JP2001128666A - 血液またはヘミンを含む色素原指示培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液またはヘミンを含む微生物用の培地、特
に血液を有するトリプティカーゼ大豆寒天およびチョコ
レート寒天を公知の色素原基質と一緒にして色素原培地
を生成する。 【解決手段】 これらの色素原を調製する方法は、色素
原基質を既に調製された培地の表面に添加すること、ま
たは培地を調製するときに培地に色素原基質を取り込ま
せることを含む。これらの培地を使用して試料中の微生
物を識別する方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】微生物を生育させ、同定する
ための色素原指示培地に関する。

【０００２】

【従来の技術】病原性生物を含有する疑いのある試料中
の細菌、カビまたは酵母などの微生物の識別および同定
は、重要である。非病原性生物は、病原性生物から区別
されなければならない。臨床的に得られた試料や、たと
えば上水道などの環境試料や、家禽畜産および乳製品を
含む食品に基づいた試料いずれにも、混合した細菌、混
合したカビまたは混合した酵母が、非常に頻繁に、試料
中に含まれる。

【０００３】微生物の区別および同定を助ける多くの方
法が開発されてきたが、ほとんどは適切な培地の選択お
よびインキュベーション、選択された微生物をさらに培
養およびインキュベートする形態学的予備分類を含むい
くつかの追加的段階を必要とする。培養物は一般に有意
な生育が検出されるまで１８〜２４時間インキュベート
するので、試料中の微生物の完全な同定は数日かかる場
合もある。

【０００４】例を挙げると、ある特性を有する細菌のみ
を生育させる培地を調製することによって（関心のな
い）いくつかの細菌の生育を抑制することができる。し
かし、成分または成分の濃度を変化させてどのような培
地を調製するにしても、一般的に培地の選択によって試
料中に存在する全細菌種をはっきり同定および分類する
ことはまだ可能ではない。通常形態の顕微鏡検査および
さらなる検査が必要であるか、または複数の異なる培地
の使用が必要である。

【０００５】このことを背景として、種々の微生物の識
別に色を使用することが試みられた。

【０００６】微生物の識別および同定に色を使用するこ
とは長年知られてきたが、今日までこれらの方法は、色
変化の低下、形成した色の拡散または蒸発、細菌間の識
別ができなかったり、培地の色を背景として読み取るこ
とが困難な色の発生、または発色のために、ＵＶ照射を
含むいくつかの段階が必要なことを含めて多くの欠点を
抱えてきた。

【０００７】比較的最近、いわゆる色素原培地が微生物
の識別に使用されるようになってきた。

【０００８】微生物を検出および識別する色素原培地に
使用される第１の方法は、以下に示すようにグリコシダ
ーゼ基質の反応である。色を形成するこの基本的な化学
反応の例としては、分子生物学でｌａｃＺ遺伝子の発現
を監視するために通常使用される試薬Ｘ−Ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピ
ラノシド）が挙げられる。この無色基質は、ガラクトシ
ダーゼと反応して、不溶性のインジゴブルー生成物を生
成する。

【０００９】

【化１】

【００１０】この酸化段階は迅速に起こり、不安定な３
−ヒドロキシインドールからインジゴ化合物を生成す
る。この酸化は空気によって媒介されることが可能であ
り、またいくつかの生物では細胞代謝過程に関係するこ
とも可能である。微生物の指示薬としてインジゴ化合物
が有利な点の１つは、これらが微生物内に局在するため
色変化の低下および拡散を防止する助けとなることであ
る。このインジゴ化合物はまた、微生物の生育に対して
比較的無毒である。もう１つの有利な点は、インドリル
環の置換基を変化させることによって数種の色を使用で
きることである。これによって、グリコシダーゼ活性の
違いによって微生物を識別することが可能になる。この
ような着色した基質生成物のリストを以下に挙げる。

【００１１】

【化２】

【００１２】公知のインドリルグリコシド基質生成物

【００１３】

【表１】

【００１４】グリコシダーゼ基質に加えて、ｐＨ指示薬
のような色素がしばしば色素原培地に使用される。エス
テラーゼ、ホスファターゼおよび他の酵素用の色素原イ
ンドリル基質も、いくつかの用途で使用される。これら
はグリコシダーゼ基質と同様に作用する。一例として、
「Ｍａｇ−Ｐｈｏｓ」を以下に示す。

