DE68925970T2

DE68925970T2 - Polypeptide und dafür kodierende dns

Info

Publication number: DE68925970T2
Application number: DE68925970T
Authority: DE
Inventors: Jennifer Hall; Kathryn Robson
Original assignee: 3I Research Exploitation Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2009-08-05
Also published as: US6491920B1; JPH04503206A; US5811106A; GB8819209D0; AU630885B2; AU4064689A; EP0428602A1; WO1990001496A1; EP0428602B1; DE68925970D1; JP3183879B2

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide und für diese kodierende DNA, gebildet von menschlichen Malaria-Parasiten. Sie betrifft auch Verfahren zur Herstellung der Polypeptide, Antikörper dazu und Mittel zur Verwendung gegen Malaria.
Plasmodium falciparum Malaria ist heutzutage eine der häufigsten Infektionskrankheiten der Welt, die bis zu 40% der Weltbevölkerung bedroht. Es ist eine Krankheit der Dritten Welt. Dort treten zwischen 150 und 300 Millionen Fälle dieser Krankheit pro Jahr auf, wobei über 1% der Fälle tödlich verlaufen und wobei Babys und Kleinkinder besonders empfindlich sind. Mit dem Aufkommen von Insektiziden und neuen parasitiziden Wirkstoffen, die nach dem 2.Weltkrieg entwickelt worden sind, entstand der Eindruck, daß diese Krankheit ausgerottet werden könnte. Die frühen Versuch erwiesen sich als sehr erfolgreich, aber mit der Zeit haben die Parasiten Resistenz entwickelt gegenüber Wirkstoffen wie Chlorochin und der Moskito-Vektor (Anopheles) hat Resistenz gegenüber DDT entwickelt. Als Folge davon ist es notwendig, neue Schritte zu unternehmen, um zu versuchen, diese Krankheit zu bekämpfen. Da sich in endemischen Gebieten mit zunehmendem Alter Immunität gegen diese Krankheit entwickelt, muß ein Impfstoff zusammen mit neuen Anti-Malariamitteln und Insektiziden entwickelt werden, wenn die Krankheit ausgerottet werden soll.
Zur Zeit beschäftigen sich Forschungsprogramme in der ganzen Welt damit, zu definieren, was für Antigene Teil eines geeigneten Impfstoffs bilden könnten. Der komplexe Lebenszyklus des Parasiten bedeutet, daß ein einfacher Impfstoff, der auf einem Antigen beruht, nicht angemessen sein kann und daß ein wirksamer Impfstoff vermutlich Antigene von verschiedenen Entwicklungsstadien erfordert.
Der menschliche Malaria-Parasit, Plasmodium falciparum, hat einen komplexen Lebenszyklus, während dem Antigene zu bestimmten Entwicklungsstadien gebildet werden. Das Haupt-Antigen auf der Sporotoit-Oberfläche ist das Circumsporozoit- oder CS-Proein, das vermutlich die Spezifität der Wechselwirkung zwischen dem Parasiten und den Leberzellen bestimme. CS-Protein enthält zwei konservierte Aminosäure-Sequenzen, die als Regionen I und II bekannt sind, die getrennt sind durch ein repititives Aminosäure-Motiv.
Das Klonieren des Gens für dieses Protein hat die Entwicklung verschiedener Impfstoffe ermöglicht. Bis heute haben sich Versuche, Impfstoffe unter Verwendung von Teilen des CS-Proteins herzustellen, als enttäuschend erwiesen. Eine Immunität gegenüber Sporozoiten verhindert nicht notwendiger Weise die erythrozyte Phase des Lebenszyklus, die mit einer klinischen Erkrankung verbunden ist. Nur ein Sporozoit braucht das Immunsystem zu umgehen, damit eine klinische Erkrankung auftritt. Zur Zeit ist das CS-Protein das einzige gut charkterisierte Protein, von dem bekannt ist, daß es bei der Erkennung der Wirtszelle beteiligt ist. Das Merozoit ist die Entwicklungsstufe, die in der Lage ist, frische rote Blutkörperchen wieder zu infizieren. Antikörper, die eine Gametozyt-Differenzierung in dem Moskito verhindern, sind auch geeignet, den Transmissionszyklus zu unterbrechen. Eine andere Komplexität ist die antigene Variation, die der Parasit zeigt. Ein Impfstoff gegen den asexuellen erythrozyten Parasiten braucht nur partiell wirksam zu sein, um die Schwere der Krankheit zu verringern. Ein Impfstoff gegen das asexuelle Blutstadium von P.falciparum wurde entwickelt von Patarroyo et al. (Nature, Bd. 332, 1988, S.158) auf der Grundlage der Verwendung von synthetischen Peptiden, aber dieser hat sich nicht als vollständig wirksam erwiesen.
Es hat sich nun gezeigt, daß Polypeptide, die bestimmte Sequenz-Motive mit CS-Protein gemeinsam haben, während des erythrozyten oder Merozyten-Stadiums des Lebenszyklus des Parasiten gebildet werden.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Protein, daß die Aminosäuresequenz der Formel I enthält oder zu wenigstens 80% zu der Aminosäuresequenz der Formel I homolog ist.
Es ist für den Fachmann verständlich, daß eine gewisse Variation der Struktur bei natürlich vorkommenden biologisch aktiven Polypeptiden auftreten kann und daß insbesondere Malaria-Proteine eine antigene Variabilität zeigen. Mit der Maßgabe, daß Struktur-Variationen die interessierende biologische Aktivität nicht ausschalten, wie z. B. die Beteiligung an der Parasiten- Erkennung von roten Blutkörperchen, die Bindung an rote Blutkörperchen oder die Merozoiten-Invasion, fallen derartige Variationen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
So umfaßt die vorliegende Erfindung, obwohl die Formel 1 ein kloniertes Isolat von P.falciparum von Thailand, bekannt als T9/96 betrifft, z. B. auch ein Polypeptid, das von einem anderen Thailand-Isolat, bekannt als Kl, abgeleitet ist. Es war bekannt, daß sich dieses von T9/96 unterscheidet, indem es keine Hinf l Restriktionsstelle und eine extra Bgl II Stelle enthält, was durch Sequenzbestimmung bestätigt wurde. Das Polypeptid von Kl unterscheidet sich von T9/96 in bestimmten Details, wie in Tabelle 1 angegeben, aber die konservierten Regionen sind intakt.
Sowohl T9/96 als auch Kl sind erhältlich von der WHO Registry of Standard Strains of Malaria Parasite, Dept. of Genetics, University of Edinburgh, Großbritannien. Tabelle 1 Vergleich von DNA und Polypeptid von T9/96 und Kl Aminosäurerest Nucleotid Stellung im T9/96 K1 Kondon Aminosäure
