JP2744821B2 - インターロイキン４レセプター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にサイトカインレセプターに関し、より
詳細にはインターロイキン４レセプターに関する。

（従来の技術） インターロイキン４（IL−４と略記する;B細胞刺激因
子またはBSF−１とも呼ばれている）はもともと、細胞
表面免疫グロブリンに特異的な抗体の低濃度に応答して
Ｂ細胞の増殖を刺激する能力により同定された。比較的
最近になつて、IL−４はＴ細胞、肥満細胞、顆粒球、血
小板生成細胞および赤血球の増殖の同時刺激を含めたか
なり広範囲の生物学的活性スペクトルを有することが判
明した。さらに、IL−４は数種のIL−２およびIL−３依
存性細胞系列の増殖を刺激し、休止Ｂ細胞面でのクラス
II主要組織適合複合分子の発現を誘導し、そして刺激さ
れたＢ細胞によるIgEおよびIgG1アイソタイプの分泌を
増強する。ネズミおよびヒトIL−４は両方とも、組換え
DNA技術および天然ネズミタンパク質の均一精製により
最終的に同定された（Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA83:5894、1986;Noma et al.,Nature 319:640、19
86;およびGrabstein et al.,J.Exp.Med.163:1405、198
6）。

IL−４の生物学的活性は、哺乳動物由来の一次細胞お
よびin vitro細胞株により発現されるIL−４に特異的な
細胞表面レセプターによつて仲介される。IL−４はこの
レセプターに結合し、その後レセプターは種々の免疫エ
フエクター細胞へこの生物学的信号を伝達する。従つ
て、精製されたIL−４レセプター（IL−4Rと略記する）
組成物は、IL−４またはIL−４レセプターの診断検定
に、あるいは診断または治療に用いるためのIL−４レセ
プターに対する抗体を誘起させるのに有用であるだろ
う。さらに、精製されたIL−４レセプター組成物はIL−
４を結合または排除するために治療において直接用いら
れ、このサイトカインの生物学的活性を調節する手段を
提供するであろう。

IL−４は十分詳しくその性状が決定されているが、そ
のレセプターについての性状決定はほとんど進歩してい
ない。広範囲の細胞型にIL−４レセプターが存在するこ
とを論じた数多くの研究が発表されたが、その構造的性
状決定はレセプターと放射性標識IL−４分子との化学的
架橋によつて形成される共有結合複合体のSDS−PAGE分
析により測定されたこのタンパク質の概算分子量に限ら
れている。Oharaら（Nature 325:537、1987）およびPar
kら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:1669、1987）は、Ｂお
よびＴリンパ球並びに広範囲の造血系統の細胞上に少数
発現された高親和性レセプターと結合する放射性ヨウ素
化組換えネズミIL−４を用いて、IL−４レセプターの存
在を初めて証明した。¹²⁵I−IL−４をIL−4Rへ親和性架
橋させることにより、OharaらおよびParkらはそれぞれ6
0,000および75,000ダルトンの見掛け分子量をもつレセ
プタータンパク質を同定した。ネズミ細胞において観察
された小さい分子量のレセプターは天然レセプターの加
水分解により開裂された断片でありうる。酵母により誘
導された¹²⁵I標識組換えヒトIL−４を用いるParkら（J.
Exp.Med.166:476、1987）によるその後の実験は、ヒトI
L−４レセプターがＢ、Ｔおよび造血系統の細胞に存在
するばかりでなく、ヒト線維芽細胞、上皮および内皮由
来の細胞にも見られることを示した。IL−４レセプター
はそれ以来CBA/N脾Ｂ細胞（Nakajima et al.,J.Immuno
l.139:774、1987）、バーキツトリンパ種ジシヨイ（Jij
oye）細胞（Cabrillat et al.,Biochem.＆ Biophys.Re
s.Commun.149:995、1987）、多種多様の造血および非造
血細胞（Lowenthal et al.,J.Immunol.140:456、198
8）、およびネズミLyt−2^-／L3T4^-胸腺細胞を含む他の
細胞系列にも存在することが見出されている。最近、Pa
rkら（UCLA Symposia,J.Cell Biol.,Suppl.12A、1988）
は、十分量のプレテアーゼ阻害剤の存在下で、138〜145
kDaの¹²⁵I−IL−４結合性原形質膜レセプターを数種の
ネズミ細胞系列において同定したと報じている。このよ
うに、IL−４レセプターの実際の分子量および構造に関
して、かなりの論争がなお残されている。

IL−４レセプターの構造および生物学的特性、並びに
IL−４または他のサイトカイン刺激に対する種々の細胞
集団の応答においてIL−４レセプターが演ずる役割、あ
るいは治療、診断または検定においてIL−４レセプター
を効果的に使用する方法等の研究は、十分量の精製IL−
４レセプターを得ることが困難であつたために、実行で
きなかつた。以前には、高レベルのIL−４レセプターを
構成的かつ連続的に発現する細胞系列が全く知られてい
なかつた。検出可能なレベルのIL−４レセプターを発現
することが知られている細胞系列では、一般に細胞あた
りのレセプターの発現レベルが約2000より少ない。従つ
て、生化学分析用のIL−４レセプター分子を精製する試
み、あるいはIL−４レセプターをコードする哺乳動物遺
伝子をクローン化して発現させる試みは、精製レセプタ
ーおよび適当なレセプターmRNA源の不足により妨げられ
ている。

（発明の目的） 本発明は、哺乳動物インターロイキン４レセプター
（IL−4R）またはそのサブユニツトをコードするDNA配
列を提供する。好ましくは、このようなDNA配列は次の
群：（ａ）天然IL−4R遺伝子のコード領域から誘導され
るヌクレオチド配列を有するcDNAクローン；（ｂ）適当
なストリンジエント条件下で（ａ）のcDNAクローンとハ
イブリダイズでき且つ生物学的に活性なIL−4R分子をコ
ードするDNA配列；および（ｃ）遺伝暗号の結果とし
て、（ａ）および（ｂ）で定義したDNA配列に対し縮重
（egeneracy）の関係にあり且つ生成学的に活性なIL−4
R分子をコードするDNA配列から選ばれる。本発明はさら
に、上記のDNA配列を含む組換え発現ベクター、組換え
発現ベクターを用いて生産された組換えIL−4R分子、お
よび発現ベクターを用いて組換えIL−4R分子を生産する
方法を提供する。

本発明はまた哺乳動物IL−4Rを含む実質的に均質なタ
ンパク質組成物を提供する。全長ネズミ分子はSDS−PAG
Eで測定して約130,000〜約140,000Mrの分子量をもつ糖
タンパク質である。CTLL 19.4ライブラリーからのネズ
ミIL−４レセプタークローン16および18によりトランス
フエクシヨンされたCOS細胞の見掛け結合親和性（Ka）
は１〜８×10⁹M^-1である。ネズミ7B9ライブラリーから
のネズミIL−４レセプタークローン7B9−２および7B9−
４によりトランスフエクシヨンされたCOS細胞のKaは２
×10⁹〜１×10¹⁰M^-1である。成熟ネズミIL−４レセプタ
ー分子は次のようなＮ末端アミノ酸配列を有する:IKVLG
EPTCFSDYIRTSTCEW。

ヒトIL−4R分子は約110,000〜約150,000Mrの分子量を
もつと考えられ、cDNA配列から推定されるそのＮ末端ア
ミノ酸配列は、成熟ネズミタンパク質の生化学的に決定
されたＮ末端配列から類推して、次のとおりである:MKV
LQEPTCVSDYMSISTCEW。

本発明はさらに、上記方法に従つて生成された可溶性
レセプタータンパク質を有効量含有する、治療、診断、
IL−４レセプターの検定、またはIL−４レセプターに対
する抗体の誘導に用いるための組成物を提供する。この
ような可溶性組換えレセプター分子には、IL−４の結合
に必要でないレセプター分子の領域が欠失されている切
断タンパク質が含まれる。本発明のこれらの面および他
の面は以下の詳細な説明および添付図面を参照すること
により明らかになるであろう。

ここで、図面について簡単に説明する。

第１図はネズミこよびヒトIL−4RcDNAのコード領域
（黒の太線で示す）を含むcDNAクローンの制限地図を示
す。制限部位EcoRI、PvuII、HincIIおよびSstIはそれぞ
れ文字Ｒ、Ｐ、ＨおよびＳで表す。

第2A〜Ｃ図は、7B9ライブラリーのクローン7B9−２か
ら誘導されるような、ネズミIL−４レセプターのコード
領域のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。成熟タ
ンパク質のＮ末端イソロイシンはアミノ酸番号１とす
る。クローン7B9−２からの全長膜結合タンパク質のコ
ード領域はアミノ酸１−785で定められる。成熟Ｎ末端
を構成するイソロイシン残基を指定するATCコドンはタ
ンパク質配列の１位に下線が引いてあり；アミノ酸209
−232の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いて
ある。クローン7B9−４、およびCTLL19.4ライブラリー
のクローンCTLL−18並びにCTLL−16のコード領域の配列
は次の点を除いて7B9−２と同じである。CTLL−16のコ
ード領域はアミノ酸−25から233（推定上の25個のアミ
ノ酸から成るシグナルペプチド配列を含む）により定め
られる膜結合IL−４レセプターをコードするが、オープ
ン・リーデイング・フレームを集結させるTAGターミネ
ーターコドン（図示せず）がその後に続いている。核酸
配列はこの位置（第１図に矢印で示す）にスプライス供
与部位が、そして３′末端の近傍（第二の矢印で示す）
にスプライス受容部位が存在することを示しており、CT
LL−16がスプライシングを受けていないmRNA中間体から
誘導されたものであることを示唆する。クローン7B9−
４およびCTLL−18はそれぞれアミノ酸23から199までと
−25から199までをコードする。アミ酸199の後に、114
塩基対挿入物（両方のクローンとも同じ、第１図に白の
ボツクスで示す）が６個の新たなアミノ酸を導入し、こ
の挿入物の次に終結コドンが来る。この形態のレセプタ
ーは可溶性である。

第３図は実施例８に詳述される哺乳動物高度発現プラ
スミドpCAV/NOTの模式図である。

第4A〜Ｃ図は、Ｔ細胞系列T22から誘導されたcDNAラ
イブラリーより得られた、クローンT22−８からのヒトI
L−４レセプターcDNAのコード配列を示す。成熟タンパ
ク質の推定Ｎ末端メチオニンおよびトランスメンブラン
領域には下線が引いてある。

第5A〜Ｂ図はヒト（上段）とネズミ（下段）のIL−４
レセプターcDNAクローンの推定アミノ酸配列の比較を示
す。

（発明の構成） 定義 本明細書において用いる“IL−４レセプター”および
“IL−4R"なる用語は、第２図と第４図に示した天然哺
乳動物インターロイキン４レセプターのアミノ酸配列と
実質的に類似したアミノ酸配列を有し、且つそれらがイ
ンターロイキン４（IL−４）分子と結合することができ
る、またはIL−４分子の結合によつて開始される生物学
的信号を細胞へ伝達することができる、あるいは天然
（すなわち非組換え）源由来のIL−4Rに対して誘導され
た抗IL−4R抗体と交差反応することができるという点で
生物学的に活性であるタンパク質を意味する。天然ネズ
ミIL−４レセプター分子はSDS−PAGEで測定して約140キ
ロダルトン（kDa）の見掛け分子量をもつと考えられ
る。“IL−４レセプター”または“IL−4R"なる用語に
は、限定するものではないが、IL−4Rと共通した生物学
的活性の一部を少なくとも示す20個以上のアミノ酸を有
する天然タンパク質の類縁体またはサブユニツトが含ま
れる。明細書全体を通して用いられる“成熟”なる用語
は、天然遺伝子の全長転写物として存在しうるような、
リーダー配列を欠く形で発現されたタンパク質を意味す
る。種々の生物学的に均等なタンパク質およびアミノ酸
類縁体は以下で詳細に説明する。

アミノ酸または核酸を定義する際に用いられる“実質
的に類似した”なる表現は、対象となる特定配列（例え
ば突然変異配列）が１以上の置換、欠失または付加によ
つて基準配列と異なるが、その最終結果としてIL−4Rタ
ンパク質の生物学的活性を保有していることを意味す
る。また、核酸サブユニツトおよび類縁体は：（ａ）DN
A配列が天然哺乳動物IL−4R遺伝子のコード領域から誘
導される；（ｂ）DNA配列が適度なストリンジエント条
件下で（ａ）のDNA配列とハイブリダイズすることがで
き且つ生物学的に活性なIL−4R分子をコードする；また
は（ｃ）DNA配列が遺伝暗号の結果として（ａ）または
（ｂ）で定義したDNA配列に対し縮重の関係にあり且つ
生物学的に活性なIL−4R分子をコードする場合、本明細
書中で開示した特定のDNA配列に“実質的に類似してい
る。”実質的に類似した類縁タンパク質は天然IL−4Rの
対応する配列に約30％以上類似しているだろう。類似性
の度合いがより低いが匹敵する生物学的活性を有する配
列は均等物であると見なされる。より好ましくは、類縁
タンパク質は天然IL−4Rの対応する配列に約80％以上類
似しており、この場合それらは“実質的に同一”である
と定義される。核酸配列を定義する際に、実質的に類似
したアミノ酸配列をコードしうる対象の核酸配列はすべ
て、基準の核酸配列に実質的に類似していると見なされ
る。類似性のパーセントは、例えばthe University of
Wisconsin Genetics Computer Group（UWGCG）から入手
しうるGAPコンピユータプログラム6.0版を用いて、配列
情報を比較することにより測定できる。GAP（プログラ
ムはNeedlemanおよびWunschの整列法（J.Mol.Biol.48:4
43、1970）をSmithおよびWatermanが改変した方法（Ad
v.Appl.Math.2:482、1981）を利用している。簡単に述
べると、GAPプログラムは２つの配列の短い方の配列中
の記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総
数で類似した整列記号の数を割つた値として類似性を規
定している。GAPプログラムのための予め設定された好
適なパラメーターには次のものが含まれる：（１）ヌク
レオチドに対して単一の比較マトリツクス（同一性に対
して１の値および非同一性について０の値を含む）、お
よびSchwartz and Dayhoff,ed.,Atlas of Protein Sequ
ence and Structure,National Biomedical Research Fo
undation,pp.353−358,1979に開示されるような、Gribs
kov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986に記載
の荷重された比較マトリツクス；（２）各ギヤツプに対
して3.0のペナルテイーおよび各ギヤツプ中の各記号に
対して0.10の追加のペナルテイー；および（３）末端ギ
ヤツプに対してペナルテイーなし。

