DE69206075T2

DE69206075T2 - Impfstoff gegen nematoden.

Info

Publication number: DE69206075T2
Application number: DE69206075T
Authority: DE
Inventors: Gary Stewart Frenchs Forest Nsw 2086 Cobon; Phillip John Glebe Nsw 2037 Sharp; Barry Maxwell Carlingford Nsw 2118 Wagland
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1991-02-06
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2012-02-07
Also published as: EP0527977A1; ATE130366T1; AU663862B2; US5525508A; EP0527977B1; US5942413A; WO1992013889A1; EP0527977A4; AU1223692A; NZ241545A; ES2081607T3; CA2079870A1; GR3018660T3; DK0527977T3; DE69206075D1

Description

Klarstellender Hinweis

Es wird darauf hingewiesen, daß sich die Ansprüche der nachfolgenden Übersetzung von der deutschen Übersetzung der Ansprüche, die vom Europäischen Patentamt in der B1- Publikation veröffentlicht wurden, unterscheiden. Bei den Ansprüchen der vorliegenden Übersetzung handelt es sich um eine korrigierte Fassung der Patentansprüche.

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Antigene, die eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion mit parasitischen Nematoden verleihen.
Die Erfindung betrifft auch Impfstoffe, die eine schützende Immunität gegenüber einer Infektion durch parasitische Nematoden verleihen und Antikörper, die eine passive Immunität gegenüber einer Infektion mit parasitischen Nematoden verleihen.

Stand der Technik

Nematoden (Nema - Faden; Oides - ähnlich), die unsegmentierte Rundwürmer mit länglichen, fusiformen oder sackartigen Körpern sind, die mit einer Cuticula bedeckt sind, sind in der Natur praktisch überall vorhanden, wobei sie Boden, Wasser und Pflanzen bewohnen, und sind an einer Vielzahl von Tier- und Pflanzenparasiten-Erkrankungen beteiligt.
Die Rundwurmparasiten von Säugetieren gehören zum Stamm der Nemathelminthes. Die Rundwürmer schließen den Hakenwurm (z.B. Necator americanus und Ancyclostoma duodenale), den Rundwurm (z.B. den gemeinen Rundwurm Ascaris lumbricoides), den Peitschenwurm ( Trichuris trichiura) und den Madenwurm oder Fadenwurm (z.B. Enterobius vermicularus) ebenso ein wie Strongyloides stercoralis, Trichinella spiralis (Infektion bei Menschen und Schweinen) und den Filarienwurm Wuchereria bancrofti. Andere wichtige Rundwurm-Parasiten schließen Ancylostoma caninum (Infektionen bei Menschen), Strongylus vulgaris (Infektionen bei Pferden), Trichostrongylus colubriformis (Infektionen bei Schafen), Haemonchus contortus (Infektionen bei Schafen und Ziegen), Ostertagia ostertagi (Infektionen bei Rindvieh), Ascaris suum (Infektionen bei Schweinen), Toxascaris leonia oder Uncinaria stenocephala (Infektionen bei Hunden), Toxocara spp (zirkulierende Infektionen bei Menschen) und Dirofilaria immitis (zirkulierende Infektionen bei Katzen und Hunden) ein.
Sogar wenn sie symptomfrei sind, sind parasitische Wurminfektionen für das Wirtstier aus einer Anzahl von Gründen schädlich; z.B. nehmen sie dem Wirt Nahrung, schädigen Organe oder verstopfen Durchgänge, können Substanzen ausscheiden, die für den Wirt toxisch sind und liefern eine Eintrittsöffnung für andere Organismen. In anderen Fällen kann der Wirt eine Art sein, die für die Nahrung gezüchtet wird und der Parasit kann beim Essen übertragen werden, indem er das verdauende Tier infiziert. Es ist äußerst wünschenswert, solche Parasiten zu vernichten, sobald sie entdeckt werden.
Meistens sind solche Infektionen nicht symptomfrei. Helminthen-Infektionen bei Säugetieren, insbesondere mit parasitischen Nematoden, sind eine Quelle für große ökonomische Verluste, insbesondere von Vieh und Haustieren, z.B. Schafen, Rindvieh, Pferden, Schweinen, Ziegen, Hunden, Katzen und Vögeln, insbesondere Geflügel. Diese Tiere müssen regelmäßig mit anthelmintischen Chemikalien behandelt werden, um solche Infektionen unter Kontrolle zu halten, sonst kann diese Krankheit zu Anämie, Diarrhoe, Entwässerung, Appetitverlust und sogar dem Tod führen.
Das einzige derzeit verfügbare Mittel, um Helminthen-Infektionen zu kontrollieren, ist die Verwendung von anthelmintischen Chemikalien, aber diese sind nur gegenüber dem zur Zeit der Behandlung vorhandenen Wurm wirksam. Daher muß die Behandlung kontinuierlich sein, da die Tiere ständig einer Infektion ausgesetzt sind; z.B. ist eine anthelmintische Behandlung mit Diethylcarbamazin jeden Tag oder jeden zweiten Tag die meiste Zeit des Jahres erforderlich, um Dirofilaria immitis oder den im Herzen von Hunden lebenden Fadenwurm zu kontrollieren. Dies ist ein teures und arbeitsintensives Verfahren. Wegen der weit verbreiteten Verwendung von anthelmintischen Chemikalien, können die Würmer eine Resistenz entwickeln und daher müssen neue und wirksamere Klassen von Chemikalien entwickelt werden. Eine alternative Lösung ist eindeutig wünschenswert.
Die Entwicklung eines Impfstoffs gegen parasitische Nematoden würde viele der Nachteile, die einer chemischen Behandlung zur Verhütung und Heilung von Helminthen-Infektionen inhärent sind, überwinden. Der Schutz würde sicher länger dauern, nur das geimpfte Tier wäre betroffen und die Probleme bezüglich Toxizität und Persistenz der Rückstände würden minimiert oder vermieden. Daher hat es Versuche gegeben, die im Stand der Technik berichtet werden, solche Impfstoffe zu entwickeln unter Verwendung von parasitischen Nematoden; unglücklicherweise war der Erfolg nur begrenzt und Faktoren wie die Verfügbarkeit des Materials und die Impfstoffstabilität haben eine Verwendung in großem Maßstab ausgeschlossen.
Diese früheren Versuche werden in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU88/00239 (WO 89/00163) und PCT/AU89/00416 (WO 90/03433) diskutiert
Kürzliche Fortschritte in der Biotechnologie und insbesondere in der Gentechnik bieten realistisch die Möglichkeit, kommerziell lebensfähige Impfstoffe gegen eine Reihe von ökonomisch wichtigen Parasiten bei Menschen und Haustieren zu erzeugen. Diese Lösung würde viele der Probleme überwinden, von denen vorgeschlagen wurde, daß sie für die mangelnde Wirksamkeit abgetöteter Vakzinen unter Verwendung roher Parasiten-Präparate verantwortlich sind. Zum Beispiel würden die durch Gentechnik hergestellten Impfstoffe keine immunsupprimierenden oder immunmodulierenden Anteile enthalten, die sich in rohen Extrakten von parasitischen Nematodenarten finden. Es ist aber notwendig, zuerst die Antigene zu identifizieren. Sobald diese einmal identifiziert und charakterisiert sind, könnte die Gentechnik verwendet werden, um Mikroorganismen zu konstruieren, die solche Proteine oder Teile der Proteine, die schützende Epitope enthalten, zu synthetisieren und die von rekombinanten Organismen synthetisierten Produkte in Impfstoffen zu verwenden, um Tiere vor Infektionen mit den Parasiten zu schützen.
In PCT/AU88/00239 wurde gezeigt, daß ein von einer rekombinanten DNA abgeleitetes Antigen, von dem gezeigt wurde, daß es Nematoden-Tropomyosin ist, bei Schafen einen 50%igen Schutz vor Haemonchus contortus bei einer Exposition ergab. In PCT/AU89/00416 wurde gezeigt, daß exkretorische/sekretorische Antigene von ausgewachsenem Trichostrongylus colubriformis geimpfte Meerschweinchen schützen. Aus Gründen, die später in der Beschreibung offenkundig werden, sind diese Antigene verschieden von dem Antigen, das in der vorliegenden Beschreibung identifiziert wird.

Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Der Ausdruck "Adjuvans", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Mittel, das verwendet wird, um die Immunantwort des immunisierten Wirts für die immunisierende Zusammensetzung zu verbessern.
Der Ausdruck "parenteral", wie er hier verwendet wird, schließt subcutane Injektionen, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektionen oder Infusionstechniken ein.
Der Ausdruck "homolog oder Homolog" bezieht sich auf Proteine oder DNA-Sequenzen, die solche Proteine kodieren, die mit einem ersten Protein oder einer DNA-Sequenz in einem solchen Ausmaß strukturell in Beziehung stehen, daß es klar ist, daß die Proteine in der Funktion verwandt sind. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird gezeigt, daß die DNA aus H. contortus, die das Antigen der Erfindung kodiert, in DNA-Hybridisierungs-Versuchen verwendet werden kann, um spezifische DNA- Sequenzen bei anderen Arten von parasitischen Nematoden zu identifizieren. Die Bedingungen, unter denen die Hybridisierungs-Versuche durchgeführt wurden, zeigen, daß verwandte DNA-Sequenzen zu mindestens 50 % homolog in der Nucleotidsequenz über 60 Basenpaare mit der von isoliertem H. contortus sind. Diese verwandten DNA-Segmente kodieren Antigene bei diesen anderen Arten von parasitischen Nematoden, die auch bezüglich der Aminosäuresequenz mit dem schützenden Antigen, das aus H. contortus isoliert wurde, in Beziehung stehen. Es wird angenommen, daß die verwandten Proteine als wirksame Immunogene dienen, um Tiere vor Parasitismus durch andere Parasitenarten zu schützen. Diese verwandten DNA-Sequenzen werden als homologe Gene bezeichnet und die verwandten Proteine werden als homologe Antigene bezeichnet. Im Zusammenhang mit der Erfindung wurde auch gezeigt, daß das schützende Antigen ein Mitglied einer Genfamilie ist, worin das kodierende Polynukleotid und das Genprodukt eine Homologie im Bereich von 50 % über 60 Nudeotide bzw. 70 % über 20 Aminosäuren mit dem kodierenden Gen und dem schützenden Antigen der Erfindung zeigen. Diese verwandten Gene und Genprodukte sind auch Homologe im Sinne der Erfindung.
Homologe der Erfindung können auch in vitro erzeugt werden, wie im folgenden beschrieben.
Der Ausdruck "abgeleitet oder stammen von" im Zusammenhang mit den Antigenen der Erfindung, wie er hier verwendet wird, soll Antigene einschließen, die durch Isolierung aus einer lebenden Stufe des parasitischen Nematoden, der das Antigen exprimiert, erhalten wurden, ebenso wie Antigene, die durch Manipulation und Expression von Nucleotidsequenzen erhalten wurden, die aus einer lebenden Stufe des parasitischen Nematoden hergestellt wurden, einschließlich genomischer DNA, mRNA, cDNA, die aus mRNA synthetisiert wurde, und synthetischen Nudeotiden, die hergestellt wurden, damit sie Sequenzen haben, die den das Antigen kodierenden Sequenzen entsprechen.
Es sollen auch synthetische Peptidantigene umfaßt sein, die auf Basis der bekannten Aminosäuresequenzen des Antigens, wie es von Nematoden exprimiert wird, hergestellt werden oder Zellinien, die rekombinante Formen des Antigens exprimieren.

