Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate. Im Besonderen
betrifft sie Antagonisten des Nebenschilddrüsenhormons.
Hintergrund der Erfindung
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Das Nebenschilddrüsenhormon (das im weiteren als PTH
bezeichnet wird) ist ein aus 84 Aminosäureresten bestehendes
Peptidhormon, das für den Knochen- und Calciumstoffwechsel
verantwortlich ist. Ein aus den ersten 34 N-terminalen
Aminosäureresten bestehendes Peptidfragment von PTH, das PTH
(1 - 34) genannt wird, hat die gleiche biologische Aktivität
wie PTH. Andererseits ist bekannt, daß andere
Peptidfragmente, bei denen die ersten N-terminalen
Aminosäuren fehlen, PTH (3 - 34), PTH (7 - 34) und
dergleichen, die PTH Aktivität unterdrücken.
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Vor kurzem wurde festgestellt, daß ein von einem menschlichen
Karzinom stammendes PTH verwandtes Peptid (das im weiteren
als PTHrP bezeichnet wird) dem PTH ähnliche biologische
Aktivität aufweist, und dessen chemische Struktur wurde
bestimmt (Suva et al., Science, Bd. 237, 893, 1987). Das
menschliche PTHrP ist ein aus 141 Aminosäureresten
bestehendes Polypeptid. Es hat eine biologische Aktivität,
die der von PTH ähnlich ist, wie Erhöhung des Calciumgehaltes
im Blut, Beschleunigung der Knochenabsorption, Senkung des
Phosphorgehaltes im Blut, Senkung des Harncalciumgehaltes,
Zunahme der cAMP-Konzentration im Urin und Aktivierung der
Hydroxylase an der 1-Position von Vitamin D in der Niere
(Horiuchi et al., Science, Bd. 238, 1988; Kemp et al.,
Science, Bd. 238, 1988).
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Die Beziehung zwischen Struktur und Funktion des ganzen
rekombinaten PTHrP und dessen aminotermialen Fragmenten wird
in Henry J. Donahue, et al.; J. Endocrinology, Bd. 126, Nr. 3
(1990) beschrieben. Die Wirkungen von PTHrP auf die
cytosolische Calciumionenmobilisierung und die
Adenylatcyclaseaktivierung wurde in roten
Osteoblastähnlichen Zellen untersucht.
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Die Gefäßaktivität von PTHrP wird in Mane-Josè Musso, et
al.; European Journal of Pharmacology, Bd. 174, S. 139-151
(1989) beschrieben. Dieser Artikel befaßt sich mit der
gefäßerweiternden Wirkung von PTHrP-(1-34) auf die
Herstellung des isolierten Nierenpräparat der Ratte und
dessen Aktivität, die Adenylatcyclase in den von Kaninchen
Nierenrinden-isolierten Mikrogefäßen zu stimulieren. Der in
diesem Artikel verwendete Antagonist ist ein bekanntes PTH-
Fragment, und das darin offenbarte PTHrP-Fragment besitzt
keine Struktur eines Antagonisten.
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C.P. Rodda, et al.; Journal of Endocrinology, Bd. 117, S.
261-271 (1988) beschäftigt sich mit einem neuen PTHrP, das in
fetalen Nebenschilddrüsen des Lammes und in der Placenta des
Schafes festgestellt wurde und mit einem ähnlichen Protein,
das an der humoralen Hypercalcämie mit Malignität beteiligt
ist, verglichen wurde.
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Die Primärstruktur von PTHrP hat mit der von PTH eine geringe
Ähnlichkeit, obwohl die Partialstruktur von PTHrP am
Aminoterminus Ähnlichkeit zu der von PTH zeigt. Trotz dieser
Tatsache unterdrücken PTHrP-Fragmente, bei denen einige
aminoterminalen Reste fehlen, z.B. PTHrP(3-34), die PTH
Aktivität gleichermaßen wie PTH (Rabbani et al., mündlicher
Vortrag bei der Konferenz der America Bone Metabolism
Association, 1988).
