに直接移されることを特徴とす
る。植物中のショ糖からの直鎖型グルカンの生合成で
は、まずショ糖がグルコースおよびフルクトースに分解
され、次にこれが活性化中間体型であるADPグルコース
に変換される。グルコース残基が酵素デンプンシンター
ゼにより、ADPグルコースからすでに存在するグルカン
に移され、そしてADPを再び放出される。2つのADPグル
コース分子へのショ糖の変換には、いくつかのエネルギ
ー消費反応が必要である。

【００５０】したがって、植物細胞中のアミロースから
ショ糖への合成のエネルギーバランスと比較すると、ア
ミロスクラーゼにより触媒される反応のエネルギーバラ
ンスは、実質的により良好であり、アミロスクラーゼ活
性を発現する植物中で合成されたグルカンの収率が増加
する。

【００５１】高等植物への外来遺伝子の導入を行うのに
使用できる、大腸菌（E. coli）の複製シグナル、およ
び形質転換された細菌細胞の選択のためのマーカー遺伝
子を含有する多くのクローニングベクターが利用でき
る。そのようなベクターの例としては、pBR322、pUC
系、M13mp系、pACYC184などがある。目的の配列は適当
な制限部位でベクターに導入することができる。得られ
るプラスミドは、大腸菌（E.coli）の形質転換に使用さ
れる。形質転換された大腸菌（E. coli）細胞は適当な
培地中で培養され、次に収穫され溶解される。プラスミ
ドが回収される。得られたプラスミドDNAの特徴を決定
するのに一般に使用される分析方法は、制限分析、ゲル
電気泳動、配列決定反応、ならびに生化学および分子生
物学で知られているその他の方法である。すべての操作
の後、プラスミドDNAを切断し、他のDNA配列に結合させ
る。すべてのプラスミドDNA配列は、同じかまたは別の
プラスミドにクローニングすることができる。

【００５２】植物宿主細胞へのDNAの導入には多くの方
法が利用できる。これらの方法には、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）を形質転換体として用いるT-DNAによる植
物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、DNA
の電気穿孔法、生物弾丸法によるDNAの導入、および他
の可能な方法が含まれる。植物細胞への目的の遺伝子の
導入の方法により、別のDNA配列が必要な場合もある。
例えば、TiまたはRiプラスミドが植物細胞の形質転換に
使用される場合、隣接領域としてTiおよびRiプラスミド
T-DNAの少なくとも右の境界配列（しかし、ほとんどは
左右の境界配列）を、導入される遺伝子に連結しなけれ
ばならない。

【００５３】アグロバクテリア（Agrobacteria）が形質
転換のために使用される場合、導入されるDNAは、特殊
なプラスミド、中間ベクターまたはバイナリーベクター
にクローニングしなければならない。T-DNA中の配列に
相同性のある配列により、中間ベクターは、相同的組換
えによりアグロバクテリア（Agrobacteria）のTiまたは
Riプラスミドに組み込むことができる。該プラスミド
は、T-DNAの移動に必要なvir領域を含有する。中間ベク
ターはアグロバクテリア（Agrobacteria）中で複製でき
ない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドを用いてア
グロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens）に移すことができる（接合）。バイナリ
ーベクターは、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリア
（Agrobacteria）の両方で複製することができる。これ
らは、左右のT-DNA境界領域が隣接した選択マーカー遺
伝子およびリンカーもしくはポリリンカーを含有する。
これらは、アグロバクテリア（Agrobacteria）に直接形
質転換することができる（Holsters et al., 1978, Mo
l. Gen. Genet. 163:181-187）。宿主細胞として作用す
るアグロバクテリア（Agrobacteria）は、vir領域を有
するプラスミドを含有すべきである。vir領域は、植物
細胞へのＴ−ＤＮＡの移動に必要である。別のＴ−ＤＮ
Ａが存在してもよい。こうして形質転換したアグロバク
テリア（Agrobacteria）は、植物細胞の形質転換に使用
される。

【００５４】植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用
は、広く研究されており、EP120516、「Hoekema, バイ
ナリー植物ベクター系（The Binary Plant Vector Syst
em）中、Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserda
m, 1985, 第5章」、「Fraleyet al., Crit. Rev. Plan
t. Sci., 4:1-46」、および「An et al;1985, EMBO J.
4:277-287」に充分に記載されている。

【００５５】植物細胞へのDNAの移動のために、植物の
外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・
リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）とともに培養
することが便利である。感染した植物物質（例えば、葉
の小片、幹の断片、根、およびプロトプラストまたは懸
濁培養した植物細胞）から、形質転換された細胞の選択
のための抗生物質または殺生物剤を含有する適当な培地
中で、完全な植物を再生できる。こうして得られた植物
は、導入されたDNAの存在についてスクリーニングされ
る。

【００５６】植物細胞へのDNAの注入および電気穿孔法
のために使用されるプラスミドについては特別の要件は
ない。pUC誘導体のような単純なプラスミドが使用でき
る。しかし、こうして形質転換された細胞から完全な植
物を再生したい場合は、選択マーカーの存在が必要であ
る。

【００５７】導入されたDNAは、いったん植物細胞のゲ
ノムに組み込まれると、一般にそこに安定にとどまり、
本来の形質転換された細胞の子孫にも見いだされる。こ
れは通常、殺生物剤または抗生物質（例えば、カナマイ
シン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、また
はグルフォシネート（gluphosinate）など）に対する耐
性を、形質転換された植物細胞に付与する選択マーカー
を含有する。したがって、個々に選択されたマーカー
は、導入されたDNAの欠如した細胞からの、形質転換さ
れた細胞の選択を可能にする。

【００５８】形質転換された細胞は、通常細胞内で増殖
する（例えば、McCormick et al.,1986, 植物細胞報告
（Plant Cell Reports） 5:81-84を比較参照）。これら
の植物は通常の方法で増殖され、同じ形質転換遺伝物質
または他の遺伝物質を有する植物と交雑することができ
る。得られたハイブリッド個体は、対応する表現型を有
する。

【００５９】表現型の特徴が安定に維持され遺伝される
ことを確認するために、2世代またはそれ以上培養する
必要がある。さらに対応する表現型または他の特質が維
持されることを確認するために、種子を採取する必要が
ある。

【００６０】本発明の他の目的は、前述の本発明の方法
から得られる修飾された植物細胞および植物、特に植物
細胞中で本発明のDNA配列の発現を可能にするDNA配列と
組合せた本発明のDNA配列を含有する植物細胞および植
物である。この植物細胞は、アミロスクラーゼの酵素活
性を有するタンパク質を発現し、こうして細胞または植
物中で直鎖型α-1,4グルカンを合成することが特徴であ
る。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニ
ック植物はさらに、アミロスクラーゼをコードするDNA
配列を含有する該発現カセットを有する、ゲノム内に安
定に組み込まれた組換えDNA分子を含有することを特徴
とする。

