JP3121166B2 - 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉモノクロナ−ル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【0001】

【産業上の利用分野】本発明は人肝細胞培養細胞株が産
生するPIVKA-IIを抗原としその抗原と反応するモノクロ
−ナル抗体の作製とその抗体を用いて生物学的試料中の
PIVKA-IIを測定する測定試薬に関する。

【0002】

【従来の技術】PIVKA-IIはビタミンK 依存性血漿蛋白質
の一つであるプロトロンビンの前駆物質であって、アミ
ノ末端領域にある10個のグルタミン酸残基についてのγ
−カルボキシル化の程度が不完全なものを言う。当該カ
ルボキシル化の程度が完全なものを正常プロトロンビン
という。従って、PIVKA-IIとは正常プロトロンビンのγ
−カルボキシグルタミン酸残基についての脱カルボキシ
ル化体であるということもでき、PIVKA-IIという名称以
外に異常プロトロンビン（Abnormal prothrombin）と呼
ばれることもある。10個のグルタミン酸残基中いくつか
がγ−カルボキシル化を受けるかにより数種類のPIVKA-
IIが混在した状態で存在している。本発明は主として生
物学的試料中のPIVKA-IIの測定を目的としているので、
本発明におけるPIVKA-IIとは、特にことわらない限り、
数種類のPIVKA-IIの混在状態を言う。10個のグルタミン
酸残基についてのカルボキシル化の程度が完全なものを
正常プロトロンビンと言う。

【0003】PIVKA-II測定の臨床的な有用性については、ビ
タミンK の不足状態あるいは抑制状態において当該γ−
カルボキシル化が不完全となり、その結果PIVKA-IIが血
液中に出現するので、ビタミンK の不足状態あるいは抑
制状態のマーカーとしてその測定は臨床上重要である。
PIVKA-IIとはProtein induced by vitamin K absence-I
I の略称であり、これは上記生理的観点に基づいて命名
されたものである。また最近では、肝細胞癌に伴って血
液中にPIVKA-IIが出現することが見いだされ、従来肝細
胞癌の良いマーカーとされているα−フェトプロテイン
が陰性の肝細胞癌患者においてもPIVKA-IIが高頻度に出
現することにより、α−フェトプロテインと同等の臨床
的な有用性が認められている。PIVKA-IIとビタミンK お
よび肝細胞癌との関連について参考のために下記文献1)
から3)を列挙する。 1)Motohara K. Kuroki Y. Kan H. Endo F. Mtsuda I.、
Detection of vitaminK deficiency by use of an enz
yme-linked immunosorbent assay for circulating ab
normal prothrombin. Pediatric Research.，19,354-7,
1985 ． 2)Okuda H. Obata H. Nakanishi T. Furukawa R. Hashi
moto E., Production ofabnormal prothrombin (des-γ
-carboxyprothrombin)by hepatocellular carcinoma.,J
ournal Hepatology,4,357-63,1987 ． 3)Hattori N. Ohmizo R. Unoura M. Tanaka N. Kobayas
hi K.,Abnormal prothrombin measurements in hepatoc
ellular carcionama., Journal of Tumor markeroncolo
gy,3,207-16,1988．

【0004】PIVKA-IIの測定方法としては、ポリクローナル
な抗PIVKA-II抗体を使用した競合ラジオイムノアッセイ
法(Blanchard R. et al. Acquired vitamin K-dependen
t carboxylation deficiency in liver disease. The N
ew England Journal ofMedicine.,305,242-8,1981) あ
るいは正常プロトロンビンを吸収後、残存するPIVKA-II
のトロンビン活性を測定する方法(Soulier J. et al.,
A new method toassay des-γ-carboxyprothrombin., G
astroenterology, 91:1258-62,1986)などが報告されて
いるが、いずれも材料の調製が繁雑であったり、測定系
が複雑であったりして多数の臨床検体を扱う臨床検査の
場においては実用的ではない。これらの方法に対して、
抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用した特異的なPIVK
A-II測定方法（特開昭60-60557号）は非常に簡便であ
り、しかも正確に多数の検体が測定できるという特徴を
持っており、現在その方法を使用した測定試薬が唯一の
PIVKA-II測定診断薬として広く利用されている。