本明細書中で用いる“組換え”なる用語は、タンパク
質が組換え（例えば、微生物または哺乳動物）発現系か
ら誘導されることを意味する。“マイクロバイアル（mi
crobial）”は細菌または真菌（例．酵母）発現系にお
いて生産された組換えタンパク質を意味する。生産物と
しての“組換えマイクロバイアル”は本質的に天然の内
因性物質を含まない、微生物発現系により生産されたタ
ンパク質を意味する。大部分の細菌培養物（例.E.col
i）により発現されたタンパク質はグリカンを含まない
であろう。酵母により発現されたタンパク質は、哺乳動
物細胞により発現されたものと異なるグリコシル化パタ
ーンを示すかもしれない。

IL−４レセプターの特性として明細書全体を通して用
いられる“生物学的に活性”なる表現は、特定の分子が
十分なアミノ酸配列の類似性をここに開示した本発明の
具体例と共有し、その結果として検出可能な量のIL−４
と結合することができ、IL−４刺激を（例えば、ハイブ
リツドレセプター構築物の一成分として）細胞へ伝達す
ることができ、または天然（すなわち、非組換え）源由
来のIL−4Rに対して誘導された抗IL−4R抗体と交差反応
することができることを意味する。好ましくは、本発明
の範囲内の生物学的に活性なIL−４レセプターは一nmol
eのレセプターあたり0.1nmole以上のIL−４と結合する
ことができ、最も好ましくは、標準結合検定（下記参
照）において1nmoleのレセプターあたり0.5nmole以上の
IL−４と結合し得る。

“DNA配列”とは、実質的に純粋な形で（すなわち、
内因性の夾雑物質を含まない）且つ標準生化学的方法
（例えば、クローニングベクターを使用）によるその配
列およびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および
回収を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離さ
れたDNAから誘導された、別個の断片の形をしたもしく
はより大きいDNA構築物の一成分としての、DNA分子を意
味する。この種の配列は好ましくは内部非翻訳配列（す
なわちイントロン；通常真核生物遺伝子中に存在する）
が介在しないオープン・リーデイング・フレームの形で
提供される。関連配列を含むゲノムDNAも使用し得るだ
ろう。非翻訳DNAの配列は、それがコード領域の操作ま
たは発現を妨害しない場合、オープン・リーデイング・
フレームから５′側にまたは３′側に存在してもよい。

“ヌクレオチド配列”とはデオキシリボヌクレオチド
のヘテロポリマーを意味する。本発明によつて提供され
るタンパク質をコードするDNA配列はcDNA断片と短いオ
リゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌ
クレオチドから組み立てられ、これにより組換え転写単
位において発現され得る合成遺伝子が得られる。

“組換え発現ベクター”とはIL−4RをコードするDNA
を増幅または発現させるために用いられる複製可能なDN
A構築物を意味し、これは（１）遺伝子発現の調節的役
割を有する遺伝要素（例．プロモーターまたはエンハン
サー）；（２）mRNAに転写され且つタンパク質に翻訳さ
れる構造配列またはコード配列；および（３）適当な転
写および翻訳開始配列と終結配列；の組合せから成る転
写単位を含む。酵母発現系での使用を目的とした構造要
素は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可
能にするリーダー配列を含むのが好ましい。これとは別
に、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列の
不在下で発現される場合、それはＮ末端メチオニン残基
を含むことができる。この残基はその後最終生産物を与
えるべく、発現された組換えタンパク質から随意に切断
され得る。

“組換え微生物発現系”とは、組換え転写単位を染色
体DNAに安定して組み込んだ、または組明け転写単位を
内在プラスミドの一成分として保有する適当な宿主微生
物（例えば、E.coliのような細菌またはS.cerevisiaeの
ような酵母）の実質的に均質な単一培養物を意味する。
一般に、この系を構成する細胞は１個の原始形質転換細
胞の子孫である。ここで定義した組換え発現系は、発現
しようとするDNA配列または合成遺伝子に連結された調
節要素の誘発により異種タンパク質を発現するであろ
う。

タンパク質および類縁体 本発明は、実質的に内因性の夾雑物質を含まず且つ、
場合によつては、天然パターンのグリコシル化を伴わな
い、実質的に均一な組換え哺乳動物IL−4Rポリペプチド
を提供する。天然ネズミおよびヒトIL−４レセプター分
子は、SDS−PAGEで測定して約130〜145キロダルトン（k
Da）の見掛け分子量を有する糖タンパク質として細胞溶
解液から回収される。本発明の哺乳動物IL−4Rには、例
えば霊長目の動物、ヒト、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、
ヒツジ、ウマおよびブタのIL−4Rが含まれる。本発明の
範囲内のIL−4R誘導体には、生物学的活性を保有する一
次タンパク質の種々の構造形体が含まれる。イオン化可
能なアミノ基およびカルボキシル基の存在ゆえに、例え
ばIL−4Rタンパク質は酸性塩もしくは塩基性塩の形体、
または中性形体であり得る。個々のアミノ酸残基は酸化
または還元によつて修飾することもできる。

一次アミノ酸構造は他の化学成分（例えば、グリコシ
ル基、脂質、ホスフエート、アセチル基など）との共有
結合または凝集複合体を形成することにより、あるいは
アミノ酸配列の突然変異体を形成することにより改変し
うる。共有結合誘導体は特定の官能基をIL−4Rアミノ酸
側鎖へ、またはＮもしくはＣ末端へ結合させることによ
り製造しうる。本発明の範囲内の他IL−4R誘導体には、
Ｎ末端またはＣ末端融合体として組換え培養物により合
成されるような、IL−4Rまたはその断片と他のタンパク
質またはポリペプチドとの共有結合もしくは凝集複合体
が含まれる。例えば、結合されるペプチドはタンパク質
のＮ末端領域におけるシグナル（またはリーダー）ポリ
ペプチド配列であり得、この配列は翻訳と同時に、また
は翻訳後に、タンパク質をその合成場所から細胞膜また
は細胞壁の内側もしくは外側のその機能場所へ移動させ
る（例、酵母のα因子リーダー）。IL−4Rタンパク質の
融合体はIL−4Rの精製または同定を容易にするために付
加されるペプチド（例、ポリ−His）を含みうる。IL−4
Rのアミノ酸配列は次のペプチド:Asp−Tyr−Tys−Asp−
Asp−Asp−Asp−Lys（DYKDDDDK）に結合させることもで
きる（Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204、1988）。
後者の配列は高度な高原性を有し、特異的なモノクロー
ナル抗体が可逆結合するエピトープを提供し、発現され
た組換えタンパク質の速やかな検定および容易な精製を
可能にする。この配列はまたウシ粘膜エンテロキナーゼ
によってAsp−Lys対のすぐ後の残基において特異的に開
裂される。このペプチドでキヤツプされた融合タンパク
質またはE.coliによる細胞内分解に対して抵抗を示す。

IL−4R誘導体は免疫原、レセプターに基づいたイムノ
アツセイ用の試薬、またはIL−４や他の結合性リガンド
のアフイニテイー精製法のための結合剤としても使用で
きる。IL−4R誘導体はまた、システイン残基およびシリ
ン残基において、Ｍ−マレイミドベンゾイルスクシンイ
ミドエステルやＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような
試薬を架橋することによつても得られる。IL−4Rタンパ
ク質はまた、反応性の側基を介して、各種の不溶性支持
体（例えば、臭化シアン活性化、ビスオキシラン活性
化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性
化アガロース構造体）へ共有結合され、あるいはポリオ
レフイン表面へ（グルタルアルデヒド架橋の存在下また
は不在下で）吸着される。ひとたび支持体へ結合される
と、IL−4Rは（検定または精製のために）抗IL−4R抗体
またはIL−４と選択的に結合させるべく使用される。

本発明はまた天然パターンのグリコシル化を伴うまた
は伴わないIL−4Rを包含する。酵母または哺乳動物発現
系（例、COS−７細胞）において発現されたIL−4Rは、
その発現系に応じて、分子量およびグリコシル化パター
ンが天然分子と類似していたり、有意に相違していたり
する。E.coliのような細菌によるIL−4R DNAの発現は非
グリコシル化分子を与える。不活性化Ｎ−グリコシル化
部位を有する哺乳動物IL−4Rの機能的な突然変異類縁体
は、オリゴヌクレオチドの合成および連結により、ある
いは部位特異的変異導入法により製造できる。これらの
類縁タンパク質は酵母発現系を用いて良好な収量で均一
な還元炭水化物形体として生産される。真核生物タンパ
ク質のＮ−グリコシル化部位は次のアミノ酸トリプレツ
ト:Asn−A₁−Ｚ（ここでA₁はPro以外のアミノ酸であ
り、ＺはSerまたはThrである）によつて特徴づけられ
る。この配列において、アスパラギンは炭水化物が共有
結合するための側鎖アミノ基を与える。このような部位
はAsnまたは残基Ｚを他のアミノ酸で置換するか、Asnま
たはＺを欠失させるか、またはA₁とＺの間非Ｚアミノ酸
を挿入するか、あるいはAsnとA₁の間にAsn以外のアミノ
酸を挿入することにより取り除くことができる。

IL−4R誘導体はIL−4Rまたはそのサブユニツトの突然
変異によつても得られる。ここで述べるIL−4R突然変異
体はIL−4Rと相同であるが、欠失、挿入または置換のた
めに天然IL−4Rと異なるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドである。大部分の哺乳動物遺伝子と同様に、哺乳動
物IL−４レセプターは恐らく多重エクソン遺伝子によつ
てコードされている。転写後の異なるmRNAスプライシン
グ現象に起因すると考えられる別のmRNA（ここに記載の
cDNAと同一性または類似性の大きい領域を共有する）
は、本発明の範囲内であるとみなされる。

IL−4Rタンパク質の生物学的に均等な類縁体は、例え
ば残基または配列をいろいろに置換させるか、あるいは
生物学的活性に関与しない末端また内部の残基もしくは
配列を欠失させることにより構築しうる。例えば、シス
テイン残基は、タンパク質の再生の際に誤つた分子内ジ
スルフイド橋の形成を防止するために、欠失させるか又
は他のアミノ酸と置換することができる。その他の変異
導入法には、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系で
の発現を高めるために、隣接する二塩基性アミノ酸残基
を修飾することが含まれる。一般に、置換は保存的に行
われるべきであり；すなわち、最適な代替アミノ酸は置
換しようとする残基の物理化学的特性に類似した特性を
窮するものである。同様に、欠失または挿入戦略が採用
される場合、欠失または挿入が生物学的活性に及ぼしう
る影響を考慮すべきである。

IL−4Rのサブユニツトは末端または内部の残基もしく
は配列を欠失させることにより構築される。特に好適な
サブユニツトには、IL−4Rのトランスメンブラン領域お
よび細胞内ドメインが欠失されるか、あるいは培地への
レセプターの分泌を促進する親水性残基で置換されたも
のが含まれる。生成するタンパク質はIL−４への結合能
を保有する可溶性IL−4R分子である。可溶性IL−4Rの特
定例には、第2A図に示すアミノ酸残基１−208、および
第4A図に示す残基１−207の配列に対して実質的な同一
性を有するポリペプチドが含まれる。

IL−4R類縁体の発現のために構築されるヌクレオチド
配列中の変異は、もちろん、コード配列のリーデイング
・フレームを保存していなければならず、好ましくは、
レセプターmRNAの翻訳に悪影響を及ぼすmRNAの二次構造
（例えば、ループやヘアピン構造）をもたすようにハイ
ブリダイズする相補領域を形成しないであろう。変異部
位は前もつて決定しうるが、変異自体の本質を予め決定
する必要はない。例えば、所定の部位における最適特性
の変異体を選択するためき、標的コドンでランダムな変
異誘発を行つて、目的とする活性について発現されたIL
−4R変異体をスクリーニングすることができる。

IL−4Rをコードするヌクレオチド配列中のすべての変
異が最終生産物において発現されるわけではない。例え
ば、ヌクレオチド置換は発現を高めるために、主として
転写mRNAの二次ループ構造を避けるために（参考として
ここに引用する欧州特許公開第75444A号を参照された
い）、または所定の縮主によつて一層容易に翻訳される
コドン（例えば、E.coli発現用のE.coli優先コドン）を
与えるために行われる。

変異は変異配列を含み且つ天然配列の断片への連結を
可能にする制限部位を両末端に有するオリゴヌクレオチ
ドを合成することにより、特定位置に導入することがで
きる。連結後に得られる再構築配列は所望のアミノ酸挿
入、置換または欠失を有する留縁体をコードする。

また、オリゴヌクレオチドにより誘導される部位特異
的変異導入法は、必要な置換、欠失または挿入に従つて
改変された特定コドンを有する改変遺伝子を得る際にも
使用できる。上記の改変を行うための代表的な方法はWa
lder et al.（Gene42:123、1986）;Bauer et al.（Gene
37:73、1985）;Craik（Bio Techniques,January 1985、
12−19）;Smith et al.（Genetic Engineering:Princip
les and Methods,Plenum press,1981）；および米国特
許第4518584号並びに同第4737462号に開示されている
（これらの文献は参照によりここに引用される）。

組換えIL−4Rの発現 本発明は哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝
子由来の適当な転写または翻訳調節要素に機能しうる状
態で連結された、哺乳動物IL−4Rまたは生物学的に均等
な類縁体をコードする合成のもしくはcDNAから誘導され
たDNA断片を含む組換え発現ベクターを提供する。前記
の調節要素には以下で詳述するような転写プロモータ
ー、転写を調節する任意のオペレーター配列、適当なmR
NAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写と
翻訳の終結と調節する配列が含まれる。通常、複製起点
により与えられる縮主内での複製能力、および形質転換
細胞の認識を容易にする選択遺伝子もさらに組み込むこ
とができる。DNA領域は、それらが互いに機能的い関連
している場合、機能しうる状態で連結される。例えば、
シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAは、それがポ
リペプチドの分泌に関係する前駆物質として発現されう
る場合、そのポリペプチドのDNAに機能しくる状態で連
結され；プロモーターは、それがコード配列の転写を調
節する場合、コード配列に機能しうる状態で連結され；
またリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするよ
うに配置される場合、コード配列に機能しうる状態で連
結される。一般に、“機能しくる状態で連結される”と
は隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合には
隣接し且つ同じリーデイング・フレームであることを意
味する。

