JPH04503206A - ポリペプチドおよびこれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドおよびこれをコードするＤＮＡ本発明は、ヒトのマラリア原虫によ って産生されるポリペプチド、およびこれをコードするＤＮＡに関する。

この発明はさらに、そのポリペプチドの調製法、これに対する抗体、およびマラ リアに対して使用する組成物に関する。

プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌ虹Ｌ−■） によって引き起こされるマラリアは、今日の世界で最も一般的な感染症の一つで あって、世界人口の４０％はどに脅威を与えている。これは、第３世界の疾病と いえる。毎年、１億５千万ないし３億の症例があり、そのうちの１％以上の症例 が致死的であって、乳児および若年者が最も罹患しやすい、殺虫剤および第２次 世異人戦後に開発された新たな駆虫剤の登場によって、この疾病が撲滅されるき ざしが感じられた。初期の試みは確かに成功を見たが、時の経過とともに、この 原虫は、クロロキンなどの薬剤に対する耐性を獲得し、媒介力（ハマダラ力属） はＤＤＴに対する耐性を獲得した。

その結果、この疾病との戦いに挑むには、新たな戦術の開発が必要である。この 疾病に対する免疫力は年令とともに増大するので、風土病が存在する地域で疾病 の撲滅を計画した場合、抗マラリア薬および殺虫剤とともにワクチンの開発が必 要である。

世界中での今日的研究計画は、どんな抗原が有益なワクチンの成分を構成し得る かを決定することに係わっている。この寄生虫の複雑な生活環は、１つの抗原に 基づく１種類の単純なワクチンでは不適当である可能性、および有効なワクチン にはおそらく生活環中の様々な発生・発達段階からの抗原が必要であることを意 味する。

ヒトのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｎＫ止肛胚）は、複雑な生活環を もち、生活環をめぐる間、特定の発生・発達段階で様々な抗原が産生される。ス ポロゾイトの表面に存在する大きな抗原はスポロゾイト周囲の（ｃｉｒｃｕｍｓ ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）　、すなわちＣＳタンパクであって、おそらくこれは、こ の寄生虫と肝細胞との相互作用の特異性を決定しているのであろう、ＣＳタンパ クは、領域Ｉおよび領域ＩＩという、２つの保存されたアミノ酸配列を含んでい るが、これらは、あるアミノ酸配列の繰り返し部分によって隔てられている。

上記タンパクの遺伝子のクローニングは、様々なワクチンの開発を可能にしてき た。今日まで、ＣＳタンパクの一部分を使ったワクチンの試みは、期待はずれに 終っている。スポロゾイトに対する免疫作用によって、生活環中の発病に結びつ く赤血球期に移ることをを必ずしも防げるというわけではない、スポロゾイトは １匹でも、免疫系をのがれて発病させることがある。現在、ＣＳタンパクは、宿 主細胞の認識に関与することが知られている、性質の解明された唯一のタンパク である。メロゾイトは、新鮮な赤血球に再感染可能な段階にあるものである。力 の中における生殖母細胞の分化を阻止する抗体は、伝染の環を断ち切るのに有用 である。その他で複雑なことは、この寄生虫のみせる抗原性の多様な変化である 。無性生殖期の赤血球寄生虫に対するワクチンは、この疾病の重症度を低下させ るという部分的効果有していれば良い、Ｐ、　匡Ｒ江肛Ｊの無性生殖期の血中段 階に対するワクチンは、合成ペプチドの使用に基づいてバッタロヤ（Ｐａｔａｒ ｒｏｙａ　）ら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、　３３２．１９８８．　ｐ１５８）に よって開発されたが、総合的な有効性は認められなかった。

我々は、ＣＳタンパクと配列部分を共有するポリペプチドが、この寄生虫の生活 環の中の赤血球段階またはメロゾイト段階に産生されることを見出した。

したがって、この発明は、 ａ）式Ｉのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ｂ）ａ）と実質的に同様の構造 および生物学的活性を有するポリペプチド、 Ｃ）生物学的活性に有意に関与する、ａ）およびｂ）の断片、誘導体および（突 然）変異体、 ｄ）生物学的活性に有意に関与する、ａ）、ｂ）およびＣ）のオリゴマー、 からなる群から選択されたポリペプチドを提供する。

当該分野の技術者ならば、構造上のいくつかの変異体が自然界に存在する生物学 的活性を有するポリペプチドに生じること、および特にマラリアのタンパクが様 々な抗原性の変化を示すことが理解されよう、構造的変異体が、例えば、赤血球 の寄生虫認識、赤血球への付着及びメロゾイトの侵入への関与など、目的とする 生物学的活性を失わなければ、そういった変異体は本発明の範囲内に含まれる。

式Ｉは、Ｔ、９／９６として知られるタイ国産のし組Ｒｎ肛Ｊの単離クローン株 のものであるが、本発明の範囲には、例えば、ＫＩとして知られるもう一つのタ イ国産単離株のものも含まれる。この単離株のものは、Ｈｉｎｆ　１制限酵素切 断部位を欠く点、およびＢｇ１１１部位を余分に有する点で、Ｔ９／９６のもの とは興なっていることが知られていた。なお、これは配列決定によって確認され た。Ｋｌからのポリペプチドは、第１表に示すごとく、細部ではＴ９／９６のも のと異なっているが、両者の保存領域に変化はなかった。

Ｔ９／９６とに１の両者は、英国のニシンバラ大学遺伝学部門、マラリア原虫標 準株ＷＨＯ登録所（ｔｈｅ　ＷＨＯＲｅｇｉｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｔａｎｄａｒｄ 　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｍａｌａｒｉａ　Ｐａｒａｓｉｔｅ。

Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｄｉｍｂ ｕｒｇｈ、Ｌｌ、に、）から入手可能である。

１−上−１ Ｔ９／９６およびＫｌから得られた ＤＮＡおよびポリペプチドの比較 一般に、アミノ酸残基の約５％の変異は許容範囲であるが、当該分野の技術者に は理解されているように、分子内のある領域や残基は、他の領域や残基よりも重 要であり、例えば生物学的活性に重要な役割を果す保存領域（例えば、式＋１１ ＴＲＰＡで示される領域及びその周辺）の異変に対する許容範囲は小さいが、抗 原性に重要な領域、例えば、ＲＧＤ配列（式Ｉの残基３０７〜３０９）は変異し やすい、なお、ここで用いるＴＲＰＡは、「トロンポスボンデイン関連無泡タン パク（Ｔｈｒｏｍｂｏｓρｏｎｄｉｎｒｅｌａｔｅｄ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｐ ｒｏｔｅｉｎ）　Ｊを示す略号であって、本発明の１つ以上のポリペプチドを表 す、他の領域は、あまり重要ではないが、ＮＰまたはＰＮ配列に関連した若干の 生物学的活性を示す、ここでの「保存」とは、比較するタンパク間でアミノ酸残 基配列の相同性が有意に高いことである６例えば、第■表に示すように、約２４ ４番目残基付近から約２９１番目の残基付近までの領域は、種々のマラリア原虫 から得られたＣＳタンパク、及びトロンポスボンデインやプロパージン（Ｐｒｏ ｐｅｒｄｉｎ　）の骨格タンパクと有意な相同性を有する。相同性の程度に様々 の厳格な規定を設けることは不可能であるが、多くの例で、８０％を越えるもの を有意とすべきである。