【００１５】

【化３】

【００１６】近年、この基礎的な化学反応を利用した試
験方法の例が多数報告されており、そのいくつかを以下
に記載する。

【００１７】サルモネラの迅速な同定は重要な公衆衛生
問題である。この目的のためＣ₇〜Ｃ₁₀脂肪酸に結合し
た色素原化合物を含む培地、およびこの色素原化合物の
遊離を促進する適切な界面活性剤がＷＯ９４／０９１５
２で提案されている。この色素原化合物はカプリル酸５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルが好ましく、こ
の界面活性剤は縮合多環式界面活性剤から選択される。
β−グルコシドおよび／またはβ−ガラクトシドを添加
すると有利である。

【００１８】ＧＵＳ酵素の基質としてインドリルグルク
ロン酸から誘導された色素原化合物はＷＯ９４／０８０
４３に記載されている。

【００１９】１個の試料を用いた１回の試験でＥｓｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉと通常の大腸菌群とを区別する
ために、試験培地中で色素原β−ガラクトシダーゼとβ
−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを組み
合わせることは、米国特許第５２１００２２号に開示さ
れている。

【００２０】β−グルクロニダーゼと反応したとき第１
の色を形成することのできる色素原β−グルクロニダー
ゼ基質と、アリールスルファターゼと反応したとき第２
の色を形成することのできる色素原アリールスルファタ
ーゼ基質と栄養基を含む、尿試料中に認められる細菌を
同定するのに有用な検査培地は、米国特許第５４６４７
５５号に記載されている。ミルク由来の化合物などの蛋
白質の不透明化合物を試験培地に含めることができる。
特異的着色を使用し、明確にサルモネラコロニーを単離
する培地が、米国特許第５１９４３７４号に記載されて
いる。この培地には、ペプトン、サルモネラによって代
謝されるポリオール、および酸性化に感受性のあるｐＨ
指示薬が含まれる。このポリオールは粉状物質に吸着さ
れる。この培地はまた、デオキシコール酸および色素原
β−ガラクトシダーゼ基質を含む。

【００２１】特定の微生物種の有無を明らかにする方法
では、ＷＯ９５／０４１５６に開示されているように、
少なくとも１種の種特異的酵素基質色素原、および高濃
度の炭水化物から選択された少なくとも１個の化合物が
培地に追加されている。この色素原が加水分解される
と、発色基の元の色とは異なった色が生じる。

【００２２】Ｘ−グルクロニドなどの活性化剤として８
−ヒドロキノリン−β−Ｄ−グルクロニドを有するＥ．
ｃｏｌｉの生育培地を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを同定す
る方法がＥＰ００２５４６７に開示されている。この方
法では、Ｅ．ｃｏｌｉは暗い着色した小球として示され
る。

【００２３】Ｅ．ｃｏｌｉ栄養培地中で色素原試薬、イ
ンドキシル−β−Ｄ−グルクロニドとフィルタを接触さ
せてインキュベートすることによって、適切な膜フィル
タを通過した液体試料中にＥ．ｃｏｌｉが存在すること
を決定することは、米国特許第４９２３８０４号に記載
されている。Ｅ．ｃｏｌｉはインジゴブルーとして表れ
る。

【００２４】１種の培地中のエンテロバクターを同定す
る方法は、米国特許第３８７０６０１号に開示されてい
る。この培地は色素原β−ガラクトシド基質とデカルボ
キシラーゼ基質、デアミナーゼ基質、ウレアーゼ基質、
二硫化水素検出系、または炭水化物発酵系との混合物を
含む。ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピ
ラノシド）が適切なものとして開示されている。

【００２５】ＷＯ９７／３６００１には、２種の異なる
色素原と、糖の発酵による酸性化によってｐＨ指示薬が
色変化することを促進するｐＨに調製した試験培地中で
糖の発酵を可能にする生物材料とを使用して、細菌が識
別される。

【００２６】（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅを除く）サルモネ
ラの直接的検出は、米国特許第５４３４０５６号に記載
されているように、培地中にβ−ガラクトシダーゼによ
って加水分解され得る色素原または蛍光化合物と一緒
に、グルクロン酸およびｐＨ指示薬を組み合わせること
によって可能になる。

