JP3043063B2

JP3043063B2 - 微生物のための沈澱テスト

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Publication number: JP3043063B2
Application number: JP2507544A
Authority: JP
Inventors: ロバートエヌジュニアウォード; ジョンピーデスロシア; エリオットディーザサードマーシャル; ジュディースフォード; ナンシージェイエスマリナク
Original assignee: バイオコントロールシステムズインコーポレイテッド
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 2000-05-22
Anticipated expiration: 2015-05-22
Also published as: US5403721A; CA2062753C; JPH04504802A; DE69020555D1; DE69020555T2; WO1990012888A1; CA2062753A1; EP0470172B1; AU639237B2; EP0470172A1; AU5655290A

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は、特定の酵素の存在により特徴ずけられる特
定の微生物または微生物群用の改良アッセイ法に関する
ものである。このアッセイは、ポリマーマトリックス内
にあるまたは固体担体表面上にある色素形成性基質を使
用する。該色素は該酵素により開裂された際に沈澱す
る。本発明は、更に色素形成性基質、ポリマー系および
固体担体を含む酵素検知デバイスをも包含する。

発明の背景ヒト胃腸管疾患は様々な微生物に起因して起こる。感
染の共通の媒介物は汚染された食物および水である。こ
のような疾病の発生率を減ずるために、ヒトが消費する
ための食物および水の衛生上の品位が継続的にテストさ
れる。多数の異なる腸内病原体のテストに代わる、指標
生物の存在に対する実験室テスト法がある。大腸菌型の
細菌が、典型的には衛生上の品位の主な指標とし使用さ
れる。というのは、これらが温血動物の胃腸管に通常関
連しているからである。大腸菌型の細菌、特にエシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli）の食品中における高率で
の存在は排泄物汚染があることを示唆し、かつヒトが消
費するには不適当であることを示している。

大腸菌型の細菌は、ラクト−スを醗酵して酸性かつガ
ス状の最終生成物（CO₂およびH₂）にするその能力のた
めに、他の微生物および腸内細菌科のその類縁菌と区別
される。いくつかの非大腸菌型細菌はラクト−スを同一
の最終生成物に醗酵し得るが、大腸菌アッセイにおける
これら微生物の生育は、テストに使用した微生物学的培
地の選択性のために、通常最小化もしくは防止される。

典型的には、サンプル中の大腸菌型の細菌の存在は液
状の微生物学的育成培地に物質を添加し、得られる混合
物を細菌の生育を助長する温度でインキュベ−トするこ
とにより決定される。サンプルと育成培地との混合物の
インキュベ−トは重要である。というのは、このアッセ
イが該サンプルの低濃度の大腸菌型細菌による汚染を検
出し得る必要があるからである。該混合物のインキュベ
−トの結果、大腸菌型細菌は培養物1ml当たり約10⁶〜10
⁸細胞なる密度にまで増殖され、ここで該細菌の存在は
多数の方法の何れかにより検出し得る。大腸菌型細菌の
検出に使用されている様々な液体微生物学的生育培地は
２つの共通する性質を有している。即ち、これらは二単
糖ラクト−スを含み、かつ非大腸菌型微生物の生育を選
択的に阻害する化学試薬を含む。選択は重要である。と
いうのは、サンプルが必ず様々な微生物を含んでおり、
また該アッセイの成功は非大腸菌型の細菌により過度の
成長が抑制されていることに依存するからである。

大腸菌アッセイは固体または液体培地の何れかを使用
して実施できる。固体培地を使用するアッセイは生菌数
の計数を可能とする。サンプルを固体培地に添加し、大
腸菌の明確なコロニ−を計数する。また、サンプルを液
状培地に添加することもできる。大腸菌群は特徴的な代
謝最終生成物の形成を通して検出される。この液体培地
形式は定性的または定量的の何れであってもよい。該固
体培地形式は、少量（例えば、1ml当たり10微生物未
満）の大腸菌群を含むサンプルまたはコロニ−の可視化
を不明確にする粒状物質（例えば、食物または乳製品）
を含むサンプルに対して好ましい。

ブロスまたは寒天中での大腸菌群のアッセイは２つの
別々の段階、即ち推定的（presumptive）および確認的
（confirmed）段階で行われる。まず、推定的アッセイ
は考えられる大腸菌群の存在の指標を与える。該確認段
階では、推定的に正の培養物または典型的なコロニ−を
第二のより選択的な培地で継代培養する。原理的には、
確認的培地は誤った正の結果を排除する。このアッセイ
の該２段階は完了までに48〜96時間を要する。従って、
当分野では時宜にかなった方法で、正確な結果を得るこ
とが要求されている。

一般に、検出は大腸菌型細菌の代謝経路の最終生成物
にもとずいている。例えば、大腸菌型細菌の酸の生成
は、一般に培地中にpH指示薬を配合することにより検出
している。酸の生成は液状培地、例えばクラ−クス（Cl
arke's）培地内のブロモクレゾ−ルパ−プル指示薬の紫
から黄色への色の変化により検出できる。酸産生はコロ
ニ−の形成により検出し得、該コロニ−の中央部は固体
培地、例えばバイオレットレッド胆汁寒天培地（VRBA）
およびマッコンキ−（MacConkey）寒天培地中の指示薬
ニュ−トラルレッドと該酸との反応により暗色となって
いる。

更に、ガス状最終生成物は通常液状培地中での気泡の
存在により検出される。この気泡は培養チュ−ブ内の小
さな倒立させた試験管または倒立させたバイアルもしく
は培養装置の特定の部分に捕集することができる。例え
ば、バイオコントロ−ルコリトラック（BioControl Col
iTrak^TM）製品は培養装置の頂部に取りつけられたド−
ム内に気泡を捕集する。固体育成培地を含むペトリフィ
ルム（Petrifilm^TM;3M）は細菌コロニ−の近接部分の気
泡を捕集する。あるいはまた、ガス状最終生成物は、水
素の電気化学的検出、放射性標識ラクト−スの醗酵によ
り遊離される¹⁴CO₂の放射能検出、あるいは醗酵を通し
て生成される有機化合物のインピ−ダンス測定（impedi
metric）またはガスクロマトグラフィ−検出などの非可
視的手段により検出することも可能である。

