JPH0563158B2 - - Google Patents
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- JPH0563158B2 JPH0563158B2 JP4477784A JP4477784A JPH0563158B2 JP H0563158 B2 JPH0563158 B2 JP H0563158B2 JP 4477784 A JP4477784 A JP 4477784A JP 4477784 A JP4477784 A JP 4477784A JP H0563158 B2 JPH0563158 B2 JP H0563158B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/12—Nitrate to nitrite reducing bacteria
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/22—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Neisseriaceae (F), e.g. Acinetobacter
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- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は微生物、特にナイセリア・コノレ
（Neisseria gonorrhoeae）（N.g.）及び（又は）
ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria
meningitidis）（N.m.）の検出法に関する。N.g.
感染の有無の検出のための公知の一方法は被検試
料をレクチン（lectin）（抗体様活性物質）又は
小麦胚芽のアグルチニン（Wheat germ
agglutinin）（WGA）と接触させて微生物を凝集
させる方法である。ドイル（Doyle）等の米国特
許第4298689号明細書開示の方法においてWGA
と試料との凝集反応の存在はN.g.菌の存在の推定
的表示であると記載されている。この試験法に関
するひとつの問題がカーチス等の報文（Curtis，
G.D.W.，etal.，Br.J.Vener.Dis.，1981；57：253
−５）中に報告されている。該報文はN.g.以外の
微生物例えばナイセリア・メニンギチジス（N.
m.）もレクチン凝集菌株であるので上記の試験
方法はN.g.の同定用として信頼し得ないと述べて
いる。この試験法に関する他の問題は試料の自動
的凝集が起ることがあることである。この事実は
N.g.同定可能の割合の増大のために新たに単離し
たものの使用を必要とすることを示す；さもない
とN.g.感染の診断を或程度誤る怖れがあり得る。 N.g.及びN.m.のアミノペプチダーゼに関する
性質は既に研究されているクロモゲン（色原体）
含有基質の使用によりN.g.とN.m.とを区別し得
ること及びその測定が再現可能であることが報告
されている〔Perrine，S.，andWatson，R.R.，
Abstracts of the Annual Meeting of the
American for Microbiology，p.39（1975）〕。即
ちガンマーグルタミルアミノペプチダーゼ
（GGA）はN.g.には存在しないから、該GGAを
含む基質の反応生成物の存在はN.m.を含むけれ
どもN.g.を含まない試料の陽性表示であることが
該報文に開示されている。もしこの試験結果が陽
性であればそれは試料がN.m.を含みN.g.を含ま
ないことを示す。けれどもその試験結果が陰性で
あればN.g.が試料中に存在するか否かは確定され
ない。この試験法に関する他の問題はガンマーグ
ルタミルアミノペプチダーゼ活性の検出のための
公知の基質はその反応に当り長時間例えば37℃で
２時間の恒温保持を要するので比較的のろい試験
であることである。 ホリス等の報文〔Hollis，D.G.，et al.，Appl.
Microbiol.，17：71−77（1969）〕はラクトース資
化性のナイセリア菌（N.l.）を記載し；コルベツ
ト等の報文〔Corbett，P.，and Ulivelli，A.，J.
Bacteriol.，95：52−57（1968）〕はラクトース−
陽性ナイセリアのガラクトシダーゼ活性を記載し
ている。ベータ−ガラクトシダーゼ活性の検出に
用いられる基質のひとつはＯ−ニトロフエニル−
Ｄ−ガラクトピラノシド（ONPG）である
〔LeMinor，L.，and Ben Hamida，F.，Ann.
lnst.Pasteur，102：267（1962）〕。 組織化学的細胞染色のためにロイシン−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミドを用いるロイシ
ンアミノペプチダーゼの検出も又公知である 〔Nachlas，M.M.，et al.，J.Biophys.Biochem.
Cytol.，７：261（1960）〕。 本発明の一般的目的はN.g.及びN.m.の存在が
疑われている微生物の分別検出のための迅速で正
確な試験方法の提供にある。 本発明の特別な目的はB.カタラリス（B.
Catarrhalis）〔ブランハメラ・カタラリス
（Branhamella catarrhalis）〕の検出のための追
加的な迅速試験法の提供にある。 更に本発明の目的は試料中の微生物の自動的凝
集のメカニズムを逆転させる方法を提供し それ
によつて凝集試験法における偽の陽性表示を減ず
ることにある。 本発明のそれ以外の目的及び態様は本発明の好
適な具体化に関する下文によつて明かとなろう。 本発明の上記の諸目的にそつて試料中のN.g.菌
及びN.m.菌の分別検出の一方法が提供される。
第１工程においてＮ−アセチルグルコサミン又は
Ｎ，N′−ジアセチルキトビオースと反応して凝
集生成物を与える型のレクチンと被検試料の一部
とを反応させる。これとは別のレクチン試験法を
好適に使用するがこれはN.g.に対するWGA試験
法並びに病原性ナイセリアに関するレクチン確認
試験法〔この方法においては大豆アグルチニン
（SBA）、バレイシヨのソラニウム ツベロソム
アグルチニン（Solanium Tuberosom
agglutinin）（STA）及びバレイシヨのレクチン
のいずれか単独又は組合せを使用する〕を含む。
N.g.とN.m.との分別のために試料を別個の部分
（複数）に分け、これらの部分と”N.g.及びN.m.