【００２７】ＷＯ９６／４０８６１は他の技術と同様、
生命に関わる可能性のあるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ
７およびサルモネラなどの病原体を同定することに関す
るものである。この明細書によれば、プロピオン酸と、
ガラクトシダーゼ基質やグルクロニダーゼ基質などの１
種または複数の色素原基質と、栄養基を含む液体または
固体培地でもこれらの細菌を同定することができる。

【００２８】グリシンアミノペプチダーゼ基質を使用し
て、非病原体からＬｉｓｔｅｒｉａの病原性単一細胞質
遺伝子種を識別することは、米国特許第５３３０８８９
号に開示されている。

【００２９】酵母の異なる種の同定および識別は、フラ
ンス、パリのＣＨＲＯＭａｇａｒＣｏｍｐａｎｙ製のＣ
ＨＲＯＭａｇａｒ Ｃａｎｄｉｄａプレートを使用して
実施することができる。このプレートで生育させた臨床
試料から得た酵母は、種々の色および形態によって同定
される。たとえばＡ．Ｐ．Ｋｏｅｈｌｅｒ、ｅｔａｌ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７、ｐｐ．４
２２〜２６（１９９９）を参照のこと。このＣＨＲＭａ
ｇａｒ培地は、１リットル当たりペプトン１０ｇ、グル
コース２０ｇ、寒天１５ｇ、クロラムフェニコール０．
５ｇ、および成分が企業秘密となっている「色素原混合
物」から成っている。（Ｅ．Ｔ．Ｓ．Ｈｏｕａｎｇ、ｅ
ｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、５０、ｐｐ．
５６３〜５６５（１９９７）。）酵母のコロニーは、透
明な背景上にピンク色、青色、黄緑色および淡紅色など
の色で表される。

【００３０】ＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ（ＣＡＳ）を使用して、１８時間インキュベートした
後、サルモネラ種は藤色のコロニーとして同定され、一
方、他の腸内細菌類は青色または無色のコロニーとして
生育する。（Ｏ．Ｇａｉｌｌｏｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７、ｐｐ．７６２
〜６５（１９９９）。）

【００３１】微生物を識別するための多数の方法が知ら
れ報告されていることは明らかであるが、現在知られて
いるこれらの方法は、透明で、したがって色変化が起こ
ったとき良好な対比をもたらし、視覚化の容易な培地を
使用することが必要である。ミルクなどの蛋白物質を添
加することによって得られるような不透明な培地もま
た、色素原と共に使用される。しかしこの場合も、感染
した細菌による色変化は検出が容易である。

【００３２】臨床的に重要な細菌、酵母またはカビが全
て前記の色素原培地で培養できるとは限らない。たとえ
ば、いわゆる選好性細菌は特異的な生育条件を有してお
り、通常の培地では生育しない（または有意に生育しな
い）。臨床的に重要な選好性細菌には、ナイセリアおよ
びヘモフィラスが含まれる。これらの細菌の多くは、呼
吸器、脳脊髄および生殖器の体液および分泌物に認めら
れる。

【００３３】これらの選好性細菌については、インキュ
ベーションおよび生育はチョコレート培地、すなわちヘ
モグロビンを含んだ培地で実施される。（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｔ ａｌ．、Ｐｕｂｌ．Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐ．、
８２：３６１（１９６７）を参照のこと）。この名前が
意味するように、チョコレート培地はチョコレートのよ
うに色が褐色である。したがって、色素原培地が細菌の
分類および同定を可能にする意味のある対比をもたらす
かどうかはわからない。

【００３４】ヒツジ血液を有するトリプティカーゼ大豆
寒天（ＴＳＡ）は、明らかな溶血反応が重要なときに選
好性微生物（たとえば、呼吸標本からＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｕｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を培養および単離
するために、通常使用される培地である。この培地は、
形態によってのみ識別ができ、それも極めて困難である
可能性がある他種類の細菌の生育を維持する。血液の存
在のため、この培地は明るい赤色をしており、したがっ
て色変化がこの培地で識別できるかどうかはわからな
い。

【００３５】ヒツジ血液を有するＴＳＡは、微生物によ
る溶血素の生成によって赤血球の透明化（または溶解）
をもたらす溶血に基づいて微生物を分類する。

【００３６】暗色のため、色素原反応がＴＳＡおよび血
液またはチョコレート寒天プレート上で識別できるかど
うかはわからない。さらに、培地中の色素原の存在が、
ヒツジ血液培地を有するＴＳＡ上の溶血反応を妨害する
かどうかもわからない。

