DE69132708T2

DE69132708T2 - Therapeutische Vervendung von Peptiden mit Thrombospondin - ähnlicher Aktivität

Info

Publication number: DE69132708T2
Application number: DE69132708T
Authority: DE
Inventors: Jacob Eyal; Bruce King Hamilton; George Paul Tuszynski
Original assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co; Philadelphia Health and Education Corp
Current assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co; Philadelphia Health and Education Corp
Priority date: 1990-09-24
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2011-09-21
Also published as: JPH04288020A; EP0478101A3; CA2052022A1; EP0478101A2; DE69132708D1; EP1069137A1; EP0478101B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Polypeptiden mit Thrombospondin(TSP)-ähnlicher Aktivität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren. Die Peptide behalten die biologische Aktivität von TSP als ein wirksamer Verstärker bzw. Inhibitor der Zelladhäsion, Zellwanderung, Zellbindung (attachment) und Zellausbreitung verschiedener Zelllinien bei und ahmen diese nach. Die Peptide besitzen auch die Fähigkeit, die Aggregation von Blutplättchen zu hemmen. In Anwesenheit von TSP hemmen die Peptide die Thrombospondin-ähnliche Aktivität und in Abwesenheit von TSP verstärken die Peptide die Thrombospondin-ähnliche Aktivität.
Die Peptide haben verschiedene biologische und pharmakologische Anwendungen gefunden. Diese Anwendungen umfassen die Verwendung als Mittel, die die Entwicklung von Krebs behindern, und zwar durch Hemmung von Metastasierung oder durch Hervorrufen eines rückläufigen Tumorwachstums. Ferner können die Peptide zur Hemmung der Aggregation von Blutplättchen bei der Therapie von Atherosklerose und Thrombose, zur Hemmung der Angiogenese, bei der Herstellung von als diagnostische oder therapeutische Reagenzien verwendbaren Antikörpern und zur Förderung der Hemmung der Zellbindung an Oberflächen verwendet werden.

