JPS6082966A - 抗原の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原の定量法に関するものであり、更に詳しく
は、抗原と抗体ｆａ）および標識物質で標識された標識
抗体（以下標識抗体（ｂｌという）を反応させて得られ
る抗体（ａｌ−抗原−標識抗体（ｂｌの複合体（以下単
に複合体という）を、抗体（ａｌに対する抗体（以下第
二抗体という）を不溶化した水不溶性担体（以下第二抗
体不溶化水不溶性担体という）に結合せしめた後、該第
二抗体不溶化水不溶性担体に結合した標識抗体（ｂ）の
量を標識物質を測定することによって測定し、これによ
って該抗原の量をめることを特徴とする抗原の定量法に
関するものである。　近年、臨床医学の発展に伴い種々
の生体体液中の微量成分の定量に対する要望が高くなっ
ている。このような状況において、特に優れた微量物質
の定量法として免疫測定法が注目されている。又、測定
の対象も多岐にわたり、たとえばインスリン、成長ホル
モン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、グルカゴン、ガ
ストリン、カルシトニンなどのホルモン類、アルファフ
エ１−プロティン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
　、各種イムノグロブリンなどの生体蛋白質、クレアチ
ンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）’、エノラーゼなどの酵素
、各種抗てんかん剤、抗生物音などの薬物などが免疫測
定法の対象となっている。

近年、免疫測定法においては水不溶性担体を用いる固相
法、いわゆるサントイ・フチ法が開発され、この方法は
測定感度が非常に高いことから既に臨床医学に応用され
ている。例えば、Ｅ、　ｌ５ｈｉｋａｉ＋＋ａとに、　
Ｋａｔｏはシリコン樹脂片に抗体を不溶化し、これに抗
原を結合させた後、更に酵素で標識された抗体（以下酵
素標識抗体という）を反応させ、シリコン樹脂片−抗体
一抗原一酵素標識抗体の複合体を形成せしめ、この酵素
の活性を測定することによって抗原を高感度で測定して
いる。〔スカンジナビアン・ジャーナル・オプ・イムノ
ロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、）第８
巻、４３〜５５ページ、（１９７８年）〕。

しかしながら、このような従来のサントイ・フチ法は高
感度ではあるけれども、測定しようとする抗原の種類に
応じて各々の抗原に対応する抗体不溶化水不溶性担体を
用意する必要があり、多種の抗原を定量する上で非常に
不便であった。特にこの方法を自動測定装置に応用する
場合、抗原に応じて抗体不溶化水不溶性担体を交換する
必要があり極めて複雑な操作が必要となる。

そこで本発明者らは上記のことを考慮し、従来のサンド
インチ法に代わる新たな固相法による高感度測定をめ鋭
意検討した結果、種々の抗原を同一の第二抗体不溶化水
不溶性担体にて定■できるところの新たなサンドインチ
法に基づく抗原の定量法を見い出したのである。

即ち、本発明は抗原と抗体（ａｌおよび標識抗体（ｂ）
を反応させて得られる複合体を第二抗体不溶化水不溶性
担体に結合せしめ、該第二抗体不溶化水不溶性担体に結
合した標識物質の量より抗原の量庵測定するものである
。ここで第二抗体は抗体（ａｌと結合するが、標識抗体
（ｂ）とは結合しないことが必要である。このような反
応を可能ならしめるためには以下に述べる方法が最も有
効であることを本発明者らは見い出した。

第一の方法は、抗体は一種のイムツク゛ロフ゛ＩＪンで
あるがイムノグロブリン（まペプシンあるし１番ま）ぐ
パインなどのプロテアーゼで限定分解すると抗原との結
合部分（Ｆ　ａ　ｂ　’、Ｆ　ａ　ｂなどの名前でｎ手
ＬＬ’れる）とそれ以外の部分＜　Ｆ　ＣＲＢ分と■手
ｂｉれる）に分離できることを利用するものである。即
ち、抗体（ａｌとしてプロテアーゼ処理しなｔａｌｃを
含む・イムノグロブリンを用Ｇ）、標＆ｈ抗体（ｂｌと
してｐｃを除いたＦａｂ’　あるし）はＦａｂを標８６
したものを用いる。そして、第二抗体としてしよＦｃ＋
こ対して特異的なものを用いるとし１う方法である。