【００３７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の一目的は、微
生物を生育させ同定する血液またはヘミンを含む色素原
指示培地を調製することである。

【００３８】本発明の他の目的は、色素原基質を含むＴ
ＳＡおよびヒツジ血液培地を調製することである。

【００３９】本発明の他の目的は、ＴＳＡおよびヒツジ
血液培地上の微生物の色変化に基づいて微生物を識別す
ることである。

【００４０】本発明の他の目的は、色素原基質を含むチ
ョコレート寒天培地を調製することである。

【００４１】本発明のさらに他の目的は、チョコレート
寒天培地上の細菌の色変化に基づいて微生物を識別する
ことである。

【００４２】

【課題を解決するための手段】本発明は、微生物を生育
させ同定する血液またはヘミンを含んだ色素原指示薬培
地に関するものである。

【００４３】本発明はまた、ヒツジ血液５％を有するト
リプティカーゼ大豆寒天（ＴＳＡＳＢ）、またはチョコ
レート寒天などの血液またはヘミンを含み、細菌、酵母
およびカビを含む微生物を色識別するための色素原指示
培地を含む。他の色素またはクリスタルバイオレットな
どの色を生成する化合物も同様に、培地に使用すること
ができる。得られた色素原反応は、これらの非透明な、
すなわち色を有する生育培地で視覚化でき、容易に読み
取ることができる。驚くべきことに、色素原の存在は、
溶血反応、コロニーの大きさや形または他の特性など生
育培地の他の異なる性質に悪影響を及ぼさない。本発明
は、臨床および産業用（たとえば、食品、水、環境また
は薬剤）標本に使用することができ、色素原を有するＴ
ＳＡＳＢおよびチョコレート寒天生育培地で細菌を識別
する方法を含む。本発明はまた、血液またはヘミンを含
む色素原指示薬培地を調製する方法を含む。

【００４４】

【発明の実施の形態】本発明では、色素原を公知の生育
培地ＴＳＡＳＢおよびチョコレート培地と共に使用す
る。

【００４５】ＴＳＡＳＢは市販されている。たとえば、
この生育培地を含む既製のプレートはＢｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｃｋ
ｅｙｖｉｌｌｅ、ＭＤからＴＳＡ ＩＩ（商標）の名称
で入手することができる。このようなプレートは通常冷
蔵して１４〜１６週間安定である。

【００４６】別法として、ＴＳＡＳＢは公知の製法およ
び手順に従って作成することもできる。たとえば、Ｄｉ
ｌｗｏｒｔｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．、２：４５３（１９７５）参照のこと。

【００４７】チョコレート寒天生育培地も市販されてお
り、既製のプレートおよび試験管斜面培地はＢｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏ
ｃｋｅｙｖｉｌｌｅ、ＭＤなどの製造会社からからチョ
コレート寒天ＩＩの名称で入手することができる。

【００４８】チョコレート寒天は、また、公知の製法お
よび手順に従って作成することもできる。たとえば、Ｍ
ａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｕｂｌ．Ｈｅａｌｔｈ
Ｒｅｐ．、８２：３６１（１９６７）を参照のこと。

【００４９】本明細書の背景の所で記載したように、適
切な色素原基質とは、標的細菌内にある酵素の作用を受
けて、不溶性の色を有する生成物を生じる、細菌内部に
含まれる化合物である。このような色素原基質は多く知
られていて、それぞれが特異的な酵素の標的となる。

【００５０】適切な色素原基質の例を以下に示す。この
表は全てを含むものではない。このような化合物は他に
も知られており、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、イリノ
イ）、ＩＮＡＬＣＯ（ミラノ、イタリア）、ＢＩＯＳＹ
ＮＴＨ（ＡＧ Ｓｔａａｄ、スイス）、ＢＩＯＳＹＮＴ
Ｈ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（ネーパーヴィル、イ
リノイ）およびＧＬＹＣＯＳＹＮＴＨ（ウォリントン、
チェシア、英国）などの会社から市販されている。