中に存在する互いに異なる夫々の酵素に対して特
異的な基質”とを反応させ、反応生成物をジアゾ
染料とカツプリングさせて呈色させる。迅速に反
応するN.m.及びN.g.用の好適基質は夫々ガンマ
ーグルタミル ナフチルアミド及びプロリン ナ
フチルアミドであつて、双方共に電子供与基によ
りその４位及び（又は）６位を置換されているも
のである。 上記試験法はN.l.菌に対する試験法と組合せて
使用され得る。N.l.菌は試料の一部と”ベータ−
ガラクトシダーゼ（BG）酵素と反応する基質”
とを接触させることにより検出され、次にこの酵
素（基質に対して反応する酵素）により生成され
た反応生成物の存在を検出し、かようにして試料
がN.l.を含有することの陽性表示とするのであ
る。好適基質はONPGである。更に４−及び
（又は）６−位に置換基をもつグリシル−プロリ
ル ナフチルアミドを使用してB.カタラリス
（B.C）に対する試験も遂行され得る。 本発明に従い各種ナイセリア菌即ちN.g.，N.
m.，N.l.及びB.C.に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素
試験法による確認試験と組合せたレクチン凝集試
験法を用いる。 選択された培地、例えばタイア−マアチン
（Thayer−Martin）培地、の上で微生物を生育
させた後にグラム染色とオキシダーゼテストとを
行つて該微生物がグラム陰性双球菌であること、
オキシダーゼテスト陽性であることを決定する。
これはN.g.，N.m.，N.l.及び（又は）B.C.存在可
能の推定表示である。試料の一部を用いて適宜の
型のレクチンを用いる凝集によりN.g.又はN.m.
菌の存在を試験する。この目的のためにＮ−アセ
チルグルコサミン又はＮ，N′−ジアセチルキト
ビオースに対して反応する型の１種又は複数種の
レクチンを選ぶ。該菌の凝集反応の存在は試料が
N.g.かまたはN.m.か又はそれら両者を含むこと
の陽性表示である。 上記のナイセリア菌の或る菌株は自動的凝集の
傾向を有する。試料の一部分についてこれがレク
チン不在下に自動的凝集を起すか否かを測定して
みるべきである。もし自動的凝集が起れば、本発
明に従い、自動的凝集のメカニズムを逆転させる
目的で、レクチン凝集以前に試料を前処理するた
めの処理法が提供される。該処理法のひとつにお
いては試料と粗又は純のDNA′アーゼ又は
DNA′アーゼ含有品とを有効濃度（例えば／mg／
ml）において反応させる。他の処理方法において
は試料中の微生物に対して陰性電荷を与える物質
を反応させて凝集体の中の個々の微生物を相互に
反撥させる。適当な陰性電荷付与剤には適宜濃度
（例えば0.25mg／ml）の無水コハク酸が含まれる。 従来技術においてN.g.存在下の凝集の目的の達
成のために想定されたレクチンはWGAである。
けれどもWGA存在下ですべてのN.g.菌が凝集す
るわけではないことが見出された。偽の陰性の凝
集結果の問題を解決するためには異る諸試験にお
いて異るレクチン（複数）を用いることが好まし
い。適切な補助的なレクチン試験法においては試
料の一部と病源性ナイセリア（N.m.，N.g.，N.l.