Offenbarung

Es ist bevorzugt, falls möglich "neue" oder "verborgene" Antigene, d.h. Komponenten des Parasiten, die als wirksame und schützende Immunogene dienen können, aber nicht an der natürlich erworbenen Immunität beteiligt sind, zu identifizieren. Um solche Komponenten zu identifizieren, ist es notwendig, den Wirt mit Extrakten aus dem Parasiten zu impfen, Fraktionen zu identifizieren, die einen Schutz ergeben, von den schützenden Komponenten Unterfraktionen zu bilden unter Verwendung von Techniken der Proteinchemie, Tiere mit diesen Unterfraktionen zu impfen und diese Unterfraktionen, die schützen, zu identifizieren und mit diesem Verfahren fortzufahren, bis eine reine Parasitenkomponente verwendet wird, um das Tier zu impfen und zu schützen.
Soweit möglich, sollte in solchen Versuchen ein natürlicher Wirt verwendet werden. Da Labormodelltiere nicht der natürliche Wirt für den Parasiten sind, ist es wahrscheinlich, daß sie den Parasiten zurückweisen mit Mechanismen, zu denen der natürliche Wirt nicht fähig ist. So ist es möglich, daß Antigene, die Labortiere gegenüber speziellen Parasiten schützen, bei dem natürlichen Wirt des Parasiten nicht wirksam sind. Dies ist noch wahrscheinlicher der Fall in Situationen, wo der natürliche Wirt eine Immunität gegenüber dem Parasiten sehr langsam entwickelt.
Das in der vorliegenden Arbeit charakterisierte Antigen stammt von Haemonchus contortus, aber es ist offensichtlich, daß ähnliche oder verwandte Antigene, "homologe", aus anderen Arten von parasitischen Nematoden, von denen bekannt ist, daß sie Menschen oder Haustiere infizieren, identifiziert werden könnten, und daß diese verwandten Antigene einen wirksamen Impfstoff gegen Parasitismus durch diese Nematodenart liefern würden. Arten von Parasiten und Wirten, die sie infizieren können, schließen z.B. ein:
Trichinella spiralis oder Ancylostoma caninum - Infektionen bei Menschen, Strongylus vulgaris - Infektionen bei Pferden, Trichostrongylus colubriformis - Infektionen bei Schafen, Haemonchus contortus - Infektionen bei Ziegen, Ostertagia ostertagi - Infektionen bei Rindvieh, Ascaris suum oder Trichinella spiralis - Infektionen bei Schweinen, Toxascaris leonina oder Uncinaria stenocephala - Infektionen bei Katzen und Ancylostoma caninum oder Trichuris vulpis - Infektionen bei Hunden ebenso wie Infektionen des Kreislaufsystems von Menschen durch Larven von Toxocara spp und des Kreislaufsystems von Hunden durch Dirofilaria immitis, ebenso wie Infektionen des Kreislaufsystems, des Urogenitalsystems, des Atmungssystems, der Haut und der subcutanen Gewebe dieser und anderer Tierarten. Es ist anzumerken, daß diese Liste in keiner Weise vollständig ist.
Es wird ein Präparat beschrieben, das bei einer Exposition vor einer Infektion durch Haemonchus contortus schützt. Die schützenden Komponenten in der Fraktion wurden als löslich in Puffern, die geringe Anteile an zwitterionischen Detergentien enthalten, löslich sind und bei einer anschließenden Chromatographie auf einer Weizenkeim-Lectin-Sepharose-Säule nicht zurückgehalten werden. Die so hergestellten schützenden Antigene können, z.B. weiter mit einer Fraktionierung über Linsen-Lectin-(LL)-Chroinatographie oder Helix pomatia-Lectin- (HpL)-Chromatographie, Reverse Phase-HPLC, Größenausschluß- Chromatographie oder andere Reinigungsmethoden, die in Gegenwart von solubilisierenden Detergentien bekannt sind, gereinigt werden.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein im wesentlichen gereinigtes glycosyliertes oder nicht glycosyliertes Protein bereitgestellt, das ein Nematodenantigen ist und die Aminosäuresequenz umfaßt, die von den Resten 12 bis einschließlich 440 der in Figur 8 dargestellten Aminosequenz definiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70 % homolog über 20 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz ist, die von den Resten 12 bis einschließlich 440 der in Figur 8 dargestellten Aminosequenz definiert wird. Typischerweise ist das Antigen zu mindestens 90 % rein. Dieser Reinheitsgrad wird gezeigt im Hinblick auf die Reinheit der Präparate, die in der Aminosäuresequenzierung verwendet werden.
Die Erfindung umfaßt das Antigen sowohl in glycosylierter als auch in nicht glycosylierter Form.
Typischerweise wird das Nematodenantigen erhalten von einer Nematodenart ausgewählt aus einer Art der Gattungen Trichinella, Ancylostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria. Beispiele für solche Arten schließen Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Strongylus vulgaris, Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia ostertagi, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, Dirofilaria immitis, Toxocara spp, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis und Wuchereria bancrofti ein.
Typischerweise ist der Schutz, der einem Wirt verliehen wird, ein Schutz vor einer parasitischen Nematodenart ausgewählt aus Arten der Gattungen Trichinella, Ancylostoma, Strongylus, Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Ascaris, Toxascaris, Uncinaria, Trichuris, Dirofilaria, Toxocara, Necator, Enterobius, Strongyloides und Wuchereria. Beispiele für solche Arten schließen Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Strongylus vulgaris, Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, ostertagia ostertagi, Ascaris suum, Toxascaris leonina, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, Dirofilaria immitis, Toxocara spp, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularus, Strongyloides stercoralis und Wuchereria bancrofti ein.
Bevorzugt wird die Nematodenart ausgewählt aus den Gattungen Haemonchus, Trichostrongylus und Ostertagia.
Bevorzugter gehört die Nematodenart zu der Gattung Haemonchus.
Bevorzugt sind die ersten und zweiten Nematodenarten Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformus und Ostertagia circumcincta.
Bevorzugter ist die Nematodenart Haemonchus contortus.
Die vorliegenden Erfinder haben bestimmt, daß das Antigen der ersten Ausführungsform wahrscheinlich ein proteolytisches Spaltprodukt eines Nematoden-Glycoproteins mit höherem Molekulargewicht ist.
Das Nematoden-Glycoprotein könnte aus nativen Quellen hergestellt werden, durch Antikörper-Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das Expressionsprodukt des klonierten Gens gezüchtet wurden.
Das Glycoprotein mit höherem Molekulargewicht in glycosylierter und unglycosylierter Form wird auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt und wird im folgenden als "Antigen-Vorläufer" bezeichnet.
Der Antigen-Vorläufer ist in im wesentlichen gereinigter Form auch Teil der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Typischerweise umfaßt der Antigen-Vorläufer die in Figur 8 dargestellte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 12).
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid-Molekül, z.B. ein DNA-Molekül, wie ein cDNA-Molekül, zur Verfügung gestellt, das ein Protein der Erfindung kodiert.
Typischerweise ist das Polynucleotid-Molekül ein DNA-Molekül.
Bevorzugt ist das Polynucleotid-Molekül ein cDNA-Molekül.
Ein bevorzugtes Polynucleotid-Molekül der Erfindung ist ein cDNA-Molekül, das im wesentlichen die in den Figuren 7 oder 8 dargestellte Sequenz hat (SEQ ID Nr. 9 oder Nr. 11).
Die Erfindung schließt in ihren Schutzbereich DNA-Moleküle ein, die zu mindestens 50 % homolog über 60 Nudeotide mit der in Figur 8 dargestellten Sequenz sind und ein schützendes Molekül kodieren, das vor einer parasitischen Nematoden- Infektion Immunität verleihen kann.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt, das ein Polynucleotid-Molekül der zweiten Ausführungsform und Vektor-DNA umfaßt.
Typischerweise umfaßt die Vektor-DNA Plasmid-, Phagen- oder virale DNA.
Bevorzugte Vektoren schließen lambda gt11, pUR290, pUR291, pUR282, pUK270, pUC8, pUC9, pZipNeo, einen Vektor auf Basis SV40, lambda gt10, einen EMBL-Vektor, pBR327, pBR329 oder pBR-329, der eine Par-Region enthält, Baculovirus oder Vacciniavirus ein.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird ein transformierter Wirt bereitgestellt, der mit mindestens einem Polynucleotid-Molekül der Erfindung transformiert ist.
Typischerweise wird der Wirt ausgewählt aus Bakterien, Hefen, anderen Pilzen, Insekten, Pflanzen und Säugetier-Zellinien.
Bevorzugte Wirtszellen sind E. coli K12-Derivate.
Gemäß einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der mindestens ein Protein der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfaßt. Die Impfstoffe der Erfindung könnten alternativ mindestens einen Anti-Idiotyp-Antikörper enthalten, der einen Wirt vor einer Infektion mit einem parasitischen Nematoden schützen kann, indem er das Antigen, den Antigen-Vorläufer, das Homologe, das Expressionsprodukt und/oder das synthetische Polypeptid nachbildet. Ein pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbarer Träger, ein Verdünnungsmittel, ein Hilfsstoff und/oder Adjuvans können zu der aktiven Komponente zugegeben werden.
Als weitere Alternative kann der Impfstoff ein Vollzell-Impfstoff sein, der einen transformierten Wirt der fünften Ausführungsform zusammen mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfaßt. Die Zellen können lebend oder abgetötet sein.
Die transformierten Zellen schließen solche ein, die das Expressionsprodukt für die Schleimhaut-Präsentation eines zu impfenden Wirtes exprimieren, z.B. als Zelloberflächen- Fusionsprodukt. Gemäß einer sechsten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines Proteins der Erfindung, wobei das Verfahren umfaßt:
a) daß man junge ausgewachsene Exemplare einer parasitischen Nematodenart homogenisiert, um ein Homogenisat herzustellen;
b) Membranmaterial aus dem Homogenisat erhält;
c) das Membranmaterial mit einem Puffer, der einen geringen Anteil eines zwitterionischen Detergens enthält, extrahiert, um einen Detergens-Extrakt zu erhalten;
d) den Detergens-Extrakt auf einer Weizenkeim-Lectin-Sepharose-Säule chromatographiert und
e) den Durchfluß aus der Säule sammelt.
Bevorzugt umfaßt das Verfahren auch:
f) die Fraktionierung durch präparative isoelektrische Fokussierung und die Sammlung der Fraktionen mit einem pI im Bereich von 3,8 bis 4,4 oder bevorzugter 4,0 bis 4,3;
g) Fraktionierung durch Gelfiltrations-Chromatographie, um Fraktionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 60 kD zu sammeln und
h) Fraktionierung mit Linsen-Lectin- und/oder Helix pomatia- Lectin-Chromatographie und Sammeln des gebundenen Materials.
Gemäß einer siebten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines Impfstoffs der Erfindung, wobei das Verfahren umfaßt: daß man eine wirksame Menge mindestens eines Proteins der Erfindung und/oder transformierten Wirts der Erfindung und/oder einen Antiidiotyp- Antikörper mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans vermischt.
Gemäß einer achten Ausführungsform der Erfindung wird ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper bereitgestellt, der gegen ein Protein der Erfindung gezüchtet wurde. Die Erfindung liefert auch andere Verbindungen, die sich ähnlich wie die erfindungsgemäßen Antikörper verhalten, indem sie an die Struktur und/oder Funktion der Proteine der Erfindung binden oder diese verändern.
Gemäß einer neunten Ausführungsform der Erfindung wird eine Antikörper-Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens einen Antikörper der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff umfaßt.
Gemäß einer zehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Diagnose-Kit bereitgestellt, der eine Probe eines Proteins der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Gemäß einer elften Ausführungsform der Erfindung wird ein Anti-Idiotyp-Antikörper bereitgestellt, der einem Teil eines Proteins der Erfindung entspricht und einen Wirt, der mit dem Anti-Idiotyp-Antikörper immunisiert wurde, vor dem Befall mit einer parasitischen Nematodenart schützt.
Es ist offensichtlich, daß eine Variation von Aminosäure- und Nucleotid-Sequenzen zwischen verschiedenen allelischen Formen eines speziellen Proteins und des/der das Protein kodierenden Gens/Gene auftreten kann. Wenn die Sequenz eines speziellen Gens oder Proteins einmal bekannt ist, wäre außerdem ein Fachmann, der die verfügbaren Techniken verwendet, fähig, solche Sequenzen zu manipulieren, um sie gegenüber spezifischen Sequenzen zu verändern, um ein Gen oder Protein zu schaffen, das immer noch auf gleiche Weise, wie das Gen oder Protein, mit dem es in Beziehung steht, funktioniert. Diese Moleküle werden hier als "homologe Moleküle" bezeichnet und sollen von der vorliegenden Erfindung umfaßt sein.
In dieser Hinsicht ist "ein homologes Molekül" ein Polypeptid, das die Grundfunktions-Eigenschaften behält, nämlich die schützende Aktivität eines Antigens der Erfindung und das zu einem Antigen der Erfindung homolog ist. Für die Zwecke der Beschreibung bezeichnet "Homologie" zwischen zwei Sequenzen eine Ähnlichkeit, fast Identität, die auf die Abstammung der ersten Sequenz von der zweiten hinweist. Insbesondere ist ein Polypeptid "homolog" mit einem Antigen der Erfindung, wenn ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen zwischen Polypeptid und Antigen eine Identität von mehr als etwa 70 % über 20 Aminosäuren liefert. Ein solcher Sequenz-Vergleich kann mit bekannten Algorithmen durchgeführt werden, z.B. dem, der von Lipman und Pearson in Science 227: 1435 (1985) beschrieben wird, der leicht auf dem Computer installiert werden kann.
Homologe können gemäß der vorliegenden Erfindung durch übliche auf eine Stelle gerichtete Mutagenese bewirkt werden, was ein Weg ist, um routinemäßig Reste des Moleküls zu identifizieren, die modifiziert werden können, ohne das entstehende Polypeptid biologisch inaktiv zu machen. Eine auf ein Oligonucleotid gerichtete Mutagenese, die umfaßt (i) die Synthese eines Oligonucleotids mit einer Sequenz, die die gewünschte Nucleotid-Substitution (Mutation) enthält, (ii) Hybridisierung des Oligonucleotids mit einer Matrize, die eine Struktursequenz umfaßt, die ein Antigen der Erfindung kodiert und (iii) Verwendung von T4-DNA-Polymerase, um das Oligonucleotid als Primer zu verlängern, ist bevorzugt, wegen ihrer schnellen Möglichkeit, die Wirkungen spezieller Veränderungen auf die Antigenstruktur-Sequenz zu bestimmen. Die relativen Kosten können dagegen sprechen und für eine Alternative, die bekannt ist als direkte Mutagenese-Methode.
Auch beispielhaft für homologe Antigene im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Moleküle, die einem Teil des Antigens entsprechen oder einen Teil des Antigens enthalten, ohne mit dem natürlichen Molekül gleich zu sein und die schützende Aktivität eines Antigens der Erfindung haben.
Andere Homologe der vorliegenden Erfindung sind Fragmente des Antigens, die die schützende Aktivität behalten. In ähnlicher Weise lägen im Bereich der vorliegenden Erfindung synthetische Polypeptide, die (i) einem Teil der Antigen-Aminosäuresequenz entsprechen und (ii) eine Aktivität behalten, die charakteristisch für das Antigen ist. Solche synthetischen Polypeptide hätten bevorzugt eine Länge von 6 bis 30 Aminosäuren.
Ob ein synthetisches Polypeptid, das Kriterium (i) erfüllt, auch Kriterium (ii) erfüllt, kann routinemäßig bestimmt werden, indem die schützende Aktivität in einem geeigneten Wirt nachgewiesen wird.
Die Menge an Antigen, Antigen-Vorläufer, homologer Form, Expressionsprodukt und/oder synthetischem Polypeptid, die mit dem Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans vereinigt wird, um eine einzelne Impfdosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der Infektion, gegen die geimpft werden soll, dem Wirt, der behandelt werden soll, und der speziellen Verabreichungsart.
