JP2702616B2 - Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬 - Google Patents
Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬Info
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- JP2702616B2 JP2702616B2 JP7031891A JP7031891A JP2702616B2 JP 2702616 B2 JP2702616 B2 JP 2702616B2 JP 7031891 A JP7031891 A JP 7031891A JP 7031891 A JP7031891 A JP 7031891A JP 2702616 B2 JP2702616 B2 JP 2702616B2
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- JP
- Japan
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＰＩＶＫＡ−IIの測定方
法および測定試薬に関する。さらに詳しくは、ＰＩＶＫ
Ａ−IIを二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定
法によって測定する測定方法および測定試薬に関する。
法および測定試薬に関する。さらに詳しくは、ＰＩＶＫ
Ａ−IIを二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定
法によって測定する測定方法および測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＩＶＫＡ−IIはビタミンＫ依存性血漿
蛋白質の一つであるプロトロンビンの前駆物質であっ
て、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基に
ついてのγ−カルボキシル化の程度が不完全なものを言
う。当該カルボキシル化の程度が完全なものを正常プロ
トロンビンと言う。従って、ＰＩＶＫＡ−IIとは正常プ
ロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基につい
ての脱カルボキシル化体であるということもでき、ＰＩ
ＶＫＡ−IIという名称以外に異常プロトロンビン（Ａｂ
ｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）と呼ばれるこ
ともある。１０個のグルタミン酸残基中いくつがγ−カ
ルボキシル化を受けるかにより数種類のＰＩＶＫＡ−II
が混在した状態で存在している。本発明は主として生物
学的試料中のＰＩＶＫＡ−IIの測定を目的としているの
で、本発明におけるＰＩＶＫＡ−IIとは、特にことわら
ない限り、数種類のＰＩＶＫＡ−IIの混在状態を言う。
１０個のグルタミン酸残基についてのカルボキシル化の
程度が完全なものを正常プロトロンビンと言う。
蛋白質の一つであるプロトロンビンの前駆物質であっ
て、アミノ末端領域にある１０個のグルタミン酸残基に
ついてのγ−カルボキシル化の程度が不完全なものを言
う。当該カルボキシル化の程度が完全なものを正常プロ
トロンビンと言う。従って、ＰＩＶＫＡ−IIとは正常プ
ロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸残基につい
ての脱カルボキシル化体であるということもでき、ＰＩ
ＶＫＡ−IIという名称以外に異常プロトロンビン（Ａｂ
ｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）と呼ばれるこ
ともある。１０個のグルタミン酸残基中いくつがγ−カ
ルボキシル化を受けるかにより数種類のＰＩＶＫＡ−II
が混在した状態で存在している。本発明は主として生物
学的試料中のＰＩＶＫＡ−IIの測定を目的としているの
で、本発明におけるＰＩＶＫＡ−IIとは、特にことわら
ない限り、数種類のＰＩＶＫＡ−IIの混在状態を言う。
１０個のグルタミン酸残基についてのカルボキシル化の
程度が完全なものを正常プロトロンビンと言う。
【０００３】ＰＩＶＫＡ−II測定の臨床的な有用性につ
いては、ビタミンＫの不足状態あるいは抑制状態におい
て当該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果Ｐ
ＩＶＫＡ−IIが血液中に出現するので、ビタミンＫの不
足状態あるいは抑制状態のマーカーとしてその測定は臨
床上重要である。ＰＩＶＫＡ−IIとはＰｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎＫ ａｂｓｅｎ
ｃｅ−IIの略称であり、これは上記生理的観点に基づい
て命名されたものである。また最近では、肝細胞癌に伴
って血液中にＰＩＶＫＡ−IIが出現することが見い出さ
れ、従来肝細胞癌の良いマーカーとされているα−フェ
トプロテインが陰性の肝細胞癌患者においてもＰＩＶＫ
Ａ−IIが高濃度に出現することがあることにより、α−
フェトプロテインと同等の臨床的な有用性が認められて
いる。ＰＩＶＫＡ−IIとビタミンＫおよび肝細胞癌との
関連について参考のために下記文献１）から３）を列挙
する。 １）Ｍｏｔｏｈａｒａ Ｋ．Ｋｕｒｏｋｉ Ｙ．Ｋａｎ
Ｈ．Ｅｎｄｏ Ｆ．Ｍａｔｓｕｄａ Ｉ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙ
ｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｂｎｏ
ｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９８５；１
９：３５４−７ ２）Ｏｋｕｄａ Ｈ．Ｏｂａｔａ Ｈ．Ｎａｋａｎｉｓ
ｈｉ Ｔ．Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｒ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ
Ｅ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒ
ｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙ ｐ
ｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）ｂｙ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ
ｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９８７；
４：３５７−６３ ３）Ｈａｔｔｏｒｉ Ｎ．Ｏｈｍｉｚｏ Ｒ．Ｕｎｏｕ
ｒａ Ｍ．ＴａｎａｋａＮ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｍｅａｓ
ｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ
ｃａｒｃｉｏｎｏｍａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｕ
ｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９８８；
３：２０７−１６
いては、ビタミンＫの不足状態あるいは抑制状態におい
て当該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果Ｐ
ＩＶＫＡ−IIが血液中に出現するので、ビタミンＫの不
足状態あるいは抑制状態のマーカーとしてその測定は臨
床上重要である。ＰＩＶＫＡ−IIとはＰｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｔａｍｉｎＫ ａｂｓｅｎ
ｃｅ−IIの略称であり、これは上記生理的観点に基づい
て命名されたものである。また最近では、肝細胞癌に伴
って血液中にＰＩＶＫＡ−IIが出現することが見い出さ
れ、従来肝細胞癌の良いマーカーとされているα−フェ
トプロテインが陰性の肝細胞癌患者においてもＰＩＶＫ
Ａ−IIが高濃度に出現することがあることにより、α−
フェトプロテインと同等の臨床的な有用性が認められて
いる。ＰＩＶＫＡ−IIとビタミンＫおよび肝細胞癌との
関連について参考のために下記文献１）から３）を列挙
する。 １）Ｍｏｔｏｈａｒａ Ｋ．Ｋｕｒｏｋｉ Ｙ．Ｋａｎ
Ｈ．Ｅｎｄｏ Ｆ．Ｍａｔｓｕｄａ Ｉ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙ
ｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｂｎｏ
ｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９８５；１
９：３５４−７ ２）Ｏｋｕｄａ Ｈ．Ｏｂａｔａ Ｈ．Ｎａｋａｎｉｓ
ｈｉ Ｔ．Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｒ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ
Ｅ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒ
ｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙ ｐ
ｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）ｂｙ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ
ｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９８７；
４：３５７−６３ ３）Ｈａｔｔｏｒｉ Ｎ．Ｏｈｍｉｚｏ Ｒ．Ｕｎｏｕ
ｒａ Ｍ．ＴａｎａｋａＮ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｍｅａｓ
ｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ
ｃａｒｃｉｏｎｏｍａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｕ
ｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９８８；
３：２０７−１６
【０００４】ＰＩＶＫＡ−IIの測定方法としては、ポリ
クローナルな抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を使用した競合ラジ
オイムノアッセイ法（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｒ．ｅｔ
ａｌ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉ
ｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔ
ｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９８１；３０５：２４２−
８）、あるいは正常プロトロンビンを吸収後、残存する
ＰＩＶＫＡ−IIのトロンビン活性を測定する方法（Ｓｏ
ｕｌｉｅｒ Ｊ．ｅｔａｌ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ
ｔｏ ａｓｓａｙ ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙｐｒ
ｏｔｈｏｍｂｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ．１９８６；９１：１２５８−６２）などが報告され
ているが、いずれも材料の調製が繁雑であったり、測定
系が複雑であったりして多数の臨床検体を扱う臨床検査
の場においては実用的ではない。これらの方法に対し
て、抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体を使用した特
異的なＰＩＶＫＡ−II測定方法（特開昭６０−６０５５
７号）は非常に簡便であり、しかも正確に多数の検体が
測定できるという特徴を持っており、現在その方法を使
用した測定試薬が唯一のＰＩＶＫＡ−II測定診断薬とし
て広く利用されている。
クローナルな抗ＰＩＶＫＡ−II抗体を使用した競合ラジ
オイムノアッセイ法（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｒ．ｅｔ
ａｌ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｄｅｆｉ
ｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔ
ｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９８１；３０５：２４２−
８）、あるいは正常プロトロンビンを吸収後、残存する
ＰＩＶＫＡ−IIのトロンビン活性を測定する方法（Ｓｏ
ｕｌｉｅｒ Ｊ．ｅｔａｌ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ
ｔｏ ａｓｓａｙ ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙｐｒ
ｏｔｈｏｍｂｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ
ｙ．１９８６；９１：１２５８−６２）などが報告され
ているが、いずれも材料の調製が繁雑であったり、測定
系が複雑であったりして多数の臨床検体を扱う臨床検査
の場においては実用的ではない。これらの方法に対し