本発明はまた、上記ポリペプチド断片、好ましくは保存配列を含む断片、例えば 、式■で示されるアミノ酸残基２４４から２９１にかけての領域の断片、および 特には下記の群から選ばれたポリペプチド断片を提供する。

ａ）ＷＤＥＷＳＰＣ３ＶＴＣＧＫＧＴＲ３ＲＫＲｂ）ＷＤＥＷＳＰＣ３ＶＴＣＧ ＫＧＴＲｃ）ＥＷＳＰＣ３ＶＴＣＧＫＧ ｄ）ＰＣ３ＶＴＣＧＫＧ ｅ）ＷＳＰＣ３ＶＴＣＧ これらの式中の文字は、天然に存在する以下のしアミノ酸を示す。

（Ａ）アラニン、（Ｃ）システィン、（Ｄ）アスパラギン酸、（Ｅ）グルタミン 酸、（Ｆ）フェニルアラニン、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）ヒスチジン、（Ｉ）イソ ロイシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ）ロイシン、（Ｍ）メチオニン、（Ｎ）アスパラ ギン、（Ｐ）プロリン、（Ｑ）グルタミン、（Ｒ）アルギニン、（Ｓ）セリン、 （Ｔ）スレオニン、（Ｖ）バリン、（Ｗ）トリプトファン、（Ｙ）チロシン。

本発明のポリペプチド誘導体は、例えば、アミノ基、水酸基、メルカプト基また はカルボキシル基といった官能基を変化させて誘導体としたものであって、それ ぞれ、例えばグリコジル化、アクリル化、アミド化またはエステル化されたもの である。グリコジル化誘導体では、一般に、オリゴ糖が、アスパラギン、セリン 、スレオニンおよび／またはりシンに結合している。アクリル化誘導体は、特に 天然に存在する有機または無機酸（例えば、酢酸、リン酸または硫酸）によって アクリル化されたものであり、これは、それぞれ例えば、Ｎ末端アミノ基または 水酸基（特には、チロシンもしくはセリンの水酸基）のところで生じるのが一般 的である。エステル類は、天然に存在するアルコール（例えば、メタノールまた はエタノール）とのエステルである。

さらに別の誘導体は塩であって、特には、薬理学的に許容性のある塩、例えば、 アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグ ネシウム、カルシウムもしくは亜鉛の塩）といった金属塩、またはアンモニア、 もしくは低級アルキルアミン（例えば、トリエチルアミン）、ヒドロキシ低級ア ルキルアミン（例えば、２−ヒドロキシエチルアミン）などの適当な有機アミン とで形成されるアンモニウム塩である。

本発明のポリペプチドの（突然）変異体は、１つ（点突然変異）またはそれ以上 的１０までのアミノ酸が、１つ以上のアミノ酸で置換されるということに特徴が ある。これは、ＤＮＡレベルで対応する（突然）変異が起きて、コドンに変化が 生じた結果である。

また、本発明には、前記ポリペプチドのオリゴマー（例えば、２量体および３量 体）がその範囲内に含まれる。こういったオリゴマーは、天然に存在する可能性 もあり、生物学的活性の発現にとって重要である。このｒオリゴマー」には、共 有結合した分子、および水素結合などの弱い分子間結合によって重要な立体配座 型に結合した分子の両者が含まれる。

さらに本発明は、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供す る。ムハ蝕江肛りのＴ９／９６株のアミン酸配列をコードするＤＮＡ配列は式１ に示されるが、この発明の範囲は、それがコードするアミノ酸を変化させない変 異型、ならびに天然に存在する突然変異型および上記のＫＩをコードする変異型 にも及ぶ。

本発明のＤＮＡは、当該分野で既知の方法によって、マラリア原虫ＤＮＡおよび ゲノムライブラリーから回収することができる。そして、一度配列が分かってし まうと、直接的増幅手段（例えば、サイキ（Ｓａｉｋｉ　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ 　、　１９８５、Ｖｏｌ、２３０　、　ＰＰ１３５０−１３５４のＰＣＲ（Ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）が利用できる。

本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基数が大きすぎない場合には化学合成によ って作製することができ、または宿主／ベクター発現系における適当なりＮＡ配 列の発現によって作製することもできる。

所望のＤＮＡと、プロモーター、マーカー遺伝子など他の機能的配列を含む組換 えベクターは、当該分野で既知の方法によって作製することができる。

適切なベクターとしては、ｐＵｃ１３（ファルマシア社）またはｐＡｃＹＭＩ　 ［ウィルス学研究所、マンスフイールド・ロード、オックスフォード、英（Ｉｎ ５ｔ、　ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ　Ｒｏａｄ、　０ｘｆｏ ｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ　）　］に本発明のＤＮＡ配列をクローン化した組換え ＤＮＡが挙げられる。

組換えウィルスベクターは、当該分野で既知の方法によって所望のＤＮＡ配列を ウィルスＤＮＡの中に取り込ませることによって得ることができる［例えば、ｒ ＤＮＡクローニングＪ　、　１１巻、ディー・エム・グローバー、１９８５年発 行、ＩＲＬブレス、オックスフォード、英国、（ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｖ ｏｌｕｍｅｌｌ　、　Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ＋９８５． 　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照］０本発明 における適切な方法の一つとして、適当な宿主細胞への同時トランスフェクショ ン（Ｇｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　）法による、プラスミドとウィルスとの 組み合わせが挙げられる。

例えば、スボドブテラ・フルギベルダ（江姐肚旦」匡■江肛ｂ）細胞中でオート グラファ・カリフオルニカ（組匡肛且加ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウ ィルス（ＡｃＮＰＶ）とともに、以下でｐＫＫＪ　ｌ　７と称するプラスミドを 用いて、本発明のＤＮＡを含む組換えウィルス例えば、以下でｖＫＫＪ　１７と 称する組換体を複製させて、これを単離することができる。

本発明の他の態様に従えば、本発明のポリペプチドに対する抗体が提供される。

これらの抗体は、当該分野で既知の手法によって作製することができる（例えば 、ＡｎｔｉｂｏｄｉｅＢ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｅ、　 ）ｌａｒｌｏｖ　ａｎｄ　Ｄ。

Ｌａｎｅ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｕｒ％１９８８年、参照） 。

本発明のポリペプチドは、マラリアに対するワクチンなどの調製に有用である。

この目的で、これらポリペプチドを有効成分として、適当な担体中にアジュバン トとともに（可能ならば、その他の免疫学的活性物質とともに）取り込ませ、こ れを用いてマラリア原虫の様々な段階に対する防御力を与えることができる。

