JPH09508969A - 前立腺特異抗原の免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌免疫検定法の分野に関する。より詳細には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の新たな免疫検定法である。また、ＰＳＡ用の免疫検定法においてキャリブレータまたは対照として使用できるＰＳＡとα‐抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の複合体に似た複合体も提示する。さらに、ＰＳＡに対するポリクロナール抗体を、ＰＳＡがＡＣＴに結合することでマスクされるエピトープと結合するものおよびこのようなエピトープと結合しないものに分別する方法を提示する。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺特異抗原の免疫検定法 技術分野 本発明は、癌免疫検定法の分野に関する。より詳細には、前立腺特異抗原（Ｐ ＳＡ）の新たな免疫検定法を提示する。また、ＰＳＡ用の免疫検定法においてキ ャリブレータまたは対照として使用できる、ＰＳＡとα₁‐抗キモトリプシン（ ＡＣＴ）との複合体に似た、ＰＳＡ−抗ＰＳＡ複合体も提示する。さらに、ＰＳ Ａに対するポリクロナール抗体を、ＰＳＡがＡＣＴに結合することでマスクされ るエピトープと結合するものおよびこのようなエピトープと結合しないものに分 別する方法を提示する。 発明の背景 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）については、Ｍ．Ｃ．ＷａｎｇらがＩｎｖｅｓｔ Ｕｒｏｌ．１７巻１５９頁（１９７９年）で最初に記述した。これは前立腺上皮 の分泌物であり、前立腺癌細胞によっても産生される。ＰＳＡは、プロテアーゼ 活性を有する分子量３３，０００〜３４，０００ダルトンの糖蛋白モノマーであ ると解析されている（Ｍ．Ｃ．Ｗａｎｇらによる前掲文献およびＹ．Ｂａｎらに よるＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１２３巻４８２頁（１９８４年））。 最近では、同抗原のアミノ酸配列が報告され（Ｗ．Ｋ．ＷａｔｔらによるＰｒｏ ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８３巻３１６６頁（１９８６年）） 、ＰＳＡの遺伝子がクローンされている（Ａ．ＬｕｎｄｗａｌｌによるＢｉｏｃ ｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１６１巻１１５１頁（１９８ ９年））。栗山らによる酵素免疫検定法の開発によって、悪性および良性の前立 腺疾患患者ならびに正常男性のかなりの部分の血中で、低濃度のＰＳＡを検出す ることが可能になった（栗山らによるＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０巻４６５８頁 （１９８０年））。 ＰＳＡ試験は、前立腺癌の手術または薬物による治療後の患者で、悪性疾患ま たは良性疾患を検出するのに大いに役立ちうる（Ｐ．Ｈ．ＬａｎｇｅらによるＵ ｒｏｌｏｇｙ，３３巻（補遺６）１３頁（1989 年６月）；Ｃ．Ｓ．Ｋｉｌｌｉ ａｎらによるＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５巻８８６頁（１９８５年））。治療し てもＰＳＡの上昇が続く場合、あるいは治療後のＰＳＡ奇ベースラインが上昇す るのであれば、疾患の再発または残留を示している（Ｍ．Ｋ．Ｂｒａｗｅｒらに よるＵｒｏｌｏｇｙ， ３３巻（補遺５）１１頁（１９８９年５月）；Ｊ．Ｋ．ＳｉｄｄａｌらによるＥ ｕｒ Ｕｒｏｌ．１２巻１号３頁（１９８６年）；Ｔ．Ａ．Ｓｔａｍｅｙらによ るＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３１７巻９０９頁（１９８７年）；Ｐ．Ｈ．Ｌａ ｎｇｅらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻８７３頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ．Ｓｔ ａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０７６頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ． ＳｔａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８４頁（１９８９年）；Ｔ． Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８８頁（１９８９年）； Ｄ．Ｗ．ＣｈａｎらによるＣｌｉｎ Ｃｈｅｍ．３３巻１９１６頁（１９８７年 ））。 ＰＳＡ検査単独では、一般集団におけるスクリーニング手順としても疾患の段 階決定の指針としても推奨できない。その代わり、前立腺癌患者の管理における 補助的検査としては広く受け入れられている（栗山らによるＪ Ｎａｔｌ Ｃａ ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６８巻９９頁（１９８２年）；Ｔ．Ａ．Ｓｔａｍｅｙらに よるＮ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３１７巻９０９頁（１９８７年）；Ｐ．Ｈ．Ｌ ａｎｇｅらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻８７３頁（１９８９年）；Ｔ．Ａ． ＳｔａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０７６頁（１９８９年）；Ｔ． Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８４頁（１９８９年）； Ｔ．Ａ．ＳｔａｍｅｙらによるＪ Ｕｒｏｌ．