Hintergrund

Thrombospondin (auch als Thrombin-empfindliches Protein oder TSB bekannt) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 450.000, das aus drei identischen, durch Disulfidbindungen miteinander verbundenen Polypeptidketten besteht (Lawler et al. J. Cell Biol (1986) 101: 1059-71). TSP wird von Blutplättchen als Reaktion auf physiologische Aktivatoren wie zum Beispiel Thrombin und Kollagen sezerniert (Lawler, J. Blood (1986) 67: 112-123). TSP macht 3% des Gesamtproteins von Blutplättchen und 25% des Gesamtproteins der Alpha-Granula von Blutplättchen aus (Tuszynski, G. P. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 12240-12245). TSP wird auch von anderen Zellen synthetisiert, unter anderem von Fibroblasten (Jaffe, E. A. et al., (1983) Natl. Acad. Sci. USA 80: 999-1002), glatten Muskelzellen (Raugi, G. J. et al., (1982) J. Cell Biol. 95: 351-354) und Endothelzellen (McPhearson, J. et al. J. Biol. Chem. 256: 11330-11336). TSP wurde in bestimmten Tumorgeweben wie etwa in Melanomzellen (Varani, J. et al., (1989) Clin. Expl. Metastais 7: 319-329), squamösem Lungenkarzinom (Riser, B. L. et al., (1988) Exo. Cell Res. 174: 319-329) und Brustkarzinom (Pratt, D. A, et al., (1989) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 343-350) nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass folgende Tumorzellen in Kultur TSP synthetisieren: Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, Glioblastom, Nephroblastom (Wilm's tumor), Neuroblastom, Teratokarzinom, Choriokarzinom, Melanom und Lungenkarzinom (Mosher, D. F., (1990) Annu. Rev. Med. 41: 85-97). Eine Reihe neuer Untersuchungen hat gezeigt, dass TSP eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell- und Zell-Substrat-Adhäsion spielt (Tuszynski, G. P. et al., (1987) Seminars in Thrombosis Hemostasis (13: 361-368, Mosher, D. F., (1990) Annu. Rev. Med. 4: 85-97). In einem Modell für experimentelle Metastasierung in Mäusen fördert TSP die Zellbindung, die Aggregation von Blutplättchen und die Bildung von Tumorkolonien in der Lunge (Tuszynski, G. P. et al., (1987) Science 236: 1570-1573, Tuszynski, G. P. et al., (1988) Blood 72: 109-115). Die Beobachtung, dass TSP in der extrazellulären Matrix der meisten Gewebe enthalten ist, spricht für eine Funktion von TSP bei der Adhäsion.
TSP besteht aus linearen Polypeptid-Domänen, die mit verschiedenen Makromolekülen wie etwa mit Plasma und Matrixkomponenten spezifisch interagieren. Beispielsweise bildet TSP einen Komplex mit Heparin (Yabkowitz, R. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 10888-10896), Fibrinogen (Tuszynski, G. P. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 12240-12245), Kollagen (Mumby, S. M. et al. (1984) J. Cell Biol. 98: 10888-10896), und Plasminogen (Depoli, P. et al. (1989) Blood 73: 976-902). Die Tatsache, dass der Antikörper gegen das menschliche Protein mit TSP aus Maus, Ratte, Schwein, Rind, Schaf, Hund und Pute kreuzreagiert (Switalska, H. I. et al., J. Lab Clin. Med. 106: 690-700), deutet daraufhin, dass die Struktur von TSP über verschiedene Tierarten hinweg konserviert ist.
Thrombospondin wurde mit verschiedenen Verfahren aufgereinigt, unter anderem durch Ausschlusschromatografie (Lawler et al., J. Biol. Chem. (1978) 253: 8609-16), Heparin- Affinitätschromatografie (Lawler et al., Thromb. Res. (1981) 22: 267-269), Fibrinogen- Affinitätschromatografie (Tuszynski et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 12240-5), Ausfällung mit Bariumchlorid (Alexander et al., Biochem. J. (1984) 217: 67-71) und Anionenaustauschchromatografie mit HPLC (Clezarolin et al., J. Chromatog. (1984) 296: 249-56).
Die vollständige Aminosäuresequenz von TSP wurde von DNA-Klonen abgeleitet, die von verschiedenen Gruppen hergestellt wurden, unter anderem von Lawler et al., J. Cell Biol. (1986) 103: 1635-48; Kobayashi et al., Biochemistry (1986) 25: 8418-25; pixit et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. (1986) 83: 5449-53; und Hennessy et al., J. Cell Biol. (1989) 108: 729-36.
Die Zelladhäsion ist kritisch für die Entwicklung und das Überleben von vielzelligen Organismen. Bei der Zelladhäsion handelt es sich um einen komplexen Vorgang, bei dem mehrere extrazelluläre Proteine wie etwa Fibronektin, Vitronektin, Kollagen, Laminin und TSP sowie mehrere Familien von zellulären Rezeptoren wie etwa die Integrine und die Zelladhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAMS) benötigt werden. Diese an der Adhäsion sowohl von normalen Zellen als auch von Tumorzellen beteiligten Moleküle wurden in den letzten Jahren recht intensiv untersucht.
Die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD) wurde bei Fibronektin als eine Zellbindungsdomäne nachgewiesen (Pierschbacher, M. D. und Ruoslahti, E., (1984) Nature (London) 309: 30-32). Die gleiche Sequenz bzw. verwandte Sequenzen wurden in vielen Proteinen gefunden und dienen als Zellbindungsstellen für Makromoleküle wie Fibrinogen (Ginsberg, M. D. et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 11891-11896). Die adhäsive Funktion von Laminin scheint jedoch nicht auf der RGD-Sequenz zu beruhen, sondern auf einem Peptidabschnitt der B1-Kette, der die Aminosäuresequenz Tyrosin-Isoleucin- Glycin-Serin-Arginin (YIGSR) enthält (Sasaki, M. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci 84: 935-938). Synthetische Peptide, die die RGD- oder die YIGSR-Sequenz enthalten, fördern die Zelladhäsion.
Über die therapeutische Anwendung von synthetischen Peptiden, die auf den adhäsiven Domänen von Fibronektin und Laminin beruhen, wurde vor kurzem berichtet. Als Erste zeigten Humphries et al. (2986) (Science 233: 467-470) eine drastische Hemmung der Bildung von Lungenkolonien in C57BLL/6-Mäusen nach Injektion des Pentapeptids GRGDS zusammen mit B16-F10-Melanomzellen der Maus. Ein weiteres synthetisches Peptid (YIGSR), das von Laminin herstammte, führte ebenfalls zu einer drastischen Hemmung der Metastasierung von B16-F10-Melanomzellen bei C57B1/6-Mäusen (Kleinman, H. K. et al., (1987) Science 238: 1132-1133; Kleinman, H. K. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2279-2283). Die Hemmwirkung dieser Peptide könnte auf ihrer Konkurrenz zu der von endogenem Laminin und Fibronektin abhängigen Adhäsion von Tumorzellen an das Blutgefäßsystem des Zielorgans bei der metastatischen Absiedlung der Tumorzellen beruhen.
Da die Metastasierung ein schrittweiser Vorgang ist, der den Transfer von Tumorzellen von einem Herd zum anderen über den Lymph- und Blutkreislauf umfasst, und bei Tieren eine Reduktion der Blutplättchen die Metastasierung in diesen wirksam blockiert (Gasic et al., (1968) Proc. Natl. Acad Sci USA 48: 46-52), wurde angenommen, dass Blutplättchen eine besondere Rolle bei der Entwicklung von Metastasen spielen. Da TSP 25% des gesamten Alpha-Granula-Proteins ausmacht, das von Blutplättchen sezerniert wird, würde man erwarten, dass TSP eine wichtige Rolle bei dem Transport von Tumorzellen über das Blut zu entfernten Organen spielt. Tatsächlich wurde in einem Maus-Modell gezeigt, dass TSP die Metastasierung von Tumorzellen fördert (Tuszynski et al., (1987) 47: 4130-4133). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass alle Vorgänge, die mit der Aktivierung von Blutplättchen einhergehen, wie zum Beispiel die Sekretion von Adhäsionsproteinen, die Aggregation von Blutplättchen, die Aktivierung von proteolytischen Enzymen und die Aktivierung der Gerinnungskaskade, eine wichtige Rolle bei der Metastasierung von Tumorzellen spielen (Gasic, G. J., (1984) Cancer Metastasis Rev. 3: 99-116).
Adhäsionsproteine, die Bestandteil der extrazellulären Matrix sind, steuern die Bewegung, das Wachstum und die Morphologie vieler Zelltypen. Die Proteine der extrazellulären Matrix interagieren mit Tumorzellrezeptoren und beeinflussen die Adhäsion von Tumorzellen an das Kollagen der Basalmembran in unterschiedlicher Weise. Beispielsweise steigerte die Behandlung von Melanomzellen mit Laminin in vitro die Fähigkeit von Tumorzellen, an der Basalmembran zu haften und Tumorkolonien in der Lunge zu bilden (Barsky, S. H. et al., (1984) J. Clin: Inv. 74: 843-848; Terranova, V. P. et al., (1984) Science 226: 982-985).
In Anbetracht der vorstehend angegebenen Informationen könnte TSP eine wichtige Rolle bei vielen unterschiedlichen und klinisch relevanten Vorgängen spielen, wie zum Beispiel bei der Zellwanderung, der Wundheilung, der Nervenregeneration und der Metastasierung von Tumorzellen. Die Zuordnung jeder dieser biologischen Aktivitäten von TSP zu einer speziellen Unterdomäne oder einem speziellen Oligopeptid von TSP würde wertvolle Information liefern, die zum besseren Verständnis der Pathophysiologie dieser Vorgänge auf der Molekularebene beitragen würde. Insbesondere könnten detaillierte Kenntnisse der Struktur der Domänen von TSP und der TSP-Rezeptoren zum Design von TSP-antagonistischen Peptiden von Nutzen sein, die die pathophysiologischen Aktivitäten von TSP wie zum Beispiel die TSP-abhängige Bildung von Tumorzellmetastasen blockieren können.
TSP umfasst drei homologe Peptidsequenzen, die als Typ I-, Typ II- und Typ III-Wiederholungen bezeichnet werden (Lawler and Hynes, (1986) J. Cell Biol. 103: 1635-1648). Jede dieser drei Wiederholungen besteht aus etwa 60 Aminosäuren, darunter sechs Cysteinreste. Die Typ I-Wiederholungen weisen eine Homologie mit Peptidabschnitten in einer Reihe verschiedener Proteine auf. Bei TSP haben wir zwei Hexapeptidsequenzen (CSTSCG und CSVTCG) identifiziert, die entweder bei anderen Proteinen vollständig konserviert sind, oder mit einer oder zwei konservativen Aminosäuresubstitutionen bei anscheinend unverwandten Proteinen auftreten, oder von deren cDNA-Sequenz kodiert oder von dieser abgeleitet werden. Die nachstehende Tabelle I enthält Angaben zur Verbreitung konservierter Sequenzen. TABELLE I
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Verwendung von Polypeptiden mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität, die die biologische Aktivität von intaktem Thrombospondin nachahmen oder hemmen, und zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Tumoren verwendbar sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, dass eine Gruppe von Fragmenten oder synthetischen Analoga einer spezifischen Domäne von Thrombospondin verschiedene Anwendungen hat. Diese Polypeptiden behalten die biologische Aktivität von TSP als hochwirksamer Verstärker oder Inhibitor der Zelladhäsion, Zeltwanderung, Zellbindung und Zellausbreitung bei und ahmen diese nach. Mittels ihrer adhäsiven Aktivität sind diese Polypeptide in der Lage, das Wachstum und die Metastasierung von Tumorzellen, die Zelladhäsion, die Angiogenese und die Aggregation von Bluttplättchen zu verstärken und zu hemmen. Es wurde festgestellt, dass die verstärkenden und hemmenden Eigenschaften dieser Peptide von der Anwesenheit bzw. Abwesenheit von endogenem TSP abhängig sind. In Anwesenheit von endogenem TSP hemmen die Polypeptide die Thrombospondin-ähnliche Aktivität. In Abwesenheit von TSP verstärken die Polypeptide die Thrombospondinähnliche Aktivität.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Polypeptide zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Tumoren verwendet.
Es wurde gezeigt, dass die gemäß dieser Erfindung verwendeten TSP-Peptide und -Analoga Thrombospondin-ähnliche Aktivität aufweisen. Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung auf Polypeptid-Verbindungen mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität gerichtet, die durch die Formel:
R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;-X&sub5;-R&sub2;
bezeichnet werden, wobei:
R&sub1; eine geschützte oder ungeschützte aminoterminale Gruppe, umfassend Wasserstoff, Amino, Acetyl oder einen Aminosäurerest oder die Desaminoform davon bedeutet;
X&sub1; X&sub5; und X&sub5; Cystein bedeuten;
X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; die gleichen oder verschiedene Aminosäurereste, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin, Serin und Arginin, bedeuten;
R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe umfassend Hydroxyl, Carboxyl, Amid oder einen Aminosäurerest umfassend Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Glycin und Arginin, bedeutet;
wobei die Struktur des Polypeptids gegebenenfalls durch eine Bindung zwischen X&sub1; und X&sub5;, vorzugsweise durch eine Disulfidbindung, oder eine Bindung zwischen R&sub1; und R&sub2; cyclisiert ist.
Die Verabreichung von therapeutisch wirksamen Dosen von Arzneimitteln, die die vorstehend genannten TSP-Peptide und -Analoga enthalten, kann eine wirksame Förderung bzw. Hemmung von Thrombospondin-ähnlicher Aktivität bei Tieren bewirken, insbesondere bei Wirbeltieren wie zum Beispiel Säugetiere und Vögel.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer HPLC-Analyse für das Peptid CSVTCG-NH&sub2;.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer HPLC-Analyse für das Peptid CSVTCG.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer HPLC-Analyse für das über eine Disulfidbindung cyclisierte Peptid CSVTCG.
Fig. 4 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von Melanomzellen zu hemmen.
Fig. 5 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, bei der Kollagen-abhängigen Adhäsion von Melanomzellen zu wirken.
Fig. 6 veranschaulicht, dass die erfindungsgemäßen Peptide in vivo antimetastatische Aktivität aufweisen.
Fig. 7 vergleicht die Lungen von Mäusen, die in Anwesenheit von Melanomzellen einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen Peptiden bzw. keiner Behandlung unterzogen wurden.
Fig. 8 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die ADP-induzierte Aggregation von Blutplättchen zu hemmen:
Fig. 9 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Kollagen-induzierte Aggregation von Blutplättchen zu hemmen.
Fig. 10 zeigt die Fähigkeit verschiedener Dosen des Peptids CSVTCG, die Kollagen- induzierte Aggregation von Blutplättchen zu hemmen.
Fig. 11 zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, die Adhäsion von humanen Blutplättchen zu unterstützen.
Fig. 12 zeigt die Fähigkeit eines gegen ein erfindungsgemäßes Peptid gerichteten Antikörpers, die ADP-induzierte Aggregation von Blutplättchen zu hemmen.
Fig. 13 zeigt, dass ein Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Peptid in vivo antimetastatische Aktivität aufweist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine Gruppe von Fragmenten und Analoga von Thrombospondin bei der Herstellung eines zum Behandeln von Tumoren bestimmten Arzneimittels eingesetzt, das in der Lage ist, die Aktivität von Thrombospondin bei Säugetieren in vivo zu hemmen oder nachzuahmen.