【００６１】トランスジェニック植物細胞およびトラン
スジェニック植物中でアミロスクラーゼを利用して生成
される直鎖型α-1,4グルカンは、通常生成されるデンプ
ンと同じ方法で、トランスジェニック植物細胞およびト
ランスジェニック植物から単離することができる。これ
らは同様に、本発明の目的である。

【００６２】本発明はまた、好ましくはそれ自身のアミ
ロスクラーゼ活性を持たない微生物中で、アミロスクラ
ーゼ活性を有するポリペプチドの発現のための本発明の
DNA配列またはその部分の使用に関する。

【００６３】本願において、微生物は例えばシュレゲル
（Schlegel）の「一般微生物学（Allgemeine Mikrobiol
ogie）」（ゲオルグ・チエメ・フェアラーク（Georg Th
iemeVerlag）、1985、pages 1-2）で規定されたような
細菌および原生生物であると理解すべきである。

【００６４】今日バイオテクノロジー研究はほとんど、
非常に広範な物質を合成し処理するために微生物を用い
ている。これは、微生物における原核生物および真核生
物遺伝子の効率的な発現のために多くの種々の系が蓄積
されてきたことにより可能になった（総説については、
例えば Methods in Enzymology 153:385-516を参照）。
例えば、細菌である大腸菌（E. coli）および枯草菌（B
acillus subtilis）の株が、広く利用されている。本発
明のDNA配列、特に配列番号1に記載のDNA配列を提供す
ることにより、適当な発現系を利用できる微生物中でア
ミロスクラーゼ活性を有するタンパク質を発現すること
が可能である。

【００６５】本発明は特に、その微生物中で本発明のDN
A配列が導入され発現される、直鎖型α-1,4グルカンを
細胞内または細胞外のいずれかで合成することができる
微生物の製造方法に関する。この方法は例えば、以下の
段階を含む。 （a）以下の部分配列: （i）選択された微生物中で活性であり、その下流のDNA
配列の転写を担うプロモーター; （ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロ
モーターに融合したDNA配列; （iii）微生物中で機能する転写終止シグナルを有する
発現カセットを産生する段階、および （b）段階（a）で作成された発現カセットで、適当な微
生物を形質転換する段階。

【００６６】発現ベクターは、当該分野で広く記載され
ている。これらはまた、選択された宿主中での複製を可
能にする選択マーカー遺伝子および複製開始点に加え
て、細菌またはウイルスプロモーターおよび転写終止シ
グナルを含有する。プロモーターと終止シグナルの間
に、少なくとも1つの制限部位またはコードDNA配列の挿
入を可能にする1つのポリリンカーがある。選択された
生物中で活性である限り、通常対応する遺伝子の転写を
調節するDNA配列をプロモーター配列として使用するこ
とができる。この配列は他のプロモーター配列で置換し
てもよい。遺伝子またはその下流の遺伝子の発現を選択
的に制御する誘導性プロモーターの構成性発現を可能に
するプロモーターを使用してもよい。これらの性質を有
する細菌およびウイルスプロモーター配列が、当該分野
で広く記載されている。下流の遺伝子の特に強い発現を
可能にするプロモーターは、例えばT7プロモーター（St
udieret al., 1990, in Methods in Enzymology 185:60
-89）、lacuv5、trp、trp-lacUV5（DeBoer et al., in
Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J. 編、"プロモー
ター、構造および機能（Promotors, Structure, and Fu
nction）"中、プレーガー（Praeger）、ニューヨーク、
1982, pp.462-481; DeBoer et al., 1983, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:21-25）、lp₁、rac（Boros et a
l., 1986, Gene42:97-100）またはompFプロモーターが
ある。

【００６７】製造段階（a）（ii）中に記載のDNA配列
は、アミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質を
コードするいかなるDNA配列であってもよい。好ましく
は、微生物、特にグラム陰性細菌、好ましくはナイセリ
ア（Neisseria）属に由来するDNA配列、特に好ましくは
ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacchare
a）由来のDNA配列が使用される。特に好適な態様におい
て、DNA配列は、配列番号1に記載のヌクレオチド配列、
またはそれにハイブリダイズし、アミロスクラーゼの酵
素活性を有するタンパク質をコードするDNA配列であ
り、該配列はセンス配向でプロモーターに結合している
（プロモーターの3'末端がコード配列の5'末端に結
合）。使用される配列は、必要に応じて、後に詳述する
ようにポリペプチドの性質またはその局在を変化させる
ために、発現ベクターへの組み込みの前または後に修飾
することができる。配列番号1に記載の配列の代わり
に、該配列から置換、挿入または欠失により得られたDN
A配列も、そのコードされたタンパク質の酵素活性が損
なわれない限り使用することができる。

【００６８】段階（b）の微生物の形質転換は通常、標
準的な方法、例えばマニアチス（Maniatis）らの記載し
た方法（分子クローニング:実験室マニュアル（Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual）、1982、ニューヨ
ーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press））
を用いて行われる。形質転換された微生物は、使用され
る各宿主の必要性に適した培地中で培養される。特にpH
値、温度、換気などに注意すべきである。本発明の別の
目的は、上記の方法で得られた微生物であり、組換えDN
A分子の一部である、アミロスクラーゼをコードするDNA
配列を含有することを特徴とする微生物である。該組換
えDNA分子は、使用される形質転換法により、使用され
る微生物の細胞のゲノムの外に存在してもよく、または
微生物細胞のゲノム内に安定に組み込まれてもよい。ナ
イセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacchare
a）によって発現されるアミロスクラーゼは、ショ糖を
基本として細胞外で直鎖型α-1,4グルカンを合成する細
胞外酵素である。細胞内で進行するほとんどの多糖の合
成経路と異なり、活性化されたグルコース誘導体も補因
子も必要ない。濃縮されたグルコース残基の間のα-1,4
グルカン結合の生成に必要なエネルギーは、ショ糖分子
のグルコース単位とフルクトース単位の間の結合の加水
分解から直接得られる。

【００６９】したがって、前述の製造段階で得られたア
ミロスクラーゼ分泌性微生物をショ糖含有培地中で分泌
されたアミロスクラーゼとともに培養して、培地中でシ
ョ糖から直鎖型α-1,4グルカンの合成に導くことができ
る。これらのグルカンは、培地から単離することができ
る。

【００７０】さらに、細胞を含まない酵素調製物を利用
して、インビトロでα-1,4グルカンを合成することがで
きる。この場合、アミロスクラーゼ分泌性微生物は、定
常増殖期に達するまで、ショ糖を含まない培地中で培養
して、アミロスクラーゼを発現させることができる。増
殖培地から遠心分離により細胞を除去して、分泌された
酵素を上清から得ることができる。次に酵素をショ糖含
有溶液に添加して、直鎖型α-1,4グルカンを合成するこ
とができる。ショ糖含有増殖培地中での直鎖型α-1,4グ
ルカンの直接合成に比較して、この方法は、反応条件が
より良好に調節でき、反応生成物が実質的に純粋であ
り、さらに精製することが容易であるという点で有利で
ある。酵素は培地から、通常の精製方法（例えば、沈降
法、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過、逆相高速液体クロマトグラフィー
など）により精製できる。