１４１巻１０８８頁（１９８９年 ）；Ｄ．Ｗ．ＣｈａｎらによるＣｌｉｎ Ｃｈｅｍ．３３巻１９１６頁（１９８ ７年）；Ｊ．Ｅ．ＯｅｓｔｅｒｌｉｎｇらによるＪ Ｕｒｏｌ．１３９巻７６６ 頁（１９８８年））。 血清ＰＳＡ濃度の測定は、現在では前立腺癌患者の診断に広く使用されている が、血清ＰＳＡ濃度の上昇は良性前立腺肥大症でも前立腺の外科的外傷に派生し ても報告されている（ＤｕｆｆｙによるＡｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１ ９８９年）；ＢｒａｗｅｒらによるＵｒｏｌｏｇｙ Ｓｕｐｐｌ（１９８９年） ）。 １９９２年２月６日に公開されたＨ．ＬｉｌｊａらによるＰＣＴ特許出願ＷＯ ９２／０１９３６号「遊離および複合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のアッセイ」 では、遊離ＰＳＡならびにプロテイナーゼインヒビター複合体としてのＰＳＡの 免疫検定法を開示している。遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ複合体は、２種類以上のモ ノクロナール抗体を採用した非競合的免疫検定法に より測定する。この発明はさらに、問題のＰＳＡプロテイナーゼインヒビター複 合体がα₁−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α₁−プロテアーゼインヒビター（Ａ ＰＩ）またはα₂−マクログロブリンのいずれかで形成されることを特徴とする 。さらに、この発明は、遊離ＰＳＡ、ＰＳＡプロテイナーゼインヒビター複合体 およびその両者の総ＰＳＡに対する比を、前立腺癌患者の診断に応用することを 特徴とする。 同特許出願では、３種類のモノクロナール抗体（以下、「ＭＡＢ」という）を 開示している。ＡＣＴとのＰＳＡ複合体（以下、「ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体」とい う）および遊離ＰＳＡは、ＭＡＢ ２Ｅ９および２Ｈ１１とされた。ＭＡＢ ５ Ａ１０は遊離ＰＳＡを認識するが、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を認識しない。ＭＡＢ ２Ｅ９は、免疫ブロット上の遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を容易に 識別した唯一の抗ＰＳＡＭＡＢである。抗ＰＳＡ ＭＡＢ ２Ｅ９、２Ｈ１１ま たは５Ａ１０のいずれも、互いに結合して固相結合ＰＳＡになるのを有意に阻止 しなかった。 ヒト血清の非競合的免疫検定法において様々なＭＡＢを組み合わせて使用する ことで、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複 合体の双方を測定することにより臨床的特異度が上昇すること、また遊離ＰＳＡ ／総ＰＳＡ比および遊離ＰＳＡ／ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体比が良性前立腺肥大症患 者と前立腺癌患者とでは有意に異なることを同出願は明らかにした。 遊離ＰＳＡに特異なＭＡＢおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に反応するＭＡＢは、 たとえばＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ（スウェーデン イェテボ リ）などから市販されている。自社ＭＡＢを様々な組み合わせで使用した場合の 阻害試験および用量反応関係を分析したＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢは、ＰＳＡ分子上に少なくとも９種類の主要抗原決定基があることに気づい た。そのＭＡＢ決定エピトープの１つの基は、複合体化していないＰＳＡおよび ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方上で曝露され、またそのＭＡＢ決定エピトープのも う１つの基は遊離ＰＳＡでのみ曝露された（ＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓ ＡＢ、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「ＰＳＡのエピトープマッピング、およびＰ ＳＡの様々なイソ型決定のための分析法の開発」、および同表題の要約、要約Ｐ ３８、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第１０回ヒト腫瘍マ ーカー国際会議、１９９３年９月８〜１１日、於ド イツ、ボン）。 ＰＳＡの競合的放射免疫検定法は市販されている（たとえば、Ｙａｎｇ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ワシントン州ベルビュー）のＰＲＯＳ−ＣＨ ＥＣＫ ＰＳＡ）。ＰＲＯＳ−ＣＨＥＣＫ ＰＳＡは、ＰＳＡに対するポリクロ ナールウサギ抗体、ならびに¹²⁵Ｉ標識したＰＳＡを使用する。現在は、２種類 のＰＳＡ非競合的サンドイッチ免疫検定法が上市されている。その１種類は、Ｐ ＳＡに特異な２セットのＭＡＢを使用するもので、（１）１セットのＭＡＢ（「 捕捉抗体」）は固相に結合してサンプル中のＰＳＡを捕捉し、（２）もう１セッ トのＭＡＢ（「プローブ抗体」）は標識されて遊離溶液の形にあって、捕捉され たＰＳＡと結合してこれを検出する。これらの検定法は、本書では「ＭＯＮＯ検 定法」と呼ばれる。一般に、これらのＭＡＢのＰＳＡとの結合は、ＡＣＴがＰＳ Ａに結合しても妨げられない。すなわち、一般にこれらのＭＡＢは遊離ＰＳＡと もＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とも結合できるわけである。