DE69323337T2

DE69323337T2 - Derivate des Parathormons

Info

Publication number: DE69323337T2
Application number: DE69323337T
Authority: DE
Inventors: Tsunehiko Fukuda; Shizue Nakagawa; Shigehisa Taketomi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-03-19
Filing date: 1993-03-18
Publication date: 1999-09-02
Anticipated expiration: 2013-03-19
Also published as: US5434246A; DE69323337D1; EP0561412B1; CA2091873C; EP0561412A1; CA2091873A1; ATE176483T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Parathormonderivate, die bei der Hormontherapie brauchbar sind.
Parathormon (PTH) wird in der Nebenschilddrüse synthetisiert und spielt beim Steuern der Blutcalciumkonzentration oder Phosphorsäureionenkonzentration durch Einwirken auf die Knochen, Nieren und den Darm, die seine Zielorgane sind, eine wichtige Rolle. PTH ist ein Peptidhormon, das aus 84 Aminosäuren besteht und dessen biologische Wirkung kann durch ein Peptidfragment eines N-terminalen (Aminosäure 1 bis 34) Abschnitts reproduziert werden [G. W. Tregear et al., Endocrinology 93 1349-1353 (1973)].
Die Aminosäuresequenz des Peptidfragments des N-terminalen (Aminosäure 1 bis 34) Abschnitts dieses PTH vom Human-Typ (dieses Peptidfragment wird hierin nachstehend als Human- PTH(1-34) abgekürzt) ist wie folgt:
Aus der biologischen Wirkung von PTH wird erwartet, daß die Verwendung von PTH als Wirkstoff einen für verschiedene Knochenerkrankungen und dergleichen brauchbaren Wirkstoff liefert. Die folgenden Eigenschaften des Peptids sind jedoch Hindernisse für eine wirksame Verwendung als therapeutisches Mittel:
(1) Das Peptid wird innerhalb des Körpers leicht durch verschiedene Enzyme zersetzt;
(2) die Absorptionswirksamkeit des Peptids im Körper auf verschiedenen Wegen ist sehr niedrig und
(3) das Peptid ist unter verschiedenen physikalisch-chemischen Bedingungen wie etwa Oxidation instabil.
Zum Lösen derartiger Probleme und zum Verstehen der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität des vorstehenden Hormons sind verschiedene Derivate des PTH(1-34)-Fragments synthetisiert worden. Obschon eine Anzahl Synthesen für Rinder-PTH(1-34) ausgeführt worden ist, sind wenige Beispiele für Human-PTH(1- 34) bekannt. Wenn zum Beispiel bei einem derartigen Derivat der C-Terminus Phe von Human-PTH(1-34) in Phe-NH&sub2; umgewandelt wird, wird eine Aktivitätszunahme beobachtet (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-96052). Von dieser Aktivitätszunahme wird angenommen, daß sie auf die Hemmung von Carboxypeptidase zurückzuführen ist, die das Hormon zersetzt. Weiter enthält Human-PTH(1-34) zwei Met-Reste. Ein Molekül, bei dem diese Met-Reste durch Nle-Reste ersetzt sind, hindert das Hormon am Aktivitätsverlust aufgrund einer Oxidation (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-24598).
Weiterhin ersetzten F. E. Cohen et al. Ser in 3-Stellung von Rinder-PTH(1-34) durch verschiedene L-Aminosäuren, aber die Aktivität wurde durch das Ersetzen der Aminosäure deutlich verringert, ausgenommen, daß das Peptid, bei dem durch Ala ersetzt wurde, eine Aktivität zeigte, die ungefähr dieselbe wie die des Peptids vom natürlichen Typ war [The Journal of Biological Chemistry 226 1997-2004 (1991)]. S. Reppe et al. zeigten für das Human-PTH(1-84)-Protein, bei dem Lys in Stellung 26 durch Gln ersetzt war, daß das Protein eine Aktivität aufwies, die der des Proteins vom natürlichen Typ ähnlich war [The Journal of Biological Chemistry 226 14198-14201 (1991)] Weiter offenbart die WO92/00753 einen Ersatz in Stellung 3, 6 oder 9 des Rinder-PTH(1-34)-Fragments und Biochemistry 17, Nr. 16, 3188-3191 (1978), führt die Überführung der Arg-Reste in Stellung 20 und 25 des Human-PTH(1-34)-Fragments in N&sup7;, N&sup8;-(1,2- Dihydroxycyclohex-1,2-ylen)-argininreste an.