大腸菌群のもう一つの検出法は、代謝最終生成物では
なくむしろ大腸菌群関連酵素活性の検出にもとずくもの
である。一般に、酵素アッセイ法は時間のかかる培養テ
スト手法を利用した確認的結果に匹敵する大腸菌型細菌
の定量的評価を与え得る。酵素、β−ガラクトシダ−ゼ
はラクト−スの醗酵に利用される細菌酵素である。β−
ガラクトシダ−ゼはラクト−スを加水分解し、その構成
糖をグルコ−スとガラクト−スに分解する。大腸菌型細
菌は典型的にこの酵素を表現する。例えば、ワ−レン
（Warren）等のAppl.Environ.Microbiol.,1978,35,pp.1
36−41は大腸菌群のテスト法に係わり、該方法は水中に
おける排泄物大腸菌群を定量するために色素産生β−ガ
ラクトシダ−ゼ基質、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ONPG）を使用している。ワ−レン（Warre
n）等の文献において、黄色の反応生成物ｏ−ニトロフ
ェノ−ル（ONP）の出現はテストサンプル中の大腸菌群
の初期濃度の逆数に関連している。

製品、コリラ−ト（Colilert ^TM）（アクセスメディ
カル（Access Medical））では飲料水中の大腸菌群の検
出にONPG酵素指示薬を使用している。水のサンプルはON
PGを含有する基本生育培地を可溶化するために使用され
る。培地中で生育する細菌起原のβ−ガラクトシダ−ゼ
はONPGを加水分解して、ガラクト−スを生成し、これは
生育用の唯一の炭素源およびエネルギー源として機能す
る。ON生成は酵素活性を示す。24時間のインキュベ−ト
後の、10mlの液体培地全体に渡る黄色の存在は該水サン
プル中に大腸菌型細菌が存在することを示す。

螢光発生β−ガラクトシダ−ゼ基質、フルオレセイン
−β−Ｄ−ガラクトシドはもう一つの活性測定用の指示
薬である。カンデル（Cundell）等はProc.Water Reuse
Symp.,1979,３,pp.1895−99において、該フルオレセイ
ン−β−Ｄ−ガラクトシドを含む培地中で大腸菌型細菌
をインキュベ−トするアッセイを提示している。大腸菌
型細菌はフロ−サイトメトリ−により定量的に測定され
る。該基質のフルオレセイン部分はβ−ガラクトシダ−
ゼによる開裂の後に該細胞内に濃縮され、紫外線の照射
下で該細胞に螢光を発せしめる。米国特許第4,242,447
号は螢光発生基質を使用した大腸菌群の評価用の螢光ア
ッセイを開示している。特に、該米国特許第4,242,447
号は、水サンプルと螢光発生基質とを油と共に乳化し
て、大腸菌型細菌含有油滴を形成する方法を開示してい
る。β−ガラクトシダ−ゼ活性は該螢光発生基質を開裂
し、螢光検出器により計数し得る螢光性油滴を形成す
る。カンデル（Cundell）等はDev.Ind.Microbiol.,197
9,20,pp.571−77において、顕微鏡スライド上に油−包
封細胞を生成する同様な技術を開示している。螢光性液
滴は螢光顕微鏡下で計数される。このカンデルの方法は
下水サンプルに対して利用されている。このカンデル法
の感度は10⁵細胞/mlである。

細菌E.コリは、大腸菌型細菌とは別にアッセイし得る
一種の大腸菌である。存在するE.コリは排泄物汚染のよ
り信頼性の高い指標と考えられる。また、ある種のE.コ
リ菌株はヒトおよび動物の病原体である。標準的なE.コ
リ検出法ではECブロス中で正の推定的培養物を継代培養
し、45.5℃にてインキュベ−トする。ガス発生が正のEC
培養物を、次に識別寒天培地上で画線培養する。単離体
を生化学的特性化により同定する。

E.コリは酵素β−グルクロニダ−ゼを有することか
ら、比較的特殊な微生物である。結局、螢光発生基質は
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グロクロニド
（MUG）が食品および水サンプル中のE.コリの検出に使
用される。このE.コリ検出法は、培養物を植えつけ、MU
Gの存在下に標準的方法でインキュベ−トすることから
なる。24時間のインキュベ−ト中に発生する螢光はE.コ
リの存在を示す。というのは、E.コリからのβ−グルク
ロニダ−ゼがMUGを螢光性生成物に開裂するからであ
る。かくして、このMUG含有培地の使用はE.コリの検出
時間を短縮することを可能とする。不幸にも、MUGは高
価な試薬であり、また大容量のサンプル、例えば水のサ
ンプルは大量のMUGの使用を必要とし、このテストを著
しく高価なものとする。一般に推奨されるMUGの濃度は
最終培養物1ml当たり50−100μｇである。食品および水
質テストのための典型的な容量はそれぞれ90および100m
lである。かくして、MUGの価格は食品テストおよびPA型
の水質テストのためには魅力のないものとしている。

それぞれ大腸菌群およびE.コリの存在を測定するため
の手段として、β−ガラクトシダ−ゼおよびβ−グルク
ロニダ−ゼ活性をアッセイすることができる。酵素検出
アッセイは醗酵最終生成物の検出に勝る利点を有する。
まず、酵素アッセイ法はより感度が高い。１つの酵素が
多くの基質分子を開裂する。１つの酵素により開裂され
る基質の各分子は螢光性または着色されたリポ−タ生成
物を生成する。従って、この信号は酵素により増幅され
る。ある種の基質を使用することにより、10⁴程度の代
謝活性細胞が24時間以内に信号を成形できる。

これとは対照的に、24時間以内に可視性の気泡を形成
するには約10⁷〜10⁸個の代謝活性細胞を必要とする。と
いうのは、ラクト−スのβ−ガラクトシダ−ゼ開裂は、
代謝の生理的調節による化学量論的な量の酸およびガス
状最終生成物を生じないからである。該ラクト−ス中の
炭素の大部分は細胞バイオマス中に組み込まれ、醗酵中
の酸化NADの再生には利用されない。酸およびガス産生
の細菌起原の醗酵酵素は該醗酵過程の最終段階にあり、
厳密に調節されている。例えば、ピルベ−ト・フォルメ
−トリア−ゼは好気的条件下では不活性であり、培地が
嫌気性となった時にのみ活性化される。ガス産生におけ
るキ−酵素であるフォルメ−トデヒドロゲナ−ゼは酸素
の存在下では、あるいは培地のpHが６以上である場合に
は合成されない。ヒドロゲナ−ゼ活性および合成は別の
酸化剤、例えば酸素、硝酸塩および亜硝酸塩により受動
的に調節される。従って、嫌気生活、酸性pHおよび外部
酸化剤のない生育条件は、達成されないか、あるいはゆ
っくりと達成されるに過ぎない。更に、培地中の多くの
ラクト−スが、酸−およびガス−産生酵素が活性となる
時点で開裂される。従って、β−ガラクトシダ−ゼ用の
酵素アッセイは醗酵経路の調節の問題を回避し、各基質
開裂の発生毎にリポ−タ基を生成する。