第二の方法は抗体（ａ）と標識抗体（ｂ）に、各々異）
重の動物より得られる抗体および標８人抗体を用し）る
ものである。例えば、抗体（ａｌとしてＧよウサギのも
のを用い、標識抗体（ｂ）としてｂまマウスの抗体を４
票識したものを用いる。ここで第二抗体としてむまウサ
ギのイムノグロブリンし二対する抗体を用し＼ることか
できる。

この際、更に第一の方法と第二の方法を同時に応用し、
例えば抗体（ａｌとしてウサギのＦＣを含も゛イムノグ
ロブリンを、標識抗体（ｂｌとしてマウスのＦａｂある
いはＦａｂ’を標識したものを、第二抗体としてウサギ
のＦＣに対する抗体を用（、ｓることもできる。又、抗
原としては抗体との結合部位が２つ以上ある多価抗原を
本発明法では定量１−るのであるが、抗体（ａ）と標識
抗体ｆｂｌが抗原の同じ抗体結合部位に競合的に結合す
ることもあり得る。

この際測定感度の低下等の問題が生しるが、このような
場合には特定の抗体結合部位にのみ、結合１−る単クロ
ーン抗体を抗体（ａｌおよび標識抗体（ｂｌの双方ある
いはいずれか一方に使うことにより測定を実施すること
ができる。

本発明法においては抗体（ａ）を同じ動物で調製１−れ
ばどのような抗原を測定する場合にも同じ第二抗体不溶
化水不溶性担体を用いることができ、これは従来知られ
ているサントイ・フチ法ＧこなＧ）優れた点である。

第二抗体不溶化水不溶性担体の調製に使用する水不溶性
担体としては、各種合成ポリマー、ガラス、不溶性多糖
などが用いられる。形態としては球状、棒状、繊維状、
微粒状などのものが用いられる。又、合成樹脂の試験管
の内壁なども利用し得る。繊維状、微粒状のものでは操
作性等を考慮するとカラムに充填して用いるのが有利で
ある。

抗体（ａ）、標識抗体ｆｂ、ｌに用いられる抗体として
は、各種動物に抗原を免疫して得られる抗血清に含まれ
るもの、あるいはマウスなどのハイブリドーマの生産す
る単クローン抗体が用いられる。これら抗体はイムノグ
ロブリンそのままかあるいはプロテアーゼで限定分解し
て得られるＦ、ａ　ｂ、　ｆ？　ａｌ）’のフラグメン
トとして使用し得る。但し、前記第一の方法における抗
体（ａ）は、Ｆｃを含むイムノグロブリンでなければな
らない。第二抗体としてもイムノグロブリンそのままか
、あるいはＦａｂ、Ｆａｂ’　のフラグメントが使用し
得る。

標識抗体（ｂ）のｍ製に用いられる標識物質としてはラ
ジオアイソトープ、酵素、各種螢光物質がある。特に酵
素は検出感度が高く、ラジオアイソトープのように安全
性に関する問題もないので有用な標識物質といえる。

標識抗体（ｂｌにおいて標識物質と抗体の結合法は従来
知られている技術を応用することができる。

例えばラジオアイソトープではクロラミンＴ法などの技
術が確立されている。酵素の場合には種々のカンプリン
グ剤が用いられる。カンプリング剤としてはグルクルフ
ルデヒド、カルボジイミド誘導体、マレイミド誘導体な
どがある。標識物質として適したラジオアイソトープの
例としてば　■、１３１１、　Ｎｈｃ　、３　Ｈ１酵素
の例としてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、グル
コースオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などがある。