Allgemein kann eine etwa 5%ige Variation von Aminosäureresten toleriert werden, aber, wie es für den Fachmann verständlich ist, sind einige Regionen des Moleküls und einige Reste von größerer Bedeutung als andere. Konservierte Regionen, die eine wichtige Rolle bei der biologischen Aktivität spielen, sind gegenüber einer Variation weniger tolerant (z. B. in der und um die Region herum, die für TRAP in Formel III steht), während antigen wichtige Regionen, z. B. um die RGD-Sequenz herum (Reste 307-309 der Formel I) leichter einer Variation unterliegen. TRAP ist, wie es hier verwendet wird, eine Abkürzung für "Thrombospondin related anonymous protein" und zeigt eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Polypeptide an. Andere Regionen können etwas weniger signifikant sein, aber es liegt ein gewisser Hinweis darauf vor, daß eine biologische Aktivität mit NP oder PN-Sequenzen verbunden ist. Unter "konserviert" ist zu verstehen, daß eine deutliche Homologie von Sequenzen von Aminosäureresten mit anderen interessierenden Proteinen vorliegt. So hat z. B. der Bereich von etwa Rest 244 bis etwa Rest 291 deutliche Homologie mit CS-Proteinen von verschiedenen Stämmen von Malaria-Parasiten und mit Thrombospondin und Properdin-Gerüst-Proteinen, wie in Formel III gezeigt. Es ist nicht möglich, genaue numerische Grenzen für den Grad der Homologie anzugeben, aber bei etwa 80% oder mehr wäre in vielen Beispielen zu erwarten, daß es signifikant ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Fragmente der oben angegebenen Proteine, vorzugsweise mit einer konservierten Sequenz, z. B. ein Peptid, umfassend ein Fragment von der Region, die sich von den Aminosäureresten 244 bis 291 der Formel I erstreckt.
Die einzelnen Buchstaben in Formel I bedeuten die folgenden natürlich vorkommenden L-Aminosäurereste: (A) Alanin, (C) Cystein, (D) Aspartinsäure, (E) Glutaminsäure, (F) Phenylalanin, (G) Glycin, (H) Histidin, (I) Isoleucin, (K) Lysin, (L) Leucin, (M) Methionin, (N) Asparagin, (P) Prolin, (Q) Glutamin, (R) Arginin, (S) Serin, (T) Threonin, (V) Valin, (W) Tryptophan, (Y) Tyrosin.
Derivate der Proteine und Peptide nach der Erfindung sind z. B. solche, bei denen funktionelle Gruppen wie Amino-, Hydroxyl-, Mercapto- oder Carboxyl-Gruppen derivatisiert, z. B. glykosyliert, acyliert, amidiert bzw. verestert sind. Bei glykosylierten Derivaten ist ein Oligosaccharid üblicher Weise an Asparagin, Serin, Threonin und/oder Lysin gebunden. Acylierte Derivate sind insbesondere acyliert durch eine natürlich vorkommende organische oder anorganische Säure, z. B. Essigsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, üblicher Weise an der N-terminalen Aminogruppe oder an Hydroxygruppen, insbesondere von Tyrosin bzw. Serin. Ester sind solche von natürlich vorkommenden Alkoholen, z. B. Methanol oder Ethanol.
Weitere Derivate sind Salze, insbesondere pharmazeutisch annehmbare Salze, z. B. Metallsalze wie Alkalimetall- und Erdalkalimetall-Salze, z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium- oder Ammonium-Salze, die gebildet worden sind mit Ammoniak oder einem geeigneten organischen Amin, wie einem niederen Alkylamin, z. B. Triethylamin, Hydroxy-niederalkylamin, z. B. 2-Hydroxyethylamin, u. a.
Mutanten der Proteine und Peptide nach der Erfindung sind gekennzeichnet durch den Austausch einer (Punktmutanten) oder mehrerer, etwa bis zu 10, seiner Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren. Sie sind die Folge der entsprechenden Mutationen im DNA-Bereich, was zu unterschiedlichen Kodons führt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch oligomere Formen der Peptide und Proteine, z. B. Dimere und Trimere. Solche Formen können natürlich vorkommen und für die biologische Aktivität signifikant sein. Unter dem Ausdruck "oligomere Form" sollen sowohl kovalent gebundene Moleküle verstanden werden als auch Moleküle, die durch schwächere intermolekulare Bindungen, wie Wasserstoffbindungen, zu konformationell signifikanten Formen miteinander verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen, die für die Proteine und Peptide nach der Erfindung kodieren. Die für den T9/96-Stamm von P.falciparum kodierende DNA-Sequenz ist in Formel I gezeigt, aber die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Variationen, die die kodierten Aminosäuren nicht beeinflussen, sowie Variationen, wie sie sich in der Natur finden und z. B. für den oben erwähnten Kl-Stamm kodieren.
Die DNA nach der vorliegenden Erfindung kann gewonnen werden aus Malaria-Parasiten-DNA und Genom-Bibliotheken nach bekannten Verfahren, und es ist zu verstehen, daß, wenn die Sequenz einmal bekannt ist, eine direkte Amplifikation (Erweiterung) möglich ist, z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion. (Saiki et al., Science 1985, Bd. 230, S. 1350-1354).
Die Proteine und Peptide nach der Erfindung können hergestellt werden durch chemische Synthese, wenn die Anzahl der Aminosäurereste nicht zu groß ist, oder durch Expression der entsprechenden DNA-Sequenzen in einem Wirt/Vektor-Expressionssystem.
Rekombinations-Vektoren, umfassend die entsprechende DNA zusammen mit anderen funktionellen Sequenzen, wie Promotor- und Marker-Genen, können nach bekannten Verfahren gebildet werden.
Geeignete Vektoren umfassen Rekombinations-Plasmide, umfassend eine DNA-Sequenz nach der Erfindung, kloniert in pUC13 (Pharmacia) oder pAcYM1 (Inst. of Virology, Mansfield Road, Oxford, England).