大腸菌群に属する属の嫌気性菌株の存在は、ガス検出
アッセイ手順を更に複雑にする。これらの菌株はβ−ガ
ラクトシダ−ゼ活性を有するが、ラクト−スからガスを
生成しない。従って、β−ガラクトシダ−ゼ活性測定ア
ッセイのみがこの大腸菌群の嫌気性菌株を検出し得る。

24時間以内のインキュベ−トにより大腸菌−関連酵素
を検出することが可能である。β−ガラクトシダ−ゼお
よびβ−グルクロニダ−ゼアッセイの結果は、大腸菌群
およびE.コリの確認的存在と相関関係をもつ。24時間酵
素アッセイ−正の大腸菌群培養物のアリコ−トを別の培
地、例えばエオシンメチレンブル−寒天およびインキュ
ベ−トした寒天上で画線培養した場合、典型的な大腸菌
およびE.コリのコロニ−は殆ど常に回収される。大腸菌
属の菌はβ−ガラクトシダ−ゼ−正の培養物からの系統
的に同定されたコロニ−である。E.コリはβ−グルクロ
ニダ−ゼ−正の培養物からの系統的に同定された微生物
である。これらの観測は、該標準的な大腸菌アッセイの
第一インキュベ−ト段階（推定的）が48時間から24時間
に短縮されること、および第二のインキュベ−ト段階
（確認的）が不要であることを示している。結局、大腸
菌群およびE.コリ用の酵素アッセイは確認上の結果を得
るに要する時間を72時間程度減少することを可能とし、
同時により一層改良された感度を与えることを可能とす
る。

食品および乳製品のサンプルには、大腸菌群の検出の
問題が付きまとう。大量の食品が供給されており、その
いくつかの物理／化学的性質は酸性のまたはガス状の最
終生成部の検出あるいはある種の酵素アッセイを困難に
する。例えば、脱脂粉乳などの食品サンプルによる濁度
のために、気泡をブロス内で検出することは困難であ
る。乾燥チ−ズ、チリ粉末または緑色もしくは黄色の野
菜などの食物製品に関連する色は、基質としてONPGを使
用するβ−ガラクトシダ−ゼアッセイにおけるONPなど
の着色されたリポ−タもしくはpH指示薬の色を不明瞭に
する。更に、食品は本来的に酸性であり得、あるいはサ
ンプルの調製中に気泡を内部に取り込む可能性がある。
最後に、食品の化学的特性はアッセイを妨害する可能性
がある。食品は培養ブロスに追加の栄養分を与え、これ
ら栄養分は非大腸菌型細胞により代謝されて、ガス状の
あるいは酸性の最終生成物を形成して、誤った正の結果
に導く可能性がある。例えば、ケ−キミックスまたは他
の甘味を付与した製品はかなりの量の二単糖類および単
糖類を含み、これらは非大腸菌群により酸および／また
はガスに転化される。

大腸菌型細菌およびE.コリ用のβ−ガラクトシダ−ゼ
およびβ−グルクロニダ−ゼアッセイ用の基質を適当に
選択することは重要である。例えば、β−ガラクトシダ
−ゼは基質ONPGを開裂して黄色の生成物ONPを生成す
る。しかしながら、食物製品に固有のあるいはこれに添
加されたある種の色は該ONPリポ−タ生成物の黄色を不
明瞭にする。この黄色を不明瞭にする可能性のある食物
製品には、赤身肉のヘモグロビン、葉菜および植物のク
ロロフィル、果実および植物中のβ−カロテンおよび他
の黄色およびオレンジ色の色素、香辛料中の天然色素、
並びに天然および人工着色料などが含まれる。濁った水
および高い有機質含有量を有する水も淡黄色の正のONP
反応を不明瞭にする。更に、標準的な微生物学的育成培
地成分、例えば蛋白またはイ−スト水解物などは該培地
に黄色または金色を付与しONPの存在を不明瞭にする可
能性がある。例えば、標準的な方法の大腸菌用培地、ラ
ウリル硫酸トリプト−ス（LST）ブロスは黄金色の色調
を有する。LSTブロス中および他の補充培地中でONPG−
型の酵素アッセイを実施した結果、夥しい数の誤った負
の結果が得られた。

ONPGの使用に関連した付随的な問題は該ONP関連生成
物の有害な性質である。ONPは揮発正の化合物であり、
公知の呼吸系、眼および皮膚の刺激物である。ONPの存
在は培養物の取り扱いに関連する能率およびガラス器具
の洗浄を研究者にとって有害なものとする。また、ONP
の使用は、有害な廃物の投棄に係わる問題をも生ずる。

同様に、β−グルクロニダ−ゼアッセイはMUGを使用
し、これは螢光信号を発生する。食品に関連する色素は
該螢光信号を減衰することが観測されている。例えば、
チリ粉末中の色素はリポ−タ生成物の螢光反応を不明瞭
にする。MUGに係わるさらなる問題は、最大の螢光を与
えるpH範囲がラクト−ス醗酵の際に達成されるpH範囲外
にあることである。MUGはpH10以上で最大の螢光を与え
る。また、ラクト−ス醗酵で生成する酸類は典型的に該
大腸菌培地のpHを５〜６に低下し、これは螢光反応を不
明瞭にする。最後に、既に述べたように、発色性物質を
使用するβ−グルクロニダ−ゼアッセイは、いくつかの
型のサンプルによる妨害を被る。従って、β−グルクロ
ニダ−ゼのための通常の酵素アッセイは食品サンプルに
起因するpHおよび妨害の問題を有し、ある種の食品に対
して使用するには不適当である。

螢光発生物質、例えばMUGは食品サンプル中のE.コリ
の検出用の寒天に使用されてきた。この螢光開裂生成
物、４−メチルウンベリフェロン、は可溶性で、かつE.
コリから寒天（固体培地）中に拡散して、どのコロニ−
が酵素β−グルクロニダ−ゼを含み、どのコロニ−がこ
れを含まないかを決定することを困難にしている。

もう一つの煩雑さは、異なる型のサンプル用の培養用
ブロスの最終体積が1ml〜１の範囲で変動することに
ある。各テストに対して、培地中の該発色性または螢光
性基質のモル濃度は一定である必要がある。このため
に、高価なテスト試薬が大量に消費される。食品加工業
者にとっては、全ての大腸菌群のテストが単一のアッセ
イで実施でき、全てのテストサンプルにまたがる結果
を、その大きさとは無関係に容易に読み取ることがで
き、かつテスト試薬を経済的なものとすることが有利で
あろう。

