MXPA04009381A - Metodos para incrementar la produccion de polipeptidos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos para incrementar la produccion de polipeptidos, opcionalmente polipeptidos recombinantes, de celulas de mamifero usando derivados de xantina o compuestos polares hibridos, y a cultivos que contienen los mismos. Tambien se pueden usar combinaciones de inductores que incluyan un compuesto polar hibrido y/o un derivado de xantina y/o un acido alcanoico, opcionalmente a temperaturas de menos de 37 degree C.

Description

METODOS PARA INCREMENTAR LA PRODUCCION DE POLIPEPTIDOS Campo de la invención La invención está en el campo de la producción de polipéptidos, particularmente la producción de polipéptidos recombinan es en cultivo de células. Antecedentes de la invención Los polipéptidos son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas, agrícolas, nutritivas y de investigación. Aunque los polipéptidos pueden ser aislados de fuentes naturales, el aislamiento de grandes cantidades de un polipéptido específico de fuentes naturales puede ser costoso. Asimismo, el polipéptido podría no ser de calidad uniforme debido a variaciones en el material de origen. La tecnología de ADN recombinante permite una producción a gran escala más uniforme y económica de polipéptidos específicos. Una meta de la producción de polipéptidos recombinantes es la optimización de las condiciones de cultivo para obtener de esta manera la mayor productividad posible. Los incrementos cada vez más altos en la productividad son económicamente significativos. Algunos de los métodos para incrementar la productividad en el cultivo de células incluyen el uso de medio enriquecido, el monitoreo de la osmolaridad durante la producción, disminución de la REF . : 158933 temperatura durante fases específicas de un cultivo de células y/o la adición de butirato- de sodio (por ejemplo véase, patente de E.U.A. No. 5,705,364). Sin embargo, ya que más fármacos a base de polipeptidos demuestran efectividad clínica y se requieren cantidades comerciales incrementadas, las instalaciones de cultivo disponibles se hacen limitadas. En consecuencia, permanece la necesidad en la técnica por mejorar continuamente los rendimientos de polipéptidos recombinantes de cada cultivo de células corrido. Breve descripción de la invención Como se muestra por los datos experimentales reportados en la presente, derivados de xantina y/o compuestos polares híbridos pueden inducir dramáticamente la producción de polipéptidos, especialmente polipéptidos recombinantes, de líneas de células de mamífero. Más aún, derivados de xantina y/o compuestos polares híbridos pueden usarse en combinación con otros métodos de inducción para incrementar más la expresión de polipéptidos. De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido, el cual puede ser un polipéptido recombinante, que comprende cultivar una línea de células de mamífero en una fase de crecimiento seguida por una fase de producción o inducción, la cual puede ocurrir a una temperatura de menos de 37°C, y añadir al cultivo durante la fase de producción un derivado de xantina. La adición del derivado de" xantina puede incrementar la producción del polipéptido. La línea de células de mamífero puede ser una línea de células que haya sido genéticamente manipulada para producir el polipéptido o una línea de células de hidroma que pueda producir un anticuerpo. El derivado de xantina puede ser cafeína a una concentración de alrededor de 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar o de aproximadamente 0.01 milimolar a alrededor de 3.0 milimolar. En algunas modalidades, la línea de células de mamífero es una línea de células CHO, y puede haber sido transformada con un vector recombinante que codifique para el polipéptido recombinante. Opcionalmente, el vector puede comprender un promotor de citomegalovirus (CMV) . Típicamente, la célula no expresa naturalmente el polipéptido o sólo expresa naturalmente el polipéptido a niveles muy bajos (en ausencia de manipulación genética) . El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión recombinante o un anticuerpo humano o humanizado. La fase de producción o inducción puede ocurrir a una temperatura de aproximadamente 29°C a alrededor de 36°C o de aproximadamente 30°C a alrededor de 33°C. La fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 38°C. Opcionalmente se pueden añadir al menos dos derivados de xantina diferentes. Los derivados de xantina se pueden seleccionar del grupo que consiste en cafeína, 3-isobutil-l-metilxantina, teofilina, teobromiña, pentoxifilina y aminofilina o a partir de un subconjunto de este grupo. Si se añaden dos derivados de xantina diferentes, éstos pueden ser cafeína y 3 - isobutil- 1-metilxantina. Los derivados de xantina se pueden añadir varias veces durante el cultivo de la línea de células, y la línea de células puede cultivarse en presencia del derivado de xantina durante al menos aproximadamente 5 días. La concentración de cada derivado de xantina añadido al cultivo puede ser de aproximadamente 0.001 milimolar a alrededor de 3 milimolar. El polipéptido recombinante puede ser recogido del medio y formulado. El medio puede comprender además un compuesto polar híbrido y/o un ácido alcanoico. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, opcionalmente a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar. El derivado de xantina puede ser cafeína, opcionalmente a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 4 milimolar. El ácido alcanoico puede ser una sal de ácido butírico, opcionalmente a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a alrededor de 2 milimolar. Las células de mamífero pueden ser cultivadas a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. Las células de mamífero pueden cultivarse en una fase de crecimiento a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C, antes de que sean desplazadas a una fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 36°C, en donde la segunda temperatura puede ser más baja que la primera temperatura. La xantina puede añadirse en el momento del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura y/o antes y/o después del desplazamiento. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido recombinante que comprende cultivar en cultivo una línea de células de mamífero, opcionalmente una línea de células CHO que haya sido genéticamente manipulada para producir el polipéptido recombinante, y añadir al medio de cultivo por lo menos un derivado de xantina seleccionado del grupo que consiste en teobromina y cafeína. La adición del derivado de xantina puede incrementar la producción del polipéptido recombinante. La línea de células de mamífero puede haber sido transformada con un vector recombinante que codifique para el polipéptido recombinante. Opcionalmente, el vector puede comprender un promotor de citomegalovirus (CMV) . Típicamente, la línea de células no expresa naturalmente al polipéptido recombinante o sólo expresa naturalmente al polipéptido recombinante a niveles muy bajos (en ausencia de manipulación genética) . El polipéptido recombinante puede ser un polipéptido de fusión recombinante o un anticuerpo humano o humanizado. La línea de células puede cultivarse en una fase - de crecimiento, la cual sea distinta de una fase de producción o inducción. La fase de producción puede ocurrir a una temperatura de menos de 37°C. La línea de células puede ser cultivada a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. Opcionalmente , al menos dos derivados de xantina diferentes pueden añadirse. Los derivados de xantina se pueden añadir varias veces durante el cultivo de la línea de células. La concentración de cada derivado de xantina añadido al cultivo puede ser de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolar. El polipéptido recombinante puede ser recogido del medio y formulado. La línea de células de mamífero se puede cultivar a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sea desplazada a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, y el derivado de xantina se puede añadir en el momento del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura y/o antes y/o después del desplazamiento. La segunda temperatura puede ser más baja que la primera temperatura. En otro aspecto, la invención proporciona un cultivo que comprende una célula CHO manipulada genéticamente para producir un polipéptido, un medio de producción y por lo menos un derivado de xantina seleccionado del grupo que consiste en cafeína, 3-isobutil-l-metilxantina, teofilina, teobromina, pentoxifilina y aminofilina o de un subconjunto de este grupo. El cultivo puede comprender al menos dos derivados de xantina. La concentración de cada derivado de xantina presente puede ser de aproximadamente 0.01 milimolar a alrededor de 3 milimolar o de aproximadamente 0.001 milimolar a alrededor de 3 milimolar. El cultivo puede comprender medio libre de suero, y puede comprender ninguna proteína añadida o puede comprender insulina o IGF-1. Además, el cultivo puede comprender dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo o dimetilacetamida . La invención, debido a su bajo costo y conveniencia, es particularmente útil para el cultivo a gran escala de CHO. El cultivo puede ser un cultivo a gran escala de al menos 100 litros, o incluso de al menos 500 litros de tamaño. El cultivo puede comprender una línea de células CHO homogéneas. En otro aspecto más, la invención abarca un cultivo que comprende una célula CHO manipulada genéticamente para producir un polipéptido, un medio de producción y por lo menos un derivado de xantina, en donde el cultivo se lleva a cabo a menos de 37°C durante al menos parte de su vida. El derivado o derivados de xantina presentes pueden estar dentro de la escala de concentración de aproximadamente 0.001 milimolar a alrededor de 3 milimolar o de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 3 milimolar, y el cultivo puede contener al menos dos derivados de xantina diferentes. Los derivados de xantina se pueden seleccionar del grupo que consiste en cafeína, 3-isobutil-l-metilxantina, teofilina, teobromina , pentoxifilina y aminofilina o de un subcojunto de este grupo tal como cafeína, teobromina y pentoxifilina . El tamaño de cultivo puede ser de al menos 100 litros, y el medio de producción puede ser medio libre de suero y puede comprender ya sea ninguna proteína añadida o insulina o IGF-1. El cultivo puede comprender una línea de células CHO homogéneas . En un aspecto más la invención incluye un método para producir un polipéptido en un cultivo de células de mamífero que comprende incubar el cultivo a una temperatura de aproximadamente 37°C y posteriormente incubar el cultivo a una temperatura de aproximadamente 29°C a 36°C, y añadir al cultivo un derivado de xantina durante la incubación a una temperatura de aproximadamente 29°C a 36°C, en donde el polipéptido es un polipéptido recombinante o un anticuerpo. El derivado de xantina se puede seleccionar del grupo que consiste en cafeína, 3-isobutil-l-metilxantina, teofilina, teobromina, pentoxifilina y aminofilina o de un subconjunto de este grupo tal como cafeína, teobromina y pentoxifilina . Las células de mamífero pueden ser células de hibridoma o células CHO. El derivado o derivados de xantina presentes pueden - estar dentro de la escala de concentración de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolar o de aproximadamente 0.001 molar a alrededor de 3 milimolar, y el cultivo puede contener al menos dos diferentes derivados de xantina. Los derivados de xantina se pueden añadir varias veces durante el cultivo de la línea de células. La invención proporciona un método para producir un polipéptido recombinante que comprende cultivar una línea de células de mamífero, en algunas modalidades una línea de células CHO, a una temperatura de alrededor de 29°C a aproximadamente 36°C, opcionalmente a temperaturas de entre aproximadamente 29°C y 35°C o de alrededor de 30°C a aproximadamente 33 °C, en un medio que comprende un compuesto polar híbrido. El medio puede estar libre de suero. La adición del compuesto polar híbrido puede incrementar la producción del polipéptido recombinante. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 20 milimolar o de alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar. Más aún, el medio puede comprender un ácido alcanoico, tal como una sal de ácido butírico, a una concentración, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 milimolar a alrededor de 10 milimolar, opcionalmente alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. Además, el medio puede comprender un derivado de xantina, por ejemplo, cafeína, a una concentración de aproximadamente 0.005 milimolar a 10 milimolar, opcionalmente a alrededor de 0.01 milimolar a 4 milimolar o de aproximadamente 0.01 milimolar a 4 milimolar. Las células de mamífero pueden cultivarse a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sean desplazadas a una segunda temperatura de entre alrededor de 29°C y 36°C, y el compuesto polar híbrido se puede añadir después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. Las células de mamífero pueden ser manipuladas genéticamente para producir un polipéptido, opcionalmente un polipéptido secretado que pueda ser recuperado del medio, incluyendo RA K:Fc, receptor de interleucina-1 tipo II, TNFR : Fe , ligando CE40, TRAIL, ligando flt3, receptor de IL-4, G-CSF, eritropoyetina, un anticuerpo o un polipéptido sustancialmente similar, entre otros. En otra modalidad, la invención proporciona un método mejorado para producir un polipéptido al cultivar células de mamífero, que comprende cultivar las células en un medio que comprende un compuesto polar híbrido, opcionalmente a temperaturas de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, entre alrededor de 29°C y 35°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33 °C. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, opcionalmente a una concentración de entre alrededor de 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolar. La adición del compuesto polar híbrido puede incrementar la' producción- del polipéptido, el cual puede ser un polipéptido recombinante . Además, el medio puede comprender un ácido alcanoico, por ejemplo, ácido butírico, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.05 milimolar a aproximadamente 10 milimolar, o alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. Más aún, el medio puede comprender una xantina, tal como, por ejemplo, cafeína, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.005 milimolar a 10 milimolar o de aproximadamente 0.01 milimolar a 5 milimolar. Opcionalmente, el polipéptido puede ser RA K : Fe , receptor de interleucina-1 tipo II, TNFR : Fe , ligando CD40, TRAIL, ligando flt3, receptor de IL-4, GM-CSF, eritropoyetina, un anticuerpo, o un poliéptido sustancialmente similar entre otros. En otro aspecto, la invención proporciona un método para obtener un polipéptido, opcionalmente un polipéptido recombinante, que comprende recuperar el polipéptido de medio en el cual células de mamífero hayan sido cultivadas, en donde las células de mamífero pueden secretar el polipéptido y se cultivan a temperaturas de entre aproximadamente 29°C y 35°C, opcionalmente alrededor de 30 °C a aproximadamente 33 °C, en medio que comprende bisacetamida de hexametileno . La bisacetamida de hexametileno puede estar presente a una concentración de entre alrededor de 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolar. Más aún, el medio puede comprender un ácido alcanoico, por ejemplo ácido butírico, opcionalmente a una concentración de aproximadamente 0.05 milimolar a alrededor de 10 milimolar o de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. Además, el medio puede comprender una xantina, por ejemplo, cafeína, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.005 milimolar a 10 milimolar o alrededor de aproximadamente 0.01 milimolar a 5 milimolar. El polipéptido puede ser un RANK: Fe , receptor de interleucina-1 tipo II, TNFR : Fe , ligando CD40, TRAIL, ligando flt3, receptor de IL-4, G-CSF, eritropoyetina , un anticuerpo, o un polipéptido sustancialmente similar, entre otros. En una modalidad más, la invención comprende un método para producir un polipéptido recombinante que comprende cultivar células de mamífero en un medio que comprende un compuesto polar híbrido y una xantina, en donde las células de mamífero han sido genéticamente manipuladas para expresar el polipéptido recombinante. El medio puede comprender además un ácido alcanoico, tal como, por e emplo, una sal de ácido butírico, la cual puede estar a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a alrededor de 2 milimolar. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, la cual puede estar a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a alrededor de 5 milimolar, y/o la xantina puede ser cafeína, la cual puede estar a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 4 milimolar.. Las células se pueden cultivar a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. Las células de mamífero se pueden cultivar a una primera temperatura de alrededor de 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sean desplazadas a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, y el compuesto polar híbrido y la xantina se pueden añadir en el momento del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura y/o antes y/o después del desplazamiento. El medio puede estar libre de suero. En una modalidad más, la invención abarca un método para producir un polipéptido, opcionalmente un polipéptido recombinante , que comprende cultivar células de mamífero en un medio que comprende un compuesto polar híbrido y un ácido al'canoico, en donde las células de mamífero pueden haber sido genéticamente manipuladas para expresar el polipéptido recombinante. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, y el compuesto polar híbrido puede estar presente a una concentración de aproximadamente 0.5 milimolar a alrededor de 10 milimolar o a una concentración de entre aproximadamente 0.5 milimolar y 2.5 milimolar. El ácido alcanoico puede ser una sal de ácido butírico, y el ácido alcanoico puede estar presente a una concentración de alrededor de" 0.1 mil-imolar a aproximadamente 5 milimolar o a una concentración de entre aproximadamente 0.1 milimolar y a alrededor de 2.0 milimolar. Las células de mamífero pueden cultivarse a una temperatura de . entre aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, y el medio puede estar libre de suero. La línea de células de mamífero puede cultivarse a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sea desplazada a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36 °C, y el compuesto polar híbrido y el ácido alcanoico se pueden añadir después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. El medio puede comprender además un derivado de xantina a una concentración de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar. La línea de células de mamífero puede ser una línea de células de hibridoma o una línea de células CHO. En otra modalidad más, la invención proporciona un método para producir un polipéptido que comprende cultivar una línea de células de mamífero en una fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 30°C a 34°C en un medio que comprende un compuesto polar híbrido, en donde la fase de producción sigue una fase de crecimiento a una primera temperatura de alrededor de 35°C a aproximadamente 38°C. El polipéptido puede ser un polipéptido recombinante o un anticuerpo. El compuesto polar híbrido puede ser bisacetamida de hexametileno, -opcionalmente · a una concentración de alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar. El compuesto polar híbrido puede añadirse después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura . El medio puede comprender además un ácido alcanoico, el cual puede ser una sal de ácido butírico, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.05 milimolar a aproximadamente 10.0 milimolar. El medio puede comprender también un derivado de xantina, opcionalmente a una concentración de alrededor de 0.001 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar. El medio puede estar libre de suero. La línea de células de mamífero puede ser una línea de células de hibridoma o una línea de células CHO. La invención proporciona también un método para producir un polipéptido que comprende cultivar una línea de células de mamífero en un medio que comprende un compuesto polar híbrido a una concentración de entre alrededor de 0.5 milimolar y 2.5 milimolar, un ácido alcanoico a una concentración de alrededor de 0.1 milimolar y 2.0 milimolar y un derivado de xantina a una concentración de aproximadamente 0.001 milimolar a alrededor de 4 milimolar. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un polipéptido, opcionalmente RANK: Fe, receptor de interleucina-1 tipo II, TNFR : Fe , ligando CD40, TRAIL, ligando flt3, receptor de IL-4, G-CSF, eritropoyetina, un anticuerpo, un polipéptido sustancialmente similar, que comprende cultivar células de mamífero, las cuales pueden haber sido genéticamente manipuladas para producir cualquiera de estos polipéptidos , en un medio que comprende alrededor de 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolar de HMBA, de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar de ácido butírico y alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 4 milimolar de cafeína a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33 °C. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra el porcentaje de las células totales que son viables bajo las condiciones indicadas a 31°C para la línea de células CHO #9 como una función de días en cultivo . La figura 2 muestra los microgramas de proteína por mililitro de cultivo de células, es decir, concentración de proteínas, bajo las condiciones indicadas a 31°C para la línea de células CHO #9 como una función de días en cultivo. La figura 3 muestra los microgramas de proteínas por 106 células al día bajo las condiciones indicadas a 31°C para la línea de células CHO #9 como una función de días en cultivo. La figura 4 -muestra una gráfica que despliega la concentración de un anticuerpo contra receptor IL-4 de murino recuperado de medio como una función de días de crecimiento de una línea de células CHO que comprende un vector que codifica para el anticuerpo a las temperaturas indicadas en presencia o ausencia de HMBA o butirato de sodio. Las marcaciones son como sigue: — —, sin inductor a 37°C; —¦—, sin inductor a 34—°C; 0.5 milimolar de butirato de sodio a 34°C; ¦ , 2.0 milimolar de HMBA a 34°C; —·—, sin inductor a 31°C; · , 0.5 milimolar de butirato de sodio a 31°C; y · , 2.0 milimolar de HMBA a 31°C. Descripción detallada de la invención Un "anticuerpo" es un polipéptido o complejo de polipéptidos , cada uno de los cuales comprende al menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable y por lo menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos diméricos o cierto complejo de orden más alto de polipéptidos que incluye, pero no está limitado a, anticuerpos heterodiméricos . Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo codificado por ácidos nucleicos que finalmente son de origen humano. Este anticuerpo puede ser expresado en una célula u organismo no humano. Por ejemplo, ADN que codifique para un anticuerpo humano puede introducirse en células de cultivo de tejidos y expresarse en líneas de células transformadas. Como alternativa, los anticuerpos humanos pueden expresarse en animales transgénicos tales como, por ejemplo, los ratones transgénicos descritos en Méndez et al. ((1997), Nature Genetics 16(4): 146-56). Estos ratones transgénicos se utilizan para fabricar los anticuerpos completamente humanos en la patente de E.U.A. No. 6,235,883 Bl . Los anticuerpos humanos pueden expresarse también en células de hibridoma. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimérico que comprende regiones de determinación de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de una fuente no humana y otras regiones que se conforman a las secuencias en anticuerpos humanos (y pueden ser de origen humano) como se explica en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,558,864 y 5,693,761 y la solicitud de patente internacional WO 92/11018. Un "dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante" es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o sustancialmente similar a un dominio CL, CHI, CH2 , CH3 o CH4 de origen animal o humano. Véase, por ejemplo, Hasemann y Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, in William E. Paul, ed. , Fundamental Immunology, segunda edición, 209, 210-218 (1989); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept . of Health and Human Services (1991) . Una "porción Fe de un anticuerpo" incluye dominios de inmunoglobulina humanos o animales CH2 y CH3 o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a éstos. Para una descripción, véase Hasemann y Capra, citado anteriormente, en 212-213 y Kabat et al., citado anteriormente. Las células han sido "genéticamente manipuladas" para expresar un polipeptido específico cuando secuencias de ácido nucleico recombinantes que permiten la expresión del polipéptido han sido introducidas en las células usando métodos de "ingeniería genética" , tales como infección viral con un virus recombinante , transfección, transformación o electroporación. Véase, por ejemplo, Kaufman et al. (1990), Meth Enzymol . 185: 487-511; Current Protcols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . (Wiley & Sons, Nueva York, 1988, y actualizaciones trimestrales). La infección con un virus que ocurre naturalmente y no alterado, tal como, por ejemplo, virus de hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, etc., no constituye manipulación genética como se intenta en la presente. El término "ingeniería genética" se refiere a un método de ADN o ARN recombinante usado para crear una' célula huésped que expresa un gen a niveles elevados o a niveles reducidos, o que expresa una forma mutante del gen. En otras palabras, la célula ha sido transfectada, transformada o transducida con una molécula de polinucleótido recombinante, y de esta manera alterada para causar así que la célula altere la expresión de un polipéptido deseado. Para los propósitos de la invención, los anticuerpos producidos por una línea de células de hibridoma que resulta de una fusión - de células no son "polipéptidos recombinantes" . Además, los polipéptidos virales producidos por una célula como resultado de una infección viral tampoco son "polipéptidos recombinantes" como se intenta decir en la presente, a menos que el ácido nucleico viral haya sido alterado mediante ingeniería genética antes de infectar la célula. Los métodos de "ingeniería genética" también abarcan numerosos métodos que incluyen, pero no están limitados a, amplificación de ácidos nucleicos usando reacción en cadena de polimerasa, ensamble de moléculas de ADN recombinantes al clonarlas en Escherichia coli, digestión con enzimas de restricción de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos y transferencia de bases a los extremos de ácidos nucleicos, entre numerosos otros métodos que se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2" ed. Vol, 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Los métodos y vectores para manipular genéticamente células y/o líneas de células para expresar un polipéptido de interés se conocen bien por los expertos en la técnica. Las técnicas de ingeniería genética incluyen pero no están limitadas a vectores de expresión, activación y recombinación homologa dirigida y activación génica (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,272,071 a Chappel) y transactivación por factores de transcripción manipulados (véase, por ejemplo, Segal et al., 1999, Proc. Nati'. Acad. -Sci . USA 96 (6):2758-63) . Opcionalmente, los polipéptidos son expresados bajo el control de un elemento de control heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor que en la naturaleza no dirige la producción de ese polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo CMV, ASV40) que dirija la expresión de un polipéptido de mamífero. La célula huésped puede o no producir normalmente el polipéptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que haya sido manipulada genéticamente para producir un polipéptido humano, significando que el ácido nucleico que codifique para el polipéptido humano haya sido introducido en las células CHO. Como alternativa, la célula huésped puede ser una célula humana que haya sido genéticamente manipulada para producir niveles incrementados de un polipéptido humano normalmente presente sólo a niveles muy bajos (por ejemplo, al reemplazar el promotor endógeno con un promotor viral fuerte) . "Fase de crecimiento" significa un periodo durante el cual las células cultivadas rápidamente se dividen y se incrementan en número. Durante la fase de crecimiento, las células se cultivan generalmente en un medio y bajo condiciones diseñadas para maximizar la proliferación celular.