及びB.C）を凝集させるレクチンとを混合する。
この試験法は非特異的であるけれどもWGA試験
法は偽の陰性結果を与えることを技術者に警告す
る働きをする。この補助試験のために適切なレク
チンはSBA又はSTAの夫々単独又はそれらの組
合せである。 最高の正確度の達成のために各種の病源性ナイ
セリアを区別する場合に上記のレクチン試験とひ
とつ又は複数の確認試験との組合せが重要である
ことが見出された。本発明に従えば確認試験のひ
とつはN.m.がGGA酵素活性を持つけれどもプロ
リン アミノペプチダーゼ（PA）活性を持たな
いという知識からみちびかれた。逆にN.g.はPA
活性をもつがGGA活性をもたない。従つてGGA
と反応するがPAと反応しない基質は被検試料が
N.m.を含むけれどもN.g.を含まないことの陽性
表示として利用され得る。詳言すればかような基
質を試料の一部に添加したとき基質と試料との反
応生成物の存在は該試料がN.m.を含みN.g.を含
まないということの陽性表示である。アミノ酸ベ
ータ−ナフチルアミドは酵素存在の表示としてベ
ータ−ナフチルアミンクロモーゲンを放出する基
質であることが公知である。けれどもこの類の公
知の基質例えばガンマーグルタミル−ベータ−ナ
フチルアミドはジアゾ染料とのカプリングによる
呈色定量のために37℃で２時間もの長時間の恒温
保持を必要とする。該基質はジアゾ染料の添加に
より変色を起す。基質−酵素反応の検出のための
他の一方法においては放出されたナフチルアミン
と蛍光検出する方法を採用し得る。 アミノ酸ナフチルアミド基質のカツプリング反
応の速度は下記構造式で示される通りその４−
位、６−位又はそれら両位を電子供与基Ｒ（例え
ばアルコキシ基、例えばメトキシ、ヒドロキシル
基又はハロゲン） で置換することにより大きく増加することが見出
された。 従つてN.m.のガンマーグルタミルアミノペプ
チダーゼ酵素に対する有効基質はガンマーグルタ
ミル−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド、特にそのアルコキシ基がメトキシであるもの
である。該基質と適切なジアゾカツプリング物質
とを使用すれば同濃度の反応体について温度37℃
で10分間以下の恒温保持で変色が起る。 N.m.に対する酵素−基質反応試験と類似の該
反応試験がN.g.についても使用され得る。この試
験の遂行のためにN.g.のプロリンアミノペプチダ
ーゼ酵素部分に対する基質を試料の一部に加え
る。未置換のプロリン−ベーターナフチルアミド
を使用し得るけれども迅速反応の基質は既述の型
の電子供与基で４−位、６−位、又はそれら両位
を置換した化合物を包含する。特に有効な基質は
プロリン−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルア
ミド、特にその４−メトキシ化合物、を包含す
る。 B.C.については他の類似の酵素−基質反応試験
を使用し得る。この試験に当りN.g.のグリシル−
プロリル−アミノペプチダーゼ酵素部分に対する
基質を試料の一部に加える。迅速検出用の基質は
４−位、６−位、又は両位を既述の型の電子供与
基で置換したグリシル−プロリル−ナフチルアミ
ドを包含する。特に有効な基質はグリシル−プロ
リル−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド、特にその４−メトキシ化合物である。 本発明の他の特徴的態様は上記のレクチン凝集
反応とGGA酵素試験との組合せの試験方法であ
る。該方法において試料中のN.l.菌の存在は試料
の一部と”BG酵素（この酵素はN.l.菌体上に存
在する）と反応する基質”とを接触させることに
より検出される。N.l.菌体中のBG酵素と基質と
の反応生成物は該試料がN.l.菌を有することの陽
性表示である。この目的にかなう適切な基質は
ONPO、そのブロモ クロロ−インドキシル誘
導体及びそのベータ−ナフチル誘導体を包含す
る。特異的基質はＯ−ニトロフエニル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、ｐ−ニトロフエニル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、フエノールフタレイン−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−イ
ンドイル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ブロモチモ
−ルフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド及びナ
フチル−ガラクトピラノシドを包含する。 総括すると病源性ナイセリア（N.m.，N.g.，
B.c.又はN.l.）に対する特異的分別試験の四方法
が次表に示される：
（Neisseria gonorrhoeae）（N.g.）及び（又は）
ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria
meningitidis）（N.m.）の検出法に関する。N.g.
感染の有無の検出のための公知の一方法は被検試
料をレクチン（lectin）（抗体様活性物質）又は
小麦胚芽のアグルチニン（Wheat germ
agglutinin）（WGA）と接触させて微生物を凝集
させる方法である。ドイル（Doyle）等の米国特
許第4298689号明細書開示の方法においてWGA
と試料との凝集反応の存在はN.g.菌の存在の推定
的表示であると記載されている。この試験法に関
するひとつの問題がカーチス等の報文（Curtis，
G.D.W.，etal.，Br.J.Vener.Dis.，1981；57：253
−５）中に報告されている。該報文はN.g.以外の
微生物例えばナイセリア・メニンギチジス（N.
m.）もレクチン凝集菌株であるので上記の試験
方法はN.g.の同定用として信頼し得ないと述べて
いる。この試験法に関する他の問題は試料の自動
的凝集が起ることがあることである。この事実は
N.g.同定可能の割合の増大のために新たに単離し
たものの使用を必要とすることを示す；さもない
とN.g.感染の診断を或程度誤る怖れがあり得る。 N.g.及びN.m.のアミノペプチダーゼに関する
性質は既に研究されているクロモゲン（色原体）
含有基質の使用によりN.g.とN.m.とを区別し得
ること及びその測定が再現可能であることが報告
されている〔Perrine，S.，andWatson，R.R.，
Abstracts of the Annual Meeting of the
American for Microbiology，p.39（1975）〕。即
ちガンマーグルタミルアミノペプチダーゼ
（GGA）はN.g.には存在しないから、該GGAを
含む基質の反応生成物の存在はN.m.を含むけれ
どもN.g.を含まない試料の陽性表示であることが
該報文に開示されている。もしこの試験結果が陽
性であればそれは試料がN.m.を含みN.g.を含ま
ないことを示す。けれどもその試験結果が陰性で
あればN.g.が試料中に存在するか否かは確定され
ない。この試験法に関する他の問題はガンマーグ
ルタミルアミノペプチダーゼ活性の検出のための
公知の基質はその反応に当り長時間例えば37℃で
２時間の恒温保持を要するので比較的のろい試験
であることである。 ホリス等の報文〔Hollis，D.G.，et al.，Appl.