微生物により発現される哺乳動物IL−４レセプターを
コードするDNA配列は、DNAのmRNAへの転写を早期に終結
させうるイントロンを含まないのが好ましい。しかしな
がら、例えば転写の早期終結が有利なＣ末端切断（例え
ば、細胞膜に結合しない可溶性レセプターを生成するた
めのトランスメンブラン領域の欠失）を有する変異体を
もたらす場合には、それは望ましいかもしれない。遺伝
暗号の縮重（degeneracy）ゆえに、同一のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列にはかなりの変動があ
り、代表的なDNAの例は図面に示したヌクレオチド配列
に相当するものである。他の例には適度なストリンジエ
ント条件（50℃,2×S2C）下で図面の配列とハイブリダ
イズし得る配列、および上記のものとハイブリダイズす
るか又は縮重の関係にあり生物学的に活性なIL−４レセ
プターポリペプチドをコードする他の配列が含まれる。

形質転換縮主細胞は組換えDNA法を用いて構築されたI
L−4Rベクターにより形質転換またはトランスフエクシ
ヨンされている細胞である。形質転換縮主細胞は通常IL
−4Rを発現するが、IL−4R DNAをクローン化または増幅
する目的で形質転換された縮主細胞はIL−4Rを発現する
必要がない。発現されたIL−4Rは、所定のIL−4R DNAに
応じて、細胞膜に付着するか、あるいは培養上清に分泌
される。哺乳動物IL−4Rの発現に適する縮主細胞は、適
当なプロモーターの支配下にある原核細胞、酵母または
高等真核細胞である。原核細胞にはグラム陰性またはグ
ラム陽性菌が含まれ、例えばE.coliまたはバシラス属の
細菌である。高等真核細胞には後述するような哺乳動物
由来の樹立された細胞系列が含まれる。また、本発明の
DNA構築物から誘導されたRNAを用いて哺乳動物IL−4Rを
生産するために、細胞を含まない翻訳系も使用し得るで
あろう。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の縮主と
共に使用するのに適したクローニングベクターおよび発
現ベクターはPouwelsら（Cloning Vectors:A Laborator
y Manual,Elsevier,New York,1985）によつて開示され
ており、関連したその記載内容は参照によりここに引用
される。

原核細胞発現縮主は多くのタンパク質加水分解および
ジスルフイドプロセツシングを必要としないIL−4Rの発
現のために使用される。原核細胞発現ベクターは一般に
１つ以上の表現型選択マーカー（例えば、抗生物質耐性
をもたらす遺伝子、または独立栄養要求物を供給するタ
ンパク質をコードする遺伝子）、および宿主によつて認
識されて縮主内での増幅を可能にする複製起点を含む。
形質転換用の適当な原核細胞縮主にはE.coli（大腸
菌）、Bacillus subtilis（枯草菌）、Salmonella typh
imurium（ネズミチフス菌）、およびシユードモナス
属、ストレプトミセス属並びにブドウ球菌属に含まれる
いろいろな菌種が含まれるが、随意に他のものも使用で
きる。

細菌と共に使用するのに有用な発現ベクターは、公知
のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝要
素を含む市販のプラスミドから誘導される選択マーカー
および細菌の複製起点を含むことができる。この種の市
販ベクターには例えば、pKK223−３（スウエーデン国ウ
プサラ、フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社）およ
びpGEM1（米国ウイスコンシン州マデイソン、プロメガ
・バイオテク社）が含まれる。これらのpBR322“主鎖”
部分は適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わされる。E.coliは一般にE.coli種由来のプ
ラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される
（Bolivar et al.,Gene 2:95、1977）。pBR3I2はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、こう
して形質転換細胞の単純な同定主を提供する。

組換え微生物発現ベクター中で通常用いられるプロモ
ーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およ
びラクトースプロモーター系（Chang et al.,Nature 27
5:615、1978;Goeddel et al.,Nature 281:544、197
9）、トリプトフアン（trp）プロモーター系（Goeddel
et al.,Nucl.Acids Res.8:4057、1980;欧州特許公開第3
6776号）、およびtacプロモーター（Maniatis,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor L
aboratory,p.412、1982）が含まれる。特に有用な細菌
発現系はフアージλP_Lプロモーターおよびcl857ts非耐
熱性リプレツサーを使用する。λP_Lプロモーターの誘導
体を組み込んでいるアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンから入手し得るプラスミドベクターにはE.
coli JMB9株中に保有されるプラスミドpHUB2（ATCC 370
92）およびE.coliRR1中に保有されるpPLc28（ATCC 5308
2）がある。

組換えIL−4Rタンパク質は酵母宿主、好ましくはS.ce
revisiaeのようなサツカロミセス属からのもの、におい
ても発現される。他の属の酵母、例えばピチア（Pichi
a）またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）も使用で
きる。酵母ベクターは一般に２μ酵母プラスミドからの
複製起点、自立複製配列（ARS）、プロモーター、IL−4
RをコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結のた
めの配列、並びに選択遺伝子を含むであろう。好ましく
は、酵母ベクターは酵母とE.coliの両方の形質転換を可
能にする複製起点および選択マーカー（例えば、E.coli
のアンピシリン耐性遺伝子およびトリプトフアン中での
成育能力を欠く酵母変異株に選択マーカーを提供するS.
serevisiae trp1遺伝子）、並びに下流の構造配列の転
写を誘導する高度発現酵母遺伝子からのプロモーターを
含むであろう。その後、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp1障
害の存在は、トリプトフアンの不在下での成育により形
質転換を検出するための効果的な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモンーター配列には、メ
タロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hi
tzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073、1980）または他
の解糖系の酵素（Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg.7:14
9、1968;およびHolland et al.,Biochem.17:4900、197
8）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコー
ス−６−リン酸シソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソラーゼ、およびグルコ
キシナーゼのプロモーター類が含まれる。酵母発現に用
いられる適当なベクターおよびプロモーターはHitzeman
の欧州特許公開第73657号にさらに詳しく記載されてい
る。

好適な酵母ベクターはE.coli内での複製および選択の
ためのpBR322由来のDNA配列（複製起点およびAmp^r遺伝
子）、並びにグルコス抑制ADH2プロモータおよびα因子
分泌リーダーを含む酵母DNA配列を用いて構築すること
ができる。ADH2プロモーターはRussellら（J.Bilo.Che
m.258:2674、1982）およびBeierら（Nature 300:724、1
982）によつて報じられた。異種タンパク質の分泌を支
配する酵母α因子リーダーは、プロモーターと発現され
るべき構造遺伝子の間に挿入することができる。例え
ば、Kurjan et al.,Cell 30:933、198;およびBitter et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330、1984を参照さ
れたい。リーダ配列は外来遺伝子とリーダー配列との融
合を容易にするために、１つ以上の有用な制限部位をそ
の３′末端に含むよう修飾してもよい。

適当な酵母形質転換プロトコールは当分野で知られて
おり、代表的な技法はHinnen et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 75:1929,1978に記載され、0.67％酵母窒素塩
基、0.5％カザミノ酸、２％グルコース、10μg/mlアデ
ニンおよび20μg/mlウラシルから成る選択培地中でTrp⁺
形質転換細胞を選択することから成る。

ADH2プロモーターを含むベクターで形質転換された宿
主菌株は、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％
グルコースを含み、さらに80μg/mlアデニンおよび80μ
g/mlウラシルを補給した栄養培地中で発現のために増殖
させる。ADH2プロモーターの抑制解除は培地グルコール
の欠乏により起こる。粗製酵母上清は過により回収さ
れ、精製に先立つて４℃で保持される。

種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系は組換えタンパ
ク質の発現に利用することができる。昆虫細胞により異
種タンパク質を生産するためのバキユロウイルス系はLu
ckow and Summers.Bio/Technology 6:47（1988）に論評
されている。適当な哺乳動物宿主細胞系列の例はGluzma
n（Cell 23:175,1981）に記載のサル腎細胞のCOS−７系
列、および適当なベクターを発現しうる他の細胞系列、
例えばＬ細胞、C127、3T3、チヤイニーズハムスター卵
巣（CHO）、HeLaおよびBHK細胞系列などである。哺乳動
物発現ベクターは複製起点、発現されるべき遺伝子に連
結された適当なプロモーターおよびエンハンサー、他の
５′または３′フランキング（flanking）非転写配列の
ような非転写要素、並びに必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、
転写終結配列のような５′または３′非翻訳配列を含む
ことができる。

脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター中
の転写および翻訳調節配列はウイルス源によつて供給さ
れる。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよび
エンハンサーはポロオーマ、アデノウイルスＩ、シミア
ンウイルス40（SV40）、およびヒトサイトメガウイルス
から誘導される。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、
例えばSV40複製起点、初期および後期プロモータ、エン
ハンサー、スプライス、およびポリアニデニル化部位は
異種DNA配列の発現に必要とされる他の遺伝要素を提供
すべく用いられる。初期および後期プロモーターは、こ
れらがSV40ウイルス複製起点をも含む断片としてウイル
スから容易に得られるので、特に有用である（Fiers et
al.,Nature 273:113,1978）。HindIII部位からウイル
ス複製起点に存在するBglI部位の方へ延びる約250bp配
列が含まれるという条件で、より小さいまたはより大き
いSV40断片も使用できる。さらに、哺乳動物ゲノムIL−
4Rプロモーター、調節および／またはシグナル配列も、
これらの調節配列が所定の宿主細胞と適合しうるという
条件で、利用できる。組換え哺乳動物IL−４レセプター
を生産するための哺乳動物高度発現ベクターの使用に関
しては、以下の実施例８においてさらに詳しく説明す
る。代表的なベクターは岡山−Berg法（Mol.Cell.Biol.
3:280、1983）により構築することができる。

C127ネズミ乳房上皮細胞による哺乳動物レセプターcD
NAの有用な安定した高レベル発現系は、実質的にCosman
らの方法（Mol.Immumol.23:935、1986）により構築する
ことができる。

IL−4R DNA発現用の特に好適な真核細胞ベクターは実
施例２において以下で説明する。pCAV/NOTと呼ばれるこ
のベクターは哺乳動物高度発現ベクターpDC201から誘導
され、SV40、アデノウイルス−２およびヒトサイトメガ
ロウイルス由来の調節配列を含む。ヒトIL−７レセプタ
ーを含むpCAV/NOTはアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（ATCC）に寄託番号68014として寄託され
ている。

精製された哺乳動物IL−４レセプターまたは類縁体
は、適当な宿主／ベクター系を培養して本発明DNAの組
換え翻訳産生を発現させ、その後培地または細胞抽出物
から精製することにより得られる。

例えば、組換えタンパク質を培地へ分泌する系からの
上清は、初めに市販のタンパク質濃縮過器（例えば、
AmiconまたはMillipore Pell−icon限外過装置）を用
いて濃縮する。濃縮工程後、濃縮物は適当な精製マトリ
ツクスにかける。例えば、適当なアフイニテイ−マトリ
ツクスは適当な支持体に結合されたIL−４、レクチンま
たは抗体分子でありうる。別法として、アニオン交換樹
脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（DEAE）基
を有するマトリツクスまたは支持体、を使用することが
できる。マトリツクスはアクリルアミド、アガロース、
デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製におい
て一般的に用いられる他のタイプであり得る。また、カ
チオン交換工程を使用してもよい。適当なカチオン交換
体にはスルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む
種々の不溶性マトリツクスが含まれる。スルホプロピル
基が好適である。

最後に、疎水性RP−HPLC媒体（例えば、ペンダントメ
チルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる
逆相高性能液体クロマトグラフイー（RP−HPLC）工程を
１回以上行つて、IL−4R組成物をさらに精製する。上記
精製工程のいくつかまたは全部をいろいろな組み合わせ
で用いて、均質な組換えタンパク質を得ることができ
る。

細菌培養物により生産された組換えタンパク質は通
常、初めに細胞ペレツトから抽出し、次に１回以上の濃
縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグ
ラフイー工程を行うことにより単離される。最後に、高
性能液体クロマトグラフイー（HPLC）が最終精製工程と
して使用される。組換え哺乳動物IL−4Rの発現に用いた
微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械
的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた有利な方法の
いずかを用いて破壊することができる。

哺乳動物IL−4Rを分泌タンパク質として発現する酵母
による発酵は精製を非常に簡単にする。大規模発酵によ
り得られる分泌組換えタンパク質はUrdalらの方法（J.C
hromatog.296:171、1984）に類似した方法により精製す
ることができる。この文献は、分離用HPLCカラムによる
組換えヒトIL−２の精製のために、２回の連続逆相HPLC
L工程を開示している。

組換え培養物により合成されたヒトIL−4Rは、ヒトIL
−4Rを培養物から回収する際に用いた精製工程に左右さ
れる量および性質の非ヒト細胞成分（タンパク質を含
む）の存在により特徴づけられる。これらの成分は通常
酵母、原核生物またはヒト以外の高等真核生物に由来す
るものであり、好ましくは約１重量％未満程度の無毒の
汚染量で存在するであろう。さらに、組換え細胞の培養
は、本来その起源種（例えば細胞、細胞滲出液または体
液）中に存在するようなIL−4Rと通常関連があるタンパ
ク質を含まないIL−4Rの生産を可能にする。

IL−4R組成物は、所望純度のIL−4Rを生理学的に許容
しうる担体と混合することにより、投与用に製剤化され
る。このような担体は投与量および使用濃度で受容者に
無毒性であるだろう。一般に、この種の組成物の製剤化
はIL−4Rを緩衝剤、酸化防止剤（例、アスコルビン
酸）、低分子量（約100残基以下）ポリペプチド、タン
パク質、アミノ酸、炭水化物（例、グルコース、スクロ
ースまたはデキストラン）、キレート化剤（例、EDT
A）、グルタチオン、並びに他の安定剤および賦形剤と
組み合わせることを伴う。