Un "compuesto polar híbrido" es un compuesto que tiene dos grupos polares separados por una cadena de carbono apolar. Esto incluye bisacetamida de hexametileno (HMBA) y las demás moléculas descritas abajo y en las siguientes referencias: Richon et al. (1998), Proc . Nati. Acad. Sci. 95: 3003-07; Marks et al. (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. 91: 10251-54; y patentes de E.U.A. Nos. 5,055,608 y 6,087,367. La producción de un polipéptido es "incrementada" por la adición de un agente inductor, tal como bisacetamida de hexametileno (HMBA) o cafeína, si la cantidad de polipéptido producida en un cultivo que contenga el agente de inducción es mayor que la cantidad que el polipéptido producido en un cultivo de otra manera idéntico que no contenga el agente inductor. Similarmente, la producción de un polipéptido es "incrementada" mediante el crecimiento a una temperatura que no sea a 37°C y la cantidad de polipéptido producida en un cultivo incubado a una temperatura que no sea 37 °C es mayor que la cantidad del polipéptido producido en un cultivo de otra manera idéntico producido en un cultivo de otra manera idéntico incubado a 37°C. Un "dominio de multimerización" es un dominio de una molécula de polipéptido que confiere en éste una propensión a asociarse con otras moléculas de polipéptido a través de interacciones covalentes o no covalentes.

