JP3183879B2

JP3183879B2 - ポリペプチドおよびこれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP3183879B2
Application number: JP50873089A
Authority: JP
Inventors: ロブソン、キャサリン、ジェーン、ハローズ; ホール、ジェニファー、ルース、サドラー
Original assignee: ３アイリサーチエクスプロイテーションリミテッド
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 2001-07-09
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: AU630885B2; DE68925970T2; JPH04503206A; DE68925970D1; US6491920B1; EP0428602B1; AU4064689A; US5811106A; GB8819209D0; EP0428602A1; WO1990001496A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒトのマラリア原虫によって産生されるポ
リペプチド、およびこれをコードするDNAに関する。こ
の発明はさらに、そのポリペプチドの調製法、これに対
する抗体、およびマラリアに対して使用する組成物に関
する。

プラスモディウム・ファルシパルム（Plasmodium fal
ciparum）によって引き起こされるマラリアは、今日の
世界で最も一般的な感染症の一つであって、世界人口の
40％ほどに脅威を与えている。これは、第３世界の疾病
といえる。毎年、１億５千万ないし３億の症例があり、
そのうちの１％以上の症例が致死的であって、乳児およ
び若年者が最も罹患しやすい。殺虫剤および第２次世界
大戦後に開発された新たな駆虫剤の登場によって、この
疾病が撲滅されるきざしが感じられた。初期の試みは確
かに成功を見たが、時の経過とともに、この原虫は、ク
ロロキンなどの薬剤に対する耐性を獲得し、媒介カ（ハ
マダラカ属）はDDTに対する耐性を獲得した。その結
果、この疾病との戦いに挑むには、新たな戦術の開発が
必要である。この疾病に対する免疫力は年令とともに増
大するので、風土病が存在する地域で疾病の撲滅を計画
した場合、抗マラリア薬および殺虫剤とともにワクチン
の開発が必要である。

世界中での今日的研究計画は、どんな抗原が有益なワ
クチンの成分を構成し得るかを決定することに係わって
いる。この寄生虫の複雑な生活環は、１つの抗原に基づ
く１種類の単純なワクチンでは不適当である可能性、お
よび有効なワクチンにはおそらく生活環中の様々な発生
・発達段階からの抗原が必要であることを意味する。

ヒトのマラリア原中（Plasmodium falciparum）は、
複雑な生活環をもち、生活環をめぐる間、特定の発生・
発達段階で様々な抗原が産生される。スポロゾイトの表
面に存在する大きな抗原はスポロゾイト周囲の（circum
sporozoite）、すなわちCSタンパクであって、おそらく
これは、この寄生虫と肝細胞との相互作用の特異性を決
定しているのであろう。CSタンパクは、領域Ｉおよび領
域IIという、２つの保存されたアミノ酸配列を含んでい
るが、これらは、あるアミノ酸配列の繰り返し部分によ
って隔てられている。

上記タンパクの遺伝子のクローニングは、様々なワク
チンの開発を可能にしてきた。今日まで、CSタンパクの
一部分を使ったワクチンの試みは、期待はずれに終って
いる。スポロゾイトに対する免疫作用によって、生活環
中の発病に結びつく赤血球期に移ることを必ずしも防げ
るというわけではない。スポロゾイトは１匹でも、免疫
系をのがれて発病させることがある。現在、CSタンパク
は、宿主細胞の認識に関与することが知られている、性
質の解明された唯一のタンパクである。メロゾイトは、
新鮮な赤血球に再感染可能な段階にあるものである。カ
の中における生殖母細胞の分化を阻止する抗体は、伝染
の環を断ち切るに有用である。その他で複雑なことは、
この寄生虫のみせる抗原性の多様な変化である。無性生
殖期の赤血球寄生虫に対するワクチンは、この疾病の重
症度を低下させるという部分的効果有していれば良い。
P.falciparumの無性生殖期の血中段階に対するワクチン
は、合成ペプチドの使用に基づいてパッタロヤ（Patarr
oya）ら（Nature Vol.332,1988,p158）によって開発さ
れたが、総合的な有効性は認められなかった。

我々は、CSタンパクと配列部分を共有するポリペプチ
ドが、この寄生虫の生活環の中の赤血球段階またはメロ
ゾイト段階に産生されることを見出した。

したがって、この発明は、ａ）式Ｉのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ｂ）ａ）と実質的に同様の構造および生物学的活性を有
するポリペプチド、ｃ）生物学的活性に有意に関与する、ａ）およびｂ）の
断片、誘導体および（突然）変異体、ｄ）生物学的活性に有意に関与する、ａ）、ｂ）および
ｃ）のオリゴマー、からなる群から選択されたポリペプチドを提供する。

当該分野の技術者ならば、構造上のいくつかの変異体
が自然界に存在する生物学的活性を有するポリペプチド
に生じること、および特にマラリアのタンパクが様々な
抗原性の変化を示すことが理解されよう。構造的変異体
が、例えば、赤血球の寄生虫認識、赤血球への付着及び
メロゾイトの侵入への関与など、目的とする生物学的活
性を失わなければ、そういった変異体は本発明の範囲内
に含まれる。

式Ｉは、T.9/96として知られるタイ国産のP.falcipar
umの単離クローン株のものであるが、本発明の範囲に
は、例えば、KIとして知られるもう一つのタイ国産単離
株のものも含まれる。この単離株のものは、Hinf 制限
酵素切断部位を欠く点、およびBgl II部位を余分に有す
る点で、T9/96のものとは異なっていることが知られて
いた。なお、これは配列決定によって確認された。KIか
らのポリペプチドは、第１表に示すごとく、細部ではT9
/96のものと異なっているが、両者の保存領域に変化は
なかった。

T9/96とK1の両者は、英国のエジンバラ大学遺伝学部
門、マラリア原虫標準株WHO登録所（the WHO Registry
of Standard Strains of Malaria Parasite,Dept.of Ge
netics,University of Edimburgh,U.K.）から入手可能
である。