螢光標識の場合は、例えば常法によってＦＩＴＣ標識抗
体が得られる。

第二抗体を水不溶性担体に不溶化して第二抗体不溶化水
不溶性担体を調製する方法としては、物理的吸着又は共
有結合が利用し得る。ポリスチレン球、シリコン樹脂片
などでは物理的吸着、不溶性多糖などでは臭化シアン、
エピクロルヒドリン、カルボジイミダゾールなどを用い
る共有結合法が一般的に用いられる方法である。

本発明法では生体体液中の各種ホルモン、蛋白質などを
同一の第二抗体不溶化水不溶性担体を用いることによっ
て高感度で測定することができる。

以下そのことを実施例にて具体的に説明する。

実施例１．サイログロブリンの定量 （１）サイログロブリン抗体の調製 精製したサイログロブリンをウサギに注射し當法により
抗サイログロブリン血清を得た。この抗サイログロブリ
ン血清より塩析、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ
ィによってサイログロブリン抗体（ウサギ）を得た。こ
の抗体は標識抗体（ｂ）の８Ｉｔｉｔ製に用いた。

一方、上記サイログロブリンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに免
疫しその肺臓細胞とミエローマ細胞を用いてケーラー（
Ｋ６ｈｌｅｒ）とミルスター（Ｍｉｌｓｔｅｒ　）の方
法〔ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、　４９
５〜４９７ページ、（１９７５年）〕に従いサイログロ
ブリン抗体産生ハイブリドーマを得た。このハイブリド
ーマをマウスの腹腔内にて培養し、得られた股木より上
と同じ方法でサイログロブリンのモノクローナル抗体を
得た。この抗体はイムノグロブリンのタイプを調べたと
ころ、イムノグロブリンＧであった。この抗体はそのま
ま抗体ｔａ＋として用いた。

第二抗体はマウスのイムノグロブリンＧをウサギに注射
して得られた抗マウスイムノグロブリンＧ血清より上と
同じ方法で調製した。

（２）標識抗体（ｂ）の調製 （１）で得られたサイログロブリン抗体（ウサギ）をペ
プシンで限定分解し、セファデックスＧ　−１５０のカ
ラムで分画してＦ（ａｂ’）２を得た。これをメルカプ
トエチルアミンで還元しＦ　ａ　ｂ’　とし、Ｆａｂ’
　のＳＨ基とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（大腸菌由来）
のＳＨ基をＮ、Ｎ”−０−フェニレンジマレイミドにて
結合することにより標識抗体（ｂ）を調製した。

（３）第二抗体不溶化水不溶性担体の調製（１）で得ら
れた第二抗体５０■を１０ｍ１のセファロース４Ｂに臭
化シアンを用いて共有結合させた。第二抗体不溶化セフ
ァロースは０．１−のポリスチレン製ミ二カラムに充填
して用いた。

（４）検量線の作成 以下の測定においては緩衝液として０．５％ゼラチン、
０．１％牛血清アルブミン、０．３Ｍ食塩、１ｍＭ塩化
マグネシウム　０．１％アジ化ナトリウムを含むｐ１１
７の１０ｍＭリン酸緩衝液を用いた。

サイログロブリンを緩衝液に０３２５．５０．１００．
２００．４００　ｎｇ／威の濃度で溶解した液の各々　
０．１ｍｅと抗体（ａｌの溶液０．５ｍｌ！を混合し、
３７℃で１時間反応させた。この反応液に標識抗体（ｂ
ｌの溶液０．５−を加え、更に３７℃で１時間反応させ
た後、反応液を第二抗体不溶化セファロースのカラムに
流した。カラムを＠衝液で洗浄後、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの基質である０−ニドしフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの溶液でカラムを満たし、２５°Ｃで１晩反応
させた。生成した０−二トロフェノールを１ｍｌの５０
ｍＭ炭酸ソーダ溶液でカラムより洗い出し、この洗浄液
の４２０ｎｍの吸光度を測定したところ、第１図に示す
検量線が得られた。