本発明をその技術的および理論的な面から本発明を明らかにするために論じるが 、本発明の有用性は、理論的に解析された細部に限定されるわけではないことを 理解すべきである。

本発明のポリペプチドは、他のよく性質が分かったタンパクと共通するアミノ酸 配列部分を共有している。もっとも重要な相同性は、アミノ酸配列ＷＳＰＣ３Ｖ ＴＣＧの付近に基づくものであって、そのコピー配列がトロンポスボンデイン（ ＴＳＰ）の領域Ｉに３個所、プロパージン（Ｐ）には６個所、全ての配列既知の スポロゾイト周囲タンパクに１個所同定された。さらに、このアミノ酸配列の相 同性は、ＴＳＰを含む細胞外糖タンパク、すなわち細胞認識シグナル（ＲＧＤ） にもみられ、これは、種々の細胞外糖タンパクとインテグリンスパーファミリー のメンバーとの相互作用といった面で極めて重要であることが分かっている。こ のようなトロンポスボンデインとの関係から、本発明のポリペプチドを、トロン ポスボンデイン関連無泡タンパク（すなわちＴＲＰＡタンパク）と呼ぶ、ＣＳタ ンパクとは異なって、ＴＲＰＡタンパクは、マラリア原虫の生活環の赤血球段階 で発現する。

Ｐ、　匡旦止肛」ゲノム中のＣＳタンパク関連配列を検索するために、領域ＩＩ に対応するＡＣＣ，ＡＴＴ、ＴＣＣ，ＡＣＡ、ＧＧＴ、ＴＡＣ，ＡＣＴ、ＡＣＡ 、ＴＧＧからなる配列（式ＩＩ　Ａに示す）を有するオリゴヌクレオチドプロー ブを用いて、Ｐ、　ｆａ旦江肛ｕｍ　（Ｔ９／９６）ＤＮＡゲノムのサザーンプ ロットを行った。Ｔ９／９６は、タイ国産のＰ、　７のクローン化分離株であっ て、Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎ ｉｍａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｋｉｎｇｓ　Ｂｕｉｌｄｉｎｇｓ、　Ｗｅｓｔ 　Ｍａｉｎｓ　Ｒｏａｄ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ。

１１に、から入手可能である。予期された９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片および８００ ｋｂのＢｓｔＮＩ断片を検出した。同一のプローブを用いて、２つのＰ、　■旦 ｎ肛ＪＤ　Ｎ　Ａゲノムライブラリーなスクリーニングした。それらの一方はＥ ｃｏＲＩでの完全消化物をλｇｔｌｌ中にローン化したものであって、もう一方 はＥｃｏＲＩ部分消化物なんｇｔｌＯ中にクローン化したものである。これらの ２つのベクターでの上限が８ｋｂであるため、真のＣＳタンパク配列をこれらラ イブラリーのいづれかに見い出せるとは予期していなかった。数種のクローンが 単離され、それらのすべては２．３５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を共通にもっていた 。この断片からのＤＮＡ配列、およびＥｃｏＲＩ断片と近接する部分のＤＮＡの 配列を決定した（式Ｉに示す）。上記のオリゴヌクレオチドによって検出された 配列、およびそのプローブ配列を式ＩＩＡに示した。これには、メチオニン残基 で始まるオーブンリーディングフレーム（式■参照）が存在し、これは５５９個 のアミノ酸からなる長さのもので、分子量６３，３００のタンパクをコードする 。このアミノ酸配列は、保存されたノナペプチドのＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ ｙｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙを含み、これにより、なぜ上記 のプローブによって式Ｉの新しい遺伝子が検出されたかが説明できる（式ＩＩ　 Ｂ参照）、この配列およびその変異型は、ＴＳＰ、ＣＳタンパクおよびプロパー ジン中に見い出される０式■には、式ＩのＴＲＡＰタンパクと、Ｐ、　垣Ｒｎと 憇（Ｐ、ｆ、）　、Ｐ、　ｖｉｖａｘ　（Ｐ、ｖ、）、Ｐ、　ｋｎｏｗｌｅｓｉ 　（Ｐ、に、）　、　Ｐ、　シ」Ａ旦ｌ」」Ｏノド２株（Ｐ。

ｃ、　）　、Ｐ、　仙猛幻シ１（Ｐ、　ｂ、　）及びＰ、　ｕ！月」（Ｐ、ｙ、 ）から得られたＣＳタンパク配列、ＴＳＰおよびプロバージンの骨格との間にお ける、保存配列の相同性を示す。

配列の解析は、ＡＬ　Ｉ　ＧＮプログラム［ダイホツフ（Ｄａｙｈｏｆｆ　）ら 、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９１．５２４−５４５　（１９８３）］を用 いて実施した。アミノ酸は１文字で表わし、ＴＲＡＰと共通の残基は四角で囲ん だ。

ＴＲＡＰタンパクのアミノ酸配列には、いずれの分子末端にも疎水性ドメインが 見られた。アミン末端にある第１のものは、おそらくシグナル配列であり、カル ボキシ末端にある第２のものは、膜通過のための配列に類似している。保存アミ ノ酸配列中及びその付近にかけてシスティン残基のクラスターが存在するが、こ れは、分子間および分子内ジスルフィド結合によって形成される二次構造を示唆 するものである。これらシスディン残基は、ＣＳタンパク、ＴＳＰおよびプロパ ージンの保存領域近傍の似かよった位置にある。そういった二次構造が形成され るという証拠は、領域ＩＩを含むＣ３由来ペプチドに対する抗体が未変成および 変成ＣＳタンパクの両方に対する反応性が乏しいという高度の立体配置を示唆す る事実から得られるものである［パーロウ（Ｂδｌｌｏ曹）ら、５ｃｉｅｎｃｅ 　２２８　、９９６−９９９　（１９８５）］　、この配列は、保存領域以外に おいてプロリンに冨んでいるが、その他多くのマラリアタンパクに特徴的な繰り 返し構造の一部を形成するものではない、ＲＧＤ部分（アミノ酸３０７〜３０９ ）は上記配列に含まれているが、これは、細胞認識に関与する多くの糖タンパク の特徴部分である。ＴＲＡＰは、この主要部分を有する最初のマラリアタンパク である。ＴＳＰは、こういったＲＧＤ部分および第■ａ因子との架橋に関係する ＩＱＱ部分を持ち、ＴＲＡＰもＩＱＱ部分（アミノ酸７６〜７８）を備えている 。Ｎグリコジル化を可能とする４つの部位が存在する。はとんどのマラリア抗原 と同様に、そのアミノ酸組成は、アスパラギン酸およびプロリンが特に豊富とい う点で際立っている。