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Zum Lösen der vorstehend beschriebenen Probleme ersetzten die Erfinder zuvor einen oder mehr Aminosäurereste von Human- PTH(1-34) durch chemische Synthese und schlugen mehrere Human- PTH(1-34)-Derivate durch (1) Ersetzen eines Aminosäurerestes im Hinblick auf die Resistenz gegen verschiedene Proteasen, (2) Verstärkung der Aktivität des Hormons entsprechend dem Ersetzen eines Aminosäurerestes im Hinblick sowohl auf die erwartete zweidimensionale Struktur als auch das hydrophile/hydrophobe oder ionische Medium und (3) Ersetzen des unter sauren, basischen oder oxidierenden Bedingungen instabilen Aminosäurerestes durch einen unter diesen Bedingungen stabilen Aminosäurerest (europäische Patentveröffentlichung Nr. 477 885). Als Ergebnis einer weiteren intensiven Untersuchung haben die Erfinder nun gefunden, daß ein Ersatz der Aminosäure in 3-Stellung, 14-Stellung, 15-Stellung, 16-Stellung, 17- Stellung, 25-Stellung, 26-Stellung, 27-Stellung oder 34- Stellung oder Kombinationen davon Peptidderivate mit ausgezeichneter Aktivität liefert.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid, das durch die folgende Aminosäuresequenz dargestellt wird:
Ser-Val-R&sub1;-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R&sub2;-Met- Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-R&sub3;-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R&sub4;
oder ein Salz davon bereit, wobei R&sub1; Ser oder einen D-α- Aminosäurerest mit 4 oder weniger Kohlenstoffatomen darstellt, R&sub2; eine Tetrapeptidkette A-B-C-D darstellt, in der A einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, B Leu oder einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, C einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt und D einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, wobei der wasserlösliche Aminosäurerest aus D- oder L-Lys, Gln, Asp, Glu, Thr, Asn, Arg, Ser, His, Ornithin, Homoarginin, 2,3-Diaminopropionsäure und Gly ausgewählt ist,
R&sub3; eine Tripeptidkette E-F-G darstellt, die wenigstens eine neutrale oder basische Aminosäure enthält, wobei die neutrale Aminosäure aus Ser, Asn, Gln, Thr, Gly, Cit und Hci ausgewählt ist und die basische Aminosäure eine L- oder D-α-Aminosäure der Formel
ist, wobei Z NH&sub2;, NHC(NH)NH&sub2; oder eine Imidazolylgruppe darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt, und
R&sub4; einen aromatischen Aminosäurerest oder ein Amid davon darstellt,
mit der Ausnahme von Peptiden, bei denen R&sub1; Ser ist, R&sub2; His- Leu-Asn-Ser ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys, His-Lys-Lys, Arg-His-Lys, Arg- Lys-Leu oder Arg-Lys-Gln ist und R&sub4; Phe oder Phe-NH&sub2; ist.
Somit werden Peptide erwartet, bei denen R&sub1; Ser ist, wenn R&sub2; His-Leu-Asn-Ser ist, R&sub3; E-F-G ist, wobei E Arg oder His ist, F Lys oder His ist, G Lys, Leu oder Gln ist.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Beschreibung schließen die durch R&sub1; dargestellten D-α-Aminosäuren mit 4 oder weniger Kohlenstoffatomen neutrale Aminosäuren wie etwa D-Ala, D-Asn, D-Cys, D-Ser und D-Thr und vorzugsweise D-α-Aminosäuren mit 3 oder weniger Kohlenstoffatomen wie etwa D-Ser und D-Ala ein.