Es versteht sich auch, daß die spezifische Dosishöhe für irgendeinen speziellen Wirt von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich der Aktivität des spezifischen Antigens, des Antigen-Vorläufers, der homologen Form, des Expressionsproduktes und/oder des synthetischen Polypeptids, die angewendet werden, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, der Nahrung, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, Arzneimittel-Kombination und dem jeweils zu verhütenden Infektionszustand.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können parenteral oder möglicherweise über die Schleimhaut verabreicht werden in Dosierungs-Einheitspräparaten, die übliche, nicht toxische, pharmazeutische und/oder veterinärmedizinisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und/oder Hilfsstoffe, je nach Wunsch, enthalten.
Injizierbare Präparate, z.B. sterile injizierbare wäßrige oder ölige Suspensionen können gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel formuliert werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, z.B. eine Lösung in 1,3-Butandiol. Zu den annehmbaren Trägern und Lösungsmitteln, die angewendet werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchlorid-Lösung. Zusätzlich werden sterile, fette Öle üblicherweise als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium angewendet. Für diesen Zweck kann jedes neutrale fette Öl angewendet werden, einschließlich synthetischen Mono- oder Diglyceriden. Außerdem finden Fettsäuren, wie Ölsäure, Anwendung bei der Herstellung von injizierbaren Lösungen.
Derzeit ist Alaun das einzige eingetragene Adjuvans für die menschliche Verwendung, jedoch werden Forschungen durchgeführt an anderen Adjuvantien für die menschliche Verwendung und es wird davon ausgegangen, daß diese anderen Adjuvantien zur Verwendung zur Herstellung von Zusammensetzungen für menschliche Impfstoffe in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet wären
Geeignete Adjuvantien für das Impfen von Tieren schließen Ölemulsionen, wie Freund'sches komplettes oder inkomplettes Adjuvans (nicht geeignet für Vieh), Marcol 52: Montanid 888 (Marcol ist ein Warenzeichen von Esso. Montanid ist ein Warenzeichen von SEPPIC, Paris), Squalan oder Squalen, Adjuvans 65 (enthaltend Erdnußöl, Mannit-Monooleat und Aluminium- Monostearat), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat und Alaun, Tenside, wie Hexadecylamin, Octadecylamin Lysolecithin, Dimethyldioctadecyiammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis( 2-hydroxyethyl-propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und Pluronicpolyole, Polyanionen, wie Pyran, Dextransulfat, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide und Aminosäuren, wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin und Trehalosedimycolat ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Antigene, Vorläufer, Expressionsprodukte und/oder synthetischen Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch verabreicht werden nach Einarbeitung in Liposomen oder andere Mikroträger oder nach Konjugation mit Polysacchariden, Proteinen oder Polymeren oder in Kombination mit Quil-A unter Bildung von "Iscoms" (immunstimulierenden Komplexen). Andere Adjuvantien, die zur Verwendung für die vorliegende Erfindung geeignet sind, schließen Konjugate ein, die das Immunogen zusammen mit einem integralen Membranprotein prokaryotischen Ursprungs, z.B. TraT enthalten (siehe PCT/AU87/00107).
Verabreichungswege, Dosierungen, die verabreicht werden, ebenso wie die Häufigkeit der Injektionen sind alles Faktoren&sub1; die unter Anwendung des üblichen Fachwissens, optimiert werden können. Typischerweise folgen der Anfangsimpfung nach einigen Wochen eine oder mehrere "Booster"-Impfungen, wobei die Nettowirkung die Erzeugung einer heftigen Immunantwort sowohl auf zellulärer als auch humoraler Ebene ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Ergebnisse einer Gelfiltrations-HPLC für IEF 5 und 6 auf einem SDS-Polyacrylamidgel, angefärbt mit Silber. Die Bahnen 1 bis 6 enthalten GF1 bis GF6; Bahn 7 enthält Bio-Rad-Standards mit hohem und niedrigem Molekulargewicht mit Größen, die in Kilodalton angegeben sind, und Bahn 8 enthält IEF 5 und 6 (Prä-GF-HPLC).
Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Lectin-Affinitäts-Chromatographie für IEF 5 und 6 auf einem SDS-Polyacrylamidgel, angefärbt mit Silber. Bahn 1 enthält Molekulargewichts-Standards. Die Bahnen 2 und 3 enthalten Material, das von Linsen- Lectin-Sepharose (LLS) gebunden und davon eluiert wurde; Bahn 4 enthält Material, das von Helix pomatia-Lectin-Sepharose (HpLS) nach anfänglicher Bindung und Elution von LLS gebunden und eluiert wurde und Bahn 5 enthält Material, das nicht an HpLS band nach einer anfänglichen Bindung an und Elution von LLS.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse einer Lectin-Affinitäts-Chromatographie für IEF 5 und 6 als Western-Blot, überlagert mit Concanavalin A-HRP und reaktivem Material, das durch eine enzymatische Reaktion sichtbar gemacht wurde. Bahn 1 enthält IEF 5 und 6; Bahn 2 enthält Material, das nicht an LLS bindet; Bahn 3 enthält Material, das an LLS bindet und davon eluiert wurde; Bahn 4 enthält Material, das an HpLS nach anfänglicher Bindung und Elution von LLS bindet und davon eluiert wird; Bahn 5 enthält Material, das nicht an HpLS bindet nach anfänglicher Bindung und Elution von LLS; Bahn 6 enthält Material, das weder an LLS noch an HpLS bindet und Bahn 7 enthält BRL-Hochmolekulargewichts-Standards.
Figur 4 zeigt die Ergebnisse einer Lectin-Affinitäts-Chromatographie für IEF 5 und 6 als Western-Blot überlagert mit Helix pomatia-Lectin-HRP und einem reaktiven Material, das durch enzymatische Reaktion sichtbar gemacht wurde. Die Materialien, die die Bahnen enthalten, sind wie für Figur 3 beschrieben.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse einer Reverse-Phase-HPLC für IEF 5 und 6 an einer PLRP-S-Säule. Der für die Elution verwendete Gradient bestand aus 30 % Acetonitril in Wasser mit 0,1 % TFA bis 60 % Acetonitril in Wasser mit 0,1 % TFA. Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml pro Minute und die Absorption wurde bei 220 nm gemessen. Die Spitzenfraktionen, die durch Zahlen bezeichnet sind, wurden manuell gesammelt.
Figur 6(a) und Figur 6(b) zeigen die Ergebnisse einer Reverse-Phase-HPLC für IEF 5 und 6 als SDS-Polyacrylamidgel (9 bis 22 % Gradient), angefärbt mit Silber. Die Zahlen beziehen sich auf die in Figur 5 gezeigten Spitzenfraktionen. Bahn 5 sind Bio-Rad-Molekulargewicht-Standards mit hohem und niedrigem Molekulargewicht, für die die Größen in Kilodalton angegeben sind.
Figur 7 zeigt die klonierte DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 9) von pBTA879 und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 10) des klonierten Gens, das ein zu dem schützenden Antigen homologes Antigen kodiert.
Figur 8 zeigt die klonierte DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 11) von pBTA963 und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 12) des klonierten Gens, das das schützende Antigen kodiert.
Figur 9 zeigt einen Southern-Blot von DNA von H. contortus hybridisiert mit der cDNA von pBTA879 und pBTA963, der die Gegenwart homologer Gene innerhalb des Parasitengenoms zeigt. Bahn 1: Haemonchus contortus-DNA, HinfI-Verdau, sondiert mit pBTA963. Bahn 2: Haemonchus contortus-DNA, HinfI-Verdau, sondiert mit pBTA979.
Figur 10 zeigt einen Southern-Blot von DNA aus T. colubriformis, Ostertagia circumcincta und Ostertagia ostertagi mit einer Antigensonde mit 45 kD, der die Gegenwart verwandter Gene in anderen Nematodenarten zeigt.
Bahn 1: Haemonchus contortus-DNA, HinfI-Verdau.
Bahn 2: Trichostrongylus dolubriformis DNA, HinfI-Verdau.
Bahn 3: Ostertagia ostertagi DNA, HinfI-Verdau.
Bahn 4: Ostertagia circumcincta DNA, HinfI-Verdau.
Bahn 5: Plasmid pBTA963, HinfI-Verdau - positive Kontrolle.
Figur 11(a) und Figur 11(b) zeigen SDS-PAGE-Gele und Western- Blots des rekombinanten Antigens mit 45 kD, das in E. coli exprimiert wird. Figur 11(a): Expression von Antigen 45 kDa aus E. coli: Proben wurden auf einein 12,5 % SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde dann mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt. Bahn 1: nicht induzierte Kontrolle; Bahn 2: eine Stunde nach der Induktion; Bahn 3: 3 Stunden nach der Induktion; Bahn 4: vorgefärbte SDS-PAGE- Biorad-Standards. Figur 11(b) Western-Blot von exprimiertem Antigen mit 45 kDa: die Proben wurden wie in Figur 11(a) elektrophoretisch aufgetrennt, dann elektrophoretisch auf ein Nitrocellulosefilter geblottet. Das Filter wurde mit Kaninchenserum, das gegen ein Peptid, das dem truncierten N-Terminus des 45 kDa-Proteins entsprach, gezüchtet worden war, sondiert. Das Promega-Protoblot-alkalische Phosphatase-System (Produkt Nr. W3930) wurde verwendet, um Farbe zu entwickeln.
Figur 12 zeigt Western-Blots von Extrakten aus H. contortus und dem im Herzen von Hunden lebenden Fadenwurm D. immitis, was zeigt, daß Antigene, die mit denen der Erfindung immunologisch verwandt sind, in anderen Arten von parasitischen Nematoden exprimiert werden. Bahn 1: D. immitis-Extrakt; Bahn 2: H. contortus-Extrakt; Bahn 3: BRL-Hochmolekulargewicht- Standards.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Junge ausgewachsene Haemonchus contortus wurden in phosphatgepufferter Kochsalziösung (PBS) homogenisiert und das Homogenisat wurde zentrifugiert, um das Membranmaterial von den Nematoden abzusetzen. Es wurde gefunden, daß dieses Pellet Schafe bei einer Immunitätstest-Infektion nach zwei Impfungen schützte. Die schützende Fraktion wurde dann mit einer Anzahl verschiedener Detergentien extrahiert. Zwittergent 3-14 (Calbiochem) erwies sich als geeignet, obwohl andere Detergentien auch wirksam waren. Die Effizienz der Extraktion wurde beurteilt nach der Fähigkeit des verwendeten Detergens, schützende Antigene (was durch Impf/Immunitätstestversuche bewertet wurde) mit der höchsten spezifischen Aktivität (abgeschätzt durch die Anzahl von Mikrogramm solubilisiertem Material, die erforderlich war, um einen Schutz zu ergeben) zu solubilisieren, während ein unlöslicher Rückstand zurückblieb, der keinen wesentlichen Schutz nach dem angewendeten Impf/Immunitätstest-Schema ergab (42 %, siehe Tabelle 3). Es wird zugegeben, daß das Zwittergent 3-14-Extraktionsverfahren nicht vollständig wirksam sein kann und einige der schützenden Antigene in der detergensunlöslichen Fraktion gefunden werden können.
Die rekombinanten DNA-Moleküle und transformierten Wirtszellen der Erfindung werden hergestellt unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie.
Expressionsprodukte der Erfindung werden erhalten, indem transformierte Wirtszellen der Erfindung unter Standardbedingungen, die für die jeweilige Wirtszelle geeignet sind, gezüchtet werden und das Expressionsprodukt von der Kultur mit Standardtechniken abgetrennt wird. Das Expressionsprodukt kann in unreiner Form verwendet werden oder kann mit Standardtechniken, die für das herzustellende Expressionsprodukt geeignet sind, gereinigt werden.
Wenn es geeignet ist, können ganze Zellen in den Impfstoffen verwendet werden.
Synthetische Polypeptide der Erfindung werden mit Standardtechniken der Peptidsynthese hergestellt, auf Basis der bekannten Sequenzen der Antigene, Antigen-Vorläufer, homologen Formen und Expressionsprodukte der Erfindung.
Die homologen Formen, Expressionsprodukte und synthetischen Polypeptide können bezüglich der schützenden Aktivität, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, getestet werden.
Gentechnik kann verwendet werden, um eine größere Menge des schützenden Antigens oder der Homologen, die hier beschrieben werden, zu liefern. Das DNA-Segment, das das schützende Antigen oder den Vorläufer für das schützende Antigen oder eine homologe Form kodiert, kann in irgendein rekombinantes Plasmidsystem insertiert werden, um das Molekül zu befähigen, es in großen Mengen zu synthetisieren. Die rekombinanten Systeme schließen E. coli, Hefe und Baculovirus-Systeme und Viren, wie Vaccinia ein. Die rekombinanten Organismen können in größen Volumina in Fermentern gezüchtet werden und die rekombinanten Antigene mit Standardmethoden gereinigt werden - Solubilisierung in Lösungen, die Harnstoff und Reduktionsmittel, wie DTT oder Mercaptoethanol enthalten, erneutes Falten in Gegenwart von Reagenzien, wie reduziertem und oxidiertem Glutathion, Reinigung durch Ionenaustausch, Filtration und/oder Gelpermeations-Chromatographie, schließlich Sterilisierung durch Filtration und Verstärkung in einer Anzahl von Adjuvantien, einschließlich Ölen.
Der Impfstoff wird hergestellt, indem ein Antigen, Antigen- Vorläufer, eine homologe Form, ein Expressionsprodukt und/oder synthetisches Polypeptid und/oder ein transformierter Wirt und/oder ein Anti-Idiotyp-Antikörper der Erfindung mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans vermischt, bevorzugt homogen vermischt wird unter Verwendung von Standardmethoden der pharmazeutischen und/oder veterinärmedizinischen Herstellung.
Die Menge an Antigen, Antigen-Vorläufer, homologer Form, Expressionsprodukt, synthetischem Polypeptid und/oder transformiertem Wirt und/oder Anti-Idiotyp-Antikörper, die erforderlich ist, um eine einzige Dosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der Infektion, gegen die geimpft werden soll, dem Wirt, der behandelt werden soll, und der jeweiligen Verabreichungsart. Die spezifische Dosishöhe für jeden speziellen Wirt hängt ab von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Nahrung des Wirts, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate und der Arzneimittel-Kombination.
Der Impfstoff kann parenteral in Einheits-Dosierungsformen verabreicht werden, die übliche, nicht toxische, pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und/oder Adjuvantien, je nach Wunsch, enthalten.
Anti-Idiotyp-Antikörper werden erzeugt, indem ein geeigneter Wirt mit einem Antigen, Vorläufer, Expressionsprodukt, Homologen und/oder synthetischem Polypeptid der Erfindung geimpft wird und die entstehenden Antikörper verwendet werden, um Antikörper gegen die Antigen-bindende Region der Antikörper, die bei der ersten Impfung erzeugt wurden, zu erzeugen.
Antikörper werden erzeugt unter Verwendung von Standard-Impfplänen in geeigneten Wirten. Der Wirt wird mit einem Antigen, Antigen-Vorläufer, einer homologen Form, einem Expressionsprodukt, synthetischen Polypeptid und/oder Impfstoff der Erfindung geimpft. Eine Immunantwort wird erzeugt als Ergebnis der Impfung. Die Immunantwort kann überwacht werden, z.B. indem der Anteil der erzeugten Antikörper gemessen wird.
Die Antikörper-Zusammensetzung wird hergestellt, indem ein Antikörper mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff vermischt, bevorzugt homogen vermischt wird, unter Verwendung von Standardmethoden der pharmazeutischen und/oder veterinärmedizinischen Herstellung.
Die Menge an Antikörper, die erforderlich ist, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, variiert abhängig von der Infektion, gegen die geimpft werden soll, dem Wirt, der behandelt werden soll, und der jeweiligen Verabreichungsart. Die spezifisch Dosishöhe für jeden einzelnen Wirt hängt ab von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und der Nahrung des Wirts, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Arzneimittelkombination und der Schwere der Infektion, die behandelt wird.
Die Antikörper-Zusammensetzung kann parenteral verabreicht werden, in Einheits-Dosierungs-Präparaten, die übliche, nicht toxische, pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe, je nach Wunsch, enthalten, um Wirte vor einem Nematoden-Befall passiv zu schützen.
Diagnose-Ks werden hergestellt, indem ein Expressionsprodukt, Antikörper, ein Antigen, ein Antigen-Vorläufer, eine homologe Form oder ein synthetisches Polypeptid in einer geeigneten Konzentration für die nachzuweisende Substanz(en) mit einem pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff formuliert wird. Ein positiver Kontrollstandard bekannter Konzentration der nachzuweisenden Substanz wird auf gleiche Weise hergestellt. Der negative Standard umfaßt Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff allein.
Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht den Schutzbereich der Erfindung beschränken sollen.