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PTH-Derivate wie [Tyr³&sup4;]-hPTH(3-34)-NH&sub2; und PTHrP-Derivate wie
hPTHrP(3-34)-NH&sub2; sind als PTH-Antagonisten bekannt. (Tyr³&sup4;)-
hPTH(3-34)-NH&sub2; ist z.B. in J. Endocrinology, Bd. 108, S. 261-
265 (1986) offenbart. Jedoch besteht ein Bedarf, wirksamere
Aktivitäten von PTH-Antagonisten zu entwickeln. Diese
Erfindung betrifft die Peptide, die aus 25-50
Aminosäureresten bestehen und die folgende Peptidsequenz
umfaßt, und Amide und Salze davon.
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Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-
Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile ... (I)
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Die folgenden Abkürzungen werden in diesem Text verwendet.
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Asp: Asparaginsäure
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Thr: Threonin
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Ser: Serin
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Asn: Asparagin
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Gln: Glutamin
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Glu: Glutaminsäure
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Gly: Glycin
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Ala: Alanin
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Met: Methionin
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Ile: Isoleucin
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Leu: Leucin
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Phe: Phenylalanin
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Lys: Lysin
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His: Histidin
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Arg: Arginin
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Boc: t-Butoxycarbonyl
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Z: Benzyloxycarbonyl
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OcHx: Cyclohexylester
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OBzl: Benzylester
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Bzl: Benzyl
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Tos: p-Toluolsulfonyl
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Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
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Die Peptidderivate der Erfindung enthalten mindestens die
Peptidsequenz, die durch die oben genannte Formel (I)
dargestellt wird. Z.B. können die Peptidderivate der
Erfindung durch die folgende Formel (II) dargestellt werden:
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X-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-
Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-Y-Z ... (II)
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worin X H, H-Gln-, H-A-Gln-, H-Glu-A-Gln- oder Ser-Glu-A-Gln-
darstellt, worin A Ile, Thr, Val oder Leu darstellt; Y His-
Thr-Ala, His-Thr-Ala-Glu-Ile-Arg-Ala, His-Thr-Ala-Glu-Ile-
Arg-Ala-Thr-Ser-Glu-Val oder His-Thr-Ala-Glu-Ile-Arg-Ala-Thr-
Ser-Glu-Val-Ser-Pro-Asn-Ser-Lys-Pro-Asn darstellt; Z OH oder
NH&sub2; darstellt.
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Die nachstehende Tabelle 1 führt spezielle Beispiele der
Peptidderivate der Erfindung auf.
Tabelle 1
X-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-
Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-Y-Z ... (II)
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Die Peptidderivate der Erfindung können nach der Umwandlung
in pharmakologisch annehmbare Salze davon wie, Hydrochlorid
oder Acetat, verwendet werden.
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Die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellten PTHrP-
Derivate der Erfindung können durch wiederholte
Kondensationsreaktion zwischen den relevanten geschützten
Aminosäuren mittels konventioneller Festphasenverfahren
hergestellt werden, wobei diese Reaktion vom C-Terminus
ausgehend der Reihe nach und entsprechend der in den Formeln
(I) oder (II) gezeigten Aminosäuresequenz und durch die
Entfernung der Schutzgruppen und Träger, an die der C-
terminale Aminosäurerest gebunden ist, mittels bekannter
Verfahren wie Säurespaltung und Aminoslyse durchgeführt wird.
Das oben genannte Peptid-Syntheseverfahren und die darin
verwendeten Ausgangsaminosäurederivate sind im Detail in
verschiedenen Textbüchern beschrieben (siehe Izumiya et al.,
"Basis and Practice of Peptide Synthesis", veröffentlicht von
Maruzen, 1985; Gross und Meienhofer's, "The Peptides", Bd. 2,
Academic Press, 1980).