In der durch -A-B-C-D dargestellten Tetrapeptidkette mit wenigstens einer wasserlöslichen Aminosäure ist die wasserlösliche Aminosäure aus D- oder Lys, Gln, Asp, Glu, Thr, Asn, Arg, Ser, His, Ornithin, Homoarginin, 2,3-Diaminopropionsäure und Gly ausgewählt, worunter Lys und Arg bevorzugt sind.
Eine Kombination von A, B, C und D von R&sub2; kann eingesetzt werden und bevorzugte Kombinationen schließen His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys und His-Leu-Lys-Ser ein.
In R&sub3; ist eine Tripeptidkette E-F-G, die wenigstens eine neutrale oder basische Aminosäure aufweist, wobei die neutrale Aminosäure aus Ser, Asn, Gln, Thr, Gly, Cit und Hci ausgewählt ist. Die bevorzugten basischen Aminosäurereste sind Arg, Lys, His, Ornithin (Orn), Homoarginin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,4-Diaminobuttersäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure und 2- Amino-3-guanidinopropionsäure, wobei die bevorzugtesten basischen Aminosäurereste Lys, Arg und Orn sind.
Jede Kombination von E, F und G von R&sub3; kann eingesetzt werden und Arg-Gln-Gln und Arg-Lys-His sind am meisten bevorzugt.
R&sub4;, ein aromatischer Aminosäurerest oder ein Amid davon schließt Phe, Phe-NH&sub2;, Tyr und Tyr-NH&sub2; ein.
Ein Ersatz im PTH(1-34)-Fragment kann nicht nur in einer Stellung erfolgen, sondern auch in zwei oder mehr Stellungen durch eine Kombination von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;. Eine Ersatzkombination in bis zu vier Stellungen ist durchführbar, wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Insbesondere im Falle eines Ersatzes in der 3- oder 34-Stellung ist eine Kombination mit anderen Ersetzungen in einer anderen Stellung bevorzugt.
Die Peptidsynthese kann in der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers durchgeführt werden. Das Verfahren von R. B. Merrifield [Advances in Enzymology 32 221-296 (1969)] findet entsprechende Anwendung auf einen grundlegenden Syntheseweg. Bei diesem Verfahren wird die Aminosäure des Carboxylterminus kovalent an den Harzträger gebunden und die Entfernung einer Schutzgruppe von einer α-Aminogruppe und die Kondensation einer geschützten Aminosäure werden unter Verlängern einer Peptidkette zum Aminoterminus nacheinander wiederholt, wodurch ein geschütztes Peptidharz mit der gewünschten Aminosäuresequenz erhalten wird. Dieses Verfahren beruht auf dem vorstehend beschriebenen Prinzip. Die Kondensation jeder Aminosäure und das Entfernen der Schutzgruppen von den α-Aminogruppen wird unter ungefähr ähnlichen Bedingungen ausgeführt und es wird keine Zwischenproduktreinigung ausgeführt. Peptide dieser Erfindung können durch dieses Verfahren rasch synthetisiert werden, so daß dieses Verfahren zum Synthetisieren verschiedener Peptide sehr bequem ist. Das auf diese Weise erhaltene geschützte Peptidharz wird zum Beispiel mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Trifluormethansulfonsäure oder Trifluoressigsäure in Gegenwart verschiedener Additive umgesetzt, wodurch die Trennung des Peptids vom Harz und das Entfernen aller Schutzgruppen in einem Schritt erreicht werden kann.
Das sich daraus ergebende rohe Peptid kann durch bekannte Mittel zum Reinigen von Peptiden oder Proteinen gereinigt werden. Beispiele derartiger Mittel schließen die Säulenchromatographie nach verschiedenen Prinzipien wie etwa Gelfiltration, Io nenaustauschchromatographie mittels eines Kationenaustauschharzes oder eines Anionenaustauschharzes, Hydrophobierungschromatographie und Teilungsadsorptionschromatographie und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ein.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Salzformen erhalten werden. Beispiele von Salzen schließen Salze anorganischer Säuren, Salze organischer Säuren wie etwa Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure und Zitronensäure, Salze anorganischer Basen wie etwa Natrium und Ammonium und Salze organischer Basen wie etwa Triethylamin, Ethylamin und Methylamin ein.