IL−4R組成物はＢ細胞の機能を調節するために使用し
うる。例えば、可溶性IL−4R（sIl−4Rと略記する）は
抗Igの存在下でIL−４により誘導されるＢ細胞培養物の
増殖を阻止する。また、sIL−4Rはアイソタイプ特異的E
LISAで測定したときLPS活性化Ｂ細胞によるIL−４誘導I
gG1分泌を抑制し、且つEPICS分析で測定したときネズミ
Ｂ細胞によるIL−４誘導Ia発現を抑制する。sIL−4Rは
またIL−４誘導IgE合成を抑制し、従つてアレルギー性
鼻炎（通常の枯草熱）、気管支ぜん息、アトピー性皮膚
炎および胃腸食物アレルギーのようなIgE誘導即時型過
敏反応を治療するために使用される。

IL−4RはまたＴ細胞を調節するためにも使用できる。
例えば、IL−4RはＴ細胞系列（例えばCTLL T細胞系列）
IL−４誘導増殖を阻止する。sIL−4Rはまた内因的に生
産されたIL−４により仲介される機能活性を抑制する。
例えば、sIL−4RがIL−２に対するモノクローナル抗体
（例、S4B6）と共に付随的に培養物中に存在する場合、
sIL−4Rは二次混合白血球培養でのアロ反応性細胞溶解
Ｔリンパ球（CTL）の生成を抑制する。IL−２とIL−４
の両方の中和剤は内因性IL−２およびIL−４（両方とも
CTLの生成を調節し、このような培養物により生産され
る）を抑制するために用いられる。

治療用途において、治療上有効な量のIL−４レセプタ
ー組成物は、製剤学的に許容しうる担体または希釈剤と
共に哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される。

以下の実施例は例示するためのものであつて、制限す
るためのものではない。

（実施例） 実施例１ IL−４レセプターの結合検定 A.IL−４の放射性標識付け：組換えエンズミおよびヒト
IL−４は酵母により発現させ、それぞれPark,et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA84:5267（1987）およびPark et a
l.,J.Exp.Med.166:476（1987）に記載の方法により均質
になるまで精製した。この精製タンパク質を市販の酵素
ビーズ（enzymobead）放射性ヨウ素化試薬（バイオラツ
ド社製）により放射製標識した。この方法では、0.2Mリ
ン酸ナトリウム（pH7.2）50μｌ中のrIL−４ 2.5μｇ
を、0.05Mリン酸アトリウム（pH7.0）20μｌ中の酵素ビ
ーズ試薬50μｌ（2MCiのヨウ化ナトリウム）および2.5
％ｂ−Ｄ−グルコース10μｌと組み合わせた。10分後25
℃で、アジ化ナトリウム（50mMを10μｌ）およびメタ重
亜硫酸ナトリウム（5mg/mlを10μｌ）を加え、インキユ
ベーシヨンを25℃で５分間続けた。この反応混合物は2.
5％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）、0.2％（w/v）
アジ化ナトリウムおよび20mMヘペス（pH7.4）を含有す
るロスウエル・パーク・メモリアル・インステイテユー
ト（RPMI）1640媒体（結合媒体）中で平衡化した2ml床
容量のSephadex Ｇ−25（シグマ社製）でゲル過する
ことにより分画化した。¹²⁵I−IL−４の最終プールは結
合媒体中２×10^-8Mの使用原液へ希釈し、レセプター結
合活性の検出しうる低下なしに４℃で最高１ケ月間貯蔵
した。比活性は一般に１〜２×10¹⁶cpm/mmole IL−４の
範囲である。

B.付着細胞への結合：懸濁培養により増殖させた細胞
（すなわち、CTLLおよびCTLL−19.4）を用いて行つた結
合検定は、本質的にPark et al.,J.Biol.Chem.261:417
7、1986およびPark et al.,supraに記載されるようなフ
タレート油分離法（Dower et al.,J.Immunol.132:751、
1984）により行つた。また、結合検定はIL−４レセプタ
ー分子をコードするcDNAを含む哺乳動物発現ベクターに
よりトランスフエクシヨンしたCOS細胞に対しても行つ
た。付着細胞への結合のスカツチヤード分析のために、
COS細胞はLuthman et al.,Nucl.Acids.Res.11:1295、19
83およびMcCutchan et al.,J.Natl.Cancer Inst.41:35
1、1968に記載の方法によりプラスミドDNAでトランスフ
エクシヨンした。トランスフエクシヨンの８時間後、細
胞をトリプシン処理し、そして６ウエルプレート（マサ
チユーセツツ州ケンブリツジ、コスター社製）に１×10
⁴COS−IL−４レセプタートランスフエクト細胞（キヤリ
アーとしての５×10⁵COS対照トランスフエクト細胞と十
分に混合したもの）をまいた。２日後、単層は本質的に
Park et al.,J.Exp.Med.166:476、1987に記載される方
法により４℃で¹²⁵I−IL−４結合について検定した。
¹²⁵I−IL−４の非特異的結合は200倍以上の過剰モル量
の未標識IL−４の存在下で測定した。37℃で¹²⁵I−IL−
４が細胞内に取り込まれる（インターナリゼーシヨン）
のを防ぐために、すべての結合検定いおいてアジ化ナト
リウム（0.2％）を使用した。

可溶性IL−4Rによる結合の阻害を分析するために、組
換えIL−4R構築物でトランスフエクシヨンしたCOS細胞
からの上清をトランスフエクシヨンの３日後に回収し
た。連続２倍希釈のならし培地（conditioned medium）
は３×10^-10M¹²⁵I−IL摩耗（比活性約１×10¹⁶cpm/m mo
lを有する）と共に37℃で１時間プレインキユベート
し、その後２×10⁶CTLL細胞を加えた。37℃で30分イン
キユベーシヨン後、遊離ネズミ¹²⁵I−IL−４と細胞に結
合したネズミ¹²⁵I−IL−４とを分離した。

C.堅相結合検定：ニトロセルロースに安定して吸着され
るIL−４レセプター（IL−４結合活性をまだ保有するCT
LL19.4細胞の界面活性剤抽出物に由来するもの）の能力
は精製のモニター手段をもたらした。1mlアリコートの
細胞抽出物（実施例３参照）、IL−４アフイニテイーカ
ラム画分（実施例４参照）または他のサンプルを乾燥BA
85/21ニトロセルロース膜（ニユハンプシヤー州キー
ン、シユライチヤー＆シユエル社製）上に置き、乾かし
た。この膜は非特異的結合部位をブロツクするために、
３％（w/v）BSAを含むトリス（0.05M）緩衝食塩水（0.1
5M）（pH7.5）を加えた組織培養皿において30分間イン
キユベートした。その後、膜は200倍過剰モルの未標識I
L−４の存在下または不在下に、PBS＋３％BSA中の４×1
0^-11M¹²⁵I−IL−４を加えて、振とうしながら４℃で２
時間インキユベートした。最後に、この膜をPBSで３回
洗い、乾かしてコダツクＸ−Omat^TMARフイルム上に−70
℃で18時間置いた。

実施例2. 螢光活性化細胞分類（FACS）による高度IL−４レセプタ
ー発現を有するCTLL細胞の選別 高いIL−４レセプター発現を得るための好適な細胞系
列はCTLL、すなわちネズミIL−２依存製細胞溶解Ｔ細胞
系列（ATCCTIB214）である。より高レベルのIL−４レセ
プター発現を得るために、CTLL細胞（母細胞）は螢光活
性化細胞分類を用いて選択した。フルオセイン結合組換
えネズミIL−４（rmIL−４と略記する）（酵母宿主のた
めにrmIL−４には十分量の炭水化物が結合している）
は、フルオレセインヒドラジドを過ヨウ素酸塩酸化糖部
分にカツプリングすることにより有利に用いられる。フ
ルオレセイン結合IL−４は、高グリコシル化rmIL−４
（0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（pH5.5）300μｌ中
300μｇ）を、0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（pH5.
5）中で新たに調製した10mM m−過ヨウ素酸ナトリウム
（シグマ社製）30μｌと混合することにより製造され、
この混合物を暗室中４℃で30分インキユベートした。こ
の反応は0.1Mグリセロール30μｌで停止させ、0.1Mクエ
ン酸塩−リン酸塩（pH5.5）に対して４℃で18時間透析
した。透析後、DMSOに溶解した100mM5−（（（２−（カ
ルボヒドラジノ）メチル）チオ）アセチル）−アミノフ
ルオレセイン（オレゴン州ユージーン、モレキユラー・
プローブズ社製）1/10容量をサンプルに加え、25℃で30
分インキユベートした。その後、IL−４−フルオレセイ
ンはPBS（pH7.4）に対して４℃で徹底的に透析し、アミ
ノ酸分析によりタンパク質濃度を測定した。最終生成物
は１％（w/v）BSAを添加して滅菌過した後４℃で貯蔵
した。

選別するために、CTLL細胞（５×10⁶）は１×10^-9M I
L−４−フルオレセインを含むPBS＋１％BSA150μｌ中37
℃で無菌条件下に30分インキユベートした。次に、この
混合物を４℃に冷却し、多量のPBS＋１％BSAで１回洗
い、EPICS Ｃフローサイトメーター（クールターイン
スツルメント社製）を使つて分類した。最高レベルの螢
光信号（最高1.0％）を与える細胞を大量に集めて、そ
の集団を液体培地中で増殖させた。別法として、単一細
胞クローニングのために、最高1.0％の螢光信号を示す
細胞は96ウエル細胞培養マイクロタイタープレートに１
細胞／ウエルで分配した。

各回のFACS選別の後に、¹²⁵I−IL−４を用いる結合検
定を行うことにより経路を監視した。選別していないCT
LL細胞（CTLL母細胞）は一般に1000〜2000IL−４レセプ
ター／細胞を示した。CTLL細胞は19回のFACS選別にかけ
た。選別した最終CTLL細胞（CTLL−19）は５×10⁵〜１
×10⁶IL−レセプター／細胞を示した。この時点でCTLL
−19集団はEPICS Ｃフローサイトメーターを用いて単
一細胞クローニングに付し、個々のクローン集団を増殖
させて¹²⁵I−IL−４結合について試験した。CTLL−19.4
と名づけた単一クローンは１×10⁶IL−４レセプター／
細胞を示し、精製およびクローニング実験のために選別
された。計算した見掛けKa値は２つの系列において類似
しているが、CTLL−19.4はその表面上にCTLL母細胞より
も約400倍多いレセプターを発現する。

実施例3. CTLL細胞の界面活性剤抽出 CTLL19.4細胞は１例羽ウシ胎児血清、50U/mlペニシリ
ン、50μg/mlストレプトマイシンおよび10ng/mlの組換
えヒトIL−２を含有するRPMI1640中に維持した。細胞を
ローラボルト中で５×10⁵細胞/mlへ増殖させ、遠心によ
り回収し、無血清DMEM中で２回洗い、2000×ｇで10分沈
降させて固化ペレツト（約２×10⁸細胞/ml）を形成させ
た。このペレツトに１％Triton Ｘ−100およびプロテ
アーゼ阻害剤混合物（2mMフツ化フエニルメチルスルホ
ニル、10μＭペプスチン、10μＭロイペプチン、2mMo−
フエナントロリン、および2mMEGTA）を含有するPBSを等
容量加えた。細胞は激しく混合しながら抽出緩衝液と混
合し、この混合物を氷上で20分インキユベートし、その
後12000×ｇ、８℃で20分遠心して核および他の細胞破
片を除いた。上清はすぐ使用するか、または使用するま
で−70℃で貯蔵した。

実施例4. IL−４アフイニテイ−クロマトグラフイーによるIL−４
レセプターの精製 ネズミIL−4RのＮ末端配列を決定するのに十分な量の
ネズミIL−4Rを得るために、あるいはヒトIL−4Rの特性
をさらに決定するために、細胞の界面活性剤抽出から得
られたタンパク質を、アフイニテイ−クロマトグラフイ
ーによりさらに精製した。組換えネズミまたはヒトIL−
４は製造者の指示に従つてAffigel −10（バイオラツ
ド社製）に結合させた。例えば、IL−４溶液（0.1Mヘペ
ス（pH7.4）0.4ml中の3.4mg/ml）に洗浄したAffigel
−10 1.0mlを加えた。この溶液を４℃で一晩揺動さ
せ、上清のアリコートは標準としてBSAを用いて製造者
の指示どおりにバイオラツドタンパク質検定によりタン
パク質について試験した。95％以上のタンパク質がゲル
に結合されており、このことはカラムが1.3mgIL−4/ml
ゲルの最終負荷を有することを示す。グリシンエチルエ
ステルを0.05Mの最終濃度で加えてゲル上の未反応部位
をすべてブロツクした。このゲルはPBS−１％Trito
n 、次いで0.1グリシン−HCl（pH3.0）で十分に洗つ
た。上記のとおりに製造したIL−４結合Affigel を用
いて0.8×4.0cmカラム（床容量4.0ml）を調製し、ネズ
ミIL−4Rの精製のために１％Trfiton Ｘ−100含有PBS
で洗つた。これとは別に、IL−４結合Affigel の20％
懸濁液の50μｌアリコートは、小規模アフイニテイー精
製およびゲル電気泳動のために、³⁵S−システイン／メ
チオニン標識細胞抽出物と共にインキユベートした。

界面活性剤で抽出したIL−４レセプター保有CTLL19.4
細胞のアリコート（25ml）は、４℃でネズミIL−４アフ
イニテイーカラムに遅い流速（3.0ml/時）で加えた。そ
の後、順次１％Triton Ｘ−100含有PBS、RIPA緩衝液
（0.05Mトリス、0.15M NaCl、１％NP−40、１％デオキ
シコーレートおよび0.1％SDS）、0.1％Triton Ｘ−100
および10mM ATPを含有するPBS、最後に１％Triton Ｘ
−100含有PBSでカラムを洗つて、mIL−4R以外の汚染物
質をすべて除いた。その後、カラムは0.1％Triton Ｘ
−100を含むグリシンHCl緩衝液（pH3.0）で溶出してIL
−4Rを溶離させ、次いで0.1％Triton Ｘ−100含有PBS
で洗つた。溶出の間は1ml画分を集め、洗浄の間は2ml画
分を集めた。溶出後すぐに、サンプルを1Mヘペス（pH7.
4）80μｌで中和した。各画分中のレセプターの存在は
¹²⁵I標識IL−４を用いる上記の固相結合検定により検出
した。SDS−PAGEによる分析のために各画分からアリコ
ートを分取し、残りは使用するまで−70℃で凍結保存し
た。SDS−PAGEのために、各カラム画分40μｌは２×SDS
サンプル緩衝液（0.125MトリスHCl pH6.8、４％SDS、20
％グリセロール、10％２−メルカプトエタノール）40μ
ｌに加えた。このサンプルを沸騰水浴中に３分間置き、
そして80μｌアリコートをLaemmliの方法（Nature 227:
680、1970）に従つて作製および注入した10％ポリアク
リルアミドゲルの試料溝に入れた。電気泳動後、レウは
Urdalらによつて以前に開示された方法（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA81:6481、1984）によつて銀染色した。