ＣＳタンパク遺伝子は、マラリア原虫生活環のスポロゾイト段階でのみ発現され る。無性生殖の原虫で発現する異なったタンパク（ＣＲＡまたはＡｇ５．１）は 、ＣＳタンパクのＮＡＮＰ繰り返し構造に対するモノクローナル抗体と交叉反応 するエピトープを有する。このタンパクのアミノ酸配列に関するデータから、（ ＮＡＮＰ）１との相同性領域は明らかになったが、ＣＳタンパクに特徴的な他の 配列は分からない。

Ｃ３遺伝子プローブを用いたノーザンプロットでは、赤血球段階でのいかなる種 類のＲＮＡも検出されなかった。ＴＲＡＰ遺伝子（式Ｉに示す）をプローブとし て用いた同様の解析（図ＩＧ参照）で、約２０Ｓの各種ＲＮＡが、検査した２つ の分離物（ＩＴＯおよびＦＣＲ３Ａ２）中に検出された。これは、ＴＲＡＰ遺伝 子が生活環の赤血球段階で発現されるが、ＥＢＶでの形質転換リンパ球では発現 されないこと、およびＴＲＡＰプローブでは夾雑物のために血中に存在するヒト の配列は検出できず、したがってＴＲＡＰプローブは原虫特異的であることを示 唆した。転写されたＲＮＡの大きさは、分子量６３．３００のタンパクをコード するＲＮＡに匹敵する。

抗体が、ＴＲＡＰ／β−ガラクトシダーゼ融合タンパクに対して形成された。ウ ェスターンプロットを用いると、これらの抗体は、約６５ｋｄのタンパク（ＴＲ ＡＰ遺伝子産物として予想された大きさ）、および成熟した感染赤血球表面抗原 （ＭＥＳＡ）および３３２など、多数の他のタンパクと反応する。ＴＲＡＰの推 定されるアミノ酸配列から、Ｇ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ　（Ｅ−Ｅ）部分を中心と する配列からなる多くの部分が存在することが分かり、このことにより交叉反応 が説明できる０間接免疫蛍光法では、ＴＲＡＰは分裂生殖の最終段階で合成され ることが示唆されている。

Ｐ、　匡匡江肛胚のを椎動物および無を椎動物段階の両段階に見られる高度の保 存部分は、トロンポスボンデインおよびプロパージンにも存在し、この事実は、 ＴＲＡＰタンパクが重要な機能を発揮することを示唆している。スポロゾイトの ＣＳタンパクの認識および肝細胞への侵入における役割が考えられる。領域Ｉか ら得られる合成ペプチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて肝細胞に特異的に結合する が、領域ＩＩに関するこの種の研究報告は見られない、他の２つの原虫−細胞相 互作用は、Ｐ、　匡Ｒｎと」の生活環に極めて重要である。病原性の強さは、原 虫が血管床深く封鎖される性質に関係する。この過程は、赤血球細胞表面上で原 虫により銹導された変更と内皮細胞上の受容体との相互作用に依存するものであ って、トロンポスボンデインが関与する。トロンポスボンデイン自体及びトロン ポスボンデイン抗体の両者は、この封鎖についてのｉｎ　ｖｉｔｒｏでのモデル における感染赤血球細胞の細胞粘着を阻害した。この事実は、血小板糖タンパク ■（トロンポスボンデイン受容体）が細胞粘着に重要な役割を担うとする証拠と 併せて考察すると、感染赤血球上における原虫誘導性のトロンポスポンディン類 似体の存在と矛盾しない、細胞粘着抗原Ｐ　ｆ　ＥＭＰ　Ｉの分子量は、３００ ｋｄと考えられ、ＴＲＰＡもその例外ではない、すなわち細胞粘着が宿主タンパ クの原虫による変異に関与し、ＴＲＰＡがこの機能を果す証拠が得られているか らである。

その他の原虫−細胞相互作用には、遊離のメロゾイトによる赤血球の認識および これへの侵入が挙げられる。

もしもＴＲＰＡが遊離メロゾイトの表面に存在しているナラハ、Ｃ３ｂに結合す るプロパージンとの相同性が、赤血球表面上におけるＣ３ｂおよびその分解産物 の認識という機能を持つであろう。極めて関連性の深い原虫、ベベシア・ローデ ィアニ（Ｂａｂｅｓｉａ　ｒｈｏｄｉａｎｉ）によって、Ｃ３ｂが関与した赤血 球への侵入を調べる手法が開発された。　Ｐ、　ｆａ旦江肛」の赤血球細胞への 侵入には血清中の補体成分を必要としないという観察結果は、赤血株細胞表面に すでにある補体成分の関与を否定するものではない。

以下、本発明の実施例および他の技術的詳細事項を、添付の式および図面を参照 して説明する。

式Ｉは、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基配列（アミノ酸を１文字で表わす ）、および隣接する非コード配列をともなうそれをコードするＤＮＡのヌクレオ チド配列を示す、ヌクレオチドには１から３１０２の番号をふり、アミノ酸残基 には、３１２〜１９８９番のこれをコードするヌクレオチドに対応させて１から ５５９の番号をふった。

式ＩＩ　Ａは、２７塩基のオリゴヌクレオチドプローブと、それによって、Ｐ、 　匡民江肛」のλｇｔｌｌゲノムライブラリーから検出されたＤＮＡ配列との比 較を示す。

式ＩＩ　Ｂは、アミノ酸配列とプローブ配列に相補的なヌクレオチド配列の比較 を示す。

式■は、式１で示されるポリペプチドと他のタンパクにおけるノナペプチド保存 部分及びその近傍のアミノ酸配列の比較を示す。

図ＩＡは、プローブとして使った図１のポリペプチドとハイブリダイズした、ｐ 、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのクローン化Ｔ９／９６系から得られたＤＮＡのサザ ーンプロット解析を示す。