Virale Rekombinations-Vektoren können erhalten werden durch Einbau der entsprechenden DNA-Sequenz in virale DNA nach bekannten Verfahren (s. z. B. DNA Cloning, Bd. II, D.M. Glover, herausgegeben 1985, IRL Press, Oxford, England). Ein geeignetes Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfaßt die Kombination eines Plasmids mit einem Virus unter Anwendung eines Co- Transfektions-Verfahrens in einer geeigneten Wirtszelle.
Unter Verwendung des im folgenden als pKKJ17 identifizierten Plasmids zusammen mit beispielsweise dem Autographa californica Nucleopolyhedrosis Virus (AcNPV) in Spodoptera frugiperda Zellen, kann ein Rekombinations-Virus, enthaltend die DNA- Sequenz nach der vorliegenden Erfindung, reproduzierbar isoliert werden, z. B. das später als vKKJ17 identifizierte.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper zu den erfindungsgemäßen Proteinen und Peptiden zur Verfügung gestellt. Die Antikörper können erzeugt werden nach bekannten Verfahren (s. z. B. Antibodies, A Laboratory Manual, E. Harlow und D. Lane, Cold Spring Harbor, 1988).
Die Proteine und Peptide nach der Erfindung sind wohl geeignet zur Herstellung von Impfstoffen u. a. gegen Malaria. Zu diesem Zweck können sie als aktive Bestandteile in geeignete Träger, Adjvantien usw. eingebaut werden, gegebenenfalls in Kombination mit anderen immunologisch aktiven Materialien, um Schutz gegen verschiedene Stadien des Malaria-Parasiten zu ergeben.
Technische und theoretische Aspekte der Erfindung werden nun zur Erläuterung diskutiert, aber es ist zu verstehen, daß die Anwendbarkeit der Erfindung nicht von der Genauigkeit dieser theoretischen Analyse abhängt.
Die Proteine und Peptide nach der Erfindung haben bestimmte Sequenz-Motive mit anderen gut charakterisierten Proteinen gemeinsam. Die deutlichste Homologie liegt um die Sequenz WSPCSVTCG vor, von der drei Kopien in der Region I von Thrombospondin (TPS), sechs Kopien in Properdin (P) und eine Kopie in allen bisher identifizierten Zircumsporozoit-Proteinsequenzen bestimmt wurden. Außerdem hat sie mit bestimmten extrazellulären Glykoproteinen, einschließlich TSP, das Zellerkennungssignal (RGD) gemeinsam, von dem gezeigt worden ist, daß es entscheidend ist bei der Wechselwirkung von einigen extrazellulären Glykoproteinen mit den Mitgliedern der Integrin-Superfamilie. Auf Grund ihrer Verwandtschaft mit Thrombospondin werden die Polypeptide nach der Erfindung hier als mit Thrombospondin verwandte anonyme Proteine oder TRAP-Proteine bezeichnet. Im Gegensatz zu CS-Protein, werden TFAP-Proteine während des erythrozyten Stadiums des Lebenszyklus des Parasiten exprimiert.
Um mit CS-Protein verwandten Sequenzen in dem Genom von Plasmodium falciparum zu suchen, wurde eine Oligonucleotid-Sonde mit der Sequenz ACC.ATT.TCC.ACA.GGT.TAC.ACT.ACA.TGG (in Formel IIA gezeigt), entsprechend der Region II, angewandt, um ein Genom Southern Blot von Plasmodium falciparum (T9/96) DNA zu untersuchen. T9/96 ist ein kloniertes Isolat von P.falciparum von Thailand, erhältlich von The Dept. of Genetics, Institute of Animal Genetics, King Buildings, West Mains Road, Edinburgh, GB. Die vorausgesagten 9kb Eco RI und 800 bp Bst Nl Fragmente wurden nachgewiesen. Die gleiche Sonde wurde angewandt, um zwei genomische Plasmodium falciparum DNA-Bibliotheken zu untersuchen, wobei die eine ein komplettes Eco RI Digest, kloniert in lambda-gt 11, und die andere ein partielles Eco RI Digest, kloniert in lambda-gt 10 war. Es wurde nicht erwartet, die echte CS-Protein-Sequenz in einer dieser Bibliotheken zu finden, da die beiden Vektoren eine obere Grenze von 8 kb besitzen. Es wurden einige Klone isoliert, die alle ein 2,35 kb Eco RI Fragment gemeinsam hatten. Bei der DNA von diesem Fragment sowie derjenigen eines benachbarten Eco RI Fragments wurde die Sequenz bestimmt (gezeigt in Formel I). Die durch das Oligonucleotid nachgewiesene Sequenz, zusammen mit der Sonden- Sequenz ist in Formel IIA gezeigt. Es liegt ein offenes Leseraster (Formel I) vor, beginnend mit einem Methionin-Rest, das 559 Aminosäuren lang ist und ein Protein Mr 63 300 kodiert. Die Aminosäure-Sequenz umfaßt das konservierte Nonapeptid Trp- Ser-Pro-Cys-Ser-Val-Thr-Cys-Gly, was erklärt, daß die Oligonucleotid-Sonde dieses neue Gen (Formel IIB) nachwies. Diese Sequenz und Variationen davon finden sich in TSP, CS-Protein und Poperdin. Die Formeln III zeigen die konservierte Sequenz- Homologie zwischen dem TRAP-Protein der Formel I und CS-Protein-Sequenzen von Plasmodium falciparum (P.f.), P.vivax (P.v.) P.knowlesi (P.k.), P.cynomolgi Stamm London (P.c.), P.berghei (P.b.), P.yoelii (P.y.), TSP und dem Properdin-Gerüst. Eine Sequenz-Ausrichtung wurde erreicht unter Anwendung des ALIGN- Programms [Dayhoff et al., Meth. Enzymol. 91, 524-545, (1983)]. Es wurde der Einbuchstaben-Aminosäurecode angewandt und die mit TRAP gemeinsamen Reste wurden eingeschlossen.
Die Protein-Sequenz von TRAP hat zwei hydrophobe Domänen, an jedem Ende des Moleküls. Die erste, an dem amino-terminalen Ende, ist vermutlich eine Einzel-Sequenz und die andere, an dem Carboxy-Terminus, erinnert an eine transmembrane Sequenz. Es existiert eine Anhäufung von Cystein-Resten um die und einschließlich der konservierten Aminosäure-Sequenz, was eine sekundäre Struktur aus intermolekularen oder intramolekularen Disulfid-Bindungen nahelegt. Cystein-Reste treten in ähnlichen Positionen um die konservierten Regionen in CS-Protein, TSP und Properdin auf. Ein Beweis für eine solche sekundäre Struktur ergibt sich durch die Tatsache, daß Antikörper, gebildet gegen das von CS abgeleitete Peptid, enthaltend die Region II, eine schwache Reaktion sowohl mit nativen als auch denaturierten CS- Protein ergaben, was eine hoch geordnete Konfiguration nahelegt [Ballou et al., Science 228, 996-999 (1985)]. Nach der konservierten Region wird die Sequenz reich an Prolin, aber das ist nicht Teil eines repititiven Merkmals von vielen anderen Malaria-Proteinen. Eingetaucht in dieser Sequenz ist ein RGD- Motiv (Aminosäuren 307-309), das charakteristisch ist für viele Glykoproteine, die an der Zellerkennung beteiligt sind. TRAP ist das erste Malaria-Protein, das dieses Motiv aufweist. TSP besitzt ein solches RGD-Motiv, sowie ein IQQ-Motiv, das an der Kreuzverbindung mit Faktor XIIIa beteiligt war; TRAP besitzt auch ein IQQ-Motiv (Aminosäuren 76-78). Es existieren vier mögliche Stellen für eine N-Glykosylierung. Wie bei den meisten Malaria-Antigenen ist die Aminosäure-Zusammensetzung unüblich, indem sie besonders reich ist an Asparagin und Prolin.