このような検定法の例とし ては、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ Ｔａｎｄｅｍ−ＥおよびＴａｎｄｅｍ−Ｒ ＰＳＡ アッセイ（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、カリフォルニア州ラホラ）がある。 第２のタイプのサンドイッチ検定法では、固相ではＰＳＡに特異なＭＡＢを、 またプローブ抗体としてＰＳＡに対するポリクロナール抗体を使用する。一般に これらの検定法では、ＭＡＢは遊離ＰＳＡとＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方と結合 することができる。これに対してポリクロナール抗体のプールには、遊離ＰＳＡ およびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方と結合できる抗体、ならびに遊離ＰＳＡとは 結合するがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合できない抗体が入っている。後者の場 合、これらの抗体が結合したエピトープは、ＡＣＴがＰＳＡに結合すると阻止さ れ ＰＳＡ Ａｓｓａｙ（本出願人）およびＡＣＳ^TM ＰＳＡ ａｓｓａｙ（Ｃｉｂ ａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサ チューセッツ州イーストワルポール）がある。 第２の種類のサンドイッチ検定法はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体よりも遊離ＰＳＡの ほうを優先的に検出することがわかっている（ここではこの現象を「バイアス」 と呼ぶ）。他方、一部のＭＯＮＯ検定法にはそのようなバイアスはない。Ｂ．Ｂ ｌｕｅｓｔｅｉｎらによるＪ．Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｏｎｃｏ ｌｏｇｙ，７巻４号４１頁（１９９２年）を参照。 良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）患者の血清中にはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体よりも遊 離ＰＳＡのほうが多くあることがわかっている。他方、前立腺癌患者の血清中で は遊離ＰＳＡよりもＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のほうが多い。（Ｈ．Ｌｉｌｊａらに よるＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７巻１６１８頁（１９９１年）；Ｕ．Ｓｔｅｎｍａ ｎらによるＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１巻２２２頁（１９９１年）；Ｈ．Ｌｉｌ ｊａらによるＣａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７０巻２３０頁（１９９２年）；Ａ． ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎらによるＪ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１５０巻１００頁（１ ９９３年））。 発明の要約 本発明は１つの態様として、サンプル中のＰＳＡを検出して定量するための新 しいＭＯＬＹ検定法およびＭＯＮＯ検定法を提示する。これらの方法では遊離Ｐ ＳＡとは結合するがＰＳＡとＡＣＴの複合体（「ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体」）とは 結合しないＨＥ_PSA抗体でサンプルを処理する。検定法にＨＥ_PSA抗体を加えるこ とで、これらの検定法におけるバイアスが減るかもしくは排除される。これらの 検定法を実施するためのキットも 提示する。 本発明のもう１つの態様として、ＰＳＡとＨＥ_PSA抗体の複合体（「ＰＳＡ− ＨＥ_PSA抗体複合体」）を提示するが、これはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に似ている 。この複合体は、ＰＳＡ免疫検定法のキャリブレーターまたは対照あるいはその 両者として有用である。 本発明のさらに別の態様として、ポリクロナール抗体をＰＳＡに分別して、Ｐ ＳＡとＡＣＴの結合によってマスクされるエピトープ（「隠れるエピトープ」） を結合する抗体、およびこのようなエピトープと結合しない抗体を含有する分画 を得る方法を提示する。同様に、このような分別に有用なアフィニティーカラム も提示する。 本発明の上記の態様は一般に遊離状態または結合分子と複合体を形成した状態 で存在することのできるあらゆる被検体に適用できる。 図面の簡単な説明 図１は、ＰＳＡ検定のための従来の方法（パートＡ）と本発明の方法（パート Ｂ）を比較し、ＨＥ_PSA抗体によって遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に 対する検定法の特異度が 改変されたことを示している。 図２は、ＰＳＡ上の隠れるエピトープと隠れないエピトープに対するポリクロ ナール抗体を獲得する方法を示している。 発明の詳細な説明 ここでいう「抗体」とは、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体、免 疫グロブリン全長ならびに免疫グロブリンの抗原結合フラグメントを含む。これ らのフラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’２）およびＦｖがある。こ のようなフラグメントは、当該技術分野で既知の方法により作製できる。 ここでいう「ＨＥ抗体」または「αＨＥ」とは、標的抗原（「被検体」）との 結合が当該被検体に別の分子（「結合分子」）が結合することで妨げられるよう な抗体のことである。「非ＨＥ抗体」または「αｎＨＥ」とは、被検体への結合 が当該被検体と結合分子が結合することで妨げられない抗体のことをいう。被検 体に結合分子が結合することでマスクされる被検体上のエピトープのことを「隠 れるエピトープ」（「ＨＥ」）という。