て、抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体を使用した特
異的なＰＩＶＫＡ−II測定方法（特開昭６０−６０５５
７号）は非常に簡便であり、しかも正確に多数の検体が
測定できるという特徴を持っており、現在その方法を使
用した測定試薬が唯一のＰＩＶＫＡ−II測定診断薬とし
て広く利用されている。
【０００５】肝細胞癌の診断および経過観察にα−フェ
トプロテインの測定と共にＰＩＶＫＡ−IIの測定が行な
われているが、α−フェトプロテインの測定が検体とし
て血清でも血漿でも使用できるのに対し、上記の特開昭
６０−６０５５７号公報に基づくＰＩＶＫＡ−IIの測定
法は、血清では正確な測定はできず、血漿を検体試料と
して使用しなければならないという大きな欠点を有して
いる（服部 信、臨床と研究、６５巻３号、２５７頁左
欄に「血清検体の中には異常に高値を示すものがみら
れ、安定した定量値が得られないことがわかった。」と
記載されている。）。また、血漿検体においてさえ、そ
の保存期間中に凍結融解を頻回おこなったり、高温に保
存したりした場合には血液凝固反応が進行し血清に近い
状態となり、測定値の信頼性に不安をいだかせる場合が
ある。このことは診断を必要とする患者から血清と血漿
の２種類の採血をしなければならず、患者の負担はもち
ろんのこと、測定する側にとっても血清試料でも信頼性
のあるＰＩＶＫＡ−IIの測定できる試薬の開発が望まれ
ている。また血漿試料で正確なＰＩＶＫＡ−IIの測定が
可能であるのに、血清試料ではなぜ安定した測定値が得
られないか、原因は不明でありその解決策はいまだ見い
出されていない。
トプロテインの測定と共にＰＩＶＫＡ−IIの測定が行な
われているが、α−フェトプロテインの測定が検体とし
て血清でも血漿でも使用できるのに対し、上記の特開昭
６０−６０５５７号公報に基づくＰＩＶＫＡ−IIの測定
法は、血清では正確な測定はできず、血漿を検体試料と
して使用しなければならないという大きな欠点を有して
いる（服部 信、臨床と研究、６５巻３号、２５７頁左
欄に「血清検体の中には異常に高値を示すものがみら
れ、安定した定量値が得られないことがわかった。」と
記載されている。）。また、血漿検体においてさえ、そ
の保存期間中に凍結融解を頻回おこなったり、高温に保
存したりした場合には血液凝固反応が進行し血清に近い
状態となり、測定値の信頼性に不安をいだかせる場合が
ある。このことは診断を必要とする患者から血清と血漿
の２種類の採血をしなければならず、患者の負担はもち
ろんのこと、測定する側にとっても血清試料でも信頼性
のあるＰＩＶＫＡ−IIの測定できる試薬の開発が望まれ
ている。また血漿試料で正確なＰＩＶＫＡ−IIの測定が
可能であるのに、血清試料ではなぜ安定した測定値が得
られないか、原因は不明でありその解決策はいまだ見い
出されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】かかる実情にかんがみ
本発明者らは、血漿検体はもちろんのこと、血液凝固反
応が進行した検体、とりわけ血清検体でもＰＩＶＫＡ−
IIが測定できる試薬を開発することを目的とする。
本発明者らは、血漿検体はもちろんのこと、血液凝固反
応が進行した検体、とりわけ血清検体でもＰＩＶＫＡ−
IIが測定できる試薬を開発することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＰＩＶＫＡ
−IIを二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法
において、第二抗体として使用する抗ヒトプロトロンビ
ン抗体を通常の方法によりヒトプロトロンビンを動物に
免疫して作成した場合には、たとえヒトプロトロンビン
アフィニティカラムを用いて抗体を精製しても（特開昭
６０−６０５５７号）その抗ヒトプロトロンビン抗体の
中にヒトトロンビンと交差反応を示す抗体が出現するこ
とを見い出した。さらにその抗体の特性を鋭意研究した
結果、ヒトトロンビンと交差反応を示す抗体が血清検体
のＰＩＶＫＡ−II測定系に悪い影響を及ぼすことを初め
て見い出した。すなわちＰＩＶＫＡ−IIの免疫測定系に
おける第二抗体として使用する抗ヒトプロトロンビン抗
体がヒトトロンビンと反応しない抗体を使用すれば血漿
検体はもちろんのこと血清検体でもＰＩＶＫＡ−IIが正
確に測定できることを初めて見い出し本発明を完成する
に至った。
−IIを二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法
において、第二抗体として使用する抗ヒトプロトロンビ
ン抗体を通常の方法によりヒトプロトロンビンを動物に
免疫して作成した場合には、たとえヒトプロトロンビン
アフィニティカラムを用いて抗体を精製しても（特開昭
６０−６０５５７号）その抗ヒトプロトロンビン抗体の
中にヒトトロンビンと交差反応を示す抗体が出現するこ
とを見い出した。さらにその抗体の特性を鋭意研究した
結果、ヒトトロンビンと交差反応を示す抗体が血清検体
のＰＩＶＫＡ−II測定系に悪い影響を及ぼすことを初め
て見い出した。すなわちＰＩＶＫＡ−IIの免疫測定系に
おける第二抗体として使用する抗ヒトプロトロンビン抗
体がヒトトロンビンと反応しない抗体を使用すれば血漿
検体はもちろんのこと血清検体でもＰＩＶＫＡ−IIが正
確に測定できることを初めて見い出し本発明を完成する
に至った。
【０００８】すなわち本発明は酸素免疫測定法、ラジオ
イムノアッセイ法あるいはその他の測定法において二抗
体サンドイッチ法を原理とするＰＩＶＫＡ−II測定試薬
の抗体には、第一抗体に抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナ
ル抗体を使用し、第二抗体にはＰＩＶＫＡ−IIとプロト
ロンビンの共通抗原に対する抗体（抗プロトロンビン抗
体と呼ぶ）を使用するが、この時、第二抗体として使用
する抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体に
かかわらずトロンビンと交差反応しない抗体を使用する
ことにより、血漿検体はもちろんのこと血清検体でもＰ
ＩＶＫＡ−IIが正確に測定できる完成された試薬を提供
することにある。このようにして製造した試薬はトロン
ビンと反応しないので、血清中に多量に存在するトロン
ビンの影響を受けずにＰＩＶＫＡ−IIが測定できる。一
方、トロンビンと交差反応する抗プロトロンビン抗体を
使用した場合には、血清中のＰＩＶＫＡ−II以外にトロ
ンビンとも反応して測定値を上昇させ、正確な測定が不
可能である。
イムノアッセイ法あるいはその他の測定法において二抗
体サンドイッチ法を原理とするＰＩＶＫＡ−II測定試薬
の抗体には、第一抗体に抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナ
ル抗体を使用し、第二抗体にはＰＩＶＫＡ−IIとプロト
ロンビンの共通抗原に対する抗体（抗プロトロンビン抗
体と呼ぶ）を使用するが、この時、第二抗体として使用
する抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体に