Die durch die allgemeine Formel dargestellten Human-PTH(1-34)- Peptidderivate der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Mittel bei Osteoporose, Hypoparathyroidismus und Bluthochdruck verwendet werden. Deren Formen schließen Injektionen, Mittel zur nasotrachealen Absorption, Mittel zur perrektalen Absorption, Mittel zur transvaginalen Absorption, Mittel zur perkutanen Absorption und Augentropfen ein. In einigen Fällen werden sie oral verabreicht.
Wenn die Peptide als derartige therapeutische Mittel verwendet werden, werden wirksame Mengen davon zum Behandeln von Säugern, insbesondere Menschen verwendet. Obschon sie allgemein innerhalb des Bereiches von 1 ng bis 100 ug/kg Gewicht verwendet werden, können genaue Mengen derselben durch den Fachmann bestimmt werden.
Wenn die Peptide als therapeutische Mittel verwendet werden, müssen sie sorgfältig gereinigt werden, um keine Bakterien und keine Pyrogene zu enthalten. Eine derartige Reinigung kann gemäß in der Technik bekannten Verfahren ausgeführt werden.
Wenn die Peptide als therapeutische Mittel für Osteoporose verwendet werden, können sie parenteral in Form der vorstehend beschriebenen Injektionen, Mittel zur nasotrachealen Absorption, Mittel zur perrektalen Absorption, Mittel zur transvaginalen Absorption, Mittel zur perkutanen Absorption oder Augentropfen, allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln verabreicht werden. Im Falle der Injektionen ist es angebracht, daß die Peptide an Erwachsene in einer Dosis von 50 ng/kg bis 5 mg/kg über 1 bis 3 Tage und vorzugsweise in einer Dosis von 1 bis 500 ug/kg über 1 bis 3 Tage verabfolgt werden. Bei den Injektionen ist es angebracht, daß die Konzentration der therapeutischen Mittel 10 bis 100 ug/ml ist.
Wenn Aminosäuren in dieser Beschreibung durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die von der IUPAC-IUB-Kommission für Biochemische Nomenklatur anerkannten Abkürzungen oder die im Stand der Technik gemeinhin verwendeten eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, versteht es sich solange nicht anders angegeben, daß die L-Formen dargestellt sind.
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Val: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Cys: Cystein
Met: Methionin
Glu: Glutaminsäure
Asp: Asparaginsäure
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tyr: Tyrosin
Trp: Tryptophan
Pro: Prolin
Asn: Asparagin
Gln: Glutamin
Nle: Norleucin
Cit: Citrullin
Hci: Homocitrullin
Orn: Ornithin
hPTH: Human-PTH
Durch den vorstehend beschriebenen Aminosäureersatz in PTH(1- 34) wird die Resistenz gegen verschiedene Proteasen erhöht und es wird ein Andauern der Aktivität im Blut erhalten. Dies wird zum Beispiel durch Ersetzen der 3-Stellung von PTH(1-34) durch D-α-Aminosäuren erreicht. Weiter zeigt sich durch den Ersatz wenigstens einer Position von 14 bis 17 durch (eine) andere wasserlösliche α-Aminosäure(n) eine hohe PTH-Aktivtät.
Weiterhin wurde beobachtet, daß die Aktivität auch durch den Ersatz wenigstens einer basischen Aminosäure in Stellung 25 bis 27 durch (eine) wasserlösliche α-Aminosäure(n), insbesondere andere neutrale oder basische Aminosäure(n), aufrecht erhalten oder erhöht wird.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend durch die folgenden Beispiele im einzelnen beschrieben.