典型的な食品加工業者または水処理施設は搬入される
および搬出される食品、処理水、排水または環境サンプ
ルをテストする。従って、ONPG−またはMUG−にもとず
く合アッセイは、ある型のサンプルのみに対して妥当で
あるにすぎない。かくして、種々のサンプル、例えば食
品、濁ったおよび／または着色した水および環境サンプ
ルに対して有効なかつ関連する種々のテスト法に伴う諸
欠点を解消し得るアッセイに対する需要がある。

インジゴ形成性（indigogenic）基質、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（Χ−Gal）がβ−ガラクトシダ−ゼ活性を発現するE.
コリコロニ−の検出用の固体培地として使用されてい
る。β−ガラクトシドはΧ−Galをガラクト−スとイン
ドリル誘導体とに開裂する。このインドリル誘導体は二
量体化して、強い青色を呈する置換インジゴを形成す
る。

フランプトン（Frampton）等はJ.Food Prot.,1988,5
1,pp.402−04において、人為的に菌を植えつけた生の鶏
肉ミンチ中のE.コリを他の細菌コロニ−から識別するた
めに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニダ−ゼ（Χ−Gluc）を補充したペプトン
−タ−ジト−ル（tergitol）寒天を開示している。レイ
（Ley）等は、Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.,Abstract Q
35:288,1988において、グリセロ−ル培地および３−イ
ンドリル−β−Ｄ−グルクロニド基質を用いる膜濾過技
術を利用した、水および下水中のE.コリを計数する方法
を開示している。E.コリコロニ−は半固体培地において
青色に見える。ワトキンス（Watkins）等は、Appl.Envi
ron.Microbiol.,1988,54,pp.1874−75において、貝中お
よび排水中のE.コリの検出のためにＸ−Glucを使用した
ポアプレ−ト（pour plate）法を開示している。

製品ペトリフィルム（Petrifilm^TM）（3M）はE.コリ
の検出のために固体培地とＸ−Glucとを使用している。
E.コリコロニ−は青色になる。

インド−ル生成化合物、Ｘ−GalおよびＸ−Glucが高
価であるために、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グル
クロニダーゼ活性の検出のために広範には利用されてお
らず、しかも比較的少量の体積で使用されている。従っ
て、当分野では、食品および水質のテストに対して、経
済的に少量のＸ−GalおよびＸ−Glucを使用することを
可能とするβ−ガラクトシダーゼテスト系に対する需要
がある。というのは、強い青色がONPの黄色および他の
着色リポ−タに係わる問題の多くを解決するからであ
る。

概して、当分野では、酵素アッセイに関連する感度お
よび速度を改良し、嫌気性大腸菌の検出を可能とし、食
品、水および環境サンプルに首尾よく適用でき、取り扱
いおよび投棄の安全性を与え、かつ高価なテスト試薬の
消費量の点での経済性をもたらす大腸菌検出アッセイに
対する需要がある。

発明の概要本発明は、特定の微生物および／または微生物群のア
ッセイに有用な、該特定の微生物および／または微生物
群に関連する酵素のアッセイ法並びに酵素指示デバイス
を包含する。一局面においては、本発明の方法は、サン
プルおよび酵素指示デバイスを育成培地に添加し、許容
される温度の下でインキュベ−トし、該酵素指示デバイ
ス上の結果を読み取ることを含む。好ましくは、該生育
培地は液体である。もう一つの方法は、生育培地にサン
プルを添加し、該サンプルおよび生育培地を、微生物の
育成に許容される温度の下で、該育成培地内で微生物の
成長の痕跡がみられるまでインキュベ−トし、酵素指示
デバイスを該育成培地に添加し（ここで、該酵素指示デ
バイスは固定担体上のポリマー系に色素−形成性または
螢光発生基質を含み、あるいは固体担体上で乾燥された
色素−形成性または螢光発生基質を含み、かつ該色素形
成性基質は酵素により開裂されて着色沈澱を形成もしく
は螢光を発生する）、該サンプル、生育培地および酵素
指示デバイスを許容温度にて、酸化性環境で約１〜48時
間インキュベ−トし、該酵素指示デバイス上での色の変
化または螢光反応により、該特定の微生物または微生物
群の存在を視覚的に検出することを含む。好ましくは、
酸化剤を該酵素指示デバイスと共に該育成培地に添加す
る。本発明の酵素指示デバイスは、好ましくはポリマー
系に色素−形成性または螢光発生基質を含むものであ
る。また、該酵素指示デバイスは、固体担体の表面に付
着された色素−形成性または螢光発生基質を含むもので
ある。より詳しくいえば、該酵素指示デバイスは、更に
固体担体成分をも含み、ここで該ポリマー系中の色素−
形成性または螢光発生基質は該固体担体系の表面上に層
状に適用されている。該固体担体は液体の表面に浮遊し
ていて、とりたてて酸化剤を使用しなくとも酸化性環境
として空気を利用し得るようにすることが好ましい。

本発明のもう一つの局面では、特定の微生物または微
生物群に関連する酵素のアッセイ法が提供され、該方法
はサンプルを育成培地に添加し、ポリマー系内の色素−
形成性基質を添加し（ここで、該色素−形成性基質は該
酵素により開裂された場合に、該ポリマーと結合して沈
澱を形成する）、該ポリマー中の該色素−形成性基質を
該サンプルおよび該育成培地と接触させ、該サンプル、
育成培地および該ポリマー中の該色素−形成性基質を、
特定の微生物または微生物群の生育に許容される温度の
下でインキュベ−トし、該ポリマーと結合し、かつ着色
された沈澱の存在を検出することを含む。

該色素−形成性基質は酵素作用により開裂された場合
に不溶性の沈澱を生成する。好ましくは、該色素−形成
性基質は以下の式で示される置換インジゴ誘導体であ
る。

ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該ハ
ロゲン原子は、塩素、臭素または沃素である。R₁、R₂お
よびR₃が全てＨである場合、生成される色素沈澱はイン
ジゴである。

該色素−形成性基質は水性系に対して不溶であり、生
育培地に暴露された場合に該ポリマーから該色素−形成
性基質が滲出されるのを防止し、もしくは該固体担体の
表面に出て来るのを防止することが好ましい。このよう
にして、各テストに必要とされる色素−形成性基質の量
を減じることにより、経費を維持することが可能であ
る。従って、使用する色素−形成性基質の量はテストの
規模またはサンプルの大きさには無関係である。更に、
特定の微生物または微生物群の酵素アッセイによる分析
は、従来の生育法と比較して、より一層迅速かつ高感度
なアッセイ系および純粋な培養検出法が提供される。