Beispiel 1

Junge H. contortus Nematoden wurden von infizierten Schafen gewonnen. Die Nematoden wurden dreimal in PBS gewaschen und in PBS homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 500 x g 10 Minuten lang zentrifugiert, um großes und unzerbrochenes Wurmmaterial zu entfernen. Der Überstand wurde dann mit 120.000 x g av 2 Stunden lang bei 4ºC zentrifugiert. Das pelletisierte Material wurde in PES suspendiert und dann verwendet, um Schafe subcutan in Abwesenheit von Adjuvans bei zwei Gelegenheiten im Abstand von 4 Wochen zu impfen, wobei jede Impfung ungefähr 50 mg (Naßgewicht) Wurmäquivalent pro kg Körpergewicht Schaf enthielt. 3 Wochen nach der zweiten Impfung erhielten das Schaf und 5 nicht geimpfte Infektionskontrollen 10.000 infektiöse Larven von Haemonchus contortus zum Immunitätstest. An den Tagen 23, 27, 28, 33, 36 und 40 nach der Infektion wurden die Eier im Faeces gezählt bei allen Schafen. Die Ergebnisse (Eier pro Gramm Faeces) sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Zählung der Fäkaleier Eier pro Gramm Faeces Tier /Tag Kontrollen geimpfte
Es ist offensichtlich, daß vier von fünf geimpften Tieren gut geschützt waren vor einer Infektion (p < 0,02 für die geimpfte Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe).

Beispiel 2

Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, wobei weibliche Meerschweinchen mit Homogenisaten aus ausgewachsenen H. contortus und mit 120.000 x g Pellets und Überständen, die aus diesen Homogenisaten stammten (hergestellt im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben) geimpft wurden. Die Meerschweinchen erhielten zwei Impfungen intraperitoneal in Abwesenheit von Adjuvans im Abstand von 3 bis 4 Wochen und wurden 3 bis 4 Wochen nach der zweiten Impfung mit 1.000 infektiösen Larven von H. contortus getestet. Fünf bis sechs Tage nach der Infektion wurden die Tiere getötet und die Würmer gezählt.
Tabelle 2 faßt die Ergebnisse dieser Versuche zusammen und zeigt die Anzahl der Würmer, die aus den geimpften Tieren gewonnen wurden als Prozentanteil der von den nicht geimpften Kontrolltieren gewonnenen, die die gleiche Testinfektion erhielten. Tabelle 2 Fraktion % Schutz Versuch Nr. Homogenisat (3 Gruppen) 120.000 x g Pellet 120.000 x g Überstand * Diese Tiere erhielten nur eine Impfung.
Es ist aus diesen Ergebnissen offensichtlich, daß Fraktionen, die von Homogenisaten von ausgewachsenen H. contortus stammen, den Meerschweinchen einen wesentlichen Schutz geben können, insbesondere das teilchenförmige Material, das sich in dem 120.000 x g Pellet befindet.

Beispiel 3

Junge ausgewachsene H. contortus wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung homogenisiert und ein 120.000 x g Pellet wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Das Pellet wurde in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 1 % (G/V) Zwittergent SB-14 (Sigma) enthielt, durch Beschallung und einstündiges Schütteln bei 4ºC resuspendiert. Der Extrakt wurde mit 50.000 x g av 30 Minuten lang zentrifugiert, um das detergensunlösliche Material zu pelletisieren. Die Überstandfraktion wurde zweimal über eine Affinitätssäule mit Weizenkeim-Lectin-Sepharose 6MB (Sigma) geleitet, um Glycoproteine, die endständige N-Acetyl-glucosaminreste enthielten, abzutrennen. Die fünf Fraktionen, die von diesem Verfahren stammten, wurden verwendet, um Meerschweinchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zu impfen. Die Ergebnisse (Tabelle 3) zeigen klar, daß ein wesentlicher Anteil des schützenden Materials in dem Detergens solubilisiert wurde, aber der überwiegende Anteil des schützenden Antigens/der schützenden Antigene nicht an Weizenkeimlectin binden konnte. Tabelle 3 Fraktion µg pro Tier % Schutz SB-14 unlösliches Material SB-14 lösliches Material SB-14 löslich WGA&spplus; SB-14 löslich WGA&supmin;
WGA+ ist Weizenkeim-Agglutinin bindendes Material
WGA&supmin; ist Weizenkeim-Agglutinin nicht bindendes Material
SB-14 ist Zwittergent SB-14 (Calbiochem).
Material, das in einem teilchenförmigen Präparat, das aus einem Homogenisat von H. contortus stammt, enthalten ist, kann, wenn es verwendet wird, um Meerschweinchen oder Schafe zu impfen, eine Immunantwort bei den geimpften Tieren zu verstärken, was bei diesen Tieren einen verminderten Parasitismus erzeugt, wenn sie mit dem Parasiten infiziert werden. Die schützenden Antigene sind großenteils löslich in Detergentien, wie Zwittergent SB-14 und binden nicht an Weizenkeim-Agglutinin unter den in den obigen Beispielen angewendeten Bedingungen.

Beispiel 4

Ein Zwittergent SB-14-Extrakt wurde hergestellt aus 10 bis 15 g Naßgewicht von jungen ausgewachsenen H. contortus, wie in Beispiel 3 beschrieben, und verwendet, um Schafe in zwei Versuchen zu impfen.
Die Tiere erhielten zwei Impfungen im Abstand von 3 Wochen, die erste in Freund'schem kompletten Adjuvans und die zweite in Freund'schem inkompletten Adjuvans. Drei Wochen nach der zweiten Impfung wurden die Schafe per os mit 10.000 Larven von H. contortus in Kontakt gebracht. Die Zählung der Eier im Faeces wurde zweimal pro Woche durchgeführt, beginnend 21 Tage nach der Infektion über die nächsten 4 Wochen, wonach die Tiere geschlachtet wurden, um die Würmer zu zählen (Tabelle 4a und 4b). Es ist offensichtlich, daß der Zwittergent SB-14-Extrakt Antigene enthielt, die Schafen einen wesentlichen Schutz gegen eine Infektion geben konnten, was entweder durch die Zählung der Eier im Faeces oder durch die Zählung der Würmer gemessen wurde, trotz der Tatsache, daß die Menge an Protein, die verwendet wurde, um jedes Tier in diesem Versuch zu impfen, sehr gering war (10 ± 2,5 mg) und der Extrakt eine große Anzahl von Komponenten enthielt, was durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese gezeigt wurde. Tabelle 4a Immunitätstest Kontrollen SB-14 in Adjuvans Kontrollen SB-14 Extrakt von H.c. L5 in Adjuvans Gruppendurchschnitt Zählung der Eier im Faeces % Schutz der Adjuvans-Kontrollen Zählung der Würmer bei den Schafen beim Schlachten % Schutz der Adjuvans-Kontrolle Tabelle 4b Immunitätstest Kontrollen SB-14 in Adjuvans Kontrollen SB-14 Extrakt von H.c. L5 in Adjuvans Gruppendurchschnitt Zählung der Eier im Faeces % Schutz der Adjuvans-Kontrollen Zählung der Würmer bei den Schafen beim Schlachten % Schutz der Adjuvans-Kontrolle