Microbiol.，17：71−77（1969）〕はラクトース資
化性のナイセリア菌（N.l.）を記載し；コルベツ
ト等の報文〔Corbett，P.，and Ulivelli，A.，J.
Bacteriol.，95：52−57（1968）〕はラクトース−
陽性ナイセリアのガラクトシダーゼ活性を記載し
ている。ベータ−ガラクトシダーゼ活性の検出に
用いられる基質のひとつはＯ−ニトロフエニル−
Ｄ−ガラクトピラノシド（ONPG）である
〔LeMinor，L.，and Ben Hamida，F.，Ann.
lnst.Pasteur，102：267（1962）〕。 組織化学的細胞染色のためにロイシン−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミドを用いるロイシ
ンアミノペプチダーゼの検出も又公知である 〔Nachlas，M.M.，et al.，J.Biophys.Biochem.
Cytol.，７：261（1960）〕。 本発明の一般的目的はN.g.及びN.m.の存在が
疑われている微生物の分別検出のための迅速で正
確な試験方法の提供にある。 本発明の特別な目的はB.カタラリス（B.
Catarrhalis）〔ブランハメラ・カタラリス
（Branhamella catarrhalis）〕の検出のための追
加的な迅速試験法の提供にある。 更に本発明の目的は試料中の微生物の自動的凝
集のメカニズムを逆転させる方法を提供し それ
によつて凝集試験法における偽の陽性表示を減ず
ることにある。 本発明のそれ以外の目的及び態様は本発明の好
適な具体化に関する下文によつて明かとなろう。 本発明の上記の諸目的にそつて試料中のN.g.菌
及びN.m.菌の分別検出の一方法が提供される。
第１工程においてＮ−アセチルグルコサミン又は
Ｎ，N′−ジアセチルキトビオースと反応して凝
集生成物を与える型のレクチンと被検試料の一部
とを反応させる。これとは別のレクチン試験法を
好適に使用するがこれはN.g.に対するWGA試験
法並びに病原性ナイセリアに関するレクチン確認
試験法〔この方法においては大豆アグルチニン
（SBA）、バレイシヨのソラニウム ツベロソム
アグルチニン（Solanium Tuberosom
agglutinin）（STA）及びバレイシヨのレクチン
のいずれか単独又は組合せを使用する〕を含む。
N.g.とN.m.との分別のために試料を別個の部分
（複数）に分け、これらの部分と”N.g.及びN.m.
中に存在する互いに異なる夫々の酵素に対して特
異的な基質”とを反応させ、反応生成物をジアゾ
染料とカツプリングさせて呈色させる。迅速に反
応するN.m.及びN.g.用の好適基質は夫々ガンマ
ーグルタミル ナフチルアミド及びプロリン ナ
フチルアミドであつて、双方共に電子供与基によ
りその４位及び（又は）６位を置換されているも
のである。 上記試験法はN.l.菌に対する試験法と組合せて
使用され得る。N.l.菌は試料の一部と”ベータ−
ガラクトシダーゼ（BG）酵素と反応する基質”
とを接触させることにより検出され、次にこの酵
素（基質に対して反応する酵素）により生成され
た反応生成物の存在を検出し、かようにして試料
がN.l.を含有することの陽性表示とするのであ
る。好適基質はONPGである。更に４−及び
（又は）６−位に置換基をもつグリシル−プロリ
ル ナフチルアミドを使用してB.カタラリス
（B.C）に対する試験も遂行され得る。 本発明に従い各種ナイセリア菌即ちN.g.，N.
m.，N.l.及びB.C.に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素
試験法による確認試験と組合せたレクチン凝集試
験法を用いる。 選択された培地、例えばタイア−マアチン
（Thayer−Martin）培地、の上で微生物を生育
させた後にグラム染色とオキシダーゼテストとを
行つて該微生物がグラム陰性双球菌であること、
オキシダーゼテスト陽性であることを決定する。
これはN.g.，N.m.，N.l.及び（又は）B.C.存在可
能の推定表示である。試料の一部を用いて適宜の
型のレクチンを用いる凝集によりN.g.又はN.m.