【００７１】さらに発現ベクターに挿入されたDNA配列
を修飾することによりポリペプチドを発現させ、ある性
質のため培地中により容易に単離できるポリペプチドを
得ることができる。その特異的結合性のために親和性ク
ロマトグラフィーにより融合タンパク質を単離すること
ができる別のポリペプチド配列とともに、融合タンパク
質として酵素を発現することができる。

【００７２】公知の方法としては、例えばグルタチオン
-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現
させて、次にグルタチオンに対するグルタチオン-S-ト
ランスフェラーゼの親和性を利用しグルタチオンカラム
で親和性クロマトグラフィーにより精製する方法がある
（Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40）。他の公
知の方法としては、マルトース結合タンパク質（MBP）
との融合タンパク質として発現させて、次にアミロース
カラムで精製する方法がある（Guan et al., 1988, Gen
e 67:21-30; Maina et al, 1988, Gene 74:365-373）。

【００７３】精製された酵素を直接ショ糖含有溶液に加
えて直鎖型α-1,4グルカンを合成できる可能性以外に、
酵素を担体物質に固定化する代替法がある。このような
固定化法は、合成触媒として酵素が容易に回収でき、数
回使用できるという利点がある。酵素の精製は通常、非
常に時間およびコストがかかり、酵素の固定化および再
利用はコストの大幅な削減に寄与する。他の利点は、反
応生成物が高度に純粋であることであり、これは特に、
固定化酵素を使用すると反応条件がより良好に調節でき
るという事実に起因する。反応生成物として得られる不
溶性直鎖型グルカンは、容易にさらに精製することがで
きる。

【００７４】共有結合または非共有結合により担体物質
に結合できるタンパク質の固定化のために、多くの担体
物質が利用することができるであろう（総説について
は、Methods in Enzymology Vol.135, 136および137を
参照）。広く使用されている担体物質は、例えばアガロ
ース、セルロース、ポリアクリルアミド、シリカまたは
ナイロンである。

【００７５】精製される酵素と同様に、目的のポリペプ
チドを発現する微生物または特定の代謝物を分泌する微
生物も固定化することができる。固定化は一般に、細胞
を適当な物質（例えば、アルギン酸塩、ポリアクリルア
ミド、ゼラチン、セルロースまたはキトサン）の中に包
括することにより行われる。しかし、担体物質に細胞を
吸着または共有結合させることもできる（Brodelius an
d Mosbach, in Methods in Enzymology, Vol. 135:173-
175）。細胞の固定化の利点は、液体培地中で培養する
よりも相当高い細胞密度が得られ、生産性がより高くな
ることである。また培養物の攪拌および換気のコスト、
ならびに無菌性を維持するための手段のコストも低下す
る。重要な面は、固定化により連続生産が可能になり、
その結果通常発酵反応で生じる長く非生産的な時期を避
けることができるか、または少なくとも大幅に短縮する
ことができることである。

【００７６】微生物における場合と同様に、本発明のDN
A配列も、真菌、特に酵母（例えばサッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae））中でアミロス
クラーゼ活性を発現するために使用することができる。
酵母で異種遺伝子を発現するためのベクターは、すでに
開示されている（例えば、Bitter et al., 1987, Metho
ds in Enzymology 153:516-544）。細菌での増殖のため
の選択マーカー遺伝子または複製開始点以外に、これら
のベクターは、形質転換された酵母細胞の同定を可能に
する少なくとも1つの選択マーカー遺伝子、酵母での複
製を可能にするDNA配列、および目的の発現カセットの
挿入のためのポリリンカーを含有する。発現カセット
は、プロモーター、発現されるDNA配列、ならびに転写
物の転写終止およびポリアデニル化を可能にするDNA配
列から作成される。サッカロミセス（Saccharomyces）
のプロモーターおよび転写終止シグナルも記載されてお
り、利用できる。発現ベクターは、標準的方法（酵母遺
伝学の方法、実験室コースマニュアル（Methods in Yea
st Genetics, A Laboratory Course Manual）、 コール
ドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）、1990）にしたがって、
形質転換により酵母細胞内に導入することができる。ベ
クターを含有する細胞を選択し、適当な選択培地上で増
殖させる。さらに酵母は、適当なベクターを用いて細胞
のゲノム内へ相同的組換えを介して発現カセットを組み
込み、形質を安定に遺伝することを可能にする。

【００７７】アミロスクラーゼを発現する酵母株は、分
泌されたアミロスクラーゼを得るために微生物と同様に
使用できる。酵母の培養方法は、充分に記載されている
（酵母遺伝学の方法、実験室コースマニュアル（Method
s in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manua
l）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス
（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1990）。
酵母の固定化も可能であり、すでにエタノールの商業的
生産に使用されている（Nagashima et al., Methodsin
Enzymology中, Vol. 136:394-405; Nojima and Yamada,
Methods in Enzymology中, Vol. 136:380-394）。

【００７８】しかし、酵母は細胞外のショ糖を加水分解
するインベルターゼを分泌するため、直鎖型α-1,4グル
カンの合成のためにショ糖含有培地中でアミロスクラー
ゼを分泌する酵母を使用することは容易ではない。酵母
はヘキソーストランスポーターを介して得られるヘキソ
ースを取り込む。しかしゴザルボ（Gozalbo）およびホ
ーマン（Hohmann）（1990, Current Genetics 17, 77-7
9）は、欠陥のあるsuc2遺伝子を有するためインベルタ
ーゼを分泌することができない酵母株を開示している。
これらの酵母細胞は、ショ糖を細胞内に取り込むための
輸送系を持たない。このような株を本発明のDNA配列で
修飾して、培地内にアミロスクラーゼを分泌するように
すれば、培地がショ糖を含有する場合でも、アミロスク
ラーゼにより直鎖型α-1,4グルカンが合成される。反応
生成物として生成するフルクトースは、次に酵母により
取り込まれる。

【００７９】したがって本発明はまた、本発明のDNA配
列が真菌細胞に導入され発現されている、細胞内または
細胞外に直鎖型α-1,4グルカンを合成することができる
真菌細胞を製造する方法にも関する。この方法は、例え
ば以下の段階を含む。 （a）以下の部分配列: （i）選択された真菌細胞中で活性であり、下流のDNA配
列の転写を担うプロモーター; （ii）アミロスクラーゼをコードし、センス配向でプロ
モーターに融合したDNA配列; （iii）上記真菌細胞中で機能する転写終止シグナル、
を有する発現カセットを産生する段階、および （b）段階（a）で構築した発現カセットで真菌細胞を形
質転換する段階。