（団血清中のサイログロブリンの定量 ヒト血清０．１−を用いて（４）と同じ方法でサイログ
ロブリンを定量し、第１図の検量線よりサイログロブリ
ンの濃度をめた。ヒト血清３槙体についてサイログロブ
リンの濃度を調べたところ、各々　９．５ｏｇ／−１２
６５ｏｇ／ｍｅ、２４．５ｏｇ／−であった。

実施例２．サイログロブリンの定量 実施例１と同様にマウスを用いてサイログロブリンのモ
ノクローナル抗体を作成したところ、イムノグロブリン
Ｇタイプの抗体以外にイムノグロブリンＡタイプの抗体
が２種頬得られた。これらイムノグロブリンＡタイプの
抗体を還元し、実施例１（２）に準じてβ〜Ｄ−ガラク
トシダーゼの結合した標識抗体（ｂｌを調製した。抗体
（ａｌと第二抗体不溶化水不溶性担体は実施例１と同じ
ものを用いた。

内因性のサイログロブリンを除いたヒト血清にサイログ
ロブリンを０１２５．１００　、２００．４００　ｎｇ
／ｍｌの濃度で添加したものを用いて実施例１と同様に
検量線を作成した。

同時にサイログロブリン濃度未知のヒト血清５検体につ
いて同じ操作を行い、検量線によりサイログロブリンの
濃度をめたところ各々１１．２ｏｇ／ｍ！、５９．５ｏ
ｇ／＋ｔ！、　８．５ｏｇ／ｍｌ！、１５８ｎｇ／ｍｆ
！、９８．３ｏｇ／ｍｅであった。

実施例３．アルファフェトプロティン（ＡＦＰ＞の定量 ウサギより得られたＡＦＰの抗体をそのまま抗体（ａ）
として用いた。又、同じ抗体を実施例１（２）に準じて
処理し、　Ｆ（ａｂ’）２とした。このＦ（ａｂ′）２
にクロラミンＴ法で　１２ｓ　ｒを導入し標識抗体（ｂ
ｌとして用いた。

第二抗体はヤギより得られた抗ウサギＦｃ血清より調製
した。第二抗体不溶化水不溶性担体はこの第二抗体を実
施例１（３）に準じてセファロースに不溶化することに
より調製した。

ＡＦＰ標準液（０，１２，５，２５，５ｏ、１００．２
００．４００ｎｇ／　ｍＲ）と検体ヒト血清の各々を２
０ｐＩ！とり、これに標識抗体（ｂ）の溶液０．５−を
加え室温で１時間反応させた。次に反応液に抗体（ａ）
の溶液０．５ｍｌを加え、同じく１時間反応させた。こ
の反応液に第二抗体不溶化セファロースの想濁液０．５
ｒｒｄ！を加え、１時間振盪した後、遠心分離を行い反
応液を除去した。第二抗体不溶化セファロースを緩衝液
で洗浄後、ガンマ−カウンターで測定した。検量線を作
成し、それよりヒト血清５検体のＡＦＰｉ度をめたとこ
ろ、各々１９．２５．１５．３２１．５７ｎｇ／　ｍｆ
！であった。

実施例４．エノラーゼαγの定量 エノラーゼは２つのサブユニットを持つ酵素である。サ
ブユニットにはα、β、γの３種があるが、このうちα
サブユニットとＴサブユニットを持つエノラーゼαγの
定量を行った。

精製したγサブユニットをウサギに注射し、実施例１と
同じ方法で抗体を調製し、この抗体とβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼを結合させ標識抗体（ｂｌとして用いた。一方
、精製したαサブユニットをマウスに注射し、得られた
抗血清より抗体（ａｌを調製した。第二抗体不溶化水不
溶性担体は実施例１と同しものを用いた。