かかわらずトロンビンと交差反応しない抗体を使用する
ことにより、血漿検体はもちろんのこと血清検体でもＰ
ＩＶＫＡ−IIが正確に測定できる完成された試薬を提供
することにある。このようにして製造した試薬はトロン
ビンと反応しないので、血清中に多量に存在するトロン
ビンの影響を受けずにＰＩＶＫＡ−IIが測定できる。一
方、トロンビンと交差反応する抗プロトロンビン抗体を
使用した場合には、血清中のＰＩＶＫＡ−II以外にトロ
ンビンとも反応して測定値を上昇させ、正確な測定が不
可能である。
【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
係わるトロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体は
例えば次のように製造される。まず、新鮮ヒト血漿より
Ｓｈａｐｉｒｏ等（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．
Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔ
ｈ．Ｈａｅｍｏｒｐｈ．，１９６６；１６：４６９−９
０）の方法により精製ヒトプロトロンビンを得る。次に
このヒトプロトロンビンでウサギを免疫し、採血して抗
血清を得る。抗血清に硫酸アンモニウムを加えて塩析
し、透析後、ＤＥ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅでイオン
交換する。これを、ヒトプロトロンビンアフィニティ
カラムにかけ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出して抗ヒトプ
ロトロンビンウサギＩｇＧ抗体を得る。透析して塩酸グ
アニジンを除去後トロンビンアフィニティ カラムにか
けて、素通り分画を採取し、トロンビンと反応しない抗
プロトロンビン抗体とする。また上記のポリクローナル
抗体の他に、精製ヒトプロトロンビンをマウスに免疫し
てその脾臓細胞を採取し、Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｇ．等の方
法（ＫｏｅｈｌｅｒＧ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．Ｄｅｖ
ｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄ
ｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏ
ｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；６：５１
１−９）によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合
し、限界希釈法により３回クローニングをおこない、ト
ロンビンと反応せずにＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロト
ロンビンと反応する抗プロトロンビン抗体産生セルライ
ンとして確立される細胞が分泌するモノクローナル抗体
をトロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体として
使用することもできる。
係わるトロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体は
例えば次のように製造される。まず、新鮮ヒト血漿より
Ｓｈａｐｉｒｏ等（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．
Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔ
ｈ．Ｈａｅｍｏｒｐｈ．，１９６６；１６：４６９−９
０）の方法により精製ヒトプロトロンビンを得る。次に
このヒトプロトロンビンでウサギを免疫し、採血して抗
血清を得る。抗血清に硫酸アンモニウムを加えて塩析
し、透析後、ＤＥ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅでイオン
交換する。これを、ヒトプロトロンビンアフィニティ
カラムにかけ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出して抗ヒトプ
ロトロンビンウサギＩｇＧ抗体を得る。透析して塩酸グ
アニジンを除去後トロンビンアフィニティ カラムにか
けて、素通り分画を採取し、トロンビンと反応しない抗
プロトロンビン抗体とする。また上記のポリクローナル
抗体の他に、精製ヒトプロトロンビンをマウスに免疫し
てその脾臓細胞を採取し、Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｇ．等の方
法（ＫｏｅｈｌｅｒＧ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．Ｄｅｖ
ｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄ
ｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏ
ｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；６：５１
１−９）によりミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合
し、限界希釈法により３回クローニングをおこない、ト
ロンビンと反応せずにＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロト
ロンビンと反応する抗プロトロンビン抗体産生セルライ
ンとして確立される細胞が分泌するモノクローナル抗体
をトロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体として
使用することもできる。
【００１０】本発明に係わる抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクロ
ーナル抗体は例えば公開特許（特開昭６０−６０５５
７）に述べられているように、次のように製造される。
まず、ワーファリン服用者血漿よりＢａＳＯ4 、ＢａＣ
Ｏ3 処理してヒトプロトロンビンを吸着除去し、次にＤ
Ｅ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅによるイオン交換をおこ
ない、最後にＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロトロンビン
と反応する抗プロトロンビン抗体を用いたアフィニティ
ーカラムに吸着せしめ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出し、
透析し、濃縮して精製ＰＩＶＫＡ−IIを得る。次にこの