【００８０】本発明の別の面は、本発明のDNA配列を用
いて安価な方法で純粋なフルクトースシロップを製造す
る可能性である。フルクトース製造の従来法では、イン
ベルターゼを用いてショ糖を酵素的に加水分解し、また
はしばしば酸分解して、次にグルコースをグルコースイ
ソメラーゼによりフルクトースに酵素的に変換すること
により、フルクトースを製造している。いずれの方法に
よっても、グルコースおよびフルクトースの混合物が得
られる。この2つの成分はクロマトグラフィー法により
互いに分離する必要がある。

【００８１】アミロスクラーゼの酵素活性を有するタン
パク質を用いる純粋なフルクトースまたは純粋なフルク
トースシロップの製造は、好ましくは、精製された酵素
を用いて細胞を含まない系で行われる。後者は、適当な
担体物質上に固定化されていてもよく、または可溶型で
存在していてもよい。ショ糖が存在すると、直鎖型グル
カンが合成され、フルクトースが放出される。反応生成
物からの基質の分離または2つの反応生成物の分離は、
例えばフルクトースは透過するがショ糖またはグルカン
は透過しない膜を用いて行われる。フルクトースがこの
ような膜により連続的に除去されるならば、ショ糖はほ
ぼ完全にフルクトースおよび直鎖型グルカンに変換され
る。

【００８２】アミロスクラーゼはまた、好ましくは2つ
の膜の間に存在する担体物質に固定化される。その一方
の膜はフルクトースは透過するがショ糖またはグルカン
は透過しないものであり、他方はショ糖は透過するがグ
ルカンは透過しないものである。基質は、ショ糖を透過
する膜を介して供給される。合成されたグルカンは、2
つの膜の間の間隙にとどまり、放出されたフルクトース
は、フルクトースのみが透過する膜を介して反応平衡か
ら連続的に除去することができる。このような構成は、
反応生成物の効率的な分離を可能にし、したがって、特
に純粋なフルクトースの製造を可能にする。

【００８３】純粋なフルクトースを製造するためにアミ
ロスクラーゼを使用することにより、比較的安価な基質
であるショ糖を出発物質として用いることができ、さら
にクロマトグラフィー法を用いることなく簡便な方法で
反応混合物からフルクトースを単離することができると
いう利点がもたらされる。したがって、本発明はまた、
フルクトースの製造のためのアミロスクラーゼの酵素活
性を有するタンパク質の使用に関する。

【００８４】アミロスクラーゼ活性を有するタンパク質
の使用のさらなる可能性は、これらをシクロデキストリ
ンの製造のために使用することである。シクロデキスト
リンは、細菌バシルス・マセランス（Bacillus maceran
s）から得られる酵素シクロデキストリントランスグリ
コシラーゼ（EC2.4.1.19）によりデンプンを分解して産
生される。デンプンの分岐のため、この系を用いてわず
か約40％のグルコース単位がシクロデキストリンに変換
される。アミロスクラーゼ活性を有する実質的に純粋な
タンパク質を提供することにより、アミロスクラーゼお
よびシクロデキストリントランスグリコシラーゼの同時
作用下で、ショ糖を基本としてシクロデキストリンを合
成することができる（アミロスクラーゼはショ糖からの
直鎖型グルカンの合成を触媒し、シクロデキストリント
ランスグリコシラーゼはこれらのグルカンのシクロデキ
ストリンへの変換を触媒する）。

【００８５】本発明のプラスミドpNB2は、ブダペスト条
約の規定にしたがって1994年5月6日にドイツ国ブラウン
シュバイヒ（Braunschweig）のドイツ微生物寄託機関
（DSM）に寄託番号DSM9196で寄託された。

【００８６】使用した略語 IPTG イソプロピルβ-D-チオガラクト-ピラノシド使用した培地と溶液 YT培地 バクト-トリプトン 8g 酵母抽出物 5g NaCl 5g 2回蒸留水で1000mlにする YTプレート 1000ml当たりバクト寒天15gを含有するYT培地 ルゴール液 KI 12g I₂ 6g 2回蒸留水で1.8リットルにする

【００８７】

【実施例】以下の実施例により、本発明を例示する。実施例1 ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacchare
a）からのアミロスクラーゼ活性をコードするゲノムDNA
配列の単離 ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacchare
a）からのアミロスクラーゼ活性をコードするDNA配列の
単離のために、まずゲノムDNAライブラリーを確立し
た。ナイセリア・ポリサッカレア（Neisseria polysacc
harea）細胞を、「コロンビア血液寒天（Columbia bloo
d agar）」（ディフコ社（Difco））で37℃で2日間培養
した。得られたコロニーをプレートから採取した。アウ
スベル（Ausubel）らの方法（「分子生物学の現在の方
法」（Current Protocols in Molecular Biology）、19
87, ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（J. Wiler & S
ons）、ニューヨーク）により、ゲノムDNAを単離し、処
理した。こうして得られたDNAを制限エンドヌクレアー
ゼSau3Aで部分的に消化した。得られたDNA断片を、BamH
Iで消化したpBluescriptSK（-）に連結させた。連結生
成物を、大腸菌（E. coli）XL1-Blue細胞中で形質転換
した。選択のために、細胞を選択マーカーとしてアンピ
シリンを含有するYTプレートに蒔いた。この選択培地は
さらに5％ショ糖および1mMIPTGを含有していた。37℃で
一晩インキュベートした後、結晶ヨウ素をシャーレのフ
タに入れ、細菌を有する培養プレートを逆さにしてシャ
ーレの中にそれぞれ10分間置いて、生成した細菌コロニ
ーをヨウ素で染色した。室温で蒸発したヨウ素は、アミ
ロース様グルカンを含有する培養プレートの領域を青く
染めた。青い光冠を示したコロニーから、Birnboim & D
oly （1979, Nucleic Acids Res. 7:1513-1523）の方法
によりプラスミドDNAを単離した。このDNAを再び大腸菌
（E. coli）SURE細胞中で形質転換した。形質転換した
細胞を、選択マーカーとしてアンピシリンを含有するYT
プレートに蒔いた。陽性のクローンを単離した。

【００８８】実施例2 プラスミドpNB2のゲノムDNA挿入配列の配列解析 実施例1にしたがって得られた大腸菌（E. coli）クロー
ンから、組換えプラスミドを単離した。制限解析は、こ
のプラスミドが2つのベクター分子および1つの約4.2kb
長のゲノム断片より構成される連結生成物であることを
示した。このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼPstI
で消化し、ゲノム断片を単離した（ジーンクリーン（Ge
neClean）、Bio101）。こうして得られた断片を、PstI
で直鎖型化したpBluescriptIISKベクターに連結し、Pst
IおよびSmaI制限部位が複製された。連結生成物を大腸
菌（E. coli）細胞中で形質転換し、後者を選択のため
アンピシリンプレートに蒔いた。陽性のクローンを単離
した。これらのクローンの1つから、プラスミドpNB2
（図1）を単離し、そのゲノムDNA挿入配列の一部を、ジ
デオキシ法（Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5463-5467）を用いる標準的方法により決
定した。全挿入配列の長さは約4.2kbpであった。このヌ
クレオチド配列は、2883塩基対の長さの部分配列から決
定した。このヌクレオチド配列は後述する（配列番号
1）。ゲノム挿入配列中の配列決定された領域の位置を
図1に示す。