同様に、被検体に結合分子が結合するこ とでマスクされない被検体上のエピトープのことを「隠れないエピトープ」（「 ｎＨＥ」）という。「α被検体」または「αＡ」とは、 αＨＥであれαｎＨＥであれ、被検体に対する抗体のことをいう。 被検体は生体サンプルで見られる抗原であることが好ましく、また当該サンプ ルに内在性のものであることが好ましい。結合分子は当該サンプルに内在性のも のであることが好ましく、またしばしば被検体を伴う。結合分子および被検体は 蛋白であることが望ましい。被検体の例としては血清プロテアーゼが、その結合 分子としては血清プロテーアゼインヒビターが挙げられる。血清プロテアーゼお よびそのインヒビター（括弧内）としては、たとえばプロテインＣ（プロテイン Ｃインヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（ＡＣＴ）、 ＰＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α₂−マクログロブリン）、トロンビン（抗トロン ビンIII）、Ｃ₁−エステラーゼ（Ｃ₁−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（ＰＡＩ−１ ）、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α₂−抗プラスミン）、ＰＳＡ（α₁− プロテアーゼインヒビター）、およびＰＳＡ（プロテインＣインヒビター）があ る。「ＰＡＩ−１」とは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター１型のこと である。「ｔ−ＰＡ」とは、組織プラスミノーゲン活性化因子のことである。「 ｕＰＡ」とは、尿 中プラスミノーゲン活性化因子のことである。当業者であれば、結合分子は血清 プロテアーゼでもよく、被検体は血清プロテアーゼイインヒビターでもよいこと がわかるだろう。 「ＭＯＬＹ検定法」とは、捕捉抗体がＭＡＢで、プローブ抗体がポリクロナー ル抗体である、あるいはその逆であるような免疫検定法のことをいう。 本発明は、試験サンプル中にある被検体の免疫検定法を開示する。サンプルは 、一般的には生体サンプルである。生体サンプルとしては、血液、血清、前立腺 液、精液、尿、リンパ液、髄液がある。 サンプルに結合分子と結合しない被検体（これら未結合の被検体を、ここでは 「遊離被検体」ともいう）および結合分子と複合体を形成する被検体（「複合体 形成被検体」または「被検体−結合分子複合体」）を含有する場合には、被検体 用のＭＯＬＹ検定法および一部のＭＯＮＯ検定法はバイアスを呈し、複合体形成 被検体のないサンプルでは複合体形成被検体のあるサンプルよりも読取り値が高 くなる。たとえば被検体検出に使用したポリクロナール抗体の一部が遊離被検体 とは結合できるが複合体形成被検体とは結合できない場合に、このようなこと が生じうる。 本発明者は、反応混合液に遊離ＨＥ抗体を加えることで被検体用のＭＯＬＹ検 定法および一部のＭＯＮＯ検定法で見られるバイアスを是正できるのを発見した 。遊離ＨＥ抗体を加えることを除いては、特定被検体用のＭＯＬＹ検定法および ＭＯＮＯ検定法は、この種の検定法の技術分野で既知の方法に従って実施するこ とができる。さらに、サンプル中の被検体がサンプルを固相とインキュベートし たときに固相に直接結合できるのであれば、捕捉抗体は必要ない。プローブ抗体 および捕捉抗体は、当該分野で既知の方法に従って作製することができる。プロ ーブ抗体は、当該技術分野で既知の方法を使って、化学発光標識、蛍光標識、酵 素および放射標識などで標識することができ、採用した標識に応じて検定法を設 定する。発光標識した免疫測定法の例は、Ｗ．Ｇ．ＷｏｏｄらによるＥｕｒ．Ｊ ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９巻７８７頁（１９９１ 年）に載っている。ＨＥ抗体および非ＨＥ抗体は、既知の方法、たとえば以下に 述べるＨＥ_PSA抗体および非ＨＥ_PSA抗体の作製に使用する方法を使って作製でき る。ＨＥ抗体は、以下に述べるようにモノクロナール抗体もしくは特異 的ポリクロナールＨＥ抗体であることが望ましい。 そこで本発明の１つの態様として、生体サンプル中の被検体のためのサンドイ ッチ非競合的免疫検定法を提示する。捕捉抗体（「αｎＨＥ」）は、当該被検体 の隠れないエピトープに向けられたもので、固相に付着して、生体サンプル中に 存在するかもしれない被検体を捕捉する。生体サンプルを加えながら、あるいは 加えた後、捕捉抗体をＨＥ抗体（「αＨＥ」）とインキュベートする。あるいは 、αＨＥを捕捉抗体に曝露する前にサンプルとインキュベートしてもよい。αＨ ＥはＭＡＢであることが望ましい。十分な時間インキュベートして、｛（αｎＨ Ｅ）（被検体）（αＨＥ）｝の複合体が形成されるようにする。次いで、固相に 結合していなかった試薬を反応混合液からすべて取り除く。これには、当該技術 分野で既知の洗浄手順によって行う。たとえば、未結合試薬を水性媒体に溶解し て固相から洗い流し、固相には｛（αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）｝複合体だ けを残す。 次いで、ポリクロナール抗被検体抗体（「α被検体^*」）を加える。α被検体^* は、できれば検出用に標識したもの、たとえば酵素標識、放射標識、蛍光標識ま たは化学発光標識したも のが好ましい。 反応混合液を十分な時間インキュベートして、｛（αｎＨＥ）（被検体）（α ＨＥ）（α被検体^*）｝複合体および｛（αｎＨＥ）（被検体）（結合分子）（ α被検体^*）｝複合体を形成する。｛（αＮＨＥ）（被検体）（αＨＥ）（α被 検体^*）｝複合体では、αＨＥとα被検体^*の双方が複合体中の被検体に結合して いる点を注意すること。サンプル中に結合分子が存在するならば、別の複合体、 すなわち｛（αｎＨＥ）（被検体）（結合分子）（α被検体^*）｝の複合体も形 成されることがある。 次いで、未結合試薬を分離する。