Un "polipéptido que ocurre naturalmente" es un polipéptido que ocurren en' la naturaleza, es decir, un polipéptido que puede ser producido por células que no hayan sido genéticamente manipuladas. Este polipéptido también 5 puede ser producido por células genéticamente manipuladas para producirlo. . "Polipéptido" significa una cadena de por lo menos 6 aminoácidos enlazados por enlaces péptidos. Opcionalmente , un polipéptido puede comprender al menos 10, 20, 30, 40, 50, "10 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ó 300 aminoácidos enlazados por enlaces péptidos. · "Medio de producción" significa un medio de cultivo de células diseñado para usarse para cultivar células durante una fase de producción. "15 "Fase de producción" significa un periodo durante el cual células producen cantidades máximas de polipéptido recombinante . Una fase de producción se caracteriza por menos división celular que durante una fase de crecimiento y por el uso de medio y condiciones de cultivo diseñados para 20 maximizar la producción del polipéptido. Un "polipéptido de fusión recombinante" es una fusión de todo o parte de por lo menos dos polipéptidos , la cual se hace usando los métodos de ingeniería genética. Un "polipéptido recombinante" es un polipéptido que 25 resulta del proceso de la manipulación genética. Para los propósitos de la invención, los anticuerpos producidos por una línea de células de hibridoma que resultan de · una fusión de células no son "polipéptidos recombinantes" . Además, las proteínas virales producidas por una célula como resultado de infección viral con un virus que ocurre naturalmente tampoco son "polipéptidos recombinantes" según se intenta decir en la presente, a menos que el ácido nucleico viral haya sido alterado por ingeniería genética antes de infectar la célula. Los polipéptidos "sustancialmente similares" . son al menos 80%, opcionalmente al menos 90%, idénticos entre sí en secuencia de aminoácidos y conservan o alteran de una manera deseable la actividad biológica del polipéptido no alterado. Las sustituciones de aminoácidos conservativas, a diferencia de afectar la actividad biológica, incluyen, sin limitación, las siguientes: Ala por Ser, Val por lie, Asp por Glu, Thr por Ser, Ala por Gly, Ala por Thr, Ser por Asn, Ala por Val, Ser por Gly, Tyr por Phe, Ala por Pro, Lys por Arg, Asp por Asn, Leu por lie, Leu por Val, Ala por Glu, Asp por Gly, y estos cambios en la forma inversa. Véase, por ejemplo, Neurath et al., The Proteins, Academic Press, Nueva York (1979) . Además los cambios de aminoácidos entre miembros de los siguientes seis grupos de aminoácidos se considerarán como sustituciones conservativas para los propósitos de la invención. Los grupos son: 1) metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cisteína, serina, treonina, asparagina y glutamina; 3) aspartato y glutamato; 4) histidina, lisina y arginina; 5) glicina y prolina y 6) triptófano, tirosina y fenilalanina . La identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante inspección visual y cálculo matemático, o más preferiblemente, la comparación se hace al comparar la información de secuencias usando un programa de computadora tal como el programa Genetics Computer Group (GCG; adison, WI) Wisconsin package versión 10.0 programa 'GAP' (Devereux et al. (1984), Nucí. Acids. Res. 12:387) ' u otros programas de computadora comparables. Los parámetros de omisión que se prefieren para el programa 'GAP' incluyen: (1) la matriz de comparación de aminoácidos ponderada de Gribskov y Burgess (1986), Nucí. Acids Res. 14:6745, como la descrita por Schwartz y Dayhoff, eds . , Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs . 353-358 (1979), u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalidad de 30 por cada espacio y una penalidad adicional de 1 por cada símbolo en cada espacio para secuencias de aminoácidos; (3) ninguna penalidad para espacios finales y (4) ninguna penalidad máxima para espacios largos. Otros programas usados por los expertos en la técnica de la comparación de secuencias también pueden usarse . Una "fase de transición" significa un periodo de cultivo celular entre una "fase de crecimiento" y una "fase de producción" . Durante la fase de transición, el medio y las condiciones ambientales- se desplazan típicamente de aquellas diseñadas para maximizar la proliferación de aquellas diseñadas para maximizar la producción de polipéptidos . Un "dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable" es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o ' sustancialmente similar a un dominio VL o VH de origen humano o animal . La presente invención está dirigida a métodos mejorados para cultivar células de mamífero, las cuales pueden haber sido genéticamente manipuladas para producir un polipéptido particular. En particular, la invención está dirigida a métodos de cultivo que maximizan la producción de polipéptidos específicos. También está dirigida a métodos para producir y obtener estos polipéptidos de células de mamífero cultivadas. Los polipéptidos son útiles en una gran variedad de aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas, agrícolas, nutricionales y de investigación. Como se muestra por los datos experimentales reportados en la presente, se ha descubierto que derivados de xantina y compuestos polares híbridos usados por separado o juntos ' pueden inducir dramáticamente la producción de polipéptidos recombinantes a partir de líneas de células CHO. En particular, la adición del derivado de xantina cafeína a la fase de producción de un cultivo de células incrementa la producción de polipéptidos recombinantes-. El compuesto polar híbrido bisacetamida de hexametileno también ha mostrado ser un inductor efectivo de la producción de polipéptidos recombinantes. Además, otros inductores, tales como, por ejemplo, ácidos alcanoicos, también se pueden añadir ya sea a un derivado de xantina, un compuesto polar híbrido o ambos. También se pueden usar otros métodos, tales como, por ejemplo, el cultivo de células a temperaturas de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, entre alrededor de 29°C y 35°C y/o alrededor de 30°C a aproximadamente 33°C. De esta manera, la invención se refiere a inducir la producción incrementada de un polipéptido recombinante a partir de una célula cultivada en cultivo al exponer la célula a inductores ' químicos , incluyendo compuestos polares híbridos y/o derivados de xantina. Los métodos de la invención incluyen cultivar células de mamífero en medio que comprenda un compuesto polar híbrido, por ejemplo, bisacetamida de hexametileno (HMBA) , opcionalmente a temperaturas de entre alrededor de 29°C y 35°C o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. Otras modalidades de la invención abarcan condiciones de cultivo en las cuales un ácido alcanoico y/o una xantina, además del compuesto polar híbrido, se añaden al medio de cultivo. En una modalidad, se usan una xantina y un compuesto polar híbrido y temperaturas de cultivo de entre aproximadamente 29°C y 36°G. Otra modalidad comprende la -adición de un ácido alcanoico y un compuesto polar híbrido más temperaturas de cultivo de entre aproximadamente 29°C y 36°C. Otra modalidad más comprende la adición de una xantina, un ácido alcanoico y un compuesto polar híbrido más temperaturas de cultivo de entre alrededor de 29°C y 36°C. Opcionalmente , el cultivo de células usando los métodos de la invención puede tener lugar durante una fase de producción, como la que se distingue de una fase de crecimiento. Una fase de crecimiento se puede distinguir de una fase de producción mediante, por ejemplo, un desplazamiento de temperaturas y/o un cambio en el medio tal como, por ejemplo, la adición de uno o más inductores. En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende cultivar en cultivo una célula de mamífero que ya haya sido genéticamente manipulada para producir un polipéptido; y añadir al cultivo un derivado de xantina. Una célula genéticamente manipulada puede ser una célula que haya sido transformada con un vector recombinante que codifique para el polipéptido. Además, el polipéptido puede ser expresado bajo el control de un promotor heterologo tal como, por ejemplo, un promotor de CMV. Típicamente, la célula no expresa naturalmente el polipéptido o sólo expresa naturalmente el polipéptido a niveles muy bajos (en ausencia de ingeniería genética) . En otro aspecto, la invención proporciona un cultivo que contiene una célula genéticamente manipulada para producir un polipéptido, un ¦ medio de producción y el derivado de xantina. Además, los métodos y composiciones de la invención se pueden usar en combinación uno con otro con cualquier otro método conocido o que se vaya a descubrir para inducir la producción de polipéptidos recombinantes . Estas técnicas incluyen desplazamiento de temperaturas frías, adiciones de ácido alcanoico (como se describe en la patente de E.U.Á. No. 5,705,364 a Etcheverry et al., incorporada en la presente a manera de referencia) , D F y DMSO, por citar sólo unos pocos ejemplos, así como cualquier técnica de inducción que se vaya a describir y/o descubrir. Según se usa en la presente, "inducir" la producción de polipéptidos o "inducción" se refiere a cultivar células bajo un conjunto de condiciones diseñadas para maximizar la cantidad total de un polipéptido deseado hecho por las células. Un "inductor" es un agente que, cuando se añade a medio de cultivo, puede incrementar la producción de un polipéptido deseado y por lo menos algunas líneas de células. Combinar la adición de derivados de xantina con otras técnicas de inducción de proteínas puede tener un efecto sinergístico en la inducción de polipéptidos, permitiendo adiciones más bajas de derivados de xantina y/o adiciones más bajas de otros agentes inductores y/o desplazamientos de temperatura más conservativos. Los otros métodos de inducción pueden tener, lugar alrededor del mismo tiempo que la adición de la xantina, y/o- antes y/o después de la adición de la xantina. Por ejemplo, se puede desplazar la temperatura de cultivo en el día cero, y después añadir un derivado de xantina y/o un compuesto polar híbrido, y opcionalmente otros inductores químicos, más adelante, por ejemplo, una a varias horas o días más adelante. Este protocolo permite cierto crecimiento adicional de un cultivo sembrado antes de la inducción completa. ¦ Más aún, varias adiciones de derivado de xantina y/o compuestos polares híbridos se pueden añadir al cultivo durante la fase de producción, separados por aproximadamente 12, 24, 48 y/o 72 horas o más, con o sin adiciones de otros agentes inductores o cambios en las condiciones de cultivo. Por ejemplo, un inductor se puede añadir en el día cero y nuevamente en el día 4. Como alternativa, un inductor se puede añadir por primera vez uno, dos, tres o cuatro días después de un desplazamiento de temperaturas. En un aspecto, la invención incluye llevar a cabo un desplazamiento a baja temperatura (desplazar la temperatura del medio de la temperatura de crecimiento óptima, normalmente alrededor de 37°C a una temperatura más baja, normalmente de alrededor de 29°C a aproximadamente 36°C y opcionalmente alrededor 30°C a aproximadamente 34°C en el momento de, antes y/o después de añadir el derivado de xantina o el compuesto polar híbrido. Como alternativa, o además, un ácido alcanoico o sal del mismo (por ejemplo, butirato de sodio) se puede añadir al cultivo alrededor del mismo tiempo que se añada el derivado de xantina y/p el compuesto polar híbrido. El ácido alcanoico se puede añadir a concentraciones usadas típicamente para inducción, o incluso a concentraciones más bajas que las que se usarían típicamente. De esa manera, al manipular tanto controles transcripcionales como post-transcripcionales , se pueden lograr niveles más altos de productividad. Existen diferencias individuales entre líneas de células en la efectividad de varios inductores. Por ejemplo, aunque el butirato de sodio es un inductor ampliamente usado, podría no tener efecto alguno o tener efectos adversos en la producción de polipéptidos en algunas líneas de células. Véase tabla 5. Diferentes inductores o diferentes concentraciones de los mismos inductores pueden ser adecuadas para diferentes líneas de células. Además, diferentes temperaturas pueden ser adecuadas para diferentes líneas de células. A pesar de esta variabilidad, algunos inductores tales como, por ejemplo, cafeína, bisacetamida de hexametileno y butirato de sodio, pueden ser útiles en una amplia variedad, aunque tal vez no toda, de líneas de células. Generalmente, los derivados de xantina tienen la siguiente estructura. en donde X, Y y Z pueden seleccionarse independientemente de un radical alquilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 12 carbonos, un radical alquinilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 12 carbonos (incluyendo un radical propinilo) , un radical acilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 12 carbonos, un radical de cadena recta o ramificada con la estructura -R-acilo que contenga de 1 a 12 carbonos en donde R sea un grupo alifático saturado o insaturado, un radical alenilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 12 carbonos, un radical hidroxialquilo de cadena recta o ramificada que tenga de ' 1 a 12 carbonos, un radical hidroxialenilo de cadena recta o ramificada que tenga de 1 a 12 carbonos, un radical de cadena recta o ramificada con la estructura -alenilo-halógeno que tenga de 1 a 12 carbonos, un radical ciclohexilo e hidrógeno. En algunas modalidades, por lo menos uno de X, Y y Z es un grupo metilo. En algunas modalidades, cada uno de X y Y representa independientemente un átomo de hidrógeno, un radical alquilo lineal o ramificado que tiene hasta 5 átomos de carbono, un radical alilo, un radical propinilo o un radical ciclohexilo; con la condición de X y Y no representen simultáneamente un átomo de hidrógeno, y Z represente un" radical hidrógeno, metilo, etilo, hidroximetilo, hidroxietilo o heterociclo. Estas xantinas se pueden obtener usando procedimientos convencionales y/o comprarse. Un número de derivados de xantina diferentes que se pueden usar se describen en Beavo et al. (1970),Molec Pharm. 6:597-603 y se incorpora a manera de referencia en la presente. Ejemplos ilustrativos de derivados de xantina que se pueden usar en los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, cafeína (1,3,7-trimetilxantina) , teofilina ( 1 , 3-dimetilxantina) , teobromina (3 , 7-dimetilxantina) , 3-isobutil-l-metilxantina, 3-butil-l-metilxantina, 1, 3, 7-trietilxantina, 3-ciclohexil-l-etilxantina, 3-etil-1-propinilxantina, 3-etil-l-pentilxantina, pentoxifilina y aminofilina. Aminofilina es el compuesto teofilina con 1, 2 -etilendiamina (2:1) dihidratada. Generalmente, el derivado de xantina se añade a una concentración en el cultivo de aproximadamente 0.0005 a aproximadamente 25 milimolar, opcionalmente alrededor de 0.001 a aproximadamente 10 milimolar, de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 5 milimolar o de alrededor de 0.01 a a aproximadamente 3 milimolar. La concentración óptima del derivado de xantina variará típicamente dependiendo de su actividad y. de la línea de células, y se puede determinar por aquellos expertos en la técnica usando la guía provista en la presente .