A. Definitionen

"Thrombospondin-ähnliche Aktivität" wird hier als jede Aktivität definiert, die die bekannten biologischen Aktivitäten von Thrombospondin nachahmt. Diese Aktivitäten sind unter anderem eine die Zelladhäsion fördernde Aktivität, eine zellmitogene Aktivität, zellchemotaktische Aktivitäten und hämostatische Aktivitäten sowie beliebige Aktivitäten, die sich von diesen Aktivitäten herleiten, wie etwa die Aktivität bei der Metastasierung von Tumorzellen, Mikroorganismen oder Parasiten, die Aktivität bei der Aggregation von Blutplättchen, die fibrinolytische Aktivität und die Immunmodulation.
"Zelladhäsionsaktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Bindung (attachment) von Zellen, vorzugsweise Säugetierzellen, an ein Substrat zu fördern oder zu hemmen.
"Aktivität bei der Aggregation von Blutplättchen" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Aggregationsfähigkeit von Blutplättchen zu hemmen.
"Antimetastatische Aktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, Tumorzellmetastasen zu verhindern bzw. deren Umfang oder Größe erheblich zu reduzieren, oder primäre feste Tumore zu hemmen oder deren Rückbildung zu bewirken.
"Atherosklerose-Aktivität" wird hier als die Fähigkeit von Thrombospondin definiert, die Bildung von atherosklerotischen Läsionen zu hemmen. Die atherosklerotische Läsion wird als die degenerative Ansammlung von lipidhaltigen Materialien, insbesondere in den Arterienwänden, definiert.
"Antithrombotische Aktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, entweder die Aggregation von Blutplättchen zu hemmen oder der Thrombusbildung entgegenzuwirken.
"Thrombolytische Aktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Struktur eines Thrombus zu zerstören.
"Angiogenese-Aktivität" wird hier als die Fähigkeit definiert, die Bildung von Blut- oder Lymphgefässen zu hemmen.
Die Sequenz der Aminosäurereste der vorliegenden Polypeptid-Verbindungen, des Kern-Pentapeptids und bevorzugter Ausführungsformen derselben werden anhand der Aminosäuren verschiedener Unterklassen mit bestimmten Eigenschaften definiert.
Die Aminosäurereste können im Allgemeinen wie folgt in vier große Untergruppen unterteilt werden:
Saure Aminosäurereste, d. h. der Aminosäurerest weist eine negative Ladung auf, die auf den Verlust eines H-Ions bei physiologischem pH zurückzuführen ist; befindet sich das Peptid, das diesen Rest enthält, in einem wässrigen Medium, so wird der Rest von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konfiguration des Peptids Positionen an der Oberfläche ein.
Basische Aminosäurereste, d. h. der Aminosäurerest weist eine positive Ladung auf, die auf die Verbindung mit einem H-Ion bei physiologischem pH zurückzuführen ist; befindet sich das Peptid, das den Rest enthält, in einem wässrigen Medium, so wird der Rest von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konfiguration des Peptids Positionen an der Oberfläche ein.
Neutrale/nicht-polare Aminosäurereste, d. h. die Aminosäurereste sind bei physiologischem pH nicht geladen; befindet sich das Peptid, das den Rest enthält, in einem wässrigen Medium, so wird der Rest von der wässrigen Lösung abgestoßen und nimmt deshalb in der Konfiguration des Peptids die Innenpositionen ein.
Neutrale/polare Aminosäurereste, d. h. die Aminosäurereste sind bei physiologischem pH nicht geladen; befindet sich das Peptid, das den Rest erhält, in einem wässrigen Medium, so wird der Rest von der wässrigen Lösung angezogen und nimmt deshalb in der Konfiguration das Peptids die Außenpositionen ein.
Es ist natürlich klar, dass bei einer statistischen Anzahl von Einzelmolekülen stets einige Moleküle geladen und andere nicht geladen sind. Um der Definition von "geladen" zu entsprechen, muss ein erheblicher Anteil (mindestens etwa 25%) der Einzelmoleküle bei physiologischem pH geladen sein.
Die Aminosäurereste können auch in cyclische oder nicht-cyclische Reste - eine selbsterklärende Unterteilung, die sich auf die Substituenten in der Seitenkette des Aminosäureests bezieht- bzw. in kleine oder große Aminosäurereste unterteilt werden. Ein Rest mit insgesamt drei oder weniger Kohlenstoffatomen wird als kleiner Aminosäurerest angesehen. Kleine Aminosäurereste sind von daher natürlich immer nicht-cyclisch.
Gemäß dem vorstehenden Schema werden die in natürlichen Proteinen auftretenden Aminosäuren wie folgt unterteilt:
Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;
Basisch/nicht-cyclisch: Arginin und Lysin;
Basisch/cyclisch: Histidin;
Neutral/polar/klein: Glycin, Serin und Cystein;
Neutral/polar/groß/nicht-cyclisch: Threonin, Asparagin und Glutamin;
Neutral/polar/groß/cyclisch: Tyrosin;
Neutral/nicht-polar/klein: Alanin;
Neutral/nicht-polar/groß/nicht-cyclisch: Valin, Isoleucin, Leucin und Methionin;
Neutral/nicht-polar/groß/cyclisch: Phenylalanin und Tryptophan.
Die Protein-Aminosäure Prolin fällt zwar unter die Klasse der neutralen/nicht-polaren/großen/cyclischen Reste, sie wird jedoch wegen ihrer bekannten Wirkungen auf die sekundäre Konformation der Peptidketten nicht berücksichtigt.
Bestimmte häufig auftretende, nicht natürliche Aminosäuren wie zum Beispiel Desaminotyrosin (desTyr), Agmatin (Agm), n-Formyltryptophan (f-Trp), alpha-Aminoisobuttersäure (Aib), und Sarcosin (Sar), Statin, Omithin (Om), Homolysin, Homoserin, Homoarginin, Norleucin (Nle) und Norvalin können auch in die Verbindungen der Erfindung eingebaut werden. Desaminotyrosin wird am N-Terminus eingebaut. Agmatin und Statin werden am C-Terminus eingebaut. Auf der Grundlage der vorstehenden Definition handelt es sich bei n-Formyl-Trp um einen neutralen/nicht-polaren/großen/cyclischen Aminosäurerest, bei Sar um einen neutralen/nicht-polaren/kleinen Aminosäurerest, bei Aib um einen neutralen/nicht-polaren/nicht-cyclischen Aminosäurerest, bei Orn um einen basischen/nicht-cyclischen Aminosäurerest, bei Homolysin um einen basischen/nicht- cyclischen Aminosäurerest, bei Homoserin um einen neutralen/polaren/kleinen Aminosäurerest, bei Homoarginin um einen basischen nicht-cyclischen Aminosäurerest, bei Norleucin um einen neutralen/nicht-polaren/großen/nicht-cyclischen Aminosäurerest und bei Norvalin um einen neutralen/nicht-polaren/großen/nicht-cyclischen Aminosäurerest.
Die zur Beschreibung der Polypeptid-Verbindungen in der vorliegenden Erfindung verwendete Nomenklatur folgt der üblichen Praxis, nach der die Aminogruppe eines Aminosäurerests links und die Carboxygruppe rechts dargestellt wird. Wenn nichts Anderes angegeben ist, wird angenommen, dass die nicht ausdrücklich angegebenen amino- und carboxyterminalen Gruppen in den Formeln, die bestimmte ausgewählte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, sich in dem Zustand befinden, den sie bei physiologischen pH Werten einnehmen würden. Bei den Aminosäure-Strukturformeln wird jeder Rest in der Regel durch eine Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben- Bezeichnung dargestellt, die dem Trivialnamen der Aminosäure entspricht, und zwar gemäß dem folgenden Muster:
Soweit nichts anderes ausdrücklich angegeben wird, z. B. durch das Symbol "[D-Xn]", handelt es sich bei Aminosäureresten mit optischer Isomerie in der vorliegenden Erfindung um die L-Form.
Um Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erhalten, können die offenbarten Formeln in verschiedener Weise modifiziert werden, solange die Aktivität der erhaltenen Polypeptid-Verbindungen erhalten bleibt. Beispielsweise kann eine oder mehrere, in der Regel zwei oder weniger, vorzugsweise eine der Aminosäuren dieser Verbindungen, die normalerweise in der natürlichen L-Form auftreten, durch das Spiegelbild-Isomer in D-Form ersetzt werden oder die Moleküle, die die Polypeptid-Verbindung umfassen, können als racemisches Gemisch der D- und L-Formen vorliegen.
Ferner können die in der Erfindung verwendeten Verbindungen eine Disulfidbindung aufweisen oder nicht aufweisen, solange die Aktivität erhalten bleibt. Wie Fachleute auf dem Gebiet erkennen würden, können durch Bildung einer Peptidbindung in den Aminosäure-Seitenketten, die Amino- oder Carboxylgruppen enthalten, verzweigte oder cyclische Ketten entstehen. Unter den Aminosäuren, die solche Seitengruppen enthalten, sind Glutaminsäure (Carboxygruppe), Asparaginsäure (Carboxygruppe) und Lysin (Amidogruppe). Verzweigte oder cyclische Ketten können ebenfalls durch die Bildung einer kovalenten Disulfidbindung zwischen Aminosäureresten mit schwefelhaltigen Seitengruppen wie zum Beispiel Cystein entstehen.
Wie hier verwendet, bezieht sich "geschützte" aminoterminale Gruppe auf eine aminoterminale Gruppe, die mit einer der bei der Peptidsynthese üblicherweise eingesetzten Schutzgruppen für den Aminoterminus gekuppelt ist. Beispiele für geeignete Gruppen sind unter anderem Acyl-Schutzgruppen, z. B. Formyl, Acetyl, Benzoyl, Trifluoracetyl, Succinyl und Methoxysuccinyl, aromatische Urethan-Schutzgruppen wie zum Beispiel Benzyloxycarbonyl, und aliphatische Urethan-Schutzgruppen wie zum Beispiel tert-Butoxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl. Gross und Mienhofer, Hrsg. The Peptides, Bd. 3, S. 3-88 (Academic Press, New York, 1981) offenbaren zahlreiche geeignete Schutzgruppen für den Aminoterminus.
Wie hier verwendet bezieht sich eine "geschützte" carboxyterminale Gruppe auf eine carboxyterminale Gruppe, die mit einer der verschiedenen Schutzgruppen für den Carboxyterminus gekuppelt ist. Geeignete Gruppen sind - wie für Fachleute auf dem Gebiet klar verständlich - unter anderem tert-Butyl, Benzyl und andere geeignete Gruppen, die über eine Ester- oder Etherbindung mit der carboxyterminalen Gruppe verbunden sind.
In den Verbindungen enthaltene Aminosäurereste, insbesondere am Carboxy- oder Aminoterminus, können auch durch Methylierung, Amidierung, Acetylierung oder Substitution mit anderen chemischen Gruppen modifiziert werden, die beispielsweise die mittlere Verweildauer (circulating half-life), die Resistenz gegen Proteasen und die Löslichkeit der Verbindungen ändern können, ohne ihre Aktivität zu beeinträchtigen.
Zusätzlich zu den vorangegangenen Definitionen werden zur Beschreibung der Erfindung folgende Abkürzungen benutzt:
BCA Bicinchoninsäure
BSA Rinderserumalbumin
t-Boc t-Butyloxycarbonyl
Bzl Benzyl
ºC Grad Celsius
DCM Dichlormethan
DIEA Diisopropylethylamin
DMEM Dulbecco-Minimalmedium (Dulbecco's minimum essential medium)
DMF Dimethylformamid
HF Flusssäure
HOBT 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie
mBHA Methylbenzhydrylamin
ug Mikrogramm
ul Mikroliter
ml Milliliter
mM Millimolar
nm Nanometer
NMP N-Methylpyrrolidon
Prozent
PAM Phenylacetamidomethyl
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung
TFA Trifluoressigsäure