Beispiel 5

Für den gleichen Versuch wie in Beispiel 3 wurde fünfmal mehr Material hergestellt, als in diesem Beispiel verwendet wurde. Der verbleibende Zwittergent SB-14-Extrakt (ungefähr 63 mg Protein) wurde durch präparative isoelektrische Fokussierung in einem 4 % Ultrodex-Harz (LKB), das Pharmalyte 3-10 Ampholine und 0,5 % CHAPS-Detergens (Calbiochem) enthielt, fraktioniert. Nach der Elektrophorese mit 10.000 Vh, wurde das Bett zu 30 Fraktionen ausgekratzt und das Material jeder Fraktion in 0,1 % CHAPS eluiert. Der pH jeder Fraktion wurde bestimmt und jede Fraktion wurde dann an einer YM10-Membran auf 1 ml eingeengt. Ein Aliquot jeder Fraktion wurde mit SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und mit Coomassie- Briliant-Blau angefärbt. Aliquots (ungefähr 1/8) jeder Fraktion wurden gepoolt auf Basis der Komponenten, die auf dem SDS-Gel sichtbar gemacht wurden, was insgesamt 5 Fraktionen ergab, die verwendet wurden, um Meerschweinchen zu impfen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Zählung der Würmer (Tabelle 5) zeigt, daß der Hauptteil der schützenden Antigene in den Fraktionen 1 bis 10 des IEF-Gels enthalten ist, was den pI-Bereich von 3,3 bis 4,6 abdeckt. Andere Fraktionen enthielten auch Material, was zu einer Abnahme der Wurmlast führte und diese sind für diese Anmeldung auch von Interesse. Tabelle 5a Versuch #229 Fraktion Zählung der Würmer % Schutz Kontrollen SB-14 Extrakt Tabelle 5b Versuch #250 Fraktion Zählung der Würmer % Schutz Kontrollen SB-14 Extrakt
Für den zweiten Versuch in Beispiel 4, dessen Ergebnisse in Tabelle 4b angegeben sind, wurden Gruppen von Schafen geimpft mit einem ähnlich breiten Bereich an IEF-Fraktionen, wie in dem obigen Beispiel. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5c angegeben. Tabelle 5c Gruppendurchschnitt % Schutz der Adjuvans-Kontrollen Fraktion Zählung der Eier im Faeces Zählung der Würmer Zählung der Eier Adjuvans-Kontrollen Würmer SB-14 Extrakt
Diese Daten stimmen überein mit denen, die bei der Meerschweinchen-Impfung und den Immunitätstestversuchen erhalten wurden, indem sie klar zeigen, daß Antigene in den IEF-Fraktionen 1-10 sind, die Schafen einen wirksamen Schutz bei einer Exposition mit H. contortus liefern können. Aus diesen Daten ist auch klar ersichtlich, daß zusätzliche schützende Komponenten in den anderen IEF-Fraktionen, die in diesem Versuch untersucht wurden, vorhanden sind und diese sind für diese Anmeldung ebenso von Interesse, wie die, die in den IEF-Fraktionen 1-10 enthalten sind.

Beispiel 6

Die Hälfte der ersten 10 TEF-Fraktionen, die in Beispiel 5 verwendet wurden, wurden in Paaren zusammengegeben und verwendet, um Meerschweinchen zu impfen. Die Zählung der Würmer (Tabelle 6) zeigt, daß der Hauptanteil des schützenden Materials in den Fraktionen 5 und 6 des ursprünglichen IEF-Gels enthalten war, das Material enthält mit einem pI von 3,8 bis 4,4. Tabelle 6 Fraktion Zählung der Würmer % Schutz Kontrollen
Als Aliquots der IEF-Fraktionen auf SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt wurden und mit Silber angefärbt wurden, konnte eine Anzahl von Komponenten sichtbar gemacht werden, die in den Fraktionen mit einem pI von 3,8 bis 4,4 angereichert zu sein schienen. Einige davon waren keine scharfen Banden und sind wahrscheinlich Glykoproteine. Das scheinbare Molekulargewicht dieser Verbindungen verglichen mit den BRL-Hochmolekulargewichts-Standards war 100 bis 120 kD, 40 bis 55 kD, ein Cluster von vielleicht 5 Komponenten im Bereich 14 bis 20 kD und ein Material, das von dem Gel nicht auf getrennt wurde, mit einem Molekulargewicht von weniger als 15 kD Außerdem gab es ein scharfes Dublett von Proteinen mit scheinbaren Molekulargewichten von 32 bis 36 kD, die jedoch benachbart zu den weniger schützenden Fraktionen reichlich vorhanden waren und es wurde daher angenommen, daß sie wahrscheinlich nicht Antigene sind, die für die schützende Immunantwort verantwortlich sind.
Die IEF-Fraktionen wurden auch in "Western-Blots" verwendet unter Verwendung von Serum aus Schafen, die in Beispiel 4 geimpft wurden, als Indikatorserum. Es wurde beobachtet, daß alle Komponenten im pI-Bereich von 3,8 bis 4,4 in den silbergefärbten Gelen mit dem Schafserum reagierten und daher eine Immunantwort in Schafen mit dem in diesem Versuch durchgeführten Impfplan erzeugen konnten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß möglicherweise schützende Antigene aus jungen ausgewachsenen H. contortus isoliert werden können, die teilchenförmig sind, mindestens teilweise mit 1 % Zwittergent SB-14 solubilisiert werden können, einen pI im Bereich von 3,8 bis 4,4 haben und ein scheinbares Molekulargewicht von 100 bis 120 kD, 40 bis 55 kD, 14 bis 20 kD oder weniger als 15 kD, abgeschätzt durch SDS-Gelelektrophorese und verglichen mit BRL-Hochmolekulargewichts-Markern, haben können.

Beispiel 7

Die IEF-Fraktionen 5 und 6 wurden gegen 50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 6,6, der 0,6 % CHAPS enthielt, dialysiert und auf einer YM-10-Membran auf 1/6 eingeengt. Aliquots mit 0,2 ml wurden durch HPLC-Gelfiltration unter Verwendung einer Bio-Sil TSK-400-Säule (30 x 0,75 mm) (Bio-Rad) im gleichen Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min aufgetrennt und die Absorption des Eluens wurde bei 280 nm überwacht. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf Basis des Absorptionsprofils des Eluens gepoolt. Die Fraktionen, die in dem letzten eluierenden Peak vorhanden waren, wurden gepoolt und wieder auf einer TSK-SW 3000 G-Gelfiltrationssäule (Toyo Soda) chromatographiert unter Verwendung der oben angegebenen Bedingungen. Insgesamt 6 Pools wurden verwendet, um Meerschweinchen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zu impfen; jeder Pool enthielt das Äquivalent von 4 ml IEF 5 und 6. Die Zählung der Würmer (Tabelle 7) zeigt, daß der Hauptanteil des schützenden Antigens/der schützenden Antigene in GF 5 und GF 6 enthalten ist, was die Antigene mit einem ungefähren Molekulargewichtsbereich von < 10 kD bis 60 kD einschließt. Tabelle 7 Fraktion Molekulargewichtsbereich (kD) Zählung der Würmer % Schutz Kontrollen
Als Aliquots der Gelfiltrationspools elektrophoretisch aufgetrennt wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen und mit Silber angefärbt wurden, konnte eine Anzahl von Komponenten sichtbar gemacht werden, die mit GF 5 und GF 6 (Figur 1) angereichert zu sein schienen. Das scheinbare Molekulargewicht dieser Komponenten verglichen mit Bio-Rad Niedrigmolekulargewicht-Standards war 45 kD, wahrscheinlich vier nicht genau bestimmbare Komponenten im Bereich 25 bis 30 kD und vielleicht 5 Proteine im Bereich 14 bis 20 kD. Es gibt aber noch andere Komponenten, die auf diesem Gel nicht getrennt werden und mit der Pufferfront mitwandern.
Die Komponenten in GF 5 und GF 6 konnten mit verschiedenen Mitteln höher aufgelöst werden. Die in den Beispielen 8 und 9 beschriebenen Methoden dienen nur der Erläuterung.

Beispiel 8

6 ml IEF 5 und 6 wurden mit einem gleichen Volumen 100 mM Tris/250 mM Natriumchlorid, pH 7 verdünnt und mit 0,5 ml Linsenlectin-Sepharose 48 (Pharmacia) 16 Stunden bei 4ºC gerührt. Das Sepharose-Konjugat wurde durch Zentrifugation eine Minute mit 3000 x g entfernt, viermal mit 50 mM Tris- Kochsalzpuffer, pH 71 der 0,1 % Zwittergent SB-14 enthielt (TSZ-Puffer) gewaschen, dann mit dem gleichen Puffer, dem 0,3 M Methyl-α-D-mannopyranosid zugegeben worden waren, eluiert. Die Hälfte der an das Linsen-Lectin gebundenen Fraktion wurde mit 0,5 ml Helix pomatia-Lectin-Sepharose 6MB (Pharmacia) 16 Stunden bei 4ºC gerührt, das Konjugat viermal in TSZ-Puffer gewaschen und dann mit TSZ-Puffer, der 0,2 M N- Acetyl-D-galactosamin enthielt, eluiert. Aliquots aller Fraktionen wurden dreifach auf SDS-Polyacrylamidgelen laufen gelassen, 1) vor dem Färben mit Silber (Figur 2) oder dem Western-Transfer und 2) vor dem Färben mit Concanavalin A- Meerrettich-Peroxidase-(HRP)-Konjugat (Sigma) (Figur 3) oder 3) vor dem Färben mit Helix pomatia-Lectin-HRP (Sigma) (Figur 4). Das mit Silber gefärbte Gel zeigt überwiegend ein Protein mit 45 kD, das sowohl an Linsen- als auch Helix pomatia- Lectin bindet; letzteres bindet nicht einen kleineren Anteil an verunreinigenden Proteine. Diese Beobachtungen werden bestätigt durch zwei Lectin-Blots (Concanavalin A hat die gleiche Zuckerspezifität wie Linsen-Lectin).
Meerschweinchen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Proben der Fraktionen von IEF 5 und 6 nach der Fraktionierung durch Lectin-Affinitäts-Chromatographie, wie oben ausgeführt, geimpft. Die Zählung der Würmer beim Schlachten (Tabelle 8) zeigte, daß der Schutz von der lectingebundenen Fraktion geliefert wurde. Andere Fraktionen lieferten in diesem Versuch auch etwas Schutz. Dies könnte auf der unvollständigen Entfernung der 45 kD-Komponente aus der IEF-Fraktion 5 und 6 durch die Lectine beruhen, da das Antigen in verschiedenen Formen mit verschiedenen Glykosilierungsgraden vorliegen kann (obwohl wenig Material mit diesem Molekulargewicht auf den SDS-Gelprofilen der von Helix pomatia-Lectin nicht gebundenen Fraktion zu sehen ist). Der mit den anderen Fraktionen erhaltene Schutz könnte auch auf der Gegenwart anderer schützender Antigene in diesen Fraktionen beruhen. Diese anderen Antigene sind hier von Interesse. Tabelle 8 Fraktion Zählung der Würmer % Schutz Kontrollen Linsen-Lectin gebunden (LL&spplus; nicht an Linsen-Lectin gebunden (LL&supmin;) LL&spplus;, an Helix pomatia-Lectin gebunden LL&spplus;, nicht an Helix pomatia-Lectin gebunden

Beispiel 9

IEF 5 und 6 wurden gegen 20 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7,5 dialysiert und dann unter Verwendung einer YM-10-Membran 10fach eingeengt. Aliquots mit 0,3 ml wurden durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf eine Konzentration von 0,1 % angesäuert und dann zentrifugiert, um Niederschläge zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine PLRP-S-Reverse-Phase- HPLC-Säule (Polymer Laboratories), die mit 30 % Acetonitril/0,1 % TFA äquilibriert war, injiziert und mit einem linearen Gradienten über 30 Minuten entwickelt, bis 60 % Acetonitril/0,1 % TFA erreicht war. Die Absorption des Eluens wurde bei 220 nm überwacht (Figur 5) und die Fraktionen mit dem Gradienten gesammelt. Die ausgewählten Fraktionen wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen laufen gelassen und mit Silber angefärbt (Figur 6), um zu zeigen, daß der größte Teil der in dem Ausgangsmaterial vorhandenen Proteine gewonnen worden war und hoch aufgelöst war.
Diese Daten zeigen, daß die Antigene in der schützenden Fraktion gut mit Reverse-Phase-HPLC aufgetrennt werden konnten, aber weitere Untersuchungen zeigten, daß das Material Meerschweinchen nach der Impfung nicht mehr schützte. Wahrscheinlich denaturierte die Behandlung der Antigen-Fraktion mit den für die Reverse-Phase-HPLC verwendeten Lösungsmitteln die Antigene, so daß ihre Struktur der der nativen Gene nicht mehr ähnelte.