【００８９】実施例3 形質転換した大腸菌（E. coli）細胞中の細胞外アミロ
スクラーゼ活性の発現 （a）YTプレート上での増殖中のアミロスクラーゼ活性
の検出 細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌
（E. coli）細胞を、標準的方法に従いベクターpNB2で
形質転換した。形質転換した株のコロニーをYTプレート
（1.5％寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM
IPTG）上で37℃で一晩インキュベートした。アミロスク
ラーゼ活性は、コロニーをヨウ素蒸気に曝して検出した
（図2）。アミロスクラーゼ発現コロニーは、青い光冠
を示す。アミロスクラーゼ活性は、おそらくその内因性
アミロスクラーゼプロモーターの活性のため、IPTGが存
在しなくても観察される。 （b）YT培地での増殖中のアミロスクラーゼ活性の検出 細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌
（E. coli）を、標準的方法に従いベクターpNB2で形質
転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン;5％ショ
糖）に、形質転換した株のコロニーを接種した。細胞を
一定条件（回転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩イ
ンキュベートした。アミロスクラーゼにより触媒された
反応の生成物を、培養上清にルゴール溶液を加えて青く
染色して検出した。 （c）ショ糖なしで培養した形質転換した大腸菌（E. co
li）細胞の培養上清中のアミロスクラーゼ活性の検出 細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、大腸菌
（E. coli）細胞を、標準的方法でpNB2ベクターで形質
転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン）に、形質
転換した株のコロニーを接種した。細胞を一定条件（回
転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩インキュベート
した。次に細胞を遠心分離（30分、4℃、5500rpm、JA10
ベックマン（Beckmann）ロータ）して除去した。上清を
0.2μmのフィルター（シュレイチャー及びシュエル（Sc
hleicher & Schuell））で無菌条件下で濾過した。アミ
ロスクラーゼ活性の検出は、以下のように行なった: （i）ショ糖含有寒天プレート上で上清をインキュベー
トして検出。上清40μlを寒天プレート（50mMクエン酸
ナトリウム緩衝液pH6.5中5％ショ糖）中にくり抜いた穴
に入れ、37℃で少なくとも1時間インキュベートした。
アミロスクラーゼにより触媒された反応の生成物を、ヨ
ウ素蒸気で染色して検出した。反応生成物が存在する
と、青く染色される。 （ii）または、未変性のゲルで上清のタンパク質を電気
泳動分離し、ショ糖でインキュベートした後、ゲル中の
反応生成物を検出。40〜80μlの上清を、8％未変性ポリ
アクリルアミドゲル（0.375Mのトリス、pH8.8）で100V
の電圧でゲル電気泳動により分離した。次にゲルを、約
100mlの50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で2回1
5分間平衡化させ、クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）
／5％ショ糖中で37℃一晩インキュベートした。アミロ
スクラーゼにより触媒された反応生成物を可視化するた
めに、ゲルをルゴール溶液で洗浄した。アミロスクラー
ゼ活性を有するバンドは、青く染色された。

【００９０】実施例4 部分的に精製したアミロスクラーゼによるグルカンのイ
ンビトロ産生 細胞外アミロスクラーゼ活性の発現のために、標準的方
法にしたがって大腸菌（E. coli）細胞をpNB2ベクター
で形質転換した。YT培地（100μg/mlアンピシリン）
に、形質転換した株のコロニーを接種した。細胞を一定
条件（回転ミキサー;150〜200rpm）で37℃で一晩インキ
ュベートした。次に細胞を遠心分離（30分、4℃、5500r
pm、JA10ベックマン（Beckmann）ロータ）して除去し
た。上清を0.2μmのフィルター（シュレイチャー及びシ
ュエル（Schleicher & Schuell））で無菌条件下で濾過
した。次にアミコンチャンバー（Amicon chamber）（排
除サイズ30kDaを有するYM30膜、アミコン社（company A
micon））を用いて、加圧下（p=3バール）で、上清を20
0倍濃縮した。濃縮した上清を、50mlのショ糖溶液（50m
Mクエン酸ナトリウム緩衝液pH6.5中5％ショ糖）に加え
た。全溶液を37℃でインキュベートした。やや白い不溶
性の多糖が生成した。

【００９１】実施例5 実施例4からのアミロスクラーゼによって合成された反
応生成物の特徴決定 実施例4に記載の不溶性反応生成物は、1MのNaOH中で可
溶性である。最大吸収を測定して反応生成物を性状解析
した。単離した反応生成物約100mg（湿重量）を、200μ
lの1M NaOHに溶解し、水で1:10に希釈した。900μlの0.
1M NaOHおよび1mlのルゴール溶液を、この希釈液の100
μlに加えた。400〜700nmの間で吸収スペクトルを測定
した。最大は605nmにあった（アミロースの最大吸収:約
614nm）。CARBOPAC PA1カラム（ジオネックス（DIONE
X））による実施例4の反応混合物のHPLC解析は、不溶性
生成物以外に可溶性生成物が生成したことを示した。こ
れらの可溶性生成物は、短鎖の多糖である。鎖の長さ
は、約5〜約60グルコース単位であった。しかし、これ
より短いかまたは長い分子もある程度検出された。利用
可能な解析方法では、合成生成物中の分岐を検出するこ
とはできなかった。

【００９２】実施例6 形質転換した大腸菌（E. coli）細胞中での細胞内アミ
ロスクラーゼ活性の発現 ポリメラーゼチェーン反応（PCR）を用いて、プラスミ
ドpNB2から配列番号1に記載の配列のヌクレオチド981〜
2871を含む断片を増幅した。以下のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いた: TPN2 5'-CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC-3'
（配列番号3） TPC1 5'-CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G-
3' （配列番号4） 得られた断片は、16個のN-末端アミノ酸をコードするヌ
クレオチド以外の、アミロスクラーゼのコード領域を含
有する。これらのアミノ酸は、細胞からの酵素の分泌に
必要な配列を含み、さらにこのPCR断片は、88塩基対の
3'非翻訳領域を含有する。プライマーを用いて、この断
片の両端にNcoI制限部位を導入した。制限エンドヌクレ
アーゼNcoIで消化した後、得られた断片を、NcoI消化し
た発現ベクターpMex7に連結した。連結生成物を大腸菌
（E. coli）細胞中で形質転換させ、形質転換したクロ
ーンを選択した。陽性のクローンをYTプレート（1.5％
寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM IPTG）
上で37℃で一晩インキュベートした。プレートをヨウ素
蒸気に曝しても細菌のコロニーの周囲には青い染色は見
られなかったが、グリコーゲンの細胞内産生が検出され
た（非形質転換XL1-Blue細胞中では染色されなかったの
に対して、形質転換した細胞では褐色に染色）。タンパ
ク質の機能を調べるために、YT培地で培養した形質転換
細胞を超音波で破壊し、粗抽出物をピペットでショ糖含
有寒天プレートに移した。プレートをヨウ素蒸気に曝す
と、青い染色が観察された。