【0005】特開昭60ー60557号の抗PIVKA-IIモノクローナル
抗体は、ビタミンＫ拮抗剤を投与した患者の血漿中から
PIVKA-IIを精製し、それを免疫用抗原としてマウスに免
疫してPIVKA-IIに対するモノクローナル抗体を作製し
た。

【0006】特開昭60ー60557号の抗PIVKA-IIモノクローナル
抗体を使用した特異的なPIVKA-II測定方法は非常に簡単
であり、しかも正確に多数の検体が測定できるという特
長を持っており、現在その方法を使用した測定試薬が唯
一のPIVKA-II測定診断薬として広く利用され、肝細胞癌
の診断および経過観察に使用されている。

【0007】

【発明が解決しようとする課題】特開昭60ー60557号の抗
PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用した特異的なPIVKA-
II測定方法によると、肝細胞癌の陽性率は52.9% であっ
た。（服部信、臨床と研究、65巻3 号249 〜258 頁1988
年）本発明者らは、特開昭60ー60557号で使用しているモ
ノクローナル抗体と特性の異なる抗体を作製し、測定試
薬を構成することにより肝細胞癌での陽性率を上昇させ
ることを目的に検討し、本発明を完成した。

【0008】

【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体を作製するための免疫用抗原であるPIVKA-IIを従
来のごとくビタミンＫ拮抗剤投与患者血中から精製する
のではなく人肝細胞培養細胞株から得ることにある。す
でにこの人肝細胞培養株がPIVKA-IIを産生することは報
告されている（奥田博明、肝胆膵第14巻第5 号1987年5
月759 〜766 頁）

【0009】人肝細胞培養細胞株からPIVKA-IIを精製しこれ
を免疫源としてマウスに投与し常法に順じマウス脾臓細
胞とマウスミエロ−マ細胞とを細胞融合させ、プロトロ
ンビンと反応せずPIVKA-IIとのみ特異的に反応するモノ
クロ−ナル抗体を産生するハイブリドーマクロ−ンを確
立する。また、確立したハイブリドーマクローンをマウ
ス腹腔内に投与することにより腹水を得、腹水よりIgG
を精製する。得られたIgG を第一抗体に、第二抗体に抗
プロトロンビン抗体の二抗体法免疫測定法により生体試
料中のPIVKA-IIを測定する。

【0010】以下に本発明を詳細に説明する。モノクローナ
ル抗体の作製のための免疫用抗原であるPIVKA-IIの精製
はPIVKA-II産生人肝培養細胞株の培養上清を硫安塩析、
DEAE-Sephacel 、Heparin-Sepharose 、Blue-Sepharos
e、Ultrogel AcA44のゲル濾過およびプロトロンビンア
フィニテイ −カラムにて得た。

【0011】抗PIVKA-IIモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ細胞の作製は、精製PIVKA-IIをマウスに免疫しその
脾臓細胞を採取し、Koehler G.等の方法(Koehler G.Mil
stein C.,Deviation of specific antibody-producting
culture and tumor lines by cell fusion., Eur. J.
Immunol.,6,511-9,1976)によりミエローマ細胞株P3U1と
細胞融合、クローニングを行い、プロトロンビンと反応
せず免疫用抗原PIVKA-IIとのみ反応する抗 PIVKA-II抗
体産生ハイブリドーマ細胞株を確立した。