標識したα被検体^*を検出して、固相上に｛ （αｎＨＥ）（被検体）（αＨＥ）（α被検体^*）｝および｛（αｎＨＥ）（被 検体）（結合分子）（α被検体^*）｝の複合体が形成されていることを検出する 。サンプル中に被検体が存在しなければ、これらの複合体は生じない。これらの 複合体の存在量は、サンプル中の被検体濃度に正比例する。あるいは、残ってい る未結合の標識α被検体^*の存在量を定量すれば、この量はサンプル中に存在す る被検体の量に反比例する。 上記の検定形式は、バイアスを呈するＭＯＮＯ検定法でも使用することができ る。ＭＯＮＯ検定法では、α被検体^*を標識したαｎＨＥ（すなわち「αｎＨＥ^* 」）とするだけで、それ以外は上記の方法をそのまま適用することができる。 捕捉抗体がポリクロナール抗体でプローブ抗体がＭＡＢの場合には、捕捉抗体 をα被検体またはαｎＨＥにし（αｎＨＥはたとえば以下に述べる分別方法でポ リクロナール抗体から分別することができる）、またプローブ抗体をαｎＨＥ^* にする以外は上記の方法をそのまま適用できる。捕捉抗体のα被検体にαＨＥの サブ集団が含まれる場合には、上記の検定手順によって得られる｛（αＨＥ）（ 被検体）（αｎＨＥ^*）｝の追加複合体もある。 これまでに述べたことでは、被検体上に１つしかＨＥがないと仮定している。 しかし、特定のαＨＥが被検体上の全ＨＥをマスクしない場合には、被検体上の 他のＨＥ部位に向けた追加ＨＥ抗体を使用することになる。 当業者であれば、プローブ抗体が標識してある別の分子によって特異的に結合 されうるのであれば、プローブ抗体は標識を要しないことがわかるだろう。さら に、被検体を固相に直接結 合できれば、捕捉抗体を使用する必要はない。 本特許出願では、上記の検定法を実施するための検定用キットも提示する。検 定用キットには、未標識ＨＥ抗体の入った容器、また当該被検体に対する捕捉抗 体が入っている別の容器があることが望ましく、これらの抗体は非ＨＥに対する ものであることが好ましく、またＭＡＢであればさらに好ましく、最も望ましい のは固相に結合したものである。未標識ＨＥ抗体は、捕捉抗体またはプローブ抗 体と同じ容器に入っていても別の容器に入れてもよい。ＭＯＬＹ検定法のために は、キットにはこの他に被検体に対するプローブポリクロナール抗体で、できれ ば検出用に標識されている抗体が入っている容器、ならびに抗体上の標識と反応 して信号を発生する試薬が入っている容器がある。たとえば、ポリクロナール抗 体はアルカリホスファターゼなどの酵素で標識することができ、それと反応する 試薬は酵素基質となる。アルカリホスファターゼの場合、４−メチルウンベリフ ェリルリン酸（ＭＵＰ）が便利なことがわかっており、その反応については以下 の例IIで述べる。あるいは、プローブ抗体はモノクロナール抗体で、捕捉抗体が ポリクロナール抗体でもよい。このような場合、モノクロナールプローブ抗 体は非ＨＥ抗体であるのが好ましい。ＭＯＮＯ検定法のためには、プローブ抗体 および捕捉抗体は被検体に対するＭＡＢとする。プローブＭＡＢおよび捕捉ＭＡ Ｂは非ＨＥ抗体であることが好ましい。上記のキットでは、抗体は溶液、たとえ ば緩衝液で、免疫検定法の有害作用をもたらさないものに入っていることが好ま しい。上記のキットには、さらにキャリブレーターの入った容器（１ないし複数 ）または対照の入った容器（１ないし複数）あるいはその両者を追加することも できる。被検体検定のためのキャリブレーターおよび対照には、以下に述べるよ うに遊離被検体、被検体−ＨＥ抗体の複合体、あるいは被検体−結合分子の複合 体が入っていることが望ましい。 発明の好ましい実施例では、被検体はＰＳＡで、結合分子はＡＣＴである。Ｐ ＳＡに対するＨＥ抗体は、遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは 結合しない抗体である。これらの抗体をここでは「ＨＥ_PSA抗体」と呼ぶ。対応 する比ＨＥ抗体のことは「非ＨＥ_PSA抗体」と呼ぶ。 ＨＥ_PSA抗体（および非ＨＥ_PSA抗体）を得る方法は、当該技術分野で既知のも のである。たとえば、Ｈ．Ｌｉｌｊａらによる前掲のＰＣＴ特許出願ＷＯ ９２ ／０１９３６号、また ＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ、Ｎｉｌｓｓｏｎらによる「ＰＳＡ のエピトープマッピング、およびＰＳＡの様々なイソ型決定のための分析法の開 発」、および同表題の要約（前掲）で述べられている。ＨＥ_PSA抗体の例として は、（１）ＷＯ ９２／０１９３６号に記載のＭＡＢ ５Ａ１０、（２）Ｋ．Ｐ ｅｔｔｅｒｓｓｏｎらによる「早期前立腺癌と良性前立腺肥大症の判別を向上さ せるためのＰＳＡに関する免疫蛍光法の開発」（第１５回臨床化学国際会議、於 オーストラリア メルボルン、１９９３年１１月１４〜１９日）に述べられてい るＭＡＢ ９Ｂ１０（同論文ではＭＡＢ Ｈ１１７およびＨ５０についても述べ ている）、（３）ＣａｎＡｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ（スウェーデン イェーテボリ）から市販されているＭＡＢ ＰＳＡ６、ＰＳＡ３０、ＰＳＡ１７ 、ＰＳＡ１９、ＰＳＡ２０、およびＰＳＡ２５がある。米国特許出願０８／０９ ４，９０１号（１９９３年７月２２日出願）でＭ．ＭａｔｉｋａｉｎｅｎらはＭ ＡＢ ５Ａ１０および９Ｂ１０の双方と、これらの生産および特徴について開示 している。そこでは、これらのＭＡＢを分泌するハイブリドーマはそれぞれ５Ａ １０Ｅ７Ｆ１１Ｈ４および９Ｂ１０Ａ９Ｈ３ と名付けられている。これらのハイブリドーマは１９９３年３月１２日に公衆衛 生研究部応用微生物学研究センターの欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣ Ｃ）（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ Ｓ Ｐ４ ０ＪＧ、英国）に寄託され、それぞれ９３０３１２０１および９３０３１ ２０２のＥＣＡＣＣ受託番号を付された。