Das CS-Proteingen wird nur während des Sporozoit-Stadiums des Lebenszyklus des Malaria-Parasiten exprimiert. Ein unterschiedliches Protein (CRA oder Ag 5.1), das in asexuellen Parasiten exprimiert ist, enthält ein Epitop, das kreuz-reaktiv ist mit monoklonalen Antikörpern gegen die NANP-Wiederholungs-Struktur in CS-Protein. Sequenz-Daten für dieses Protein zeigen einen Bereich von Homologie mit (NANP)&sub2; und kein anderes Sequenz- Merkmal des CS-Proteins.
Die Northern-Blot-Analyse unter Anwendung einer CS-Gensonde wies keine RNA-Spezies von erythrozyten Stadien nach. Eine ähnliche Analyse (s. Fig. 1C) unter Anwendung einer TRAP-Gen- (der Formel I) Sonde zeigte, daß RNA-Spezies von etwa 20S in den zwei untersuchten Isolaten, ITO und FCR3A2, nachgewiesen wurden, was anzeigt, daß das TRAP-Gen während des erythozyten Stadiums des Lebenszyklus, aber nicht in EBV-transformierten Lymphocyten, exprimiert wird, was anzeigt, daß die TRAP-Sonde keine menschlichen Sequenzen nachweist, die im Blut auf Grund einer Kontamination vorhanden sind, und daher parasiten-spezifisch ist. Die Größe des RNA-Transcripts ist vergleichbar mit der für ein Protein von Mr 63 300 kodierenden. Antikörper wurden gebildet auf TRAP/β-Galctosidase-Fusionsproteine. Sie reagieren auf Western Blots mit einem Protein von etwa 65 kd (die vorausgesagte Größe des TRAP-Genproduktes), sowie einer Anzahl von anderen Parasit-Proteinen, einschließlich reifem infizierten erythrozyten Oberflächenantigen (MESA) und 332. Eine weitere Untersuchung der abgeleiteten Aminosäuresequenz für TRAP zeigt verschiedene Motive, die um ein Glu-Glu (E-E)- Motiv zentriert sind, und das erklärt vermutlich diese Kreuzreaktion. Indirekte Immunofluoreszenz legt nahe, daß TRAP während der Endstadien der Schizogonie synthetisiert wird.
Das Auftreten eines hoch konservierten Motivs, das auch in Thrombospondin und in Properdin vorhanden ist, in sowohl vertebraten als auch invertebraten Stadien von Plasmodium falciparum legt nahe, daß TRAP-Proteine von funktioneller Bedeutung sein könnten. Eine mögliche Rolle des SC-Proteins von Sporozoiten ist das Erkennen und Eindringen in Hepatozyten. Synthetische Peptide von Regionen I binden in vitro spezifisch an Hapatozyten; über solchen Untersuchungen ist für die Region II noch nicht berichtet worden. Zwei andere Parasit/Zell-Wechselwirkungen sind kritisch im Lebenszyklus von Plasmodium falciparum.
Seine Virulenz hängt zusammen mit seiner Neigung, sich in tiefe Gefäßbetten zurückzuziehen. Dieser Prozeß, der abhängt von der Wechselwirkung von parasit-induzierten Modifikationen der Oberfläche von roten Zellen mit Rezeptoren auf Endothelzellen, umfaßt Thrombospondin. Sowohl Thrombospondin selbst als auch Thrombospondin-Antikörper hemmen die Zellhaftung von infizierten roten Blutzellen in in vitro Modellen der Sequesterbildung. Das würde zusammen mit dem Nachweis, daß Blutplättchen Glykoprotein IV (der Thrombospondin-Rezeptor) eine entscheidende Rolle bei der Zellhaftung spielt, übereinstimmen mit dem Vorhandensein eines parasit-induzierten Thrombospondin-Analogen auf dem infizierten Erythrozyten. Es wird angenommen, daß das Zellhaftungs-Antigen Pf EMP 1 300 kd ist; das schließt TRAP nicht aus, da eine gewisse Wahrscheinlichkeit besteht, daß die Zellhaftung eine Parasiten-Modifikation eines Wirtproteins umfaßt und TRAP könnte diese Rolle spielen.
Die andere Parasit/Zell-Wechselwirkung ist das Erkennen und Eindringen in rote Blutzellen durch freie Merozoiten. Wenn TRAP auf der Oberfläche von freien Merozoiten vorhanden wäre, könnte die Homologie mit Properin, das an C3b bindet, eine Rolle spielen bei der Erkennung von C3b oder seinen Anbauprodukten auf der Oberfläche von roten Blutzellen. Der nahe verwandte Parasit Babesia rhodiani hat eine Strategie entwickelt zum Eindringen in Erythrozyten, umfassend C3b. Die Beobachtung, daß das Eindringen von Plasmodium falciparum Merozoiten in rote Blutzellen keine Serum-Komplement-Komponenten erfordert, schließt die Beteiligung von Komplement-Komponenten, die schon auf der Oberfläche von roten Blutzellen vorhanden sind, nicht aus.
Beispiele für die Erfindung und andere technische Details werden nun mit Bezug auf die beiliegenden Formeln und Zeichnungen beschrieben, bei denen:
Formel I die Aminosäuresequenz eines Polypeptids nach der Erfindung zeigt, unter Anwendung des Einbuchstaben- Aminosäurecodes, sowie die Nucleotidsequenz einer dafür kodierenden DNA, zusammen mit flankierenden, nicht-kodierenden Sequenzen. Die Nucleotide sind von 1 bis 3102 numeriert und die Aminosäurereste von 1 bis 559, entsprechende kodierenden Nucleotiden von 312 bis 1989;
Formel IIA einen Vergleich zeigt zwischen einer 27-Basen Oligonucleotid-Sonde und einer von ihr nachgewiesenen DNA-Sequenz von einer lambda gt11 Genom-Bibliothek von P. falciparum und
Formel IIB ein Vergleich ist zwischen Aminosäure- und Nucleotidsequenzen, komplementär zu den Sondensequenzen;
Formel III einen Vergleich zeigt zwischen Aminosäuresequenzen um das und einschließlich dem konservierten Nonapeptid-Motiv des Polypeptids der Formel I mit anderen Proteinen;