本発明の方法および本発明の酵素指示デバイスの使用
の利点は、該色素−形成性基質を、溶液全体に渡り分散
させるというよりも、画成された反応表面上で有効利用
することを可能とする。該反応表面は固体担体部材また
はポリマーマトリックスの表面である。その結果培養物
の容積とは無関係のアッセイが与えられ、かくして試薬
消費の経済性が導かれる。第二に、インジゴ生成基質か
らの該不溶性インジゴ色素−形成性基質の色は青乃至紫
の範囲にあり、この色は食品またはある種の水に関連す
る顔料もしくは濁りにより隠蔽もしくは減衰されること
はない。かくして、該インジゴ生成基質は食品および水
サンプル両者の大腸菌型細菌の検出を可能とする。第三
に、このインジゴ生成性基質は、酵素アッセイに関連す
る速度および感度をもたらす。第四に、β−ガラクトシ
ダ−ゼアッセイはラクト−ス醗酵経路の下方部分での酵
素調節に関連する問題を排除する。第五に、酵素アッセ
イは、該酵素が色素−形成性基質の加水分解を実施した
時点毎に、ガラクトシド部分のみの開裂が終了する該経
路の終端においてではなく、該経路の第一段階において
信号を発生する。

本発明のもう一つの局面では、特定の微生物および微
生物群に関連した酵素のアッセイは、（ａ）液状生育培
地にサンプルを添加し；（ｂ）画成された反応表面上に
色素−形成性または螢光発生基質を添加し、ここで該基
質は該酵素により開裂された場合に沈澱または螢光性副
生成物を形成し；（ｃ）該サンプル、生育培地および基
質を該特定の微生物および微生物群の生育に許容される
温度にてインキュベ−トし；（ｄ）該画成された反応表
面上または回りの培地中における着色された沈澱の存在
または螢光の存在により、該特定の微生物および微生物
群の存在を検出する各工程を含む。好ましい態様におい
て、該螢光発生基質は４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−グルクロニドである。

図面の簡単な説明添付図は、ブロモクロロインジゴを生成するための、
ブロモクロロインドリルガラクトシド（Ｘ−Gal）の加
水分解の反応経路を示すものである。ブロモクロロイン
ドリルガラクトシドは、まず該特定の微生物または微生
物群由来のβ−ガラクトシダ−ゼにより開裂されてガラ
クト−ス基が除去され、かつブロモクロロインドキシル
を生成し、これは酸化反応により二量化されて、高度に
着色された青緑色の沈澱、ブロモクロロインジゴとな
る。酸化は、溶液中の酸化剤によりまたはブロモクロロ
インドキシルの空気への暴露により行うことができる。

発明の詳細な説明本発明は、特定の微生物および／または微生物群に関
連する酵素の検定法に関する。好ましくは、該特定の微
生物はE.コリであり、かつ該微生物群は大腸菌型細菌で
ある。該酵素β−ガラクトシダ−ゼは該大腸菌型細菌に
特徴的なものであり、またβ−グルクロニダ−ゼ活性は
E.コリに特徴的なものである。該色素−形成性基質は、
好ましくはポリマー系に混合され、かつ酵素により開裂
された場合には不溶性の沈澱を形成する。また、該色素
−形成性基質は固体担体部材に付着させることも可能で
あり、該担体部材も該不溶性の沈澱を形成するための表
面であり得る。好ましくは、該色素−形成性基質は水性
液体、例えば生育培地に不溶性であって、該生育培地全
体に渡り該色素−形成性基質が分散するのを防止し、代
わりに該ポリマー系または該固体担体部材の表面に該色
素−形成性基質を集中させる。

該色素−形成性基質の、高度に着色された沈澱の生成
反応は、糖基を開裂するための特定の酵素および該開裂
された色素−形成性基質から高度に着色された二量体の
沈澱を形成するための酸化性環境を必要とする。該酸化
性環境は該ポリマー中の色素−形成性基質を空気に暴露
させるか、あるいは該生育培地に酸化剤を添加すること
により生成することができる。酸化剤の例は、過酸化水
素、NO₃ ^-、Fe³⁺、Ag⁺、ピロガロ−ル、Cu⁺などを包含す
る。最も好ましくは、該酸化剤は0.10よりも大きな酸化
還元電位を有し、かつ生育中の微生物に対して有害作用
を回避し得る濃度で使用される。

該色素−形成性基質は、好ましくは以下の式で示され
る置換インジゴ誘導体である。

ここで、各Ｒはハロゲンまたは水素原子である。該糖
基は任意の単糖類、その誘導体、またはアルデヒド酸で
ある。好ましくは、該糖基はガラクトシドまたはグルコ
シドであり、該アルデヒド酸はグルクロン酸である。最
も好ましくは、該糖またはアルデヒド酸はβ−結合によ
り酸素に結合している。該置換インジゴ色素の例は、ガ
ラクト−スおよびグルクロン酸とβ−Ｄ結合している３
−インドリル−、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−、５−ブロモ−３−インドリル−、５−ブロモ−
６−クロロ−３−インドリル−、および５−アイオド−
３−インドリル−誘導体を含む。該基質は無色である
が、適当な酵素により加水分解された場合には、該基質
のインドキシルまたは置換インドキシル部分が酸化され
て、例えば添付図に示したように、強く着色された不溶
性のインジゴ沈澱またはインジゴ誘導体を形成する。該
二量化反応は酸化性の環境を必要とする。更に、酵素に
よる開裂後に有色の不溶性生成物を形成する非インジゴ
生成β−糖基質は本発明の方法および発明の酵素指示デ
バイスに使用することができる。

別の態様において、特定の微生物または微生物群の培
養物は育成培地で生育でき、もしくは特定の微生物また
は微生物群に対して推定的に正の結果を与えた。特定の
微生物または微生物群に関連する特定の酵素のアッセイ
のための本発明の酵素指示デバイスは育成培地でサンプ
ルを生育した後、該育成培地中に添加することができ
る。例えば、色素−形成性基質はポリマー系と混合で
き、次いで固体担体の頂部で層に形成し得る。あるい
は、該色素−形成性基質は固体担体部材の表面上に付着
させることもできる。該固体担体は、これを液体育成培
地の表面上に維持すべく浮遊性のプラスチックであるこ
とが好ましい。また、色素−形成性基質はポリマー材
料、例えばラテックスと混合して全体に渡り該色素−形
成性基質を含むマトリックスを形成することも可能であ
る。該色素−形成性基質を含むラテックス製マトリック
スは液体育成培地中に落とし込むか、あるいは該液体育
成培地の表面上に懸垂させることができる。