菌の存在を試験する。この目的のためにＮ−アセ
チルグルコサミン又はＮ，N′−ジアセチルキト
ビオースに対して反応する型の１種又は複数種の
レクチンを選ぶ。該菌の凝集反応の存在は試料が
N.g.かまたはN.m.か又はそれら両者を含むこと
の陽性表示である。 上記のナイセリア菌の或る菌株は自動的凝集の
傾向を有する。試料の一部分についてこれがレク
チン不在下に自動的凝集を起すか否かを測定して
みるべきである。もし自動的凝集が起れば、本発
明に従い、自動的凝集のメカニズムを逆転させる
目的で、レクチン凝集以前に試料を前処理するた
めの処理法が提供される。該処理法のひとつにお
いては試料と粗又は純のDNA′アーゼ又は
DNA′アーゼ含有品とを有効濃度（例えば／mg／
ml）において反応させる。他の処理方法において
は試料中の微生物に対して陰性電荷を与える物質
を反応させて凝集体の中の個々の微生物を相互に
反撥させる。適当な陰性電荷付与剤には適宜濃度
（例えば0.25mg／ml）の無水コハク酸が含まれる。 従来技術においてN.g.存在下の凝集の目的の達
成のために想定されたレクチンはWGAである。
けれどもWGA存在下ですべてのN.g.菌が凝集す
るわけではないことが見出された。偽の陰性の凝
集結果の問題を解決するためには異る諸試験にお
いて異るレクチン（複数）を用いることが好まし
い。適切な補助的なレクチン試験法においては試
料の一部と病源性ナイセリア（N.m.，N.g.，N.l.
及びB.C）を凝集させるレクチンとを混合する。
この試験法は非特異的であるけれどもWGA試験
法は偽の陰性結果を与えることを技術者に警告す
る働きをする。この補助試験のために適切なレク
チンはSBA又はSTAの夫々単独又はそれらの組
合せである。 最高の正確度の達成のために各種の病源性ナイ
セリアを区別する場合に上記のレクチン試験とひ
とつ又は複数の確認試験との組合せが重要である
ことが見出された。本発明に従えば確認試験のひ
とつはN.m.がGGA酵素活性を持つけれどもプロ
リン アミノペプチダーゼ（PA）活性を持たな
いという知識からみちびかれた。逆にN.g.はPA
活性をもつがGGA活性をもたない。従つてGGA
と反応するがPAと反応しない基質は被検試料が
N.m.を含むけれどもN.g.を含まないことの陽性
表示として利用され得る。詳言すればかような基
質を試料の一部に添加したとき基質と試料との反
応生成物の存在は該試料がN.m.を含みN.g.を含
まないということの陽性表示である。アミノ酸ベ
ータ−ナフチルアミドは酵素存在の表示としてベ
ータ−ナフチルアミンクロモーゲンを放出する基
質であることが公知である。けれどもこの類の公
知の基質例えばガンマーグルタミル−ベータ−ナ
フチルアミドはジアゾ染料とのカプリングによる
呈色定量のために37℃で２時間もの長時間の恒温
保持を必要とする。該基質はジアゾ染料の添加に
より変色を起す。基質−酵素反応の検出のための
他の一方法においては放出されたナフチルアミン
と蛍光検出する方法を採用し得る。 アミノ酸ナフチルアミド基質のカツプリング反
応の速度は下記構造式で示される通りその４−
位、６−位又はそれら両位を電子供与基Ｒ（例え
ばアルコキシ基、例えばメトキシ、ヒドロキシル
基又はハロゲン） で置換することにより大きく増加することが見出
された。 従つてN.m.のガンマーグルタミルアミノペプ
チダーゼ酵素に対する有効基質はガンマーグルタ
ミル−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド、特にそのアルコキシ基がメトキシであるもの
である。該基質と適切なジアゾカツプリング物質
とを使用すれば同濃度の反応体について温度37℃
で10分間以下の恒温保持で変色が起る。 N.m.に対する酵素−基質反応試験と類似の該
反応試験がN.g.についても使用され得る。この試
験の遂行のためにN.g.のプロリンアミノペプチダ
ーゼ酵素部分に対する基質を試料の一部に加え
る。未置換のプロリン−ベーターナフチルアミド
を使用し得るけれども迅速反応の基質は既述の型
の電子供与基で４−位、６−位、又はそれら両位
を置換した化合物を包含する。特に有効な基質は
プロリン−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルア
ミド、特にその４−メトキシ化合物、を包含す
る。 B.C.については他の類似の酵素−基質反応試験
を使用し得る。この試験に当りN.g.のグリシル−
プロリル−アミノペプチダーゼ酵素部分に対する
基質を試料の一部に加える。迅速検出用の基質は
４−位、６−位、又は両位を既述の型の電子供与
基で置換したグリシル−プロリル−ナフチルアミ
ドを包含する。特に有効な基質はグリシル−プロ
リル−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド、特にその４−メトキシ化合物である。 本発明の他の特徴的態様は上記のレクチン凝集