BEISPIEL 1 Synthese und Reinigung von Derivaten des PTH(1-34)-Fragments

Die Peptide wurden gemäß einem abgeänderten Verfahren der von R. B. Merrifield et al., Adv. Enzymol. 32 221-296 (1969), entwickelten Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert und es wurde ein automatischer Peptidsynthetisierer 430A (Applied Biosystems) verwendet. Geschützte Peptidharze wurden unter Verwenden von Applied Biosystems angegebener Vorschriften synthetisiert. Geschützte Aminosäure-p-oxymethylphenylacetamidomethylharze (Polystyrol - 1% Divinylbenzol) werden als Ausgangsmaterialien verwendet, wenn Derivate mit freien Carbonsäuren als Carboxyltermini gewünscht werden und 4-Methylbenzhydrylharze werden als Ausgangsmaterialien verwendet, wenn Derivate von Carboxamiden gewünscht werden und geschützte Aminosäuren wurden nacheinander daran kondensiert. Zum Schützen einer α- Aminogruppe jeder Aminosäure bei der Kondensation wurde eine tert-Butoxycarbonylgruppe (BOC) verwendet. Funktionelle Seitengruppen wurden in der folgenden Weise geschützt. Hydroxylgruppen von Serin und Threonin wurden als O-Benzylether, eine Hydroxylgruppe von Tyrosin als p-Brombenzyloxycarbonylester, Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure als Benzylester, der Imidazolstickstoff von Histidin mit Benzyloxymethyl, die Aminogruppe in der Seitenkette von Lysin mit 2- Chlorbenzyloxycarbonyl, eine Aminogruppe in der Seitenkette von Ornithin mit Benzyloxycarbonyl, eine funktionelle Guanidinogruppe von Arginin mit einer p-Toluolsulfonylgruppe und das Indolimin von Tryptophan mit einer Formylgruppe geschützt. Alle Aminosäuren wurden von Applied Biosystems Japan, Nova Biochem und Bachem Chemicals erhalten.
Nachdem alle Aminosäuren an das Harz kondensiert worden waren, wurde das geschützte Peptidharz dem Synthetisierer entnommen und getrocknet. Man ließ das Peptidharz (1 g) mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (8 ml), der p-Kresol (1 ml), 1,2-Ethandithiol (1 ml) und 2-Mercaptopyridin (100 mg) enthielt, 2 Stunden bei 0ºC reagieren. Nach Abschluß der Reaktion wurde Fluorwasserstoff durch Destillation entfernt und der Rückstand wurde mit Diethylether unter Entfernen der meisten Additive gewaschen. Das Peptid wurde mit 3% Essigsäure (10 ml) extrahiert und das Harz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Gelfiltration mittels einer Sephadex® G-25-Säule gereinigt. Die Bedingungen für die Gelfiltration waren wie folgt: Säulengröße: 2,8 · 60 cm; Nachweiswellenlänge: 230 oder 280 nm; Lösungsmittel: 3%ige Essigsäure; Fließgeschwindigkeit: 40 ml/Stunde. Das Peptid enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und anschließend lyophilisiert. Die sich daraus ergebende pulverige Probe wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie weiter gereinigt [Säule: YMC-Pack A-324 ODS (10 · 250 mm); Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Wasser; Elutionslösungsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Acetonitril; Programm zur Lineargradientenelution: 0 Minuten (90% A + 10% B), 30 Minuten (60% A + 40% B) (nötigenfalls kann manchmal ein anderes Elutionsprogramm verwendet werden); Elutionsgeschwindigkeit: 1,6 ml/Minute; Nachweiswellenlänge: 230 oder 280 nm]. Das gewünschte reine Produkt enthaltende Peakfraktionen wurden gesammelt und durch eine Bio RAD AGIX8-Säule (Acetat form, 1,8 · 5 cm) geführt. Das Eluat wurde mit den Waschflüssigkeiten vereinigt und Acetonitril wurde daraus durch Destillation entfernt, gefolgt von der Lyophilisierung.
Die auf diese Weise erhaltenen Peptide, das Ergebnis der Aminosäureanalyse und die Retentionszeiten bei der HPLC werden in Tabelle 1 dargestellt.
In Tabelle 1 sind a, b und c wie folgt:
a: Die Peptide wurden im verschlossenen Rohr mit 6 N Salzsäure unter verringertem Druck in Gegenwart von 4% Thioglykolsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und anschließend der Aminosäureanalyse unterzogen. Die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben.
b: Namen von Testverbindungen (kein NH&sub2; am Terminus bedeutet COOH):
(1) [D-Ser³]hPTH(1-34)NH&sub2;
(2) [D-Ala³]hPTH(1-34)
(3) [Thr¹&sup6;]hPTH(1-34)
(4) [Glu¹&sup6;]hPTH(1-34)
(5) [Lys¹&sup6;]hPTH(1-34)
(6) [Thr²&sup7;]hPTH (1-34)
(7) [Asn²&sup7;]hPTH(1-34)
(8) [Gln26,27]hPTH(1-34)
(9) [Gln25,26,27]hPTH(1-34)
(10) [Ser²&sup7;]hPTH(1-34)
(11) [Gly²&sup7;]hPTH(1-34)
(12) [His²&sup7;]hPTH(1-34)
(13) [Lys¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34)
(14) [Orn¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34)
(15) [Hci¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34)
(16) [Asp¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34)
(17) [Arg¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34)
(18) [Arg26,27]hPTH(1-34)
(19) [Gln²&sup6;]hPTH(1-34)
(20) [Lys15,16,His²&sup7;]hPTH(1-34)
(21) [Lys¹&sup5;, His²&sup7;]hPTH(1-34)
(22) [Gln²&sup5;]hPTH(1-34)
(23) [D-Lys¹&sup6;]hPTH(1-34)
(24) [Lys15,16,17,His²&sup7;]hPTH(1-34)
(25) [Gln¹&sup6;]hPTH(1-34)
(26) [Ser¹&sup6;]hPTH(1-34)
(27) [Gly¹&sup6;]hPTH(1-34)
(28) [Lys¹&sup6;]hPTH(1-34)NH&sub2;
(29) [Lys¹&sup6;, Asp¹&sup7;]hPTH(1-34)
(30) [Lys14,15,16,17]hPTH(1-34)
(31) [Lys15,16,17]hPTH(1-34)
(32) [Lys16,17]hPTH(1-34)
(33) [Arg16,17]hPTH(1-34)
(34) (Arg15,16,17)hPTH(1-34)
c: Retentionszeit der Peptide bei der Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie
Analysenbedingungen: es wurde ein VISTA 5000 Hochleistungschromatograph (Varian), der mit einem automatischen Probensammler 712W (Waters) verbunden war, verwendet. Säule: YMC A- 324 ODS (4,6 · 250 mm); Elutionsmittel: A, 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Wasser; Elutionsmittel: B, 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Acetonitril; Lineargradientenelutionsprogramm: 0 Minuten (80%A + 20%B), 30 Minuten (50% A + 50% B) Fließgeschwindigkeit: 0,7 ml/Minute; Nachweiswellenlänge: 280 nm. Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b) Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PTH(34)-Derivaten (a) (Fortsetzung) Peptidderivat (b)

