JPH0875737A - ヒト前立腺特異抗原とヒトプロテインｃインヒビターとの複合体の測定方法および同測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト血液を試料として、ヒト血中のヒト前立
腺特異抗原とヒトプロテインＣインヒビターとの複合体
を測定する方法であって、ヒト前立腺特異抗原に対する
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とヒトプロ
テインＣインヒビターに対するモノクローナル抗体とを
用いて、二抗体サンドイッチ法により免疫測定法によっ
て測定するヒト血中のヒト前立腺特異抗原とヒトプロテ
インＣインヒビターとの複合体の測定法および測定用キ
ット。 【効果】 ヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の濃度を簡
単な操作で精度良く測定することができる方法を提供す
るものであり、前立腺肥大症の診断を可能にし、さら
に、既存の前立腺癌における最も有用な腫瘍マーカーと
して用いられているＰＳＡの測定と本発明方法によるＰ
ＳＡ・ＰＣＩの測定とを併せ行うことにより前立腺肥大
症と前立腺癌とを鑑別することを可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明はヒト血中のヒト前立腺特異抗原
（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ：以下ＰＳＡと略記する）とヒトプロテインＣインヒ
ビター（以下、ＰＣＩと略記する）の複合体（以下、Ｐ
ＳＡ・ＰＣＩ複合体と略記する）の測定方法に関するも
のであり、さらに詳しくは、前立腺肥大症と前立腺癌と
を鑑別するために極めて重要な役割を果たすヒト血中の
ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体を測定する方法に関する。

【０００２】

【背景技術】ヒトの前立腺は、ほぼ５０才代において萎
縮性変化が起こり、尿道周囲の腺（内腺）に繊維筋性ま
たは腺性の小結節が出現し、しだいに大きな結節を形成
するようになる。このような結節の形成により前立腺は
しだいに大きくなり前立腺肥大症となる。結節の形成は
加齢とともに増加する。前立腺肥大症に関しては、通
常、直腸内指診、残尿量測定、Ｘ線検査、内視鏡検査、
超音波検査等により診断が行われているが、前立腺肥大
症に特異的な生化学的検査方法は未だ見出されておら
ず、したがって、血液等を検体とする簡便な検査方法が
求められている。

【０００３】また、前立腺癌は尿路腫瘍の中でも最も頻
度の高い癌種であり、抗男性ホルモン療法が一時的に奏
功するものの、不応性となると以後の治療に難渋する疾
患であるので、早期発見と根治療法が必要である。その
ため、住民検診や一般健康診断におけるこの疾患につい
てのスクリーニングの導入が切望されている。この疾患
を効率良く診断する手段として腫瘍マーカーが用いられ
ている。現在、使用されている前立腺癌マーカーはＰＳ
Ａであり、このＰＳＡは、前立腺癌診断について高い感
度があり、前立腺癌に関する最も有用な腫瘍マーカーと
して実用化されている。しかしながら、ＰＳＡは前立腺
癌に対して高い感度を有する反面、前立腺肥大症に対し
ても、ある感度を示すため、これのみでは単なる前立腺
肥大症と前立腺癌の鑑別ができない。したがって、前立
腺肥大症と前立腺癌の鑑別を可能とする臨床検査方法
が、切に要望されている現状にある。

【０００４】本発明者らは、前立腺肥大症に特異的で前
立腺肥大症と前立腺癌とを鑑別、診断し得る生化学的検
査方法を探求したところ、ヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複
合体を精度よく測定することにより、前記の前立腺肥大
症と前立腺癌とを鑑別するための指標が得られることを
見出した。

【０００５】

【発明の開示】本発明は、ヒト血液を試料として、ヒト
血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合体を測定する方法であって、
ＰＳＡに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル
抗体とＰＣＩに対するモノクローナル抗体とを用いて、
二抗体サンドイッチ法により酵素免疫測定法によって測
定することを特徴とするヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合
体の測定法を提供するものである。前述したように、従
来、ヒト血中のＰＳＡ測定は、その測定が前立腺癌で高
い数値を示すことより、前立腺癌の最も有用な指標の一
つとされているが、ＰＳＡは、正常前立腺、前立腺肥大
症、前立腺癌のいずれにおいても同様に、前立腺組織
（前立腺上皮）及び精漿中に局在していることから、そ
の測定値は必ずしも前立腺癌に特異的なものとはいえな
い。また、ＰＳＡ濃度は前立腺肥大症においても前立腺
癌においても前立腺組織の重量に相関し、この両疾患に
おいて高い数値を示すが、その測定のみでは前立腺肥大
症と前立腺癌とを鑑別することは困難であり、当該技術
分野において両疾患の鑑別ができる指標となる生化学的
検査方法の開発が切望されていた。

【０００６】本発明によるＰＳＡ・ＰＣＩ複合体測定方
法によれば、前立腺に対する特異性は高く、前立腺肥大
症でのみ高い数値を示し、健常者および前立腺癌患者で
は低い値を示すことから、従来、ＰＳＡ測定のみでは困
難であった前立腺肥大症と前立腺癌との鑑別を容易に行
うことができるものである。すなわち、ＰＳＡ濃度が高
い値を示し、ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体濃度が高い値を示す
場合には前立腺肥大症が疑われ、ＰＳＡ濃度が高い値を
示し、ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体濃度が低い値を示す場合に
は前立腺癌が疑われることとなる。このように本発明の
測定法によれば、これまでＰＳＡ測定のみでは困難とさ
れていた前立腺肥大症と前立腺癌との鑑別を容易ならし
め、前立腺癌の診断における指標として極めて有用なも
のである。

【０００７】本発明による、ヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ
複合体の測定方法は、ＰＳＡに対するポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体とＰＣＩに対するモノクロー
ナル抗体とを用いて、二抗体サンドイッチ法により酵素
免疫測定法によって測定することを特徴とする。本発明
方法の代表的サンドイッチ法としては、次の方法があげ
られる。すなわち、ヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合体
を、二抗体サンドイッチ法を利用する酵素免疫測定法に
よって測定するにあたり、固相化抗体としてＰＳＡに対
するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を
使用し、酵素標識抗体用としてＰＣＩに対するモノクロ
ーナル抗体を使用することを特徴とするヒト血中のＰＳ
Ａ・ＰＣＩ複合体の測定法である。以下に本発明を詳細
に説明する。

【０００８】本発明方法に使用される抗ＰＳＡ抗体は、
ポリクローナル抗体または、モノクローナル抗体のいず
れでもよく、Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．：Ｉｎ
ｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．，１７，１５９（１９７９）記載
の方法により精製したＰＳＡを抗原として常法により製
造することができる。また、市販の抗ＰＳＡポリクロー
ナル抗体または、抗ＰＳＡモノクローナル抗体を使用す
ることもできる。これら抗体のうち、ＰＳＡ・ＰＣＩ複
合体と結合することのできるものを選択する。

【０００９】本発明方法に使用される抗ＰＣＩモノクロ
ーナル抗体はたとえば次のようにして製造される。ヒト
血漿にバリウム塩を加え、ＰＣなどのビタミンＫ依存性
蛋白質を除き、その上清にＰＥＧ−６０００を加え、そ
の沈殿を集め、溶出し、硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ，Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔ
ｅ Ａｇａｒｏｓｅ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−４４，ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌ，ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙによりＰＣＩ
を精製する。精製方法はＳｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，１６３（１
９８３）に詳細に述べられている。

【００１０】このようにして得られた精製ＰＣＩをフロ
イント完全アジュバンドと共にＢａｌｂ／ｃマウスの腹
腔内に投与した後、脾臓細胞を摘出し、ミエローマ細胞
株と脾臓細胞をＯｉ ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ
（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．
Ａ．，Ｉｎ：Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．ａｎｄ Ｓｈｉ
ｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ：ＷＨ Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，３５１，１９８０）の方法
により細胞融合を行う。次に限界希釈法によりＰＣＩと
反応するハイブリドーマをクローニングし、抗ＰＣＩ抗
体産生セルラインを確立し、抗ＰＣＩモノクローナル抗
体を得ることができる。このモノクローナル抗体のうち
ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体と結合することのできるものを選
択する。

【００１１】次に、本発明における二抗体サンドイッチ
法を利用するＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の酵素免疫測定法の
詳細を述べる。測定系全体の構成要素は固相担体、固相
コート用の抗ＰＳＡ抗体（固相）、標準抗原、標識用抗
ＰＣＩモノクローナル抗体（標識抗体）、酵素および基
質である。抗体はそのまま、もしくは抗体をペプシンで
消化して得られたＦ（ａｂ′）_２、Ｆ（ａｂ′）_２を還
元して得られたＦａｂ′および抗体をパパインで消化し
て得られたＦａｂなどの、抗原に結合する抗体フラグメ
ントを抗体として、また、これらを標識して標識抗体と
して使用することができる。

【００１２】固相担体は一般にイムノアッセイ用に用い
られる固相担体が使用される。その形状は、ボール状、
プレート状、棒状、角状、その他任意の形状であっても
よく、ゲル濾過に用いる担体、例えばセファロース４Ｂ
等でもよい。担体の材質は、ポリスチレン、ポリアセテ
ート、ポリカーボネート、アクリロニトリル−ブタジエ
ン−スチレン共重合体等のプラスチック、セルロース等
の紙類、その他イムノアッセイに従来使用されている任
意の材料でよい。また、当該固相に抗体を結合させるに
は、物理化学的な吸着あるいは化学的に結合させる等の
既知の技術によって達成できる。

【００１３】標識抗体は、抗体を^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５
Ｉ、^１３１Ｉ、等の放射性同位元素、ペルオキシダー
ゼ、アルカリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、等の酵素、フルオレッセイン、ローダミンＢ、等の
蛍光物質、イソミノール誘導体等の発光物質等、当該分
野で一般的に用いられている標識剤で常法により標識す
ることにより得られる。基質は選択した酵素に応じて適
宜使用すればよい。例えば酵素として、アルカリ性フォ
スファターゼを選択した場合においてｐ−ニトロフェニ
ルフォスフェートを、また、ペルオキシダーゼを選択し
た場合においてはｏ−フェニレンジアミン、あるいはＡ
ＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３′−エチルベンゾ
チアゾリンスルホン酸））を発色剤として使用し、過酸
化水素を基質として使用すればよい。

【００１４】次に、固相抗体および標識抗体を用いた本
発明の実施方法を簡単に説明する。先ず、測定すべき試
料を一定量反応容器にとり、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ウシγ−グロブリンまたは動物血清を０．１〜５
％、好ましくは０．５〜２％ＢＳＡを含む緩衝液を一定
量加えて混和する。この場合の緩衝液は、０．０１〜
０．０５Ｍのホウ酸緩衝液，ｐＨ７．２〜９．０、０．
０１〜０．５Ｍのリン酸緩衝液，ｐＨ５．２〜８．５、
０．０１〜０．５Ｍのベロナール緩衝液，ｐＨ６．８〜
９．６、０．０１〜０．５Ｍのトリス−塩酸緩衝液，ｐ
Ｈ７．２〜９．１等の緩衝液、あるいは０．０５〜０．
５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５〜０．５Ｍの塩化カリ
ウム等の塩を含む上記緩衝液を使用する。次に、試料と
緩衝液の混合液に抗体結合固相を加え、一定時間反応さ
せる。反応後、抗体結合を場合により洗浄してから、上
記の緩衝液に溶解した標識抗体と抗体結合を一定時間反
応させる。反応後、抗体結合を洗浄してから、抗体結合
固相に結合している標識抗体の標識剤の量を検出するこ
とにより、ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の量を知ることができ
る。

【００１５】次に、本発明の測定用キットは、本発明の
測定方法の実施に直接使用するためのものであり、本発
明測定試薬キットの具体的仕様を示せば次の如くなる。
即ち、本測定用キットは固相用抗ＰＳＡ抗体、酵素標識
抗ＰＣＩモノクローナル抗体を必須の構成要素として含
み、該キット中には、任意に測定の実施の便益のために
適当なる標準抗原、抗原希釈用液、反応用液、基質、基
質溶解液、反応停止液等が添付される。これらは本発明
を限定するものではない。後記実験例によって示される
ごとく、本発明の測定方法によってヒト血中のＰＳＡ・
ＰＣＩ複合体を精度よく測定することが可能であり、既
存の前立腺癌における最も有用な腫瘍マーカーとして用
いられているＰＳＡの測定と、本発明方法によるＰＳＡ
・ＰＣＩ複合体の測定とを併用して、ＰＳＡ濃度が高い
値で、ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体濃度も高い値である場合に
は前立腺肥大症が疑われ、ＰＳＡ濃度が高い値でＰＳＡ
・ＰＣＩ複合体濃度が低い値の場合には前立腺癌が疑わ
れる。このようにして、前立腺肥大症と前立腺癌とを鑑
別し診断することができる。

【００１６】本発明の効果は、次のごとく要約される。
本発明は、ヒト血中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の濃度を簡
単な操作で精度良く測定することができる方法を提供す
るものであり、前立腺肥大症の診断を可能にし、さら
に、既存の前立腺癌における最も有用な腫瘍マーカーと
して用いられているＰＳＡの測定と本発明方法によるＰ
ＳＡ・ＰＣＩ複合体の測定とを併せ行うことにより前立
腺肥大症と前立腺癌とを鑑別することを可能とするもの
である。以下に記載する実施例をもって本発明を更に具
体的に説明する。

【００１７】

【実施例】

実施例１ （１） 抗体結合固相の調製 抗ＰＳＡポリクローナル抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｓｉｔｅ社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液，ｐＨ９．３で
１３μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウエルマイクロプレート
に１ウエルにつき１００μｌずつ注入し、４℃で一夜放
置した後、０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ
及び、０．０２％チメロサール含有０．０５Ｍトリス−
塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で３回洗浄後、２％牛血清アル
ブミン及び、０．５％ゼラチン含有、リン酸緩衝液，ｐ
Ｈ７．５を１５０μｌ注入して室温で２時間放置し、前
記緩衝液で３回洗浄して、抗体結合固相とした。

【００１８】（２） 酵素標識抗体の調製 １） 精製ＰＣＩの調製 新鮮血漿４リットルに１０ｍＭ塩酸ベンザミン、１ｍＭ
フルオロリン酸イソブチル（ＤＦＰ）、１ｍＭフッ化フ
ェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び、５０ｍｇ／
リットル ダイストリプシンインヒビターを加え、１Ｍ
ＢａＣｌ_２を３２０ｍｌ滴下した。

【００１９】以下の操作は、すべて４℃で行った。１時
間撹拌後、５０００回転で３０分間遠心し、上清を採取
し固相ＰＥＧ−６０００を６０ｇ／リットル加えた。１
時間撹拌後沈殿を５０００回転で１５分間遠心し、沈殿
を破棄した。更に上清に固形ＰＥＧ−６０００を６０ｇ
／リットル加え、１時間撹拌後、５０００回転で３０分
間遠心し、沈殿を採取した。沈殿に０．１Ｍ ＮＨ_４Ｃ
ｌ、１０ｍＭ塩酸ベンザミン、１ｍＭ ＤＦＰ及び、１
ｍＭ ＰＭＳＦ含有０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐ
Ｈ７．５を５００ｍｌ加えて溶解した。溶解に使用した
緩衝液と同一の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ＣＬ−６８カラムにかけ、素通り画分を採
取した。採取液に硫酸アンモニウム粉末を加えて５０％
飽和とし、１時間撹拌後、８０００回転で１５分間遠心
し、上清を採取した。更に硫酸アンモニウム粉末を加え
て７０％飽和とし、１時間撹拌後、８０００回転で３０
分間遠心し、沈殿を採取した。沈殿に０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ塩酸ベンザミン、０．１ｍＭ ＤＦＰ及び、
０．１ｍＭ ＰＭＳＦ含有０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝
液，ｐＨ７．５を加えて溶解し、同一緩衝液に対して透
析した。Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ａｇａｒｏ
ｓｅカラムにかけ、ＰＣＩ画分に硫酸アンモニウム粉末
を加えて７０％飽和とした。１００００回転で１５分間
遠心し沈殿を採取し、溶解可能な最小液量の０．１５Ｍ
ＮａＣｌ含有０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ
７．５に溶解した後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４
カラムにかけ、ＰＣＩ画分を０．０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液，ｐＨ９．０に透析した。透析後、０．０５Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液，ｐＨ９．０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌ（０．５×１０ｃｍ）にかけ、０．０５
Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ９．０でよく洗浄した後、
０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を持つ溶出液で溶出
し精製ＰＣＩを得た。その最終回収率は１０％であっ
た。

【００２０】２） 抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調製 精製ＰＣＩ ５０μｇを同容量のフロイント完全アジュ
バンドと共に２匹のＢａｌｂ／ｃマウス（メス、８週
齢）の腹腔内に投与し、更に各５０μｇを１６、５２日
目に各々腹腔内、尾静脈へ投与した。３日後に脾臓細胞
を摘出し、ミエローマ細胞株ＳＰ−２／０−Ａｇ１４と
細胞融合した。細胞融合はポリエチレングリコール４０
００を用いてＯｉ ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇの方
法（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ａｎｄ Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，
Ｌ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．ａｎｄ Ｓ
ｈｉｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ：ＷＨ
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，３５１，１９８０）で
行った。次に９６ウエルマイクロプレートを用いて限界
希釈法によりＰＣＩと反応するハイブリドーマをクロー
ニングし、抗ＰＣＩ抗体産生セルライン（１５クロー
ン）を確立した。得られた各クローンをプリスタン処理
Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与（１×１０^７細胞／マウス）
し、１〜２週間後にそれらの腹水を採取した。次にＩｇ
Ｇｌ／κ抗体に関して各腹水を４０％飽和硫安分画、プ
ロテインＡ−セルロファインカラムクロマトグラフィー
操作で精製した。得られた精製抗体（クローン番号１６
０−１２Ｂ５）をサンドイッチＥＩＡ系の酵素標識用抗
体として用いた。

【００２１】３） ＨＲＰ標識抗ＰＣＩモノクローナル
抗体の調製 得られた抗ＰＣＩ抗体５ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．２で透析した後、ブタ胃・ペプシン０．２ｍｇを
加え３７℃で２４時間インキュベートしｐＨを７．０に
合わせた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−４４カラムに
かけて０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０でゲル濾過を
行い、Ｆ（ａｂ′）_２を０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ
６．０に透析した後、０．１Ｍメルカプトエチルアミン
（０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ５０ｍｌを添加し３７℃で９０分間インキュベート
した。５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐ
Ｈ６．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ２５カラ
ムに通して透析を行いＦａｂ−ＳＨを得た。一方酵素と
して西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰと略す）２
ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０に溶解し、
Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
−シクロヘキサン−１−カルボキシレート０．７ｍｇ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解する）を添加し
３０℃で６０分間インキュベートした。０．１Ｍリン酸
緩衝液，ｐＨ６．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５カラムに通して透析を行い、マレイミド化ＨＲＰ
を得た。Ｆａｂ−ＳＨとマレイミド化ＨＲＰとを混合し
て４℃で一夜間インキュベートし、０．１Ｍリン酸緩衝
液，ｐＨ６．５で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
−４４カラムでゲル濾過を行いＨＲＰ標識抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体を得た。

【００２２】（３） 検体の調製 血清検体を０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％牛血清アルブ
ミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ
及び、０．０２％チメロサール含有０．０５Ｍトリス−
塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で５倍希釈したものを被検検体
とした。

【００２３】（４）検体の測定 前記（１）における抗体結合固相に１ウエル当たり前記
（３）の被検検体１００μｌを加え、室温で２時間イン
キュベートする。０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％牛血清
アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＮ Ｅ
ＤＴＡ及び、０．０２％チメロサール含有０．０５Ｍト
リス−塩酸緩衝，ｐＨ７．５で３回洗浄後、前記（２）
における酵素標識抗体１００μｌを加えて室温で６０分
間インキュベートする。０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１％
牛血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び、０．０２％チメロサール含有０．０
５Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で３回洗浄後、
１．３３ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンチジン及び、０．
０３％過酸化水素含有クエン酸緩衝液，ｐＨ４．６５、
１００μｌを加えて室温に３０分間放置し、１Ｎ硫酸５
０μｌを加え発色反応を停止した後、分光光度計により
波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【００２４】（５） 標準曲線の作成 （試料および方法）ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の標準品は、
下記（ａ）、（ｂ）いずれかの方法により調製する。 ａ） 前記（２）−１）で得られた精製ＰＣＩ １００
μｌ（４００μｇ／ｍｌ）と、下記の方法で得られたＰ
ＳＡ ２００μｌ（２００μｇ／ｍｌ）とを０．０５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１Ｕ／ｍｌへパリン溶液中で、３７℃で４時
間、反応させた。この反応液を、上記緩衝液で平衡化し
たＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−４４カラムを用いてゲル
濾過した。高分子領域に溶出され、かつ抗ＰＳＡ抗体、
抗ＰＣＩ抗体ともに反応する分画をＰＳＡ・ＰＣＩ複合
体とした。ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体濃度は、吸光係数（Ｐ
ＳＡ・ＰＣＩ複合体１％溶液の２８０ｎｍの波長での吸
光度は１０．０）より算出した。ＰＳＡは５名の健康な
男性より得られた精液１５ｍｌを１０ｍＭベンザミジン
含有０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で５倍
に希釈し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラ
ムにかけ素通り分画をさらにＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムにかけ素通り分画を採取した。
この採取液に硫酸アンモニウム粉末を加えて７０％と
し、１００００回転で１５分遠心し沈殿を最小量の１．
０Ｍ ＮａＣｌ含有０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液で溶
解後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−５４カラムにかけ、
精製ＰＳＡを得た。

【００２５】ｂ） 健常人より得られた精液を前記
（２）−２）で得られた抗ＰＣＩモノクローナル抗体を
結合させたアガロースカラムにかけた。結合した分画を
へパリンアガロースカラムにかけ、ＰＳＡ・ＰＣＩ複合
体の分画を濃縮後Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−４４で分
画し、精製ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体を調製した。得られた
ＰＳＡ・ＰＣＩ複合体を９０ｎｇ／ｍｌになるように調
製し、標準抗原溶液とした。上記標準抗原溶液を希釈し
たものを、前記（３）検体の調製、（４）検体の測定、
におけると同じ手順にしたがって測定を行った。

【００２６】（結果）結果を図１に示す。横軸は、被検
検体中のＰＳＡ・ＰＣＩ複合体の濃度を表し、縦軸は波
長４５０ｎｍの吸光度値を示す。本検量線の測定感度
（Ｍ＋２ＳＤ）は、２．８ｎｇ／ｍｌで、測定範囲２．
８〜９０ｎｇ／ｍｌで直線性が認められた。

【００２７】（６） 検体の測定 （試料および方法）健常者１４例、前立腺肥大症患者７
例、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ａ）４例、前立腺癌患
者（ｓｔａｇｅ Ｂ）２例、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ
Ｃ）５例、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｄ_２）７例、
の血清について前記（３）検体の調製、（４）検体の測
定、におけると同じ手順にしたがって測定を行った。

【００２８】（結果）結果を図２に示す。図２中の各Ｐ
ＳＡ・ＰＣＩ複合体の平均濃度は、健常者１１．４ｎｇ
／ｍｌ、前立腺肥大症患者 ４６．８ｎｇ／ｍｌ、前立
腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ａ）４９．４ｎｇ／ｍｌ、前立
腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｂ）１２．７ｎｇ／ｍｌ、前立
腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｃ）１８．０ｎｇ／ｍｌ、前立
腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｄ_２）８．４ｎｇ／ｍｌであっ
た。上記健常者血清値より正常上限値（Ｍ＋２ＳＤ）を
求めると、２２．６ｎｇ／ｍｌであり、この値より陽性
率を求めると、前立腺肥大症患者（６／７、８５．７
％）、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ａ）（２／４、５
０．０％）、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｂ）（０／
２、０％）、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｃ）（１／
５、２０％）、前立腺癌患者（ｓｔａｇｅ Ｄ_２）（０
／７、０％）となり、前立腺肥大症患者は陽性率８５．
７％と高かった。しかし、前立腺癌はいずれのｓｔａｇ
ｅでも陽性率は低く、本発明の測定法は、前立腺肥大症
の診断に有用であることが認められた。

【００２９】（７） 既存マーカーとの比較 上記（６）で測定したものと同一の検体を市販品ＰＳＡ
測定キット（ヤングラボラトリー社製）で血清ＰＳＡ濃
度を測定した。なお、本キットの正常上限値は３．２ｎ
ｇ／ｍｌであった。

【００３０】（結果）結果を図３に示す。図３の各ＰＳ
Ａの平均濃度は、健常者 ２．５３ｎｇ／ｍｌ、前立腺
肥大症患者 ９．２６ｎｇ／ｍｌ、前立腺癌患者（ｓｔ
ａｇｅ Ａ）６．３７ｎｇ／ｍｌ、前立腺癌患者（ｓｔ
ａｇｅ Ｂ）７．９０ｎｇ／ｍｌ、前立腺癌患者（ｓｔ
ａｇｅ Ｃ）２８．９ｎｇ／ｍｌ、前立腺癌患者（ｓｔ
ａｇｅＤ_２）１１１７．６ｎｇ／ｍｌであり、図３から
も分かるように、前立腺肥大症患者の陽性率は（７／
７、１００％）であった。したがって、ＰＳＡ・ＰＣＩ
複合体濃度と、前立腺癌マーカーとして用いられている
ＰＳＡ濃度を比較した場合、ＰＳＡ濃度が高い値でＰＳ
Ａ・ＰＣＩ複合体濃度が高い値の場合には前立腺肥大症
が疑われ、ＰＳＡ濃度が高い値でＰＳＡ・ＰＣＩ複合体
濃度が低い値の場合には前立腺癌が疑われる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明測定方法に使用される標準曲線の一例を
示すグラフである。

【図２】本発明測定方法による検体の測定の結果の一例
を示すグラフであり、健常者および各種疾患患者血清Ｐ
ＳＡ・ＰＣＩ複合体濃度の測定値を示すものである。

【図３】既存マーカーでの測定結果の一例を示すグラフ
であり、健常者および各種疾患患者血清ＰＳＡ濃度の測
定値を示すものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血液を試料として、ヒト血中のヒト
   前立腺特異抗原とヒトプロテインＣインヒビターとの複
   合体を測定する方法であって、ヒト前立腺特異抗原に対
   するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とヒト
   プロテインＣインヒビターに対するモノクローナル抗体
   とを用いて、二抗体サンドイッチ法により免疫測定法に
   よって測定することを特徴とするヒト血中のヒト前立腺
   特異抗原とヒトプロテインＣインヒビターとの複合体の
   測定法。
2. 【請求項２】 ヒト血中のヒト前立腺特異抗原とヒトプ
   ロテインＣインヒビターとの複合体を、二抗体サンドイ
   ッチ法を利用する酵素免疫測定法によって測定するにあ
   たり、固相化抗体としてヒト前立腺特異抗原に対するポ
   リクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を使用
   し、酵素標識抗体用としてヒトプロテインＣインヒビタ
   ーに対するモノクローナル抗体を使用することを特徴と
   するヒト血中のヒト前立腺特異抗原とヒトプロテインＣ
   インヒビターとの複合体の測定法。
3. 【請求項３】 前立腺肥大症を診断するための請求項１
   および２記載の測定法。
4. 【請求項４】 ヒト血中のヒト前立腺特異抗原とヒトプ
   ロテインＣインヒビターとの複合体を、二抗体サンドイ
   ッチ法を利用する酵素免疫測定法によって測定するため
   の測定用キットであって、固相用抗ヒト前立腺特異抗原
   抗体および酵素標識抗ヒトプロテインＣインヒビターモ
   ノクローナル抗体を含み、所望により標準抗原、抗原希
   釈用液、反応用液、基質、基質溶解液およびまたは反応
   停止液を含む測定用キット。
5. 【請求項５】 前立腺肥大症を診断するための請求項４
   記載の測定用キット。