Beispiel 10

Um das Detergens zu entfernen, die Probe einzuengen, Salze zu entfernen und das Antigen in einen Puffer auszutauschen, der für eine Aminosäuresequenz-Analyse geeignet war, wurde das an Linsen-Lectin gebundene, an Helix pomatia gebundene Antigen mit ungefähr 45 kD mit Reverse-Phase-HPLC auf einer Polypore- Phenyl-RP (30 x 2,1 mm) Säule fraktioniert und 20 Minuten lang mit einem Gradienten von 0,1 % TFA/10 % Acetonitril bis 0,07 % TFA/70 % Acetonitril (Fließgeschwindigkeit 200 µl/min) aufgetrennt. Das 45 kD Antigen wurde zur Mitte des Gradienten hin als Hauptpeak mit einer kleinen Schulter eluiert. Die zwei Fraktionen wurden getrennt gesammelt, schienen aber aus dem gleichen Polypeptid zusammengesetzt zu sein, auf Basis der erhaltenen N-terminalen Aminosäuresequenzdaten.
Die N-terminale Aminosäuresequenz der Fraktionen wurde durch Gasphasen-Sequenzierung an einem Aminosäuresequenziergerät von Applied Biosystems, Modell 470A bestimmt. Die folgende Sequenz wurde erhalten (SEQ ID Nr. 1):
Außerdem wurden Proben des 45 kD Antigens mit Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgelen gereinigt, auf Nitrocellulose übertragen, mit Ponceau S angefärbt, die Bereiche der Nitrocellulose, die das 45 kD Antigen enthielten, wurden ausgeschnitten und mit Endoproteinase Lys-C inkubiert. Peptide, die bei dem Verdau entstanden, wurden mit Reverse-Phase-HPLC abgetrennt und wie oben sequenziert. Die folgenden Sequenzen wurden erhalten:
X bedeutet, daß der speziellen Position keine Aminosäure zugeschrieben werden konnte. Reste in Klammern werden mit weniger Zuverlässigkeit als andere Reste zugeordnet. In einigen Fällen war es nicht möglich, zwischen zwei oder drei Resten in einem speziellen Zyklus zu unterscheiden, wobei sie in diesem Fall untereinander aufgeführt sind. Es wird angenommen, daß der erste Rest in jedem Peptid ein Lysin (K) ist, auf Basis der Spezifität der Endoproteinase Lys-C.
Diese Sequenzen sind geeignet, um Oligonukleotid-Sequenzen zu entwerfen, die geeignet wären, um als Hybridisierungssonden verwendet zu werden, um das Gen zu identifizieren, das das Antigen kodiert, in Genbibliotheken, die erzeugt werden unter Verwendung von H. contortus-RNA (komplementäre DNA-Bibliotheken) oder -DNA (Genom-Bibliotheken) oder als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Beispiel 11

Molekulare Klonierung des 45 kD Gens

a) Oligonukleotidsynthese

Aus der in Beispiel 10 beschriebenen Aminosäuresequenz wurden Oligonukleotide hergestellt, die verwendet werden konnten, um cDNA- und Genom-Bibliotheken zu screenen, um das Gen/die Gene zu identifizieren, die das 45 kD Antigen kodieren. Außerdem konnte das Oligonukleotid verwendet werden zusammen mit Oligo-(dT) bei der PCR (Saiki et al., 1988) um die DNA, die das 45 kD Protein kodiert, zu amplifizieren.
Die folgenden mehrfach degenerierten Primer wurden entworfen und synthetisiert an einem DNA-Syntheseautomaten Applied Biosystem Modell 380A. Weitere Nudeotide, zusätzlich zu denen die notwendig waren, um die erforderliche Aminosäuresequenz zu kodieren, wurden an den 5'- Enden der Oligonukleotide eingeführt. Diese Sequenzen kodieren Stellen für die Restriktionsenzyme Eco RI und Sma I, um das Klonieren von mit PCR amplifizierter DNA in geeignete Vektoren zu fördern. Ein Oligo-(dT)-Primer zur Verwendung in der PCR wurde auch synthetisiert. Der Primer enthielt auch EcoRI- und SmaI-Restriktionsstellen.
A112/302 ist identisch mit A112/301 außer dem sechsten Codon vom 5'-Ende. Dieses wurde verändert von AAC/T zu T/AC/GG/A/T/C, um dem gemischten Signal zu genügen, das in der aminoterminalen Sequenz gesehen wurde, nämlich Asparagin (A112/301) oder Serin (A112/302).

b) RNA-Isolierung und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek

Die gesamte RNA wurde aus 1 g (Naßgewicht) H. contortus isoliert unter Verwendung eines RNA-Extraktionskits, das von Pharmacia erhalten wurde (Cat # XY-016-00-01). Larven wurden erhalten aus dem Labmagen von Schafen 15 Tage nach dem Befall mit ausgeschlüpften Parasiten der Stufe L3, und bei -70ºC nach dem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Um die RNA zu extrahieren, wurden die gefrorenen Würmer unter flüssigem Stickstoff pulverisiert, zu 7 ml Extraktionslösung (die eine gepufferte wäßrige Lösung ist, die Guanidin-Thiocyanat, N-Laurylsarcosin und EDTA enthält; Dichte bei 25ºC = 1,15 g/ml) zugegeben und dann über 2 x 1,25 ml Kissen aus CsTFA (gepufferte wäßrige Lösung, die CsTFA enthält; Dichte bei 25ºC 1,51 g/ml) in 13 x 51 mm Polyallomerröhrchen geschichtet. Die Gradienten wurden mit 31.000 Upm 16 Stunden lang bei 15ºC zentrifugiert unter Verwendung eines SW 50.1 Rotors in einer L8-70 Beckman- Ultrazentrifuge. Nach der Zentrifugation wurden die RNA- Pellets in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA gelöst) und wieder aus Ethanol bei -20ºC ausgefällt. Die sedimentierte RNA wurde dann wiederum in TE gelöst und weiter gereinigt durch Zentrifugation durch eine Oligo- (dT)-Cellulosesäule (Pharmacia MRNA Reinigungskit Cat, # XY-012-00-02), wie vom Hersteller beschrieben.
Die entstehende gereinigte Poly(A)&spplus;RNA wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken zu konstruieren unter Verwendung eines Pharmacia cDNA-Synthesekits (Cat # XY-003-00-03). Kurz wurde polyadenylierte RNA, die aus 325 µg Gesamt-RNA gereinigt wurde, mit Reverser Transcriptase aus Moloney Mäuseleukämie-Virus in Gegenwart von Oligo-(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; versetzt. Die Synthese des zweiten Strangs wurde erreicht unter Verwendung von RNase H und E. coli DNA-Polymerase I. Die doppelsträngige cDNA wurde mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase behandelt und mit EcoRI/Not I Adaptoren ligiert. Die cDNA wurde dann mit T4-Polynucleotidkinase behandelt, um sie zu phosphorylieren und in mit EcoRI verdaute, dephosphorylierte lambda gt 10 Arme ligiert und in vitro in infektiöse Bakteriophagenteilchen verpackt (Protoclone lambda gt 10 System und Verpackungssystem, Promega), wie vom Lieferanten beschrieben. Die verpackte cDNA wurde in E. coli C600 Hfl transfiziert und auf Luria-Agarplatten plattiert unter Verwendung von Luria-top-Agar, der 10 mM MgSO&sub4; enthielt. Insgesamt 6 x 10&sup7; p.f.u. wurden erhalten, von denen 98 % Rekombinanten waren. Die durchschnittliche Insertgröße war 2,0 kbp.

(c) Herstellung von DNA-Sonden, um rekombinante Bibliotheken zu screenen

Eine 45 kD antigenspezifische doppelsträngige DNA-Sonde wurde hergestellt unter Verwendung von POR. Das verwendete Verfahren basierte auf dem von Saiki et al. (1985) beschriebenen und es wurde eine klonierte Form von Tag- Polymerase (Perkin Elmer Cetus) verwendet. 2 µg Gesamt- RNA wurden mit 100 ng Oligo-(dT)-PCR-Primer in 6 µl Wasser hybridisiert, indem 5 Minuten auf 70 ºC erhitzt wurde und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde. Das hybridisierte RNA-Oligo-(dT) wurde dann mit 200 Einheiten Reverser Transkriptase (BRL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Spermidin, 10 mM DTT, einer Einheit RNasin eine Stunde lang bei 37ºC in einem Endvolumen von 25 µl inkubiert. Eine ähnliche Reaktion, bei der die Reverse Transcriptase weggelassen wurde, diente als negative Kontrolle für die PCR-Reaktion.
Die PCR wurde an einer cDNA, die wie oben beschrieben hergestellt worden war, durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt einsträngige cDNA, die aus 1 µg Gesamt- RNA synthetisiert worden war jeweils 1 µM A112/301 oder A112/302 und 1 µM Oligo-(dT)-PCR-Primer, jeweils 200 µM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 2 mM MgCl&sub2;, 0,01 mM Gelatine, 0,01 % Triton X-100 und 2 Einheiten Taq- Polymerase in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Amplifikation wurde über 25 Zyklen durchgeführt, wobei jeder in einer Denaturierung eine Minute bei 94ºC, einer Hybridisierung 2 Minuten bei 40ºC und einer Verlängerung 3 Minuten bei 72ºC bestand.
Proben jeder PCR-Reaktion wurden an einem 0,8 % Agarosegel am Ende der Reaktion analysiert.
Bei der Reaktion, die den Primer A112/301 und Oligo-(dT) enthielt, wurde eine einzige Bande von ungefähr 650 bp beobachtet. Mehrere andere Banden waren vorhanden, aber diese waren auch zu sehen bei der Reaktion, in der nur Oligo-(dT) verwendet wurde. Die Bande mit ungefähr 650 bp wurde nicht gesehen, wenn Primer A112/302 verwendet wurde. Keine Banden wurden gesehen bei der negativen Kontrollreaktion, bei der die Reverse Transkriptase weggelassen worden war.
Das PCR-Produkt mit ungefähr 650 bp wurde mit EcoRI verdaut, mit Elektrophorese auf einem Agarosegel gereinigt, in pBluescript SK- (Stratagene) ligiert unter Verwendung üblicher Techniken (Maniatis et al., 1982) und sequenziert unter Verwendung des Dideoxy-Kettenabbruchverfahrens (Amersham Microtitre Plate Sequencing Kit, Cat # RPN.1590). Die Sequenzanalyse der Enden des Klons bestätigte, daß dieser die Sequenz des Primers A112/301 am 5'-Ende und eine Poly(A)-Verlängerung am 3'-Ende enthielt. Weiterhin entsprachen 14 von den 18 Nudeotiden direkt stromabwärts des 3'-Endes der Region, die dem Primer A112/301 entsprach, denen, die aus der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins vorhergesagt wurden. Dies ist eine Homologie von 86 % auf Aminosäurelevel (18 Aminosäuren von 21 aus der N-terminalen Sequenzierung). Die Unterschiede zwischen der aus dem gereinigten Antigen erhaltenen Aminosäuresequenz und der aus der DNA-Sequenz des PCR-Klons vorhergesagten könnten auf Ungenauigkeiten in der aminoterminalen Sequenzanalyse des gereinigten Proteins und/oder Irrtümern beim PCR-Einbau beruhen, obwohl dies eine unwahrscheinliche Erklärung ist bei der großen Anzahl von Unterschieden. Der PCR-Klon wurde gezüchtet, die DNA isoliert, mit EcoRI verdaut und das Insert zur Verwendung als Hybridisierungssonde gereinigt, um die cDNA-Bibliothek die in (b) dieses Beispiels beschrieben wurde, zu screenen.
Ungefähr 10&sup5; p.f.u. wurden durch Hybridisierung der Nitrocellulosefilter-Replikas der Bibliothek bei 55ºC in einer Lösung, die 2 x 10&sup5; cpm/ml Sonde, 5 x SSPE, 5 x Denhardt's Lösung, 0,5 % (G/V) SDS und 20 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA enthielt, gescreent. Nach dem Waschen der Filter bei 60ºC in 0,5 x SSC, 0,1 % SDS und Autoradiographie wurden 16 positive Plaques identifiziert. Von diesen wurden 8 herausgenommen für die anschließende Reinigung und Analyse. Die EcoRI-Inserts wurden aus der gereinigten Phagen-DNA isoliert und in pBluescript SK- zur weiteren Analyse subkloniert. Die Sequenz eines dieser Klone, pBTA879 ist in Figur 7 gezeigt.
Es gibt nur einen einzigen langen offenen Leserahmen von 1.336 Nudeotiden nach einem Translations-Stopcodon, TGA. Der offene Leserahmen dieses Klons erstreckt sich vom 5'-Ende des Klons. Es gibt kein Methionin-Anfangscodon, das in diesem Bereich der Sequenz vorhanden ist, so daß dieser Klon wahrscheinlich nicht die vollständige kodierende Region widerspiegelt.
Eine genaue Untersuchung der Aminosäuresequenz, die aus der cDNA-Sequenz stammt (Figur 7) zeigt einen Homologiebereich mit der aminoterminalen Sequenz des gereinigten 45 kD Proteins, beginnend bei Nucleotid 65 vom 5'-Ende des cDNA- Klons, wo 11 der vorhergesagten Aminosäuren über die folgenden 16 Reste auftreten. Außerdem gibt es einen zweiten Homologiebereich mit der N-terminalen Sequenz, beginnend bei Nucleotid 773 der Sequenz. Von 19 Aminosäuren sind 14 Reste identisch mit denen, die bei der Proteinsequenz bestimmt wurden. Der Homologiegrad war 73,7 % auf Aminosäureebene. Es scheint, daß es sich wiederholende Domänen innerhalb des Moleküls gibt. Beide Homologieregionen sind in Figur 7 durch doppelte Unterstreichung gezeigt.
Weitere Regionen innerhalb der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die eine Homologie mit den Endoproteinase-Lys-C- Peptid-Sequenzen, die von dem gereinigten Protein stammen, zeigen, sind in Figur 7 gezeigt (durch einfache Unterstreichung). Diese Regionen liegen alle innerhalb der carboxyterminalen Hälfte des Moleküls; alle in dem Teil, der zur Aminosäure 253 carboxyterminal ist.
Außerdem gibt es eine Region, die direkt vor der Sequenz liegt, die mit Nucleotid 773 beginnt, die den Peptidsequenzen gleicht, von denen hypothetisch angenommen wurde, daß sie äußerst empfänglich sind für einen Proteinase-Verdau.
Die Aminosäuresequenz N-terminal zu dem Beginn bei Nucleotid 65 ist sehr hydrophob und enthält Aminosäuren ähnlich denen, die von Signalpeptidasen erkannt werden.
Die wahrscheinlichste Erklärung dieser Analysen ist, daß der cDNA-Klon, der in Figur 7 beschrieben wird, ein Glycoprotein kodiert, das mit dem nativen Glycoprotein, das aus H. contortus isoliert wurde, verwandt, jedoch nicht identisch ist. Der cDNA-Klon kodiert nicht die volle Länge des Proteins; mindestens ein komplettes Signalpeptid kommt vor dem in Figur 7 gezeigten und es ist möglich, daß weitere Aminosäuren auch in dem nativen Molekül voller Länge vorhanden sind.
Um einen cDNA-Klon zu isolieren, der das native 45 kD Antigen in voller Länge kodiert, wurden cDNA-Bibliotheken mit dem aus pBTA879 isolierten Fragment gescreent. Die in (b) dieses Beispiels beschriebene cDNA-Bibliothek wurde wiederum gescreent unter Verwendung der EcoRI-Bande von pBTA879 als Hybridisierungssonde. Ungefähr 10&sup5; p.f.u. wurden gescreent unter Verwendung der gleichen Bedingungen, wie vorher ausgeführt. Nach dem Waschen der Filter bei 60ºC in 0,5 x SSC, 0,1 % SDS und Autoradiographie wurden 15 positive Plaques identifiziert.
Von diesen wurden 11 EcoRI-Inserts gereinigt und in pBluescript SK- zur weiteren Analyse subkloniert. Die Sequenz eines dieser Klone, pBTA963 ist in Figur 8 gezeigt. Diese enthält einen offenen Leserahmen von 1320 Nudeotiden gefolgt von einem Translations-Stopcodon, TAA.
Wiederum enthält Dieser Klon kein Anfangsmethionin, jedoch waren 16 von 18 Aminosäuren, die von der 5'-Sequenz dieses Klons kodiert werden, identisch mit der ursprünglichen N-terminalen Aminosäuresequenz. Dieser Homologiebereich beginnt bei Base 50 oder Aminosäure 12 und eine zweite Wiederholung findet sich beginnend bei Base 722. Beide Regionen sind durch doppelte Unterstreichung gezeigt. Die anderen Peptidsequenzen können auch in der translatierten Aminosäuresequenz von pBTA963 lokalisiert werder. Diese haben eine viel größere Homologie mit den Peptidsequenzen, als mit pBTA879. In den meisten Fällen ist diese Homologie 100 %.
Die anderen charakteristischen Merkmale der zwei Proteinsequenzen sind sehr ähnlich. Beide enthalten ein hydrophobes Leader-Sequenz-Segment, beide enthalten die Peptidaseempfindliche Region zur Mitte des Moleküls hin und beide haben ein ähnliches Molekulargewicht und eine ähnliche Gesamtladung. Jedoch haben beide nur ungefähr 54 % Homologie über die Gesamt-Aminosäuresequenz, obwohl die Homologie an einigen Stellen viel größer ist, insbesondere an solchen, aus denen die Peptidsequenzen stammen.
In einem Versuch, sicherzustellen, daß das klonierte Gen das gereinigte Antigen kodiert, wurde das EcoRI-Fragment aus dem ursprünglichen PCR-Klon isoliert und in einen durch IPTG induzierbaren bakteriellen Expressionsvektor insertiert. Das Genprodukt wurde isoliert, gereinigt und verwendet, um Schafe zu impfen. Die aus diesen Schafen erhaltenen Seren wurden verwendet, um Western-Blots des gereinigten 45 kD Glycoproteins und Homogenisate von H. contortus zu sondieren. In beiden Fällen wurde gefunden, daß ein Antigen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 45 kD in den IEF-Fraktionen 1-10 spezifisch mit den Antiseren reagierte. Antikörper, die gegen ein 24 Aminosäuren langes Peptid mit einer Sequenz, die aus der DNA-Sequenz vorhergesagt wurde, erzeugt wurden, reagierten auch mit dem 45 kD Antigen in den IEF-Fraktionen 1 bis 10.
Eine genaue Untersuchung der Western-Blots der gesamten Parasiten-Homogenisate und jeder breiten IEF-Fraktion, die aus dem Serum von Schafen, die mit dem rekombinanten Antigen geimpft worden waren, aufgetrennt wurden, zeigt, daß in der Tat Parasiten-Komponenten mit höherem Molekulargewicht vorhanden sind, die spezifisch mit dem Serum nach der Impfung reagieren. Diese Komponenten mit höherem Molekulargewicht sind wahrscheinlich Produkte der gleichen Genfamilie, wie das isolierte Antigen. Sie sind in den IEF-Fraktionen 2, 3 und 4 angeordnet und scheinen über die isoelektrisch fokussierenden Gele verstreut zu sein. Dieses Phänomen, daß keine scharfe Bande bei Fraktionierung durch IEF fokussiert wird, ist charakteristisch für Glykoproteine; die variablen Kohlenhydratreste führen bei den Molekülen eine Ladungsheterogenität ein und eine Heterogenität des pI's der Population von Molekülen.
Es scheint daher, daß das native 45 kD Antigen, das aus den Parasiten isoliert wurde, ein Glied einer Klasse von Proteinen ist, die ähnliche Aminosäuresequenzen in Anteilen von Molekülen haben. Dies wird weiter gestützt durch die Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA von H. contortus unter Verwendung beider EcoRI-Inserts (Figur 9). Diese zeigen, daß pBTA963 mit vielen Banden mit verschiedener Intensität hybridisiert. Die Banden bei 1480, 890 und 740 Basenpaaren sind die am stärksten hybridisierenden. Wenn der gleiche Blot mit pBTA879 gescreent wird, erscheint jedoch eine Bande bei 1350 Basenpaaren, wobei die Banden bei 890 und 740 noch schwach mit dieser Sonde binden.
Bei den Western-Blots scheint es, daß einige Mitglieder der Proteinfamihe ein Molekulargewicht von mehr als 65 kD haben könnten. Es ist auch möglich, daß der dem geimpften Schaf und den geimpften Meerschweinchen durch die IEF-Fraktion 2, 3 und 4 in den Beispielen 4 und 5 dieser Beschreibung vermittelte Schutz auf der Gegenwart der Formen mit höherem Molekulargewicht des hier beschriebenen schützenden Antigens beruht.
Es konnten keine DNA- oder Proteinsequenzen mit einer bedeutenden Homologie mit der dieses Klons gefunden werden nach Durchsuchen der Genbank-, EMBL- oder PIR-Computerdaten-Basen.