図ＩＢは、図４Ａと類似しているが、ＣＳタンパクプローブとハイブリダイズし たものを示す。

図ＩＣは、ＥＢＶで形質転換させたリンパ球および２つのＰ、　ハ肢組虹Ｊ分離 株から得られた総ＲＮＡのノーザンプロット解析を示す。

図２および図３はそれぞれ、本発明によって提供されるプラスミドｐＫＲ５およ びｐＫＫＪ　１７の概略図であって、制限酵素切断部位およびその他の特徴を示 す。

式ＨＡおよび式ＩＩＢを参照にして、２７塩基のオリゴヌクレオチドを、ＣＳタ ンパクの領域Ｈにおけるアミノ酸配列ＰＣＳＶＴＣＧＮＧから合成した。ＤＮＡ とＲＮＡ配列の両方を検出することができるように、相補鎖を合成した。このオ リゴヌクレオチドは、固体担体にホスホアミダイト（Ｐｈｏｇｐｈｏｒａｍｉｄ ｉｔｅｓ）のモノマーを添加することによるアブライトバイオシステムズモデル （Ａｐｐｌｆｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋ｓ　ｍｏｄｅｌ）　３０８　Ａ　（登 録商標）の合成装置で合成した。脱保護したプローブを、調製用ポリアクリルア ミドゲル電気泳動によって精製した。末端標識化オリゴヌクレオチドを使用して 、λｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ部位にクローン化したＰ、　匡Ｒ江肛朋Ｔ９／９６Ｄ ＮＡ（Ｆ）ＥｃｏＲＩ消化産物のプラーク４ＸＩＯ”個（大腸菌Ｙ１０８日上で ）をスクリーニングした。６つの陽性プラークを同定し、これを再度スクリーニ ングにかけた。これらは、２．３５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。へイブ リダイゼーションは、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＮＰ４０および 剪断サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを含む６×ＮＥＴ　（ＩＸＮＥＴ＝０．１ ５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｎ　Ｔｒｉｓ−Ｈ，ＣＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　Ｅ　 Ｄ　Ｔ　Ａ　）中で３７’ＣＩ６時間行った。洗浄は、０．１％ＳＤＳを含む６ ×ＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣ１，０，１５Ｍクエン酸ナトリウム） 中で３７℃にて行い、続いて、同溶液中で６０℃にて１回行った。濾紙は、予備 露光したＸ線フィルムとともに、１６時間オートラジオグラフィーにかけた。

λｇｔｌｌファージから得られた２、３５ｋｂのＥｃｏＲ■挿入断片を、ｐＵＣ ８およびＭ１３ｍｐｌＯにサブクローニングした。この断片の配列決定をジデオ キシ法で行なった結果、不完全なオーブンリーディングフレームが見付かった。

第２のライブラリーは、λｇｔｌｏ中にＴ９／９６のＥｃｏＲＩ部分消化断片を クローン化することによって作製し、これを先の２．３５ｋｂ断片でスクリーニ ングした。１．ｌＸｌ０’個のプラーク（大腸菌ＮＭ５１４上で）をスクリーニ ングし、先のものと重複する部分を有する配列をもつクローンが得られた。ＴＲ ＡＰ遺伝子およびその隣接配列からなる完全なりＮＡ配列は、サンガー（Ｓａｎ ｇｅｒ）らのＤＮＡ末端配列決定法［Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４３．１６１−１７８　（１９８０）］を用しＡで 決定した。その配列情報は、ＤＮＡ両鎖の配列決定を可能とする、Ｍ１３ｍｐｌ Ｏへの「ショットガン」クローニングによるクローンから得られた。ギャップは 、常法による合成に用いられるオリゴヌクレオチドブライマーを使って埋めた。

この手法は、制限酵素切断部位のないところからＤＮＡ配列を切り出すのに最も 有効な方法であることが分かった（これはＡ−Ｔに冨んだＤＮＡ領域での問題点 であった）、データの解析には、スターデン（Ｓｔａｄｅｎ）のＤＮＡ配列処理 プログラム（ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈａｎｄｌｉｎｇ　ｐｒｏｇｒａｍｍ ｅｓ）　［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｖ、、　１０．　４７３１−４７６１ （１９８２）　］を用いた。オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする 部位は、式■に下線で示す、Ｎグリコジル化を起こす可能性がつよい部位にある アスパラギン残基には、アステリクス（★）を付した。ＲＧＤ配列（残基３０７ 〜３０９）には上に線を引いた。ＩＱＱ部分（残基７６〜７８）は四角で囲んだ 。

図ＩＡおよび図ＩＢ（サザーンプロット）では、レーン１〜１１は、それぞれ、 Ａｓｐ７１８、ＢａｍＨＩ、Ｂ　ｑ　Ｉ　ＩＩ、ＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｃＨｌＨｉ 　ｎｄｍ、Ｔａｑ■、ＢｓｔＮＩ、Ｈｈａ　Ｉ、Ｈｐ　ａ　ＩＩ、およびＭｓｐ Ｉの制限酵素による消化物での結果を示す。

図ＩＧ（ノーザンプロット）では、レーン１がＥＢＶ形質転換リンパ球（２５μ ｇ）での結果を、レーン２がＰ、　ｆａｌｃ旦肛」分離株ＩＴＯ（ブラジル株、 ２５μｇ）での結果を、およびレーン３がＰ、　ｆａ旦江肛」Ｆ　ＣＲ３Ａ２（ ロックフェラー株、クローン化、２５μｇ）での結果を示す。

サザーンブロツティングおよびハイブリダイゼーションは、ウー（Ｗｏｏ）らの 報告［Ｎａｔｕｒｅ　３０６．１５１−１５５　（１９８４）］に従って実施し ゛た。ノーザンブロッティングは、ロップソン（Ｒｏｂｓｏｎ）らの報告［Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７９，４７０１−４７０５　（１９８２）］に従って実施した。ハイ ボンドＮ　（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ　：登録商標）膜を使えば、同じ濾紙を再びハイ ブリダイゼーションすることができた。パネルＡ（図ＩＡ）の濾紙は、初めに、 ＴＲＡＰ配列に対応する２つのＥｃｏＲＩ断片でハイブリダイズさせ、シグナル を除去してから、ＣＳタンパク遺伝子配列を含む断片で再びハイブリダイズさせ た。パネルＣ（図ＩＣ）のプローブは、パネルＡのものと同一であった。パネル Ｃの濾紙も、パネルＢ（図ＩＢ）と同じプローブでハイブリダイズさせたが、ハ イブリダイズを示すシグナルは認められなかった。

本発明のポリペプチドおよびＤＮＡを純粋な形で大量に産生させるために、以下 の手順を踏んだ。

複数の精製β−ガラクトシダーゼＴＲＡＰ融合タンパクに対するポリクローナル 抗体を作製した。タンパクの精製で界面活性剤およびポリアクリルアミドゲル電 気泳動による変性が生じた結果、重要な立体配座エピトープがすべて破壊された 。ウェスターンプロットにおいて、これらの抗体は他の原虫抗原も認識したので 、これらを培養原虫からの未変性ＴＲＡＰの精製に使用することはできなかった 。したがって、正確に調製でき、簡単に精確できる大量の未変性タンパクを産生 できるように設計した真核細胞用の発現ベクターを用いる代わりの方法を行なう ことを決めた。

可能性のある発現系として、バキュロウィルスを利用するものがあげられた。バ キュロウィルス発現系によって、真核細胞環境での外来遺伝子の高レベル発現が 可能である。天然遺伝子の調節、すなわち、非常に遅いが大量発現の可能なポリ ヘトリン（Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子の発現を利用する。バキュロウィルス ゲノムのサイズが大きいため、通常組換えウィルスの作製は、目的の遺伝子とウ ィルスの対立遺伝子とを置換する生体内での組換えにより行なわれている０組換 え用のプラスミドには、外来遺伝子の挿入のための部位、及びこれに隣接する組 換えのための相同配列としてのウィルスの配列が含まれる。