B. Bevorzugte Ausführungsformen

Sämtliche erfindungsgemäße Polypeptidverbindungen enthalten die Kern-Pentapeptidsequenz:
R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;-X&sub5;-R&sub2;
wobei:
R&sub1; eine geschützte oder ungeschützte aminoterminale Gruppe, umfassend Wasserstoff, Amino, Acetyl oder einen Aminosäurerest oder die Desaminoform davon bedeutet;
X&sub1; und X&sub5; Cystein bedeuten;
X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; die gleichen oder verschiedene Aminosäurereste, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Valin, Threonin, Serin und Arginin, bedeuten;
R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe bedeutet, umfassend Hydroxyl, Carboxyl, Amid, oder einen Aminosäurerest, einschließlich der Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Glycin und Arginin;
wobei die Struktur des Polypeptids gegebenenfalls durch eine Bindung zwischen X&sub1; und X&sub5;, vorzugsweise durch eine Disulfidbindung, oder durch eine Bindung zwischen R&sub1; und R&sub2; cyclisiert ist.
Besonders bevorzugt sind solche Ausführungsformen, bei denen die Sequenz aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die Sequenz Säure- und Amidformen der C-terminalen Aminosäure, Formen mit einer Disulfidbindung und Formen mit blockierten Cysteinresten einschließt:
CSVTCG (SEQ ID NO: 1)
CSVTCR (SEQ ID NO: 2)
CSTSCR (SEQ ID NO: 3)
CSTSCG (SEQ ID NO: 4)
CRVTCG (SEQ ID NO: 5)
RCRVTCG (SEQ ID NO: 6)
CSVTCK (SEQ ID NO: 8)
CSTSCK (SEQ ID NO: 9)
CSRTCG (SEQ ID NO: 10)
CRTSCG (SEQ ID NO: 11)
CRVTC (SEQ ID NO: 12)
CSTSC (SEQ ID NO: 13)
PCSVTCR (SEQ ID NO: 14)
Die am stärkesten bevorzugten Ausführungsformen sind aus folgender Gruppe ausgewählt:
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verbindungen können mit Hilfe im Stand der Technik bekannter Methoden wie z. B. durch Festphasen-Peptidsynthese chemisch synthetisiert werden. Die Synthese beginnt am carboxyterminalen Ende des Peptids mit einer an der Alpha-Aminogruppe geschützten Aminosäure. t-Butylcarbonyl(Boc)-Schutzgruppen können für alle Aminogruppen verwendet werden, obwohl auch andere Schutzgruppen ebenfalls geeignet sind. Siehe Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis," W. H. Freeman Co., San Francisco (1969) und Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963), Vale et al., Science 213, 1394-1397 (1981) und Marke et al., J. Am. Chem. Sci. 103, 3178 (1981). Andere anwendbare präparative Methoden sind unter anderem das Verfahren von Houghton Proc. Natl. ACAD Sci. 82: 5132 (1981) oder ein anderes Syntheseverfahren, das für kleine verzweigte oder cyclische Peptide besonders bevorzugt sind, einschließlich der herkömmlichen Flüssigphase-Verfahren. Das Flüssigphase-Verfahren sowie andere Synthesemethoden werden in "Principle of Peptide Synthesis" M. Bodansky Hrsg. (Spring-Verlag 1984) beschrieben. Diese und andere Verfahren zur Peptidsynthese werden beispielsweise in den US-Patenten Nrn. 3 862 925, 3 842 067, 3 972 859 und 4105 602, 4 683 291, 4 244 946 und 4 305 872 benutzt.
Zweckmäßigerweise können die Verbindungen manuell oder automatisch synthetisiert werden; , beispielsweise mit dem Peptidsynthesator 430A von Applied BioSystems (Foster City, Kalifornien) oder dem automatischen Peptidsynthesator SAM II von Biosearch (Biosearch, Inc., San Rafsel, Kalifornien), und zwar gemäß den Anweisungen in dem Bedienungshandbuch des Herstellers.
Zwar wird eine Reinheit des synthetisierten Peptids von über 95 Prozent bevorzugt, doch kann auch ein geringerer Reinheitsgrad noch akzeptabel sein. Cyclische Peptide, zum Beispiel Peptide, bei denen die zwei Cystein-Aminosäuren miteinander verbunden sind, oder bei denen die Aminosäurereste eine Disulfidbrücke enthalten, können durch Oxidierung einer verdünnten wässrigen Lösung des Peptids mit K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] erhalten werden. Andere im Stand der Technik bekannte Cyclisierungsmethoden können ebenfalls angewandt werden. Das stabilisierte cyclisierte Peptid in der vorliegenden Erfindung kann auch durch Bildung einer Peptidbindung zwischen nicht benachbarten Aminosäureresten hergestellt werden. Ein Verfahren zur Bildung einer solchen Peptidbindung wird in Schiller et al., Int. J. Pe tide Protein Res. (1985) 25: 171 angegeben.
Alternativ können ausgewählte Verbindungen zur Verwendung in der Erfindung durch Expression von gemäß bekannten Methoden bereitgestellten rekombinanten DNA- Konstrukten hergestellt werden. Dieses Herstellungsverfahren kann zweckmäßig sein, wenn große Mengen oder alternative Ausführungsformen solcher Verbindungen bereitgestellt werden sollen.