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Die in der Peptidsynthese zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Peptidderivate verwendeten Festphasenträger
können herkömmliche sein, und spezielle Beispiele sind
Polystyrolharze vom substituierten Benzyltyp, Polystyrolharze
vom Hydroxymethylphenylessigsäureamid-Typ, substituierte
Benzhydrylpolystyrolharze oder Polyacrylamidharze mit einer
funktionellen Gruppe, um an ein Peptid zu binden. Die
Aminosäurekondensation kann auch konventionell sein, und
Dicyclohexylcarbodiimid (DDC)-, Säureanhydrid- und aktivierte
Esterverfahren können verwendet werden.
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Schutzgruppen der geschützten Ausgangsaminosäuren können
Gruppen sein, die bei der herkömmlichen Peptidsynthese
bekannt sind und mittels herkömmlicher Mittel, wie
Säurezersetzung Reduktion oder Aminolyse leicht entfernt
werden. Spezielle Beispiele der Aminoschutzgruppen sind
Formyl; Trifluoracetyl; Benzyloxycarbonyl; substituierte
Benzyloxycarbonyle wie (ortho- oder para-)
Chlorbenzyloxycarbonyl und (ortho- oder para-)
Brombenzyloxycarbonyl; und aliphatisches Oxycarbonyl wie t-
Butoxycarbonyl und t-Amyloxycarbonyl. Die Carbonsäure in den
Aminosäuren kann durch Umwandlung in die Estergruppe
geschützt werden. Als Estergruppen können genannt werden:
Benzylester; substituierte Benzylester wie
Methoxybenzylester; Alkylester wie Cyclohexylester,
Cycloheptylester oder t-Butylester. Eine Guanidino-Gruppe
erfordert keine Schutzgruppe, aber kann durch Nitro; oder
Arylsulfonyl, wie Tosyl, Methoxybenzolsulfonyl, oder
Mesithylensulfonyl geschützt werden. Schutzgruppen für
Imidazol schließen Tosyl, Benzyl und Dinitrophenyl ein. In
Serin- und Threoninmolekülen vorhandene Hydroxygruppen können
ungeschützt oder durch Benzyl oder substituiertes Benzyl
geschützt sein. Die Indolgruppe des Tryptophanmoleküls kann
ungeschützt oder durch Formyl oder dergleichen geschützt
sein.
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Die endgültige Abspaltung der Schutzgruppen und die Ablösung
des resultierenden Peptids vom Träger kann unter Einwirkung
von wäßrigem Fluorwasserstoff in der Gegenwart eines von
verschiedenen Radikalfängern durchgeführt werden. Beispiele
für Radikalfänger sind Anisol, (ortho-, meta- oder para-)
Cresol, Dimethylsulfid, Thiocresol, Ethandiol und
Mercaptopyridin, die alle bei der Peptidsynthese
konventionell verwendet werden. Die Reinigung des
resultierenden Peptids kann mittels konventioneller Verfahren
wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und
Hoch- oder Niederdruck-Umkehrphasen-Chromatographie durchgeführt
werden. Das auf diese Weise gereinigte Peptid kann unter
Verwendung von Gelchromatographie, die mit wäßriger
Essigsäure oder wäßriger Salzsäure äquilibriert ist, in
dessen Salz umgewandelt werden.
Beste Art für die Durchführung der Erfindung
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Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung einiger
spezifischer Merkmale dieser Erfindung angegeben. Die
Beispiele sind nur repräsentativ und sollten in keiner Weise
als eine Einschränkung angesehen werden.
Beispiel 1
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Synthese von Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-
Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-
Glu-Ile-His-Thr-Ala-NH&sub2; (Verbindung 1 in Tabelle 1).