上記方法に精製は、IL−４結合活性を示す画分中に存
在する平均45〜55kDa〜55kDaと30〜40kDaの２本のmIL−
4Rタンパク質バンドのポリアクリルアミドゲル銀染色に
よる同定をもたらした。CTLL−19.4細胞の細胞表面タン
パク質を放射性標識し、その後¹²⁵I標識レセプターをア
フイニテイークロマトグラフイーで精製した実験は、こ
れら２つのタンパク質が細胞表面で発現されたことを示
唆した。低分子量バンド対高分子量バンドの比は４℃で
の画分の貯蔵の際に増加し、このことは前駆体生産物と
の関係（恐らく遅いタンパク質加水分解による）を示し
ている。上記方法により精製されたmIL−４レセプター
タンパク質は、溶解しているときにも、ニトロセルロー
スに吸着されているときも、IL−４を結合する能力を保
有している。

実施例5. IL−４レセプタータンパク質の配列決定 mIL−４アフイニテイ−カラム精製からのCTLL19.4mIL
−４レセプター含有画分は、アミノ末端タンパク質配列
の分析のために、SDS−PAGEゲル上で分画化し、その後P
VDF膜に移行させた。ポリアクリルアミドゲル上でタン
パク質画分を泳動する前に、初めにアフイニテイー精製
法からの残留界面活性剤を除く必要があつた。３つの調
製物からのmIL−４アフイニテイーカラムに結合したタ
ンパク質を含む画分は融解させて、スピードバク（spee
d vac）により減圧下で最終容量1mlにそれぞれ濃縮し
た。その後、濃縮画分は50％（v/v）TFAの添加によりpH
2に調整し、0.1％（v/v）TFA/水で平衡化したブラウン
リース（Brownlees）RP−300逆相HPLCカラム（2.1×30m
m）に、ヒユーレツドパツカード（Hewlett Packard）10
90M型HPLCで流しながら200μl/mlの流速で注入した。こ
のカラムは注入後0.1％TFA/水で20分間洗つた。その
後、結合タンパク質を含むHPLCカラムは次のような勾配
を用いて展開した：時間 0.1％TFA中のアセトニトリル％ 0 0 5 30 15 30 25 70 30 70 35 100 40 0 ５分ごとに1ml画分を集め、SDS−PAGEおよび銀染色によ
りタンパク質の存在を調べた。

HPLCからの各画分はスピードバクで蒸発乾固させ、La
emmli,U.K.Nature 227:680、1970に記載のとおりに調製
したレムリ還元試料緩衝液中に再懸濁した。この試料を
５−20％勾配のレムリSDSゲルに加え、色素の先端がゲ
ルの底に達するまで45mAで泳動した。ゲルはその後PVDF
ペーパーに移し、Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035、
1987に記載されるように染色した。３つの各々の調製物
からの画分には約30,000〜40,000Mrに染色バンドがはつ
きりと認められた。

先のPVDFブロツテイングからのバンドは切り出して、
本質的にMarchらの方法（Nature 315:641、1985）に従
つてアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）477A型タンパク質シークエンサーで自動エドマン分
解にかけた。ただし、PTHアミノ酸は自動的に注入し、
アプライド・バイオシステムズ120A型HPLCで製造者によ
り供給される勾配および検出系を用いてon line分析し
た。次のアミノ末端配列がシークエンシングの結果から
決定された：NH₂−Ile−Lys−Val−Leu−Gly−Glu−Pro
−Thr−Cys/Asn−Phe−Ser−Asp−Tyr−Ile_oアミノ末端
配列決定に用いた２番目の調製物からのバンドはMarch
らのin situ法（Nature 315:641、1985）を用いてCNBr
で処理し、内部メチオニン残基の後でタンパク質を切断
した。生成した切断産物の配列決定は次のデータをもた
らし、CNBrが２個の内部メチオニン残基の後でタンパク
質を切断したことを示している：サイクル 観測された残基 1 Val,Ser 2 Gly,Leu 3 Ile,Val 4 Tyr,Ser 5 Arg,Tyr 6 Glu,Thr 7 Asp,Ala 8 Asn,Leu 9 Pro,Val 10 Ala 11 Glu,Val 12 Phe,Gly 13 Ile,Asn 14 Val,Gln 15 Tyr,Ile 16 Lys,Asn 17 Val,Thr 18 Thr,Gly クローン16および18から誘導されたタンパク質配列（第
２図参照）と比較したとき、配列は次のように合致し
た： Asn（２）を除く配列１および８、10、12位のArg、13位
のSer、16位のLeuを除く配列２のすべての位置において
一致が見られた。上記配列は第２図のアミノ酸残基137
−154および169−187に対応する。

さらに、アミノ末端配列は９位がCysと定められたク
ローンから誘導された配列と合致した。

上記データは、クローン16および18がIL−４レセプタ
ーの遺伝情報から誘導されたものであるという結論を支
持している。

実施例6. ハイブリツド減算したcDNAプローブの合成 ネズミIL−４レセプターをコードするクローンについ
てライブラリーをスクリーニングするために、減算ハイ
ブリダイゼーシヨン戦略（subtractivehybridization s
trategy）を用いて、高度に純化されたIL−４レセプタ
ーcDNAプローブを得た。ポリアデニル化（ポリA⁺）mRNA
は２つの類似した細胞系列、すなわち母細胞系列CTLL
（約2000レセプター／細胞を発現する）および選別した
細胞系列CTLL19.4（１×10⁶レセプター／細胞を発現す
る）、から単離した。これら２つの細胞系列のmRNA含量
は、IL−４レセプターmRNAの相対レベルを除けば同じで
あると予測される。その後、放射性標識一本鎖cDNA調製
物は、Maniatis et al.,Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,New York,
1982）に記載の方法と類似した方法を用いて、CTLL19.4
細胞からのポリアデニル化mRNAの逆転写により作製し
た。簡単に述べると、ポリA⁺mRNAをMarchら（Nature31
5:641−647,1985）に記載されるとおりに精製し、プラ
イマーとしてオリゴdTを用いて逆転写酵素によりcDNAに
複製した。cDNAを³²Pで高レベル標識するために、100μ
Ciの³²P−dCTP（比活性＝3000Ci/mmol）は10μＭの非放
射性dCTPを含有する反応混合物を50μｌ中で使用した。
42℃で２時間逆転写後、EDTAを20mM加え、次にNaOHを0.
2M加え、cDNA混合物を68℃で20分インキユーエトするこ
とによりRNAを加水分解した。一本鎖cDNAは10mMトリス
−Cl、1mM EDTAで予め平衡化したフエノール／クロロホ
ルム（50/50）混合溶剤で抽出した。水相を清浄な試験
管に移して、NaOHを0.5M添加することにより再びアルカ
リ性にした。その後、cDNAは6ml Sephadex G50カラム
によるクロマトグラフイーにかけ、30mM NaOHおよび1mM
EDTAを流して大きさに基づいて分画化し、これにより
低分子量の汚染物質を除いた。

選別したCTLL19.4細胞から得られた分画化cDNAはその
後、CTLL19.4細胞由来のcDNAを、選別していないCTLL細
胞から分離したポリA⁺mRNA 30μｇと共にエタノール沈
殿させ、16μｌの0.25M NaPO₄（pH6.8）、0.2％SDS、2m
M EDTA中に再懸濁した後68℃で20時間インキユベートす
ることにより、密封選別CTLL母細胞由来のmRNAの過剰量
とハイブリダイズさせた。未選別CTLL細胞由来のmRNAに
相補的な選別CTLL19.4細胞由来のcDNAは二本鎖cDNA/mRN
Aハイブリツドを形成し、このハイブリツドはその後ヒ
ドロキシアパタイトに対するそれらの異なる結合親和性
に基づいて一本鎖cDNAから分離することができる。この
混合物は30倍容量の0.02M NaPO₄（pH6.8）で希釈し、室
温でヒドロキシルアパタイトに結合させ、そしてSims e
t al.,Nature 312:541,1984に記載されるように60℃で
0.12MNaPO₄（pH6.8）を用いて樹脂から一本鎖cDNAを溶
出した。リン酸塩緩衝液はその後水中の2ml Sephadex
G50スピンカラムでの遠心により除去した。このハイブ
リツド減算法はCTLL19.4細胞と未選別CTLL細胞との共通
配列を大部分除き、cDNAライブラリーの検索（以下で説
明する）に使用できる放射性標識IL−４レセプターcDNA
について純化された一本鎖cDNAを残存させる。

実施例7. cDNAライブラリーの合成およびプラークスクリーニング cDNAライブラリーはCTLL19.4細胞から分離したポリア
デニル化mRNAから標準技法（Gubler,et al.,Gene 25:26
3,1983;Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Mo
lecular Biology,Vol.1,1987）により作製した。オリゴ
dTをプライマーとして用いて逆転写した後、一本鎖cDNA
をDNAポリメラーゼＩにより二本鎖となし、T4 DNAポリ
メラーゼで平滑末端を作り、EcoRIメチラーゼでメチル
化してcDNA内のEcoRI切断部位を保護し、そしてEcoRIリ
ンカーへ連結させた。得られた構築物はEcoRIで消化し
てcDNAの両末端におけるリンカーを１コピーだけ除いて
全部除去し、その後等モル濃度のEcoRI切断および脱リ
ン酸化したλZAP アームに連結させ、この連結混合物
を製造者の指示どおりにin vitro（Gigapack ）バツケ
ージングした。λフアージベクター内にcDNAライブラリ
ーを作製するための他の適当な方法および試薬はHuynhe
tal.,DNA Cloning Techniques:A Practical Approach,I
RL Press,Oxford（1984）;Meissner et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 84:4171（1987）およびAusubel et al.,s
upra.に開示されている。λZAP はλgt11（米国特許第
4788135号）に類似したフアージλクローニングベクタ
ーであり、pUC19（Norrander et al.,Gene 26:101,198
7）からのプラスミド配列、lacZ遺伝子中に配置された
ポリリンカー部位、およびf1フアージ複製起点（宿主細
菌がf1ヘルパーフアージに重感染するとき、ssDNAの回
収を可能にする）を含む。DNAは前記要素を含むプラス
ミド（Bluescript と呼ばれる）の形で切り出される。
Gigapack はλフアージDNAのパツケージングに用いら
れる音波処理E.coli抽出物である。λZAP 、Bluescrip
t およびGigapack は米国カルフオルニア州サンジエ
ゴ、ストラタジーン社の登録商標である。

実施例６からハイブリツド減算法により得られた放射
性標識cDNAはその後、cDNAライブラリーをスクリーニン
グするためのプローブとして使用した。増幅したライブ
ラリーは20枚の150mmプレートのそれぞれに25,000プラ
ークの密度でBB4細胞上にまき、37℃で一晩インキユベ
ートした。λZAP の全操作およびBluescript プラス
ミドの切り出しは、Shortら（Nucl.Acids Res.16:7585,
1988）およびストラタジーン社の製品文献に記載のとお
りに行つた。プラークを写し取つたフイルターはWahl e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:3683,1979に記載さ
れるように、50％ホルムアミド、５×SSC、５×Denhard
t試薬および10％硫酸デキストランを含むハイブリダイ
ゼーシヨン緩衝液中で実施例６からのハイブリツド減算
したcDNAプローブと42℃で48時間インキユベートした。
その後、0.2×SSC中68℃でフイルターを洗つた。16個の
陽性プラークは更なる分析のために精製した。

cDNA挿入物を含むBluescript プラスミドは製造者の
指示どおりにフアージから切り出し、E.coliに形質転換
した。プラスミドDNAは個々のコロニーから単離し、Eco
RIで消化してcDNA挿入物を放出させ、そして標準１％ア
ガロースゲル上で電気泳動した。４枚の同じゲルをナシ
ロンフイルターへ移行させて同一のサザンブロツトをつ
くり、IL−４レセプター陰性マウス細胞系列（LBRM 331
A5B6）からのポリA⁺mRNAへの２回目のハイブリダイゼー
シヨン後に、数種のプローブ：すなわち（１）未選別CT
LL細胞由来の放射性標識cDNA、（２）CTLL19.4選別細胞
由来の放射性標識cDNA、（３）CTLL19.4選別細胞由来の
ハイブリツド減算したcDNA、および（４）CTLL19.4選別
細胞由来のハイブリツド減算したcDNA、を用いて分析し
た。これらのプローブは選別細胞系列CTLL19.4に特異的
なmRNAのcDNAコピーが次第に濃縮されたものであつた。
ライブラリーから単離された16個の陽性プラークのう
ち、４つのクローン（11A、14、16および18）はプロー
ブの濃縮につれて信号強度の増加を示した。

単離したCTLLクローンの制限地図作成（第１図に示
す）およびDNA塩基配列決定は、少なくとも上記つの別
個のmRNA集団の存在を明らかにした。両方の型のmRNAは
コード領域の大部分にわたつて同じオープン・リーデイ
ング・フレームを有するが３′末端では相違しており、
従つて異なるCOOH末端配列を有する相同タンパク質をコ
ードしている。両方のクローンのオープン・リーデイン
グ・フレーム内部のDNA配列は、実施例５に詳述した精
製IL−４レセプターの塩基配列決定から誘導されたタン
パク質配列と同じタンパク質配列をコードする。クロー
ン16および18はこれら２つの別個の遺伝情報の原型（プ
ロトタイプ）として用いた。クローン16は第2A図のアミ
ノ酸−25から233までを含む258個のアミノ酸から成るポ
リペプチドをコードするオープン・リーデイング・フレ
ームを含んでいる。クローン18は230個のアミノ酸から
成るポリペプチドをコードし、そのうちＮ末端の224個
のアミノ酸はクローン16のＮ末端と同一であるが、その
３′末端は次の配列:CCAAGTAATGAAAATCTG（これはＣ末
端の６個のアミノ酸:Pro−Ser−Asn−Glu−Asn−Leuを
コードする）および終結コドンTGAを有し、クローン16
と相違している。両方のクローンは実施例８に記載する
ように哺乳動物発現系により発現させた。