該色素−形成性基質が空気と接していない場合には、
該色素−形成性基質と共にあるいはその添加の直ぐ後
に、該育成培地に発色溶液を添加すべきである。該発色
溶液は酸化剤、例えば過酸化水素、Ag⁺、Hg⁺⁺、I₃ ^-、IO
₄ ^-、過硫酸、Pd⁺⁺、ニトロベンゼン類、アゾベンゼン
類、キノン類、２−クロロ−２−ニトロ−プロパン、K₃
Fe（CN）_６、インドロン類、およびｐ−ヒドロキシメル
カリベンゾエ−ト（ｐ−hydroxymercaribenzoate）など
を含む。好ましくは、更に該発色溶液は沈澱促進剤およ
び細胞浸透剤をも含む。該細胞浸透剤はインジゴ発生基
質の該細胞内への侵入を容易にして、迅速な該基質の再
編成およびより迅速な該細胞からの該インドキシルまた
はインジゴの分泌をもたらす。細胞浸透剤の例は、トル
エン、アニオン性および非イオン性洗浄剤、およびセチ
ルトリメチルアンモニウムブロミドを包含する。該沈澱
促進剤は生成した沈澱の固体担体および／またはポリマ
ーマトリックスからの移動の防止を助長する。沈澱促進
剤の一例はアルカリ性洗浄剤の混合物、例えば濃度0.1
％〜1.0％でpHが8.0〜10.0のドデシル硫酸ナトリウムで
ある。この沈澱促進剤は濁りまたは強い発色反応の停止
作用を示す育成培地で使用することが好ましい。

本発明の酵素指示デバイスは色素−形成性基質、例え
ばＸ−Galを溶媒、例えばジメチルフォルムアミド（DM
F）、メチルセロソルブ（２−メトキシエタノ−ル）、
またはDMSOに溶解し、次いで液状ポリマー系、例えばラ
テックスと混合することにより製造し得る。乾燥して固
体または半固体状態に転化し得る他の接着型ポリマー
は、例えばエチレンビニルアセテ−ト（EVA）、ポリビ
ニルアルコ−ル（PVA）、およびポリビニルピロリドン
（PVP）を包含する。EVAは塩化メチレンに可溶性のポリ
マーである。また、溶媒、例えば塩化メチレン中で液化
し得るポリマー系は該色素−形成性基質と混合すべき該
接着型のポリマーを液化するのに有用である。色素−形
成性基質とポリマーとの混合物は乾燥して固体または柔
軟な固体に成形する。好ましくは、極めて粘稠な状態に
ある該液状の色素−形成性基質とポリマーは固体担体の
表面上に層状に成形し得る。最も好ましくは、固体担体
は液体表面上で浮遊し得る多孔性のプラスチック材料製
のものである。

更に、溶媒中の該色素−形成性基質は、直接固体担体
部材の表面に添加し、乾燥（溶媒の蒸発）することがで
きる。また、該色素−形成性基質は溶媒、例えばDMFか
ら、試薬例えば塩化メチレンを加えることにより沈澱さ
せることができ、この場合該色素−形成性基質は不溶性
である。次いで、該沈澱は直接固体担体部材上に層状に
形成される。

色素−形成性基質の濃度は、与えられた表面積および
該反応容積で可視的応答を与えるのに十分な値である。
例えば、孔径70μで、径1/2インチかつ厚み1/16インチ
のポリエチレン製円形固体担体部材上のＸ−Galの濃度
は約50μｇ〜約1mgの範囲内である。

該固体担体は液体の表面上で浮遊でき、該液体表面の
下方に維持されてもよく、あるいは例えば培養物容器ま
たは培養物容器のクロ−ジャ−に物理的に取りつけるこ
とにより、液状育成培地の表面近傍に機械的に配置する
ことも可能である。該固体支持体を該液体−気体界面に
もしくはその近傍に配置することにより、空気中の酸素
の極近傍に位置させてインドキシルのインジゴへの酸化
を容易にし、結果として該アッセイの速度並びに感度を
改善することを可能とする。更に、該固体支持体および
最終的な着色位置が該培地の頂部に局在している場合に
は、該反応は該培養ブロスにより不明瞭化されず、かつ
読み取りが容易となる。該固体支持体が該液体の表面下
に位置する場合には、該色素−形成性基質の酸化を容易
にするために発色溶液を添加することが好ましい。

大腸菌型細菌をテストする場合、該培地、例えばLST
ブロス中の通常の成分は可溶性基質、例えばONPGの発生
反応を妨害する恐れがある。従って、ONPGは透明な培地
内でのみテストすることができ、結果として弱い反応を
読み取ることを可能とする。ここで、実際上任意の寸法
の固体担体上への該色素−形成性基質の組み込みはサン
プルの寸法とは無関係に、使用する試薬を保存すること
を可能とする。同一の固体担体およびポリマー系と結合
した色素−形成性基質の表面積を任意の体積の培養物に
対して使用することができる。というのは、該基質と細
菌酵素との反応は該培地の全容積に渡ってではなく画成
された表面積内でおこるからである。発生する青色は通
常の微生物学的培地成分により不明瞭化されないので、
ポリマー系内の該色素−形成性基質を使用したアッセイ
は複雑な培地、例えばLSTブロス中で実施することがで
きる。酸化性環境の存在下での該色素−形成性基質の加
水分解により生じた不溶性の青色の沈澱は該固体支持体
の表面に維持され、その結果反応生成物はかなり小さな
より観察の容易な空間に集中される。該沈澱の局在化は
該テストの読み取りを容易にし、その感度を高める。該
酵素アッセイの固体支持体への局在化は試薬利用上の経
済化をもたらす。

更に別の局面では、本発明の方法並びに酵素指示デバ
イスは、最確数（MPN）法を利用した、食品または水サ
ンプル中の大腸菌型細菌の数を評価する定量的アッセイ
においても利用し得る。MPN大腸菌アッセイは、ポリマ
ー系、例えばラテックス中の色素−形成性基質を標準的
な大腸菌培地、例えばLSTブロスに配合することにより
達成される。該サンプルの調製は標準的な方法で行う。
一夜インキュベ−トした後、試験管内の該ポリマー系に
おける発色を読み取り、正の試験管につき、標準的なMP
N法に従って確定されたMPN/gまたはMPN/mlを計算する。
食品の微生物学的試験法の概説（Compendium of Method
s for the Microbilogical Examination of Foods）
（第２版、米国公衆衛生協会（American Public Health
Association）,1984）；公定分析法（Official Method
s of Analysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオ
フィシャルアナリティカルケミスツ（Association of O
fficial Analytical Chemists）,1984）；および水およ
び排水の検査のための標準的方法（Standard Methods f
or the Examination of Water and Wastewater）（第17
版、米国公衆衛生協会（American Public Health Assoc
iation）,1981）を参照のこと。