【0012】抗PIVKA-II抗体産生ハイブリドーマ細胞株をマ
ウスに投与し、腹水を得た後、腹水よりProtein A にて
IgG を精製する。

【0013】本発明によるPIVKA-II測定法は、酵素免疫測定
法、ラジオイムノアッセイ法あるいはその他の測定法に
よる二抗体サンドイッチ法を原理とし抗体としては、第
一抗体に抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用し、第二
抗体にはPIVKA-IIとプロトロンビンの共通抗原に対する
抗体（抗プロトロンビン抗体と呼ぶ）を使用して生体試
料中のPIVKA-IIを測定する。

【0014】次に本発明における二抗体サンドイッチ法を利
用する測定法は例えば次のように実施される。なお、こ
こでは酵素免疫測定法の場合を示すが、ラジオイムノア
ッセイ法あるいはその他の方法においても本発明が使用
できることは言うまでもない。本発明測定試薬の具体的
態様を示せば次の如くになる。すなわち、本発明測定試
薬はヒトトロンビンと反応する抗体を含まない抗ヒトプ
ロトロンビン抗体を必須の構成成分とし、モノクローナ
ル抗PIVKA-II抗体（単独または固相化したもの）、標準
抗原、酵素及び基質よりなる群より任意に選択したもの
を組み合わせたもののセットである。ここにおいて、セ
ット中に固相が含まれる場合に当該固相がモノクローナ
ル抗PIVKA-II抗体によってコートされた状態で提供され
ること、あるいはセット中に抗ヒトプロトロンビン抗体
と酵素とが含まれる場合に、両者がコンジュゲートした
状態で提供されることは自由であり、これらも同様に本
発明測定試薬の態様に含まれる。また測定の実施の便益
のために適当なる抗原希釈液、反応希釈液、基質溶解
液、反応停止液等がセット中に添付されることも自由で
あり、これらは本発明を限定するものではない。測定は
抗PIVKA-IIモノクローナル抗体コート固相体に標準抗原
または被検生物学的試料（血液、血漿または血清）を加
えてインキュベートする。固相体を洗浄後、酵素標識抗
プロトロンビン抗体（トロンビンと反応しない）を加え
て再びインキュベートし、洗浄し、最後に基質を加えて
インキュベート後、基質の分解量を分光光度計を用いて
測定する。後記実施例によって示されるごとく、本発明
測定試薬によってはじめて従来の測定感度の30倍の感度
でのPIVKA-II測定が可能となる。

【0015】

【発明の効果】本モノクローナル抗体及びそれを用いた
PIVKA-II測定試薬で測定することにより、従来のPIVKA-
II測定試薬で測定できなかったPIVKA-II抗原が30倍の測
定感度で測定可能となる。

【0016】

【実施例】以下に記載する実施例をもって本発明の効果
を更に具体的に説明する。 実施例１ 人肝細胞培養株の細胞培養とPIVKA-IIの精製 人肝細胞の培養細胞株をワルファリンカリウム10ug/ml
を含むMEM 培地で培養しその上清を採取する。培養上清
中のPIVKA-IIの精製は、40リットルの培養上清に4M飽和
硫安を等量加え、2 時間撹拌後遠心分離した。沈澱物を
0.1Mリン酸緩衝液で溶解し透析した。DEAE-Sephacel に
て0M〜0.6M NaCl 分画を行い、PIVKA-II画分を集め透析
後Heparin-Sepharose およびBlue-Sepharoseに通す。Ul
trogel AcA44にてゲル濾過およびプロトロンビンアフィ
ニテイ −カラムでPIVKA-IIを作製した。その最終回収率
は、10% であった。

【0017】実施例２ 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞
株の確立 精製PIVKA-IIをマウスに12.5ug/ 匹で5 回免疫をし、そ
の脾臓細胞を採取して、Koehler G.等の方法(Koehler
G. Milstein C. Deviation of specific antibody pro
ducting culture and tumor lines by cell fusion., E
ur. J. Immunol.,6, 511-9,1976)によりミエローマ細胞
株P3U1と細胞融合し、限界希釈法により3 クローニング
を行い、プロトロンビンと反応せず免疫用抗原であるPI
VKA-IIとのみ反応する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマP19B7 を細胞株として確立した。