反応とGGA酵素試験との組合せの試験方法であ
る。該方法において試料中のN.l.菌の存在は試料
の一部と”BG酵素（この酵素はN.l.菌体上に存
在する）と反応する基質”とを接触させることに
より検出される。N.l.菌体中のBG酵素と基質と
の反応生成物は該試料がN.l.菌を有することの陽
性表示である。この目的にかなう適切な基質は
ONPO、そのブロモ クロロ−インドキシル誘
導体及びそのベータ−ナフチル誘導体を包含す
る。特異的基質はＯ−ニトロフエニル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、ｐ−ニトロフエニル−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、フエノールフタレイン−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−イ
ンドイル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ブロモチモ
−ルフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド及びナ
フチル−ガラクトピラノシドを包含する。 総括すると病源性ナイセリア（N.m.，N.g.，
B.c.又はN.l.）に対する特異的分別試験の四方法
が次表に示される：
【表】
【表】
基質−酵素反応生成物を着色型へ転化させるた
めの適当なジアゾカツプリング染料は下記の諸物
質を包含する：４−アミノ−２，５−ジメトキシ
−4′−ニトロゾベンゼンジアゾニウム塩；テトラ
アゾ化されたＯ−ジアニシジン；ジアゾ化された
−4′−アミノ−2′，5′−ジエトキシベンズアニリ
ドの塩化亜鉛塩；４−ベンゾイルアミノ−２，５
−ジメトキシアニリン塩化亜鉛塩のジアゾ化物；
Ｏ−アミノアゾトルエンのジアゾニウム塩〔フア
ストガーネツト（Fast Garnet）という名称で公
知されてる〕；アントラキノン−１−ジアゾニウ
ムクロリド；５−ニトロ−２−アミノ−メトキシ
ベンゼン ジアゾテート；N′，N′−ジエチル−
４−メトキシメタニルアミドのジアゾニウム塩；
２−アミノ−４−メトキシベンズアミドのジアゾ
ニウム塩；ジアゾ−２−アミノ−５−クロロアニ
ソール、即ちジアゾ−５−クロロ−Ｏ−アニシジ
ン；５−クロロ−２−トルイジンジアゾニウム
クロリドの半塩化亜鉛塩；５−クロロ−４−ベン
ズアミド−２−メチルベンゼン ジアゾニウム
クロリドの半塩化亜鉛塩；６−ベンズアミド−５
−メトキシ−ｍ−トルイジン ジアゾニウム ク
ロリド；及びその他のジアゾニウム塩。 実施例 本発明に従う検出法の一例は下記の通りであ
る。タイア−マアチン平面培地上に生育させた一
試料を被検物とした。この試料微生物をグラム染
色し、このタイア−マアチン平面培地からグラム
陰性双球菌の純粋培養が得られたことを確認し
た。オキシダーゼテストを行つてこの微生物がオ
キシダーゼ陽性であることを確証した。形態学的
に類似する多数のコロニーを除去してから適宜の
緩衝物質例えばリン酸塩でPH7.2で緩衝された試
験管内の食塩溶液の中で乳化させた。 この細菌懸濁物の最終的な混濁度はマクフアラ
ンド（McFarland）No.３又はNo.４の硫酸バリウ
ム標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管
又は凝集板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一
滴に対しWGA（水溶液又は緩衝溶液／ml当りお
よそ／mg）の一滴を加えた。他の第２の試験管又
は凝集板又は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の他の
一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の一滴を加え
た。第３の試験管又は凝集板／皿の中でこの細菌
懸濁物の一滴に対しSBA又はSTA（水溶液又は緩
衝溶液／ml当りおよそ／mg）の一滴を加えた。
〔すべての該試験管／板／皿を振盪した。〕対照食
塩溶液は振盪後に凝集陰性であるべきである。も
し対照食塩溶液が凝集陽性であるならばこれは自
動的凝集を起したものであるから試料を処理して
この処理済みの細菌懸濁物についてWGA及び
SBA／STAを用いて自動的凝集試験を行うべき
である。自動的凝集を逆転させる適宜の処理とし
てはWGA及びSBAを用いる凝集試験の遂行以前
に0.2mlの試料に対し0.005mlの無水コハク酸溶液
を加える。WGA及びSBA／STAを用いる凝集
反応が陽性であればこれはN.g.又は不被嚢（non
−encapsulated）のM.c.の存在を示す。WGA使
用による凝集が陰性であるがSBA／STA使用に
よる凝集が陽性であるならばこれはN.m.又はN.