本発明の方法および酵素指示デバイスは、例えば大腸
菌型細菌の定量テストで使用できる。インジゴ生成性ガ
ラクトシド基質は飲料水中の大腸菌のPAテストで使用す
る培地に配合される。この水のサンプルはポリマー系中
に、好ましくは浮遊性のプラスチック固体担体上の層と
しての色素−形成性基質を含む培地に添加する。適当な
インキュベ−ト時間の経過後、培養器内で該固体担体部
材上の沈澱したインジゴは該サンプル中に大腸菌が存在
することを示す。この手順は、環境サンプルを大腸菌の
存在につき定量的にテストするためにも利用される。例
えば、先端に綿布を取りつけたアプリケ−タで拭い、ポ
リマー系に組み込まれた、好ましくは固体担体部材上に
適用されたインジゴ生成性の色素−形成性基質を含む大
腸菌用培地に該アプリケ−タを置くことにより下水設備
の有効性を調べるために表面または排水管をアッセイす
ることができる。適当な時間、例えば１〜24時間、細菌
の育成に許容される温度でのインキュベ−トの後、該培
養器内に、またはより特定的には該固体担体の表面上に
沈澱したインジゴの色は該サンプル中における大腸菌の
存在を示す。

上記のような色素−形成性基質の使用の他に、本発明
は、付随的な培養物の移動、試薬の調製もしくは診断法
の使用の必要なしに、E.コリおよび大腸菌型細菌両者の
同時に確認的測定法をも提供する。より詳しくいえば、
上記の如き色素−形成性および螢光発生基質を含む円板
を、E.コリおよび／または大腸菌型細菌の存在につきテ
ストすべき微生物学的培地を含む容器に添加する。培地
と該反応性円板とを含む該容器を、対象とする微生物の
生育に許容される温度にてインキュベ−トする。インキ
ュベ−トの後、該容器を該反応性円板または回りの培地
における識別色の存在につき観察する。次いで、該容器
を長波長の紫外光（360 nm）に暴露して、回りの培地に
おける螢光の存在につき観察する。該円板上に見られる
色は該大腸菌型細菌のための確認反応（confirmed reac
tion）を示す。また、螢光の存在は、特定の微生物、E.
コリの存在に対する確認反応を示す。

以下の実施例は例示の目的で与えられるものであり、
本発明を限定するものではない。

実施例１本例は、水および排水の標準的検査法（Standard Met
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されたようなPA（存在−
不在）法により飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示
する。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中
の３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条
件下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示
薬を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテック
スポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質を含
むプラスチック担体を該培養器に加えて、該液体表面に
これを浮かべた。該プラスチック担体上の、ラテックス
ポリマー系中の該インジゴ生成性ガラクトシド基質はす
でに述べたようにして調製した。この混合物を35℃でイ
ンキュベ−トし、24時間後に、該プラスチック担体をイ
ンジゴ形成につき検査した。インジゴ形成−正の反応は
該水サンプル中に大腸菌が確実に存在することを示し
た。

実施例２本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル硫酸トリプト−スブロス育成培地内
に置いた。浮遊性の円形プラスチック担体の半面にポリ
マー系中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を層状に適
用し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を
層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを培養物に加え
た。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。
該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応
により、該環境サンプル中における大腸菌型細菌の存在
が示された。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ
形成−正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの
存在が示された。

実施例３本例では、本発明の方法を利用して、最確数（MPN）
分析により食品または水サンプル中の大腸菌およびE.コ
リの濃度を見積もる方法を例示する。このMPN法は食品
の微生物学的検査法の概説（Compendium of Methods fo
r the Microbiological Examination of Foods）（第２
版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health Assoc
iation）,1984）；公定分析法（Official Methods of A
nalysis）（第14版、アッソシェ−ションオブオフィシ
ャルアナリティカルケミスツ（Association of Officia
l Analytical Chemists）,1984）；および水および排水
の標準的検査法（Standard Methods for the Examinati
on of Water and Wastewater）（第17版、米国公衆衛生
協会（Americal Public Health Association）,1981）
に記載されている。

水サンプル（10ml）を２倍濃度のラウリル硫酸トリプ
ト−ス（LST）ブロス10mlに無菌条件下で添加した。浮
遊性の円形プラスチック固体支持体の半面にポリマー系
中のインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの
半面にポリマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質
を層状に適用し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に
加えた。この混合物を35℃にて24時間インキュベ−トし
た。該プラスチック担体の半面上のインジゴ生成−正の
反応により、該水サンプル中における大腸菌型細菌の存
在が示される。該プラスチック担体の両半面上のインジ
ゴ形成−正の反応により、該サンプル中のE.コリの存在
が示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的
統計確率表（MPN表）を使用して元の水サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。

食品サンプルをMPNアッセイ前に、連続的10倍希釈に
より希釈した。固体食品サンプルの一部（塊）を無菌希
釈剤、バタ−フィ−ルズ（Butterfield's）緩衝燐酸バ
ッファ−９部（容量部）に添加した。この混合物を高速
で２分間ブレンドした。２種の別の10倍希釈物を1:10希
釈食品サンプルから調製した。該10倍希釈物の各1 mlを
10mlの３種のLSTブロスの試験管の各々添加した。浮遊
性の円形プラスチック担体の半面にポリマー系中のイン
ジゴ形成性ガラクトシド基質を適用し、残りの半面にポ
リマー系中のインジゴ形成性グルクロニド基質を適用
し、インキュベ−ト後にこれを各試験管に加えた。この
混合物を35℃にて24時間インキュベ−トした。該プラス
チック担体の半面上のインジゴ生成−正の反応により、
該希釈物サンプル中における大腸菌型細菌の存在が示さ
れる。該プラスチック担体の両半面上のインジゴ形成−
正の反応により、該希釈物サンプル中のE.コリの存在が
示される。インジゴ生成−正の培養物の数は、標準的統
計確率表（MPN表）を使用して元の食品サンプル中に存
在する大腸菌型細菌およびE.コリの数を評価するのに利
用した。

実施例４本例は、インジゴ形成性基質混合物を使用して、推定
的に正の大腸菌培養物の全大腸菌およびE.コリについて
の確認法を説明する。大腸菌型細菌に対する推定的ガス
発生性が正の培養物を、以下の手順に従って大腸菌型細
菌およびE.コリの存在につき確認した。浮遊性の円形固
体担体の半面にインジゴ形成性ガラクトシド基質を適用
し、残りの半面にインジゴ形成性グルクロニド基質を適
用し、これを該培養物に加えた。酸化剤（過酸化水素、
10％濃度）を該培養物に加えた。大腸菌MPN分析の推定
分析部分は実施例３に記載の手順を利用して、食品また
は水サンプルにつき、LSTブロス中で実施した。24〜48
時間後にガス発生が正の培養物を、上記の浮遊性円形固
体担体を使用し、同時に酸化剤を含む発色剤を添加して
確認した。この培養物を35℃にて約１時間インキュベ−
トし、該プラスチック担体をインジゴの形成に関して検
査した。該円形固体担体の半面上でインジゴ形成−正で
ある培養物には大腸菌型細菌が存在することが確認され
たものと考えた。該円形固体担体の両半面上でインジゴ
形成−正である培養物にはE.コリが存在することが確認
された。インジゴ形成−負の培養物を更に１時間インキ
ュベ−トして、再度検査した。２時間たっても依然とし
てインジゴ形成−負の培養物は大腸菌型細菌またはE.コ
リの存在につき未確認のままであった。