Fig. 1A eine Southern Blot Analyse von DNA von einer klonierten Linie T9/96 von P.falciparum, hybridisiert mit der DNA der Fig. 1 als Sonde zeigt;
Fig. 1B ähnlich ist der Fig. 4A, aber hybridisiert mit einer CS-Protein-Gensonde;
Fig. 1C eine Norhtern Blot Analyse zeigt von Gesamt-RNA von EBV transformierten Lymphocyten und von zwei P. falciparum Isolaten;
Fig. 2 und 3 diagrammartige Darstellungen von Plasmiden pKR5 bzw. pKKJ17 nach der Erfindung sind, die Restriktionsstellen und andere Merkmale zeigen.
In den Formeln IIA und IIB, wurde eine 27-Basen Oligonucleotid- Sequenz synthetisiert aus der Aminosäuresequenz PCSVTCGNG in der Region II des CS-Proteins. Der komplementäre Strang wurde synthestisiert, so daß sowohl DNA- als auch RNA-Sequenzen nachgewiesen werden konnten. Das Oligonucleotid wurde synthetisiert mit einer Applied Biosystems Modell 308A (Warenzeichen) Synthesevorrichtung durch Monomer-Zugabe von Phosphoramiditen zu einem festen Träger. Die von Schutzgruppen befreite Sonde wurde gereinigt durch präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Das am Ende markierte Oligonucleotid wurde angewandt, um 4 · 10&sup5; Plaques (auf E.coli Y1088) eines Eco RI Abbauproduktes von P. falciparum T9/96 DNA, kloniert in die Eco RI Stelle von lambda gt11 zu untersuchen. Es wurden sechs positive Plaques identifiziert, die erneut untersucht wurden. Diese enthielten 2,35 kb Eco RI Fragmente. Es wurde eine Hybridisierung durchgeführt während 16 h bei 37ºC in 6 · NET (1 · NET = 0,15 M NaCl, 0,015 N Tris·HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), 5 · Denhards 0,5% NP40, 100 µg/ml zerkleinerter Lachs-Sperma-DNA. Gewaschen wurde bei 37ºC in 6 · SSC (1 · SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) 0,1% SDS, gefolgt von 1 min. langem Waschen in der gleichen Lösung bei 60ºC. Die Filtrate wurden 16 h der Autoradiographie mit einem vorher blitzbelichteten Röntgenfilm unterworfen.
Das 2,35 kb Eco RI Insert von dem lambda-gt11 Phagen wurde subkloniert in pUC8 und M13MP10. Die Didesoxy-Sequenzbestimmung dieses Fragments zeigte ein unvollständiges offenes Leseraster. Es wurde eine zweite Bibliothek durch Klonieren eines partiellen Eco RI Abbauproduktes von T9/96 in lambda-gt10 aufgebaut und mit dem Original 2,35 kb Fragment untersucht. 1,1 · 10&sup5; Plaques (auf E.coli NM514) wurden untersucht und es wurden Klone mit überlappenden Sequenzen erhalten. Die vollständige DNA-Sequenz des TRAP-Gens und ihre flankierenden Sequenzen wurden erzeugt unter Anwendung des Ketten-Terminations-Verfahrens von Sanger et al. [J.Mol.Biol., 143, 161-178 (1980)]. Die Information wurde erhalten von "Schrotschuß"-Klonen in M13mp10, was die Sequenzbestimmung von beiden Strängen ermöglichte. Die Zwischenräume wurden ausgefüllt unter Verwendung von auf übliche Weise synthetisierten Oligonucleotid-Primern. Dieser Weg erwies sich als am wirksamsten zur Ableitung der DNA- Sequenz, wenn keine Restriktions-Enzym-Stellen vorhanden waren, ein besonderes Problem in Regionen von A-T reicher DNA. Die DNA-Sequenz-Bearbeitungsprogramme von Staden wurden angewandt, um die Daten zu analysieren [Nucl. Acids Res. 10, 4731-4751 (1982)]. Die Stelle, an die die Oligonucleotid-Sonde hybridisierte, ist in Formel I unterstrichen. Die Asparaginreste, die potentielle Stellen zur N-gebundenen Glykosylierung sind, haben Sternchen. Die RGD-Sequenz (Reste 307-309) ist überstrichen. Das IQQ-Motiv ist umrandet.
In den Fig. 1A und 1B (Southern Blots) entsprechen die Reihen 1-11 Restriktions-Abbauprodukten mit den folgenden Enzymen: Asp 718, Bam HI, Bgl II, EcoRI, Hinc II, Hind III, Tag I, Bst NI, Hha I, Hpa II bzw Msp I.
In Figur IC (Northern Blots) entspricht die Reihe 1 EBV transformierten Lymphozyten (25 µg); Reihe 2 P.falciparum-Isolat ITO (Brasilien Stamm) (25 µg) und Reihe 3 P.falciparum FCR3 A2 (Rockefeller Stamm) (kloniert) (25 µg).
Southern Blotting und Hybridisierung wurden durchgeführt wie von Woo et al. [Nature 306, 151-155 (1984)] beschrieben. Northern Blotting wurde durchgeführt wie von Robson et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4701-4705 (1982)] beschrieben. Hybond-N-Membranen (Warenzeichen) wurden angewandt, um eine Rehybridisierung des gleichen Filters zu ermöglichen. Das Filter in Tafel A wurde zunächst mit den beiden Eco RI Fragmenten, entsprechend der TRAP-Sequenz, hybridisiert; das Signal wurde entfernt und das Filter mit demjenigen, enthaltend die CS-Protein-Gensequenz, rehybridisiert. Die Sonde in Tafel C war die gleiche wie in Tafel A. Das Filter in Tafel C wurde auch mit der gleichen Sonde hybridisiert wie Tafel B: Es wurde kein Hybridisierungs-Signal beobachtet.
Um größere Mengen der Polypeptide und DNA nach der Erfindung in reinerer Form herzustellen, wurden die folgenden Verfahren angewandt.
Es wurden polyklonale Antikörper auf verschiedene gereinigte β-Galalctosidase/TRAP-Fusionsproteine gebildet. Die Reinigung der Proteine umfaßte eine Denaturierung durch Detergens und Polyacrylamidgel-Elektrophorese, so daß alle wichtigen Konformations-Epitope zerstört wurden. Da diese Antikörper auch andere Parasiten-Antigene auf Western Blots erkannten, konnten sie nicht angewandt werden, um natives TRAP von kultivierten Parasiten zu reinigen. Es wurde daher beschlossen, eine alternative Strategie anzuwenden, unter Verwendung von eukariontischen Expressionsvektoren, vorgesehen zur Erzeugung großer Mengen an nativem Protein, das korrekt verarbeitet werden sollte und leicht gereinigt.