細胞へウィルスＤＮＡと組換え用のプラスミドＤＮＡを同時にトランスフェクシ ョンすることによって、プラスミド中の外来遺伝子領域と標的ウィルス遺伝子と の間で細胞媒介による対立遺伝子の置換（組換え）が生じる。

外来遺伝子をバキュロウィルス発現系で十分に発現させるには、これら遺伝子は 、イントロン、ならびに５′および３′隣隣接列の大部分が除かれるように加工 する必要がある。ＴＲＡＰ遺伝子はイントロンを含まないので、遺伝子増幅法（ ＰＣＲ）を用いて、ＢａｍＨＩ制限酵素切断片として全オーブンリーディングフ レームを有する図１のＴＲＡＰ遺伝子を加工し、これをトランスファーベクター ｐＡｃＹＭＩ　［英国、オックスフォードのウィルス学研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｒ　ｏｆ　Ｖｆｒｏｌｏｇｙ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手 可能］中にクローン化した。

これは以下のように実施された。Ｂａｎ＋Ｈ１部位、ならびにＴＲＡＰ遺伝子の ５′および３゛末端を有するオリゴヌクレオチドブライマーを設計した。これら ２つのプライマーは以下のとおりである。

下線部の配列は、コーディング領域のそれぞれの末端に相当する。この下線部分 には、プライマーＡではコード鎖がそのまま、プライマーＢでは相補鎖が用いら れている。このプライマーは、ＤＮＡが常に５′末端から３゜末端方向に合成さ れるので、必要である。Ｍ２Ｓ中にサブクローンされたＴ９／９６ゲノム由来の ＤＮＡが増幅された。この反応は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らの方法［５ｃｉｅｎ ｃｅ　、　＋９８５、Ｖｏｌ、　２３０、ＰＰ１３５０−１３５４　］に従って 、Ｔａｃｌポリメラーゼ［（１ｍＭ）オリゴヌクレオチドブライマーＡおよびＢ 、１０ｍＭ　デオキシヌクレオシドトリフオスフェート、ならびにｌｎｇのＲＶ ９　（Ｍ２Ｓ中へのＴＲＡＰのサブクローン）］を使って開始させた。サイクル の温度および時間は、９３℃で１分間、３７℃で１分間、７２℃で５分間であっ て、サイクルの回数は、１５回であった。増幅終了後、反応混合物全体をフェノ ール／クロロホルムで抽出し、続いて、ゲル濾過によって未反応のデオキシヌク レオシドトリフオスフェートを除去した。このＤＮＡ産物の末端は、デオキシリ ボヌクレアーゼＩのクレノー断片および新しいデオキシヌクレオシドトリフオス フェートを用いて修復した０反応を再びフェノール／クロロホルム抽出によって 終了させて、セファデックスＧ　５０／８０のゲル濾過を行った。このＤＮＡの ５°末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびアデノシントリフオスフェー トでリン酸化した０反応はフェノール／クロロホルム抽出で終了させ、ＤＮＡを プロパン−２−オール沈澱によって回収した。この物質を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ およびｐＵｃ１３（ファルマシア社）をＳａｍＩで消化し、フォスファターゼで 処理したものを用いた連結反応の基質として使用した。所定の挿入片を含む構成 物が得られ、ＤＮＡ配列決定によってそれらの真偽が確かめられた。そのプラス ミドの一つをｐＫＲ５とした。ＢａｍＨ１消化によってｐＵｃ１３から断片を得 ることができるが、これは、必要な制限酵素切断部位によって組換え用プラスミ ドｐＡｃＹＭ１への転移が可能になることを示している。そこで、ｐＫＲ５をＢ ａｍＨＩおよびＨｅａＩＩＩで消化処理し、反応をフェノール／クロロホルム抽 出で停止し、エタノール沈殿を行なった。この消化処理は、ｐＡｃＹＭｌのＢａ ｍＨ１部位への連結に先立って、所定の１．７ｋｂＢａｍＨ１断片のゲル精製を 省略するために実施した。上記と同様の連結および形質転換の操作を、この挿入 用断片および新しいベクターｐ　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｍ　１を用いて実施した。再び、 所定の断片を含む構成物が得られた。ポリへドリンプロモーターに対する、ＴＲ ＡＰ配列を含む挿入断片の方向は、制限酵素切断地図および配列決定によって確 認した。この構成物をｐＫＫＪ　１７と命名し、制限酵素切断地図は図３に示す 、このプラスミドは、ＮＣＩ　Ｍ　Ｂ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄＭａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ ）　［Ｔｏｒｒｅｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　 ３１．１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　ＡＢ９８ＤＧ、 　Ｕ、に、］へ寄託番号ＮＣＩＭ８４０，１６４で１９８９年７月１４日に寄託 された。

ｐＫＫＪ　１７を用いて、以下のように、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏ ｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）細胞のトランスフェクションを行う ことができた。２５μｇのｐＫＫＪ１７および塩化セシウムで精製したオートグ ラファ・カリフォルニカ７　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（Ａ ｃＮＰＶ）ＤＮＡ　１　ｕｇを１０ｍＭ　グルコースおよび１２５ｍＭ　ＣａＣ ＋２　を含むＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水液（ｐＨ７，５）中に加えた。カルシウ ム−ＤＮＡ９体を４５分間で形成させてから、プレートに播種したての払江■江 肛勤細胞（１，５Ｘ１０”個細胞）に添加して、室温で１時間インキュベーショ ンした。ＤＮＡ沈澱物を除去し、新鮮培地（ＴＣｌｏｏ）を添加して、細胞変性 効果が認められるまで細胞を２０℃でインキュベーションした（トランスフェク ション後３日）、これらの細胞で産生されたウィルスは、野生型のＡｃＮＰＶと ＴＲＡＰを含む組換型ＡｃＮＰＶとの両者であった。力価測定後のプラーク精製 によって、純粋な組換型ウィルスが得られた。これは、野生型ＡｃＮＰＶは完全 なポリヘトリン遺伝子を持っているので封入されたプラークを形成したが、組換 型はこれを形成しなかった、という事実によっても確認できた。こういった２つ のタイプの差異は、光学顕微鏡でも認めることができた。

１回目のトランスフェクションの後、１つの組換型プラークが認められ、これを 精製した。塩化セシウム精製したウィルスＤＮＡを初期の段階で使用したところ 、２００個のプラークのうち約１個が組換型であった０組換型ウィルスはｖＫＫ Ｊ　１７と命名され、１９８９年７月１４日にＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（Ｅ　ＣＡ　Ｃ Ｃ、Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐ目ｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐ。

ｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＦ３　０Ｊ Ｇ、Ｕｎｉｔｅｄ　にｉｎｇｄｏａ＋］に寄託番号８９０７１４０２で寄託され た。