BEISPIEL 2 Test der biologischen Aktivität von PTH(1-34)- Derivaten

Die biologische Aktivität der PTH(1-34)-Derivate wurde durch eine abgeänderte Version des von Shigeno et al. in The Journal of Biological Chemistry 263 18369-18377 (1988), mitgeteilten Verfahrens bestimmt. Eine Kulturlösung (Hanksche Lösung, die 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 0,1% Rinderserumalbumin und 0,5 mM Isobutylmethylxanthin enthielt), die 0,01, 0,1, 1, 10 oder 100 nM Derivat enthielt, wurde in einer Menge von 100 ul einem aus Maus-Schädelknochen stammenden, Osteoblasten-ähnlichen Zellstamm, MC3T3-EI-Zellen, zugesetzt, die auf einer Multiplatte mit 96 Näpfchen (Nunclon, Nung) kultiviert wurden, gefolgt von 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Zugabe von 100 ul 0,2 N Salzsäure wurde das Gemisch 2,5 Minuten in siedendes Wasser getaucht und das durch einen PTH-Rezeptor produzierte cyclische Adenosinmonophosphat (cAMP) wurde aus den Zellen extrahiert. Das gesamte cAMP in der Kulturlösung und den Zellen wurde mittels eines handelsüblichen Radioimmungssaykits (Kit für cyclisches AMP [¹²&sup5;I] "Du Pont-Daiichi", Daiichi Kagaku Yakuhin) bestimmt. Eine Zunahme der cAMP-Produktion in Abhängigkeit von dem als Standard zugesetzten Human-PTH(1-34) wurde in jedem Fall beobachtet. Die biologische Aktivität der PTH(1-34)-Derivate wird in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Biologische Aktivität von PTH(1-34)-Analoga (dargestellt durch die relative Aktivität gegenüber hPTH(1-34)

hPTH(1-34) 1.00
[D-Ala³]hPTH(1-34) 2.17
[Thr¹&sup6;]hPTH(1-34) 1.74
[Glu¹&sup6;]hPTH(1-34) 1.55
[Lys¹&sup6;]hPTH(1-34) 3.37
[Thr²&sup7;]hPTH(1-34) 0.96
[Gln26,27]hPTH(1-34) 1.19
[Gln25,26,27]hPTH(1-34) 0.41
[Orn¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34) 1.82
[Hci¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34) 1.54
[Arg¹&sup6;, Gln²&sup7;]hPTH(1-34) 2.16
[Arg26.27]hPTH(1-34) 0.98
[Lys15,16,His²&sup7;]hPTH(1-34) 1.49
[D-Lys¹&sup6;]hPTH(1-34) 0.86
[Lys15,16,17, His²&sup7;]hPTH(1-34) 7.47
[Gln¹&sup6;]hPTH(1-34) 1.73
[Lys¹&sup6;, Asp¹&sup7;]hPTH(1-34) 1.24
[Lys15,16,17]hPTH(1-34) 7.62
[Lys14,15,16,17]hPTH(1-34) 8.85
[Lys16,17]hPTH(1-34) 6.39
[Lys¹&sup6;]hPTH(1-34) 5.48

SEQUENZLISTE

SEQ. ID. NR. 1:

SEQUENZLÄNGE: 34 Aminosäuren
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
FRAGMENTTYP: N-terminal

SEQ. ID. NR. 2:

SEQUENZLÄNGE: 34 Aminosäuren
TYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: Protein
FRAGMENTTYP: N-terminal
MERKMAL:
ORT: 3 Xaa = Ser oder D-α-Aminosäurerest mit 4 oder weniger Kohlenstoffatomen, 14 Xaa = His oder wasserlösliche α- Aminosäure, 15 Xaa = Leu oder wasserlösliche α-Aminosäure, 16 Xaa = wasserlösliche α-Aminosäure, 17 Xaa = Ser oder wasserlösliche α-Aminosäure, 25 Xaa = wasserlösliche α-Aminosäure, 26 Xaa = wasserlösliche α-Aminosäure, 27 Xaa = wasserlösliche α-Aminosäure, 34 Xaa = aromatische Aminosäure oder Amid derselben NACHWEISVERFAHREN: E