上記の出版物および特許出願をここで 引用して本書の一部ととする。 このように本発明では特にＰＳＡ検定法に有用な３つの発明、すなわちＨＥ_{PS A} 抗体を用いた新しいＰＳＡ検定法、特異的ポリクロナールＨＥ_PSA抗体および隠 れないエピトープ用の抗体の選択方法、ならびにＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に似てい るＰＳＡ−ＨＥ_PSA抗体複合体を提供する。最初の２つの発明では、従来技術の ＭＯＬＹ検定法で見られるバイアスを回避するかもしくは減らす。最後の発明は ＭＯＮＯおよびＭＯＬＹの双方のＰＳＡ検定法のキャリブレーターまたは対照あ るいはその両者として有用である。第２の方法で選択した特異的ポリクロナール 非ＨＥ_PSA抗体は、ＰＳＡ用のＭＯＬＹ免疫検定法でも（プローブ抗体または捕 捉抗体のいずれかとして、あるいは両者と して）、非競合的免疫検定法でも（捕捉抗体として）利用できる。他方、ＨＥ_{PS A} 抗体は遊離ＰＳＡに特異な検定法で使用することもできれば、先に述べたよう にバイアスをもたらしやすいＰＳＡ免疫検定法（ＭＯＬＹまたはＭＯＮＯのいず れでも）でこのようなバイアスを緩和または排除するために利用することができ る。 本出願においては、ＰＳＡ、ＡＣＴおよびＨＥ_PSA抗体と非ＨＥ_PSA抗体を使っ て本発明を説明する。ただし、当業者であれば、本発明をいかなる被検体、結合 分子、およびＨＥ抗体と非ＨＥ抗体にも応用できることがわかるだろう。 Ｉ．新しいＰＳＡ免疫検定法 図１では、従来のＰＳＡ ＭＯＬＹ検定法（パートＡ）および本発明のＰＳＡ ＭＯＬＹ検定法（パートＢ）を比較して、ＨＥ_PSA抗体が遊離ＰＳＡおよびＰ ＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異な検定法をいかに改良するかを示している。 パートＡは、バイアスを生じやすい従来のＭＯＬＹ検定法を示している。パー トＢに工程Ｂ１が追加される点を除けば、パートＡの手順とパートＢの手順は同 じである。 パートＡの手順は次のとおりである。 工程Ａ１：ＰＳＡ分子上の隠れないエピトープ（ｎＨＥ１と命名）に特異な非 ＨＥ抗体（αｎＨＥ１）を固相に結合させる。遊離ＰＳＡまたはＰＳＡ−ＡＣＴ 複合体のいずれかを含有するサンプルを固相に結合したαｎＨＥ１と反応させる と、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の双方が、ｎＨＥ１エピトープを通 じて排他的に結合できる。他方、その後に他の抗体と反応するために遊離ＰＳＡ 上でＨＥがいまだに利用できる。 工程Ａ２：その後、ＨＥに特異な標識抗体（αＨＥ^*）および非ＨＥ２に特異 な抗体（αｎＨＥ２^*）の双方を含有する標識したＰＳＡに対するポリクロナー ル抗体（「標識ポリクロナール」）を追加すると、両方のタイプの抗体が遊離Ｐ ＳＡに結合する。それに対して、ＨＥはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによっ てマスクされるので、同じ標識ポリクロナールは隠れないエピトープｎＨＥ２と のみ結合できる。これらの標識ポリクロナールは、検出の目的で標識に接合され ている。標識の例としては、当該技術分野で既知の化学発光標識、放射標識およ び酵素標識がある。この実施例では、標識は酵素である。未結合の試薬を、たと えば当該技術分野で既知の方法を使って固相から洗い流すなどして固相から取り 除く。 工程Ａ３：引続き固相に酵素基質を加えると酵素産物が信号を発生するので、 それをモニターする。２つの標識ポリクロナールと結合している遊離ＰＳＡは、 １つの標識ポリクロナールとしか結合していないＰＳＡ−ＡＣＴ複合体にに比べ 信号を２倍発生し、このために遊離形式のＰＳＡについてプラス方向のバイアス （数値のずれ）をもたらす。 パートＢは本発明の検定法を示したもので、パートＡで述べた検定法にさらに 未標識ＨＥ_PSA抗体を加えており（工程Ｂ１）、それによって検定法にバイアス が生じなくなっている。 パートＢの工程は次のとおりである。 工程Ｂ１：サンプルを未標識ＨＥ_PSA抗体（αＨＥ）で事前処理する。この抗 体は遊離ＰＳＡ上のＨＥとは反応するが、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体とは結合しない 。あるいは、未標識αＨＥを工程Ｂ２または工程Ｂ３で追加してもよい。 工程Ｂ２：パートＡのようにしてαｎＨＥ１抗体に結合した固相にサンプルを 加える。 工程Ｂ３：さらに、ＨＥを認識する標識抗体（αＨＥ^*）および非ＨＥを認識 する抗体（αｎＨＥ２^*）を含有する標識ポリクロナールを加えると、遊離ＰＳ ＡおよびＰＳＡ−ＡＣＴ複 合体の双方にαｎＨＥ２^*が結合する。αＨＥ^*は遊離ＰＳＡともＰＳＡ−ＡＣＴ 複合体とも結合できない。これは、ＨＥが遊離ＰＳＡ中の未標識αＨＥで、また ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴでそれぞれマスクされているからである。 工程Ｂ４：基質を加え、信号をモニターする。遊離ＰＳＡおよびＰＳＡ−ＡＣ Ｔ複合体のいずれもαｎＨＥ２^*としか結合していないので、双方が等しい信号 を発生する。そのため、検定でＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に比べて遊離ＰＳＡにバイ アスが生じることがない。 固相の材料は、免疫検定法に使用する材料であれば何でもよい。天然材料、合 成材料、天然材料を合成修飾したものが使える。たとえば、多糖類（たとえば紙 、セルロース、セルロース誘導体［酢酸セルロースやニトロセルロース］などの セルロース材料）、シリカ、ガラス繊維、無機材料（不活性化アルミニウム、け い藻土、あるいは塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレン共重合体、塩化ビニル− 酢酸ビニル共重合体などの重合体でできた多孔性高分子マトリックス中に均一に 拡散した微粉砕した他の無機材料、天然布地（たとえば木綿）および合成布地（ たとえばナイロン）、多孔性ゲル（シリカゲル、アガロース、 デキストラン、ゼラチン）、高分子フィルム（たとえばポリアクリルアミド）、 磁性粒子、微量定量プレート、ポリスチレンチューブ、蛋白結合膜、アガロース 、セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎ ｃ．、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（Ｐｏｉｎ ｔｅｔ−Ｇｉｒａｒｄ、フランス）、シリコン粒子、多孔性繊維マトリックスな どである。固相は合成微粒子が好ましく、直径０．１〜１０ミクロンのポリスチ レン、塩化ビニルまたはラテックスでできた合成微粒子が望ましい。 II．被検体に対するポリクロナール抗体の分別方法 本発明は、被検体に対するポリクロナール抗体を分別してそれぞれＨＥ抗体お よび非ＨＥ抗体を含有する分画をもたらす方法も提示する。被検体に対するポリ クロナール抗体は、当該技術分野で既知の方法を使って産生できる。たとえば、 ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、等々の宿主動物に被検体またはそのフラグメン トを単独であるいは必要に応じて適当な担体に接合させて注入し、抗体反応を引 き起こして抗体を生み出すことができる。 この方法では、ＨＥ部位を結合分子またはＨＥ抗体のいずれ かでマスクされた被検体（「マスクされた被検体」）に対してポリクロナール抗 体を曝露する。マスクされた被検体と結合し、しかも溶出できる抗体は、遊離被 検体および被検体−結合分子の複合体の双方と結合する非ＨＥ抗体である。した がって、遊離状態であるいは複合体の形であっても、被検体を検出するための非 ＨＥ抗体を使った免疫検定法ではバイアスが生じない。こうして得られた非ＨＥ 抗体は、ＭＯＬＹ免疫検定法でも（プローブ抗体または捕捉抗体、あるいはその 両者として）、競合的免疫検定法でも（捕捉抗体として）使用することができる 。他方、マスクされた被検体と結合しないポリクロナール抗体はＨＥ抗体である 。ＨＥ抗体は、遊離被検体に特異な検定法で使用するか、もしくは前述のように バイアスの生じる被検体検定法（ＭＯＬＹ免疫検定法であれＭＯＮＯ免疫検定法 であれ）に加えてそのようなバイアスを緩和もしくは解消するのに利用できる。 前述の分別は、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行うのが好まし い。マスクされた被検体は、結合分子、ＨＥ抗体、または非ＨＥ抗体と架橋する のが好ましい。架橋は、当該分野で既知の方法もしくは当業者であれば知ってい るその改 良法により行うことができる。分子の架橋の方法を開示している文献の例として は、Ｔ．Ｈ．ＪｉによるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９１巻５ ８０頁（１９８３年）；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇらによる「Ｂｉｏｃａｔａｌyｓｔ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ 」（Ｍ．Ｅ．Ｈｉｍｍｅｌ、Ｇ．Ｇｅｒｏｇｉｏｕ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤＣ（１９９３年））第２２章２６ ６〜２８２頁；Ｍ．Ｎ．Ｇｕｐｔａによる同書第２６章３０７〜３２６頁；「Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ」第２版（Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボストン ）がある。これらの発表文献は、引用して本書の一部とする。 こうして得られた複合体は、固相に直接結合するか、もしくは固相上に固定化 したＨＥ抗体などの結合剤を利用して固相に結合し、アフィニティークロマトグ ラフィーで利用してＨＥ抗体を選択するのが好ましい。アフィニティークロマト グラフィーの一般的方法、たとえば抗体および固相の準備、およびその 手順は、当該技術分野で既知のものであり、たとえば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｕｌ ｌｅｔｉｎ １０９９「Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」（１９９０年）； Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ 」（１９９３年）；および「分子生物学の方法」第１０巻「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｓ」（Ｍ．Ｍ．Ｍａｎｓｏｎ編）８９〜９１頁（１ ９９２年）；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」の Ａ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅらによる第１０章２０２〜２３２頁（Ｓｉｅｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード、１９８２年）；および「Ｃｕ ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」第２巻「 蛋白分離用アフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」のＷ． Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎによる３７〜４３頁（１９９１年）を参照されたい。これら の公表文献は本願中で引例とする。 図２に、例としてＰＳＡ、ＡＣＴおよびＨＥ_PSA抗体を使ってＨＥ抗体および 非ＨＥ抗体にポリクロナール抗体を分別する３種類の方法を示している。この方 法は次のとおりである。 