実施例8. 哺乳動物細胞によるIL−4Rの発現 A.COS−７細胞による発現：第３図に示す真核細胞発現
ベクターpCAV/NOTは哺乳動物の高度発現ベクターpDC201
（Sims et.al.,Science 241:585,1988）から誘導され
た。pDC201はCosman et al.,Nature312:768,1984に以前
に報じられたpMLSVの誘導体である。pCAV/NOTは、哺乳
動物細胞にトランスフエクトされたとき、その多重クロ
ーニング部位（MCS）に挿入されたcDNA配列を発現でき
るように作られており、次の成分を含む：すなわちSV40
（斜線ボツクス）は複製起点、エンハンサー配列および
初期並びに後期プロモーターを含む座標5171−270から
のSV40配列を含む。この断片は、初期プロモーターから
の転写方向が矢印で示すように方向づけられる。CMVは
ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエ
ンハンサー領域（Boshart et al.,Cell 41:521−530,19
85）に発表された配列からのヌクレオチド−671から＋
７まで）を含む。３分節（tripartite）リーダー（点描
ボツクス）はアデノウイルス−２ ３分節リーダーの第
一エキソンおよび第一と第二エキソン間のイントロンの
一部、３分節リーダーの第二エキソンおよび第三エキソ
ンの一部、並びにXhoI、KpnI、SmaI、NotIおよびBglII
部位を含む多重クローニング部位（MCS）を包含する。p
A（斜線ボツクス）は初期転写のためのポリアデニル化
シグナルおよび終結シグナルを含む4127−4100および27
70−2533からのSV40配列を包含する。pAから時計回り
に、VAIおよびVAII遺伝子を含むアデノウイルス−２配
列10532−11156（黒の太線で示す）が存在し、これに続
いてアンピシリン耐性遺伝子と複製起点を含む4363−24
86および1094−375からのpBR322配列（実線）が存在す
る。得られた発現ベクターはpCAVF/NOTと名づけられ
た。

クローン16およびクローン18中の挿入物は両方ともAs
p718およびNotIで消化してBluescript プラスミドから
分離した。その後、クローン16からの3.5kb挿入物は、
ポリリンカー領域中のAsp718およびNotI部位で切断した
発現ベクターpCAV/NOTに直接連結した。クローン18から
の挿入物はT4ポリメラーゼで平滑末端とした後、SmaIで
切断し脱リイン酸化したベクターpCAV/NOTに連結させ
た。

両方のIL−４レセプター発現プラスミドからのプラス
ミドDNAは、Luthman et al.（Nucl.Acids Res.11:1295,
1983）およびNcCutchan et al.,（J.Natl.Cancer Inst.
41:351,1968）に記載されるようなDEAE−デキストラ
ン、その後のクロロキン処理を用いて、サルCOS−７細
胞の半集密細胞層をトランスフエクシヨンするために使
用した。細胞はその後挿入配列の一時的発現を起こさせ
るべく３日間培養下で増殖させた。３日後、培養上清お
よび細胞単層を（実施例１に記載したように）検定し、
IL−４の結合を確認した。

B.CHO細胞による発現:IL−4Rはまた、初めにクローン18
のAsp718/NotI制限断片を実施例８に記載のpCAV/NOTベ
クターに連結することにより、哺乳動物CHO細胞系列で
発現させた。クローン18からの挿入物を含むpCAV/NOTベ
クターはその後、標準リン酸カルシウム法を用いて、SV
40初期プロモーターの制限下にあるジヒドロ葉酸還元酵
素（DHFR）cDNA選択マーカーと共にCHO細胞に同時トラ
ンスフエクシヨンした。DHFR配列はこのプラスミドを保
有する哺乳動物細胞のメトトレキセート選択を可能にす
る。この種の細胞でのDHFR配列の増幅現象は高濃度のメ
トトレキセートを用いて選択した。この方法では、近傍
のDNA配列も増幅されるので、高められた発現が達成さ
れる。トランスフエクト細胞の大量の細胞培養物は、約
100ng/mlの量で可溶性の活性IL−4Rを分泌した。

C.HeLa細胞による発現:IL−4RはCMV前初期（immediate
−early）エンハンサー／プロモーターの支配下でEBV核
抗原１−を構成的に発現するヒトHeLa−EBNA細胞株653
−６により発現させた。用いた発現ベクターはpDC201の
誘導体であるpHAV−EO−NEO（Dower et al.,J.Immunol.
142:4314,1989）であり、このベクターはEBV複製起点を
含み、653−６細胞系列での高レベル発現を可能にす
る。pHAV−EO−NEOは、アデノウイルス主要後期プロモ
ーターを、ウイルスmRNAのキヤツプ部位に対して−148
から＋78まで延びるHIV−１からの合成配列と置き換
え、そしてHIV−1 tat遺伝子をSV−40初期プロモーター
の支配下におくことによつて、pDC201か誘導された。そ
れはまたBgiIIおよびHpaI部位に挿入されたpSV2NEO（So
uthern＆Berg,J.Mol.Appl.Genet.1:332,1982）のネオマ
イシン耐性遺伝子を含むBglII−SmaI断片（SalIクロー
ニング部位の下流にサブクローニングされる）を含んで
いる。得られたベクターはネオマイシン耐性によるトラ
ンスフエクト細胞の選択を可能にする。

760bpのIL−4R断片はEcoNIおよびSstI制限酵素で消化
することによりBluescript プラスミドから分離した。
クローン18のこの断片は５′末端ヌクレオチド配列:GTG
CAGGCACCTTTTGTGTCCCCA、第2A図のヌクレオチド672の後
続のTGA終止コドン、並びに３′末端ヌクレオチド配列:
CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGTを追加した、第
2A図のヌクレオチド１−672に対応する。この断片はそ
の後T4ポリメラーゼを用いて平滑末端となし、pHAV−EO
−NEOのSalI部位にサブクローニングした。得られたプ
ラスミドはDower et al.,（J.Immunol.142:4314,1989）
に記載されるような改変したポリブレントランスフエク
シヨン法により653−６細胞系列ニトランスフエクシヨ
ンした。ただし、細胞はトランスフエクシヨン後２日で
トリプシン処理を行い、1mg/mlの濃度のG418（ギブコ社
製）を含有する培地に1:8の比で分配した。培地はネオ
マイシン耐製コロニーが樹立されるまで１週間に２回取
り換えた。その後、コロニーはクローニングリングを使
つて別々に採取するか、または一緒にプールして、いく
つかの異なる細胞系列を発生させた。これらの細胞系列
は250μg/mlのG418濃度で薬物選択下に維持した。細胞
が集密的生長に達した時点で上清を採取し、実施例1Bの
阻害検定により試験した。細胞系列は100〜600ng/mlの
可溶性IL−4Rタンパク質を産出した。

実施例9. 酵母細胞によるIL−4Rの発現 mIL−4Rの発現のために、pIXY120から誘導される酵母
発現ベクターを次のように構築した。pIXY120は、それ
がcDNA挿入物を含まずかつNcoI部位を有するポリリンカ
ー／多重クローニング部位を含むことを除いて、pYαHu
GM（ATCC 53157）と同一である。このベクターは次の供
給源からのDNA配列を含む：すなわち（１）プラスミドp
BR322（ATCC 37017）から切り出した、複製起点および
E.coli選択用のアンピシリン耐性マーカーを含む大きい
SphI（ヌクレオチド562）−EcoRI（ヌクレオチド4361）
断片；（２）TRP−１マーカー、２μ複製起点、ADH2プ
ロモーターを含むS.cerevisiaeDNA;および（３）分泌ペ
プチドα因子をコードする遺伝子から誘導された、85個
のアミノ酸から成るシグナルペプチドをコードするDNA
（Kurjanらの米国特許第4546082号公報）。Asp718制限
部位は異種遺伝子への融合を容易にするために、α因子
シグナルペプチド中の237位に導入した。これはCraik,B
io Techniques,January 1985,pp.12−19に記載されるよ
うな特定オリゴヌクレオチドによるin vitro変異導入法
を用いて、ヌクレオチド241のチミジン残基をシトシン
残基に変えることによつて達成された。多重クローニン
グ部位を含み、α因子シグナルペプチドの３′末端近傍
のアミノ酸79におけるAsp718部位から２μ配列中のSpeI
部位までの次の配列を有する合成オリゴヌクレオチドが
挿入された： pBC120はpBR322配列中のNruI部位に挿入された、複製起
点および遺伝子間領域を含む一本鎖フアージf1由来の51
4bpDNA断片の存在によつてpYαHuGMと異なつている。f1
複製起点の存在は、適当なE.coli株に形質転換してバク
テリオフアージf1を重感染させる場合、ベクターの一本
鎖DNAコピーを生じさせ、これはベクターのDNA塩基配列
決定を容易にし、またin vitro変異導入の土台を提供す
る。cDNAを挿入するために、pIXY120はAsp718（α因子
リーダーペプチドの３′末端近傍（ヌクレオチド237）
で切断する）と、例えばBamHI（ポリリンカー中で切断
する）とで消化する。その後、大きいベクター断片を精
製して、発現すべきタンパク質をコードするDNA断片に
連結させる。

mIL−4Rを発現する分泌ベクターを作るために、mIL−
4RをコードするcDNA断片は、実施例８のBluescript プ
ラスミドをPpumIとBglIIで消化して、mIL−4R配列（Ile
およびLysをコードする最初の２個の５′コドンを除
く）を含むPpumI部位（図面参照）からオープン・リー
デイング・フレームの３′側にあるBglII部位までの831
bp断片を分離することにより、Bluescript プラスミド
から切り出した。pLXY120はAsp718（α因子リーダーの
３′末端近傍）およびBamHIで消化した。ベクター断片
はPpumI/BglIIhIL−4R cDNA断片、およびα因子リーダ
ーの最後の６個のアミノ酸と成熟mIL−4Rの最初の２個
のアミノ酸とを再形成させる一対の合成オリゴヌクレオ
チドのアニーリングにより作つた次の断片に連結させ
た： このオリゴヌクレオチドはまた、コードされるアミノ酸
配列を変えることなく、XbaI制限部位を導入するための
ヌクレオチド配列TGGATAからCTAGATへの変更を含んでい
た。

前記の発現ベクターはその後精製し、これを用いて標
準技法（例えば欧州特許公開第165654号に記載される方
法）によりS.cerevisiaeの二倍体酵母株（XV2181）を形
質転換し、トリプトフアン原栄養株について選択した。
得られた形質転換細胞は分泌mIL−4Rタンパク質の発現
のために培養した。生物学的活性を検定するための培養
物は、YPD培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１％
グルコース）20〜50ml中37℃で１〜５×10⁸細胞/mlの細
胞密度へ増殖させた。細胞を培地から分離するために、
遠心により細胞を除き、検定に先立つて培地を0.45μ酢
酸セルロースフイルターに通して過した。形質転換酵
母株によりもたらされた上清、またはプラスミドにより
形質転換され、その後破壊された酵母細胞からの粗製抽
出物は、生物学的に活性なタンパク質の発現を証明する
ために検定を行つた。

実施例10. 選別していない7B9細胞からの全長および末端切断形態
のネズミIL−４レセプターcDNAの分離 C57BL/6マウスより誘導された抗原依存性ヘルパーＴ
細胞クローンである7B9細胞からポリアデニル化RNAを分
離し、これを用いて実施例７に記載したごとくλZAP
（サンジエゴ、ストランジーン社製）にcDNAライブラリ
ーを作製した。λZAPライブラリーは一度増幅させ、そ
して実施例７に記載したように全部で300,000個のプラ
ークをスクリーニングした。ただし、プローブはCTLL1
9.4クローン16から単離し、ランダムプライマーを用い
て作つた³²P標識700bpEcoRI断片であつた。13個のクロ
ーンが単離され、制限分析により同定された。

クローン7B9−２の核酸素配列分析は、それがポリア
デニル化尾部、推定上のポリアデイル化シグナル、およ
び810個のアミノ酸のオープン・リーデイング・フレー
ム（第２図に示す）を含み、このうちの最初の258個はC
TLL19.4クローン16によりコードされるものと同一であ
り、25個のアミノ酸から成る推定上のシグナルペプチド
配列を含むことを明らかにした。7B9−2cDNAは真核細胞
発現ベクターpCAV/NOTにサブクローニングし、得られた
プラスミドは実施例８に記載したとおりにCOS−７細胞
にトランスフエクシヨンした。COS−７トランスフエク
ト細胞は実施例12で説明するように分析した。

CTLL19.4ライブラリー中のクローン18に類似した第二
cDNA形態が7B9ライブラリーから分離され、配列分析に
かけられた。このcDNA、クローン7B9−４、はその５′
末端においてクローン7B9−２よりも376bp短く、7B9−
２によりコードされる最初の47個のアミノ酸を欠くが、
残りのＮ末端アミノ酸23−199をコードする（第２図参
照）。200位に、クローン7B9−４は（CTLL19.4からのク
ローン18と同様に）アミノ酸配列をPro Ser Asn Glu As
n Leuに変える114bp挿入物および後続の終結コドンを含
む。クローン7B9−４とCTLL19.4クローン18の両方に存
在する114bp挿入物は核酸配列が同一である。このcDNA
形態（COS−７細胞中で発現させると分泌型のIL−４レ
セプターをもたらす）がこれが２つの異なる細胞系列か
ら分離された事実は、それがクローニング人工産物でも
なく選別CTLL細胞に特有の変異体でもないことを示して
いる。