【００５１】

【表２】

【００５２】

【表３】

【００５３】前記のものなどの色素原基質は、少なくと
も２通りの方法で生育培地に添加することができる。

【００５４】少量の色素原基質、０．０５から０．２
ｇ、好ましくは０．０５から０．１ｇ（たとえば、０．
０８ｇ）を少量のＤＭＳＯ（たとえば、１ｍｌ）に添加
することができる。次いで、この溶液を少量（たとえば
約５０マイクロリットル）既製培地、ＴＳＡＳＢまたは
チョコレート寒天の表面に添加し、その後塗沫棒を用い
て分散させる。次いで、このプレートを覆いをして３〜
４時間乾燥させる。分散中に不溶性の粉末状の沈殿物が
形成する場合があることに留意されたい。

【００５５】生育培地に色素原基質を取り込ませる他の
方法は、公知の手順に従って新たに培地を調製すること
である。色素原は全て、０．１ｇ／ｌ（適切な範囲は
０．０５から０．２０ｇ／ｌである）の好ましい濃度で
加圧蒸気滅菌後の基質に無菌的に添加する。色素原は、
水に不溶性の場合は、ＤＭＳＯに予備溶解するかまたは
粉末として添加する。色素原はまた、加圧蒸気滅菌前に
添加することもできる。

【００５６】色素原基質を取り込ませる他の方法は、当
業者には明らかであろう。

【００５７】本発明で使用することが可能なカビは当業
者には公知のもので、アスペルギウス種、トリコスポロ
ン種、ゲオトリクム種などが含まれ、本発明で評価する
ことが可能な酵母は、当業者には公知で、カンジダ種お
よびクリプトコッカス種が含まれる。

【００５８】本発明を使用して生育させ識別される細菌
は、血液またはヘミンを含む培地で生育することに適し
ていることが知られている細菌である。既に記載したよ
うに、選好性細菌はチョコレート寒天培地に向いてい
る。例としてはヘモフィルス種およびナイセリア種が含
まれる。

【００５９】このような細菌の原料には、痰、尿および
血液などの臨床試料、食品、水、環境または薬剤試料な
どの産業原料が含まれる。

【００６０】ＴＳＡＳＢに適した細菌もまたよく知られ
ている。例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｙｇｅｎｅｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｇａｌａｃｔｉａｅがある。

【００６１】ＴＳＡＳＢに適した細菌の試料は、臨床試
料および産業試料を含む多くの原料から得ることができ
る。

【００６２】もちろん、よく知られているように、識別
された特異的微生物は、バージニア州マナッサスのＡＴ
ＣＣ、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ などの供給元から得ることができる。

【００６３】種々の色素原基質をＴＳＡＳＢおよびチョ
コレート寒天培地の両方に使用した特定の実施例を以下
に記載する。以下に記載した特定の実験は、様々な細菌
が色素原基質の存在に対して異なる反応をすることを示
している。

【００６４】いくつかの細菌は濃い青色、緑色またはピ
ンク色などの色を生じ、おそらく形態学的特性と組み合
わせて試料中の他の細菌から識別されよう。場合によっ
ては、特定の細菌は同種の他の細菌が色を生じるのに対
して、無色のままであり、したがってこの細菌を識別す
る別の基準となる。さらに、特定の細菌は試料中の他の
細菌とは異なる色を生じる可能性がある。これによっ
て、試料中の他の細菌からその細菌を識別するさらに他
の手段となる。

【００６５】

【実施例】実施例１ この一連の実験では、以下に示した色素原をそれぞれ
０．０８ｇずつＤＭＳＯ１．０ｍｌに添加して徹底的に
混合した。透明な薄いオレンジ色で表されるＭａｇ−Ｐ
ｈｏｓを除いて色素原は全て溶解するのは明らかで、透
明かつ／または無色の溶液となる。

【００６６】

【表４】

【００６７】

【表５】

【００６８】各色素原溶液５０μｌを以下の既製のプレ
ート培地それぞれの表面に添加した（１プレート当たり
１色素原）。

【００６９】ＴＳＡＩＩ ヒツジ血液５％、チョコレー
トＩＩ、およびＴＳＡ平板（血液なし）

【００７０】既製のプレート培地は全てＢｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、ＭＤから入手した。

【００７１】この溶液を塗布棒を用いて分散し、覆いを
して３〜４時間乾燥させた。透明なままであったＸ−Ｇ
ｕｃｕｒｏ（ｓ）を除いて、場合によっては、分散中に
粉末状の不溶性沈殿が形成した。しかし、１週間後に
は、Ｘ−ＧｌｕｃｏｓｉｄｅおよびＸ−Ａｃｇｌｍｎプ
レートにのみいくらかの沈殿が認められた。