エノラーゼαγを緩衝液に熔解し０．５．１０．２０．
４０．８０．１６０．３２０ｎｇ／ｍＥの標準液を作っ
た。

この標準液と検体血清の各々２０ｍに抗体（ａｌの溶液
を０．５ｍｌ、標識抗体（ｂｌの溶液を０．５−加え、
３７℃で２時間反応させた。この反応液を第二抗体不溶
化セファロースのカラム（カラム内容量０．７＞に流し
、カラムを洗浄後実施例１に準じて酵素活性を測定した
。標準液を用いた場合の酵素活性より検量線を作成し、
検体血清５検体のエノラーゼαγの濃度をめたところ１
４．３ｎｇ／ｍｆ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、９８．５ｎｇ
／＋＋＋Ｉ’、１１０５ｎ／ｍｅ、２５ｎｇ／産であっ
た。

実施例５９分泌型イムノグロブリンＡ（ＳＩｇＡ）の定
量 分泌型イムノグロブリンＡ（ＳｉｇＡ）はイムノグロブ
リンＡ（ＩｇＡ）とセクレタリーコンポーネント（Ｓ　
Ｃ）からなる複合蛋白質である。精製したＩｇＡとＳＣ
を各々別のウサギに注射し、得られた抗血清より各にの
抗体を調製した。

ＩｇＡに対する抗体は抗体（ａ）として用いた。ＳＣに
対する抗体は実施例３と同様にＦ（ａｂ’）ｚとし、１
２５Ｉで標識し標識抗体（ｂ）として用いた。

第二抗体不溶化水不溶性担体は実施例３と同しものを用
いた。

ＳＩｇＡ標準液（０，１０，３０，６０，１２０ｐｇ／
＋＋＋ｆ’）と検体血清の各々を１００倍に希釈した液
２００ｇと標識抗体（ｂｌの溶液０．５＋ｔ！、抗体（
ａｌの溶液０．５ｍｌ！を混合し、３７°Ｃで１時間反
応させた。この反応液に第二抗体不溶化セファロースの
懸濁液０．５ｍｆ！を加え、以下実施例３と同様に操作
し検体血清のＳＩｇＡＩ度をめた。ヒト血清１０検体の
Ｓ　ｔ　ｇ　Ａ濃度は、１５ｐｇ／＋＋＋ｆ！、　８．
５ｐＪｇ／ｍＲ１９，４ｐｇ／−１６４ｐｇ／−１２４
ｐｇ　／　ｍｎ、３．５ｐｇ／ｍ、ｌｌｐｇ／ｍｆ！、
１３Ｉｔｇ／ｍｌ、９８７＋ｇ　／　ｍｉ！、７．９７
１ｇ／−であった。

特許出願人　天野製薬株式会社 第１図 サイログロブリン（ｎｑ／ｍＴ　） 手続補正書（方式） ％式％ ］ １、事件の表示 昭和５８年　特許願第１９２７１５号 ２、発明の名称 抗原の定量法 ３、補正をする者 、事件との関係　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号昭和５９年
１月３１日 ５、補正の対象 「明細書」 ６、補正の内容 （１）明細書第１６頁第１５行に下記の文章を加入しま
す。

！−４、図面の簡単な説明

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗原と抗体（ａｌおよび標識物質で標識された標識
   抗体ｆｂ）を反応させて得られる抗体（ａ）−抗原−標
   識抗体（ｂ）の複合体を、抗体（ａｌに対する抗体を不
   溶化した水不溶性担体に結合せしめた後該水不溶性担体
   に結合した標識抗体（ｂ）の量を標識物質を測定するこ
   とによって測定し該抗原の量をめることを特徴とする抗
   原の定量法。 ２　抗体（ａｌおよび標識抗体（ｂｌの双方又は一方が
   単クローン抗体であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の抗原の定量法。 ３　標識物質が酵素であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の抗原の定量法。 ４　抗体（ａ）に対する抗体を不溶化した水不溶性担体
   をカラムに充填して用いることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項、第２項又は第３項記載の抗原の定量法。