Ein mögliches Expressions-System verwendet Baculoviren. Das Baculovirus-Expressions-System erlaubt eine hohe Expression von fremden Genen in einer eukariontischen Umgebung. Es nutzt die natürliche Gen-Regulation aus, d. h. die sehr späte aber außerordentlich umfangreiche Expression des Polyhedrin-Gens. Auf Grund der großen Größe von Bactulovirus-Genomen, beruht der größte Teil des Rekombinations-Virus-Aufbaus auf der in vitro Rekombination zum Ersatz eines viralen Allels durch das interessierende Gen. Transplantations-Plasmide enthalten die Stelle für den Einbau von fremdem Gen sowie flankierende virale Sequenzen, die homologe Sequenzen für die Rekombination liefern. Eine Co-Transfektion von Zellen mit viralen und Rekombinations-Plasmid-DNAs erlaubt einen zellvermittelten allelen Ersatz des viralen Zielgens durch das aus dem Plasmid stammende fremde Gen-Konstrukt.
Damit fremde Gene in dem Baculovirus-Expressions-System reichlich exprimiert werden, müssen sie so manipuliert werden, daß sie keine Intronen sowie den größten Teil der 5'- und 3'- flankierenden Sequenzen enthalten. TRAP-Gene enthalten keine Intronen und unter Anwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde das TRAP-Gen der Fig. 1 aufgebaut mit einem vollständig offenen Leseraster als ein Bam HI Restriktions-Fragment und kloniert in den Transfer-Vektor pAcYM1 (erhältlich von dem Institute of Virology, Oxford, England).
Das wurde wie folgt durchgeführt. Zwei Oligonucleotid-Prirner wurden gebildet, enthaltend Bam HI Stellen, sowie die 5'- und 3'-Enden der TRAP-Gene. Die Sequenzen dieser beiden Primer sind:
A GGATCCAAAATAATGAATCATCTTGGG
B GGATCCGTATTATATTTAATTCCACTCG
wobei die unterstrichenen Sequenzen den Enden der kodierenden Sequenz entsprechen. Bei dem Primer A ist dies der kodierende Strang und bei dem Primer B ist dies der komplementäre Strang; das ist notwendig, weil DNA immer in der 5'zu 3'-Richtung synthetisiert wird. Die amplifizierte DNA war ein genomischer Subklon von T9/96 in M13. Die Reaktion wurde durchgeführt wie von Saiki et al. (Science, 1985, Bd. 230, S. 1350-1354) angegeben unter Anwendung von Tag 1 Polymerase [(1 mM) Oligonucleotid-Primer A und B, 10 mM Desoxynucleosid-triphosphat und 1 ng RV9 (der Subklon von TRAP in M13)]. Die Zykluszeiten und - temperaturen waren 1' bei 93ºC, 1' bei 37ºC und 5' bei 72ºC, die Anzahl der Zyklen betrug 15. Nach der Amplifizierung wurde das vollständige Reaktionsgemisch mit Phenol/CHCI&sub3; und Chloroform extrahiert, gefolgt von Gelfiltration zur Entfernung der nicht verbrauchten Desoxynucleosid-triphosphat. Die Enden des DNA-Produktes wurden repariert unter Verwendung von des Klenow- Fragments von Desoxyribonuclease 1 und frischen Desoxynucleosid-triphosphaten. Die Reaktion wurde wieder beendet durch Extraktion mit Phenol/CHCl&sub3; und Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G50/80. Die 5'-Enden der DNA wurden phosphoryliert unter Verwendung von T4 Polynucleotid-kinase und Adenosintriphosphat. Die Reaktion wurde beendet durch Extraktion mit Phenol/CHCl&sub3; und die DNA wurde gewonnen durch Ausfällen mit Propan-2-ol. Dieses Material wurde verwendet als Substrat für eine Ligationsreaktion unter Verwendung T4 DNA Ligase und phosphatisiertem Sma Schnitt pUC13 (Pharmacia). Konstrukte, enthaltend das gewünschten Insert wurden erhalten und ihre Autentität untersucht durch DNA Sequenzbestimmung. Ein solches Plasmid war pKR5. Das Fragment konnte freigesetzt werden von pUC13 durch Bam H1-Abbau, was zeigt, daß die erforderlichen Restriktionsstellen einen Transfer des Transplantations- Plasmids pAcYM1 erlauben. pKR5 wurde abgebaut mit Bam HI und Hae III, die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol/CHCl&sub3; beendet, gefolgt von einer Ausfällung mit Ethanol. Dieser Abbau wurde durchgeführt, um eine Gel-Reinigung des gewünschten 1,7 kb Bam HI Fragments vor der Religation in die Bam HI Stelle von pAcYMI zu vermeiden. Eine ähnliche Ligation und Transformation wurde durchgeführt mit dem Insert und dem neuen Vektor pAcYMI. Wieder wurden Konstrukte, enthaltend das gewünschte Fragment, erhalten. Die Orientierung des Inserts, enthaltend die TRAP-Sequenz, relativ zu dem Polyhedrin-Promotor wurde untersucht durch Restriktionskartierung und Sequenzbestimmung. Dieses Konstrukt wurde pKKJ17 genannt und die Karte ist in Fig. 3 angegeben. Dieses Plasmid wurde hinterlegt bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Torrey Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, AB9 8DG, Großbritannien, am 14. Juli 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40 164.
Unter Verwendung von pKKJ17 war es möglich, eine Transfektion von Spodoptera frugiperda Zellen, wie unten angegeben, durchzuführen. 25 µg pKKJ17 zusammen mit 1 µg mit Cäsiumchlorid gereinigter Autographa californica Nucleopolyhedrosis Virus (AcNPV) DNA wurde in mit Hepes gepufferter Salzlösung, pH 7,5, enthaltend 10 mM Glucose und 125 mM CaCl&sub2;, hergestellt. Es konnte sich ein Calcium/DNA-Komplex innerhalb eines Zeitraums von 45 min. bilden vor der Zugabe von frisch plattierten Spodoptera frugiperda Zellen (1,5 · 10&sup6; Zellen) und 1 h langer Inkubation bei Raumtemperatur. Das DNA Präzipitat wurde entfernt und frisches Medium (TC100) zugegeben und die Zellen bei 20ºC inkubiert, bis ein cytopathischer Effekt beobachtet wurde (3 Tage nach der Transfektion). Die durch diese Zellen gebildeten Viren waren sowohl Wildtyp AcNPV als auch Rekombinations AcNPV, enthaltend das TRAP-Gen. Plaque-Reinigung nach Titration erlaubte die Isolierung von reinem Rekombinations- Virus. Das wurde erleichtert durch die Tatsache, daß Wildtyp AcNPV intaktes Polyhedrin Gen besaß und so eingeschlossene Plaques bildete, während Rekombinanten dies nicht taten. Der Unterschied zwischen den beiden Arten von Plaques kann sichtbar gemacht werden durch Licht-Mikroskopie.