g.（その表面構造は変化している）の存在の可能
性を示す。 次に試料の一滴を下記の基質の各溶液の一滴に
対して別々に添加する：ガンマーグルタミル−４
−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、プロリル
−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、
ONPG、及びグリシル−プロリル−４−メトキ
シ−ベータ−ナフチルアミド。但し濃度はトリス
−NCl（Tris−NCl）緩衝溶液又はリン酸塩緩衝
溶液中／ml当り／mgである。ONPGについて試
験結果が陽性であれば、即ち37℃で10分間以内に
無色から黄色に変色すれば、これはN.l.の存在を
示す。GGAについて試験結果が陽性ならば、即
ち細菌懸濁液を用いガンマーグルタミル−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミド含有溶液中にお
いて37℃に10分間恒温保持した後に、及びフアス
ト ガーネツトGBC塩（水溶液／ml中およそ0.2
mgの濃度）添加の後に、赤からピンクへの変色が
示されるならば、これはN.m.の存在を示す。PA
について試験結果が陽性ならば、即ち細菌懸濁液
を用いプロリル−４−メトキシ−ベータ−ナフチ
ルアミド含有溶液中において37℃に10分間恒温保
持した後に、及びフアスト ガーネツトGBC塩
溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示され
るならば、これはN.g.の存在を示す。GPAにつ
いて試験結果が陽性ならば、即ちグリシル−プロ
リル−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド含
有溶液中において37℃に20分間恒温保持した後
に、及びフアスト カーネツトGBC塩溶液添加
の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはB.c.の存在を示す。 上記の諸試験は凹味（複数）を有する一個の平
板の上で遂行し得るものであつてN.g.，N.m.及
びN.l.を迅速（即ち30分間以内）に同定させる。
更にSBA又はSTAとWGAとの組合せの使用に
より、及び自動的凝集が問題である場合には
DNA′アーゼ及び（又は）無水コハク酸を用いて
試料を処理することにより、同定の正確度は増大
する。
めの適当なジアゾカツプリング染料は下記の諸物
質を包含する：４−アミノ−２，５−ジメトキシ
−4′−ニトロゾベンゼンジアゾニウム塩；テトラ
アゾ化されたＯ−ジアニシジン；ジアゾ化された
−4′−アミノ−2′，5′−ジエトキシベンズアニリ
ドの塩化亜鉛塩；４−ベンゾイルアミノ−２，５
−ジメトキシアニリン塩化亜鉛塩のジアゾ化物；
Ｏ−アミノアゾトルエンのジアゾニウム塩〔フア
ストガーネツト（Fast Garnet）という名称で公
知されてる〕；アントラキノン−１−ジアゾニウ
ムクロリド；５−ニトロ−２−アミノ−メトキシ
ベンゼン ジアゾテート；N′，N′−ジエチル−
４−メトキシメタニルアミドのジアゾニウム塩；
２−アミノ−４−メトキシベンズアミドのジアゾ
ニウム塩；ジアゾ−２−アミノ−５−クロロアニ
ソール、即ちジアゾ−５−クロロ−Ｏ−アニシジ
ン；５−クロロ−２−トルイジンジアゾニウム
クロリドの半塩化亜鉛塩；５−クロロ−４−ベン
ズアミド−２−メチルベンゼン ジアゾニウム
クロリドの半塩化亜鉛塩；６−ベンズアミド−５
−メトキシ−ｍ−トルイジン ジアゾニウム ク
ロリド；及びその他のジアゾニウム塩。 実施例 本発明に従う検出法の一例は下記の通りであ
る。タイア−マアチン平面培地上に生育させた一
試料を被検物とした。この試料微生物をグラム染
色し、このタイア−マアチン平面培地からグラム
陰性双球菌の純粋培養が得られたことを確認し
た。オキシダーゼテストを行つてこの微生物がオ
キシダーゼ陽性であることを確証した。形態学的
に類似する多数のコロニーを除去してから適宜の
緩衝物質例えばリン酸塩でPH7.2で緩衝された試
験管内の食塩溶液の中で乳化させた。 この細菌懸濁物の最終的な混濁度はマクフアラ
ンド（McFarland）No.３又はNo.４の硫酸バリウ
ム標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管
又は凝集板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一
滴に対しWGA（水溶液又は緩衝溶液／ml当りお
よそ／mg）の一滴を加えた。他の第２の試験管又
は凝集板又は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の他の
一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の一滴を加え
た。第３の試験管又は凝集板／皿の中でこの細菌
懸濁物の一滴に対しSBA又はSTA（水溶液又は緩
衝溶液／ml当りおよそ／mg）の一滴を加えた。
〔すべての該試験管／板／皿を振盪した。〕対照食
塩溶液は振盪後に凝集陰性であるべきである。も
し対照食塩溶液が凝集陽性であるならばこれは自
動的凝集を起したものであるから試料を処理して
この処理済みの細菌懸濁物についてWGA及び
SBA／STAを用いて自動的凝集試験を行うべき
である。自動的凝集を逆転させる適宜の処理とし
てはWGA及びSBAを用いる凝集試験の遂行以前
に0.2mlの試料に対し0.005mlの無水コハク酸溶液
を加える。WGA及びSBA／STAを用いる凝集
反応が陽性であればこれはN.g.又は不被嚢（non
−encapsulated）のM.c.の存在を示す。WGA使
用による凝集が陰性であるがSBA／STA使用に
よる凝集が陽性であるならばこれはN.m.又はN.