El derivado de xantina se puede disolver en cualquier solvente adecuado: Por ejemplo, 3-isobutil-l-metilxantina (IBX) puede disolverse en agua, pero tiene que ser calentada hasta casi el punto de ebullición. Como alternativa, la IBX se puede disolver en los solventes DMSO (sulfóxido de dimetilo) , DMF (dimetilformamida) o DMA (dimetilacetamida) . La IBX también se puede disolver fácilmente como una solución de abastecimiento 100 milimolar en NaOH 0.5 M. Las diluciones de esta solución de abastecimiento se pueden añadir al medio de inducción mientras éste se esté preparando (pre-estériles) y los efectos del NaOH deben ser inconsecuentes toda vez que tiene que añadirse comúnmente una base para elevar el pH del medio a 7.0. Muchos de los derivados de xantina para usarse en la invención son inhibidores de cAMP fosfod esterasa . De esta manera, además de usar derivados de xantina que son inhibidores de cAMP fosfodiesterasa, se cree que los inhibidores de cAMP fosfodiesterasa que no son derivados de xantina también se pueden usar para inducir la producción de polipéptidos en métodos alternativos de la invención. Ejemplos de estos inductores incluyen pero no están limitados a imidazopirimidina, pirazol o piridina, etazolato, pirazoloquinolina y triazoloquinazolina (Pflugers Archiv 407:S31, 1986). Otros ejemplos de inhibidores de cAMP fosfodiesterasa se pueden encontrar en la patente de E.U.A, No. RE37,234, la cual se incorpora en- la- presente a manera de referencia . Los compuestos polares híbridos, el uso de los cuales es abarcado por la invención, pueden tener dos grupos polares separados por una cadena de carbono no polar, tales como aquellos descritos en Richon et al. (1998), Proc. Nati. Acad. Sci. 95:3003-07, Marks et al. (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. 91: 10251-54, patentes de E.U.A. Nos. 5,055,608 y 6,087,367. Los compuestos polares híbridos de la invención pueden tener la propiedad de inducir uno o más cambios característicos de un estado terminalmente diferenciado de las células huésped. Estos compuestos incluyen aquellos con la estructura: en donde Ri y R2 pueden ser los mismos o diferentes entre sí. i y 2 pueden ser cada uno un grupo carbonilo al cual un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un radical alquilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, alquinilo, alenilo, alilo, alquiloxi, ariloxi y arilalquiloxi sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, el cual contenga 12 o menos átomos de carbono, o grupo piridina, también se le puede unir. La "n" puede ser un entero de aproximadamente cuatro a aproximadamente ocho. Específicamente, la HMBA se incluye dentro de esta clase ~ de compuestos polares híbridos, y su estructura es: La presente invención abarca además el uso de compuestos polares híbridos con la siguiente estructura: en donde R3 y R4 pueden ser los mismos o diferentes entre sí. Cuando R3 y R son los mismos, cada uno es un radical arilamino, cicloalquilamino, piridinamino, piperidino, 9-purina-6-amina o tiozolamino sustituido o no sustituido que tiene 12 o menos átomos de carbono. Cuando R3 y R4 son diferentes, R3 es igual a R5—N—R6, en donde R5 y R6 son los mismos o diferentes uno del otro y son un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo. alquilo, alquenilo, ciclocloalquilo, arilo, alquinilo, alenilo, alilo, alquiloxi, ariloxi, ari lalquiloxi o piridina sustituido o no sustituido, ramificado o no ramificado, el cual contiene 12 o menos átomos de carbono, o R5 y R6 se unen juntos para formar un grupo piperidina y R4 es un grupo hidroxilamino, hidroxilo, amino, alquilamino, dialquilamino o alquiloxi, el cual contiene 12 o menos átomos" de carbono. · La "n" es un entero de aproximadamente cuatro a aproximadamente ocho. La invención abarca además el uso de todos los compuestos descritos en la patente de E.U.A. No. 6,087,367, patente de E.U.A. No. 5,055,608, Richon et al., citado anteriormente, y Marks et al., citado anteriormente. En algunos de éstos, la cadena de carbono apolar puede ser más corta que 4 carbonos y más larga de 8 carbonos, y se puede interrumpir por grupos aromáticos, grupos apolares y/o grupos polares . Si se usa HMBA, se puede añadir a concentraciones de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 20 milimolar, opcionalmente entre alrededor' de 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolar. Otros compuestos polares híbridos pueden ser activos a concentraciones más bajas o más altas. La concentración óptima para un compuesto polar híbrido particular variará dependiendo de su actividad y de la línea de células en la cual se use, y se puede determinar por un experto en la técnica usando métodos de rutina y la guía provista en la presente. Por ejemplo, compuestos tales como ácido suberoilanilida hidroxámico o bishidroxamida de ácido m-carboxicinámico se pueden usar a concentraciones aproximadamente mil veces más bajas que aquellas requeridas para HMBA, de alrededor de 0.01 micromolar a aproximadamente 10 micromolar . Véase Richon et al., citado anteriormente. Las concentraciones de compuestos polares - híbridos requeridas para inducir la diferenciación celular como las descritas en Marks et al. (citado anteriormente) y Richon et al. (citado anteriormente) se pueden usar como una guía para determinar la concentración de un compuesto polar híbrido requerida para incrementar la producción de polipéptidos . La determinación de la concentración necesaria para un compuesto polar híbrido específico usado en una línea de células específica se puede usar usando métodos de rutina como los descritos en la presente y la guía provista en Richon et al. (citado anteriormente) y Marks et al. (citado anteriormente). Los ácidos alcanoicos para usarse en la invención incluyen el ácido seleccionado y/o una sal correspondiente. Los ácidos incluyen ácidos alcanoicos de cadena recta o ramificada, saturados o insaturados o sales de los mismos. Un ácido alcanoico comprende generalmente de 1 a 10 átomos de carbono. Ejemplos de ácidos alcanoicos contemplados por la invención son ácido pentanoico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido propiónico y ácido acético. Las concentraciones para ácidos alcanoicos abarcadas por la invención varían de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 10 milimolar, opcionalmente alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. Las concentraciones adecuadas de ácidos alcanoicos variarán dependiendo de su actividad y de la línea de células, y se pueden determinar por un experto en la técnica usando métodos de rutina y la guía provista en la presente. Una sal ejemplar de ácido butírico es butirato de sodio. Las sales adecuadas de los ácidos alcanoicos descritos arriba incluyen aquellas que comprenden grupos sodio, potasio o amonio, entre otros. Los polipéptidos particularmente preferidos para la expresión son fármacos a base de polipéptidos, también conocidos como biológicos. De preferencia, los polipéptidos se secretan como productos extracelulares . El polipeptido que se produzca puede comprender parte o todo de un polipéptido que sea idéntico o sustancialmente similar a un polipéptido que ocurra naturalmente, y/o puede, o no puede, ser un polipéptido de fusión recombinante. Opcionalmente , el polipéptido puede ser un polipéptido humano, un fragmento del mismo, o un polipéptido sustancialmente similar que tenga por lo menos 15 aminoácidos de longitud. Puede comprender un polipéptido que no sea anticuerpo y/o un anticuerpo. Puede producirse intracelularmente o ser secretado en el medio de cultivo del cual puede ser recuperado. Puede o no ser un polipéptido soluble. El polipéptido que se produzca puede comprender parte o todo de un polipéptido que sea idéntico o sustancialmente similar a un polipéptido que ocurra naturalmente, y/o puede, o no puede, ser un polipéptido de fusión recombinante . Puede comprender un polipéptido que no sea anticuerpo y/o un anticuerpo. Puede producirse intracelularmente o ser secretado en el medio de cultivo del cual puede ser recuperado. La invención se puede usar para inducir la producción de sólo alrededor de cualquier polipéptido, y es particularmente adecuada para polipéptidos cuya expresión esté bajo el control de un promotor fuerte, tal como, por ejemplo, un promotor viral, y/o los polipéptidos que sean codificados en un mensaje que tenga un elemento líder tripartita adenoviral . Ejemplos de vectores de expresión útiles que pueden usarse para producir proteínas se describen en la solicitud internacional WO 01/27299 y en McMahan et al., (1991), EMBO J. 10:2821, la cual describe el vector pDC409. Una proteína se entiende generalmente que es un polipéptido de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, opcionalmente alrededor de 25, 75 ó 100 aminoácidos. Generalmente, los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de polipéptidos recombinantes . Algunos polipéptidos que se pueden producir con los métodos de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o sustancialmente similares a todos o parte de los siguientes polipéptidos: un ligando flt3 (como el descrito en la solicitud internacional WO 94/28391, incorporada en la presente a manera de referencia) , un ligando CD40 (como el descrito en la patente de E.U.A. No. -6,087,329 incorporada en la presente a manera de referencia) , eritropoyetina, trombopoye ina, calcitonina, leptina, IL-2, angiopoyetina-2 (como la descrita por Maisonpierre et al., (1997), Science 277(5322) : 55-60, incorporado en la presente a manera de referencia), ligando Fas, ligando para activador de receptor de NF-kappa B (RA KL, como el descrito en la solicitud internacional WO 01/36637, incorporada en la presente a manera de referencia) , ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral (FNT) (TRAIL, como el descrito en la solicitud internacional WO 97/01633, incorporada en la presente a manera de referencia) , linfopoyetina derivada de estroma tímico, factor estimulador de colonia de granulocitos, factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, como el descrito en la patente australiana No. 588819, incorporada en la presente a manera de referencia) , factor de crecimiento de células cebadas, factor de crecimiento de células madre (descrito por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,204,363, incorporada en la presente a manera de referencia) , factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocitos , factor de crecimiento y desarrollo de megacariontes , RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento tipo insulina, hormona paratiroides , interferones que incluyen a- interferones ?-interferón e interferones de consenso (tales como aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 4,695,623 y 4,897471, ambas de las cuales están incorporadas en la presente a manera de referencia) , factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas tipo sinaptotagmina (SLP 1-5) , neurotropina-3 , glucagón, interleucinas 1 a 18, factores estimuladores de colonia, linfotoxina-ß, factor de necrosis tumoral (TNF) , factor inhibidor de leucemia, oncostatina-M y varios ligandos para moléculas de superficie celular ELK y Hek (tales como los ligandos para cinasas relacionadas con eph o LERKS) . Descripciones de polipeptidos que se pueden producir de acuerdo con los métodos de la invención pueden encontrarse en, por ejemplo, Human Cytokines : Handbook for Basic and Clinical Research, Vol . II (Agarwal y Gutterman, eds . Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors : A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nueva York, 1993); y The Cytokine Handbook (A. W. Thompson, ed. , Academic Press, San Diego, CA, 1991) , todos los cuales están incorporados en la presente a manera de referencia. Otros polipéptidos que se pueden producir usando los métodos de la invención incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de las secuencias de aminoácidos de un receptor para cualquiera de los polipéptidos mencionados arriba, un antagonista para este receptor o cualquiera de los polipéptidos mencionados arriba, - y/o polipéptidos sustancialmente similares a estos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas de factor de necrosis tumoral y receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR, referidas como p55 y p75, como las descritas en la patente de E.U.A. No. 5,395,760 y patente de E.U.A. No. 5,610,279, ambas de las cuales están incorporadas en la presente a manera de referencia) , receptores de interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; descritos en la patente EP No. 0 460 846, patente de E.U.A. No. 4,968,607 y patente de E.U.A. No. 5,767,064, todas las cuales están incorporadas en la presente a manera de referencia) , antagonistas del receptor de IL-1 (tales como aquellos descritos en la patente de E.U.A., No. 6,337,072, incorporada en la presente a manera de referencia) , antagonistas o inhibidores de IL-1 (tales como aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,981,713, 6,096,728 y 5,075,222, todas las cuales están incorporadas en la presente a manera de referencia), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (como los descritos en la patente europea No. 0 367 566 y en la patente de E.U.A. No. 5,856,296, ambas de las cuales están incorporadas a manera de referencia) , receptores de IL-15, receptores de 11-17, receptores de lile, receptores del factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos , receptor de factor estimulador de colonia de granulocitos, receptores de oncostatina M y factor inhibidor de leucemia, activador de receptor de NF-kappa B (RANK, descrito en WO 01/36637 y patente de E.U.A. No. 6,271,349, ambas de los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia) , osteoprotegerina (descrita por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,015,938, incorporada a manera de referencia) , receptores de TRAIL (incluyendo receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como FAS o receptor de inductor de apoptosis (AIR) . Otros polipéptidos que se pueden producir usando el proceso de la invención incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de las secuencias de aminoácidos de antígenos de diferenciación (referidas como polipéptidos CD) o sus ligandos o polipéptidos substancialmente similares a cualquiera de estos. Estos antígenos se describen en Leukocyte Typing VI {Proceedings of the VI th International Workshpo and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996, la cual se incorpora a manera de referencia. Los polipéptidos CD similares se describen en trabajos subsecuentes. Ejemplos de estos antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia del receptor de TNF, los cuales también incluyen 41BB y 0X40. Los ligandos son comúnmente miembros de la familia de TNF, al igual que el ligando 41BB y el ligando OX40. En consecuencia, los miembros de las familias de TNF y TNFR también pueden purificarse usando la presente invención. Los polipéptidos enzimáticamente activos o sus ligandos también pueden producirse de acuerdo con los métodos de la invención. Ejemplos incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de uno de los polipéptidos siguientes o sus ligandos o un polipéptido que sea sustancialmente similar a uno de éstos: miembros de la familia de metaloproteinasa-desintegrina, varias cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador de plasminógeno tisular, factor VIII, factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1 antitripsina, TNF-alfa y enzima de conversión de TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y numerosas otras enzimas y sus ligandos. Los métodos de la invención también se pueden usar para producir anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tengan dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante humanos acoplados a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variables de murino, fragmentos de los mismos o proteínas sustancialmente similares. El método de la invención también se puede usar para producir conjugados que comprendan un anticuerpo y una sustancia citotóxica o luminiscente. Estas sustancias incluyen: derivados de maytansina (tales como DM1) ; enterotoxinas (tales como una enterotoxina estafilocócica) ; isótopos de yodo (tales como yodo- 125) ; isótopos de tecnio (tales como Tc99m) fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5.18) y polipéptidos de inactivación de ribosomas (tales como bouganina, gelonina o saporina-S6) . La invención se puede usar también para producir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para unirse a una proteína objetivo específica y modificar su actividad, tales como aquellas descritas en las solicitudes internacionales WO 01/83525 y WO 00/24782, ambas de las cuales se incorporan a manera de referencia. Ejemplos de anticuerpos, proteínas quiméricas seleccionadas in vitro o conjugados anticuerpo/citotoxina o anticuerpo/luminóforo que se pueden producir mediante los métodos de la invención incluyen aquellos que reconocen cualquiera o una combinación de polipéptidos que incluyen, pero no están limitados a, las proteínas mencionadas anteriormente y/o los siguientes antígenos: CD2 , CD3 , COA, CD8, CDlla, CD14 , CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-la, IL-1E, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades del receptor de IL-18, PDGF-ß y análogos de los mismos (tales como aquellos descritos en las patentes de E.U.A'. Nos. 5,272,064 y 5,149,792), receptor de VEGF, TGF, TGF- 2 , TGF-Sl , EGF -(incluyendo aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 6,235,883 Bl, incorporada a manera de referencia) , receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferón gama, estimulador de linfocitos B (BlyS, tambén conocido como BAFF, THANK, TALL-1 y zTNF4 ; véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (el cual es un producto génico que es expresado en asociación con cáncer pulmonar) , HER-2 , una glicoproteína asociada a tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epítopes asociados a tumor que estén presentes a niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epítopes o polipéptidos asociados a cáncer expresados en células de cáncer de mama, colon, células escamosas, próstata, pancreático, pulmonar y/o renal, y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1,2, 3 y 4, RANK, ligando RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) , molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM-3), adhesina de leucointegrina, la glicoproteína de plaquetas gp Ilb/IIIa, cadena pesada de miosina cardíaca, hormona paratiroide, rNAPc2 (el cual es un inhibidor del factor VIIa-factor tisular) , HC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa- fetoproteína (AFP),- factor de necrosis tumoral (TNF) , CTLA-4 (el cual es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos) , receptor de Fc-?-?, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, Virus Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de hepatitis B (HBV) , Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus . La invención se puede usar también para producir todo o parte de un anticuerpo antiidiotípico o un polipéptido sustancialmente similar, incluyendo anticuerpos antiidiotípicos contra:' un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72 un anticuerpo contra el gangliósido GD3 ; un anticuerpo contra el gangliósido GD2 ; o anticuerpos sustancialmente similares a éstos. Los métodos de la invención también se pueden usar para producir polipéptidos de fusión recombinantes que comprendan cualquiera de los polipéptidos mencionados arriba. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden uno de los polipéptidos mencionados arriba más un dominio de multimerización, tales como una cremallera de leucina, una bobina bobinada, una porción Fe de un anticuerpo o una proteína sustancialmente similar, se pueden producir usando los métodos de la invención. Véase, por ejemplo, WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hákansson et al. (1999),- Structure 7:255-64, todos los cuales se incorporan a manera de referencia. Específicamente incluidos entre estos polipéptidos. de fusión recorabinantes están los polipéptidos en los cuales una porción de TNFR o RANK está fusionada a una porción Fe de un anticuerpo (TNFR: Fe o RANK: Fe) . TNFR: Fe comprende la porción Fe de un anticuerpo fusionada a un dominio extracelular de TNFR, el cual incluye las secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a los aminoácidos 1-163, 1-85 ó 1-235 de la figura 2A de la patente de E.U.A. No. 5,395,760, la cual está incorporada a manera de referencia. RANK: Fe se describe en la solicitud internacional O 01/36637, la cual se incorpora a manera de referencia. De preferencia, los polipéptidos son expresados bajo el control de un elemento de control heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor que en la naturaleza no dirija la producción de ese polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo, CMV, SV40) que dirija la expresión de un polipéptido de mamífero. La célula huésped puede o no producir normalmente polipéptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que haya sido genéticamente manipulada para producir un polipéptido humano, significando que el ácido nucleico que codifique para el polipéptido humano ha sido introducido en las células CHO. Como alternativa, la célula huésped puede ser una célula humana que haya sido genéticamente manipulada para producir niveles incrementados de un polipéptido humano normalmente presente sólo a niveles muy bajos (por ejemplo, al reemplazar el promotor endógeno con un promotor viral fuerte) . Para la producción de polipéptidos recombinantes , un vector de expresión que codifique para el polipéptido recombinante puede ser transferido, por ejemplo mediante transfección o infección viral, a un cultivo sustancialmente homogéneo de células huésped. El vector de expresión, el cual puede construirse usando los métodos de ingeniería genética, puede incluir ácidos nucleicos que codifiquen para el polipéptido de interés enlazados operablemente a secuencias reguladoras adecuadas. Las secuencias reguladoras se derivan típicamente de genes de mamífero, microbianos, virales y/o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales , operadores y potenciadores, un sitio de unión a ribosomas (véase, por ejemplo, Kozak (1991), J. Biol . Chem. 266:19867-19870), secuencias adecuadas para controlar el inicio y terminación de la transcripción y la traducción, señales de poliadenilación (véase, por ejemplo, McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:5323-33), y sitios de fijación a matriz y andamiaje (véase Phi-Van et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10:2302-07; Stief et al. (1989), Nature 341:342-35; Bonifr et al. (1990), EMBO J. 9:2843-38). Las secuencias de nucleótidos · están enlazadas operablemente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de codificación de polipéptidos . De esta manera, una secuencia de nucleótidos promotora está enlazada operablemente a una secuencia de codificación de polipéptidos si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de codificación. Un gen .que codifica para un marcador seleccionable se incorpora generalmente en el vector de expresión para facilitar la identificación de las células recombinantes . Secuencias de control de transcripción y traducción para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden ser extirpadas de los genomas virales. Las secuencias promotoras y potenciadoras usadas comúnmente se derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus simiano 40 (SV40) , y ci omegalovirus humano (CMV) . Por ejemplo, puede usarse el promotor/potenciador de CMV humano del gen 1 temprano inmediato. Véase, por ejemplo, Patterspn et al. (1994), Applied Microbiol . Biotechnol . 40:691-98. Secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de empalme y poliadenilación se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, el cual puede también contener un origen viral de replicación (Fiers et al. (1978),. Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. In Enzymol . 185:487-511). Fragmentos SV40 más grandes o más pequeños también pueden usarse, siempre y cuando la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extienda desde el sitio HindlII hacia el sitio Bgll localizado en el origen viral SV40 de replicación sea incluida. Además, una secuencia que codifique para un péptido de señal nativo o heterólogo adecuado (secuencia líder) se puede incorporar en el vector de expresión, para promover la secreción extracelular del polipéptido recombinante . El péptido de señal será cortado del polipéptido recombinante después de la secreción de la célula. La elección del péptido de señal o líder depende del tipo de células huésped en las cuales el polipéptido recombinante vaya a ser reproducido. Ejemplos de péptidos de señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia de señal para interleucina (IL-7) descrita en la patente de E.U.A. No. 4,965,195, la secuencia de señal para el receptor de interleucina- 2 descrita en Cosman et al. (1984), Nature 312:768; el péptido de señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente europea No. 367,566; el péptido de señal del receptor de interleucina-1 tipo I descrito en la patente de É.U.A. No . - 4 , 968 , 607 ; y el péptido de señal del receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la patente europea No. 0460 846. Los métodos establecidos para introducir ADN en células de mamífero han sido descritos. Kaufman, R. J. , Large Scale Mawmalian Cell Culture, 1990, págs . 15-69. Los protocolos adicionales que usan reactivos disponibles comercialmente , tales como los reactivos líquidos catiónicos LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™-200 O LIPOFECTAMINE™-PLUS (los cuales pueden comprarse de Invitrogen) , se pueden usar para transfectar células. Felgner et al. (1987)., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 84:7413-7417. Además, la electroporación o bombardeo con microproyectiles revestidos con ácidos nucleicos se pueden usar para transfectar células de mamífero usando procedimientos, tales como aquellos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2* ed. Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Fitzpatric-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10(9):1036- 40. La selección de transformantes estables puede llevarse a ¦ cabo usando métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al. ((1990), Meth. In Enzymology 185:487-511), describe varios esquemas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR) . Una cepa huésped adecuada para la selección de DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, la cual es deficiente en DHFR. Urlaub y" Chasin ¦ (1980), P-roc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220. Un plásmido que expresa el ADNc de DHFR puede introducirse en la cepa DX-B11, y sólo las células que contengan el plásmido pueden crecer en el medio selectivo adecuado. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen moléculas de ADNCc que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que portan el vector pueden seleccionarse sobre la base de resistencia a estos compuestos. Las secuencias de control adicionales que han mostrado mejorar la expresión de genes heterólogos para el vector de expresión de mamífero incluyen elementos tales como el elemento de secuencia de incremento de expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris et al . , in Animal Cell Technology, págs . 529-534 (1997); patentes de E.U.A. Nos. 6,312,951 Bl, 6,027,915 y 6,309,841 Bl) y el líder tripartita' (TPL) y moléculas de ARN de gen VA de adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol . Che . 257:13475-13491). Las secuencias del sitio de entrada de ribosomas interno (IRES) de origen viral permiten que moléculas de ARNm dicistrónicas sean traducidas eficientemente (Oh y Sarnow (1993) , Current Opinión in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2691-2100) . La expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguido por el gen para un marcador- - seleccionable (por ejemplo, DHFR) ha mostrado mejorar la capacidad de transfección del huésped y la expresión del ANDc heterólogo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol , 185:487-511). Los vectores de expresión ejemplares que emplean moléculas de ARNm dicistrónicas son pTR-DC/GFP descrito por Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997), y p2A5I descrito por Morris et al., in Animal Cell Technology, págs . 529-534 (1997). Un vector de alta expresión útil, pCAVNOT, ha sido descrito por Mosley et al. ((1989), Cell 59:335-348). Otros vectores de expresión para usarse en células huésped de mamífero pueden construirse como se describe por Ikayama y Berg ((1983), Mol. Cell. Biol . 3:280). Un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de moléculas de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 se puede construir sustancialmente como se describe por Cosman et al. ((1986), Mol. Immunol . 23:935). Un vector de alta expresión útil PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. ((1984), Nature 312:768) ha sido depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles y adicionales se describen en la patente europea No. -A-0 367 566 y O 01/27299 Al. Los vectores se pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal nativa, se puede añadir una secuencia de señal heteróloga, tal como una de las siguientes secuencias: la secuencia de señal para IL-7 descrita en la patente de E.U.A. No. 4,965,195; la -secuencia de señal para el receptor de IL-2 descrita en Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); el péptido de señal de IL-4 descrito en la patente europea No. 0 367 566; el péptido de señal del receptor de IL-1 tipo I descrito en la patente de E.U.A. No. 4,968,607 y el péptido de señal del " receptor de IL-1 tipo II descrito en la patente europea No. 0 460 846. Los polipéptidos pueden producirse en forma recombinante en células eucarióticas y se secretan de preferencia por células huésped adaptadas para crecer en cultivo de células. Opcionalmente, las células huésped para usarse en la invención son de preferencia células de mamífero. Las células también pueden ser manipuladas genéticamente para expresar un gen de interés, pueden ser células de producción de mamífero adaptadas para crecer en cultivo de células y/o pueden ser líneas de células homogéneas. Ejemplos de estas células usadas comúnmente en la industria son VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos) , MDCK, 293, 3T3, líneas de células de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1) , PC12, I38, y células de ovario de hámster chino (CHO) , las cuales se usan ampliamente para la producción de varios polipéptidos recombinantes complejos, por ejemplo, citocinas, factores de coagulación y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al., (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol. Endocrinol 6:231-239; Wood et al . (1990) , "'J. Immunol . 145:3011-3016). Las líneas de células mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) - (Urlaub et al., (1980), Proc Nati. Acad Sci USA 77: 4216-4220, la cual se incorpora en la presente a manera de referencia), DXB11 y DG-44, son líneas de células huésped CHO deseables porque el sistema de expresión de gen seleccionable y amplificable de DHFR eficiente' permite una expresión de polipéptidos recombinantes de alto nivel en estas células (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566, la cual se incorpora a manera de referencia) . Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o en suspensión, y exhiben estabilidad genética relativamente adecuada. Las células CHO y polipéptidos recombinantes expresados en ellas han sido extensamente caracterizados y han sido aprobados para usarse en la fabricación comercial clínica por agencias reguladoras. Los métodos de la invención también se pueden llevar a la práctica usando líneas de células de hibridoma que produzcan un anticuerpo. Los métodos para fabricar líneas de hibridoma se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Berzofsky et al., en Paul, ed. , Fundamental Iirrnunology, segunda edición, págs. 315-356, a 347-350, Raven Press Ltd. , Nueva York (1989) . Las líneas de células derivadas de las líneas mencionadas arriba también son adecuadas para llevar a la práctica la invención.

De acuerdo con la presente invención, una célula huésped de mamífero se cultiva bajo condiciones que promuevan la producción del polipéptido de interés, el cual puede ser un anticuerpo o un polipéptido recombinante . Formulaciones de medio de cultivo de células básicas también se conocen en la técnica. A estas formulaciones de medio de cultivo básicas el experto en la técnica le agregará componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, reguladores de pH, antibióticos, lípidos, elementos residuales y similares, dependiendo de los requerimientos de las células huésped que serán cultivadas. El medio de cultivo puede o no contener suero y/o proteínas. Varios medios de cultivo de tejidos, incluyendo medio de cultivo libre de suero y/o definido, están disponibles comercialmente para el cultivo de células. El medio de cultivo de células y de tejido se define, para los propósitos de la invención, como un medio adecuado para el crecimiento de células animales, y de preferencia células de mamífero, en cultivo de células in vi tro. Típicamente, el medio de cultivo de tejidos contiene un regulador de pH, sales, fuente de energía, aminoácidos, vitaminas y elementos esenciales residuales. Puede usarse cualquier medio capaz de soportar el crecimiento de la célula eucariótica adecuada en cultivo,-la invención es ampliamente aplicable a células eucarióticas en cultivo, particularmente células de mamífero, y la elección del medio no es crucial para la invención. Los medios de cultivo de tejido adecuados para usarse en la invención están disponibles comercialmente de, por ejemplo, ATCC (Manassas, VA) . Por ejemplo, cualquiera o una combinación de los siguientes medios puede usarse: medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) , Eagle Esencial Mínimo, medio F-12K, medio F12 de Ham, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio 5A de McCoy, medio L-15 de Leivbovitz y medio libre de suero tal como EXCELL™ serie 300 (disponible de JRG Biosciences, Lenexa, Kansas, E.U.A.)-, entre otros, los cuales pueden obtenerse de la Colección Americana de Tipos de Cultivos o JRH Biosciences, así como de otros vendedores. Cuando se usa medio definido que está libre de suero y/o libre de peptona, el medio normalmente es altamente enriquecido para aminoácidos y elementos residuales. Véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,122,469 a Mather et al., y 5,633,162 aKeen et al . En los métodos y composiciones de la invención, las células pueden ser cultivadas en medio libre de suero, libre de proteínas, libre de factores de crecimiento y/o libre de peptona. El término "libre de suero" según se aplica a medios incluye cualquier medio de cultivo de células de mamífero que no contenga suero, tal como suero de bovino fetal. El término "libre de insulina" aplicado a medios incluye cualquier medio al cual no se le haya añadido insulina exógena. Por exógena se intenta decir, en este contexto, otra que no sea la producida al cultivar las propias células. El término "libre de IGF-1" aplicado a medios incluye cualquier medio al cual no se le haya añadido algún factor de crecimiento tipo insulina 1 exógeno (IGF-1) o análogo (tal como, por ejemplo, análogos de LongR3 , [Ala31] o [Leu24] [Ala31] IGF-1 disponibles de GroPep Ltd. de Thebarton, Australia del Sur) . El término "libre de factor de crecimiento" aplicado a medios incluye cualquier medio al cual no se le haya añadido ningún factor de crecimiento exógeno (por ejemplo, insulina, IGF-1) . El término "libre de proteínas" según se aplica a medios incluye un medio libre de proteínas añadidas exógenamente, tal como, por ejemplo, transferrina y los factores de crecimiento de proteína IGF-1 e insulina. Los medios libres de proteínas pueden o no tener peptonas . El término "libre de peptona" según se aplica a medios incluye cualquier medio al cual no se le hayan añadido hidrolizados de proteínas exógenos tales como, por ejemplo, hidrolizados de proteínas animales y/o plantas. La eliminación de la peptona del medio tiene las ventajas de reducir la variabilidad entre lotes y de incrementar el procesamiento tal como la filtración. Los medios químicamente definidos son medios en los cuales cada componente se define y se obtiene de una fuente pura, de preferencia una fuente no animal . El experto en la técnica también puede seleccionar el uso de una de las diferentes formulaciones de medios individualizadas que hayan sido desarrolladas para maximizar el crecimiento de células, viabilidad de células y/o producción de polipéptidos recombinantes en una célula huésped cultivada particular. Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en combinación con medios de cultivo de células disponibles comercialmente o con un medio de cultivo de células que haya sido formulado individualmente para usarse con una línea de células particular. Por ejemplo, un medio enriquecido que pudiera soportar la producción incrementada de polipéptidos puede comprender una mezcla de dos o más medios comerciales, tales como, por ejemplo, medios DMEM y F12 de Ham combinados en relaciones tales como, por ejemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, O incluso hasta 1:15 o más altas. Alternativamente o además, un medio puede ser enriquecido mediante la adición de nutrientes, tales como aminoácidos o peptona, y/o un medio (o la mayoría de sus componentes con excepciones indicadas abajo) se puede usar a una concentración más alta que la normal recomendada, por ejemplo a 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X o concentraciones todavía más altas. Según se usa en la presente, "IX" significa la concentración estándar, "2X" significa el doble de la concentración estándar, etc. En cualquiera de estas modalidades, los componentes del medio que puedan afectar sustancialmente la osmolaridad, tales como sales, no pueden ser incrementados en concentración de tal manera que la osmolaridad del medio caiga fuera de una escala aceptable. De esta manera, un medio puede, por ejemplo, ser 8X con respecto a todos los componentes excepto sales, las cuales pueden estar presentes sólo a IX. Un medio enriquecido puede estar libre de suero y/o libre de proteínas. Además, un medio puede ser complementado periódicamente durante el tiempo en el que un cultivo se mantenga para restablecer los componentes del medio que puedan ser agotados tales como, por ejemplo, vitaminas, aminoácidos y precursores metabólicos. Como se conoce en la técnica, diferentes medios y temperaturas pueden tener efectos un poco diferentes que en líneas de células diferentes, y el mismo medio y temperatura podría no ser adecuado para todas las líneas de células. Las condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Animal Cell Cuture : A Practical Approach, D. Rickwoos, ed. , Oxford university press, Nueva York (1992) . Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o mientras están unidas a un substrato sólido. Además, las células en mamífero pueden ser cultivadas, por ejemplo, en biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibras huecas, botellas giratorias, matraces de agitación o biorreactores de tanque agitado, con o sin microvehículos , y operarse en un modo intermitente, de alimentación intermitente, · continuo, semicontiuo o de perfusión. Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden usar para mejorar la producción de polipéptidos recombinantes tanto en procesos de cultivo de una sola fase como de fases múltiples. En un proceso de una sola fase, las células se inoculan en un ambiente de cultivo y los métodos descritos se emplean durante la producción de una sola fase. En un proceso de varias etapas, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células pueden cultivarse primero en una fase de crecimiento, bajo condiciones ambientales que maximicen la proliferación y viabilidad celular, y después transferirse a una fase de producción bajo condiciones que maximicen la producción de polipéptidos. Las fases de crecimiento y producción pueden ser precedidas, o separadas, por una o más fases de transición. En los procesos de fases múltiple, los métodos de acuerdo con la presente invención se emplean al menos durante la fase de producción. Una fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura más alta que una fase de producción, por ejemplo, una fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura más alta que una fase de producción. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede ocurrir a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C, y una fase de producción puede ocurrir a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, opcionalmente a alrededor de 30°C a aproximadamente 33 °C. Los inductores químicos de la producción de polipéptidos , tales como, por ejemplo, cafeína, butirato y HMBA, se pueden añadir al mismo tiempo que, antes y/o después que un desplazamiento de temperaturas. Si los inductores se añaden después de un desplazamiento de temperaturas, pueden ser añadidos de una hora a 5 días después del desplazamiento de temperaturas, opcionalmente de uno a dos días después del desplazamiento de temperaturas. Después de la inducción usando los métodos de la invención, el polipéptido expresado resultante puede ser recogido. Además, el polipéptido puede ser purificado, o parcialmente purificado, de este cultivo o componente (por ejemplo, de medio de cultivo o extractos celulares o fluido corporal) usando procedimientos conocidos. Por "parcialmente purificado" se intenta decir que cierto procedimiento o procedimientos de fraccionado se han llevado a cabo, pero que más especies de polipéptidos (por lo menos 10%) que el polipéptido deseado están presentes. Por "purificado" se intenta decir que el polipéptido es esencialmente homogéneo, es decir, menos de 1% de polipéptidos contaminantes están presentes. Los procedimientos de fraccionado pueden incluir pero no están limitados a una o más etapas de filtración, centrifugación, separación de fases, purificación de afinidad, filtración en gel", cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC; usando resinas tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico) , HPLC o alguna combinación de las anteriores. Por ejemplo, la purificación del polipéptido puede incluir una columna de afinidad que contenga agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas de columna sobre resinas de afinidad tales como concanavalina A-agarosa, heparina-TOYOPEARL® (Toyo Soda Manufacturing Col., Ltd., Japón) o azul Cibacrom 3GA SEPHAROSE* (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Nueva York); una o más etapas que incluyan elución y/o cromatografía de inmunoafinidad . El polipéptido puede ser expresado en una forma que facilite la purificación. Por ejemplo, puede ser expresado como un polipéptido de fusión, tal como aquellos de polipéptido de unión a maltosa (MBP) , glutationa-S-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX) . Los equipos para la expresión y purificación de estos polipéptidos de fusión están disponibles comercialmente de New England BioLab (Beverly, Mass) , Pharmacia (Piscataway, N.J.) e In Vitrogen, respectivamente. El polipéptido puede ser marcado con un epítope y purificarse subsecuentemente mediante el uso de un anticuerpo específico dirigido a tal epítope. Uno de estos epítopes (FLAG®) está disponible comercialmente de Kodak (New Haven, Conn.) . También es posible utilizar una columna de afinidad que comprenda una proteína de unión a polipéptido, tal como un anticuerpo monoclonal para el polipéptido recombinante, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Otros tipos de etapas de purificación por afinidad pueden ser una columna de proteína A o proteína G, agentes de afinidad que se unan a proteínas que contengan dominios Fe. Los polipéptidos pueden ser removidos de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un regulador de pH de alta elución de sal y después dializarse en un regulador de pH contenido de sal más bajo para usarse o al cambiar el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o se pueden remover competitivamente usando el substrato que ocurra naturalmente de la porción de afinidad. El grado deseado de pureza final depende del uso deseado del polipéptido. Un grado de pureza relativamente alto se desea cuando el polipéptido va a ser administrado in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de tal manera que. ninguna banda de polipéptido que corresponda a otros polipéptidos sea detectable después del análisis mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) . Se reconocerá por un experto en el campo pertinente que varias bandas que correspondan al polipéptido pueden ser visualizadas mediante SDS-PAGE, debido a glucosilación diferencial, procesamiento después de traducción diferencial y similares. - Opcionalmente , el polipéptido de la invención se purifica a homogeneidad sustancial, como se indica por una sola banda de polipéptido después del análisis mediante SDS-PAGE. La banda de polipéptido puede visualizarse mediante tinción con plata, tinción con azul de Coomassie o (si el polipéptido está marcado radiactivamente) mediante autorradiograf£a . La invención abarca también opcionalmente formular más los polipéptidos . Por el término "formular" se intenta decir que puede cambiarse el regulador de pH de los polipéptidos, esterilizados, empacados a granel y/o empacados para un usuario final. Para los propósitos de la invención, el término "forma a granel estéril" significa que una formulación está libre, o esencialmente libre, de contaminación microbiana (a tal grado que sea aceptable para propósitos alimenticios y/o de fármacos) , y es de composición y concentración definidas. El término "forma de dosis unitaria estéril" significa una forma que es adecuada para la administración o consumo del cliente y/o paciente. Estas composiciones pueden comprender una cantidad efectiva de polipéptido, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. El término "fisiológicamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los' ingredientes activos. Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostatos insolutos que hagan a la formulación isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Los polipéptidos se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se pueden combinar en mezcla, ya sea como el único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato y soluciones de pH regulado con fosfato), conservadores (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos) , emulsificantes , solubilizantes , adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen aquellas descritas en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA. Además, estas composiciones pueden ser acomplejadas con polietilenglicol (PEG) , iones de metal o incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc. o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares , fantasmas de eritrocitos o esferoblastos . Los lípidos adecuados para la formulación liposómica incluyen, sin limitación, " monoglicéridos , diglicéridos , sulfátidos, lisolecitina, fosfolípios, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de estas formulaciones liposómicas está dentro de la capacidad del experto en la técnica, como se describe, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 y 4,737,323. Estas composiciones tendrán influencia en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo, y de esta manera se seleccionan de acuerdo con la aplicación deseada, de tal manera que las características del vehículo dependen de la ruta de administración seleccionada. Las formas de liberación prolongada adecuadas para usarse incluyen, pero no están limitadas a, polipéptidos que sean encapsulados en un polímero biocompatible de disolución lenta (tales como las micropartículas de alginato descritas en la patente de E.U.A. No. 6,036,978), mezclados con un polímero tal (incluyendo hidrogeles tópicamente aplicados) , y/o encerrados en un implante semipermeable biocompatible. Habiéndose descrito la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y no de limitación .

Ejemplo 1 Comparación de la actividad inductora de cafeína y butirato a 31°C En este experimento, cafeína (a concentraciones de 0.5 a 2.0 m ) se comparó con butirato de sodio para su capacidad para inducir la expresión de un polipéptido recombinante . Una línea de producción de células CHO genéticamente manipulada para expresar TNFR : Fe (línea de células #5) se usó para probar la efectividad de cafeína como un agente inductor. Las células CHO fueron cultivadas en matraces centrífugos a 37°C usando medio de crecimiento libre de suero que contenía metotrexato. Cuando la masa celular adecuada se obtuvo, las células se colocaron en condiciones de inducción mediante una centrifugación de cinco minutos a 1,000 x g, seguida por el reemplazo de medio de crecimiento con medio libre de suero sin metotrexato. Las células, a densidades iniciales de 2 x 106 células/ml en 20 mi, fueron colocadas en matraces Erlenmeyer de plástico de 125 mi con tapas selladoras de tapón y se colocaron sobre plataformas agitadoras en incubadoras ajustadas a las temperaturas adecuadas. La viabilidad y número de células se monitorearon mediante conteo hematocitométrico usando colorante de azul de tripano. Las concentraciones de polipéptidos recombinantes se evaluaron mediante ensayos a base de ELISA. Para esta línea de células, 0.2 mM se sabe que es la concentración óptima de butirato de sodio para inducción. En consecuencia, 0.2 mM de butirato- de- sodio se -compararon contra los efectos inductores de 0.5, 1.0 y 2.0 mM de cafeína. Un matraz que no contenía compuesto inductor también se incluyó. Los matraces agitadores se incubaron en esta fase de producción durante 5 días a 31°C en incubadores sin el control de dióxido de carbono. Después de 5 días en cultivo, las viabilidades celulares para todas las condiciones probadas fueron muy similares y variaron entre 75 y 85%. La concentración de proteínas relativa más alta (en µg/ml) , la cual fue aproximadamente 1.15 veces la concentración del cultivo de control sin inductores, y la productividad relativa (en µg deproteína/106 células/día), la cual fue aproximadamente 1.3 veces la productividad del cultivo de control, fue exhibida por las células que fueron inducidas con 1 mM de cafeína. Las células inducidas con 0.2 mM de butirato produjeron aproximadamente 1.11 veces la proteína total (en ¿ig/ml) producida por el cultivo de control a una velocidad (en /¿g de proteína/106 células/día) que fue aproximadamente 1.07 veces la velocidad de los cultivos de control. Concentraciones de proteínas similares se observaron en las células inducidas con 0.5 mM de cafeína, aunque estos cultivos tuvieron velocidades de producción ligeramente más altas. A concentraciones de cafeína de 2 mM, la concentración de proteínas fue similar a la observada sin agente inductor, aunque la velocidad de productividad por -célula fue más alta. Estos resultados indican que la cafeína se puede usar como un agente inductor y puede inducir concentraciones de producto iguales o que excedan aquellas observadas usando butirato de sodio como un agente inductor. Además, se obtuvieron datos experimentales adicionales que indicaban que el polipéptido recombinant'e producido usando cafeína era igual en calidad de producto (por ejemplo, glicosilación, doblez y composición de aminoácidos) al producido usando butirato de sodio.

Ejemplo 2 Inducción de la expresión de polipéptidos recombinantes en línea de células #9 En este experimento, se examinó el efecto de cafeína (a concentraciones de 0 a 1.4 mM) en la inducción de la expresión de un poliéptido recombinante diferente, una forma soluble del receptor de IL-1 tipo II, en una segunda línea de células CHO (línea de células #9) . Células CHO fueron cultivadas en matraces centrífugos a 37°C usando medio de crecimiento libre de suero que contenía metotrexato. Cuando la masa celular adecuada fue obtenida, el medio usado se removió mediante una centrifugación de cinco minutos a 1,000 x g y se volvió a colocar con medio de producción sin metotrexato . Las células, con densidades celulares iniciales de 2 x 106 células/ml en 20 mi, fueron colocadas en matraces Erlenmeyer de plástico de 125 mi con tapas selladoras de tapón. Las siguientes concentraciones de cafeína fueron probadas: 0, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 y 1.4 mM de cafeína. Los matraces se incubaron después en esta fase de inducción durante 5 días a 31°C en incubadoras sin control de dióxido de carbono. La viabilidad y número celular se monitorearon mediante conteo por hematocitómetro usando colorante de azul de tripano. Las concentraciones de polipéptidos recombinantes se evaluaron mediante ensayos a base de ELISA. Cada experimento de evaluación de inducción se llevó a cabo durante 5 días. Después de 5 días de cultivo, la viabilidad celular para la mayoría, de las condiciones probadas fue similar y promedió alrededor de 85%. Figura 1. Para el matraz inducido con 1.4 mM de cafeína, se observó 67% de viabilidad celular después de 5 días. Se observaron concentraciones de proteínas similares usando 0.6 mM, 0.8 mM y 1.0 mM de cafeína, es decir, alrededor de 350 µg/mL, lo cual es igual a la concentración observada para 0.5 mM de butirato. Figura 2. Ya que 0.6 mM es la concentración de cafeína más baja probada, estos datos no excluyen la posibilidad de que incluso concentraciones más bajas de cafeína pudieran dar resultados iguales o mejores. La productividad más alta (en de proteína/106 células/día) observada para un cultivo inducido con cafeína estuvo en el cultivo de 0.8 mM de cafeína. Figura 3. A niveles más altos de cafeína, es decir, 1.2 y 1.4 mM, las concentraciones de proteínas fueron comparables con el control negativo (sin agente inductor) , aunque la productividad en una base por células fue un poco más alta. Figuras 2 y 3. Ejemplo 3 Inducción de la expresión de polipeptidos recombinantes en línea de células #60 En este experimento, se analizó el uso de cafeína para inducir producción recombinante a partir de una tercera línea de células CHO (línea de células #60) que expresaba un tercer producto recombinante, un anticuerpo humano que reconoce el receptor de factor de crecimiento epidérmico. Para esta línea de células, los efectos inductores de 0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mM de cafeína se probaron, y el experimento se llevó a cabo como en el experimento anterior excepto que la fase de inducción se llevó a cabo a 36°C. En el día 5, el matraz de células sin inductor y el matraz de células inducido con 0.5 mM de cafeína exhibió las viabilidades celulares más altas (aproximadamente 76%) de todas las condiciones. Las viabilidades de los cultivos que contenían 1.0 mM y 1.5 mM de cafeína fueron de aproximadamente 68% y 60%, respectivamente. . Los cultivos que contenían 0.75 mM de butirato o 2.0 mM de cafeína fueron aproximadamente 51% viables. Esta viabilidad, en general, fue más baja que la observada en la línea de células #9 a 5 días, un efecto que pudiera ser atribuido a una variedad de factores incluyendo la diferencia en temperatura y/o diferencias de líneas de células. Una clara respuesta a dosis se observó con concentraciones de cafeína más altas que llevaban a viabilidades celulares más bajas. La concentración de proteínas de día 5 más alta se observó en células inducidas por 0.5 mM de cafeína (305 µ9/tt?1) , la cual fue aproximadamente 111% de la concentración del cultivo de control sin inductor. Generalmente, la concentración de polipéptido recombinante fue menor al incrementarse las concentraciones de cafeína por arriba de 0.5 mM. La productividad (en /ig de proteína/106 células/día) pareció estar relacionada con la concentración de cafeína, con la productividad más alta obtenida de células inducidas con 2.0 mM de cafeína y un nivel más bajo de productividad obtenida de las células inducidas con concentraciones de cafeína más bajas. Ya que 0.5 mM fue la concentración de cafeína más baja probada así como la concentración más efectiva probada para la inducción de la producción de proteínas, estos datos no excluyen la posibilidad de que una concentración más baja de cafeína pudiera ser igualmente o más efectiva que un inductor de línea de células #60 incubado a 36°C.

Este experimento, junto con aquellos descritos en los ejemplos 1 y 2, demuestra que la capacidad de la cafeína para inducir la expresión de polipéptidos recombinantes no es específica de- la línea de células y que una viabilidad celular favorable se mantiene . en presencia de cafeína. Además, la cafeína se puede usar en una fase de inducción o producción implementada a temperaturas de 31°C a 36°C. Sin embargo, estos datos indican también diferencias entre líneas de ' células en qué tan efectivamente la cafeína induce la síntesis de una proteína recombinante . Por ejemplo, la inducción de la línea de células #9 con cafeína es más efectiva que la inducción de la línea de células #60. Compárese el ejemplo 2 y la figura 2 con el ejemplo 3.

Ejemplo 4 Optimización de la inducción para la línea de células #60 El propósito de este experimento fue el de probar escalas de temperatura y concentraciones de cafeína en matraces de agitación para de esta manera optimizar las condiciones de inducción para la línea de células #60. Materiales y métodos. Doce matraces agitadores fueron programados bajo las condiciones descritas en la tabla Tabla 1 Concentraciones de cafeína y temperaturas de las muestras Las células fueron recogidas mediante centrifugación de un cultivo centrífugo de línea de células #60 (26.85 x 105 células/ml, 95.2% viables) y se inocularon en un matraz centrífugo de 575 mi a 2 x 106 células/ml en medio de producción libre de suero. Después se formaron alícuotas del cultivo en doce matraces de agitación. Se añadió cafeína de acuerdo con el plan experimental como el descrito en la tabla 1. Los matraces de agitación se incubaron a las temperaturas designadas durante 7 días. Se tomaron muestras los días 3, 5 y 7. La densidad y viabilidad celular se midieron usando un sistema automatizado de conteo celular que emplea tinción con azul de tripano para determinar la viabilidad (el Sistema de Examen de Densidad Celular o Cedex, desarrollado por Innovatis GmbH, Bielefeld, Alemania) . Se tomaron mediciones de glucosa y lactato con los instrumentos Yellow Springs 2700 (disponibles de Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio, E.U.A.) . La glucosa se añadió bajo demanda para mantener una concentración de >2g/l. El C02 y pH externo fueron medidos usando el analizador de gas en sangre Ciba-Corning 248 (disponible de Bayer Diagnostics, Tarryton, Nueva York, E.U.A.) . Las concentraciones de proteínas se determinaron por medio de una pre-purificación del anticuerpo en una columna de Proteína A seguida por una medición de la absorbancia de la proteína ligada y eluida de la columna a 280 nanómetros. Las densidades de células viables cumulativas (CVCDs) se calcularon como sigue: la CVCD para el día 1 es el número de células viables por mililitro de cultivo medida el día 1; la CVCD para el día 2 es el número de células viables por mililitro de cultivo medida el dáa 2 más el número de células viables por mililitro de cultivo medido el día 1; la CVCD para el día 3 es el número de células viables por mililitro de cultivo medido el día 3 más los números de células viables por mililitro de cultivo medido los días 1 y 2 ; y las CVCDs para días subsecuentes se calculan de manera similar. Resultados. CVCDs más altas se lograron en presencia de muy poca o ninguna cafeína. Una temperatura más baja, es decir, 36°C en lugar de 37°C, y niveles más bajos de cafeína dieron como resultado viabilidad final más alta. Cafeína a 2.5 mM dio como resultado- muerte celular y terminación de los cultivos. Sobre el resto de la escala de concentraciones probada, niveles aumentados de cafeína dieron como resultado productividad específica cumulativa incrementada (Cum Qp) , con el nivel más alto siendo de casi 30 µg/l06 células/día. Los cultivos que contenían los niveles más altos de cafeína dieron como resultado cultivos viables (2 mM) , mientras que los que tenían una alta Cum Qp, tuvieron un bajo CVCD, indicando que 2 mM de cafeína disminuyeron la viabilidad celular pero incrementaron la productividad de células viables restantes. Sin embargo, las concentraciones de proteína de los cultivos inducidos con 2 mM de cafeína fueron más bajas que para los cultivos no inducidos 7 días a ambas temperaturas. Las concentraciones de proteínas más altas resultaron a los niveles bajos a intermedios de cafeína para ambas temperaturas. La concentración en día 7 más alta se observó en el cultivo llevado a cabo a 36°C en presencia de 0.5 mM de cafeína, y su concentración fue aproximadamente 124% la concentración observada en un cultivo de control llevado a cabo a 36°C durante 7 días sin inductores. Las concentraciones en día 7 de los cultivos a 36°C llevados a cabo en presencia de 1.0 mM y 1.5 mM de cafeína fueron aproximadamente 116% y 111% de los niveles de control. respectivamente. Las concentraciones en día 7 de los cultivos llevados a cabo' a 37 °C en presencia de 0.5 mM, 1.0 mM y 1.5 ttiM de cafeína fueron aproximadamente 110%, 112% y 109%, respectivamente, del cultivo de control sin inductor a 37°C. Juntos, estos datos indican que la inducción de la línea de células #60 fue más efectiva a 36 °C de lo que fue a 37 °C. Las concentraciones en día 7 de los cultivos de control sin inductores cultivados a 36°C y 37°C fueron comparables. De esta manera, como en el ejemplo 3, la concentración más baja de cafeína probada llevó a las concentraciones de proteínas más altas a 36°C, sugiriendo la posibilidad de que incluso concentraciones más bajas pudieran producir concentraciones iguales o más altas. En resumen, la inducción con cafeína incrementó la productividad específica y la concentración tanto a 36°C como a 37°C. Las concentraciones fueron modestamente más altas a 36 °C que a 37°C, a pesar de valores Cum Qp más bajos debido a las CVCDs más altas y viabilidad a la temperatura más baja. Con base en el rendimiento y productividad de las células, se puede usar cafeína para inducir la producción de esta línea de células. Ejemplo 5 Efectos de inducción para compuestos relacionados con cafeína en la línea de células #9 Ya que los experimentos anteriores mostraron que la cafeína como un agente inductor incrementó concentraciones de polipéptidos recombinantes entre aproximadamente 9% y aproximadamente 67%, se ' llevaron- a- · cabo experimentos adicionales con otros derivados de xantina para probar su capacidad de inducción. Con base en la estructura de la xantina, se modelaron una variedad de compuestos y se seleccionaron para prueba. Éstos incluyen 3-isobutil-l-metilxantina, teofilina, teobromina, pentoxifilina y aminofilina, cuyas estructuras se ilustran abajo. Tabla 2 Derivados de xantina Compuesto X Y Z Cafeína Metilo Metilo Metilo 3-isobutil-l- Metilo Isobutilo Hidrógeno metilxantina (IBX) Teofilina Metilo Metilo Hidrógeno Teobromina Hidrógeno Metilo Metilo Pentoxifilina 5-oxihexilo Metilo metilo La aminofilina es el compuesto teofilina con 1,2-etilendiamina (2:1) dihidratada. Estos derivados de xantina, incluyendo algunas combinaciones, se probaron en la línea de células #9 en un formato de matraz de agitación (20 mi en matraces de agitación de 125 mi) como se describió arriba para los ejemplos 1 y 2. Para disolver 3-isobutil-l-metilxantina (IBX), ésta fue solubilizada en agua y calentada casi hasta el punto de ebullición, y rápidamente añadida a los matraces antes de que se precipitara. Como alternativa, IBX fue disuelta en DMF. La fase de inducción del cultivo de células se llevó a cabo durante 6 días a 31°C y las muestras fueron removidas para su análisis en el día 3 y día 6 de puntos de tiempo. Las concentraciones de proteínas de cada matraz de agitación se muestran en la tabla 3.

Tabla 3 Concentración de polipéptidos reeombinan es bajo varias condiciones de inducción Condición Concentración Concentración ^g/ml) ( g/ml) Dia 3 dia 6 0.6 mM cafeína '+ 0.5 mM butirato 120 280 0.1 mM teobromina 90 270 0.5 mM teobromina 100 260 1 mM teobromina 100 260 0.1 mM aminofilina 110 260 0.5 mM aminofilina 120 250 1 mM aminofilina 100 200 0.1 mM pentoxifilina 110 320 0.5 mM pentoxifilina . 130 380 1 mM pentoxifilina 130 400 0.3% DMF + 0.5 Mm IBX no 340 determinada 0.3% DMFf 120 330 0.5 mM IBX 150 420 0.5 mM IBX+0.6 Mm cafeína 130 370 0.1 mM IBX + 0.6 Mm cafeína 140 390 0.1 mM IBX 0.6 Mm + 0.5 Mm 130 280 butirato 0.1 mM IBX + 0.6Mm cafeína + 0.3% 150 390 D F 0.2 mM cafeína 150 400 0.6 mM cafeína 120 320 0.5 mM butirato 100 220 SIN INDUCTOR 100 290 Varias conclusiones pueden hacerse de estos datos. La producción del matraz inducido con- ?.5 mM de IBX fue incluso mejor que la de cafeína, y los tres matraces que contenían pentoxifilina también dieron resultados promisorios. Las concentraciones de cultivos inducidos con pentoxifilina se incrementaron con una dosis cada vez más alta y fueron más altas que la concentración del cultivo de control que no tenía inductor. Además, algunas combinaciones de diferentes derivados de xantina, así como diferentes •derivados de xantina con otros agentes inductores (por ejemplo, butirato y/o DMF) produjeron concentraciones de proteínas por arriba de los niveles de control. Teobromina y aminofilina no indujeron concentraciones de proteínas por arriba de las observadas en el cultivo de control que no contenía inductor. Las concentraciones de proteínas más altas obtenidas cuando se usó cafeína como un inductor se obtuvieron a la concentración más baja probada, es decir, 0.2 mM de cafeína. Como se explicó arriba, este resultado deja abierta la posibilidad de que concentraciones incluso más bajas de cafeína podrían ser efectivas. Finalmente, a diferencia del ejemplo 2 (figura 2), el butirato no induce concentración de proteínas incrementada sobre la observada en un cultivo sin inductor.

Ejemplo 6 Inducción de linea de células #60 por varios agentes inductores a 37 °C Este experimento se llevó a cabo en matraces Erlentneyer agitados como los descritos arriba en los ejemplos 1 y 2, excepto que los matraces se incubaron durante 5 días a 37°C, en lugar de 31°C y se usó la línea de células #60. Como un control, un matraz sin inductores fue cultivado a 31°C. La concentración de polipéptidos recombinantes en el medio se ensayó después de 5 días. Los derivados de xantina probados incluyeron cafeína (a 0.5 mM) , teobromina (a 0.1 mM, 0.5 mM y 1.0 mM) , 3 -isobutil- 1 -metilxantina (IBX, a 0.05 mM, 0.1 mM y 0.15 mM) y pentoxifilina (a 0.1 mM, 0.5 mM y 1.0 mM) . Además, butirato, algunas combinaciones de inductores y el compuesto no xantina papaverina fueron probados. El cultivo de control a 31°C produjo varias concentraciones de proteínas en comparación con el cultivo de control a 37°C, probablemente debido a la preferencia de la línea de células #60 por temperaturas más altas. Teobromina á una concentración de 0.1 mM incrementó la concentración de proteínas sobre la observada en el cultivo de control a 37°C, pero fue contraproducente a concentraciones más altas (0.5 mM y 1.0 mM) . Ni la cafeína, IBX o pentoxifilina incrementaron las concentraciones de proteínas por arriba de las observadas en un cultivo de control sin inductores. La concentración de proteínas fue inversamente proporcional a las concentraciones de teobromina, IBX y pentoxifilina en las escalas probadas. De manera interesante, la línea de células #9 (tabla 3, ejemplo 5) mostró concentraciones de proteínas incrementadas con concentraciones de pentoxifilina cada vez más altas dentro de esta misma escala, resaltando la variabilidad en las respuestas de diferentes líneas de células incubadas a diferentes temperaturas para agentes inductores. Al igual que en otros ejemplos (véase ejemplo 3), 0.5 mM de cafeína parece ser un mejor inductor que 0.5 mM de butirato para la línea de células #60, aunque ambos fallaron en incrementar la concentración de proteínas por arriba de la observada en el cultivo de control sin agente inductor en este experimento. En un experimento anterior, la cafeína había inducido una producción de proteínas ligeramente más alta que la observada en un cultivo de control a 37°C el día 7 (aproximadamente 110% de la concentración observada en el cultivo de control) , aunque se observó una inducción más grande a 36°C. Ejemplo 4. La falla de la cafeína por inducir una producción de proteínas incrementada en este experimento puede explicarse por una variedad de factores tales como variabilidad experimental, el pequeño tamaño del efecto positivo a 37°C en la línea de células #60 y/o la posibilidad de que 0.5 mM podría no ser una concentración de cafeína óptima para la inducción de la línea de células #60 a 37°C.

Ej emplo 7 Producción de RANK: Fe en presencia de cantidades variables de HMBA Acidos nucleicos que codificaban para RANK:Fc insertados en un vector adecuado (como el descrito en la solicitud internacional WO 01/36637) fueron introducidos en células CHO. Aproximadamente 2 millones de células de una línea transformada establemente propagada a 37°C se inocularon en 20 mililitros de medio a 31°C, ya sea sin HMBA o en presencia de concentraciones variables de HMBA, como se indica en la tabla 4. Las células fueron cultivadas durante un total de 5 días . en matraces agitadores. Posteriormente, todo el medio fue cosechado. El número de células presentes en el cultivo se determinó mediante tinción con azul de tripano y conteo de las células en un hemocitómetro . La concentración de RANK: Fe por mililitro de medio cosechado se determinó al purificar RANK: Fe mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de Proteína A (HPLC) y midiendo posteriormente la absorbancia a 280 nanómetros. Un número promedio de células en el cultivo se calculó al promediar los números de células de partida y finales. La productividad específica se determinó del número total de microgramos de RANK: Fe producidos, un número de células promedio (calculado como se describió arriba) y el número de días de crecimiento. Los datos de este experimento se muestran en la tabla 4.