【００７２】細菌の試験株を０．５マックファーランド
当量に調整し、無菌食塩水で１：１０に希釈した。次い
でこのプレートに標準画線接種法で接種した。

【００７３】以下の細菌を評価した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ２５９２２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２５９２３、Ｓ．ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓ １２２２８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ６３０３、Ｇｒｏｕｐ Ｂ群
連鎖球菌１２３８６、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｅ ３５５４０、１０２１１、Ｂｒａｎｈ
ａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ２５２３８、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ １３
０９０、Ｎ．ｓｉｃｃａ ２９１９３、Ｎ．ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅ３５２０１、およびＧａｒｄｎｅｒｅｌｌ
ａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ １４０１９。

【００７４】プレートは全て３５℃で２０〜２４時間イ
ンキュベートした。ヒツジ血液を有するＴＳＡＩＩおよ
びＴＳＡ ＩＩ（素寒天）は空気中でインキュベートし
たが、チョコレート培地はＣＯ₂（５％）中でインキュ
ベートした。

【００７５】インキュベーション後、このプレートの四
半分における読取り可能なコロニーによって生育評価し
た。

【００７６】細菌の選好性株は、チョコレートＩＩ寒天
についてのみ検査した。これらの検査の結果を以下の表
６〜９に示した。

【００７７】

【表６】

【００７８】種々の色素原基質を追加した５％ヒツジ血
液を有するＴＳＡ ＩＩ、ＴＳＡ素寒天およびチョコレ
ートＩＩ寒天上での微生物コロニーの生育による色形成
の評価

【００７９】

【表７】

【００８０】

【表８】

【００８１】

【表９】

【００８２】驚くべきことに、色素原基質は有機溶媒ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、濃い色を有
する培地（すなわち、血液またはヘミンを含む培地）の
表面に添加したり、または取り込ませたりしたとき、微
生物の生育を維持でき微生物の色による識別を可能にす
ることが発見された。

【００８３】Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅは、いずれの種もＭａｇ−ｐｈｏｓを有するチョ
コレート寒天上で濃い紫色として表れる。これによっ
て、無色として表れる他の正常な痰細菌叢からはっきり
と識別される。

【００８４】Ｂ群連鎖球菌は、Ｘ−Ｇｌｕｃｕｒｏを有
するＴＳＡＳＢ上でベータ溶血により青色として表れ
る。

【００８５】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａは、Ｍａ
ｇ−ｐｈｏｓを有するチョコレート寒天上で紫として表
れる。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは無色として表れ
る。

【００８６】これらの実験を実施するに当たり、プレー
ト培地に添加するとき、Ｘ−ＣａｐおよびＭａｇ−ｐｈ
ｏｓは多少不溶性で白色の沈殿を形成する。これらの２
種の化合物はまた、最も高い阻害活性を有する。これら
の化合物の使用濃度が高すぎる可能性がある。

【００８７】実施例２ 実施例１の手順を使用して、以下の表に示した細菌をＴ
ＳＡ ＩＩ ヒツジ血液５％およびチョコレートＩＩ寒
天で評価した。いずれの場合も、色素原は既製のプレー
ト培地の表面に５０μｌＤＭＳＯに溶かして０．００４
ｇ／プレートで添加した。以下の細菌を評価した。Ｂｒ
ａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｒｉｓ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａ
ｌｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｕｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＣ、Ｆおよび
Ｇ群連鎖球菌。

【００８８】コロニー色形成に対する生育条件（インキ
ュベーション）の影響を評価するために計画したこの実
験の結果を以下の表に示した。

【００８９】

【表１０】

【００９０】

【表１１】

【００９１】

【表１２】

【００９２】

【表１３】

【００９３】前表のデータの検討から認められるよう
に、Ｘ−ＡｃｇｌｍｎおよびＸ−Ｇａｌは微好気性また
は嫌気性条件下で生育する他のｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
種からＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを識別するために有
用である可能性がある。また、Ｘ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇｌｕ
ｃｕｒｏｎｏおよびＭａｇ−Ｐｈｏｓは、周囲空気条件
に加えて微好気性または嫌気性条件下で生育するＥ．ｃ
ｏｌｉを識別するために使用できる可能性がある。