一般に、アミノ酸残基の約５％の変異は許容範囲であ
るが、当該分野の技術者には理解されているように、分
子内のある領域や残基は、他の領域や残基よりも重要で
あり、例えば生物学的活性に重要な役割を果す保存領域
（例えば、式III TRPAで示される領域及びその周辺）の
変異に対する許容範囲は小さいが、抗原性に重要な領
域、例えば、RGD配列（式Ｉの残基307〜309）は変異し
やすい。なお、ここで用いるTRPAは、「トロンボスポン
ディン関連無名タンパク（Thrombospondin related ano
nymous protein）」を示す略号であって、本発明の１つ
以上のポリペプチドを表す。他の領域は、あまり重要で
はないが、NPまたはPN配列に関連した若干の生物学的活
性を示す。ここでの「保存」とは、比較するタンパク間
でアミノ酸残基配列の相同性が有意に高いことである。
例えば、第III表に示すように、約244番目残基付近から
約291番目の残基付近までの領域は、種々のマラリア原
虫から得られたCSタンパク、及びトロンボスポンディン
やプロパージン（Properdin）の骨格タンパクと有意な
相同性を有する。相同性の程度に様々の厳格な規定を設
けることは不可能であるが、多くの例で、80％を越える
ものを有意とすべきである。

本発明はまた、上記ポリペプチド断片、好ましくは保
存配列を含む断片、例えば、式Ｉで示されるアミノ酸残
基244から291にかけての領域の断片、および特には下記
の群から選ばれたポリペプチド断片を提供する。

ａ）WDEWSPCSVTCGKGTRSRKR ｂ）WDEWSPCSVTCGKGTR ｃ）EWSPCSVTCGKG ｄ）PCSVTCGKG ｅ）WSPCSVTCG これらの式中の文字は、天然に存在する以下のＬアミ
ノ酸を示す。

（Ａ）アラニン、（Ｃ）システイン、（Ｄ）アスパラ
ギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｆ）フェニルアラニ
ン、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）ヒスチジン、（Ｉ）イソロ
イシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ）ロイシン、（Ｍ）メチオ
ニン、（Ｎ）アスパラギン、（Ｐ）プロリン、（Ｑ）グ
ルタミン、（Ｒ）アルギニン、（Ｓ）セリン、（Ｔ）ス
レオニン、（Ｖ）バリン、（Ｗ）トリプトファン、
（Ｙ）チロシン。

本発明のポリペプチド誘導体は、例えば、アミノ基、
水酸基、メルカプト基またはカルボキシル基といった官
能基を変化させて誘導体としたものであって、それぞ
れ、例えばグリコシル化、アクリル化、アミド化または
エステル化されたものである。グリコシル化誘導体で
は、一般に、オリゴ糖が、アスパラギン、セリン、スレ
オニンおよび／またはリシンに結合している。アクリル
化誘導体は、特に天然に存在する有機または無機酸（例
えば、酢酸、リン酸または硫酸）によってアクリル化さ
れたものであり、これは、それぞれ例えば、Ｎ末端アミ
ノ基または水酸基（特に、チロシンもしくはセリンの水
酸基）のところで生じるのが一般的である。エステル類
は、天然に存在するアルコール（例えば、メタノールま
たはエタノール）とのエステルである。

さらに別の誘導体は塩であって、特には、薬理学的に
許容性のある塩、例えば、アルカリ金属およびアルカリ
土類金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カルシウムもしくは亜鉛の塩）といった金属塩、
またはアンモニア、もしくは低級アルキルアミン（例え
ば、トリエチルアミン）、ヒドロキシ低級アルキルアミ
ン（例えば、２−ヒドロキシエチルアミン）などの適当
な有機アミンとで形成されるアンモニウム塩である。

本発明のポリペプチドの（突然）変異体は、１つ（点
突然変異）またはそれ以上約10までのアミノ酸が、１つ
以上のアミノ酸で置換されるということに特徴がある。
これは、DNAレベルで対応する（突然）変異が起きて、
コドンに変化が生じた結果である。

また、本発明には、前記ポリペプチドのオリゴマー
（例えば、２量体および３量体）がその範囲内に含まれ
る。こういったオリゴマーは、天然に存在する可能性も
あり、生物学的活性の発現にとって重要である。この
「オリゴマー」には、共有結合した分子、および水素結
合などの弱い分子間結合によって重要な立体配座型に結
合した分子の両者が含まれる。

さらに本発明は、上述の本発明のポリペプチドをコー
ドするDNA配列を提供する。P.falciparumのT9/96株のア
ミン酸配列をコードするDNA配列は式Ｉに示されるが、
この発明の範囲は、それがコードするアミノ酸を変化さ
せない変異型、ならびに天然に存在する突然変異型およ
び上記のKIをコードする変異型にも及ぶ。

本発明のDNAは、当該分野で既知の方法によって、マ
ラリア原虫DNAおよびゲノムライブラリーから回収する
ことができる。そして、一度配列が分かってしまうと、
直接的増幅手段（例えば、サイキ（Saiki）ら、Scienc
e、1985、Vol.230、PP1350−1354のPCR（Polymerase ch
ain reaction）が利用できる。

本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基数が大きすぎ
ない場合には化学合成によって作製することができ、ま
たは宿主／ベクター発現系における適当なDNA配列の発
現によって作製することもできる。

所望のDNAと、プロモーター、マーカー遺伝子など他
の機能的配列を含む組換えベクターは、当該分野で既知
の方法によって作製することができる。

適切なベクターとしては、pUC13（ファルマシア社）
またはpAcYMI［ウイルス学研究所、マンスフィールド・
ロード、オックスフォード、英（Inst.of Virology,Man
sfield Road,Oxford,England）］に本発明のDNA配列を
クローン化した組換えDNAが挙げられる。

組換えウイルスベクターは、当該分野で既知の方法に
よって所望のDNA配列をウイルスDNAの中に取り込ませる
ことによって得ることができる［例えば、「DNAクロー
ニング」、II巻、ディー・エム・グローバー、1985年発
行、IRLプレス、オックスフォード、英国、（DNA Cloni
ng,Volume II,D.M.Glover,published 1985,IRL Press,O
xford,England）を参照］。本発明における適切な方法
の一つとして、適当な宿主細胞への同時トランスフェク
ション（Co−transfection）法による、プラスミドとウ
イルスとの組み合わせが挙げられる。

例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera f
rugiperda）細胞中でオートグラファ・カリフォルニカ
（Autographa carifornica）核多角体病ウイルス（AcNP
V）とともに、以下でpKKJ17と称するプラスミドを用い
て、本発明のDNAを含む組換えウイルス例えば、以下でv
KKJ17と称する組換体を複製させて、これを単離するこ
とができる。

本発明の他の態様に従えば、本発明のポリペプチドに
対する抗体が提供される。これらの抗体は、当該分野で
既知の手法によって作製することができる（例えば、An
tibodies,A Laboratcry Manual,E.Harlow and D.Lane,C
old Spring Harbour、1988年、参照）。

本発明のポリペプチドは、マラリアに対するワクチン
などの調製に有用である。この目的で、これらポリペプ
チドを有効成分として、適当な担体中にアジュバントと
ともに（可能ならば、その他の免疫学的活性物質ととも
に）取り込ませ、これを用いてマラリア原虫の様々な段
階に対する防御力を与えることができる。

本発明をその技術的および理論的な面から本発明を明
らかにするために論じるが、本発明の有用性は、理論的
に解決された細部に限定されるわけではないことを理解
すべきである。

本発明のポリペプチドは、他のよく性質が分かったタ
ンパクと共通するアミノ酸配列部分を共有している。も
っとも重要な相同性は、アミノ酸配列WSPCSVTCGの付近
に基づくものであって、このコピー配列がトロンボスポ
ンディン（TSP）の領域Ｉに３個所、プロパージン
（Ｐ）には６個所、全ての配列既知のスポロゾイド周囲
タンパクに１個所同定された。さらに、このアミノ酸配
列の相同性は、TSPを含む細胞外糖タンパク、すなわち
細胞認識シグナル（RGD）にもみられ、これは、種々の
細胞外糖タンパクとインテグリンスパーファミリーのメ
ンバーとの相互作用といった面で極めて重要であること
が分かっている。このようなトロンボスポンディンとの
関係から、本発明のポリペプチドを、トロンボスポンデ
ィン関連無名タンパク（すなわちTRPAタンパク）と呼
ぶ。CSタンパクとは異なって、TRPAタンパクは、マラリ
ア原虫の生活環の赤血球段階で発現する。

P.falciparumゲノム中のCSタンパク関連配列を検索す
るために、領域IIに対応するACC.ATT.TCC.ACA.GGT.TAC.
ACT.ACA.TGGからなる配列（式II Aに示す）を有するオ
リゴヌクレオチドプローブを用いて、P.falciparum（T9
/96）DNAゲノムのサザーンブロットを行った。T9/96
は、タイ国産のP.falciparumのクローン化分離株であっ
て、Dept.of Genetics,Institute of Animal Genetics,
kings Buildings,West Mains Road,Edinburgh,UK,から
入手可能である。予期された9kbのEcoR I断片および800
kbのBstN I断片を検出した。同一のプローブを用いて、
２つのP.falciparum DNAゲノムライブラリーをスクリー
ニングした。それらの一方はEcoR Iでの完全消化物をλ
gt11中にローン化したものであって、もう一方はEcoR I
部分消化物をλgt10中にクローン化したものである。こ
れらの２つのベクターでの上限が8kbであるため、真のC
Sタンパク配列をこれらライブラリーのいづれかに見い
出せるとは予期していなかった。数種のクローンが単離
され、それらのすべては2.35kbのEcoR I断片を共通にも
っていた。この断片からのDNA配列、およびEcoR I断片
と近接する部分のDNAの配列を決定した（式Ｉに示
す）。上記のオリゴヌクレオチドによって検出された配
列、およびそのプローブ配列を式II Aに示した。これに
は、メチオニン残基で始まるオープンリーディングフレ
ーム（式Ｉ参照）が存在し、これは559個のアミノ酸か
らなる長さのもので、分子量63,300のタンパクをコード
する。このアミノ酸配列は、保存されたノナペプチドの
Trp−Ser−Pro−Cys−Ser−Val−Thr−Cys−Glyを含
み、これにより、なぜ上記のプローブによって式Ｉの新
しい遺伝子が検出されたかが説明できる（式II B参
照）。この配列およびその変異型は、TSP、CSタンパク
およびプロパージン中に見い出される。式IIIには、式
ＩのTRAPタンパクと、P.falciparum（P.f.）、P.vivax
（P.v.）、P.knowlesi（P.k.）、P.cynomolgiロンドン
株（P.c.）、P.berghei（P.b.）及びP.yoelii（P.y.）
から得られたCSタンパク配列、TSPおよびプロパージン
の骨格との間における、保存配列の相同性を示す。

配列の解析は、ALIGNプログラム［ダイホッフ（Dayho
ff）ら、Meth.Enzymol.91,524−545（1983）］を用いて
実施した。アミノ酸は１文字で表わし、TRAPと共通の残
基は四角で囲んだ。

TRAPタンパクのアミノ酸配列には、いずれの分子末端
にも疏水性ドメインが見られた。アミノ末端にある第１
のものは、おそらくシグナル配列であり、カルボキシ末
端にある第２のものは、膜通過のための配列に類似して
いる。保存アミノ酸配列中及びその付近にかけてシステ
イン残基のクロスターが存在するが、これは、分子間お
よび分子内ジスルフィド結合によって形成される二次構
造を示唆するものである。これらシステイン残基は、CS
タンパク、TSPおよびプロパージンの保存領域近傍の似
かよった位置にある。そういった二次構造が形成される
という証拠は、領域IIを含むCS由来ペプチドに対する抗
体が未変成および変成CSタンパクの両方に対する反応性
が乏しいという高度の立体配置を示唆する事実から得ら
れるものである［バーロウ（Ballow）ら、Science 228,
996−999（1985）］。この配列は、保存領域以外におい
てプロリンに富んでいるが、その他多くのマラリアタン
パクに特徴的な繰り返し構造の一部を形成するものでは
ない。RGD部分（アミノ酸307〜309）は上記配列に含ま
れているが、これは、細胞認識に関与する多くの糖タン
パクの特徴部分である。TRAPは、この主要部分を有する
最初のマラリアタンパクである。TSPは、こういったRGD
部分および第VIII a因子との架橋に関係するIQQ部分を
持ち、TRAPもIQQ部分（アミノ酸76〜78）を備えてい
る。Ｎグリコシル化を可能とする４つの部位が存在す
る。ほとんどのマラリア抗原と同様に、そのアミノ酸組
成は、アスパラギン酸およびプロリンが特に豊富という
点で際立っている。

CSタンパク遺伝子は、マラリア原虫生活環のスポロゾ
イト段階でのみ発現される。無性生殖の原虫で発現する
異なったタンパク（CRAまたはAg5.1）は、CSタンパクの
NANP繰り返し構造に対するモノクローナル抗体と交叉反
応するエピトープを有する。このタンパクのアミノ酸配
列に関するデータから、（NANP）_２との相同性領域は明
らかになったが、CSタンパクに特徴的な他の配列は分か
らない。

CS遺伝子プローブを用いたノーザンブロットでは、赤
血球段階でのいかなる種類のRNAも検出されなかった。T
RAP遺伝子（式Ｉに示す）をプローブとして用いた同様
の解析（図1C参照）で、約20Sの各種RNAが、検査した２
つの分離物（ITOおよびFCR3A2）中に検出された。これ
は、TRAP遺伝子が生活環の赤血球段階で発現されるが、
EBVでの形質転換リンパ球では発現されないこと、およ
びTRAPプローブでは夾雑物のために血中に存在するヒト
の配列は検出できず、したがってTRAPプローブは原虫特
異的であることを示唆した。転写されたRNAの大きさ
は、分子量63,300のタンパクをコードするRNAに匹敵す
る。抗体が、TRAP/β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
に対して形成された。ウエスターンブロットを用いる
と、これらの抗体は、約65kdのタンパク（TRAP遺伝子産
物として予想された大きさ）、および成熟した感染赤血
球表面抗原（MESA）および332など、多数の他のタンパ
クと反応する。TRAPの推定されるアミノ酸配列から、Gl
u−Glu（Ｅ−Ｅ）部分を中心とする配列からなる多くの
部分が存在することが分かり、このことにより交叉反応
が説明できる。間接免疫蛍光法では、TRAPは分裂生殖の
最終段階で合成されることが示唆されている。

P.falciparumの脊椎動物および無脊椎動物段階の両段
階に見られる高度の保存部分は、トロンボスポンディン
およびプロパージンにも存在し、この事実は、TRAPタン
パクの重要な機能を発揮することを示唆している。スポ
ロゾイトのCSタンパクの認識および肝細胞への侵入にお
ける役割が考えられる。領域Ｉから得られる合成ペプチ
ドはin vitroにおいて肝細胞に特異的に結合するが、領
域IIに関するこの種の研究報告は見られない。他の２つ
の原虫−細胞相互作用は、P.falciparumの生活環に極め
て重要である。病原性の強さは、原虫が血管床深く封鎖
される性質に関係する。この過程は、赤血球細胞表面上
で原虫により誘導された変更と内皮細胞上の受容体との
相互作用に依存するものであって、トロンボスポンディ
ンが関与する。トロンボスポンディン自体及びトロンボ
スポンディン抗体の両者は、この封鎖についてのin vit
roでのモデルにおける感染赤血球細胞の細胞粘着を阻害
した。この事実は、血小板糖タンパクIV（トロンボスポ
ンディン受容体）が細胞粘着に重要な役割を担うとする
証拠と併せて考察すると、感染赤血球上における原虫誘
導性のトロンボスポンディン類似体の存在と矛盾しな
い。細胞粘着抗原PfEMPIの分子量は、300kdと考えら
れ、TRPAもその例外ではない。すなわち細胞粘着が宿主
タンパクの原虫による変異に関与し、TRPAがこの機能を
果す証拠が得られているからである。

その他の原虫−細胞相互作用には、遊離のメロゾイト
による赤血球の認識およびこれへの侵入が挙げられる。
もしもTRPAが遊離メロゾイトの表面に存在しているなら
ば、C3bに結合するプロパージンとの相同性が、赤血球
表面上におけるC3bおよびその分解産物の認識という機
能を持つであろう。極めて関連性の深い原虫、ベベシア
・ローディアニ（Babesia rhodiani）によって、C3bが
関与した赤血球への侵入を調べる手法が開発された。P.
falciparumの赤血球細胞への侵入には血清中の補体成分
を必要としないという観察結果は、赤血球細胞表面はす
でにある補体成分の関与を否定するものではない。

以下、本発明の実施例および他の技術的詳細事項を、
添付の式および図面を参照して説明する。

式Ｉは、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基配列
（アミノ酸を１文字で表わす）、および隣接する非コー
ド配列をともなうそれをコードするDNAのヌクレオチド
配列を示す。ヌクレオチドには１から3102の番号をふ
り、アミノ酸残基には、312〜1989番のこれをコードす
るヌクレオチドに対応させて１から559の番号をふっ
た。

式II Aは、27塩基のオリゴヌクレオチドプローブと、
それによって、P.,falciparumのλgt11ゲノムライブラ
リーから検出されたDNA配列との比較を示す。

式II Bは、アミノ酸配列とプローブ配列に相補的なヌ
クレオチド配列の比較を示す。

式IIIは、式Ｉで示されるポリペプチドと他のタンパ
クにおけるノナペプチド保存部分及びその近傍のアミノ
酸配列の比較を示す。

図1Aは、プローブとして使った図１のポリペプチドと
ハイブリダイズした、P.falciparumのクローン化T9/96
系から得られたDNAのサザーンブロット解析を示す。

図1Bは、図4Aと類似しているが、CSタンパクプローブ
とハイブリダイズしたものを示す。

図1Cは、EBVで形質転換させたリンパ球および２つの
P.falciparum分離株から得られた総RNAのノーザンブロ
ット解析を示す。

図２および図３はそれぞれ、本発明によって提供され
るプラスミドpKR5およびpKKJ17の概略図であって、制限
酵素切断部位およびその他の特徴を示す。

式II Aおよび式II Bを参照にして、27塩基のオリゴヌ
クレオチドを、CSタンパクの領域IIにおけるアミノ酸配
列PCSVTCGNGから合成した。DNAとRNA配列の両方を検出
することができるように、相補鎖を合成した。このオリ
ゴヌクレオチドは、固体担体にホスホアミダイト（Phos
phoramidites）のモノマーを添加することによるアプラ
イトバイオシステムズモデル（Applied Biosystems mod
el）308A（登録商標）の合成装置で合成した。脱保護し
たプローブを、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。末端標識化オリゴヌクレオチドを使
用して、λgt11のEcoR I部位にクローン化したP.falcip
arum T9/96DNAのEcoR I消化産物のプラーク４×10⁵個
（大腸菌Y1088上で）をスクリーニングした。６つの陽
性プラークを同定し、これを再度スクリーニングにかけ
た。これらは、2.35kbのEcoR I断片を含んでいた。ハイ
ブリダイゼーションは、５×Denhardt's、0.5％NP40お
よび剪断サケ精子DNA100μg/mlを含む６×NET（１×NET
＝0.15M NaCl、0.015N Tris−HCl pH8.0、０、1mM EDT
A）中で37℃16時間行った。洗浄は、0.1％SDSを含む６
×SSC（１×SSC＝0.15M NaCl、0.15Mクエン酸ナトリウ
ム）中で37℃にて行い、続いて、同溶液中で60℃にて１
回行った。濾紙は、予備露光したＸ線フイルムととも
に、16時間オートラジオグラフィーにかけた。

λgt11ファージから得られた2.35kbのEcoR I挿入断片
を、pUC8およびM13mp10にサブクローニングした。この
断片の配列決定をジデオキシ法で行なった結果、不完全
なオープンリーディングフレームが見付かった。第２の
ライブラリーは、λgt10中にT9/96のEcoR I部分消化断
片をクローン化することによって作製し、これを先の2.
35kb断片でスクリーニングした。1.1×10⁵個のプラーク
（大腸菌NM514上で）をスクリーニングし、先のものと
重複する部分を有する配列をもつクローンが得られた。
TRAP遺伝子およびその隣接配列からなる完全なDNA配列
は、サンガー（Sanger）らのDNA末端配列決定法［J.Mo
l.Biol.,143,161−178（1980）］を用いて決定した。そ
の配列情報は、DNA両鎖の配列決定を可能とする、M13mp
10への「ショットガン」クローニングによるクローンか
ら得られた。ギャップは、常法による合成に用いられる
オリゴヌクレオチドプライマーを使って埋めた。この手
法は、制限酵素切断部位のないところからDNA配列を切
り出すのに最も有効な方法であることが分かった（これ
はＡ−Ｔに富んだDNA領域での問題点であった）。デー
タの解析には、スターデン（Staden）のDNA配列処理プ
ログラム（DNA sequence handling programmes）［Nuc
l.Acids Res.,10,4731−4751（1982）］を用いた。オリ
ゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする部位は、
式Ｉに下線で示す。Ｎグリコシル化を起こす可能性がつ
よい部位にあるアスパラギン残基には、アステリクス
（★）を付した。RGD配列（残基307〜309）には上に線
を引いた。IQQ部分（残基76〜78）は四角で囲んだ。

図1Aおよび図1B（サザーンブロット）では、レーン１
〜11は、それぞれ、Asp718、BamH I、Bql II、EcoR I、
Hinc II、Hind III、Taq I、BastN I、Hha I、Hpa II、
およびMsp Iの制限酵素による消化物での結果を示す。

図1C（ノーザンブロット）では、レーン１がEBV形質
転換リンパ球（25μｇ）での結果を、レーン２がP.falc
iparum分離株ITO（ブラジル株、25μｇ）での結果を、
およびレーン３がP.falciparum FCR3A2（ロックフェラ
ー株、クローン化、25μｇ）での結果を示す。

サザーンブロッティングおよびハイブリダイゼーショ
ンは、ウー（Woo）らの報告［Nature 306,151−155（19
84）］に従って実施した。ノーザンブロッティングは、
ロッブソン（Bobson）らの報告［Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,79,4701−4705（1982）］に従って実施した。ハイボ
ンドＮ（Hybond−N:登録商標）膜を使えば、同じ濾紙を
再びハイブリダイゼーションすることができた。パネル
Ａ（図1A）の濾紙は、初めに、TRAP配列に対応する２つ
のEcoR I断片でハイブリダイズさせ、シグナルを除去し
てから、CSタンパク遺伝子配列を含む断片で再びハイブ
リダイズさせた。パネルＣ（図1C）のプローブは、パネ
ルＡのものと同一であった。パネルＣの濾紙も、パネル
Ｂ（図1B）と同じプローブでハイブリダイズさせたが、
ハイブリダイズを示すシグナルは認められなかった。

本発明のポリペプチドおよびDNAを純粋な形で大量に
産生させるために、以下の手順を踏んだ。

複数の精製β−ガラクトシダーゼTRAP融合タンパクに
対するポリクローナル抗体を作製した。タンパクの精製
で界面活性剤およびポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる変性が生じた結果、重要な立体配座エピトープがす
べて破損された。ウエスターンブロットにおいて、これ
らの抗体は他の原虫抗原も認識したので、これらを培養
原虫からの未変性TRAPの精製に使用することはできなか
った。したがって、正確に調製でき、簡単に精確できる
大量の未変性タンパクを産生できるように設計した真核
細胞用の発現ベクターを用いる代わりの方法を行なうこ
とを決めた。

可能性のある発現系として、バキュロウイルスを利用
するものがあげられた。バキュロウイルス発現系によっ
て、真核細胞環境での外来遺伝子の高レベル発現が可能
である。天然遺伝子の調節、すなわち、非常に遅いが大
量発現の可能なポリヘドリン（Polyhedrin）遺伝子の発
現を利用する。バキュロウイルスゲノムのサイズが大き
いため、通常組換えウイルスの作製は、目的の遺伝子と
ウイルスの対立遺伝子とを置換する生体内での組換えに
より行なわれている。組換え用のプラスミドには、外来
遺伝子の挿入のための部位、及びこれに隣接する組換え
のための相同配列としてのウイルスの配列が含まれる。
細胞へウイルスDNAと組換え用のプラスミドDNAを同時に
トランスフェクションすることによって、プラスミド中
の外来遺伝子領域と標的ウイルス遺伝子との間で細胞媒
介による対立遺伝子の置換（組換え）が生じる。

外来遺伝子のバキュロイウルス発現系で十分に発現さ
せるには、これら遺伝子は、イントロン、ならびに５′
および３′隣接配列の大部分が除かれるように加工する
必要がある。TRAP遺伝子はイントロンを含まないので、
遺伝子増幅法（PCR）を用いて、BamH I制限酵素切断片
として全オープンリーディングフレームを有する図１の
TRAP遺伝子を加工し、これをトランスファーベクターpA
cYMI［英国、オックスフォードのウイルス学研究所（In
stitutr of Virology,Oxford,England）から入手可能］
中にクローン化した。

これは以下のように実施された。BamH I部位、ならび
にTRAP遺伝子の５′および３′末端を有するオリゴヌク
レオチドプライマーを設計した。これら２つのプライマ
ーは以下のとおりである。

下線部の配列は、コーディング領域のそれぞれの末端
に相当する。この下線部分には、プライマーＡではコー
ド鎖がそのまま、プライマーＢでは相補鎖が用いられて
いる。このプライマーは、DNAが常に５′末端から３′
末端方向に合成されるので、必要である。M13中にサブ
クローンされたT9/96ゲノム由来のDNAが増幅された。こ
の反応は、サイキ（Saiki）らの方法［Science、1985、
Vol.230、PP1350−1354］に従って、Taclポリメラーゼ
［（1mM）オリゴヌクレオチドプライマーＡおよびＢ、1
0mMデオキシヌクレオシドトリフォスフェート、ならび
に1ngのRV9（M13中へのTRAPのサブクローン）］を使っ
て開始させた。サイクルの温度および時間は、93℃で１
分間、37℃で１分間、72℃で５分間であって、サイクル
の回数は、15回であった。増幅終了後、反応混合物全体
をフェノール／クロロホルムで抽出し、続いて、ゲル濾
過によって未反応のデオキシヌクレオシドトリフォスフ
ェートを除去した。このDNA産物の末端は、デオキシリ
ボヌクレアーゼＩのクレノー断片および新しいデオキシ
ヌクレオシドトリフォスフェートを用いて修復した。反
応を再びフェノール／クロロホルム抽出によって終了さ
せて、セファデックスG50/80のゲル濾過を行った。この
DNAの５′末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび
アデノシントリフォスフェートでリン酸化した。反応は
フェノール／クロロホルム抽出で終了させ、DNAをプロ
パン−２−オール沈澱によって回収した。この物質を、
T4DNAリガーゼおよびpUC13（ファルマシア社）をSam I
で消化し、フォスファターゼで処理したものを用いた連
結反応の基質として使用した。所定の挿入片を含む構成
物が得られ、DNA配列決定によってそれらの真偽が確か
められた。そのプラスミドの一つをpKR5とした。BamH I
消化によってpUC13から断片を得ることができるが、こ
れは、必要な制限酵素切断部位によって組換え用プラス
ミドpAcYM1への転移が可能になることを示している。そ
こで、pKR5をBamH IおよびHea IIIで消化処理し、反応
をフェノール／クロロホルム抽出で停止し、エタノール
沈澱を行なった。この消化処理は、pAcYM1のBamH 1部位
への連結に先立って、所定の1.7kbBamH 1断片のゲル精
製を省略するために実施した。上記と同様の連結および
形質転換の操作を、この挿入用断片および新しいベクタ
ーpAcYM1を用いて実施した。再び、所定の断片を含む構
成物が得られた。ポリヘドリンプロモーターに対する、
TRAP配列を含む挿入断片の方向は、制限酵素切断地図お
よび配列決定によって確認した。この構成物をpKKJ17と
命名し、制限酵素切断地図は図３に示す。このプラスミ
ドは、NCIMB（National collections of Industrial an
d Marine Bacteria）［Torrey Research Station,P.O.B
ox 31,135 Abbey Road,Aberdeen,AB9 8DG,U.K.］へ寄託
番号NCIMB40,164で1989年７月14日に寄託された。

pKKJ17を用いて、以下のように、スポドプテラ・フル
ギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフ
ェクションを行うことができた。25μｇのpKKJ17および
塩化セシウムで精製したオートグラファ・カリフォルニ
カ（Autographa Californica）核多角体病ウイルス（Ac
NPV）DNA1μｇを10mMグルコースおよび125mM CaC12を
含むHepes緩衝生理食塩水液（pH7.5）中に加えた。カル
シウム−DNA錯体を45分で形成させてから、プレートに
播種したてのSp.frugiperda細胞（1.5×10⁶個細胞）に
添加して、室温で１時間インキュベーションした。DNA
沈澱物を除去し、新鮮培地（TC100）を添加して、細胞
変性効果が認められるまで細胞を20℃でインキュベーシ
ョンした（トランスフェクション後３日）。これらの細
胞で産生されたウイルスは、野生型のAcNPVとTRAPを含
む組換型AcNPVとの両者であった。力価測定後のプラー
ク精製によって、純粋な組換型ウイルスが得られた。こ
れは、野生型AcNPVは完全なポリヘドリン遺伝子を持っ
ているので封入されたプラークを形成したが、組換型は
これを形成しなかった、という事実によっても確認でき
た。こういった２つのタイプの差異は、光学顕微鏡でも
認めることができた。

１回目のトランスフェクションの後、１つの組換型プ
ラークが認められ、これを精製した。塩化セシウム精製
したウイルスDNAを初期の段階で使用したところ、200個
のプラークのうち約１個が組換型であった。組換型ウイ
ルスはvKKJ17と命名され、1989年７月14日にEuropean C
ollection of Animal Cell Cultures（ECACC,Public He
alth Service Laboratory,Centre for Applied Microbi
ology and Research,Porton Down,Salisbury,Wiltshir
e,SP4 OJG,United Kingdom］に寄託番号89071402で寄託
された。

AcNPVは、バキュロウイルス科の原栄養株ウイルスで
ある。このウイルスを、Sp.frugiperda細胞にインフェ
クションしたとき、２つの型の子孫ウイルス、すなわ
ち、細胞外ウイルス粒子および封入ウイルス粒子が得ら
れた。封入ウイルス粒子は、ポリヘドリンタンパクを含
むタンパク様物質に包理されている。光学顕微鏡下で
は、これらは多角体として観察される。昆虫の幼虫への
感染がこれら粒子の注入によって起きるので、これらの
ウイルス封入体は生活環の重要な一部である。

組換型ウイルスのvKKJ17は、ポリヘドリン遺伝子を欠
くので、封入粒子を形成することができない。このポリ
ヘドリン遺伝子は、TRPA遺伝子によって置換された。そ
の結果として、vKKJ17ウイルスは、組織培養システム
（Sp.frugiperda）では感染性を保持しているが、昆虫
の幼虫には感染できない。TRPAタンパクは、ポリヘドリ
ンタンパクの調節下で発現する。これは、TRPAタンパク
の合成が感染後20時間で始まることを表している。ポリ
ヘドリンタンパクは野生型ウイルスで最も多量に含まれ
るタンパクであって、通常、ポリヘドリンプロモーター
による発現により、外来遺伝子から目的とするタンパク
が高レベルで産生する。vKKJ17では、TRPA配列は、すべ
てのポリヘドリンをコードする配列の全部を置換してい
るBamH I断片上にある。

バキュロウイルスは、DNAが感情構造をとる２本鎖DNA
ウイルスである。このDNAの大きさは、135kbである。

TRPAの産生は、Sp.frugiperda細胞を組換型ウイルスv
KKJ17に感染させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびウエスタン法によって調べる前に、この細胞を72
時間増殖させた。検出システムに使用した抗体は、β−
ガラクトシダーゼ融合物質を用いて作製したウサギのポ
リクローナル抗体であった。この組換ウイルスは、実際
に、この発明のTRPAポリペプチドを合成した。さらに解
析を進めると、この物質が培養上清中に分泌されること
が判明した。この特性は精製に役立った。

感染を多発させる際に、血清含有培地でSp.frugiperd
a栽培を培養し続ける必要はない。この事実を利点とし
て利用し、細胞のvKKJ17での感染を多発させ、血清不存
在下で72時間28℃でインキュベーションした。感染細胞
は、遠心によって除いた（ベックマンJA10 4K、４℃10
分間）。

TRAPおよびウイルス粒子を含む清澄化上清を、（N
H₄）₂SO₄沈澱とそれに続く透析によって濃縮した。この
ウイルス粒子は遠心（ベックマンJA10 4K、４℃10分
間）によって除去した。この物質をイオン交換クロマト
グラフィーにかけた（Mono Ｑ、ファルマシア、LK
B）。TRAPを含む画分は、凍結乾燥によって濃縮した
後、さらにゲル濾過（TSK G3000、ファルマシア、LKB）
によって精製した。TRAPの純度は30％、おそらくは90％
を上回っており、一定量の分解が生じ、これが、推定量
の不確実性を示す理由である。

昆虫の細胞は、小胞体（ER）へタンパクを誘導する哺
乳類のシグナル配列を認識し、切断するようである。ま
た、昆虫細胞（Sp.frugiperda）でのグリコシル化の標
的となる部位は、哺乳類細胞でのものと同一であると思
われる。昆虫細胞は、ガラクトーストランスフェラーゼ
およびシアル酸トランスフェラーゼを欠いているようで
あるので、複雑なオリゴ糖を生成し得ない。このため、
Man₃G1cNAc₂中心核についたＮ結合の切り出しが生じ
る。しかし、これらの系でつくられる、インターロイキ
ン、インターフェロンなどのタンパクは、生物学的活性
を示すことが指摘されてきた。この様式で産生されたTR
APは、会合して２量体および３量体になるとみられ、こ
のポリペプチドがオリゴマー形態で作用を発揮すること
が考えられる。

相補性の研究は、アミノ酸配列を規定するDNA塩基配
列の可能な変異を検索するために行った。オリゴヌクレ
オチドプライマーＡおよびＢを使ッて、PCRを再び実施
した。酵素反応の基質は、様々な地域での分離株から得
られた全ゲノムDNAであった。増幅された物質は、配列
決定のためのベクターM13mp8（アマシャム）のSam I部
位へのクローニングに先立って、上記と同様の方法で処
理した。セットになった一連のプライマーを用いて、KI
（T9/96とは異なったタイ産の分離株）からの完全な1.7
kb挿入断片の配列を決定することができた。第１表に示
すごとく、式Ｉの配列との相違点がいくつか見いだされ
たが、保存領域はすべて変化なかった。１つずつの塩基
の置換は、22個のアミノ酸の置換を生じさせている。ア
ミノ酸の変化につながらない単一の塩基置換が１つみら
れ、これによりシステイン残基が保持されている。この
結果は、CSタンパクの場合と同様、細胞の接着に関与す
るその他の抗原性の異なるタンパクでも得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＥＢＡ６１Ｋ 37/02 ＡＥＢＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ホール、ジェニファー、ルース、サドラー英国エスエヌ３１エイエイスウィンドンカンバーランドロード 36 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 A61K 38/00 A61K 39/00 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のアミノ酸配列：または、該アミノ酸の有する免疫原性が維持され得る範
囲内で、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加が行われた
アミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】オリゴマーを形成している請求項１に記載
のタンパク質。
【請求項３】グルコシル化されている請求項１または２
に記載のタンパク質。
【請求項４】請求項１に記載のタンパク質をコードする
ことを特徴とするDNA配列。
【請求項５】以下のDNA配列：を有する請求項４に記載のDNA配列。
【請求項６】以下のアミノ酸配列：または、該アミノ酸の有する免疫原性が維持され得る範
囲内で、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加が行われた
アミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【請求項７】オリゴマーを形成している請求項６に記載
のペプチド。
【請求項８】グルコシル化されている請求項６または７
に記載のペプチド。
【請求項９】請求項６に記載のペプチドをコードするこ
とを特徴とするDNA配列。
【請求項１０】以下のDNA配列：を有する請求項９に記載のDNA配列。
【請求項１１】所望の遺伝子産物をコードするDNA配列
とベクターとを有し、該DNA配列が請求項４、５、９ま
たは10に記載のDNA配列であることを特徴とする組換え
ベクター。
【請求項１２】前記ベクターがプラスミドであり、組換
えプラスミドとして形成されている請求項11に記載の組
換えベクター。
【請求項１３】前記ベクターがウイルスであり、組換え
ウイルスとして形成されている請求項11に記載の組換え
ベクター。
【請求項１４】前記ベクターが、バキュロウイルスであ
る請求項13に記載の組換えベクター。
【請求項１５】前記ベクターとしてのウイルスが、オー
トグラファ・カルフォルニカ核多角体病ウイルスである
請求項14に記載の組換えベクター。
【請求項１６】オートグラファ・カルフォルニカ核多角
体病ウイルスをベクターとする組換えベターにおいて、
請求項11〜15のいずれかに記載の組換えベクターの有す
る所望の遺伝子産物をコードするDNA配列を含む部分
を、該オートグラファ・カルフォルニカ核多角体病ウイ
ルスに取り込ませたものであることを特徴とする組換え
ベクター。
【請求項１７】請求項11〜16のいずれかに記載の組換え
ベクターと、該組換えベターの有する所望の遺伝子産物
をコードするDNAの発現を可能とする宿主と、を有する
ことを特徴とする宿主・組換えベクターシステム。
【請求項１８】前記宿主が、スポドプテラ・フルギペル
ダである請求項17に記載の宿主・組換えベクターシステ
ム。
【請求項１９】（Ａ）請求項１に記載のタンパク質また
は請求項６に記載のペプチドをコードするDNA配列をベ
クターに組み込んで組換えベクターを調製する過程と、（Ｂ）前記組換えベクターを、前記DNA配列の発現を可
能とする宿主に導入する過程と、（Ｃ）該宿主中で前記DNA配列を発現させて、前記タン
パク質またはペプチドを製造する過程と、を有することを特徴とするタンパク質またはペプチドの
製造方法。
【請求項２０】前記宿主中で製造されたタンパク質また
はペプチドがオリゴマーを形成している請求項19に記載
の製造方法。
【請求項２１】前記宿主中で製造されたタンパク質また
はペプチドがグリコシル化されている請求項19または20
に記載の製造方法。
【請求項２２】前記DNA配列が、以下のDNA配列（ｉ）ま
たは（ii）： DNA配列（ｉ） DNA配列（ii）である請求項19〜21のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２３】前記ベクターがプラスミドである請求項
19〜22のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２４】前記ベクターがウイルスである請求項19
〜22のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２５】前記ベクターがバキュロウイルスである
請求項24に記載の製造方法。
【請求項２６】前記バキュロウイルスが、オートグラフ
ァ・カルフォルニア核多角体病ウイルスである請求項25
に記載の製造方法。
【請求項２７】前記宿主が、スポドプテラ・フルギペル
ダである請求項19〜26のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２８】請求項１〜３及び６〜８のいずれかに記
載のタンパク質またはペプチドに特異的に結合し得るこ
とを特徴とする抗体。
【請求項２９】請求項１〜３及び６〜８のいずれかに記
載のタンパク質またはペプチドを有効成分として含有す
ることを特徴とするマラリアに対するワクチン用の医薬
製剤。
【請求項３０】薬学的に許容される担体を更に含む請求
項29に記載の医薬製剤。
【請求項３１】マラリアの予防または治療のために処置
に有効である請求項29または30に記載の医薬製剤。