実施例５本例は、水および排水の標準的検査法（Standard Met
hods for the Examination of Water and Wastewater）
（第17版、米国公衆衛生協会（Americal Public Health
Association）,1981）に記載されているPA（存在−不
在）法による飲料水中の大腸菌型細菌の検出法を例示す
る。簡単に言えば、100 mlの水を容量250 mlのビン中の
３倍濃度のクラ−クス（Clark's）培地50mlに無菌条件
下で加えた。クラ−クス（Clark's）培地にはpH指示薬
を除く改良を施した。インキュベ−トの後、ラテックス
ポリマー系中のインジゴ生成性ガラクトシド基質および
螢光発生基質を含むプラスチック担体を該培養器に加え
て、該液体表面にこれを浮かべた。該プラスチック担体
上の、ラテックスポリマー系中の該インジゴ生成性ガラ
クトシド基質はすでに述べたようにして調製した。この
混合物を35℃でインキュベ−トし、24時間後に、該プラ
スチック担体をインジゴ形成につき検査した。インジゴ
形成−正の反応は該水サンプル中に大腸菌が確実に存在
することを示した。

実施例６本例は、本発明の方法を利用して、環境サンプル中の
大腸菌型細菌およびE.コリの検出法を例示する。この環
境サンプルは下水施設の有効性を検査するためにあるい
は日常の環境スクリーニングプログラムの一部として採
取した。先端に綿を取りつけたアプリケ−タを滅菌した
希釈剤で湿し、表面を拭うのに使用した。このスワブを
微生物学的ラウリル酸トリプト−スブロス育成培地内に
置いた。浮遊性の円形プラスチック担体にポリマー系中
のインジゴ形成性ガラクトシド基質および螢光発生性グ
ルクロニド基質を層状に適用し、インキュベ−ト後にこ
れを培養物に加えた。この混合物を35℃にて24時間イン
キュベ−トした。該プラスチック担体上のインジゴ生成
−正の反応により、該環境サンプル中における大腸菌型
細菌の存在が示された。該プラスチック担体を長波長の
紫外光（366 nm）を照射した際の該容器中の螢光発生−
正の反応により、該サンプル中におけるE.コリの存在が
示された。

以上、本発明を明瞭にしかつ理解を容易にする目的
で、本発明を例示並びに実施例により記載してきたが、
本発明の精神並びに範囲を逸脱することなく、いくつか
の変更並びに改良が可能であることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者デスロシアジョンピーアメリカ合衆国ワシントン州 98103 シアトルバークアベニューノース 3520 (72)発明者マーシャルエリオットディーザサードアメリカ合衆国ワシントン州 98055 レントングラントアベニューサウス 1411 アパートメントエム― 305 (72)発明者フォードジュディースアメリカ合衆国ワシントン州 98011 ボーセルナインティフィフスプレイスノースイースト 17939 アパートメント６ (72)発明者マリナクナンシージェイエスアメリカ合衆国ワシントン州 98117 シアトルノースウェストエイティナインス 1900 アパートメント２ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/04 C12Q 1/34 C12Q 1/04 C12R 1:19 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル、液状育成培地及び酵素指示デバ
イスを、単一の容器中、特定の微生物又は微生物群の生
育に許容される温度にてインキュベ−トする工程であっ
て、該酵素指示デバイスは、水性系において不溶性であ
り、該酵素に特異的であり、かつ非吸収性固体担体の表
面上に位置している色素−形成性基質を含み、該色素−
形成性色素は該酵素により切断されたとき、不溶性沈殿
物を形成する工程、及び、非吸収性固体担体の表面上の着色不溶物沈殿物により、
該特定の微生物又は微生物群の存在を検出する工程、を含む、サンプル中の特定の微生物又は微生物群に関連
する酵素のアッセイ法。
【請求項２】色素−形成性基質が以下の式で示される置
換インジゴ誘導体：（ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】特定の微生物がE.コリであり、微生物群が
大腸菌群細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】サンプルが水、飲料水、排水、食品又は環
境サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】サンプルを液状育成培地に添加する工程、サンプル育成培地を、特定の微生物又は微生物群の育成
に許容される温度にて、微生物生育の痕跡が認められる
までインキュベ−トする工程、酵素指示デバイスを添加する工程であって、該酵素指示
デバイスは、水性系において不溶性であり、酵素に特異
的であり、かつ非吸収性固体担体の表面に位置している
色素−形成性基質を含み、該色素−形成性基質は該酵素
により切断されたとき、不溶性着色沈殿物を形成する工
程、サンプル育成培地及び酵素指示デバイスを、許容された
温度にて約１〜約24時間インキュベ−トする工程、及
び、特定の微生物又は微生物群の存在を、該酵素指示デバイ
ス上の色に変化により視覚的に検出する工程、を含むサンプル中の特定の微生物又は微生物群に関連す
る酵素を単一の容器内でアッセイする方法。
【請求項６】色素−形成性基質が以下の式で示される置
換インジゴ誘導体：（ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】特定の微生物がE.コリであり、微生物群が
大腸菌群細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】サンプルが水、飲料水、排水、食品又は環
境サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】酵素に関連する特定の微生物又は微生物群
のアッセイ用酵素指示デバイスであって、非吸収性固体
担体表面上に付着された色素−形成性基質を含み、該基
質は該酵素により切断されて該非吸収性固体担体表面上
に不溶性着色沈殿物を形成することを特徴とするデバイ
ス。
【請求項１０】色素−形成性基質が以下の式で示される
置換インジゴ誘導体：（ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】本質的に非吸収性固体担体表面上に付着
された１以上の色素−形成性基質からなる、E.コリ又は
大腸菌群細菌のアッセイ用酵素指示デバイスであって、
該色素−形成性基質がE.コリ又は大腸菌群細菌由来の酵
素により切断されたとき、不溶性沈殿物を形成するデバ
イス。
【請求項１２】少なくとも１つの色素−形成性基質が以
下の式で示される置換インジゴ誘導体：（ここで、各Ｒはハロゲン又は水素原子を表す）であ
る、請求項11に記載のデバイス。