精製ＰＩＶＫＡ−IIをマウスに免疫してその脾臓細胞を
採取し、前記したＫｏｈｌｅｒＧ．等の方法によりミエ
ローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合し、限界希釈法により
３回クローニングをおこない、正常プロトロンビンとは
反応せずにＰＩＶＫＡ−IIとのみ反応する抗体産生セル
ラインとして確立される細胞が分泌するモノクローナル
抗体を抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体として使用
することができる。
ーナル抗体は例えば公開特許（特開昭６０−６０５５
７）に述べられているように、次のように製造される。
まず、ワーファリン服用者血漿よりＢａＳＯ4 、ＢａＣ
Ｏ3 処理してヒトプロトロンビンを吸着除去し、次にＤ
Ｅ−５２ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅによるイオン交換をおこ
ない、最後にＰＩＶＫＡ−IIおよび正常プロトロンビン
と反応する抗プロトロンビン抗体を用いたアフィニティ
ーカラムに吸着せしめ、４Ｍ塩酸グアニジンで溶出し、
透析し、濃縮して精製ＰＩＶＫＡ−IIを得る。次にこの
精製ＰＩＶＫＡ−IIをマウスに免疫してその脾臓細胞を
採取し、前記したＫｏｈｌｅｒＧ．等の方法によりミエ
ローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合し、限界希釈法により
３回クローニングをおこない、正常プロトロンビンとは
反応せずにＰＩＶＫＡ−IIとのみ反応する抗体産生セル
ラインとして確立される細胞が分泌するモノクローナル
抗体を抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体として使用
することができる。
【００１１】次に本発明における二抗体サンドイッチ法
を利用する測定法は例えば次のように実施される。な
お、ここでは酵素免疫測定法の場合を示すが、ラジオイ
ムノアッセイ法あるいはその他の方法においても本発明
が使用できることは言うまでもない。本発明測定試薬の
具体的態様を示せば次の如くになる。すなわち、本発明
測定試薬はヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗
ヒトプロトロンビン抗体を必須の構成成分とし、モノク
ローナル抗ＰＩＶＫＡ−II抗体（単独または固相化した
もの）、標準抗原、酵素および基質よりなる群より任意
に選択したものを組合わせたもののセットである。ここ
において、セット中に固相が含まれる場合に当該固相が
モノクロナール抗ＰＩＶＫＡ−II抗体によってコートさ
れた状態で提供されること、あるいはセット中に標準用
抗ヒトプロトロンビン抗体と酵素とが含まれる場合に、
両者がコンジュゲートした状態で提供されることは自由
であり、これらも同様に本発明測定試薬の態様に含まれ
る。また測定の実施の便益のために適当なる抗原希釈
液、反応希釈液、基質溶解液、反応停止液等がセット中
に添付されることも自由であり、これらは本発明を限定
するものではない。測定は抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクロナ
ール抗体コート固相体に標準抗原または被検生物学的試
料（血液、血漿または血清）を加えてインキュベートす
る。固相体を洗浄後、酵素標識抗プロトロンビン抗体
（トロンビンと反応しない）を加えて再びインキュベー
トし、洗浄し、最後に基質を加えてインキュベート後、
基質の分解量を分光光度計を用いて測定する。後記実施
例によって示されるごとく、本発明測定試薬によっては
じめて血清検体でのＰＩＶＫＡ−II測定が可能となる。
を利用する測定法は例えば次のように実施される。な
お、ここでは酵素免疫測定法の場合を示すが、ラジオイ
ムノアッセイ法あるいはその他の方法においても本発明
が使用できることは言うまでもない。本発明測定試薬の
具体的態様を示せば次の如くになる。すなわち、本発明
測定試薬はヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗
ヒトプロトロンビン抗体を必須の構成成分とし、モノク
ローナル抗ＰＩＶＫＡ−II抗体（単独または固相化した
もの）、標準抗原、酵素および基質よりなる群より任意
に選択したものを組合わせたもののセットである。ここ
において、セット中に固相が含まれる場合に当該固相が
モノクロナール抗ＰＩＶＫＡ−II抗体によってコートさ
れた状態で提供されること、あるいはセット中に標準用
抗ヒトプロトロンビン抗体と酵素とが含まれる場合に、
両者がコンジュゲートした状態で提供されることは自由
であり、これらも同様に本発明測定試薬の態様に含まれ
る。また測定の実施の便益のために適当なる抗原希釈
液、反応希釈液、基質溶解液、反応停止液等がセット中
に添付されることも自由であり、これらは本発明を限定
するものではない。測定は抗ＰＩＶＫＡ−IIモノクロナ
ール抗体コート固相体に標準抗原または被検生物学的試
料（血液、血漿または血清）を加えてインキュベートす
る。固相体を洗浄後、酵素標識抗プロトロンビン抗体
（トロンビンと反応しない）を加えて再びインキュベー
トし、洗浄し、最後に基質を加えてインキュベート後、
基質の分解量を分光光度計を用いて測定する。後記実施
例によって示されるごとく、本発明測定試薬によっては
じめて血清検体でのＰＩＶＫＡ−II測定が可能となる。
【００１２】
【発明の効果】本発明は従来正確な測定が不可能であっ
た血清におけるＰＩＶＫＡ−II測定を可能にし、肝細胞
癌の診断および経過観察に有効なＰＩＶＫＡ−IIの測定
をα−フェトプロテインの測定と同じ血清で測定できる
ようにし、血清と血漿を別々に採血するという患者の負
担を除くことができる。
た血清におけるＰＩＶＫＡ−II測定を可能にし、肝細胞
癌の診断および経過観察に有効なＰＩＶＫＡ−IIの測定
をα−フェトプロテインの測定と同じ血清で測定できる
ようにし、血清と血漿を別々に採血するという患者の負
担を除くことができる。
【００１３】
【実施例】以下に記載する実施例をもって本発明の効果
を更に具体的に説明する。 実施例１． トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体の作成 新鮮ヒト血漿１リットルに１Ｍ ＢａＣｌ2 を８０ml添
加し、１時間攪拌した後、遠心にてバリューム沈澱を回
収する。０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２００mlを加えて２時間
攪拌後、硫酸アンモニウムにて２５〜６５％飽和分画を
採取する。０．１Ｍ燐酸緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌにて０Ｍ〜０．６Ｍ ＮａＣｌ分画を行
なう。プロトロンビン画分を集め、透析後、Ｈａｐａｒ
ｉｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅに通す。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４にてゲ