【００９４】実施例３ この一連の実験では、色素原基質は培地を調製しプレー
トに分配する前に培地に直接添加した。

【００９５】ＴＳＡ ＩＩ基質およびヒツジ血液５％か
らなる研究室調製培地は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＢＢＬ
（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、４版、Ｄ．Ａ．Ｐｏｗｅｒ
ａｎｄ Ｐ．Ｊ．ＭｃＣｕｅｎ著、１９８８に記載さ
れた手順に従って調製した。色素原は全て加圧蒸気滅菌
後の基質に０．１ｇ／ｌ培地の濃度で無菌的に添加され
た。色素原は（水に不溶性の場合）粉末としてまたはＤ
ＭＳＯに予備溶解して添加された。１例では、色素原は
加圧蒸気滅菌前に添加された。

【００９６】使用した色素原基質を以下に記載する。以
下の表で、 Ｘ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル Ｍａｇ＝５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル Ｓａｌ＝６−クロロ−３−インドリルである。

【００９７】

【表１４】

【００９８】（表１６，１７に定義した通りの略号の）
５５株全てを、前記の培地を使用して試験した。プレー
トはＣＯ₂および空気、またはＣＯ₂のみでインキュベー
トした。プレートは全て１８〜２４時間後に、色、溶血
活性、および生育を非色素原対照と比較して読み取っ
た。

【００９９】色は、得られた色をより正確かつ完全に同
定するために、以下に示したようにパントン値を使用し
て評価した。

【０１００】

【表１５】

【０１０１】前記の色略号の前に使用した、ｄ＝濃い、
ｌ＝薄い、ｖｌ＝非常に薄い、である。

【０１０２】細菌株は通常の生理食塩水で０．５マック
ファーランドに調製し、１０分の１に希釈した。

【０１０３】プレートに標準画線プレート法またはＳｔ
ｔｅｒｓレプリケータを使用して接種した。Ｓｔｅｅｒ
ｓ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ．、９：３０７〜３１１（１９５９）。

【０１０４】結果を以下の表１６，１７および１８〜２
３に示した。

【０１０５】

【表１６】

【０１０６】

【表１７】

【０１０７】

【表１８】

【０１０８】

【表１９】

【０１０９】

【表２０】

【０１１０】

【表２１】

【０１１１】

【表２２】

【０１１２】

【表２３】

【０１１３】

【表２４】

【０１１４】

【表２５】

【０１１５】また驚くべきことに、色素原基質は濃い色
の培地（すなわち、血液またはヘミンを含む栄養培地）
の表面に添加するか取り込ませて微生物を同定／識別す
るために役立つことができることが発見された。

【０１１６】前記の表のデータの検討から認められるよ
うに、（３株中３株とも）Ｂ群連鎖球菌はＸ−ｇｌｕｃ
ｏｓｉｄｅ ＴＳＡ ＩＩ上で青色のコロニーとして得
られた。コロニー溶血活性は、少し減少していた。ＣＡ
ＭＰ試験は、（Ｍａｎｕａｌｏｆ ＢＢＬ（商標）Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏ
ｃｅｄｕｒｅｓに記載されているように）Ｘ−ｇｌｕｃ
ｏｓｉｄｅ ＴＳＡＩＩ上で首尾良く行われる。ＰＹＲ
試験は（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６版、Ｐ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ、
Ｅ．Ｊ．Ｂａｒｏｎ、Ｍ．Ａ．Ｐｆａｌｌｅｒ、Ｆ．
Ｃ．Ｔｅｎｏｖｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｙｏｌｋｅｎ、
１９９５ ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、ワシントン、ＤＣ）、
やはり青色になる可能性のあるＳ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ
またはＤ群連鎖球菌を除外するために必要であろう。
Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ７種のうち４種は薄い灰青色を
示した。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ７種のうち７種が青
色を呈した。

【０１１７】Ｄ群連鎖球菌（７株中７株）はＸ−Ａｃｇ
ｌｍｎ上で濃い青色コロニーを示した。グラム陰性株
２、３種、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ１種およびＳ．ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ１種もまた、青色のコロニーを示し
た。