【００９３】

【配列表】 配列表 (1) 一般情報: (i) 出願人: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH (A) 氏名: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH (B) 街路名: Ihnestrasse 63 (C) 氏名: Berlin (E) 国名: DE (F) 郵便番号 (ZIP): 14195 (G) 電話: +49 30 8300070 (H) ファックス: +49 30 83000736 (ii) 発明の表題: 植物、真菌および微生物中で直鎖型α-1,4グルカンの合 成を促進することができる酵素をコードするDNA配列 (iii) シーケンス数: 4 (iv) 文書通信住所: (A) メイディア形式: Floppy disk (B) コンピューター: IBM PC compatible (C) 運転システム: PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) 先の出願の情報: (A) 出願番号: DE P 44 17 879.4 (B) 出願日: 18-MAY-1994 (vi) 先の出願の情報: (A) 出願番号: DE P 44 47 388.5 (B) 出願日: 22-DEC-1994 (2) 配列番号: 1の情報: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 2883 塩基対 (B) 配列の型: 核酸 (C) 鎖の数: 不明 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: DNA (genomic) (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: Neisseria polysaccharea (vii) 直接の起源: (A) ライブラリー名: genomic library in pBluescriptII SK (B) クローン名: pNB2 (ix) 配列の特徴: (A) 特徴を表す記号: CDS (B) 存在位置:939..2780 (xi) 配列の記載: 配列番号: 1: GAGTTTTGCG TTCCCGAACC GAACGTGATG CTTGAGCCGA ACACCTGTCG GCAAGCGCTG 60 ACCGCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG 120 AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGGCCTTT CGGCATCACC GCAATTTTGC 180 AGATGTCCGC GCCGCAGTCC TCCATCTGTT TCAGACGGCA TACGATTTCT TCTTGCGGCG 240 GCGTGCGGTG AAACTCATGA TTGCAGAGCA GGGCGATGCC GTTTTTTTGA GCATGCCACG 300 GCGCCGGAGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AATGTCGGGC AGGCGGCTTT 360 CAATCAGCGA GTCGAGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGGAAC GAGCCGCCTT 420 CGCCATGCCG TCTGAACGTA AACAGCAGCG GCTTGTCGGG CAGCGCGTCG CGGACGGTCT 480 GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAAAAATCG GCGCGGAACT 540 CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT ACGGCGGCAT 600 CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG GTGTTTTTGA 660 CGGTCAGGGC TGGTGTGCAT GGCGGTTGTT GCGGCTGAAA GGAACGGTAA AGACGCAATT 720 ATAGCAAAGG CACAGGCAAT GTTTCAGACG GCATTTCTGT GCGGCCGGCT TGATATGAAT 780 CAAGCAGCAT CCGCATATCG GAATGCAGAC TTGGCACAAG CCTGTCTTTT CTAGTCAGTC 840 CGCAGTTCTT GCAGTATGAT TGCACGACAC GCCCTACACG GCATTTGCAG GATACGGCGG 900 CAGACCGCGT CGGAAACTTC AGAATCGGAG CAGGCATC ATG TTG ACC CCC ACG 953 Met Leu Thr Pro Thr 1 5 CAG CAA GTC GGT TTG ATT TTA CAG TAC CTC AAA ACA CGC ATC TTG GAC 1001 Gln Gln Val Gly Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Thr Arg Ile Leu Asp 10 15 20 ATC TAC ACG CCC GAA CAG CGC GCC GGC ATC GAA AAA TCC GAA GAC TGG 1049 Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Arg Ala Gly Ile Glu Lys Ser Glu Asp Trp 25 30 35 CGG CAG TTT TCG CGC CGC ATG GAT ACG CAT TTC CCC AAA CTG ATG AAC 1097 Arg Gln Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe Pro Lys Leu Met Asn 40 45 50 GAA CTC GAC AGC GTG TAC GGC AAC AAC GAA GCC CTG CTG CCT ATG CTG 1145 Glu Leu Asp Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Ala Leu Leu Pro Met Leu 55 60 65 GAA ATG CTG CTG GCG CAG GCA TGG CAA AGC TAT TCC CAA CGC AAC TCA 1193 Glu Met Leu Leu Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr Ser Gln Arg Asn Ser 70 75 80 85 TCC TTA AAA GAT ATC GAT ATC GCG CGC GAA AAC AAC CCC GAT TGG ATT 1241 Ser Leu Lys Asp Ile Asp Ile Ala Arg Glu Asn Asn Pro Asp Trp Ile 90 95 100 TTG TCC AAC AAA CAA GTC GGC GGC GTG TGC TAC GTT GAT TTG TTT GCC 1289 Leu Ser Asn Lys Gln Val Gly Gly Val Cys Tyr Val Asp Leu Phe Ala 105 110 115 GGC GAT TTG AAG GGC TTG AAA GAT AAA ATT CCT TAT TTT CAA GAG CTT 1337 Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Pro Tyr Phe Gln Glu Leu 120 125 130 GGT TTG ACT TAT CTG CAC CTG ATG CCG CTG TTT AAA TGC CCT GAA GGC 1385 Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe Lys Cys Pro Glu Gly 135 140 145 AAA AGC GAC GGC GGC TAT GCG GTC AGC ACG TAC CGC GAT GTC AAT CCG 1433 Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Thr Tyr Arg Asp Val Asn Pro 150 155 160 165 GCA CTG GGC ACA ATA GGC GAC TTG CGC GAA GTC ATT GCT GCG CTG CAC 1481 Ala Leu Gly Thr Ile Gly Asp Leu Arg Glu Val Ile Ala Ala Leu His 170 175 180 GAA TCG CAT TTC CGC CGT CGT CGA TTT TAT CTT CAA CCA CAC CTC CAA 1529 Glu Ser His Phe Arg Arg Arg Arg Phe Tyr Leu Gln Pro His Leu Gln 185 190 195 CGA ACA CGA ATG GCG CAA CGC TGC GCC GGC GAC CCG CTT TTC GAC AAT 1577 Arg Thr Arg Met Ala Gln Arg Cys Ala Gly Asp Pro Leu Phe Asp Asn 200 205 210 TTC TAC TAT ATT TTC CCC GAC CGC CGG ATG CCC GAC CAA TAC GAC CGC 1625 Phe Tyr Tyr Ile Phe Pro Asp Arg Arg Met Pro Asp Gln Tyr Asp Arg 215 220 225 ACC CTG CGC GAA ATC TTC CCC GAC CAG CAC CCG GGC GGC TTC TCG CAA 1673 Thr Leu Arg Glu Ile Phe Pro Asp Gln His Pro Gly Gly Phe Ser Gln 230 235 240 245 CTG GAA GAC GGA CGC TGG GTG TGG ACG ACC TTC AAT TCC TTC CAA TGG 1721 Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr Thr Phe Asn Ser Phe Gln Trp 250 255 260 GAC TTG AAT TAC AGC AAC CCG TGG GTA TTC GCG CAA TGG CGG GCG AAA 1769 Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val Phe Ala Gln Trp Arg Ala Lys 265 270 275 TGC TGT TCC TTG CCA ACT TGG GCG TTG ACA TCC TGC GTA TGG ATG CGG 1817 Cys Cys Ser Leu Pro Thr Trp Ala Leu Thr Ser Cys Val Trp Met Arg 280 285 290 TTG CCT TTA TTT GGA AAC AAA TGG GGA CAA GCT GCG AAA ACC TGC GCA 1865 Leu Pro Leu Phe Gly Asn Lys Trp Gly Gln Ala Ala Lys Thr Cys Ala 295 300 305 GCG CAC GCC CTC ATC CGC GCG TTC AAT GCC GTT ATG CGT ATT GCC GCG 1913 Ala His Ala Leu Ile Arg Ala Phe Asn Ala Val Met Arg Ile Ala Ala 310 315 320 325 CCC GCC GTG TTC TTC AAA TCC GAA GCC ATC GTC CAC CCC GAC CAA GTC 1961 Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu Ala Ile Val His Pro Asp Gln Val 330 335 340 GTC CAA TAC ATC GGG CAG GAC GAA TGC CAA ATC GGT TAC AAC CCC CTG 2009 Val Gln Tyr Ile Gly Gln Asp Glu Cys Gln Ile Gly Tyr Asn Pro Leu 345 350 355 CAA ATG GCA TTG TTG TGG AAC ACC CTT GCC ACG CGC GAA GTC AAC CTG 2057 Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu Ala Thr Arg Glu Val Asn Leu 360 365 370 CTC CAT CAG GCG CTG ACC TAC CGC CAC AAC CTG CCC GAG CAT ACC GCC 2105 Leu His Gln Ala Leu Thr Tyr Arg His Asn Leu Pro Glu His Thr Ala 375 380 385 TGG GTC AAC TAC GTC CGC AGC CAC GAC GAC ATC GGC TGG ACG TTT GCC 2153 Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His Asp Asp Ile Gly Trp Thr Phe Ala 390 395 400 405 GAT GAA