ル濾過をし、精製された正常ヒトプロトロンビンを得
た。その最終回収率は、３０〜４０％であった。ここに
得られた正常ヒトプロトロンビンでウサギを免疫し、そ
の抗血清に３５％硫酸アンモニウムを加えて沈澱を得た
後、透析し、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムにか
け、０．０１７Ｍ燐酸緩衝液でイオン交換クロマトグラ
フィーを行なってＩｇＧ分画を得る。ＢｒＣＮで活性化
したＳｅｐｈａｒｏｓｅに精製した正常ヒトプロトロン
ビンを結合し、アフィニティーカラムとする。精製した
ＩｇＧ分画をアフィニティーカラムに通し、結合した抗
体を４Ｍ塩酸グアニジンで溶出して抗ヒトプロトロンビ
ンウサギＩｇＧ抗体を得る。透析して塩酸グアニジンを
除去した後、トロンビンアフィニティーカラムに通し
て、素通り分画を採取する。このようにして精製した抗
体を、トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体と
する。
を更に具体的に説明する。 実施例１． トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体の作成 新鮮ヒト血漿１リットルに１Ｍ ＢａＣｌ2 を８０ml添
加し、１時間攪拌した後、遠心にてバリューム沈澱を回
収する。０．２Ｍ ＥＤＴＡ ２００mlを加えて２時間
攪拌後、硫酸アンモニウムにて２５〜６５％飽和分画を
採取する。０．１Ｍ燐酸緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌにて０Ｍ〜０．６Ｍ ＮａＣｌ分画を行
なう。プロトロンビン画分を集め、透析後、Ｈａｐａｒ
ｉｎ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅに通す。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４にてゲ
ル濾過をし、精製された正常ヒトプロトロンビンを得
た。その最終回収率は、３０〜４０％であった。ここに
得られた正常ヒトプロトロンビンでウサギを免疫し、そ
の抗血清に３５％硫酸アンモニウムを加えて沈澱を得た
後、透析し、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムにか
け、０．０１７Ｍ燐酸緩衝液でイオン交換クロマトグラ
フィーを行なってＩｇＧ分画を得る。ＢｒＣＮで活性化
したＳｅｐｈａｒｏｓｅに精製した正常ヒトプロトロン
ビンを結合し、アフィニティーカラムとする。精製した
ＩｇＧ分画をアフィニティーカラムに通し、結合した抗
体を４Ｍ塩酸グアニジンで溶出して抗ヒトプロトロンビ
ンウサギＩｇＧ抗体を得る。透析して塩酸グアニジンを
除去した後、トロンビンアフィニティーカラムに通し
て、素通り分画を採取する。このようにして精製した抗
体を、トロンビンと反応しない抗プロトロンビン抗体と
する。
【００１４】実施例２． 酵素標識抗体の作成 トロンビンと反応しない抗プロトロンビン精製抗体５mg
を０．１Ｍ酢酸緩衝液pH４．２で透析した後、ブタ胃・
ペプシン０．２mgを加え３７℃で２４時間インキュベー
トした。pHを７．０にあわせた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ４４カラムにかけて０．１Ｍ酢酸緩衝液pH７．０
でゲル濾過を行ない、Ｆ（ａｂ’）2 を得る。Ｆ（ａ
ｂ’）2 を０．１Ｍ燐酸緩衝液pH６．０に透析した後、
０．１Ｍメルカプトエチルアミン５０μl を添加し３７
BR>℃で９０分間インキュベートした。０．１Ｍ燐酸緩
衝液pH６．０（５mM、ＥＤＴＡ）で平衡化したＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通して透析を行ない、Ｆａｂ
−ＳＨを得た。一方、酵素として西洋ワサビ・ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰと略す）２mgを０．１Ｍ燐酸緩衝液pH
７．０に溶解し、Ｎ−サクシニミジル ｍ−マレイミド
ベンゾエート０．７mg（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に溶解する）を添加し３０℃で６０分間インキュベート
した。０．１Ｍ燐酸緩衝液pH６．０で平衡化したＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通して透析を行ない、マレ
イミド化ＨＲＰを得た。Ｆａｂ−ＳＨとマレイミド化Ｈ
ＲＰとを混合して４℃で一夜間インキュベートし、０．
１Ｍ燐酸緩衝液pH６．５で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ４４カラムにかけてゲル濾過を行ない酵素標識
抗体を得た。
を０．１Ｍ酢酸緩衝液pH４．２で透析した後、ブタ胃・
ペプシン０．２mgを加え３７℃で２４時間インキュベー
トした。pHを７．０にあわせた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ４４カラムにかけて０．１Ｍ酢酸緩衝液pH７．０
でゲル濾過を行ない、Ｆ（ａｂ’）2 を得る。Ｆ（ａ
ｂ’）2 を０．１Ｍ燐酸緩衝液pH６．０に透析した後、
０．１Ｍメルカプトエチルアミン５０μl を添加し３７
BR>℃で９０分間インキュベートした。０．１Ｍ燐酸緩
衝液pH６．０（５mM、ＥＤＴＡ）で平衡化したＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通して透析を行ない、Ｆａｂ
−ＳＨを得た。一方、酵素として西洋ワサビ・ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰと略す）２mgを０．１Ｍ燐酸緩衝液pH
７．０に溶解し、Ｎ−サクシニミジル ｍ−マレイミド
ベンゾエート０．７mg（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
に溶解する）を添加し３０℃で６０分間インキュベート
した。０．１Ｍ燐酸緩衝液pH６．０で平衡化したＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムに通して透析を行ない、マレ
イミド化ＨＲＰを得た。Ｆａｂ−ＳＨとマレイミド化Ｈ
ＲＰとを混合して４℃で一夜間インキュベートし、０．
１Ｍ燐酸緩衝液pH６．５で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ
ＡｃＡ４４カラムにかけてゲル濾過を行ない酵素標識
抗体を得た。
【００１５】実施例３． 測定方法 ＰＩＶＫＡ−IIモノクロンナール体は特開昭６０−６０
５５７号公報に記載されている常法により作成する。こ
の抗体をエンザイムイムノアッセイ用マルチプレートへ
の固相化する方法は同公報記載の常法により行なう。抗
ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体コート固相に１ウエ
ル当り被検検体１００μl を注入し、４℃で一夜間イン
キュベートする。０．０５Ｍトリス一塩酸緩衝液pH７．
５（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で三回洗浄後、酵素標
識抗体１００μl を加えて４℃で１時間インキュベート
する。０．０５Ｍトリス一塩酸緩衝液pH７．５（０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０）で三回洗浄後、ＡＢＴＳ溶液１０
０μlを加えて６０分間静置し、２mMアジ化ナトリウム
１００μl を加えて反応を停止して分光光度計により波
長４０５nmの吸光度を測定する。
５５７号公報に記載されている常法により作成する。こ
の抗体をエンザイムイムノアッセイ用マルチプレートへ
の固相化する方法は同公報記載の常法により行なう。抗
ＰＩＶＫＡ−IIモノクローナル抗体コート固相に１ウエ
ル当り被検検体１００μl を注入し、４℃で一夜間イン
キュベートする。０．０５Ｍトリス一塩酸緩衝液pH７．
５（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で三回洗浄後、酵素標
識抗体１００μl を加えて４℃で１時間インキュベート
する。０．０５Ｍトリス一塩酸緩衝液pH７．５（０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０）で三回洗浄後、ＡＢＴＳ溶液１０
０μlを加えて６０分間静置し、２mMアジ化ナトリウム
１００μl を加えて反応を停止して分光光度計により波
長４０５nmの吸光度を測定する。
【００１６】実施例４． ＰＩＶＫＡ−II陰性健常人血漿および血清試料の測定 ＰＩＶＫＡ−II陰性健常人４０人より同時に血漿試料お
よび血清試料を採取し、それぞれについて実施例３記載
の方法に従いＰＩＶＫＡ−IIの測定を行なった。結果を
図１および図２に示す。図１は血漿試料についてであ
り、ヒトトロンビンと反応する抗体を含む抗ヒトプロト
ロンビン抗体を使用する方法（Ａ）とヒトトロンビンと
反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使
用する本発明の方法（Ｂ）の結果を示す。この測定試薬
の検出限界が０．０６２５AU／mlであるので方法Ａ，Ｂ
いずれの方法によっても健常人血漿試料の場合は検出限
界以下であることを示す。すなわち、健常人はＰＩＶＫ
Ａ−IIは検出されず測定値の高い人はいないという正確
な値を示す。一方図２に示す如く、血清試料の場合は方
法Ｂでは血漿試料と同じく検出限界以下であるが方法Ａ
で同じ健常人でありながら０．０６２５〜０．１３AU／
mlまで分布し高い測定値を示す場合が多く安定した値が
得られない。このように本発明の方法Ｂは血漿試料はも
ちろんのこと血清試料でも測定を可能とし、方法Ａでは
血清試料についてはこれまで言われているように正確な
測定が不可能である。
よび血清試料を採取し、それぞれについて実施例３記載
の方法に従いＰＩＶＫＡ−IIの測定を行なった。結果を
図１および図２に示す。図１は血漿試料についてであ
り、ヒトトロンビンと反応する抗体を含む抗ヒトプロト
ロンビン抗体を使用する方法（Ａ）とヒトトロンビンと
反応する抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使
用する本発明の方法（Ｂ）の結果を示す。この測定試薬
の検出限界が０．０６２５AU／mlであるので方法Ａ，Ｂ
いずれの方法によっても健常人血漿試料の場合は検出限
界以下であることを示す。すなわち、健常人はＰＩＶＫ
Ａ−IIは検出されず測定値の高い人はいないという正確
な値を示す。一方図２に示す如く、血清試料の場合は方
法Ｂでは血漿試料と同じく検出限界以下であるが方法Ａ
で同じ健常人でありながら０．０６２５〜０．１３AU／
mlまで分布し高い測定値を示す場合が多く安定した値が
得られない。このように本発明の方法Ｂは血漿試料はも
ちろんのこと血清試料でも測定を可能とし、方法Ａでは
血清試料についてはこれまで言われているように正確な
測定が不可能である。
【００１７】実施例５． ＰＩＶＫＡ−II陽性肝細胞癌患者血清および血漿試料の
測定 ＰＩＶＫＡ−II陽性肝細胞癌患者２５人より同時に血清
検体および血漿検体を採取し、それぞれについて測定方
法に従って測定を行なった。同時に採取した血清検体と
血漿検体の相関性をプロットした結果を図３および図４
に示す。図３はヒトトロンビンと反応する抗体を含まな
い抗プロトロンビン抗体を使用した試薬による血清検体
と血漿検体の相関性をプロットした結果である。相関係
数は０．９８９であり、傾きは０．９８１であり（図３
中実線を傾き１の直線であり、血清検体と血漿検体をプ
ロットした曲線は点線で示す）、血清検体でも正確な測
定が可能であった。一方、図４はヒトトロンビンと反応
する抗体を含む抗プロトロンビン抗体を使用した結果で
あるが、相関係数は０．９９１と良好であったが、傾き
が０．９４９となり、特に低濃度で血清における定量値
が高くなり、トロンビンの非特異反応をＰＩＶＫＡ−II
の特異反応と同時に測定していることを意味する（図４
中実線は傾き１の直線であり、血清検体と血漿検体をプ
ロットした曲線は点線で示す）。
測定 ＰＩＶＫＡ−II陽性肝細胞癌患者２５人より同時に血清
検体および血漿検体を採取し、それぞれについて測定方
法に従って測定を行なった。同時に採取した血清検体と
血漿検体の相関性をプロットした結果を図３および図４
に示す。図３はヒトトロンビンと反応する抗体を含まな
い抗プロトロンビン抗体を使用した試薬による血清検体
と血漿検体の相関性をプロットした結果である。相関係
数は０．９８９であり、傾きは０．９８１であり（図３
中実線を傾き１の直線であり、血清検体と血漿検体をプ
ロットした曲線は点線で示す）、血清検体でも正確な測
定が可能であった。一方、図４はヒトトロンビンと反応
する抗体を含む抗プロトロンビン抗体を使用した結果で
あるが、相関係数は０．９９１と良好であったが、傾き
が０．９４９となり、特に低濃度で血清における定量値
が高くなり、トロンビンの非特異反応をＰＩＶＫＡ−II
の特異反応と同時に測定していることを意味する（図４
中実線は傾き１の直線であり、血清検体と血漿検体をプ
ロットした曲線は点線で示す）。
【００１８】このように、トロンビンと反応する抗プロ
トロンビン抗体を使用した場合には、血清検体での測定
は不可能であるのに対して、トロンビンと反応しない抗
プロトロンビン抗体を使用することによって血漿と同じ
ように血清検体も使用できる。
トロンビン抗体を使用した場合には、血清検体での測定
は不可能であるのに対して、トロンビンと反応しない抗
プロトロンビン抗体を使用することによって血漿と同じ
ように血清検体も使用できる。
【図１】第二抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体