Beispiel 12

Homologe Gene in Bezug auf das schützende Antigen sind in anderen Arten von parasitischen Nematoden vorhanden.
Die DNA-Hybridisierung (oder Southern-Blot-Analyse) wurde durchgeführt unter Verwendung von Standardtechniken (Maniatis et al., 1982), um zu bestimmen, ob andere Arten von parasitischen Nematoden Gene haben, die mit denen, die das schützende Antigen von H. contortus kodieren, "homolog" sind. Das in Beispiel 11 (Figur 8) beschriebene EcoRI-Insert des cDNA-Klons pBTA963 wurde als Hybridisierungssonde für DNA, die aus einer Anzahl anderer Arten von parasitischen Nematoden isoliert wurden, verwendet, Die Probe hybridisierte sowohl, wie erwartet, stark mit verschiedenen Restriktionsfragmenten der DNA, die aus der homologen Art, d.h. H. contortus, isoliert worden war, als auch mit spezifischen Restriktionsfragmenten von DNA, die aus Ostertagia circumcincta, Ostertaqia ostertagi und Trichostrongylus colubriformis isoliert worden war. Die Blots wurden mit einer Stringens gewaschen, die auf einen Homologiegrad von etwa 70 % deutete (Figur 10).
Dies zeigt klar, daß es Gene gibt, die eng mit denen verwandt sind, die das schützende Antigen in diesen anderen Arten von parasitischen Nematoden kodieren und extrapoliert in allen Arten von parasitischen Nematoden. Diese Gene könnten unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken isoliert werden und rekombinante Organismen könnten erzeugt werden, die diese verwandten oder homologen Antigene aus anderen Arten von parasitischen Nematoden synthetisieren. Die vorliegenden Erfinder nehmen an daß die verwandten Antigene als wirksame Immunogene dienen, um den geimpften Tieren Schutz gegen eine Infektion durch andere Arten von Parasiten zu liefern. Außerdem könnten verwandte Antigene, die aus einem breiten Bereich von parasitischen Nematoden isoliert wurden, isoliert werden und wirksame schützende Immunogene liefern, um Tiere vor dem Befall mit einer Vielzahl solcher Nematoden zu schützen.
Es wurde bereits gezeigt, daß diese Lösung erfolgreich sein kann (Internationale Anmeldung Nr. PCT/AU88/00239). Diese Patentanmeldung beschreibt, wie ein Antigen aus einem Homogenisat von T. colubriformis gereinigt wurde aufgrund der Fähigkeit dieses Antigens, Meerschweinchen einen Schutz gegen Infektion mit T. colubriformis zu liefern. Die Information über die Aminosäuresequenz wurde für dieses Antigen bestimmt, was es ermöglichte, das Gen, das dieses Antigen kodierte, aus rekombinanten DNA-Bibliotheken zu isolieren. Die DNA, die das T. colubriformis-Gen kodiert, wurde dann als Hybridisierungssonde verwendet, um rekombinante Organismen zu identifizieren, die das "homologe" Gen aus H. contortus kodieren. Rekombinante Organismen wurden dann konstruiert, die das H. contortus-Antigen synthetisierten, das dann zur Impfung und für Immunitätstestversuche bei Schafen und Meerschweinchen verwendet wurde. Das rekombinante Antigen aus H. contortus lieferte geimpften Schafen einen Schutz gegen einen Befall mit H. contortus und lieferte Meerschweinchen einen Schutz gegen eine Infektion mit T. colubriformis.
Dies zeigt, daß es möglich ist, bei der in den obigen Hybridisierungsversuchen gezeigten DNA-Sequenz-Homologie, die das schützende Antigen einer Art von parasitischen Nematoden kodierende klonierte DNA-Sequenz zu verwenden, um Klone zu identifizieren, die die homologen Genprodukte aus anderen Arten von parasitischen Nematoden kodieren, solche rekombinanten Organismen zu bearbeiten, damit sie das homologe Antigen exprimieren und dieses in einem Impfstoff zu verwenden, um einen Schutz gegen andere Arten von parasitischen Nematoden zu liefern. Es wird angenommen, daß die hier gezeigten Ergebnisse so extrapoliert werden können, daß dies mit den DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung erfolgen kann.
Es versteht sich, daß die Nucleotidsequenz der homologen Gene und die Aminosäuresequenz der homologen Antigene nicht identisch sein müssen mit denen der ersten Zielart, aber um mindestens 50 % über den Verlauf von mindestens 60 Basenpaaren verwandt sein müssen und bevorzugt wäre die Verwandtschaft über 70 % oder mehr dieses gleichen Bereichs, wobei die Homologie der Aminosäuren mindestens 70 % über 20 Aminosäuren ist. In den meisten Fällen wäre dieser Homologiegrad ausreichend, um eine unzweideutige Identifizierung der Verwandtschaft zweier Gene oder Proteine zu ermöglichen.

Beispiel 13

Expression des 45 kD Antigens in E. coli

Eine Anzahl von Systemen könnte verwendet werden, um das rekombinante 45 kD Antigen zu exprimieren, z.B. Säugetierzellen, Virus infizierte Insektenzellen, Hefen oder Bakterien. Als Beispiel wurde das Gen in E. coli exprimiert. Das vollständige cDNA-Fragment aus pBTA963 wurde isoliert als ein Bam HI/Hind III-Fragment mit 1.386 Basenpaaren und wurde in den E. coli Expressionsvektor pBTA954 subkloniert. pBTA954 ist ein Vektor auf pUR-Basis, der den lac-Promotor, die inituerenden Aminosäuren für das β-Galactosidasegen und mehrfache Klonierungsstellen enthält. Wenn die Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert wurde, lieferte dies ein Fusionsprotein mit 11 N-terminalen Aminosäuren, die von dem Vektor kodiert werden, fusioniert mit dem 45 kD Protein. Das scheinbare Molekulargewicht des Fusionsproteins war ungefähr 61 kD (Figur 11a). Das Fusionsprotein wurde von Kaninchenserum das gegen ein Peptid, das dem trunkierten N-Terminus des 45 kD Proteins (Figur 11b) entsprach, erzeugt worden war, erkannt. Von diesem Serum wurde vorher gezeigt, daß es das Hauptprotein in dem nativen Extrakt, IEF-Fraktion 1, erkennt.
Das Fusionsprotein konnte mit Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden, mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden und verwendet werden, um den Wirt, z.B. ein Schaf zu impfen und Schutz vor einer Parasiten-Infektion zu verleihen.