GAC GCG GCA TAT CTG GGC ATA AGC GGC TAC GAC CAC CGC CAA 2201 Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Gly Tyr Asp His Arg Gln 410 415 420 TTC CTC AAC CGC TTC TTC GTC AAC CGT TTC GAC GGC ACG TTC GCT CGT 2249 Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Arg 425 430 435 GGC GTA CCG TTC CAA TAC AAC CCA AGC ACA GGC GAC TGC CGT GTC AGT 2297 Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Asp Cys Arg Val Ser 440 445 450 GGT ACA GCC GCG GCA TTG GTC GGC TTG GCG CAA GAC GAT CCC CAC GCC 2345 Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Gly Leu Ala Gln Asp Asp Pro His Ala 455 460 465 GTT GAC CGC ATC AAA CTC TTG TAC AGC ATT GCT TTG AGT ACC GGC GGT 2393 Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Ala Leu Ser Thr Gly Gly 470 475 480 485 CTG CCG CTG ATT TAC CTA GGC GAC GAA GTG GGT ACG CTC AAT GAC GAC 2441 Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Val Gly Thr Leu Asn Asp Asp 490 495 500 GAC TGG TGC CAA GCA GCA ATA AGA GCG ACG ACA GCC GTT GGG CCA CCG 2489 Asp Trp Cys Gln Ala Ala Ile Arg Ala Thr Thr Ala Val Gly Pro Pro 505 510 515 TCC GCG CTA CAA CGA AGC CCT GTA CGC GCA ACC GAA CGA TCC GTC GAC 2537 Ser Ala Leu Gln Arg Ser Pro Val Arg Ala Thr Glu Arg Ser Val Asp 520 525 530 CGC AGC CGG CAA ATC TAT CAG GGC TTG CGC CAT ATG ATT GCC GTC CGC 2585 Arg Ser Arg Gln Ile Tyr Gln Gly Leu Arg His Met Ile Ala Val Arg 535 540 545 CAA AGC AAT CCG CGC TTC GAC GGC GGC AGG CTG GTT ACA TTC AAC ACC 2633 Gln Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly Gly Arg Leu Val Thr Phe Asn Thr 550 555 560 565 AAC AAC AAG CAC ATC ATC GGC TAC ATC GCA ACA ATG CGC TTT TGG CAT 2681 Asn Asn Lys His Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Thr Met Arg Phe Trp His 570 575 580 TCG GTA ACT TCA GCG AAT ATC CGC AAA CCG TTA CCG CGC ATA CCC TGC 2729 Ser Val Thr Ser Ala Asn Ile Arg Lys Pro Leu Pro Arg Ile Pro Cys 585 590 595 AAG CCA TGC CCT TCA AGG CGC ACG ACC TCA TCG GTG GCA AAA CTG TCA 2777 Lys Pro Cys Pro Ser Arg Arg Thr Thr Ser Ser Val Ala Lys Leu Ser 600 605 610 GCC TGAATCAGGA TTTGACGCTT CAGCCCTATC AGGTCATGTG GCTCGAAATC 2830 Ala GCCTGACGCA CGCTTCCCAA ATGCCGTCTG AACCGTTTCA GACGGCATTT GCG 2883 (2) 配列番号:2の情報 (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 614 アミノ酸 (B) 配列の型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: タンパク質 (xi) 配列の記載: 配列番号: 2: Met Leu Thr Pro Thr Gln Gln Val Gly Leu Ile Leu Gln Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Thr Arg Ile Leu Asp Ile Tyr Thr Pro Glu Gln Arg Ala Gly Ile Glu 20 25 30 Lys Ser Glu Asp Trp Arg Gln Phe Ser Arg Arg Met Asp Thr His Phe 35 40 45 Pro Lys Leu Met Asn Glu Leu Asp Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Ala 50 55 60 Leu Leu Pro Met Leu Glu Met Leu Leu Ala Gln Ala Trp Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp Ile Asp Ile Ala Arg Glu Asn 85 90 95 Asn Pro Asp Trp Ile Leu Ser Asn Lys Gln Val Gly Gly Val Cys Tyr 100 105 110 Val Asp Leu Phe Ala Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Pro 115 120 125 Tyr Phe Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe 130 135 140 Lys Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Ala Val Ser Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Asp Val Asn Pro Ala Leu Gly Thr Ile Gly Asp Leu Arg Glu Val 165 170 175 Ile Ala Ala Leu His Glu Ser His Phe Arg Arg Arg Arg Phe Tyr Leu 180 185 190 Gln Pro His Leu Gln Arg Thr Arg Met Ala Gln Arg Cys Ala Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Phe Asp Asn Phe Tyr Tyr Ile Phe Pro Asp Arg Arg Met Pro 210 215 220 Asp Gln Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu Ile Phe Pro Asp Gln His Pro 225 230 235 240 Gly Gly Phe Ser Gln Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr Thr Phe 245 250 255 Asn Ser Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val Phe Ala 260 265 270 Gln Trp Arg Ala Lys Cys Cys Ser Leu Pro Thr Trp Ala Leu Thr Ser 275 280 285 Cys Val Trp Met Arg Leu Pro Leu Phe Gly Asn Lys Trp Gly Gln Ala 290 295 300 Ala Lys Thr Cys Ala Ala His Ala Leu Ile Arg Ala Phe Asn Ala Val 305 310 315 320 Met Arg Ile Ala Ala Pro Ala Val Phe Phe Lys Ser Glu Ala Ile Val 325 330 335 His Pro Asp Gln Val Val Gln Tyr Ile Gly Gln Asp Glu Cys Gln Ile 340 345 350 Gly Tyr Asn Pro Leu Gln Met Ala Leu Leu Trp Asn Thr Leu Ala Thr 355 360 365 Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gln Ala Leu Thr Tyr Arg His Asn Leu 370 375 380 Pro Glu His Thr Ala Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His Asp Asp Ile 385 390 395 400 Gly Trp Thr Phe Ala Asp Glu Asp Ala Ala Tyr Leu Gly Ile Ser Gly 405 410 415 Tyr Asp His Arg Gln Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn Arg Phe Asp 420 425 430 Gly Thr Phe Ala Arg Gly Val Pro Phe Gln Tyr Asn Pro Ser Thr Gly 435 440 445 Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Ala Ala Ala Leu Val Gly Leu Ala Gln 450 455 460 Asp Asp Pro His Ala Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr Ser Ile Ala 465 470 475 480 Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Val Gly 485 490 495 Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Cys Gln Ala Ala Ile Arg Ala Thr Thr 500 505 510 Ala Val Gly Pro Pro Ser Ala Leu Gln Arg Ser Pro Val Arg Ala Thr 515 520 525 Glu Arg Ser Val Asp Arg Ser Arg Gln Ile Tyr Gln Gly Leu Arg His 530 535 540 Met Ile Ala Val Arg Gln Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly Gly Arg Leu 545 550 555 560 Val Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Thr 565 570 575 Met Arg Phe Trp His Ser Val Thr Ser Ala Asn Ile Arg Lys Pro Leu 580 585 590 Pro Arg Ile Pro Cys Lys Pro Cys Pro Ser Arg Arg Thr Thr Ser Ser 595 600 605 Val Ala Lys Leu Ser Ala 610 (2) 配列番号:3の情報 (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 配列の型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: 他の核酸 (A) 説明: /desc = "oligonucleotide" (vi) 直接の起源: (A) 生物名: Neisseria polysaccharea (xi) 配列の記載: 配列番号: 3: CTCACCATGG GCATCTTGGA CATC 24 (2) 配列番号:の情報 配列番号: 4: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 25 塩基対 (B) 配列の型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 分子の型: 他の核酸 (A) 説明: /desc = "oligonucleotide" (vi) 直接の起源: (A) 生物名: Neisseria polysaccharea (xi) 配列の記載: 配列番号: 4: CTGCCATGGT TCAGACGGCA TTTGG 25