Nach der ersten Transfektion wurde eine Rekombinations-Plaque festgestellt und gereinigt. Etwa eine von zweihundert Plaques war rekombinant, mit der Maßgabe, daß mit Cäsiumchlorid gereinigte virale DNA in früheren Stufen verwendet wurde. Rekombinations-Virus wurde identifiziert als vKKJ17 und hinterlegt am 14. Juli 1989 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Public Health Service Laboratory, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Großbritannien, unter der Hinterlegungsnummer 89071402.
AcNPV ist das Prototyp-Virus der Familie Baculoviridae. Während der Infektion von Spodoptera frugiperda Zellen mit diesem Virus werden zwei Arten von Virus-Nachkommen gebildet, extrazelluläre Virusteilchen und eingeschlossene Virusteilchen. Die eingeschlossenen Virusteilchen sind in Protein-Material eingebettet, umfassend das Polyhedrin-Protein. Unter dem Mikroskop sind diese als Polyeder sichtbar. Diese viralen Einschlüsse sind ein wichtiger Teil des Lebenszyklus, da die Insektenlarven durch die Einnahme dieser Teilchen infiziert werden.
Das Rekombinations-Virus vKKJ17 besitzt kein Polyhedrin-Gen und kann somit keine eingeschlossenen Teilchen bilden. Das Polyhedrin-Gen ist ersetzt durch das TRAP-Gen. Als Folge davon bleibt das Virus vKKJ17 für das Gewebekultursystem (Sp.frugiperda) infektiös, aber kann Insektenlarven nicht infizieren. Die Expression des TRAP-Proteins wird durch das Polyhedrin-Protein kontrolliert. Das bedeutet, daß TRAP-Protein 20 h nach der Infektion anfängt gebildet zu werden. Das Polyhedrin-Protein ist das in größter Menge vorhandene Protein in dem Wildtyp Virus und im allgemeinen bilden fremde Gene unter der Expression des Polyhedrin-Promotors hohe Gehalte an dem interessierendem Protein. In vKKJ17 befindet sich die TRAP-Sequenz an einem Bam HI Fragment, das die gesamte Polyhedrin kodierende Sequenz ersetzt.
Baculoviren sind doppelsträngige DNA-Viren, bei denen die DNA kreisförmig ist. Die Größe der DNA ist 135 kb.
Die Bildung von TRAP wurde untersucht durch Infizieren von Sp. frugiperda Zellen mit Rekombinations-Virus vKKJ17 und 72 h langes Züchten der Zellen vor der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Western Blotting. Der in dem Nachweissystem angewandte Antikörper war polyklonaler Kaninchen-Antikörper, gebildet unter Verwendung des β-Galactosidase-Fusionsmaterials. Dieses Rekombinations-Virus bildete tatsächlich TRAP-Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung. Die weitere Analyse zeigte, daß dieses Material in den Kultur-Überstand sekretiert wurde. Diese Tatsache unterstützte die Reinigung.
Bei hoher Multiplizität der Infektion ist es nicht erforderlich Sp. frugiperda Zellen ein einem Medium, enthaltend Serum, zu halten. Diese Tatsache wurde ausgenutzt und Zellen mit hoher Multiplizität der Infektion mit vKKJ17 infiziert und in Abwesenheit von Serum 72 h bei 28ºC inkubiert. Die infizierten Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt (Beckman JA10 4K, 10' 4ºC).
Der geklärte Überstand, der TRAP und Virusteilchen enthielt, wurde konzentriert durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Ausfällung und anschließende Dialyse. Die Virusteilchen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt (Beckman JA20, 20K, 4ºC. 90'). Dieses Material wurde der Ionenaustauscher-Chromatographie (Mono Q, Pharmacia, LK) unterworfen. Fraktionen, enthaltend TRAP, wurden konzentriert durch Lyophilisieren vor der weiteren Reinigung durch Gelfiltration (TSK G3000, Pharmacia, LKB). Das TRAP war mehr als 30%, rein, möglicherweise 90%, es war ein gewisser Abbau eingetreten und das ist der Grund für die Ungenauigkeit dieser Werte.
Insektenzellen erkennen und spalten offensichtlich Säugetier- Signal-Sequenzen, die Peptide zu dem endoplastischen Retikuium (ER) dirigieren. Es scheint auch, daß Stellen, die Ziel der Glykosylierung sind, in Insektenzellen (Sp.frugiperda) die gleichen sind wie solche von Säugetierzellen. Diese Insektenzellen scheinen keine Galactose und Sialinsäure-transferasen zu enthalten und können daher keine "komplexen" Oligosaccharide bilden, das führt zum Trimmen der N-Bindung zu einem zentralen Kern von Man&sub3;GlcNAc&sub2;. Trotzdem hat es sich gezeigt, daß Proteine wie Interleukine und Interferone, die unter Verwendung dieser Systeme hergestellt worden sind, biologisch aktiv sind. Auf diese Weise hergestelltes TRAP scheint in ein Dimer oder Trimer eingeordnet zu sein, was anzeigt, daß oligomere Formen des Polypeptids funktionell sind.
Es wurden komplementäre Arbeiten durchgeführt, um eine mögliche Variation in der DNA-Sequenz festzustellen, die sich in der Aminosäure-Sequenz äußert. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde wieder angewandt unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern A und B. Das Substrat für die enzymatische Reaktion war vollständig genomische DNA von verschiedenen geographischen Isolaten. Das amplifizierte Material wurde auf ähnliche Weise behandelt vor dem Klonieren in die Sma 1 Stelle des sequenz-bestimmenden Vektors M13mp8 (Amersham). Unter Verwendung einer Reihe von verschachtelten Primern, war es möglich, von dem vollständigen 1,7 kb Insert für Kl (ein von T9/96 verschiedenes Thai-Isolat) die Sequenz zu bestimmen. Es zeigten sich einige Unterschiede gegenüber der Sequenz der Formel I, wie in Tabelle 1 angegeben, aber die konservierten Regionen waren alle intakt. Die Substitution einzelner Basen führt zur Substitution von 22 Aminosäuren. Es gibt eine einzige Substitution, die nicht zu einer Aminosäure-Veränderung führt. Das bewahrt einen Cysteinrest. Diese Arten von Ergebnissen wurden bei anderen antigen-variablen Proteinen beobachtet, die bei untersuchten Zell-Anbindungen beteiligt sind, sowie bei CS-Protein. FORMEL I
Oligonucleotid-Sequenz ACC ATT TCC ACA GGT TAC ACT ACA TGG
Nachgewiesene Sequenz ACC TTT ACC ACA AGT TAC ACT ACA TGG