C. Verabreichung

Die Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung haben Thrombospondin-ähnliche Aktivität im unversehrten Tier. Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel mit der nachgewiesenen physiologischen Wirkung, die Wirkung von intaktem Thrombospondin zu hemmen oder nachzuahmen, können therapeutisch und prophylaktisch verwendet werden, beispielsweise in der Krebstherapie.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung solcher Verbindungen, einschließlich der nicht-toxischen Additionssalze, Amide und Ester davon bereit, die die vorstehend angegebenen therapeutischen Vorteile allein liefern können. Zur Herstellung von Arzneimitteln können physiologisch verträgliche, flüssige, gelierte oder feste Verdünnungsmittel, Adjuvanzien und Arzneimittelträger verwendet werden.
Zur veterinärmedizinischen Anwendung können die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Arzneimittel Tieren, beispielsweise Haustieren verabreicht werden; in der Humanmedizin können sie wie andere therapeutischen Mittel verwendet werden. Im Allgemeinen liegt die therapeutisch wirksame Dosis zwischen etwa 1 ug und 300 mg/kg, häufiger zwischen 10 ug und 30 mg/kg Körpergewicht des Wirtsorganismus. Alternativ können die Dosen in diesen Bereichen durch kontinuierliche Infusion über einen längeren Zeitraum, in der Regel über 24 Stunden verabreicht werden, bis das gewünschte Therapieziel erreicht wird.
Typischerweise werden derartige Arzneimittel als injizierbare flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; sie können jedoch auch in einer geeigneten festen Form hergestellt und vor der Injektion in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert werden. Die Präparation kann auch emulgiert werden. Der Wirkstoff wird oft mit physiologisch verträglichen und mit dem Wirkstoff kompatiblen Verdünnungsmitteln oder Arzneimittelträgern gemischt. Geeignete Verdünnungsmittel und Arzneimittelträger sind zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin o. Ä. sowie Kombinationen von diesen. Darüber hinaus kann das Arzneimittel nach Bedarf kleine Mengen an Hilfsstoffen enthalten, beispielsweise Benetzungsmittel oder Emulgatoren, Stabilisatoren oder Mittel zur pH-Einstellung u. Ä..
Die Arzneimittel werden üblicherweise parenteral verabreicht, beispielweise durch subkutane oder intravenöse Injektion. Weitere Rezepturen, die sich für andere Verabreichungsarten eignen, sind unter anderem Zäpfchen, intranasale Aerosole und, in einigen Fällen, Rezepturen zur oralen Verabreichung. Bei Zäpfchen können übliche Bindemittel und Arzneimittelträger, zum Beispiel Polyalkylenglycole oder Triglyceride enthalten sein; solche Zäpfchen können aus Gemischen mit einem Anteil an Wirkstoff von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1%-2% hergestellt werden. Rezepturen zur oralen Verabreichung können herkömmlich verwendete Arzneimittelträger mit der zur Verwendung in Arzneimitteln erforderlichen Reinheit enthalten, wie zum Beispiel Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin; Cellulose, Magnesiumcarbonat u. Ä. Diese Zusammensetzungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Rezepturen zur langsamen Freigabe oder Puder enthalten 10%-95%, vorzugsweise 25%-70% Wirkstoff. Diese Rezepturen zur oralen Verabreichung schließen Rezepturen ein, die zum Schutz des Peptids bis zu seiner Absorption bestimmt sind.
Die Polypeptid-Verbindungen können in diesen Zusammensetzungen in neutraler Form oder als Salze enthalten sein. Pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze sind unter anderem durch Addition von Säure gebildete Salze (der freien Aminogruppen), die mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure o. Ä. gebildet werden. Salze der freien Carboxygruppen können mit anorganischen Basen wie Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxid oder mit organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain u. Ä. gebildet werden.
Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können Homopolymere einer einzigen Verbindung (d. h. (Peptid)n) oder Heteropolymere aus mehreren Verbindungen (d. h. Peptid 1-Peptid 2) bilden. Die Verbindungen können auch durch Disulfidbindungen oder andere Bindungen cyclisiert werden. Die Verbindungen können ebenfalls mit biokompatiblen Polymerverbindungen wie zum Beispiel BIOPOLTM-Polymeren (W. R. Grace & Co.- Conn.) konjugiert werden.
Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass die gemäß dieser Erfindung hergestellten Arzneimittel als Agonisten oder Antagonisten des natürlichen Thrombospondins wirken. Es wird ebenfalls angenommen, dass die Polypeptide als Agonisten oder Antagonisten des Circumsporozoit-Proteins, eines mit Thrombospondin verwandten unbekannten Proteins, des Antistasins und des Properdin-Komplementproteins wirken. Aufgrund ihrer (im Vergleich mit intaktem Thrombospondin) geringen Größe sind die Eigenschaften der in der Erfindung verwendeten Verbindungen ferner wahrscheinlich spezifisch, im Gegensatz zu den Wirkungen anderer allgemein adhäsiver Verbindungen wie zum Beispiel RGD-enthaltender Verbindungen (deren Sequenz in über hundert Proteinen zu finden ist) und Fibronektin. Die Nebenwirkungen der in der Erfindung verwendeten Peptidverbindungen sind im Vergleich mit diesen unspezifischen adhäsiven Verbindungen deutlich geringer.