Ｃ

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1は、プラスミドpNB2（DSM9196）を示す。
細い線は、クローニングベクターpBluescriptSK（-）の
配列に対応する。太い線は、ナイセリア・ポリサッカレ
ア（Neisseria polysaccharea）のゲノムDNAの約4.2kb
長の挿入配列を示す。アミロスクラーゼのコード領域
は、挿入配列の下の矢印で示す。挿入配列の上に配列を
決定した領域を示す。すべての数値は、この2883塩基対
の長さの領域に関する。

【図２】 図2は、形質転換した大腸菌（E. coli）細胞
をヨウ素蒸気に曝して発現させたアミロスクラーゼ活性
を示す。pBluescriptIISKプラスミド（A）で形質転換し
た大腸菌（E. coli）細胞、およびプラスミドpNB2（B）
で形質転換した大腸菌（E. coli）細胞を、YT培地（1.5
％寒天;100μg/mlアンピシリン;5％ショ糖;0.2mM IPT
G）上に蒔き、37℃で一晩インキュベートした。次にプ
レートをヨウ素蒸気に曝した。プラスミドpNB2で形質転
換した細胞のコロニーは、明瞭な青い光冠を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェルシュ トーマス ドイツ国 ベルリン ションブルグスト ラッセ 20 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/61 C12N 9/10 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物細胞中におけるDNA配列の発現を可能
   にするDNA配列と組合せた、以下の(a)〜(c)より選択さ
   れるアミロスクラーゼの酵素活性を有するタンパク質を
   コードするDNA配列を含有するトランスジェニック単子
   葉植物。 (a) プラスミドpNB2(DSM9196)のDNA挿入配列に含まれる
   ナイセリア・ポリサッカレア(Neisseria polysacchare
   a)由来のアミロスクラーゼをコードするコード領域によ
   ってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有する
   タンパク質をコードするDNA配列； (b) プラスミドpNB2(DSM9196)のDNA挿入配列に含まれる
   ナイセリア・ポリサッカレア(Neisseria polysacchare
   a)由来のアミロスクラーゼをコードするコード領域のヌ
   クレオチド配列を有するDNA配列； (c) (a)または(b)の配列のいずれかに厳密な条件下でハ
   イブリダイズするDNA配列;および (d) (b)または(c)に記載の配列と比較して遺伝コードの
   ため縮重しているDNA配列。
2. 【請求項２】アミロスクラーゼの酵素活性を有するタン
   パク質をコードするDNA配列が、 (a) 生物の細胞のゲノムDNAまたはmRNAに基づき、ゲノ
   ムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製する
   段階; (b) 段階(a)により構築されたライブラリーで適当な宿
   主を形質転換する段階; (c) 形質転換した細胞をヨウ素蒸気に曝す段階; (d) 青色に染色された細胞を同定する段階; (e) 段階(d)で同定された細胞を単離し培養する段階; (f) 形質転換された細胞からゲノムDNA挿入配列またはc
   DNA挿入配列を単離する段階、および (g) 単離されたDNA配列にコードされるタンパク質がア
   ミロスクラーゼ活性を有することを確認する段階、を含
   む方法により得られる、請求の範囲1に記載のトランス
   ジェニック単子葉植物。
3. 【請求項３】トランスジェニック単子葉植物が、トウモ
   ロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、またはサトウキビで
   あることを特徴とする、請求項1または2に記載の植物。