【０１１８】ＣＯ₂インキュベーションは、一般に全て
の色素原において空気インキュベーションに対して少し
強い色反応をもたらした。

【０１１９】加圧蒸気滅菌の前にＸ−色素原を添加する
ことによって、性能に影響はなかった。

【０１２０】Ｍ−ＣａｐおよびＸ−Ｓｕｌｆはほとんど
の生物に対して不活性であった。文献では、デオキシコ
ール酸ナトリウムはサルモネラ種によるＭ−Ｃａｐ反応
に重要である可能性があることを示唆している。Ｃｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒの１株は、Ｘ−Ｓｕｌｆ ＴＳＡ Ｉ
Ｉで灰青色になった。

【０１２１】色素原のいくつか、特にマジェンタ基質
は、インキュベーション後、特にＣＯ ₂インキュベーシ
ョン後血液寒天を濃くする原因となった。プレートの色
が濃くなることによって、紫色の色反応および溶血反応
の読み取りが困難になった。

【０１２２】Ｘ−ｇａｌはグラム陽性菌に特に有用とい
うわけではない。ＩＰＴＧはＸ−ｇａｌによっていくつ
かの株の反応性を減少させるようである。Ｅ．ｆａｅｃ
ｉｕｍ（ＡＴＣＣ ４９０３２）はＸ−Ｇａｌで濃い青
色であるが、ＩＰＴＧを有するＸ−Ｇａｌでは無色であ
った。

【０１２３】期待通り、血液プレートの赤い表面に対し
て明確な対比を示すコロニー色を生成する色素原は最適
である。青色−色素原、Ｘ−基質（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドキシル）は６１５ｎｍに吸収極大を有
し、約５１５ｎｍの赤血球プレートから最も良く識別さ
れる。紫／赤／マジェンタコロニーを生成するいくつか
の色素原は、赤血球プレートの背景に対して読み取るの
が容易ではない。

【０１２４】前記のデータに基づき、色の対比を以下に
まとめて示した。

【０１２５】

【表２６】

【０１２６】^*化合物は不安定で、陽性対照（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ２５９２２）との反応が乏しかった。

【０１２７】実施例では血液またはヘミンを含む培地と
してＴＳＡＳＢおよびチョコレート寒天を使用している
が、本発明はこれら２種の培地に限定されない。

【０１２８】欧州で広く使用されている血液を添加した
Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天基質など他の同様の血液またはヘ
ミンを含む培地も本発明に有用であることが期待され
る。この培地は市販されており、ＴＳＡＳＢよりもアミ
ノ酸および炭水化物を多く含む。

【０１２９】ただし、細菌は生育するが色の変化のな
い、血液を有する市販のＢｒｕｃｅｌｌａ寒天を使用し
ないようにすべきことに留意されたい。

【０１３０】前記の実施例は純粋に例示的なものであっ
て、本発明の範囲を限定するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 マイケル シー． ゴスネル アメリカ合衆国 21047 メリーランド州 フォールストン ミル クリーク ロー ド 1208 (72)発明者 キャリー エー． ヒューエス アメリカ合衆国 21120 メリーランド州 パークトン ブライアー グローブ コ ート ３ (72)発明者 ポール イー． ゴールデンバウム アメリカ合衆国 21074 メリーランド州 ハンプステッド ブルターニュ レーン 3931

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物を生育させ、同定するための色素
   原指示培地であって、 ｉ）血液またはヘミンを含む栄養分と、（ｉｉ）色素原
   と、を含むことを特徴とする色素原指示培地。
2. 【請求項２】 成分（ｉ）がチョコレート寒天またはト
   リプティカーゼ大豆寒天および血液であることを特徴と
   する請求項１に記載の色素原指示培地。
3. 【請求項３】 前記微生物が細菌または酵母であり、前
   記色素原がＸ−結合色素原、マジェンタ−結合色素原ま
   たは蛍光色素原であることを特徴とする請求項１に記載
   の色素原指示培地。
4. 【請求項４】 前記蛍光色素原が約１０ｎｍと４００ｎ
   ｍとの間に吸収極大を有することを特徴とする請求項１
   に記載の色素原指示培地。
5. 【請求項５】 前記色素原が、Ｘ−Ａｃｇｌｍｎ、Ｘ−
   ｇｌｕｃｏｄｉｄｅ、Ｘ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅまた
   はＭａｇ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅであることを特徴とする
   請求項１に記載の色素原指示培地。
6. 【請求項６】 前記色素原が約４００ｎｍと８００ｎｍ
   との間に吸収極大を有することを特徴とする請求項１に
   記載の色素原指示培地。