Beispiel 14

Immunologische Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern gegen das 45 kD Antigen und Dirofilaria immitis-Proteinen Kaninchen wurden mit einem synthetischen Peptid geimpft, das von der Sequenz des N-terminalen Bereichs des 45 kD Antigens stammte. Antiseren dieser Kaninchen wurden verwendet, um einen Western-Blot von Extrakten sowohl aus ausgewachsenen D. immitis als auch ausgewachsenen H. contortus zu sondieren. Nach Entwicklung mit einem zweiten Antikörper, der mit einer alkalischen Phosphatase konjugiert war, wurde von zwei Antigenen jeder Art gezeigt, daß sie reaktiv waren. Die Komponenten mit 45 kD und 27 kD wurden in dem H. contortus-Extrakt nachgewiesen und mit 52 und 32 kD in dem D. immitis-Extrakt (Figur 12). Dieses Ergebnis stützt andere Beobachtungen (Beispiel 12) unter Verwendung von DNA-Hybridisierungs-Techniken, daß Proteine, die mit dem 45 kD Antigen verwandt sind, vorhanden sind und von D. immitis exprimiert werden.

Beispiel 15

Herstellung von kommerziellen Impfstoffen in größerem Maßstab

Die Herstellungs- und Reinigungstechniken, die bisher beschrieben wurden, wurden im Labormaßstab durchgeführt. Für die kommerzielle Produktion von Antigenen der Erfindung ist eine Fermentation der transformierten Wirte in großem Maßstab erforderlich.
Die Fermentationen in großem Maßstab werden mit Standardtechniken durchgeführt, wobei die jeweiligen Techniken so ausgewählt werden, daß sie für den transformierten Wirt, der zur Herstellung des Antigens verwendet wird, geeignet sind.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Stamm BTA 2033, der E. coli JM101 ist, das das Plasmid pBTA879 enthält, wurde hinterlegt bei dem Analytischen Labor der Australischen Regierung, Suakin Street 1, Pymble 2073, New South Wales, Australien nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags vom 29. Januar 1992 mit der Hinterlegungsnummer N92/4387.
Der Genotyp von E. coli JM101 ist: (pro-lac) F' lacIq M15, traD1, lambda&supmin;. pBTA879 ist pBLUESCRIPT-SK-minus (Stratagene, San Diego, CA, USA), das ein EcoRI-Insert mit 1.400 Basenpaaren enthält, das einen Teil eines antigenen Proteins aus den gastromtestinalen Nematoden Haemonchus contortus kodiert.
Stamm BTA 2125, der ein E. coli SURE-Stamm ist, der das Plasmid pBTA963 enthält, wurde hinterlegt bei den Analytischen Laboratorien der Australischen Regierung, Suakin Street 1, Pymble 2073, New South Wales, Australien nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 29. Januar 1992 mit der Hinterlegungsnummer N92/4388.
Der Genotyp von E. coli SURE ist BTA2125: E. coli SURETM- Stamm (Strategene, San Diego, CA, USA), Genotyp: mcrA, Δ(mrr, hsd RMS mcrBC), endA1, supE44, thi-1, lambda&supmin;, gyrA96, relA1, lac, recB, recJ, sbcC, umuC::Tnr(kan ), uvrC, {F' proAB, lacIqZΔM15, Tn10(tet )}.
Plasmid pBTA963 ist pBLUESCRIPT-SK-minus (Stragagene, San Diego, CA, USA), enthaltend ein EcoRI-Insert mit 1386 Basenpaaren, das einen Teil eines antigenen Proteins aus dem gastrointestinalen Nematoden Haemonchus contortus kodiert.

Industrielle Anwendungen

Die vorliegende Erfindung ist von Nutzen, um Antigene, Impfstoffe und Antikörper bereitzustellen, die geeignet sind, um Tiere gegen eine Infektion durch parasitische Nematoden zu schützen.

Literaturstellen

T. Maniatis, EF Fritsch und J. Sambrook (Herausgeber) (1982) Molecular doning: A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor.
RK Saiki, DH Gelfand, Stoffels, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis und HA Erlich (1988): Primer directed amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase Science 239: 487-491.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Informationen:

(i) Anmelder:
(A) Name: Biotech Australia Pty. Limited
(B) Straße: 28 Barcoo Street
(C) Stadt: Roseville
(D) Staat: New South Wales
(E) Land: Australien
(F) Postleitzahl: NSW 2069
(A) Name: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation
(B) Straße: Limestone Avenue
(C) Stadt: Campbell
(E) Land: Australien
(F) Postleitzahl: ACT 2600
(ii) Titel der Erfindung: Nematoden-Impfstoff
(iii) Anzahl der Sequenzen: 12
(iv) Computer-lesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy-Disk
(B) Computer: IBM-PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patentln Release #l.0, Version # 1.25 (EPO)
(v) Aktuelle Anmeldungsdaten:
Anmeldungsnummer: EP 92 904 027.7

(2) Information für SEQ ID Nr. 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung "kann Phe oder Tyr sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 3
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann His sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 5
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Gly, Asp oder Pro sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 6
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Ser oder Asn sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 19
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Val oder Ser sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 20
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asp, Gly oder Pro sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 21
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Lys, Gly, Pro oder Asp sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:

(2) Information für SEQ ID Nr. 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2..3
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäuren unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 4
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Pro oder Tyr sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 6
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäuren unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 17
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asn oder Ser sein"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2

(2) Information für SEQ ID Nr. 3:

i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asp, Ser, His oder Gly sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 11..12
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäuren unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 16
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäuren unbekannt"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:

(2) Information für SEQ ID Nr. 4:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Leu, Asp, Gly oder Ala sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 3
(D) Sonstige Angaben:
/Markierung = Rest-3
/Bemerkung = "Aminosäure kann Asp, Gly oder Ala sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 4
(D) Sonstige Angaben:
/Markierung = Rest-4
/Bemerkung = "Aminosäure kann Gly oder Asp sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 9
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4

(2) Information für SEQ ID Nr. 5:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann His, Ser oder Gly sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 9
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Leu oder Ile sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 10
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Ala oder Thr sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 13
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 16
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung "Aminosäure unbekannt"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:

(2) Information für SEQ ID Nr. 6:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(v) Art des Fragments: N-terminal
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 3
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Pro, Gly oder Asp sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 4
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Tyr oder Lys sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 5
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asp oder Pro sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 6
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 7
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asp, Thr oder Glu sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 9
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 11
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "kann Asp oder Thr sein"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 12..14
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäuren unbekannt"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Stelle
(B) Lage: 18
(D) Sonstige Angaben:
/Bemerkung = "Aminosäure unbekannt"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 6:

(2) Information für SEQ ID Nr. 7:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 16
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 19
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 22
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 25
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 28
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 31
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 34
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 37
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 40
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 46
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 49
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 7:

(2) Information für SEQ ID Nr. 8:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(iv) Anti-sense: ja
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 16
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 19
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 22
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 25
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 28
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 29
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 30
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 31
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 34
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 37
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 40
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 46
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 49
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 8:

(2) Information für SEQ ID Nr. 9:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1.400 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: unbekannt
(ii) Art des Moleküls: cDNA
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 17. .1381
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 9:

(2) Information für SEQ ID Nr. 10:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 454 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 10:

(2) Information für SEQ ID Nr. 11:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1.386 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: unbekannt
(ii) Art des Moleküls: cDNA
(vi) Ursprüngliche Herkunft:
(A) Organismus: Haemonchus contortus
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 17. .1339
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 11:

(2) Information für SFQ ID Nr. 12:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 440 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 12:

Claims

1. Im wesentlichen gereinigtes glycosyliertes oder nicht glycosyliertes Protein, das ein Nematoden-Antigen ist und die Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die Reste 12 bis einschließlich 440 der in Figur 8 dargestellten Aminosäuresequenz definiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70 % homolog über 20 Aminosäuren zu der Aminosäuresequenz ist, die durch die Reste 12 bis einschließlich 440 der in Figur 8 gezeigten Aminosäuresequenz definiert wird.

2. Glycosyliertes oder nicht glycosyliertes Protein, das ein Vorläufer eines Nematoden-Antigens nach Anspruch 1 in im wesentlichen gereinigter Form ist.

3. Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer Reinheit von mindestens 90 %.

4. Glycosyliertes oder nicht glycosyliertes Protein, das ein Vorläufer eines Nematoden-Antigens ist und die in Figur 8 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70 % homolog ist über 20 Aminosäuren zu der in Figur 8 dargestellten Aminosäuresequenz.

5. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein die in Figur 7 dargestellte Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz, die von den Resten 17 bis einschließlich 454 der in Figur 7 dargestellten Aminosäuresequenz definiert wird, umfaßt.

6. Polynukleotid-Molekül, z.B. DNA-Molekül, wie ein cDNA- Molekül, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.

7. Polynukleotid-Molekül nach Anspruch 6, das umfaßt: die in Figur 7 dargestellte Nukleotidsequenz; die in Figur 8 dargestellte Nukleotidsequenz; eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens 50 % homolog ist über 60 Nukleotide zu der in Figur 8 dargestellten Nukleotidsequenz; die Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 65 bis einschließlich 1381 der in Figur 7 dargestellten Nukleotidsequenz definiert wird; die Nukleotidsequenz, die durch die Nukleotide 50 bis einschließlich 1339 der in Figur 8 dargestellten Nukleotidsequenz definiert wird; oder eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens 50 % homolog über 60 Nukleotide zu der Nukleotidsequenz ist, die durch die Reste 50 bis einschließlich 1339 der in Figur 8 dargestellten Nukleotidsequenz definiert wird.

8. Rekombinantes DNA-Molekül umfassend ein Polynukleotid- Molekül nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 und Vektor-DNA, z.B. Plasmid-, Phagen- oder virale DNA.

9. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 8, worin die Vektor-DNA ausgewählt ist aus lambda gt11, pUR290, pUR291, pUR282, pUK270, pUC8, pUC9, pZipNeo, einem Vektor auf Basis SV40, lambda gt10, einem EMBL-Vektor, pBR327, pBR329, pBR329, der einen Par-Locus enthält, Baculovirus oder Vaccinia-Virus.

10. Plasmid pBTA879 enthalten in dem E. coli Stamm, der bei den Analytischen Laboratorien der Australischen Regierung mit der Hinterlegungsnummer N92/4387 hinterlegt wurde oder Plasmid pBTA963 enthalten in dem E. coli Stamm, der bei den Analytischen Laboratorien der Australischen Regierung mit der Hinterlegungsnummer N92/4388 hinterlegt wurde.

11. Transformierter Wirt, z.B. ein Bakterium, eine Hefe, ein anderer Pilz, ein Insekt, eine Pflanze oder eine Säugetier-Zellinie, transformiert mit mindestens einem Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 6 bis 10.

12. Transformierter Wirt nach Anspruch 11, worin der Wirt ein E. coli K12-Derivat ist.

13. Wirtszelle BTA 2033 hinterlegt bei den Analytischen Laboratorien der Australischen Regierung mit der Hinterlegungsnummer N92/4387 oder Wirtszelle BTA 2125 hinterlegt bei den Analytischen Laboratorien der Australischen Regierung mit der Hinterlegungsnummer N92/4388.

14. Impfstoff, umfassend mindestens ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans.

15. Vollzellimpfstoff in lebender oder abgetöteter Form umfassend einen transformierten Wirt nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittei, Hilfsstoff oder Adjuvans.

16. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:

a) daß man junge ausgewachsene Exemplare einer parasitischen Nematodenart homogenisiert, um ein Homogenisat herzustellen;

b) Membranmaterial aus dem Homogenisat erhält;

c) das Membranmaterial mit einem Puffer, der einen geringen Anteil eines zwitterionischen Detergens enthält, extrahiert, um einen Detergens-Extrakt zu erhalten;

d) den Detergens-Extrakt auf einer Weizenkeim-Lectin- Sepharose-Säule chromatographiert und

e) den Durchfluß aus der Säule sammelt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Verfahren auch umfaßt,

f) die Fraktionierung durch präparative isoelektrische Fokussierung und die Sammlung der Fraktionen mit einem pI im Bereich von 3,8 bis 4,4 oder bevorzugt 4,0 bis 4,3;

g) Fraktionierung durch Gelfiltrations-Chromatographie, um Fraktionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 60 kD zu sammeln und

h) Fraktionierung mit Linsen-Lectin- oder Helix pomatia-Lectin-Chromatographie und Sammeln des gebundenen Materials.

18. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gezüchtet wurde.

19. Antikörper-Zusammensetzung umfassend mindestens einen Antikörper nach Anspruch 18 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.

20. Diagnosekit umfassend eine Probe eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 18.

21. Anti-Idiotyp-Antikörper entsprechend einem Teil eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der einen Wirt, der mit dem Anti-Idiotyp-Antikörper immunisiert wurde, gegen einen Befall mit einer parasitischen Nematodenart schützt.

22. Impfstoff umfassend einen Anti-Idiotyp-Antikörper nach Anspruch 21 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger, verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Adjuvans.

23. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem Arzneimittel.

24. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prophylaxe eines mit parasitischen Nematoden infizierten Tiers.

25. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Polynukleotid-Molekül nach einem der Ansprüche 6 bis 10 exprimiert.