実施例11. 交差種（cross−species）ハイブリダイゼーシヨンによ
るPBLおよびT22ライブラリーからのヒトIL−４レセプタ
ーcDNAの分離 ポリアニデル化RNAは、標準フイコール精製により分
離してIL−２中で６日間培養し、その後RMAおよびCon−
Ａで８時間刺激したヒト末梢血リンパ球（PBL）から単
離した。オリゴdTをプライマーとして用いたcDNAライブ
ラリーは実施例７に記載した手法を用いてλgt10に作製
した。プローブはT7 RNAポリメラーゼを用いて7B9−4cD
NAの未標識RNA転写物を合成し、次にランダムプライマ
ー（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて逆転写酵
素で³²P標識cDNAを合成することにより作つた。このネ
ズミ一本鎖cDNAプローブを用いて、ヒトcDNAライブラリ
ーからの50,000個のプラークを50％ホルムアミド/0.4M
NaCl中42℃でスクリーニングし、その後２×SSC中55℃
で洗つた。３個の陽性プラークを精製し、EcoRI挿入物
をBluescript プラスミドベクターにサブクローニング
した。クローンPBL−１（3.4kbのcDNA）の一部の核酸配
列決定は、このクローンがネズミIL−４レセプターの対
応配列に対し約67％相同であることを示した。しかしな
がら、終結コドンを含む且つマウスIL−４レセプターク
ローンに対し相同でない68bpの挿入物が、成熟タンパク
質の推定上のＮ末端から45アミノ酸下流に存在してお
り、このことはクローンPBL−１が非機能的な末端切断
形態のレセプターをコードしていることを示唆した。同
一のライブラリーを（ストリンジエント条件下で）クロ
ーンPBL−１（3.4kbのEcoRI cDNA挿入物）からランダム
プライマーを用いて作つた³²P標識プローブでスクリー
ニングすることにより、９個の追加ヒトPBLクローンが
得られた。これらのクローンのうち２個（PBL−11およ
びPBL−５）は、PBL−１において68bp挿入物を含む５′
領域へ延びているが68bp挿入物を含まず、そしてそれら
の大きさから明らかであるように、完全に３′へ延びて
いない。そのため、これらのクローンは哺乳動物発現に
よる機能分析を妨げる。COS−７細胞において発現可能
な構築物を得るために、クローンPBL−11およびPBL−５
の５′NotI−HincII断片を別々にクローンPBL−１の
３′HincII−BamHI末端に連結させ、そして実施例８に
記載のNotIとBglIIで切断したpCAV/NOT発現ベクターに
サブクローニングした。PBL−11/PBL−１およびPBL−5/
PBL−1 DNA配列を含むこれらのキメラヒトIL−4R cDNA
は、実施例12で詳述するように、それぞれクローンA5お
よびB4と名づけられた。これらの構築物はCOS−７細胞
にトランスフエクシヨンし、実質的にSims et al.（Sci
ence 241:585,1988）に記載されるようなプレート結合
検定でIL−４結合について分析した。両方の複合構築物
はIL−４結合活性を示すタンパク質をコードしていた。
複合A5構築物のヌクレオチド配列および推定上のアミノ
酸配列は第4A〜4C図に示した配列情報に一致するが、た
だしGTCコドンが50位のIleの代わりにValをコードす
る。塩基配列の決定を行つた他のクローンにはこの変更
が見られなかつた。クローンPBL−１、PBL−５およびT2
2−８からのコンセンサスコドンはATCであつて、第4A図
に示すようにIle⁵⁰をコードする。複合B4構築物のヌク
レオチド配列および推定上のアミノ酸配列もまた、PBL
−11の25個のアミノ酸から成るリーダー配列が次の配
列:Met−Gln−Lys−Asp−Ala−Arg−Arg−Glu−Gly−As
nによつて置き換えられていることを示す。

可溶性形態のヒトIL−４レセプターを発現する構築動
は、PBL−５から５′末端の0.8kb SmaI−DraIII断片
を、そしてPBL−11から対応する0.8kb Asp718−DraIII
断片を、それぞれ切り出し、DraIII突出部分をT4ポリメ
ラーゼで平滑末端とすることにより作つた。PBL−５お
よびPBL−11断片は別々に、SmaIまたはAsp718＋SmaIで
それぞれ切断したCAV/NOTにサブクローニングした；こ
れらはそれぞれ可溶性hIL−4R−５および可溶性hIL−4R
−11と呼ばれる。両方の構築物とも、最後のIL−４レセ
プターアミノ酸Thr¹⁹⁴コドンの後で、しかも終結コドン
の前に、ベクターによりコードされるアミノ酸:Gly Gln
Arg Pro Leu Gln Ile Tyr Ala Ileが存在する。

CD4＋/CD8−ヒト細胞クローン、T22、（Acres et a
l.,J.Immunol.138:2132,1987）から作製した第二のライ
ブラリーは、上記のように合成した２つの異なるプロー
ブで（写し取つたフイルターを用いて）スクリーニング
した。第一のプローブはクローンPBL−１の５′末端か
らの220bp PvuII断片より得られ、第二のプローブはク
ローンPBL−１の３′末端からの300bp PvfuII−EcoRI断
片より得られた。５個の追加のcDNAクローンがこれら２
つのプローブを用いて同定された。これらのクローンの
うち２つは68bp挿入物を含む５′領域へ延びているが、
この挿入物のどちらも含んでいない。これらのクローン
の３番目のもの、T22−８、は大きさが約3.6kbであり25
個のアミノ酸から成るリーダー配列、207個のアミノ酸
から成る成熟外部ドメイン、24個のアミノ酸から成るト
ランスメンブラン領域および569個のアミノ酸から成る
細胞質ドメインを含む、825個のアミノ酸のオープン・
リーデイング・フレームを含んでいた。クローンT22−
８の配列は第4A〜4C図に示す。第5Aおよび5B図は推定上
のヒトIL−4Rアミノ酸配列と推定上のネズミIL−4R配列
とを比較するものであり、これら２種類のタンパク質間
での約53％の配列同一性を示す。

第三の可溶性ヒトIL−４レセプター構築物は次のよう
に作製した。cDNAクローンT22−８をThr¹⁹⁴コドン中のD
raIII部位で切断し、合成オリゴヌクレオチドで修復し
てThr¹⁹⁴コドンおよびLys¹⁹⁵コドン、後続の終結コド
ン、並びにNotI制限部位を生成させた。その後、このク
ローンの0.68kb StyI−NotI制限断片をStyI部位で平滑
末端となし、SmaI−NotIで切断したpCAV/NOTベクターに
サブクローニングした。このcDNA発現ベクターはhIL−4
R−８と名づけた。

実施例12. COSトランスフエクト細胞により産生されたIL−４レセ
プターの分析および精製 平衡結合実験はCTLL19.4ライブラリーからのネズミIL
−４レセプタークローン16および18でトランスフエクシ
ヨンしたCOS細胞に対して実施した。すべての場合に、
スカツチヤード座標系（Scatchard,Ann,N.Y.Acad.Sci.5
1:660−672,1949）でのデータの分析は直線をもたし、
ネズミIL−４に対する単一クラスの高親和性レセプター
を示した。COS pCAV−16細胞の場合、計算された見掛け
Kaは3.6×10⁹M^-1であり、細胞あたりの特異的結合部位
数は5.9×10⁵であつた。同様の見掛けKa1.5×10⁹M^-1がC
OSpCAV−18細胞に対して算出されたが、細胞表面に発現
されたレセプター数は4.2×10⁴であつた。7B9細胞ライ
ブラリーから分離したIL−4R DNAクローンでトランスフ
エクシヨンしたCOS細胞に対して実施した平衡結合実験
もまた、IL−４へのレセプターの高親和性結合を示し
た。特に、pCAV−7B9−２でトランスフエクシヨンしたC
OS細胞を用いた実験は、全長ネズミIL−４レセプターが
¹²⁵I−IL−４に見掛けKa約1.4×10¹⁰M^-1で結合し、細胞
あたりの特異的結合部位が4.5×10⁴であることを証明し
た。CAV−7B9−4 IL−4Rの見掛けKaは約1.7×10⁹M^-1で
あると算出された。Kaの絶対値および細胞あたりの結合
部位数はトランスフエクシヨン間で変化したが、結合親
和性は一般に近似しており（１×10⁹〜１×10¹⁰M^-1）、
以前に発表されたIL−４の結合親和性定数とよく合致し
た。

プラスミドpCAV、pCAV−18またはpCAV−7B9−４でト
ランスフエクシヨンしたCOS細胞からのならし培地（con
ditioned medium）によるCTLL細胞への¹²⁵I−mIL−４結
合の阻害は、これらのcDNAが機能的な可溶性レセプター
分子をコードするのかどうかを調べるために用いられ
た。最終検定容量150μｌ中のCOS pCAV−18ならし培地
約1.5μｌは、CTLL細胞上のIL−ｃレセプターへの¹²⁵I
−IL−４結合の約50％阻害を与える。¹²⁵I−IL−４レセ
プターの競合活性は対照のpCAVトランスフエクトCOS細
胞上清において検出されない。¹²⁵I−IL−４結合を50％
阻害するのに要するpCAV−18上清の希釈物の定量分析か
ら、約60〜100ng/mlの可溶性IL−４レセプターが、トラ
ンスフエクシヒョンの３日後に回収した場合、COS細胞
によつて分泌されたと概算される。同様の結果がpCAP−
7B9−４でトランスフエクシヨンしたCOS細胞からの上清
を用いても得られた。

pCAV−18またはpCAV−7B9−４（実施例８参照）でト
ランスフエクシヨンを行い、３％FBSを含むDMEM中で増
殖させたCOS細胞からのならし培地はトランスフエクシ
ヨン後３日目に回収した。上清は3000cpmで10分遠心
し、使用するまで凍結保存した。ならし培地200mlは、
上記のように調製したmuIL−4Affigel4mlを含むカラム
にかけた。カラムをPBSで十分に洗い、IL−４レセプタ
ーを0.1Mグリシン、0.15M NaCl（pH3.0）で溶出した。
溶出直後に、試料を1Mヘペス（pH7.4）で中和した。試
料は実施例1Bで説明したようにCTLL細胞への¹²⁵I−muIL
−４の結合を阻害するそれらの能力について試験した。
さらに、試料は先に述べたようなSDS−PAGE上での分析
および銀染色により純度について調べた。機能的な可溶
性レセプターの活性またはIL−４結合の阻害を試験する
他の方法には、実施例ICに記載したような固相結合検
定、または放射性ヨウ素化されたあるいは比色定量用に
開発されたIL−４の結合を利用するRIAまたはELISAのよ
うな無細胞検定が含まれる。SDS−PAGEで還元条件下に
分析したタンパク質は約37500の分子量を有し、ゲルの
銀染色分析により約90％の純度であると思われる。

精製した組換え可溶性ネズミIL−４レセプタータンパ
ク質は、CTLL細胞内へのIL−４誘導³H−チミジン取込み
を阻害するその能力についても試験すことができる。こ
のような方法によつて、可溶性IL−４レセプターはIL−
４で刺激される増殖を阻止することが判明したが、IL−
２によつて誘起されるマイトジエン応答には影響を及ぼ
さない。

分子量の概算はCOS細胞にトランスフエクシヨンされ
たmIL−４レセプタークローンについて行つた。ネズミC
TLL19.4細胞に対して作られたM2モノクローナル抗体
（実施例13参照）を用いて、CAV−16、CAV−7B9−２お
よびCAV−7B9−４でトランスフエクシヨンし、その後³⁵
S−システインおよび³⁵S−メチオニンで標識したCOS細
胞からIL−４レセプターを免疫沈降させた。CAV−7B9−
４からの細胞関連レセプターは32〜39kDaの範囲の分子
量不均一性を示す。分泌されたCAV−7B9−４レセプター
は36〜41kDaの分子量を有する。CAV−16トランスフエク
トCOS細胞からの細胞関連レセプターは約40〜41kDaであ
る。これはPark et al.,J.Exp.Med.166:476,1987;J.Cel
l.Biol.,Suppl.12A,1988に開示された架橋実験からの分
子量概算値よりもはるかに小さい。COS CAV−7B9−２細
胞関連レセプターの免疫沈降は、Park et al.,J.Cell.B
iol.,Suppl.124A,1988の概算値に類似した130〜140kDa
の分子量を示し、全長IL−４レセプターであると見なさ
れた。細胞関連CAV−16およびCAV−7B9−2 IL−４レセ
プターの同様の分子量概算はまた、これらのcDNAでトラ
ンスフエクシヨンしたCOS細胞への¹²⁵I−IL−４の架橋
に基づいても行われた。個々のクローンの分子量の不均
一性は幾分かはグリコシル化のためであると考えられ
る。このデータは、DNA塩基配列の解析と合わせて、7B9
−2 cDNAが全長細胞表面IL−４レセプターをコードし、
一方7B9−４およびクローン18が両方とも可溶性形態の
ネズミIL−４レセプターを表すことを示唆している。

レセプターの性状決定実験もまたhIL−4R含有表現プ
ラスミドでトランスフエクシヨンしたCOS細胞を用いて
行つた。２つのキメラヒトIL−4R分子A5およびB4（実施
例11に記載）をCOS細胞にトランスフエクシヨンし、そ
の後平衡結合実験を行つた。COSサル細胞はそれ自体がh
IL−４に結合可能なレセプターを持つている；それ故
に、hIL−4R cDNAでトランスフエクシヨンされ、それを
過剰発現するCOS細胞に対して行つた結合計算値は、内
因性サルIL−4R分子からのバツクグラウンド結合を全結
合から減じた値を表す。hIL−4R A5でトランスフエクシ
ヨンされたCOS細胞は5.3×10⁴のhIL−４結合部位を有
し、算出されたKaは3.48×10⁹M^-1であつた。同様に、CO
S細胞により発現されたhIL−4R B4は3.94×10⁹M^-1の親
和性で¹²⁵I−hIL−４を結合し、3.2×10⁴レセプター／
細胞を示した。

COS細胞により発現されたヒトIL−4Rの分子量の概算
も行つた。pCAV/NOT中のクローンA5またはB4でトランス
フエクシヨンしたCOS細胞は³⁵Sシステイン／メチオニン
で標識し、その後溶解した。hIL−４結合Affigel を用
いて、（実施例４に記載したように）この細胞溶解液か
らヒトIL−4Rをアフイニテイー精製した。このアフイニ
テイー担体から溶出されたhIL−4R A5およびB4はSDS−P
AGE上を約140,000ダルトンで泳動し、これは架橋による
hIL−4R分子量の従来の概算値（Park et al.,J.Exp.Me
d.166:476,1987）、並びに本明細書中で示した全長mIL
−4Rの概算値とよく一致する。