D. Verwendung

Wie bereits erwähnt, können die nach der Erfindung hergestellten Arzneimittel verschiedene biologische, prophylaktische oder therapeutische Anwendungen haben. In Betracht kommt die Verwendung dieser Arzneimittel zur Vorbeugung gegen Erkrankungen oder Krankheitszustände, die in Verbindung mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität stehen, oder zur Behandlung derselben. Diese Erkrankungen oder Krankheitszustände schließen Krebs ein, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Antikörper, die gegen die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen gerichtet sind, können auch als diagnostische Reagenzien, Therapeutika oder Träger für andere Verbindungen verwendet werden.
Zum Nachweis der Thrombospondin-ähnlichen Aktivität von Verbindungen können verschiedene in vitro- und in vivo-Tests durchgeführt werden. Diese Tests schließen Zelladhäsionstests, Tests der Blutplättchenaggregation und Zellproliferationstests ein, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

METASTASIERUNG

Metastasierung ist die Ausbreitung einer Erkrankung von einem Teil des Körpers auf einen anderen, mit ihm nicht in Verbindung stehenden Teil des Körpers, wie z. B. der Transfer von Zellen eines bösartigen Tumors über den Blut- oder Lymphkreislauf. Es wird angenommen, dass die Metastasierung über einen Kaskadenmechanismus in Gang gesetzt wird, der unter anderem die Adhäsion der Tumorzellen an das Endothel, die Retraktion des Endothels, den Abbau der Matrix der Basalmembran und das Eindringen der Tumorzellen in den Blutkreislauf umfasst. Es wird auch vermutet, dass die Blutplättchen bei der Ausbreitung der Tumorzellen in dem Blutkreislauf und beim Auslösen von metastatischem Wachstum an von dem primären Tumor entfernten Stellen eine wichtige Rolle spielen. Ein Eingriff in einer beliebigen Phase dieser Kaskade könnte zur Behandlung von metastasierenden Krebsarten oder zur Vorbeugung dagegen nützlich sein.
Es wurde gezeigt, dass das natürliche Thrombospondin-Molekül die Metastasierung von Tumorzellen verstärkt (Tuszynski et al., Cancer Research (1987) 47: 4130-4133). Die Mechanismen, auf denen die Verstärkung durch Thrombospondin beruht, sind bisher nicht hinreichend geklärt.
Eine antimetastatische Aktivität zeichnet sich aus durch die Fähigkeit der Verbindungen zur Bindung an Melanomzellen in vitro (Tuszynski et al., Anal. Bio. (1990) 184: 189-91) sowie durch die Fähigkeit, die Größe und Anzahl von Tumorkolonien in vivo zu verringern (Tuszynski et al. Cancer Research (1987) 47: 4130-4133).
Die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen sind als antimetastatische Mittel, insbesondere als Mittel gegen Metastasierung in der Lunge verwendbar. Diese Verbindungen hemmen die Adhäsion von metastatischen Tumorzellen, insbesondere von solchen, die auf Thrombospondin reagieren. Ferner bewirken die Verbindungen eine Senkung der Anzahl und Größe der Tumorkolonien.
Die antimetastatische Aktivität könnte auf verschiedenen Mechanismen beruhen. Die Peptide können cytotoxisch sein oder die Zellproliferation hemmen. Als Inhibitoren der Zellproliferation können die Verbindungen (1) eine Hemmung der Mitogenese, (2) eine Hemmung der Angiogenese oder (3) eine Aktivierung des Komplementweges und der damit verbundenen Killerzellen bewirken. Es ist ebenfalls möglich, dass das Peptid durch Hemmung der Blutplättchenaggregation auch die Fähigkeit der Blutplättchen hemmt, mit Tumorzellen zu interagieren, und auf diese Weise die Bildung von Blutplättchen-Tumor-Emboli verhindert, die entfernte Organe infiltrieren können.
Die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen können auch in biomedizinischen Vorrichtungen Anwendung finden. Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Bindung von metastatischen Tumorzellen zu fördern, könnten die Verbindungen zur Beschichtung einer biomedizinischen Vorrichtung verwendet werden, um auf diese Weise die zirkulierenden Tumorzellen aus dem Blut oder der Lymphe zu entfernen. Die biomedizinische Vorrichtung ist auch zum Auffangen von Hepatomen verwendbar.
Ferner können die Verbindungen als Träger von Toxinen, Arzneimitteln, Hormonen oder Visualisierungsmitteln dienen und diese zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken gezielt an metastatische Tumorzellen heranbringen. Diese Träger würden ebenfalls an Hepatome binden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und implizieren keine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes.

BEISPIELE

Die Peptide dieser Erfindung können mit den üblichen Peptidsynthese-Verfahren synthetisiert werden. Die bevorzugten üblichen Verfahren wenden die in Int. J. Peot. Proc. Res. 21, 57-63 (1983) beschriebenen Methoden an. Die Festphasen-Synthese von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Science 150, 178-185 (1965); Ebd. 232, 341-347 (1986) wird ebenfalls bevorzugt. Die Festphasen-Synthese beginnt in der Regel am C-Terminus des Peptids durch Kupplung einer geschützten Alpha-Aminosäure an ein geeignetes Harz, z. B. an Phenylacetamidmethyl(PAM)-Polystyrol-Harz oder p-Methylbenzhydrylamin(mBHA)-Harz, wenn ein Peptid mit Carboxyamid am C- Terminus synthetisiert werden soll. Bei der Synthese werden nach Bedarf geeignete Schutzgruppen für die Seitenketten der Aminosäuren benutzt. So wird die Beta-Carboxylgruppe der Asparaginsäure durch Bildung eines Benzylesters und die Guanidinogruppe des Arginins durch Tosyl geschützt. Nach der Synthese des gewünschten Peptids wird dieses von dem Harz abgespalten und die Schutzgruppen werden durch Behandlung mit einem Reagenz wie zum Beispiel Flusssäure (HF) entfernt. Das Peptid kann dann durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) oder durch andere Verfahren zur Peptidaufreinigung gereinigt werden. Hintergrundinformation über die etablierten Methoden für die Festphasen-Peptidsynthese findet man in "Solid Phase Peptide Synthesis" von Stewart and Young, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969.
In Übereinstimmung mit der vorstehenden Beschreibung wurden die folgenden Methoden zur chemischen Synthese der neuartigen synthetischen Peptide angewandt:

Beispiel 1

Synthese der Peptidsequenz CSVTCG (SEQ ID NO: 1) mit einer C-terminalen Amidogruppe

Ein für eine C-terminale Amidogruppe geeignetes 4-Methylbenzhydrylamin(MBHA)-Harz wurde in Säckchen aus Polypropylengewebe (64 um) versiegelt. Um das Harz zu waschen und quellen zu lassen, wurden alle Päckchen in denselben Behälter mit CH&sub2;Cl&sub2; gegeben und kräftig geschüttelt. Um einen hinreichenden Transfer des Lösungsmittels zu gewährleisten, wurden alle nachfolgenden Schritte unter kräftigem Schütteln durchgeführt. Anschließend wurde der N-α-Butoxycarbonylrest durch 30minütige Acidolyse mit 55% Trifluoressigsäure (TFA)/CH&sub2;Cl&sub2; entfernt; die α-Aminosäuregruppe verblieb in Form eines TFA-Salzes. Um überschüssige TFA zu entfernen und die Neutralisierung vorzubereiten, wurden die Säckchen mit CH&sub2;Cl&sub2; (2x), IPA (2x) und CH&sub2;Cl&sub2; (2x) gewaschen. Zur Neutralisierung des IFA-Salzes wurden die Säckchen dreimal je 2 Minuten lang mit einer 5%igen Diisopropylethylamin-Lösung in CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Anschließend wurden sie zum Entfernen der überschüssigen Base zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die Säckchen wurden aus dem gemeinsamen Behälter herausgenommen und in die jeweilige 0,2 M Aminosäurelösung gegeben, die vor der Neutralisierung anhand von computergenerierten Informationen angesetzt worden war. Zur Aktivierung der Kupplungsreaktion wurde dann das gleiche Volumen einer 0,2 M Dipropylcarbodiimid-Lösung zugesetzt. Nach einer einstündigen Kupplung bei Raumtemperatur wurden die Säckchen mit Dimethylformamid und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und in den gemeinsamen Behälter zurückgegeben. Dieses Verfahren wurde für jede Aminosäure wiederholt. Zur Abspaltung wurde das Peptid 90 Minuten lang mit 92,5% Flusssäure/7,5% Anisol bei -10ºC bis 0ºC behandelt. Anisol wurde als Radikalfänger benutzt, der mit Carbokationen reagiert, die beim Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen entstehen.
Sodann wurde diese Lösung unter starkem N&sub2;-Fluss und durch anschließenden Einsatz einer Vakuumpumpe bei einer konstanten Temperatur von 0ºC entfernt. Das übriggebliebene Anisol wurde durch 2 Waschungen mit Ethylether entfernt. Das Peptid wurde dann mit 10% Essigsäure extrahiert.
Die Reinheit des ungereinigten Peptids wurde durch analytische RP-HPLC mit einem Beckman System Gold und einer Vydac C-18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min überprüft. Als Lösungsmittelsystem wurde eine 0,05%ige TFA-Lösung in Wasser (A) und eine 0,05%ige TFA-Lösung in Acetonitril (B) in einem 30minütigen Gradienten von 5-65% B benutzt, wobei die Extinktion bei 215 um bestimmt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative "Waters delta prep. 3000"-HPLC in einer "Waters prep. Pak Nodule Radial Compression C18"-Säule (25 cm · 5 cm, 10-20 um). Als Lösungsmittelsystem wurde eine 0,05%ige TFA-Lösung in Wasser (A) und eine 0,05%ige TFA-LÖsung in Acetonitril (B) benutzt. Es wurden verschiedene lineare Gradienten benutzt; die Extinktion bei 230 nm wurde gemessen und es wurden Fraktionen von 40 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden dann in dem analytischen System von Beckman analysiert. Die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt wurde noch einmal durch analytische RP-HPLC analysiert. In Fig. 1 werden typische HPLC-Chromatogramme dieses Peptids nach seiner Reinigung gezeigt.