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Das Zielpeptid wurde durch ein herkömmliches
Festphasenverfahren synthetisiert. Als Festphasenträger wurde
1%iges vernetztes 4 -Methylbenzylhydrylamin-Polystyrol
(Aminogruppengehalt: 0,5 mM) verwendet. Die
Aminosäurederivate, die für die Peptidsynthese verwendet
wurden, sind:
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Boc-Ala, Boc-Asp(OcHx), Boc-Asn, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-
Lys(OcHx), Boc-Gln, Boc-His(Tos), Boc-Ile, Boc-Leu, Boc-
Lys(Cl-Z), Boc-Met, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-
Val.
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Die Verlängerung der Peptidkette wurde durch Wiederholung der
in Tabelle 2 beschriebenen Schritte durchgeführt.
Tabelle 2
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*DCC/HOBt-Verfahren (Mojsov et al., J. Org. Chem., 45:555
(1980)) wurde für Boc-Asn, Boc-Gln und Boc-Arg(Tos)
verwendet.
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** Das symmetrische Säureanhydrid wurde durch Mischen mit DCC
erhalten und die relevante Aminosäure wurde ohne Isolierung
verwendet.
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Der Träger und die Schutzgruppen wurden durch das bekannte
HF-Verfahren entfernt. Genauer gesagt wurde geschütztes
Peptid-Polystyrol in 10% Parakresol, 65% Dimethylsulfid und
25% wasserfreiem Fluorwasserstoff (20 ml) bei 0ºC für 2
Stunden inkubiert, und das Reaktionsgemisch wurde
anschließend unter reduziertem Druck eingeengt, um das
Lösungsmittel zu entfernen, und mit 5% Parakresol und 95%
wasserfreim Fluorwasserstoff bei 0ºC für 1 Stunde behandelt.
Nach dem Einengen des Reaktionsgemisches unter reduziertem
Druck wurde der Rest mit Ethylacetat gewaschen, mit 1 M
Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet, um rohes Peptid
zu erhalten. Das rohe Peptid wurde auf eine
Hochdruckumkehrphasenchromatographie aufgetragen und mit
einem linearen Gradienten aus Wasser-Acetonitril, enthaltend
0,1%ig Trifluoressigsäure, eluiert. Nach dem Gefriertrocknen
wurde das Material auf CM Toyopearl 650S (1,5 x 30 cm) in 10
mM Amuoniumacetat (pH 6,0) aufgetragen und getrennt und mit
einem linearen Gradienten von 20 mM bis 1,0 M Natriumacetat
gereinigt. Die die gewünschte Verbindung enthaltende Fraktion
wurde durch eine Sephadex G25-Säule(15 x 50 cm), die mit 2%
Essigsäure äquilibriert ist, gelfiltriert und anschließend
gefriergetrocknet und dann durch die vorher beschriebenen
Gelfiltration in das Acetat umgewandelt, unter Erhalt der
reinen Zielverbindung.
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Ausbeute: 31 mg
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Aminosäureanalyse: Durch Hydrolyse in 5,5 M Salzsäure bei
11000 für 48 h erhaltene abgebaute Materialien wurden in
einem Aminosäureanalysiergerät analysiert. Die theoretischen
Werte sind in Klammern gezeigt. Keine Korrektur wurde für den
während der Hydrolyse vorkommenden Abbau vorgenommen.
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Asp 1,93(2), Thr 0,96(1), Ser 1,56(2), Glu 4,07(4), Gly
0,94(1), Ala 2,01(2), Met 0,91(1), Ile 3,84(4), Leu 5,19(5),
Phe 1,94(2), Lys 0,95(1), His 3,85(4), Arg 3,13(3)
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Optische Rotation [α]²&sup5;D : -66º (C=0,24, 1 M Essigsäure)
Beispiel 2
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Synthese von Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-
Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-
His-Thr-Ala-NH&sub2; (Verbindung 3 in Tabelle 1).
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Das Zielpeptid wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene
Verfahren synthetisiert.
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Optische Rotation [α]²&sup5;D : -65º (C=0,1, 1 M Essigsäure)
Beispiel 3
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Synthese von Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-
Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-
Ala-NH&sub2; (Verbindung 5 in Tabelle 1).