を含む抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法（Ａ）
とヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロ
トロンビン抗体を使用する方法（Ｂ）によるＰＩＶＫＡ
−II陰性健常人４０人の血漿中ＰＩＶＫＡ−IIの測定
値。
を含む抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法（Ａ）
とヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロ
トロンビン抗体を使用する方法（Ｂ）によるＰＩＶＫＡ
−II陰性健常人４０人の血漿中ＰＩＶＫＡ−IIの測定
値。
【図２】第二抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体
を含む抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法（Ａ）
とヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロ
トロンビン抗体を使用する方法（Ｂ）によるＰＩＶＫＡ
−II陰性健常人４０人の血清中ＰＩＶＫＡ−IIの測定
値。
を含む抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する方法（Ａ）
とヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプロ
トロンビン抗体を使用する方法（Ｂ）によるＰＩＶＫＡ
−II陰性健常人４０人の血清中ＰＩＶＫＡ−IIの測定
値。
【図３】抗トロンビン抗体を含まない抗プロトロンビン
抗体を使用する方法によるＰＩＶＫＡ−II陽性患者の血
漿検体と血清検体の相関。
抗体を使用する方法によるＰＩＶＫＡ−II陽性患者の血
漿検体と血清検体の相関。
【図４】抗トロンビン抗体を含む抗プロトロンビン抗体
を使用する方法による、ＰＩＶＫＡ−II陽性患者の血漿
検体と血清検体の相関。
を使用する方法による、ＰＩＶＫＡ−II陽性患者の血漿
検体と血清検体の相関。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/44 Ａ６１Ｋ 39/44
Claims (5)
- 【請求項１】 生物学的試料中のＰＩＶＫＡ−IIを二抗
体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によって測
定するに当り、第二抗体としてヒトトロンビンと反応す
る抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する
ことを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬。 - 【請求項２】 ヒトトロンビンと反応しない抗ヒトプロ
トロンビン抗体がヒト以外の動物にヒトプロトロンビン
を免疫して得た抗体より抗ヒトトロンビン抗体を除去し
て製造される抗体であることを特徴とする請求項１記載
のＰＩＶＫＡ−IIの測定試薬。 - 【請求項３】 ヒトトロンビンと反応しない抗ヒトプロ
トロンビン抗体がマウスモノクロナール抗体であること
を特徴とする請求項１記載のＰＩＶＫＡ−IIの測定試
薬。 - 【請求項４】 生物学的試料が血漿または血清であるこ
とを特徴とする請求項１記載のＰＩＶＫＡ−IIの測定試
薬。 - 【請求項５】 生物学的試料中のＰＩＶＫＡ−IIを二抗
体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法によって測
定するに当り、第二抗体としてヒトトロンビンと反応す
る抗体を含まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用する
ことを特徴とするＰＩＶＫＡ−IIの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7031891A JP2702616B2 (ja) | 1991-03-12 | 1991-03-12 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7031891A JP2702616B2 (ja) | 1991-03-12 | 1991-03-12 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05249108A JPH05249108A (ja) | 1993-09-28 |
| JP2702616B2 true JP2702616B2 (ja) | 1998-01-21 |
Family
ID=13427986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7031891A Expired - Lifetime JP2702616B2 (ja) | 1991-03-12 | 1991-03-12 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2702616B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6893831B1 (en) | 1999-12-14 | 2005-05-17 | Sanko Junyaku Co., Ltd. | Immunoassay of PIVKA-II |
| CA2834432C (en) * | 2011-05-23 | 2020-01-07 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method of inhibiting nonspecific reaction in pivka-ii assay reagent |
| JP6032470B2 (ja) | 2012-08-09 | 2016-11-30 | 富士レビオ株式会社 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉ測定方法、測定試薬及び測定キット |
| KR102549704B1 (ko) | 2015-10-07 | 2023-06-30 | 후지레비오 가부시키가이샤 | Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법 |
-
1991
- 1991-03-12 JP JP7031891A patent/JP2702616B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05249108A (ja) | 1993-09-28 |
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|---|---|---|---|
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