FORMEL IIA

CS-Protein Aminosäure-Sequenz P C S V T C G N G
DNA-Sequenz CCA TGT AGT GTA ACT TGT GGA AAT GGT
TRAP
Aminosäure-Sequenz P C S V T C G K G
DNA-Sequenz CCA TGT AGT GTA ACT TGT GGT AAA GGT FORMEL IIB FORMEL III Rest Nr. Protein Thrombospondin Properdin-Gerüst

Claims

1. Protein, das die Aminosäuresequenz der Formel I enthält oder zu wenigstens 80% zu der Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel I homolog ist.

2. Peptid mit einem Fragment der Formel I, das sich vom Aminosäurerest 244 bis zum Aminosäurerest 291 erstreckt oder zu wenigstens 80% zu diesem Fragment homolog ist.

3. Protein oder Peptid, das eine oligomere Form eines Proteins nach Anspruch 1 oder eines Petids nach Anspruch 2 umfaßt (wobei oligomere Form wie vorstehend definiert ist).

4. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das glykosyliert ist.

5. DNS-Sequenz, die für ein Protein oder Peptid kodiert, wie es in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert ist.

6. DNS-Sequenz nach Anspruch 5, die die DNS-Sequenz der Formel I umfaßt.

7. Rekombinanter Vektor mit einer DNS-Sequenz nach Anspruch 5 oder Anspruch 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, welcher ein Plasmid ist.

9. Vektor nach Anspruch 7, welcher ein rekombinantes Virus, beispielsweise ein Baculovirus ist.

10. Vektor nach Anspruch 9, worin das Virus ein Autographa californica-Nucleopolyhedrosevirus ist.

11. Vektor, der einen Vektor nach Anspruch 10 in Verbindung mit einem anderen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 9 umfaßt.

12. Ein Wirt/Vektorsystem, das zur Expression einer DNS-Sequenz nach Anspruch 5 oder 6 fähig ist und einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 11 umfast.

13. Wirt/Vektorsystem nach Anspruch 12, worin der Wirt der Spezies Spodoptera frugiperda angehört.

14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches Verfahren die Expression einer DNS-Sequenz nach Anspruch 2 oder 3 umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die DNS-Sequenz in einem Wirt/Vektor-Expressionssystem nach Anspruch 12 exprimiert wird.

16. Antikörper, der zur spezifischen Bindung an ein Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 fähig ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit einem pharmakologisch annehmbaren Träger enthält.

18. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in der Medizin.

19. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der prophylaktischen oder heilenden Behandlung von Malaria.

20. Verwendung eines Proteins oder Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Malaria.