【0018】実施例３ 測定法 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体をエンザイムイムノアッ
セイ用マルチプレ−トへの固相化する方法は特開昭60-6
0557記載の常法により行う。このようにして得られた抗
PIVKA-IIモノクロ−ナル抗体コ−ト固相に1 ウエル当り
被検検体100ulを注入し、4 ℃で一夜間インキュベ−ト
する。0.05M トリス−塩酸緩衝液pH7.5(0.05%Tween20)
で 3回洗浄後抗プロトロンビン抗体に酵素を標識した酵
素標識抗体を100ul を加えて4 ℃で1 時間インキュベ−
トする。0.05M トリス−塩酸緩衝液pH7.5 (0.05%Tween2
0)で3 回洗浄後、 ABTS 溶液100ul を加えて60分静置
し、2mM アジ化ナトリウム100ul を加えて反応を停止し
て分光光度計により波長405nm の吸光度を測定する。こ
の方法により測定した標準曲線を図１に示す。健常人8
例を測定したところ0.002AU/ml以下であったのでこの測
定試薬の検出限界は0.002AU/mlである（図２）。

【図１】

【図２】

【0019】実施例４ 得られたモノクローナル抗体の特性 モノクローナル抗体をマイクロカップに固相化し、実施
例3 記載の方法に従いPIVKA-II陽性血漿を利用してモノ
クローナル抗体の特性比較を行った。結果を図３に示
す。本発明により得られたモノクローナル抗体は特開昭
60-605575 号記載のモノクローナル抗体に比べ活性が10
倍高い。

【図３】

【0020】実施例５ 肝疾患患者血清中のPIVKA-IIの測定 肝疾患患者214 人より得られた血清を特開昭60-605575
号記載のモノクローナル抗体を使用したPIVKA-II測定試
薬と本測定試薬により、PIVKA-II測定値を比較した。そ
の結果を図２に示す。本発明によるモノクローナル抗体
は、従来のPIVKA-II測定試薬で測定できなかったPIVKA-
IIが測定でき、陽性率は28.3％上昇した（表-1）。また
従来のPIVKA-II測定試薬とはr2=0.252と相関しなかった
（図４）。

【図４】

【表１】

【0021】このように、ヒト肝細胞培養細胞株が産生する
PIVKA-IIを用いて抗PIVKA-IIモノクローナル抗体の作成
ができた。また、特開昭60-605575 号の抗PIVKA-IIモノ
クローナル抗体に比較して反応性が約30倍高く、従来の
PIVKA-II測定試薬で測定されなかったPIVKA-IIがこの抗
体により測定可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明により作製したモノクローナル抗体を使
用した測定試薬の標準曲線

【図２】肝疾患患者検体中のPIVKA-IIの測定分布図

【図３】モノクローナル抗体間の活性比較

【図４】特開昭60-605575 合記載のモノクローナル抗体
を使用した測定試薬及び本発明によるPIVKA-II測定試薬
間のPIVKA-II測定値の相関

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−60557（ＪＰ，Ａ) 奥田博明ら「肝臓」第28巻 第２号 270頁 ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ 49，6493−6497，1989

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体試料中のＰＩＶＫＡ−IIの免疫化学的
   測定試薬であって、人肝癌細胞培養細胞株より精製した
   ＰＩＶＫＡ−IIを抗原として作製した抗ＰＩＶＫＡ−II
   モノクローナル抗体を用いることを特徴とするＰＩＶＫ
   Ａ−IIの測定試薬。
2. 【請求項２】人肝癌細胞培養細胞株がPLC/PRF/5、huH-
   1、huH-2、HepG2またはHep3Bである請求項１に記載のＰ
   ＩＶＫＡ−IIの測定試薬。