ＡｃＮＰＶは、バキュロウィルス科の原栄養株ウィルスである。このウィルスを Ｓｉ、ｆｒ■止肛白細胞にインフェクションしたとき、２つの型の子孫ウィルス 、すなわち、細胞外ウィルス粒子および封入ウィルス粒子が得られた。封入ウィ ルス粒子は、ポリヘトワンタンパクを含むタンパク様物質に包埋されている。光 学顕微鏡下では、これらは多角体として観察される。昆虫の幼虫への感染がこれ ら粒子の注入によって起きるので、これらのウィルス封入体は生活環の重要な一 部である。

組換型ウィルスのｖＫＫＪ　１７は、ポリヘトリン遺伝子を欠くので、封入粒子 を形成することができない、このポリヘトリン遺伝子は、ＴＲＰＡ遺伝子によっ て置換された。その結果として、ｖＫＫＪ　１７ウイルスは、組織培養システム （ＳＬ紅■江肛■）では感染性を保持しているが、昆虫の幼虫には感染できない 、ＴＲＰＡタンパクは、ポリヘトリンタンパクの調節下で発現する。これは、Ｔ ＲＰＡタンパクの合成が感染後２０時間で始まることを表している。ポリヘトリ ンタンパクは野生型ウィルスで最も多量に含まれるタンパクであって、通常、ポ リへドリンプロモーターによる発現により、外来遺伝子から目的とするタンパク が高レベルで産生する５ｖＫＫＪ１７では、ＴＲＰＡ配列は、すべてのポリヘト リンをコードする配列の全部を置換しているＢａｍＨＩ断片上にある。

バキュロウィルスは、ＤＮＡが環状構造をとる２本鎖ＤＮＡウィルスである。こ のＤＮＡの大きさは、１３５ｋｂである。

ＴＲＰＡの産生は、１に■ｎ二す細胞を組換型ウィルスｖＫＫＪ　１７に感染さ せ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタン法によって調べる 前に、この細胞を７２時間増殖させた。検出システムに使用した抗体は、β−ガ ラクトシダーゼ融合物質を用いて作製したウサギのポリクローナル抗体であった 。この組換型ウィルスは、実際に、この発明のＴＲＰＡポリペプチドを合成した 。さらに解析を進めると、この物質が培養上清中に分泌されることが判明した。

この特性は精製に役立った・ 感染を多発させる際に、血清含有培地で５ＬＬｌ」山細胞を培養し続ける必要は ない、この事実を利点として利用し、細胞のｖＫＫＪ　１７での感染を多発させ 、血清不存在下で７２時間２８℃でインキュベージジンした。感染細胞は、遠心 によって除いた（ベックマンＪＡ１０４に、４℃ｌＯ分間）。

ＴＲＡＰおよびウィルス粒子を含む清澄化上清を、（ＮＨ４）ＩＳＯ４沈澱とそ れに続く透析によって濃縮した。このウィルス粒子は遠心（ベックマンＪＡＩＯ ４Ｋ、４℃１０分間）によって除去した。この物質をイオン交換クロマトグラフ ィーにかけた（Ｍｏｎｏ　Ｑ、ファルマシア、ＬＫＢ）、ＴＲＡＰを含む画分は 、凍結乾燥によって濃縮した後、さらにゲル濾過（ＴＳＫ　Ｇ３００口、ファル マシア、ＬＫＢ）によって精製した。ＴＲＡＰの純度は３０％、おそらくは９０ ％を上回っており、一定量の分解が生じ、これが、推定量の不確実性を示す理由 である。

昆虫の細胞は、小胞体（ＥＲ）へタンパクを銹導する哺乳類のシグナル配列を認 識し、切断するようである。

また、昆虫細胞（陣工■ｍ＞でのグリコジル化の標的となる部位は、哺乳類細胞 でのものと同一であると思われる。昆虫細胞は、ガラクトーストランスフェラー ゼおよびシアル酸トランスフェラーゼを欠いているようであるので、複雑なオリ ゴ糖を生成し得ない、このため、Ｍａｎ＋＋　Ｇ　ｌ　ｃＮＡｃａ中心核につい たＮ結合の切り出しが生じる。しかし、これらの系でつくられる。インターロイ キン、インターフェロンなどのタンパクは、生物学的活性を示すことが指摘され てきた。この様式で産生されたＴＲＡＰは、会合して２量体および３量体になる とみられ、このポリペプチドがオリゴマー形態で作用を発揮することが考えられ る。

相補性の研究は、アミノ酸配列を規定するＤＮＡ塩基配列の可能な変異を検索す るために行った。オリゴヌクレオチドブライマーＡおよびＢを使って、ＰＣＲを 再び実施した。酵素反応の基質は、様々な地域での分離株から得られた全ゲノム ＤＮＡであった。増幅された物質は、配列決定のためのベクターＭ１３ｍｐ８（ アマジャム）のＳａｍＩ部位へのクローニングに先立って、上記と同様の方法で 処理した。セットになった一連のプライマーを用いて、ＫＩ　（Ｔ９／９６とは 異なったタイ産の分離株）からの完全な１．７ｋｂ挿入断片の配列を決定するこ とができた。第１表に示すごとく、式１の配列との相違点がいくつか見いだされ たが、保存領域はすべて変化なかった。１つずつの塩基の置換は、２２個のアミ ノ酸の置換を生じさせている。アミノ酸の変化につながらない単一の塩基置換が １つみられ、これによりシスティン残基が保持されている。この結果は、ＣＳタ ンパクの場合と同様、細胞の接着に関与するその他の抗原性の異なるタンパクで も得られた。

オリゴヌクレオチド配列 検出された配列 アミノ酸配列 ＤＮＡ塩基配列 ＴＲＡＰ アミノ酸配列 ＤＮＡ塩基配列 式２８ 式Ｉ （次頁に統く） 式！ （前頁より） ＵにＷｋｌｋｌ輩２ψ←（ （抄　訳）　添付書類Ｍ３ 微生物 明細書第８頁、第１７行に言及された微生物に関連するオプショナル用紙 Ａ、寄託の確認 他の寄託に関する確認が追加の用紙でなされている。

寄託機関名 ザ　ナショナル　コレクションズ　オブ　インダストリアルアンド　マリーン　 バクテリア　エルティーディー寄託機関の住所 トレイ　リサーチ　ステーション、ビーオー　ボックス３１、１３５アビ−ロー ド、アバディーン、ＡＢ９８ＤＧ　。

コナイテッド　キングダム 寄託臼 １９８９年７月１４日 寄託番号 ＭＣＩＭ８　４０１６４ Ｂ、追加指示 ヨーロッパ特許をめることの指定に当り、ヨーロッパ特許の公告、あるいは出願 が拒絶され、または取り下げられもしくは取り下げられたとみなされた日までは 、この寄託微生物のサンプルは、サンプルの要求者によって指名された専門家へ のサンプルの配給によってのみ利用可能となる。