Beispiel 2

Chemische Synthese der Peptidsequenz CSVTCG-Säure (SEQ ID NO: 1)

Ein für eine C-terminale Säuregruppe geeignetes Phenylacetamidmethyl(PAM)-Harz wurde in Säckchen aus Polypropylengewebe (64 um) versiegelt. Um das Harz zu waschen und quellen zu lassen, wurden alle Päckchen in denselben Behälter mit CH&sub2;Cl&sub2; gegeben und kräftig geschüttelt. Um einen hinreichenden Transfer des Lösungsmittels zu gewährleisten, wurden alle nachfolgenden Schritte unter kräftigem Schütteln durchgeführt. Anschließend wurde der N-α-Butoxycarbonylrest durch 30minütige Acidolyse mit 55% Trifluoressigsäure (TFA)/CH&sub2;Cl&sub2; entfernt; die α-Aminosäuregruppe verblieb in Form eines TFA-Salzes. Um überschüssige TFA zu entfernen und die Neutralisierung vorzubereiten, wurden die Säckchen mit CH&sub2;Cl&sub2; (2x), fPA (2x) und CH&sub2;Cl&sub2; (2x) gewaschen. Zur Neutralisierung des IFA-Salzes wurden die Säckchen dreimal je 2 Minuten lang mit einer 5%igen Diisopropylethylamin-Lösung in CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Anschließend wurden sie zum Entfernen der überschüssigen Base zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die Säckchen wurden aus dem gemeinsamen Behälter herausgenommen und in die jeweilige 0,2 M Aminosäurelösung gegeben, die vor der Neutralisierung anhand von computergenerierten Informationen angesetzt worden war. Zur Aktivierung der Kupplungsreaktion wurde dann das gleiche Volumen einer 0,2 M Dipropylcarbodiimid-Lösung zugesetzt. Nach einer einstündigen Kupplung bei Raumtemperatur wurden die Säckchen mit Dimethylformamid und CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und in den gemeinsamen Behälter zurückgegeben. Dieses Verfahren wurde für jede Aminosäure wiederholt. Zur Abspaltung wurde das Peptid 90 Minuten lang mit 92,5% Flusssäure/7,5% Anisol bei -10ºC bis 0ºC behandelt. Anisol wurde als Radikalfänger benutzt, weil es mit Carbokationen reagiert, die beim Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen entstehen. Sodann wurde diese Lösung unter starkem N&sub2;-Fluss und durch anschließenden Einsatz einer Vakuumpumpe bei einer konstanten Temperatur von 0ºC entfernt. Das übriggebliebene Anisol wurde durch 2 Waschungen mit Ethylether entfernt. Das Peptid wurde dann mit 10% Essigsäure extrahiert.
Die Reinheit des ungereinigten Peptids wurde durch analytische RP-HPLC mit einem Beckmän System Gold und einer Vydac C-18-Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min überprüft. Als Lösungsmittelsystem wurde eine 0,05%ige TFA-Lösung in Wasser (A) und eine 0,05%ige TFA-Lösung in Acetonitril (B) in einem 30minütigen Gradienten von 5-65% B benutzt, wobei die Extinktion bei 215 um bestimmt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative "Waters delta prep. 3000"-HPLC in einer »Waters prep. Pak Nodule Radial Compression C18"-Säule (25 cm · 5 cm, 10-20 um). Als Lösungsmittelsystem wurde eine 0,05%ige TFA-Lösung in Wasser (A) und eine 0,05%ige TFA-Lösung in Acetonitril (B) benutzt. Es wurden verschiedene lineare Gradienten benutzt; die Extinktion bei 230 nm wurde gemessen und es wurden Fraktionen von 40 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden dann in dem analytischen System von Beckman analysiert. Die gewünschten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das trockene Endprodukt wurde noch einmal durch analytische RP-HPLC analysiert. In Fig. 2 werden typische HPLC-Chromatogramme dieses Peptids nach seiner Reinigung gezeigt.

Beispiel 3

Synthese von cyclischer CSVTCG-Säure (SEQ ID NO: 1)

Zur Cyclisierung des Peptids CSVTCG (SEQ ID NO: 1) wurde das ungereinigte Peptid aus Beispiel 2 (52 mg) in 500 ml Wasser, dem der Sauerstoff entzogen worden war, gelöst und der pH-Wert wurde mit 28% NH&sub4;OH (Lösung A) auf 8,5 eingestellt. K&sub3;Fe(CN)&sub6; (1,75 g) wurde in 100 ml Wasser, dem Sauerstoff entzogen worden war, gelöst und der pH-Wert wurde mit 28% NHaOH auf 8,5 eingestellt. Diese Lösung wird Lösung B genannt.
Die Lösung A wurde über 2 Stunden hinweg in die Lösung B gegeben und das Gemisch wurde eine weitere Stunde gerührt. Sodann wurde der pH-Wert mit 10% AcOH auf 4 eingestellt und die Lösung in eine präparative HPLC eingespritzt. Nach der Reinigung wurden 28 mg Peptid mit 95%iger Reinheit gewonnen.
Die Zusammensetzung des cyclischen Materials wurde durch analytische Umkehrphase-HPLC und durch Feb-MS bestätigt. Das Ergebnis einer typischen HPLO-Chromatografie wird in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 4

Chemische Synthese von weiteren Peptiden

Nach den in den Beispielen 1-3 und in Int. J. Peilt. Proc. Res. 21, 57-65 (1983) allgemein beschriebenen Methoden mit geeigneten Modifikationen wurden die folgenden Peptide synthetisiert. Sämtliche Peptide der Erfindung wurden mit herkömmlichen LAL- Testmethoden auf Endotoxine getestet und ihre Endotoxinfreiheit wurde festgestellt.

Beispiel 5

Adhäsion verschiedener Zellen an TSP und an die Peptide

In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Peptiden getestet, um ihre Fähigkeit zur Bindung an verschiedene Zellen mit der von Thrombospondin zu vergleichen. Es wird angenommen, dass die Wirkung von Thrombospondin bei der Metastasierung durch seine adhäsiven Eigenschaften vermittelt wird. In allgemeiner Übereinstimmung mit der Offenbarung von Tuszynski et al. (Anal. Bio. (1990) 184: 189-91) wurde ein Test entwickelt, bei dem die Fähigkeit von Zellen ermittelt wird, an den Thrombospondin-Fragmenten oder -analoga in der Erfindung zu haften. In diesem Test diente Thrombospondin (das mit dem Verfahren von Tuszynski et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 12240-5 gereinigt wurde) als positive Kontrolle; Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Chemical Co.) und die Peptide ANKHYF, VCTGSC und TCVCGS dienten als negative Kontrollen. Die untersuchten Zelltypen waren B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Melanomzellen von Maus, menschliche A549 Lungenadrenokarzinomzellen, glatte Muskelzellen aus Rinderaorta und glatte Muskelzellen von Kaninchen.
Die Thrombospondin-Analoga der der Erfindung wurden wie in den Beispielen 1-4 beschrieben synthetisiert. Zwei Mikrogramm des Peptids bzw. der Kontrollproteine wurden über Nacht in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen an der Luft getrocknet. Die Vertiefungen wurden dann mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und eine Stunde lang mit einer 1%igen Lösung von fettsäurefreiem BSA in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gesättigt.
Die verschiedenen Zellen wurden mit herkömmlichen Methoden kultiviert und in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die geernteten Zellen wurden zweimal mit serumfreiem Dulbecco-Minimalmedium (DMEM) (Flow Laboratories) gewaschen und in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, die 5 mM Glucose und 100 uM MgCl&sub2; enthielt, in einer Endkonzentration von 4 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit den verschiedenen Liganden wurden 200.000 Zellen aus der Zellsuspension gegeben und die Platte wurde 30 Minuten lang in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden durch Absaugen entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit 200 ul PBS gewaschen. Zellgebundenes Gesamtprotein wurde durch Auflösen der anhaftenden Zellen mit 200 ul der BCA-Arbeitslösung von Pierce BCA (Pierce Chem. Co. Heft Nr. 23225 (1987)) in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte direkt ermittelt. Die Platte wurde mit einer adhäsiven Mylar-Folie (Flow Labs) abgedeckt und 30 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Man ließ die Platten auf Raumtemperatur abkühlen; sodann wurde die Abdeckfolie entfernt und die Extinktion jeder Vertiefung bei 562 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Biotek, Burlington, Vermont) ermittelt. Die Extinktionswerte wurden mit Hilfe eines empirisch ermittelten Konversionsfaktors in Anzahl der anhaftenden Zellen umgewandelt.
Die in Fig. 4 grafisch dargestellten Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Peptide der Erfindung gegenüber B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Melanomzellen adhäsive Eigenschaften zeigen. Die Ergebnisse in Tabelle II deuten daraufhin, dass die Peptide der Erfindung bei allen getesteten Zelllinien adhäsive Aktivität zeigen. TABELLE II Prozentanteil der TSP-anhaftenden Zellen