Claims

1. Peptid mit der Aminosäuresequenz

Ser-Val-R&sub1;-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R&sub2;-Met- Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-R&sub3;-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R&sub4;

oder ein Salz davon, wobei R&sub1; Ser oder einen D-α- Aminosäurerest mit 4 oder weniger Kohlenstoffatomen darstellt,

R&sub2; eine Tetrapeptidkette A-B-C-D darstellt, in der A einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, B Leu oder einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, C einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt und D einen wasserlöslichen Aminosäurerest darstellt, wobei der wasserlösliche Aminosäurerest aus D- oder L-Lys, Gln, Asp, Glu, Thr, Asn, Arg, Ser, His, Ornithin, Homoarginin, 2,3-Diaminopropionsäure und Gly ausgewählt ist,

R&sub3; eine Tripeptidkette E-F-G darstellt, die wenigstens eine neutrale oder basische Aminosäure enthält, wobei die neutrale Aminosäure aus Ser, Asn, Gln, Thr, Gly, Cit und Hci ausgewählt ist und die basische Aminosäure eine L- oder D-α-Aminosäure der Formel

ist, wobei Z NH&sub2;, NHC(NH)NH&sub2; oder eine Imidazolylgruppe darstellt und n eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt, und

R&sub4; einen aromatischen Aminosäurerest oder ein Amid davon darstellt,

mit der Ausnahme von Peptiden, bei denen R&sub1; Ser ist, R&sub2; His-Leu-Asn-Ser ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys, His-Lys-Lys, Arg- His-Lys, Arg-Lys-Leu oder Arg-Lys-Gln ist und R&sub4; Phe oder Phe-NH&sub2; ist.

2. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei R&sub1; ein neutraler Aminosäurerest ist.

3. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei die basische Aminosäure in der Tripeptidkette E-F-G aus Arg, Lys, His, Ornithin, Homoarginin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,4- Diaminobuttersäure, 2-Amino-4-guanidinobuttersäure und 2- Amino-3-guanidinopropionsäure ausgewählt ist.

4. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem basischen Aminosäurerest um Lys, Arg oder Orn handelt.

5. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei R&sub1; Ser, D-Ser oder D-Ala ist.

6. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 2, wobei A His oder Lys ist.

7. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 2, wobei B Leu, Lys oder Arg ist.

8. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 2, wobei C Asn, Orn, Hci, Asp, Arg, Lys, D-Lys, Ser oder Gly ist.

9. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 2, wobei D Ser, Lys, Asp oder Arg ist.

10. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei R&sub2; His- Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys oder His- Leu-Lys-Ser ist.

11. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei E Arg oder Gln ist.

12. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei F Lys, Gln oder Arg ist.

13. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei G Lys, Gln, Arg, His, Asn, Thr oder Ser ist.

14. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei R&sub3; Arg- Gln-Gln oder Arg-Lys-His ist.

15. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei R&sub4; Phe, Phe-NH&sub2;, Tyr oder Tyr-NH&sub2; ist.

16. Peptid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei

(1) R&sub1; Ser ist, R&sub2; His-Lys-Lys-Lys ist, R&sub3; Arg-Lys-His ist und R&sub4; Phe ist,

(2) R&sub1; Ser ist, R&sub2; His-Lys-Lys-Lys ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys ist und R&sub4; Phe ist,

(3) R&sub1; Ser ist, R&sub2; His-Leu-Lys-Lys ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys ist und R&sub4; Phe ist,

(4) R&sub1; Ser ist, R&sub2; Lys-Lys-Lys-Lys ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys ist und R&sub4; Phe ist oder

(5) R&sub1; Ser ist, R&sub2; His-Leu-Lys-Ser ist, R&sub3; Arg-Lys-Lys ist und R&sub4; Phe-NH&sub2; ist.