（抄　訳）　添付書類Ｍ３ 微生物 明細書第８頁、第２３行に言及された微生物に関連するオプショナル用紙 Ａ、寄託の確認 他の寄託に関する確認が追加の用紙でなされている。

寄託機関名 ヨーロピアン　コレクション　オブ　アニマル　セルセンチャー（ＥＣＡＣＣ） 寄託機関の住所 パブリック　ヘルス　サービス　ラボラトリ−、センターフォー　アプライド　 マイクロバイオロジー　アンドリサーチ、ボートン　ダウン、サリスベリー、ウ ィルドジャー、ＳＰ４０ＪＧ　、ユナイテッド　キングダム寄託臼 １９８９年７月１４日 寄託番号 Ｂ、追加指示 ヨーロッパ特許をめることの指定に当り、ヨーロッパ特許の公告、あるいは出願 が拒絶され、または取り下げられもしくは取り下げられたとみなされた日までは 、この寄託微生物のサンプルは、サンプルの要求者によって指名された専門家へ のサンプルの配給によってのみ利用可能となる。

口　ＴＲＡＰとコー白３配り・ｊ 杉］　オマソへドゾン田【イ表）＋−？４１ｔｉノぐキュ０今イ、レスＤＮＡし ３ｐｕｃ６２　月 補正書の翻訳文提出古（特許法第１８４条の７第１項）平成３年２月１２日囁

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）式Ｉのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ｂ）ａ）と実質的に同じ構 造および生物学的活性を有するポリペプチド、 ｃ）上記ポリペプチドの生物学的活性に有意に関与する、 ａ）またはｂ）の断片、誘導体および突然変異体、および ｄ）有意な生物学的活性を有する、ａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴマー、 からなる群より選ばれたポリペプチド。
2. ２．先に規定するような保存配列を含む、請求項１のポリペプチド。
3. ３．アミノ酸残基の配列が、先に規定するような保存配列である、請求項１のポ リペプチド。
4. ４．アミノ酸残基の配列が、式Ｉの残基２４４ないし２９１の領域から選ばれる 、請求項１のポリペプチドの断片。
5. ５．アミノ酸の配列が、以下の群 ａ）ＷＤＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧＫＧＴＲＳＲＫＲ（残基２４７から２６６） ｂ）ＷＤＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧＫＧＴＲ（残基２４９から２６０） ｃ）ＥＷＳＰＣＳＶＴＣＧＫＧ （残基２５２から２６０） ｄ）ＰＣＳＶＴＣＧＫＧ （残基２５２から２６０） ｅ）ＷＳＰＣＳＶＴＣＧ （残基２５０から２５８） から選ばれる、請求項４の断片。
6. ６．基本的に、前記請求項のいずれか１項のポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列からなるＤＮＡ配列。
7. ７．基本的に、式Ｉの配列（ＫＩに関して第１表に示す差異の有無にかかわらず ）をコードするヌクレオチド、それによってコードされるポリペプチドを変化さ せない変異体またはそれらの断片もしくは突然変異体からなる、請求項６のＤＮ Ａ配列。
8. ８．請求項６または７のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
9. ９．分子の長さが約４．３８ｋｂのプラスミドであって、実質的には第２図よう な制限酵素エンドヌクレアーゼの切断地図で示される、請求項８のベクター。
10. １０．ｐＫＲ５である、請求項９のベクター。
11. １１．分子の長さが約１１．５ｋｂのプラスミドであって、実質的には第３図よ うな制限酸素エンドヌクレアーゼの切断地図で示される、請求項８のベクター。
12. １２．１９８９年７月１４日にＮａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｇへ寄 託番号ＮＣＩＭＢ４０，１６４で寄託されたブラスミドｐＫＫＪ１７である、請 求項１１のベクター。
13. １３．組換えウイルスまたはその変異体もしくは突然変異体である、請求項８の ベクター。
14. １４．上記ウイルスがバキュロウイルスである、請求項１３のベクター。
15. １５．上記ウイルスがオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ 　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスである、請求項１４のベクター 。
16. １６．上記ウイルスが、請求項１１または１２の他のベクターと結合しているオ ートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ ａ）核多角体病ウイルスである、請求項１５のベクター。
17. １７．ｖＫＫＪ１７またはその変異体もしくは突然変異体である、請求項１３な いし１６のいずれか１項のウイルスベクター。
18. １８．１９８９年７月１４日にＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）Ｐａｂｌｉｃ　Ｈｅ ａｌｔｈＳｅｒｒｉｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ，ＳＰ４　ＯＪＧ．Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎ ｇｄｏｍに寄託番号８９０７１４０２で寄託されたウイルスまたはその変異体も しくは突然変異体。
19. １９．請求項６または７のＤＮＡ配列の発現を可能とし、請求項８ないし１８の いずれか１項のベクターを含む宿主／ベクター系。
20. ２０．上記宿主がスボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕ ｇｉｐｅｒｄａ）種から選ばれる、請求項１９の宿主／ベクター系。
21. ２１．宿主／ベクター発現系で請求項６または７のＤＮＡ配列を発現させること を含む、請求項１ないし５のいずれか１項のポリペプチドの生産法。
22. ２２．請求項８ないし１８のいずれか１項の宿主／ベクター系を使用することを 含む、請求項２１の方法。
23. ２３．請求項１９または２０の宿主／ベクター系を使用することを含む、請求項 ２１の方法。
24. ２４．以下の工程、 ａ）請求項６または７のＤＮＡ配列を含むプラスミドを作製する工程、 ｂ）宿主に該配列からのＤＮＡおよびウイルスからのＤＮＡを同時にトランスフ ェクションする工程、ｃ）該ＤＮＡ配列を含む組換えウイルスを回収する工程を 含む、請求項１３ないし１８のいずれか１項のベクターの作製法。
25. ２５．上記プラスミドが請求項８ないし１２のいずれか１項のベクターである、 請求項２４の方法。
26. ２６．上記ウイルスがバキュロウイルスである、請求項２４または２５の方法。
27. ２７．上記ウイルスがオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ 　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスである、請求項２６の方法。
28. ２８．上記組換えウイルスがｖＫＫＪ１７またはその変異体もしくは突然変異体 である、請求項２７の方法。
29. ２９．上記宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆ ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）種に属するものである、請求項２４ないし２８のいずれか １項の方法。
30. ３０．請求項１ないし５のいずれか１項のポリペプチドに結合し得る抗体。
31. ３１．前記ポリペプチドの該エピトープに結合し得るバラトーブを有し、該エピ トープはこれらポリペプチドで保存されている請求項３０の抗体。
32. ３２．薬理学的に許容性のある担体中に、活性成分として請求項１ないし５のい ずれか１項のポリペプチドを含む免疫学的活性組成物。
33. ３３．マラリアに罹患しているか、またはそれによって危篤状態にある患者に治 療効果のある用量で請求項３７の組成物を投与することを含む、マラリアの予防 法または治療法。