Beispiel 6

Wirkung der Peptide auf die Kollagen-abhängige Adhäsion von B&sub1;&sub0;F&sub1;&sub0;-Melanomzellen

Zwei Mikrogramm Kollagen in 5 mM Essigsäure-Lösung wurden über Nacht bei 4ºC an Vertiefungen adsorbiert. Die Vertiefungen wurden dann mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und eine Stunde lang mit einer 1%igen Lösung von fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (BSA) in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gesättigt. Eine Suspension von B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 5 mM Glucose und 100 uM MnCl&sub2; (200.000 Zellen pro Vertiefung) wurde 15 Minuten lang bei 37ºC entweder in Puffer oder in Puffer mit 100 ug/ml Peptid bzw. 100 ug/ml BSA vorinkubiert. Die Zellsuspensionen wurden dann in Kollagen-beschichtete Vertiefungen gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden durch Absaugen entfernt und anhaftende Zellen durch Bestimmung des zellgebundenen Proteins wie vorstehend in Beispiel 5 beschrieben ermittelt. Die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Peptide in der Erfindung die Bindung von Melanomzellen an Kollagen hemmen.

Beispiel 7

Wirkung der Peptide auf die Metastasierung von B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Lungentumorzellen

Das in vivo-Modell, das zum Nachweis der antimetastatischen Aktivität der Peptid-Verbindungen der Erfindung benutzt wurde, wird von Tuszynski et al. Cancer Res. (1987) 47: 4130-4133) beschrieben. Kurz erläutert: Schwarzen C57-Mäusen wurden 1 · 10&sup5; B&sub1;&sub6;F&sub1;&sub0;-Mausmelanomzellen in Gegenwart von Kontrollpuffer (Hepes-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) oder von 1 mg der angegebenen Peptid-Verbindung der Erfindung intravenös injiziert. Für jede Verbindung wurden fünf bis sechs Tiere benutzt. Wie durch Ausschluss von Trypan Blau-Farbstoff ermittelt, zeigten die in diesem Test getesteten Peptide keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Darüber hinaus zeigten die Peptide in einer Konzentration von 1 mg/ml nach 24stündiger Co-Kultivierung keine Wirkung auf das Zellwachstum. Nach 14 Tagen wurden die Mäuse getötet und die Anzahl der Lungentumore ermittelt.
Die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Peptide in der Erfindung antimetastatische Aktivität haben. Die Balkendiagramme zeigen den Mittelwert der Anzahl der in den Behandlungsgruppen beobachteten Lungentumore und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Fig. 7 zeigt repräsentative Lungen aus den einzelnen Behandlungsgruppen.

Beispiel 8

Test der Proliferation von Kapillarendothelzellen

Es wurde die Wirkung der Peptide der Erfindung auf die Proliferation von Kapillarendothelzellen in vitro ermittelt. Es ist bekannt, dass Kapillarendothelzellen als Reaktion auf einen angiogenetischen Stimulus bei der Gefäßneubildung proliferieren (Ausprunk et al., J. Microrasc. Res. (1977) 14: 53). Durch Verwendung der an der Angiogenese beteiligten spezifischen Zellen, die mit einem bekannten angiogenen Faktor, dem sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), stimuliert wurden, kann die Angiogenese in vitro nachgeahmt werden. Der angewandte Test wurde vom Moses et al. (Science 1990) 248: 1408 = 10) beschrieben. Die Peptide CSVTCG (SEQ ID NO: 1) und CSVTCR (SEQ ID NO: 2) wurden in Dosen von 0,01, 0,1, 1,0, 10 und 100 ug/ml getestet.
Am wirksamsten war das Peptid CSVTCR (SEQ ID NO: 2), das bei 10 ug/ml eine 20%ige Hemmung der Proliferation von stimulierten Endothelzellen und bei 100 ug/ml eine 100%ige Hemmung bewirkte. Das Peptid CSVTCG (SEQ ID NO: 1) bewirkte bei 100 ug/ml eine 39%ige Hemmung.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Eyal, Jacob
Hamilton, Bruce King
Tuszynski, George Paul
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Therapeutische Verwendung von Peptiden mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: W. R. Grace & Co.-Conn.
(B) STRASSE: 7379 Route 32
(C) ORT: Columbia
(D) STAAT: Maryland
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 21044
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: Floppy Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Word Perfect 5.1
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION: 530
(viii) INFORMATION ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Appleby, Vanessa L.
(B) REGISTERNUMMER: 33223
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 01-7900
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (301) 531-4515

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(8) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 14:

Claims

1. Verwendung eines Polypeptids mit Thrombospondin-ähnlicher Aktivität für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Tumoren, wobei das Polypeptid eine Sequenz aufweist, umfassend die Formel:

R&sub1;-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;-X&sub5;-R&sub2;

wobei:

R&sub1; eine geschützte oder ungeschützte aminoterminale Gruppe, umfassend Wasserstoff, Amino, Acetyl oder einen Aminosäurerest oder die Desaminoform davon bedeutet;

X&sub1; und X&sub5; C bedeuten;

X&sub2;, X&sub3; und X&sub4; die gleichen oder verschiedene Aminosäurereste, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R, S, T und V bedeuten,

R&sub2; eine geschützte oder ungeschützte carboxyterminale Gruppe umfassend Hydroxyl, Carboxyl, Amid, oder einen Aminosäurerest umfassend Carboxyamid- oder Alkylamidformen davon, bedeutet;

wobei die Struktur des Polypeptids gegebenenfalls durch eine Bindung zwischen X&sub1; und X&sub5; oder eine Bindung zwischen R&sub1; und R&sub2; cyclisiert ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches Tumorzellmetastasen hemmt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches das Tumorwachstum hemmt.

4. Verwendung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches die Tumorgröße verringert.

5. Verwendung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches die Anzahl der Tumorkolonien verringert.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Aminosäurerest ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Polypeptidverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

CSVTCG (SEQ ID NO: 1),

CSVTCR (SEQ ID NO: 2),

CSTSCR (SEQ ID NO: 3),

CSTSCG (SEQ ID NO: 4),

CRVTCG (SEQ ID NO: 5),

RGRVTCG (SEQ ID NO: 6),

CSVTCK (SEQ ID NO: 8),

CSTSCK (SEQ ID NO: 9),

CSRTCG (SEQ ID NO: 10),

CRTSCG (SEQ ID NO: 11),

CRVTC (SEQ ID NO: 12),

CSTSC (SEQ ID NO: 13) und

PCSVTCR (SEQ ID NO: 14),

wobei jedes Peptid C-terminale Säure- und Amidformen, Disulfid-verknüpfte Formen und desaktivierte (blockierte) Cysteinformen umfassen kann.

8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Polypeptidverbindung mit wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei X&sub2; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S und R, wobei X&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus R, T und V, und wobei X&sub4; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S und T.