ネズミレセプター（クローン18および7B9−４）の場
合と同様に、可溶性ヒトIL−4R cDNAはこれまで自然界
に存在していなかつたので、実施例11に記載したように
して末端切断形態を構築した。COS細胞での発現後、上
清は可溶性hILA−4R−11および可溶性hIL−4R−５でト
ランスフエクシヨン後３日目に回収して、ヒトＢ細胞系
列Rajiへの¹²⁵I−hIL−４結合の阻害について試験し
た。可溶性hIL−4R−11でトランスフエクシヨンしたプ
レートのうち２つからの上清と、可溶性hIL−4R−５で
トランスフエクシヨンしたプレートのうち１つからの上
清は29〜149ng/mlのIL−4R競合活性お培地中に含んでい
た。さらに、末端切断タンパク質はhIL−４結合Affigel
でのアフイニテイー精製により、SDS−PAGEで約44kDa
タンパク質として、³⁵S−メチオニン／システイン標識
トランスフエクトCOS細胞においても検出することがで
きた。hIL−4R−８（可溶性末端切断IL−4Rをコードす
る）でトランスフエクシヨンされたCOS細胞からの上清
は、25倍に濃縮したとき、Raji細胞へのヒトIL−４結合
を阻害し、約16ng/mlの競合活性を含んでいた。

実施例13. IL−4Rに対するモノクローナル抗体の製造 精製された組換えIL−４レセプター（例えば、ヒトま
たはネズミIL−４レセプター）、高レベルのIL−４レセ
プターを発現するトランスフエクトCOS細胞、またはCTL
L19.4細胞の調製物は、米国特許第4411993号に記載され
るような慣用技法を用いて、IL−４レセプターに対する
モノクローナル抗体をつくるために用いられる。この種
の抗体はIL−４レセプターへのIL−４の結合を防げるの
に有用であり、例えばIL−４の有毒なまたは他の望まし
くない作用を改善するのに有用であるだろう。

ラツトを免疫するために、IL−４レセプターを保有す
るCTLL19.4細胞は完全フロインドアジユバント中に乳化
して免疫原として使用し、10〜100μｌの量でLewisラツ
トに皮下注射した。３週間後、免疫した動物は不完全フ
ロインドアジユバント中に乳化した追加の免疫原で二次
免疫を施し、その後３週間ごとに追加免疫を施した。血
清試料はドツト−ブロツト検定、ELISA（酵素結合免疫
吸着検定）、またはCTLL細胞抽出物への¹²⁵I−IL−４の
結合阻害（実施例１に記載）により調べるために、眼窩
後の出血または尾先端部の切除により定規的に採決す
る。他の検定法も適している。適当な抗体価の検出後、
陽性動物には最後に食塩液中の抗原を静脈注射した。３
〜４日後、動物を殺滅し、脾細胞を採取し、そしてネズ
ミ黒色腫細胞系列AG8653に融合させた。この方法により
得られたハイブリドーマ細胞系列は多重マイクロタイタ
ープレート中の非融合細胞、黒色腫細胞ハイブリツドお
よび脾細胞ハイブリツドの増殖を阻止するHAT選択培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）
にまいた。

このようにして得られたハイブリドーマクローンはIL
−４レセプターとの反応性についてスクリーニングし
た。ハリブリドーマ上清の初期スクリーニングは部分精
製した¹²⁵I−mIL−４レセプターの抗体捕獲・結合を利
用したものであつた。スクリーニングした400個以上の
ハイブリドーマのうち４個がこの方法で陽性であつた。
これら２つのモノクローナル抗体、M1およびM2、は阻止
抗体を検出する抗体捕獲の変法により支援した。M1のみ
が完全なCTLL細胞への¹²⁵I−rmIL−４結合を阻止するこ
とができた。両方の抗体はIL−4Rクローンでトランスフ
エクシヨンされ、³⁵S−システイン／メチオニンで標識
されたCOS−７細胞またはCTLL細胞からの天然mIL−4Rタ
ンパク質を免疫沈降させることができる。その後、M1お
よびM2はヌードマウスの腹腔内に注入し、高濃度（＞1m
g/ml）の抗IL−4Rモノクローナル抗体を含む腹水を生じ
させた。得られたモノクローナル抗体は硫安沈殿とその
後のゲル排除クロマトグラフイー、および／またはプロ
テインＧに対する抗体の結合に基づいたアフイニテイー
クロマトグラフィーにより精製した。

実施例14. 免疫反応をin vivo抑制するための可溶性IL−4Rの使用 実験は膝窩リパ節検定を用いてin vivoでの同種異系
宿主対移植片（HVG）応答に対する可溶性IL−4Rの影響
を調べるために行つた。このモデルでは、マウスの足裏
のふくらみ（footpad）に、照射した同種異系の脾細胞
を注入する。その後、反対側の足裏に、照射した同種同
系細胞を注入する。同種異系細胞を受容する足裏にはア
ロ反応性応答（alloreactive response）が起こり、こ
の応答の度合いは抗原沈着部位から排出される膝窩リン
パ節の大きさおよび重さの相対的増加により測定するこ
とができる。

０日目に、３匹のBALB/Cマウスの足裏のふくらみにc5
7BL/6マウス由来の照射した同種異系脾細胞を注入し、
反対側の足裏に照射した同種同系脾細胞を注入した。−
１日目、０日目および＋１日目に、３匹のマウスいリン
酸緩衝溶液中の精製可溶性IL−4R（sIL−4R）100ngを
（−１日目と０日目には静脈に、＋１日目には皮下に）
注射し、３匹のマウスにsIL−4R 1μｇを静脈注射し、
３匹のマウスにsIL−4R 2μｇを注射し、そして３匹の
マウスにMSA（対照）を注射した。同種異系および同種
同系脾細胞の部位からのリンパ節お重さの平均差は、MS
A処置マウスの場合が約2.5mg、sIL−4R100ngで処置した
マウスの場合が1mg、そしてsIL−4R 1μｇで処置したマ
ウスの場合が0.5mgであつた。sIL−4R 2μｇで処置した
マウスの場合には、リンパ節の重さの検出可能な差を確
認できなかつた。こうして、IL−4Rは対照マウスに対し
て用量依存の関係でin vivoリンパ節増殖応答を有意に
（両側Ｔテストを用いて、すべてのグループにおいて、
ｐ＜0.5）抑制した。

【図面の簡単な説明】

第１図はネズミおよびヒトIL−4R cDNAのコード領域
（黒の太線で示す）を含むcDNAクローンの制限地図を示
す。 第2A〜Ｃ図は、7B9ライブラリーのクローン7B9−２から
誘導されるような、ネズミIL−４レセプターのコード領
域のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す配列図であ
る。 第３図は哺乳動物高度発現プラスミドpCAV/NOTの模式図
である。 第4A〜Ｃ図は、Ｔ細胞系列T22から誘導されたcDNAライ
ブラリーより得られた、クローンT22−８からのヒトIL
−４レセプターcDNAのコード配列を示す配列図である。 第5A〜Ｂ図はヒト（上段）とネズミ（下段）のIL−４レ
セプターcDNAクローンの推定アミノ酸配列を示す配列図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ (31)優先権主張番号 ３７０９２４ (32)優先日 1989年６月23日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ブルース・モスレー アメリカ合衆国ワシントン州98125，シ アトル，サーティーシックスス・アベニ ュー・ノース・イースト 11331 (72)発明者 パトリシア・ベックマン アメリカ合衆国ワシントン州98370，ポ ールスボ，ネシカ・ベイ・ロード 15875 (72)発明者 カール・ジェイ・マーチ アメリカ合衆国ワシントン州98106，シ アトル，エイス・サウス・ウエスト 8133 (72)発明者 レジーン・イドゼルダ アメリカ合衆国ワシントン州98125，シ アトル，サーティーシックスス・アベニ ュー・ノース・イースト 11331 (56)参考文献 特開 平２−503752（ＪＰ，Ａ) Ｉｒｏｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 54，Ｎｏ．４（1985）ｐ．745−754 Ｉｒｏｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 64，Ｎｏ．１（1988．Ｍａｙ）ｐ．101 −105

Claims (31)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）および（ｂ）からなるグルー
   プから選択される、IL−４に結合できる哺乳類IL−４レ
   セプター（以下、「IL−4R」という）タンパク質または
   その類縁体をコードする、単離されたDNA: （ａ）図2A−2Cの−25〜785のアミノ酸配列、図2A−2C
   の１〜785のアミノ酸配列、図4A−4Cの−25〜800のアミ
   ノ酸配列、または図4A−4Cの１〜800のアミノ酸配列を
   含むタンパク質 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数の
   アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   配列を含み、かつIL−４に結合可能なタンパク質。
2. 【請求項２】図2A−2Cの−75〜2355の核酸配列、図2A−
   2Cの１〜2355の核酸配列、図4A−4Cの−75〜2400の核酸
   配列、または図4A−4Cの１〜2400の核酸配列を含む、請
   求項１に記載のDNA。
3. 【請求項３】請求項１または２のDNAとストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、IL
   −４に結合可能なタンパク質をコードする、単離された
   DNA。
4. 【請求項４】図4A−4Cの−25〜207のアミノ酸配列また
   は図4A−4Cの１−207のアミノ酸配列を含む、可溶性ヒ
   トIL−4Rをコードする、請求項１または３に記載のDN
   A。
5. 【請求項５】図4A−4Cの−75〜621の核酸配列または図4
   A−4Cの１〜621の核酸配列を含む、請求項４に記載のDN
   A。
6. 【請求項６】以下の（ａ）−（ｃ）： （ａ）図2A−2CのマウスIL−4Rポリペプチド； （ｂ）図4A−4CのヒトIL−4Rポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片であっ
   て、IL−４に結合可能な前記断片 から選択されるIL−4Rをコードする単離されたDNA。
7. 【請求項７】請求項１−６のいずれか１項に記載のDNA
   を含む、組換え発現ベクター。
8. 【請求項８】請求項７に記載のベクターを含む、宿主細
   胞。
9. 【請求項９】請求項８に記載の宿主細胞を、IL−4Rまた
   はその類縁体の発現を促進する条件下で培養することを
   含む、哺乳動物IL−4Rまたはその類縁体の調製方法。
10. 【請求項１０】前記ベクターが請求項５に記載のDNAを
    含むものである、請求項９に記載の調製方法。
11. 【請求項１１】請求項１−６のいずれか１項に記載のDN
    Aによってコードされる、IL−４に結合可能な、精製さ
    れたIL−4Rポリペプチドまたその類縁体。
12. 【請求項１２】請求項５に記載のDNAによってコードさ
    れる、請求項11に記載のIL−4Rポリペプチドまたはその
    類縁体。
13. 【請求項１３】本質的にマウスに由来する、請求項11に
    記載のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体。
14. 【請求項１４】本質的にヒトに由来する、請求項11に記
    載のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体。
15. 【請求項１５】SDS−PAGEによる約130と145キロダルト
    ンの間の分子量を有し、かつヒトIL−４に対する結合親
    和性（Ka）約１〜８×10⁹M^-1を有する糖タンパク質の形
    態である、請求項14に記載のIL−4Rポリペプチドまたそ
    の類縁体。
16. 【請求項１６】以下の（ａ）−（ｂ）： （ａ）図2A−2Cの１〜785のアミノ酸配列または図4A−4
    Cの１〜800のアミノ酸配列を含むポリペプチド；または （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数の
    アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
    配列を含み、かつIL−４に結合可能な、（ａ）のポリペ
    プチドの類縁体 から選択される、IL−４に結合可能な、精製されたIL−
    4Rポリペプチドまたその類縁体。
17. 【請求項１７】天然のIL−４タンパク質の細胞膜領域お
    よび細胞質領域を欠失させた、請求項16に記載のIL−4R
    またはその類縁体。
18. 【請求項１８】図2A−2Cの残基１〜785、図2Aの残基１
    〜208、図4A−4Cの残基１〜800、または図4Aの残基１〜
    207の配列から選択されるアミノ酸配列と80％以上同一
    のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載のIL−4Rまたは
    その類縁体。
19. 【請求項１９】図2A−2Cの残基１〜785、図2Aの残基１
    〜208、図4A−4Cの残基１〜800、または図4Aの残基１〜
    207の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1
    8に記載のIL−4Rまたはその類縁体。
20. 【請求項２０】図4Aの残基１〜207の配列から選択され
    るアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のIL−4Rまたは
    その類縁体。
21. 【請求項２１】以下の（ａ）−（ｃ）： （ａ）図2A−2CのマウスIL−4Rポリペプチド； （ｂ）図4A−4CのヒトIL−4Rポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片であっ
    て、IL−4Rの生物学的活性を有する前記断片 から選択される、精製されたIL−4Rまたその類縁体。
22. 【請求項２２】IL−４に結合可能な、図4A−4CのヒトIL
    −4Rポリペプチドの可溶性断片である、請求項21に記載
    のIL−4Rまたはその類縁体。
23. 【請求項２３】哺乳動物中の免疫応答を制御するための
    組成物であって、有効量の請求項12、17、20または22の
    いずれか１項に記載のIL−4Rまたはその類縁体、並びに
    適当な希釈剤または担体を含む、前記組成物。
24. 【請求項２４】請求項22に記載のIL−4Rタンパク質また
    はその類縁体を含む、請求項23に記載の組成物。
25. 【請求項２５】ヒトの喘息を治療するための組成物であ
    って、有効量の請求項12、０または22のいずれか１項に
    記載のヒトIL−4Rまたはその類縁体、並びに適当な希釈
    剤または担体を含む、前記組成物。
26. 【請求項２６】ヒトのアレルギー反応を治療するための
    組成物であって、有効量の請求項12、20または22のいず
    れか１項に記載のヒトIL−4Rまたはその類縁体、並びに
    適当な希釈剤または担体を含む、前記組成物。
27. 【請求項２７】請求項11ないし22のいずれか１項に記載
    のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体、並びに異種の
    ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
28. 【請求項２８】図2A−2Cまたは図4A−4Cに示された核酸
    配列のうちの、少なくとも60の連続した核酸を含む、単
    離されたDNA。
29. 【請求項２９】請求項11ないし22のいずれか１項に記載
    のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体と免疫反応する
    抗体。
30. 【請求項３０】モノクローナル抗体である、請求項29に
    記載の抗体。
31. 【請求項３１】モノクローナル抗体がヒトIL−4Rポリペ
    プチドと免疫反応するものである、請求項30に記載の抗
    体。