g.（その表面構造は変化している）の存在の可能
性を示す。 次に試料の一滴を下記の基質の各溶液の一滴に
対して別々に添加する：ガンマーグルタミル−４
−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、プロリル
−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、
ONPG、及びグリシル−プロリル−４−メトキ
シ−ベータ−ナフチルアミド。但し濃度はトリス
−NCl（Tris−NCl）緩衝溶液又はリン酸塩緩衝
溶液中／ml当り／mgである。ONPGについて試
験結果が陽性であれば、即ち37℃で10分間以内に
無色から黄色に変色すれば、これはN.l.の存在を
示す。GGAについて試験結果が陽性ならば、即
ち細菌懸濁液を用いガンマーグルタミル−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミド含有溶液中にお
いて37℃に10分間恒温保持した後に、及びフアス
ト ガーネツトGBC塩（水溶液／ml中およそ0.2
mgの濃度）添加の後に、赤からピンクへの変色が
示されるならば、これはN.m.の存在を示す。PA
について試験結果が陽性ならば、即ち細菌懸濁液
を用いプロリル−４−メトキシ−ベータ−ナフチ
ルアミド含有溶液中において37℃に10分間恒温保
持した後に、及びフアスト ガーネツトGBC塩
溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示され
るならば、これはN.g.の存在を示す。GPAにつ
いて試験結果が陽性ならば、即ちグリシル−プロ
リル−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド含
有溶液中において37℃に20分間恒温保持した後
に、及びフアスト カーネツトGBC塩溶液添加
の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはB.c.の存在を示す。 上記の諸試験は凹味（複数）を有する一個の平
板の上で遂行し得るものであつてN.g.，N.m.及
びN.l.を迅速（即ち30分間以内）に同定させる。
更にSBA又はSTAとWGAとの組合せの使用に
より、及び自動的凝集が問題である場合には
DNA′アーゼ及び（又は）無水コハク酸を用いて
試料を処理することにより、同定の正確度は増大
する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ナイセリア・ゴノレ、ナイセリア・メニンギ
チジス及びブランハメラ・カタラリスからなる群
から選択されるナイセリア菌の存在を検出する迅
速方法であつて、以下の工程： (1) 前記ナイセリア菌を、ガンマーグルタミルー
ナフチルアミド、プロリン−ナフチルアミド及
びグリシル−プロリル−ナフチルアミドからな
る群から選択される迅速基質（前記各基質は、
４位、６位又は両位置において、電子供与基で
置換されている）と接触させる工程、及び (2) 前記工程(1)の反応生成物をジアゾ染料呈色剤
とカツプリングさせ、視認できる色を形成さ
せ、前記ナイセリア菌の存在の表示として前記
視認できる色を検出する工程、 を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47266383A | 1983-03-07 | 1983-03-07 | |
| US472663 | 1990-01-30 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3860893A Division JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59220200A JPS59220200A (ja) | 1984-12-11 |
| JPH0563158B2 true JPH0563158B2 (ja) | 1993-09-09 |
Family
ID=23876437
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4477784A Granted JPS59220200A (ja) | 1983-03-07 | 1984-03-07 | 微生物の検出方法 |
| JP3860893A Pending JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3860893A Pending JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0122023A1 (ja) |
| JP (2) | JPS59220200A (ja) |
| CA (1) | CA1219201A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3345748A1 (de) * | 1983-12-17 | 1985-08-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase |
| CA1298763C (en) * | 1986-06-16 | 1992-04-14 | Mary Lou Gantzer | Rapid detection of n. gonorrhoeae without culture |
| US5554388A (en) * | 1989-02-25 | 1996-09-10 | Danbiosyst Uk Limited | Systemic drug delivery compositions comprising a polycationi substance |
| GB9700624D0 (en) | 1997-01-14 | 1997-03-05 | Danbiosyst Uk | Drug delivery composition |
| CA2322639C (en) | 1998-03-18 | 2006-10-10 | Boston Scientific Limited | Improved ptfe vascular prosthesis and method of manufacture |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3862011A (en) * | 1971-08-16 | 1975-01-21 | Robert E Smith | Method for quantitatively determining enzyme concentrations in homogenates |
| US3957584A (en) * | 1974-09-30 | 1976-05-18 | Warner-Lambert Company | Detection of beta-galactosidase producing micro-organisms |
| US4298689A (en) * | 1978-09-25 | 1981-11-03 | Research Corporation | Gonorrhea diagnostic test |
| GB2031949B (en) * | 1978-10-16 | 1983-01-06 | American Home Prod | Identification of microrganisms |
| WO1980002433A1 (en) * | 1979-05-02 | 1980-11-13 | Nat Res Dev | The identification of bacteria |
-
1984
- 1984-03-06 CA CA000448977A patent/CA1219201A/en not_active Expired
- 1984-03-07 JP JP4477784A patent/JPS59220200A/ja active Granted
- 1984-03-07 EP EP84301507A patent/EP0122023A1/en not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-02-26 JP JP3860893A patent/JPH0622792A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59220200A (ja) | 1984-12-11 |
| JPH0622792A (ja) | 1994-02-01 |
| EP0122023A1 (en) | 1984-10-17 |
| CA1219201A (en) | 1987-03-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |