JPS58149700A - ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫化学的分析法とくに酵素免疫測定法（以下
、ＢＩＡと略称する。）用試薬に関する。

ＥＩＡは放射免疫測定法Ｃ以下、ＲＩＡと略称する。）
と同様に、極めて微量の物質を測定することのできる優
れた臨床検査法として、疾病の診断、病態把握、管理な
どζ°：繁用されている。しかし、ＲＩＡは放射性同位
元素を利用することに起因する難点を持っているのでそ
の普及には制限がある。一方、ＢＩＡは標識に酵素を利
用するものであり、特殊な検査室を必要としないという
特徴があるので、近年急速に発展してきた。ＢＩＡの手
法として「酵素免疫測定法」〔石川栄治編、医学書院（
１９７８年）〕に記載された方法があり、競合法、非競
合法に２分される。とくに、非競合法すなわちサンドイ
ツチ法ならびにそれに類する方法が繁用されている。

ＢＩＡで用いられる標識用酵素として、安定で高感度測
定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けないことが
望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−Ｄ−〃ラ
クトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース
オキシダーゼなどが用いられているが、上記の酵素のう
ち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極めて安定な酵
素で、酵素活性も高いため最も繁用されている。

ペルオキシダーゼをＥＩＡに利用するにあたって、ペル
オキシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる
必要がある。以下に、通常行なわれている方法を示すが
、それぞれ欠点を有し、改善が切望されていた。

グルグルアルデヒド架橋法；ペルオキシダーゼと免疫化
学的活性物質例えばタンパクとをグルタルアルデヒドで
架橋する方法である。ペルオキシダーゼとタンパクとを
同時に加える１段階法〔イムノケミストリー（Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６巻（１９６９年）、第
４８頁参照〕とぺ〜オキシダーゼをグルタルアルデヒド
で処理し洗浄後タンパクを結合させる２段階法〔イムノ
ケミストリー、第８巻（ｌ・９７１年）、第１１７５頁
参照〕があるが、前者では、得られた酵素複合体は重合
物を含む極めて不均一なものとなる。後者では比較的重
合物は少ないが、酵素の複合体生成のための収率が１０
％以下となり低収率であるという欠点を有する。

過ヨウ素酸架橋法；中根らによって開発された方法〔ザ
・ジャーナＶ・オブ・ヒストケミトリー嗜アンド曾サイ
トケミヌトリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）第２２巻（１９７４年）第１０８４頁参照〕
であり、ペルオキシダーゼの糖の部分を過ヨウ素酸酸化
してアルデヒド基を生成させ、免疫化学的活性物質例え
ばタンパクの有するアミノ酸と結合させてシッフ塩基を
つくり、さらに還元して安定な酵素複合体を調製する。

この方法は酵素の利用率は高いが重合体かできやずいと
いう欠点を有する。

グルタルアルデヒド架橋法あるいは過ヨウ素酸架橋法で
得られた酵素複合体はセファデックスＧ−２００（ファ
ｌレマシア・ファインケミカル社（ヌエーテン）ＩＩＩ
）などのゲルクロマトグラフィーを行なって精製しても
不均一な酵素複合体しか得られず、したがってＥＩＡに
供しても重合した酵素複合体による非特異的反応が大き
く、高感度測定用としては不適当であるとされた。また
これらの方法はぺ〜オキシダーゼに結合させる免疫化学
的活性物質例えばタンパクが種々の程度の損傷を受ける
ので、測定感度の低下をきたす。　　。

本発明者は、高感度測定が可能なペルオキシダーゼ複合
体の作成方法について鋭意検討したところ、ペルオキシ
ダーゼと免疫化学的活性物質とを、サクシンイミド基と
マレイミド基とを有する化合物により結合させると、上
記欠点を有しない極めて優れた酵素複合体が得られるこ
とを見いだし、これに基づいてさらに研究した結果、本
発明を完成した。

Ｃ式中、Ａは免疫化学的活性物質（Ａ−８Ｈ）の残基を
、Ｂはべｌレオキシダーゼ（Ｂ　−ＮＨ２）を、ｎは０
ないし５の整数を、Ｒは化学結合または６員環状炭化水
素残基なそれぞれ示す。〕で表わされるペルオキシダー
ゼと免疫化学的活性物質との複合体ｆｌ）、（２）　　
ペルオキシダーゼ（Ｂ−ＮＨ２）に〔式中、ｎは０ない
し５の整数を、Ｒは化学結合または６員環状炭化水素残
基をそれぞれ示す。〕で表わされる化合物（Ｉｌｌを反
応させ〔式中、Ｂはペルオキシダーゼの残基を表わす。

ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされる化
合物ｌ）を得、ついでこれに免疫化学的活性物質（Ａ−
８Ｈ）を反応させることを特徴とする一般式 〔式中、Ａは免疫化学的活性物質の残基を示す。

Ｂ、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされ
るペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体（
１）の製造法および（３）一般式〔式中、Ａは免疫化学
的活性物質（Ａ−８Ｈ）の残基を、Ｂはペルオキシダー
ゼ（Ｂ−ＮＨ２）の残基を、ｎは０ないし５の整数を、
Ｒは化学結合または６員環状炭化水素残基をそれぞれ示
す。〕で表わされるペルオキシダーゼと免疫化学的活性
物質との複合体（１）を含有する免疫化学的測定試薬で
ある。

Ａ−８Ｈで示される免疫化学的活性物質としては、分子
中にチオール基を有していることが必須である。分子中
に千オール基がない場合でもＳ−アセチルメルカプトコ
ハク酸無水物などを用いて免疫化学的活性物質にチオー
ル基を導入したものでもよい。分子中にジスルフィド結
合を有する場合は、２−メルカプトエチルアミンなどの
還元剤を用いてチオール基を生成させたものでもよい。

本発明における免疫化学的活性物質としては、抗原、ハ
プテンおよび抗体が挙げられる。具体的には、例えば免
疫グロブリン、ア〜ブミン、フィブリノーゲン（フィブ
リンおよびそれらの分解産物）、α−フェトプロティン
、Ｃ反応性タンパク。

β２−ミクログロブリン、ミオグロブリン、ガン胎児性
抗原、肝炎ウィルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（
以下、ｈＣＧと略称する）、ヒト胎盤性ラクトーゲン、
インスリンなどのタンパク、ホルモン、投与薬剤など、
またそれらの抗体などが挙げられる。

ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを用いる
ことができるが、その例としてはたとえば西洋わさび、
パイナツプル、イチジク、甘藷。

ソラマメおよびトウモロコシなどから得られるペルオキ
シダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホ
ースラディツシュパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄ
４ｓｈ　ｐｅｒｏｘｊｄａｓｅ）が好ましい。

上記式中、Ｒで表わされる６員環状炭化水素残基として
は、飽和のもの、不飽和のもののいずれでもよい。飽和
６員環状炭化水素残基の例としては、たとえばシクロヘ
キシレンが挙げられ、不飽和６員環状炭化水素残基の例
としてはたとえばフェニレンなどが挙げられる。

該６員環状炭化水素残基としては、特にシクロヘキシレ
ンが好ましい。

本発明の方法において用いられる化合物［１１１は、た
とえばザ・ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｔ
ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）第７９巻２８８頁（１９７６年）、ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒ
ｙ）第１０１巻３９５頁（１９７９年）、特開昭５２−
８５１６８号公報、特開昭５２−８５１６４号公報等に
記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製造すること
ができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。

ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマ
レイミド化合物ａ）と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示す。

〕で表わされるサクシンイミド化合物Ｍとを脱水剤ある
いは脱酸剤の存在下で反応させることにより製造するこ
とができる。上記一般式において、ハロゲン原子として
は塩素、臭素などが挙げられ、アルカリ金属原子として
はたとえばナトリウム、カリウムなどが挙げられる。ま
た反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、硫酸、ジ
シクロへキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤としては
たとえばピリジン、トリエチルアミンｆｘトが挙げられ
る。

前記化合物側は、たとえば特開昭５２−８５１６４号公
報に記載の方法あるいはこれに準じて製造することがで
きる。たとえば一般式 （式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。）で表わ
されるｊヒ合物帽を脱水閉環せしめることにより得られ
る。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢酸又
は無水酢酸と酢酸す）　ＩＪウム（無水物）を用い、温
和に加熱することにより反応させることができる。

さらに別法として、ヘルベテイ力・キミ力・アクタ（Ｈ
ｅｌｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ）第５８
巻（１９７５年）　５３１頁に記載されている方法ある
いはこれに準じて製造することができる。

たとえば、一般式 （Ｚはア啼しキル基を示す）で表わされるＮ−アルコキ
シカルボニルマレイミドと、一般式％式％（） 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるアミノ酸とを反応させて、一般式〔式中、ｎおよ
びＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマレイミ
ド化合物を得る。次に一般弐Ｍで表わされるサクシンイ
ミド化合物を加え先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱
酸剤の存在下で反応させることにより製造することがで
きる。

上記一般式（ＶＩ）で表わされる化合物においてＺで表
わされるアルキルとしては、メチル、エチルが挙げられ
る。

ペルオキシダーゼに化合物（Ｉｌｌを反応させるには、
両者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ないし５０
°Ｃの温度で約１０分ないし２４時間反応させることに
よって行なわれる。該緩衝液としては、たとえばｐＨ７
，０の０．１　Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８の０．０５
ＭＩＪン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして化合物（１）が得られる。得られた化合
物（１）の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーな
どにより行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィ
ーを行なう際に用いられる担体としてはたとえばセファ
デックスＧ−２５（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）ＩＩＪ）。

パイオゲｖｐ　−２（バイオ・ウッド・ラボラトリーズ
社（米国）製〕などが挙げられる。

化合物（Ｉ）に免疫化学的活性物質を反応させるには、
両者を緩衝液中で約０°Ｃないし４０°Ｃの温度で、約
１ないし４８時間反応させることにより行なうことがで
きる。該緩衝液としては１．たとえばｐＨ６，０の５ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１　
Ｍ　ｉＪン酸緩衝液などが挙げられる。

このようにして得られた化合物（Ｉ）は、たとえばゲル
クロマトグラフィーなどにより精製することができる。

該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担体としては、
たとえばウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社（スエーデ
ン）製〕、セファクリルＳ−２００Ｃファルマシア・フ
ァインケミカシ社（スエーデン）製〕などが挙げられる
。

本発明の複合体（Ｔ）を用いて免疫化学的測定を行なう
際の被測定物質としては、臨床診断に利用できる物質が
挙げられ、例えば体液中に含まれるヒトイムノグロブリ
ンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリン
Ａ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトフルブミン、ヒトフ
ィブリノーゲン（フィブリンおよびそれらの分解産物）
、α−フェトプロティン、Ｃ反応性タンパク、β２−ミ
クログロブリン、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎
ウィルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性
ラクトーケン。インスリンなどのタンパク、ホルモン、
投与薬剤などが挙げられる。

本発明の複合体（Ｔ）は、免疫化学的分析法における試
薬として用いることができる。

たとえば、複合体＋１１において、Ａが抗体の残基テす
るものは、サンドイツチ法による酵素免疫測定法に用い
ることができる。

本発明の複合体（１）を含むＥＩＡ用試薬の例として、
サンドイツチ法によるキットを以下に挙げる。

（１）担体上に保持された抗体 （２）本発明方法により得られたペルオキシダーゼで標
識化された抗体フラグメント（Ｆａｂ′）。

（８）被測定物質の標準品 （４）上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用い
ることができる緩衝剤であればいずれでもよいが、その
−例としてはｐＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン
緩衝液が挙げられる）。

（５）インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液（該担体の洗浄に用いることがでさる緩衝液であれば
いずれでもよいが、その−例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。） （６）ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。

その−例として螢光法の場合、酵素基質としてＰ−ハイ
ドロキ゛ジフェニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、
０−フェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解
に用いる緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素
反応停止液が挙げられる。

上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。

被測定物質の標準品もしくは被検液約ｌθ〜２００μｌ
に試薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬（１）、次
いで試薬（２）を１０〜８００μｌを加えたのち、約０
〜４０℃で反応させる。約１〜２４時間反応後、試薬（
５）で洗浄し担体上に結合しているべνオキシダーゼの
活性を測定する。即ち、基質液約１０〜１０００μｌを
加えて約２０〜４０℃で約０．２〜２４時間反応させた
のち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは
螢光強度を測定する。

本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の検
査室において簡単な操作で高感度測定が１１能となる。

と（（：ＢＩＡが臨床診断法として極めて有用であるが
、この他に免疫組織化学の領域においても本発明の酵素
複合体は組ｉ特異的な反応が少ないところから極めて効
果的である。

本発明方法において用いられる結合用試薬は、サクシン
イミド基とマレイミド基とを有しており、ぺＭオキシダ
ーゼに存在するアミノ基と反応して酵素にマレイミド基
を導入し、さらに免疫化学的活性物質例えば免疫グロブ
リンフラグメント　（Ｆａｂ’）に存在する千オール基
と反応して、酵素と免疫化学的活性物質との複合体を容
易に調製することができる。本発明の複合体（１１の製
造方法によると収率は約７０％以上と極めて優れており
、しかも複合体の重合物はほとんど認められず、前述の
グルタルアルデヒド架橋法や過ヨウ素酸架橋法と比べて
極めて高性能な酵素複合体を得ることができる。本発明
の酵素複合体を非競合法によるＥＩＡに供した場合、前
述の工法で得られた酵素複合体による結果と比べて測定
感度は約１０倍以上向上する。さらに、本発明の複合体
における高濃度の酵素複合体を用いても固相への非特異
的吸着は大きくならないので測定に要する時間を短縮す
ることができる。

上記の如く、本発明による酵素複合体を用いることによ
り非特異的吸着が小さくなり、したがつて測定感度が向
上した原因は、べ〜オキシダーゼ１分子にほぼ１分子の
免疫化学的活性物質が結合し、また複合体の重合体の生
成が極めて少なく、調製した複合体が非常に均一である
ことに基因すると考えられる。

以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。

参考例１　過ヨウ素酸架橋法 伸根らの方法〔ザ・ジャーナル・オプ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー　（Ｔｈｅ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａ
ｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２２巻（１９７４
年）第１０８４頁〕に従って行なった。７ダの西洋わさ
びペルオキシダーゼを１ｍｌの０．３Ｍ重炭酸ナトリウ
ム溶液（ｐＨ８，１）にとかし、０．１　ｍｌの１％１
−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを加工て室温で
１時間反応させた。次に０．０６　Ｍ　Ｎａ　ｌ０４１
１１１を加えて室温で３０分間攪拌したのち、０，１６
Ｍエチレングリコール水溶液１■ｌを加えて室温で１時
間放置した。０．６１Ｍ炭酸す）　ＩＩウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）に対して１夜透析した。

加藤らの方法〔ザ・ジャーナル・オプ・イムノロジー（
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　）第１１６巻（１９７６年）１５５４頁〕により得
られたウサギ抗ヤギｒｇＧ（Ｆａｂ’フラグメント）５
’ｌＦを２４ｍＭエチＩレマレイミドの０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）に加えてチオール基をブロックし
く室温、８０分間）、セファデックスＧ−１５０のカラ
ムを用いるゲルクロマトグラフィーで精製しコロジオン
膜法で濃縮したのち、先に調製したアＩレデヒドベルオ
キシダーゼと混合して室温で８時間反応させてから、５
′ｑのＮａＨＢ４を加えて４℃で１夜反応させた。０．
１５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，ｘ）に対して４°Ｃで１夜透析した後、ウルトロゲ
ｌしＡｃＡ４４　（ＬＫＪｔ　（；ｘ。

エーデン）製〕を充てんしたカラム（１，５×４５１）
を用いるゲルクロマトグラフィーにかケ、０．１ＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。溶出液の２８
０および４０８　ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定
した。溶出液の酵素活性は溶出フラクションを０．１９
６ウシ血清アルブミンを含む０．１ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐＩ（ｙ、ｏ）で５００倍に希釈したのち、この１０μ
ｌについてギルパルト（Ｇｕｉｌｂａｌｔ）　　らの方
法〔アナリティカル書ケミス）　＋７−（４ｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　第４０巻（１９６
８年）　１２５６頁〕に従って測定した。即ち希釈され
た溶出液ｌＯμｌに０．１９６ウシ血清アルブミンを含
ｂｏ、ｘＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ）に溶解した０、
５％ｐ−ハイドロキシフ） エニル酢酸０．２５　ｍｌを加えて混合し、　８　Ｇ　
’Ｃで５分間インキュベートした。次に０，０１％過酸
化水素０、０５　ｍｌを加えて８０℃で２０分反応させ
た。０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０，８）　２．５
ｍｌを加えて酵素反応を停止させ、ｌμｆ／ｍｅ　　の
キニンの螢光強度を１００として励起光３２０　ｎｍに
おける４　０５　ｎｍの螢光強度を測定した。結果を第
１図に示す。第１図において、−０−は２８０　ｎｍに
おける吸光度を、÷は４０８　ｎｍにおける吸光度を、
＋はペルオキシダーゼ活性（螢光強度として）をそれぞ
れ示す。

実施例　１゜ （１）マレイミド基の゛導入 ６ＴＩＩｇの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンが
　マンハイム社（西ドイツ）製〕を１ｍｌの０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０μｌのｎ−、尺
−ジメチｌし小１ヒムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ
（一般式ｆｎｌ＋ｎおイテ、ｎ＝１　、Ｒ＝シクロヘキ
シレンである化合物’）４．８＃を加えて３０°Ｃで６
０分間攪拌しながら反応させた。生成した沈殿を遠心分
離して除去し、上清をセファデックスＧ−２５のカラム
（１，０Ｘ４５備）に通し、ｏ、　ＩＭＩＪン酸緩衝液
で溶出させた。タンパクを含む画分を分取し、コロジオ
ン膜を用いて濃縮した。

このようにして調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ
においてベルオキシダーゼ１分子あたり導入されたマレ
イミド基の数は１．０〜１．２個であった（ペルオキシ
ダーゼの分子量を４０，０ＯＯＥ１％＝２２．７５とし
て計算１゜ （２）マレイミド化ペルオキシダーゼとウサギ抗ヤキＩ
ｇＧＦａｂ’　　フラグメントとの結合ウサギ抗ヤギＩ
ｇＧ血清〔マイルズ・ラボラトリーズ社（米国）製〕か
ら、加藤らの方法〔ザ・ジャーナル・オプーイムノロジ
ー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒ−ｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ）、第１１６巻（１９７６年）、１５５４頁〕に
準じてＦａｂ　　フラグメントを調製した。即ち、ウサ
ギ抗ヤギＩｇＧ血清を硫酸ナトリウム法で透析し、ＤＥ
ＡＥ−セｔｖロースのカラムクロマトグラフィーでＩｇ
Ｇフラクションとしたのち、ペプシン消化してＦ（ａｂ
）２とし、さらに２−メルカプトエチルアミンで還元し
、セファデックスＧ−２５のカラムによるゲルクロマト
グラフィーで精製してウサギ抗ヤギＩｇＧＦａｂ’フラ
グメントを得た。

実施例１−（１１で調製したマンイミド化ペルオキシダ
ーゼ１．５岬を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０
．１５ｇ／に溶解し、先に得たウサギ抗ヤギＩｇＧＦａ
ｂ’　フラグメント１．７ｗｖをとかした５ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）　０１１５譚ｌを加えて４°Ｃで２
０時間反応させた。反応後、ウルトロゲルＡ　ｃ　Ａ　
４４を充てんしたカラム（１，５Ｘ　ｊ５ｃＭ）を用い
るゲルクロマトグラフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６，５）で溶出させた。溶出液の２８０および
４　Ｑ　３１ｍの吸光度ならびに酵素活性を測定シタ。

ペルオキシダーゼとウサギ杭ヤギＴｇＧＦａｂ　　フラ
グメントの複合体が生成していることを、以下の方法で
確認した。

まず、酵素活性の測定はギルパルトらの方法〔アナリテ
イカル・ケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）　、第４０巻（１９６８年）、１２５６頁
〕で行なった。即ち、溶出液の各フラクションを０．１
％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で１８００倍に希釈した。

この１０μｌに０１％ウシ血清アルブミンを含む００５
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）ｉ二溶解した０
、５％ｐ−ハイドロキシフェニル酢酸０．２５ｙｘｌを
加えて混合し３０°Ｃで５分間インキュベートした。次
に０．０１％過酸化水素０．０５　ｍｌを加えて３０°
Ｃで２０分反応させた。ｐ、　１　Ｍグリシン緩衝液（
ｐＨ１０，８）　２．５ｍｌを加えて酵素反応を停止さ
せ、１μＩ／ｍｌ　　のキニンの螢光強度を１００とし
励起光８２０　ｎｍにおける４　０５　ｎｍの螢光強度
を測定した。結果を第２図に示す。第２図において、分
は２８０　ｎｍにおける吸光度を、ｆトは４０　：３　
ｎｍにおける吸光度を、＋はペルオキシダーゼ活性（螢
光強度として）をそれぞれ示す。

参考例１で得られた溶出パターン第１図と比較すると、
フラクション２９前後で溶出する酵素複合体の重合物は
全く認められず、フラクション８５前後のペルオキシダ
ーゼとウサギ抗ヤギＩｇＧＦａｂ’フラグメントとの複
合体の生成が極めて良好であることが分かった。

＋８１ＥＩＡ ＥＩＡ用の試薬として、次のものを用いた。

■　ヒトＩｇＧ　Ｋ作シリコンゴム片 ■　実施例１（２）で得られたペルオキシダーゼとウサ
ギ抗ヤギＩｇＧＦａｂフラグメントとの複合体■　標準
ヤギ抗ヒトＩｇＧ ■　洗浄ならびに■、■の希釈に用いる０、ＩＭＮａＣ
Ｉ　、１ｍＭＭｇＣＩ２，０．１％ウシ血清アルブミン
、　０．００２％メルチオレートを含むＰＨ７，０の０
．ＯＩＭリン酸緩＃液 ■　ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬０５％ｐ−
ハイドロギシフエニル酢酸ヲ含ムｐＨ５，０の酢酸緩衝
液、０．０１％過酸化水素水および反応停止液（ｐＨ１
０，８の０．１Ｍグリシン緩衝液） 抗体結合固相の調製、清浄なシリコンズム片（内径３關
、長さ４ｎ＋、富士高分子工業株式会社製シリコンｈｓ
、ＳＨ型から作製）をヒトＩｇＧ１００μｆＡｌを含む
０．２５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ４７，５）に室温で３０
分浸漬したあと４°Ｃで１夜放置した。０．２５Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ７，５）および緩衝液Ａ　（０，１Ｍ　
ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１％ウシ血清アル
ブミン、０．００２％メＩレチオレートを含む００１Ｍ
リン酸緩衝液（、ｐ）４７．０））で洗浄し、緩衝液Ａ
中に冷所保對した。

測定：緩衝液Ａ０．１５ｇ／中でヤギ抗ヒ）ＩｇＧ（Ｉ
ｇＧフラクション）Ｃマイルズ・ラボラドＩＪ−ズ社（
米国）製〕と、先に調製したヒ）　ＩｇＧ感作シリコン
ゴム片とを８７°Ｃで６時間、続いて４°Ｃで１夜反応
させた。シリコンゴム片を緩衝液Ａで２回洗浄後、実施
例１（２）で調製したベルオキシダー−ｖ−ウサギ抗ヤ
ギＩｇＧ（Ｆａｂ’フラグメント）複合体溶液（第２図
、フラクション３７〜３９を分取し緩衝液Ａで希釈した
もの、　５６０　ｎｇ／ｄ）（第８図中、−０−で示す
。）０．１５ゴを加えて８７℃で６時間反応させたのち
、シリコンゴム片を緩衝液Ａで２回洗浄し、固相に結合
した酵素活性を実施例１（２）に示したギルパルトらの
方法に従い測定した。結果を参考例１で得られた過ヨウ
素酸架橋法によるペルオキシダーゼ−ウサギ仇ヤギＩｇ
Ｇ（Ｆａｂ　　フラグメント）複合体溶液＋１１図１重
含体混入の少ない画分としてフラクション８７−８９を
分取し緩衝液Ａで希釈したもの（１１０２０ｎ／ｓ＋ｊ
Ｘ第８図中−−ｅ−テｚＲＴ。）。

重合体混入の大きな画分としてフラクション２８〜８０
を分取し緩衝液Ａで希釈したもの（ＳＯＯｎｇ／ｊ）（
第８図中、＋で示す。）。〕を用いて同一のアッセイ操
作での測定で得られた結果と比較した（それぞれの複合
体溶液の酵素活性は同一である）。第３図に示したよう
に、本発明の実施例１（２）で得られた酵素複合体を用
いたシステムでは他と比べて固相への非特異的吸着が最
小で約１０倍の高感度であった。

実施例　２．　ヒトＩｇＧの測定 （１）ペルオキシダーゼとウサギ抗ヒトＩｇＧ　　（Ｆ
ａｂ’　フラグメント）との複合体 実施例１（１）で得たマレイミド化ベルオキシダーセ１
．５　Ｗｖとウサギ抗ヒ）ＩｇＧ血清〔マイルズ・ラボ
ラ）　ＩＪ−ズ社（米国）製〕から実施例１（２）と同
様の方法で得たウサギ抗ヒ）ＩｇＧ（Ｐａｂ’フラグメ
ンｌ１１．７Ｗとを実施例１（２）と同様の方法で結合
させ、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒ）ＩｇＧ（Ｆａｂ
’　　フラグメン藺複合体を得た。

（２）　　ＥＩＡ ＥＩＡ用の試薬として、次のものを用いた。

■　ウサギ抗ヒトｉｇＧ（ＩｇＧフラクション）感作シ
リコンゴム片 ■　実施例２（１）で得られたペルオキシダーゼとウサ
ギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ’フラグメントとの複合体 ■　標準ヒトＩｇＧ ■　洗浄ならびに■、■の希釈に用いる０、　１　ＭＮ
ａＣＩ、　１ｍＭＭｇｃＩ２．Ｏ，ｔ％ウシ血清アルブ
ミン、０．００２％メルチオレートを含むＰＨ７，０の
０．０１Ｍリン酸緩衝液 ■　ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬０．５％ｐ
−ハイドロキシフエニル酢酸ヲ含むｐ　Ｈ５，０の酢酸
緩衝液、０．０１％過酸化水素水および反応停止液（ｐ
Ｈ１０，８の０．１　Ｍグリシン緩衝液） 抗体結合固相の調製：清浄なシリコンゴム片（内径（３
ｔｍ、長さ４ｍ、富士高分子工業株式会社製シ＋）　コ
ｙＮｎ８　＋　ＳＨ型から作成）をウサギ抗ヒトＩｇＧ
（ＩｇＧフラクション）１ｏｏμｇ／／Ｍｌを含む０．
２５ＭＩＪン酸緩＃液（ｐＨ７，５）に室温テ３０分浸
漬したあと４℃で１夜放置した。０．２５ＭＩＪン酸緩
衝液（ＰＨ７，５）および緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ
中に冷所保存した。

測定、緩衝液Ａ０．１５ｍ／中でヒトＩｇＧ　Ｃマイル
ズ・ラボラトリーズ社（米国）製〕と先に調製したウサ
ギ抗ヒトＩｇＧ感作シリコンゴム片とを３７°Ｃで６時
間、続いて４°Ｃで１夜反応させた。

シリコンゴム片を緩衝液Ａで２回洗浄後、実施例２（１
）で調製したペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒトＩｇＧ（
Ｆａｂ′フラグメ７）３複合体溶ｇ１０．１５　ｍｌを
加えて８７°Ｃで６時間反応させたのち、シリコンゴム
片を緩衝液Ａで２回洗浄し、固相に結合した酵素活性を
実施例１（２）に示したギルバルトらの方法に従い測定
した。結果を第４図に示す。第４図においては、÷はＭ
ＭＣで結合させた複合体を使用した場合の結果を、＋お
よびＩは参考例１（過ヨウ素酸架橋法）と同様の方法で
架橋すせ、ゲルクロマトグラフィーを行なって得られた
重合体混入の極小な画分および重合体が比較的混入して
いる両分をそれぞれ使用した場合の結果をそれぞれ表わ
す。第４図から明らかなごとく、本発明の複合体を用い
た場合の方が、固相への非特異的吸着は極めて小さく、
過ヨウ素酸架橋法によるペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヒ
トＩｇＧ（Ｆａｂ’フラグメント）複合体を用いた場合
と比べて１０〜２０倍の高感度を与えた。

実施例　８．　　ｈＣＧの測定 （１）抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約１０，０ＯＯＩＵ／岬
のｈｃＧＩＩｖを生理食塩水１１１１に溶解し、これに
フロイントの完全アジュバント〔Ｆｒｅｕｎｄ′Ｓｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ、　　免疫の生化学、
橘ら著、共立出版株式会社（１９６７年）〕１１ｍを加
えてよく混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋
肉内および背部及下数箇所に注射する。以上の操作を８
週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し、抗ｈＣＧ
血清を得た。

ｈｃＧ５Ｗを０．５ＭＮａＣ１を含むｏ、　１ＭＮａＨ
ＣＯＢ　８ｓ＋／に溶解し、予めＮ／　１，０００ＨＣ
Ｉで洗浄したブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（フ
ァＩレマシア・ファインーケミカルズ社製）１１に加え
、５°Ｃで一夜攪拌した。反応終了後同じ０．５ＭＮａ
Ｃｌ　　を含む０．１　Ｍ　Ｎａ　ＨＣＯＢで十分に洗
浄し、次いでＨＣＩでＰＨ８に調整した０、　５　Ｍエ
タノールアミン１０ｍ＋／を添加して室温で１時間反応
させた後、ｆｌｌｌＭＮａｃｌ　　を含む０．１　Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４，０’）　、（２）ＩＭ　ＮａＣｌ　
　を含む０．１ＭＭリン酸緩衝液ｐＨ８，０）および（
８）０．１５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ８，、ｏ　）で順次洗浄しカラムに充填した。

先に得られた抗ｈＣＧ血清８ｍｌを１．５ｇの無水硫酸
ナトリウムを用いて塩析沈殿させ、得られたγ−グロブ
リン画分を上記のｈＣＧ結合セファロース４Ｂカラム（
０，９ｘ４ｎ）に付した。

０、１５　Ｍ　ＮａＣｌ　　を含む０．０２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐ）（ｓ、ｏ　）でカラムを洗浄し、次いで０．
１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，８）で溶出する
ことによってウサギ抗ｈＣＧ抗体を得た。

（２）ペルオキシダーゼとウサギ抗ｈＣＧ（Ｆａｂ’フ
ラグメント）との複合体 実施例１（１）で得たマレイミド化ペルオキシダーゼ１
．５　Ｗと、実施例８（１）で調製したウサギ抗ｈｃＧ
抗体を実施例１（２）の方法に従って得たウサギ抗ｈｃ
Ｇ（Ｆａｂ’）−）グメン日１．８Ｉｖとを実施例１（
２）に示した方法で結合させペルオキシダーゼ−ウサギ
抗ｈＣＧ（Ｆａｂ’フラグメン日複合体を得た。

＋８１ＥＩＡ ＥＩＡ用の試薬として、次のものを用いた。

■　抗ｈＣＧ抗体感作ポリスチレンポール■　実施例３
（２）で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ｈＣＧＦ
ａｂ′フラグメントとの複合体■　標準ｈＣＧ ■　洗浄ならびに■、■の希釈に用いるＭ＃液■　ペル
オキシダーゼ活性測定に必要な試薬００２％過酸化水素
と０．１５％０−フェニレンジアミンを含むＰＨ４，８
の０．１　Ｍクエン酸−リン酸ニナ）　ＩＪウム緩衝液
および反応停止液（ＩＮ−塩酸） 抗体結合固相の調整：ポリスチレンボール（直径６．４
ｇ、プレシジョン・プラスティックス・ボール社（Ｐｒ
ｅｃｉｓｉｏｎ　　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　　Ｂａ１ｌ　Ｃ
ｏ。

（米国）製〕８００個に実施例８（１）で調製した抗ｈ
ＣＧ抗体２．５１ｖを０．０１　Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ
７，７）５０１Ｉ＋／に溶解した液を加えて室温で１時
間浸漬したあと４℃で１夜放置した。０．１％ウシ血清
アルブミンを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で洗浄したのち、用時まで冷所保存した。

測定　緩衝液Ａ中でｈＣＧと先に調製したウサギ抗ｈＣ
Ｇ感作ポリスチレンポールとを室温で１夜反応させた。

ポリスチレンボールを緩衝ｉＡで洗浄後、実施ｍｌ　８
　（２）で調製したペルオキシダーゼ−ウサギ抗ｈｃＧ
（Ｆａｂ’フラグメント）複合体溶液０．１５１７を加
えて３７°Ｃで６時間反応させたのち、ポリスチレンボ
ールを緩衝液Ａで洗浄し、これに０．０２％過酸化水素
と０．１５％０−フェニレンジアミンを含む０．１　Ｍ
クエン酸−リン酸ニナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）　
０．５ｇ／を加え−（８０°Ｃで１時間反応させたのち
、ｌＮ塩酸２ｍｌを添加して反応を停止させ、４９２　
ｎｍにおける吸光度を測定し標準曲線を得た。結果を第
５図に示したが固相への非特異的吸着は極めて小さく、
高感度測定ができた。

実施例　４．　　ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ハイ
ドロキシサクンンイミドＣＭＢ　Ｓ＞による結合性西洋
わさびべ〜オキシダーゼ〔ベーリンガーマンハイム社（
西ドイツ）製〕６１１ｙを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解し、５０μｌのＮ、Ｎ’−ジメチルホ！
レムアミドにとかした結合試薬ＭＢＳ〔一般式ｆｕｌｌ
においてｎ＝ｏ、Ｒ−フェニレンである化合物）４．８
Ｗｇを加えて２５°Ｃで３０分間攪拌しながら反応させ
た。次に反応生成物をセファデックスＧ−２５のカラム
（１，Ｏｘ４５ｍ）に通し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）で溶出した。

タンパクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用いて濃
縮した。このようにして得たマレイミド化ペルオキシダ
ーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導入された
マレイミド基の数は０６８〜０．７８であった。

加藤らの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー、
第１１６巻（１９７６年）、１５５４頁〕により得られ
たウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｆａｂ’フラグメント）１．’
ｔｙｖをとかした５ｍＭエチレンジアミン四酢酸す）　
ＩＪウム塩を含む０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）　０．１５ｘｌを、先に調製したマレイミド化ペ
ルオキシダーゼ１．５Ｎｇの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）０．１５翼ｌに加えて４°Ｃで２０時間反応
させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充てんした
カラム（１，５Ｘ４５ｃＩｌ）を用いるゲルクロマトグ
ラフィーにかけ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
で溶出させ、ペルオキシダーゼ−ウサギ抗ヤギ■ｇＧ（
Ｆａｂ’フラグメント）複合体を得た。

本複合体を実施例１（３）に示したＥＩＡの手順に従っ
て検定したところ、固相への非特異的吸着が極めて小さ
く、高感度を与えることが分った。

ＥＩＡにおける試薬としては、以下のものを用いた。

■　ヒトＩｇＧｒＥ作シリコンゴム片 ■　実施例４で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗ヤ
ギＩｇＧＦａｂ’フラグメントとの複合体 ■　標準ヤギ抗ヒトＩｇＧ ■　洗浄ならびに■、■の希釈に用いる緩衝液■　ペル
オキシダーゼ活性測定に必要な試薬０．５％ｐ−ハイド
ロキシフェニル酢酸を含ムｐ　Ｈ５，０の酢酸緩衝液、
０．０１％過酸化水素水および反応停止液（ｐＨ１０Ｊ
の０．１　Ｍグリシン緩衝液）

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１で得られたペルオキシダーゼとウサギ
抗ヤギＩｇＧＦａｂ’　　フラグメントとの反応生成物
のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パターンを、第
２図は実施例１で得られたペルオキシダーゼとウサギ抗
ヤギＩｇＧＦａｂ’フラグメントドの反応生成物のゲル
クロマトグラフィーにおける溶出へターンを、第３図は
実施例１もしくは参考例１で得られたペルオキシダーゼ
とウサギ抗ヤギＩｇＧＦａｂ’　　フラグメントとの複
合体を用いて得られたヤギ抗ヒ）ＩｇＧの標準曲線を、
第４図は実施例２もしくは過ヨウ素酸架橋法によるペル
オキシダーゼとウサギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆａｂ’　　フラ
グメントとの複合体を用いて得られたヒ）ＩｇＧの標準
曲線を、第５図は実施例８で得られたペルオキシダーゼ
とウサギ抗ｈＣＧＦａｂ’フラグメントとの複合体を用
いて得られたｈＣＧの標準曲線をそれぞれ表わす。 箒１　区 フチクシジン数、 フラクション４（ ヒト　　ＩｇＧ　　　　ｎｇ／簀

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　一般式 〔式中、Ａは免疫化学的活性物質（Ａ−８Ｈ）の残基を
   、Ｂはペルオキシダーゼ（Ｂ−ＮＨ，）の残基を、ｎは
   ０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または６員環状炭化
   水素残基をそれぞれ示す。〕で表わされるペルオキシダ
   ーゼと免疫化学的活性物質との複合体。
2. （２）　　べＮｔキシダーゼ（Ｂ−ＮＨｔ）に一般式ま
   たは６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わさ
   れる化合物を反応させ 一般式 〔式中、Ｂはペルオキシダーゼの残基な表わす。 ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされる化
   合物を得、ついでこれに免疫化学的活性物質（Ａ−８Ｈ
   ）を反応させることを特徴とする−〔式中、Ａは免疫化
   学的活性物質の残基な示す。 Ｂ、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わされ
   るペルオキシダーゼと免疫化学的活性物質との複合体の
   製造法。
3. （３）　　一般式 〔式中、Ａは免疫化学的活性物質（Ａ−８Ｈ）の残Ｊｌ
   −，Ｂはペルオキシダーゼ（Ｂ　−ＮＨｇ）の残基を、
   ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または６員環状
   炭化水素残基なそれぞれ示す。〕で表わされるペルオキ
   シダーゼと免疫化学的活性物質との複合体を含有する免
   疫化学的測定試薬。