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Das Zielpeptid wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene
Verfahren synthetisiert.
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Optische Rotation [α]²&sup5;D : -62º (C=0,1, 1 M Essigsäure)
Beispiel 4
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Synthese von Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-Ser-
Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-
Glu-Ile-His-Thr-Ala-Glu-Ile-Arg-Ala-NH&sub2; (Verbindung 7 in
Tabelle 1).
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Das Zielpeptid wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene
Verfahren synthetisiert.
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Optische Rotation [α]²&sup5;D : -95º (C=0,13, 1 M Essigsäure)
Experiment
Bestimmung des PTH-Antagonismus
(Verfahren)
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Der PTH-Antagonismus der erfindungsgemäßen Peptidderivate
wurde auf der Basis der cAMP-Produktion unter Verwendung von
kultivierten MC3T3-E1 Osteoblasten, die von Mäusen abstammen,
bestimmt.
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Die kultivierten Zellen wurden in einer 12 Well Multiwell-
Kultur-Platte in einem Verhältnis von 1x10&sup5; Zellen/Well
verteilt. Die Zellen wurden unter Verwendung von α-
modifiziertem MEM, das 10%iges quasifetales Rinderserum
enthält, als Kulturmedium bei 37ºC bei 95% Luft-5% CO&sub2; für 3
Tage kultiviert. Das Medium wurde durch α-modifiziertes MEM,
das 1% Rinderserumalbumin enthält, ausgetauscht und für 6 h
inkubiert. Das Medium wurde wiederum durch α-modifiziertem
MEM, das das Peptidderivat in verschiedenen Konzentrationen,
5x10&supmin;&sup9; M hPTH (1-34), 1% Rinderserumalbumin und 1 mM
Isobutylmethylxanthin enthält ausgetauscht und weiter
inkubiert.
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Nach einer einstündigen Inkubation wurden das Medium und die
Zellen getrennt. Ohne Weiterbehandlung wurde das getrennte
Medium als Testprobe für die Bestimmung von cAMP verwendet.
Die getrennten Zellen wurden mit 90%igem n-Propylalkohol
behandelt, um CAMP entsprechend dem Verfahren von Yamaguchi
et al. (Journal of Biological Chemistry, Bd. 262, 7711-7718,
1987) zu extrahieren. Die cAMP-Bestimmung wurde unter
Verwendung eines kommerziell erhältlichen cAMP-
Radioimmunoassaykits ist, durchgeführt. Tabelle 3 zeigt eine
50%ige Inhibierung der cAMP-Bildung, die durch die
erfindungsgemäßen Peptidderivate verursacht wird, wenn die
durch 5x10&supmin;&sup9; M hPTH (1-34) hergestellte cAMP-Menge als 100%
definiert wird. Als Kontrolle wurden [Tyr³&sup4;]-hPTH (3-34)-NH&sub2;
und hPTHrP (3-34)-NH&sub2;, die als PTH-Antagonisten bekannt sind,
verwendet.
Tabelle 3
Ergebnisse
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Tabelle 3 zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine
50%ige Inhibierung bei einer Konzentration von 1/140,
verglichen mit der von [Tyr³&sup4;]-hPTH (3-34)-NH&sub2;, und bei einer
Konzentration von 1/12, verglichen mit der von hPTHrP (3-34)-
NH&sub2;, aufweisen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
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Wenn die erfindungsgemäßen Peptidderivate mit konventionellen
Inhibitoren verglichen werden, haben sie eine stärkere
Inhibierungsaktivität gegenüber hPTH, und es wird deshalb
erwartet, daß sie für die Behandlung von verschiedenen
Krankheiten, die mit Calcium- oder Phosphorsäurestoffwechsel
zusammenhängen, z.B. Hyercalcämie und Osteoporose, oder von
Krankheiten, die mit PTH und PTHrP zusammenhängen, nützlich
sind.