Tabla 4 Efectos de concentraciones variables de HMBA en la concentración de proteínas y productividad específica Estos datos indican que la adición de HMBA a concentraciones de 0.5 ó 2.0 mM tuvo efectos positivos en la producción de polipéptidos y productividad específica.

Ejemplo 8 Producción de RANK: Fe en presencia de HMBA, cafeína y/o ácido butírico Acidos nucleicos que codificaban para RANK: Fe insertados en un vector adecuado (como el descrito en la solicitud internacional O 01/36637) fueron introducidos en células CHO. Aproximadamente 2 millones de células de una línea establemente transformada propagada 37 °C se inocularon en 20 mi de medio libre de suero a 31 °C sin inductores o en presencia de HMBA y/o cafeína y/o ácido butírico, como se indica en la tabla 5. Las células se cultivaron durante un total de 5 días en un matraz agitador. Posteriormente todo el medio se cosechó. El número de células' presentes en el cultivo,, la concentración de RANK:Fc por mililitro de medio cosechado, y la productividad específica se determinaron como se describe arriba en el ejemplo 7. Los datos de este experimento se muestran en la tabla 5.

Tabla 5 Efectos de cafeína, HMBA y ácido butírico individualmente y en combinación en la concentración de proteínas y productividad específica Estos datos indican que la adición ya sea de cafeína (a 1 mM) , ácido butírico (a 0.5 mM) o HMBA (a 2 mM) tuvieron efectos positivos sobre tanto la producción de polipéptidos como la productividad- específica, y que la combinación de ácido butírico, cafeína y HMBA (a las concentraciones mencionadas arriba) tuvo efectos positivos más grandes que cualquiera de estos compuestos solos.

Ejemplo 9 Producción del receptor de IL-1 tipo II en presencia de HMBA en un biorreactor Ácidos nucleicos que codificaban para un receptor de IL-1 tipo II insertado en un vector adecuado se introdujeron en células CHO. Aproximadamente 500 mil células de una línea transformada establemente se inocularon en un litro de medio libre de suero en un biorreactor. Las células se cultivaron durante dos días a 37°C. Posteriormente las células fueron desplazadas a 31°C, ya sea sin HMBA o en presencia de 2 mM de HMBA, y cultivadas durante 12 días más. Posteriormente, todo el medio se cosechó. La concentración del receptor de IL-1 tipo II por mililitro de medio cosechado se determinó mediante purificación por HPLC de fase inversa seguida por la medición de la absorbancia a 280 nanómetros. Los datos de este experimento se muestran en la tabla 6 como un porcentaje del promedio de las concentraciones de proteínas obtenidas de las dos muestras sin HMBA redondeado al número entero más cercano.

Tabla 6 Efectos de 2 mM de HMBA en la concentración de proteínas Estos datos muestran que los cultivos en biorreactor desplazados a 31°C después de una fase de crecimiento inicial de 37 °C produjeron más receptor de IL-1 tipo II si HMBA se añadía en el momento del desplazamiento de temperaturas que si no se hacía. Estos datos sugieren además que la invención puede ser útil para producir una variedad de polipéptidos en una variedad de líneas de células y que la mecánica de cómo las células se cultivan, por ejemplo, en un matraz de cultivo contra un biorreactor, no son criticas. Ejemplo 10 Producción de un anticuerpo contra receptor IL-4 de murino en células CHO El experimento descrito abajo prueba el efecto de usar ya sea butirato de sodio o HMBA como un inductor en otra línea de células a varias temperaturas. Ácidos nucleicos que codificaban para un anticuerpo contra un receptor IL-4 de ' murino insertado en · un vector adecuado se introdujeron en células CHO. Aproximadamente 2 millones de células de una línea establemente transformada propagada a 37°C fueron inoculados en 20 mililitros de medio a las temperaturas indicadas en la figura 4 y en presencia o ausencia de HMBA (2 mM) o butirato de sodio (0.5 mM) , como se indica en la figura 4. Las células se cultivaron durante un máximo de 14 días en un matraz agitador. Las alícuotas se removieron en los momentos indicados en la figura 4, y la concentración del anticuerpo (en microgramo por mililitro de medio cosechado) se determinó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , un método bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) , en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol . 32:461-466. Los resultados se muestran en la figura 4. Estos datos indican que el crecimiento a 31°C dio. como resultado la producción de más anticuerpo durante mayor tiempo que el crecimiento ya sea a 34°C o 37°C cuando el medio fue cosechado 7 días o más tarde . Estos datos indican también que tanto HMBA como butirato de sodio, individualmente, incrementaron la producción del anticuerpo y que HMBA también lo hizo en mayor grado que el butirato de sodio a 31°C.

Ejemplo 11 Producción de TNFR; Fe en células CHO Ácidos nucleicos que codificaban para TNFR: Fe humana en un vector adecuado se introdujeron en células CHO. Aproximadamente 3 ± 0.5 x 106 células de una línea de células establemente transformada propagada a 37°C se introdujeron en cada uno.de tres biorreactores dé un litro y se cultivaron a 32.5°C en un medio enriquecido y libre de suero. Se añadió butirato de sodio (0.5mM) a todos los tres cultivos y HMBA (2 mM) se añadió a dos de los cultivos ("día 1 + HMBA") un día después del desplazamiento a 32.5°C. Las células se incubaron durante un total de 11 días a 32.5°C. El medio se cosechó y la concentración de proteínas se determinó al medir la densidad óptica a 280 nanómetros después de una purificación usando proteína A PR0S0° Perfusión Chromatographjy™ (Applied Biosystems, Foster City, California, E.U.A.). Estos resultados se muestran en la tabla 7 como un porcentaje de la concentración obtenida de la muestra sin HMBA ("día 1") redondeado al número entero más cercano.

Tabla 7 Efectos de la sincronización de la adición de inductores Estos datos indican que la adición de HMBA incrementó la concentración de TNFR: Fe producida por estos cultivos cuando se añadió un día después de un desplazamiento de temperatura a 32.5°C. Estos datos, junto con los datos en los ejemplos anteriores, indican que la adición de HMBA puede incrementar la concentración de proteínas cuando se añade en el momento o después de un desplazamiento a una temperatura más baja. La descripción anterior de modalidades específicas revela la naturaleza general de la invención para que otros puedan fácilmente modificar y/o adaptar estas modalidades a varias aplicaciones sin alejarse de los conceptos genéricos presentados en la presente. Cualquiera de estas adaptaciones o modificaciones está diseñada para ser abarcada dentro del significado y gama de equivalentes de las modalidades descritas . La fraseología y terminología empleadas en presente tienen el propósito de descripción y no limitación. Todas las referencias citadas en la presente incorporan aquí a manera de referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: cultivar una línea de células de mamífero en una fase de crecimiento seguida por una fase de producción, en donde la fase de producción ocurre a una temperatura de menos de 37°C y añadir al medio de cultivo un derivado de xantina durante la fase de producción; en donde la adición del derivado de xantina incrementa la producción del polipéptido y en donde la línea de células de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una línea de células de mamífero que ha sido genéticamente manipulada para producir el polipéptido y una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la línea de células de mamífero ha sido transformada con un vector recombinante que codifica para el polipéptido y en donde el vector recombinante comprende un promotor de CMV . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el derivado de xantina es cafeína a una concentración de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 3.0 mi 1 iraolar . . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de fusión recombinante. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo humano o humanizado. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fase de producción ocurre a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de cada derivado de xantina añadido al cultivo es de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolar. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el derivado de xantina se selecciona del grupo que consiste en cafeína, 3 - i sobut i 1 - 1 -me t ilxánt ina ,· teobromina y pent o i f i 1 ina . 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se añaden al menos dos derivados de xantina. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los dos derivados de xantina diferentes son cafeína y 3-i sobut i 1 - 1 -me t i lxant ina . 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la línea de células de mamífero es una línea de células CHO . 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la línea de células CHO es expuesta al derivado o derivados de xantina durante al menos aproximadamente cinco días. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio usado durante la fase de producción está libre de suero. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además recoger el polipéptido del medio. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende además formular el polipéptido. 16. El método ' de conformidad · con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además varias adiciones del derivado de xantina. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio comprende además un compuesto polar híbrido. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el medio comprende además un ácido alcanoico. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio comprende además un ácido alcanoico. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el compuesto polar híbrido es bisacetamida de hexametileno y el derivado de xantina es cafeína. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el medio comprende además una sal de ácido butírico a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 mil imolar , en donde la bisacetamida de hexametileno está a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar y en donde la cafeína está a- una concentración de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5 milimolar . 22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva en la fase de crecimiento a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sea desplazada a la fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C y en donde el compuesto polar híbrido y la xantina se añaden después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. 25. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva a una temperatura de aproximadamen e 29°C a aproximadamente 36°C. · 26. Un método para producir un polipéptido recombinante, caracterizado porque comprende: cultivar una línea de células CHO que haya sido genéticamente manipulada para producir el polipéptido recombinante; y añadir al medio de cultivo por lo menos un derivado de xantina seleccionado del grupo que consiste en teobromina y cafeína, en donde la adición del derivado de xantina incrementa la producción del polipéptido recombinante . 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la línea de células CHO ha sido transformada con un vector recombinante que codifica para el polipéptido recombinante y en donde el vector recombinante comprende un promotor de CMV . 28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polipéptido recombinante es un polipéptido de fusión. 29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polipéptido recombinante es un anticuerpo humano o humanizado. 30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la concentración de cada derivado de xantina añadido al medio de cultivo es de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolar. 31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el derivado de xantina es cafeína. 32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además recoger el polipéptido recombinante del medio. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende además formular el polipéptido recombinante. 34. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además varias adiciones del derivado de xantina. 35. El método de conformidad con la' reivindicación 26, caracterizado porque la línea de células CHO se cultiva a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la línea de células CHO se cultiva a una temperatura de aproximadamente 300 C a aproximadamente 33°C. 37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la línea de células CHO se cultiva a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sea desplazada a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C y en donde el derivado de xantina se añade después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. 38. Un cultivo caracterizado porque comprende una célula CHO genéticamente manipulada para producir un polipéptido, un medio de producción y un derivado de xantina seleccionado del grupo que consiste en cafeína, teobromina y pentoxi fi 1 ina . 39. El cultivo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la concentración de cada derivado de xantina presente es de alrededor de 0.01 milimolar a aproximadamente 3 mil imolar . 40. El cultivo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el medio de producción está libre de suero. 41. El cultivo de conformidad con la reivindicación 38, caracter zado porque el cultivo comprende al menos dos derivados de xantina. 42. Un método para producir un polipéptido recombinante , caracterizado porque comprende: cultivar una línea de células de mamífero a una temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C y añadir un compuesto polar híbrido al medio de cultivo, en donde la línea de células de mamífero ha sido genéticamente manipulada para producir el polipéptido recombinante ; y en donde la adición del compuesto polar híbrido incrementa la producción del polipéptido recombinante . 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el compuesto polar híbrido es bisacetamida de hexametileno a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 20 milimolar. 44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva a una primera temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que sea desplazada a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamen e 36°C y en donde el compuesto polar híbrido se añade después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. 45. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el medio comprende además un ácido alcanoico a una concentración de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 10 milimolar. 46. El método de conformidad con la reivindicación' 43, caracterizado porque la bisacetamida de hexametileno en el medio está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar. 47. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la línea de células de mamífero se cultiva a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. 48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el ácido alcanoico es una sal de ácido butírico y la concentración de la sal de ácido butírico es de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. 49. El método " de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el compuesto polar híbrido es bisacetamida de hexametileno a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar, y el ácido alcanoico es una sal de ácido butírico a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. 50. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el medio está 1 ibre de suero . 51. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el medio comprende además un derivado de xantina. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el derivado de xantina es cafeína. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el medio comprende además una sal de ácido butírico. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el derivado de xantina está' presente a una concentración de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 3 milimolar, y la sal de ácido butírico está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar. 55. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el polipéptido recombinante es un polipéptido secretado. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además recuperar el polipéptido recombinante del medio. 57. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la línea de células de mamífero es una línea de células CHO . 58. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: cultivar una línea de células de mamífero que puede expresar el polipéptido en una fase de crecimiento a una primera . temperatura de aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C y luego cultivar la línea de células de mamífero en una fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 30°C a 34°C en un medio que comprende un compuesto polar híbrido. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido recombinante o un ant i cuerpo . 60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el compuesto polar híbrido es bi sacet amida de hexamet i 1 eno . 61. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el medio comprende además un ácido alcanoico. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el compuesto polar híbrido es bisacetamida de hexametileno y el ácido alcanoico es una sal de ácido butírico. 63. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el medio está libre de suero. 64. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el compuesto polar híbrido se añade después del desplazamiento de la primera temperatura a la segunda temperatura. 65. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el medio comprende además un derivado de xantina a una concentración de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar, y un ácido alcanoico a una concentración de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 10.0 milimolar y el compuesto polar híbrido -es bisace-tamida de hexametileno a una concentración de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 5 milimolar. 66. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la línea de células de mamífero es una línea de células de hibridoma o una línea de células CHO . 67. Un método para producir un polipéptido, caracte izado porque comprende cultivar células de mamífero que pueden producir el polipéptido en un medio que comprende entre alrededor de 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolar de bi sace.tamida de hexametileno, alrededor de 0.1 milimolar a aproximadamente 2 milimolar de ácido butírico, y de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 4 milimolar de cafeína a una temperatura de alrededor de 30°C a aproximadamente 36°C. 68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en RANK : Fe , receptor de interleucina tipo II, TNFR : Fe , ligando CD40, TRAIL, ligando flt3, receptor de IL-4, G-CSF, eri tropoyet ina , un anticuerpo y polipéptidos sustancialmente similares. 69. Un cultivo de células caracterizado porque comprende una línea de células CHO que ha sido genéticamente manipulada para producir un polipéptido y un medio de producción que comprende bisacetamida de hexamet i 1 eno , en donde el cultivo es incubado a una temperatura de aproximadamente 30°C a 36°C durante al menos aproximadamente cinco días.