パートＡ：ＡＣＴを使ったＰＳＡとの結合 ＡＣＴを、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、スウェーデンから市販）などの固相に抱合さ せる。精製したＰＳＡをＡＣＴと反応させて、隠れるエピトープ（ＨＥ）をマス クするＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が生成する。この複合体を化学的架橋によりさらに 安定させることもできる。ＰＳＡに対するポリクロナール抗体をＰＳＡ−ＡＣＴ −固相とインキュベートすると、ＨＥ_PSA抗体は未結合である。隠れていないエ ピトープに特異な非ＨＥ_PSA抗体、たとえばｎＨＥ１およびｎＨＥ２は結合し、 低ｐＨなどの標準的方法で溶出できる。こうして、ポリクロナール抗ＰＳＡ抗体 がＨＥ_PSA抗体および非ＨＥ_PSA抗体に分離される。 パートＢ：ＨＥ_PSA抗体（αＨＥ）を使ったＰＳＡとの結合 ＨＥ_PSA抗体（αＨＥ）を、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂなどの固相 に抱合させる。精製したＰＳＡをαＨＥと反 応させて、隠れているエピトープ（ＨＥ）をマスクするＰＳＡ−αＨＥ複合体を 生成する。この複合体を化学的架橋によりさらに安定させることもできる。ＰＳ Ａに対するポリクロナール抗体をＰＳＡ−αＨＥ−固相とインキュベートすると 、ポリクロナールＨＥ_PSA抗体は固体相に結合しない。他方、ポリクロナール非 ＨＥ_PSA抗体は結合し、低ｐＨなどの標準的方法で溶出できる。特定のαＨＥが ＰＳＡ上のＨＥすべてをマスクしない場合には、他のＨＥ部位に向けた追加のＨ Ｅ抗体を同時に、あるいは好ましくは順次分画カラムで使用することができる点 に注目されたい。 パートＣ：非ＨＥ_PSA抗体（αｎＨＥ１）を使ったＰＳＡとの結合とその後の ＨＥ_PSA抗体（αＨＥ）を使ったＨＥのブロック 隠れていないエピトープ１（ｎＨＥ１）に向けた非ＨＥ_PSA抗体（αｎＨＥ１ ）を、臭化シアン活性化セファロース−４Ｂなどの固相に抱合させる。精製した ＰＳＡをαｎＨＥ１と反応させて、ＰＳＡ−αｎＨＥ１複合体を生成する。ＨＥ_PSA 抗体（αＨＥ）をＰＳＡ−αｎＨＥ１と反応させて、隠れているエピトープ （ＨＥ）をマスクする複合体を精製する。この複合体 を化学的架橋によりさらに安定させることもできる。ＰＳＡに対するポリクロナ ール抗体を固相−αｎＨＥ１−ＰＳＡ−αＨＥとインキュベートすると、ＨＥお よびｎＨＥ１に対する抗体は固相に結合しない。ｎＨＥ１以外の隠れないエピト ープに対する非ＨＥ_PSA抗体は固相に結合し、低ｐＨなど標準的な方法で溶出で きる。固相に結合しない抗体は、方法ＡまたはＢによってさらに分離することが できる。こうして、ポリクロナール抗ＰＳＡ抗体はＨＥ_PSA抗体、ｎＨＥ１に対 する抗体、およびｎＨＥ１以外のｎＨＥに分離される。特定のαＨＥがＰＳＡ上 のＨＥすべてをマスクしない場合には、他のＨＥ部位に向けた追加のＨＥ抗体を 同時に、あるいは好ましくは逐次分画カラムで使用することができる点に注目さ れたい。 III．ＰＳＡ検定のキャリブレーターおよび対照として有用な被検体−ＨＥ抗体 の複合体 本発明では、被検体の検定におけるキャリブレーターおよび対照として役立つ 被検体−ＨＥ抗体の複合体も提示する。この複合体は、被検体に過剰なＨＥ抗体 を加えることで生成できる。ＨＥ抗体は、被検体の２倍から１００倍多いことが 好ましく、１０倍多いことがより望ましい。あるいは、被検体をＨＥ区隊 に架橋することができる。前述の被検体と結合分子の架橋方法が、被検体とＨＥ 抗体の架橋にも同じく適用できる。複合体は、リン酸緩衝食塩水、トリス−ＨＣ ｌ、またはＨＥＰＥＳなどの不活性緩衝液中に保存するのが好ましい。貯蔵温度 は２〜２５℃が望ましい。ｐＨは５〜９が望ましい。被検体の検定でキャリブレ ーターまたは対照の役もなす被検体とその結合分子の架橋複合体も、同じように して生成できる。 以下に、本発明の実施例を示すが、これらに限定されるものではない。 実施例 実施例Ｉ 新しいＰＳＡ検定方法 器（本出願人）で実施したが、本発明では遊離ＰＳＡとは結合するがＰＳＡ−Ａ ＣＴ複合体とは結合しないＭＡＢ ９Ｂ１０または５Ａ１０（前述）０〜２０μ ｇ／ｍＬを追加含有す Ａｓｓａｙ試薬としては次のものがある。（１）遊離ＰＳＡおよび複合体化ＰＳ Ａ（すなわちＡＣＴと複合体を形成した ＰＳＡ）の双方と結合し捕捉する捕捉抗体ＭＡＢ Ｈ５０で被覆された微粒子（ 「抗ＰＳＡ被覆微粒子」）、および（２）検出用にアルカリホスファターゼで標 識されたＰＳＡに対するヤギポリクロナール抗体（プローブ抗体として働く）（ 「ヤギポリクロナール抗ＰＳＡ：アルカリホスファターゼ抱合体」または「プロ ーブポリクロナール抗体」）。 前立腺癌患者から採取した血清試料を試験サンプルとした。 らによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍ．１４巻２号１１５〜１１９頁（１９９１年）お よびＥＰ−Ａ−２８８，７９３；ＬｕｄｉｎｇｔｏｎらによるＣｌｉｎ．Ｃｈｅ ｍ．３４巻９号１７２６〜１７３２頁（１９８８年）に記載されている。反応セ ルの構成要素はＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４巻９号１７２７頁の図２（ａ）に示さ れている。この場合、反応方法は微粒子酵素免疫検定法（ＭＥＩＡ）のものと同 じで以下のとおりである。 ル、抗ＰＳＡ被覆微粒子および検定希釈剤を反応セルのインキュベーションウェ ルに入れる。この反応混合液をインキュベートしている間に、サンプル中の遊離 ＰＳＡおよび複合体化 ＰＳＡが抗ＰＳＡ被覆微粒子と結合して抗体−抗原複合体を形成する。ＭＡＢ ９Ｂ１０が次いで抗ＰＳＡ被覆微粒子と結合しているＰＳＡ（ＡＣＴと複合体を 形成していない）と結合して、抗体−抗原−抗体複合体を形成する。 マトリックスに移す。微粒子はガラス繊維マトリックスと不可逆的に結合する。 （３）マトリックスを洗浄して未結合物質、たとえば血清蛋白、検定希釈剤、 および微粒子に結合していないＭＡＢ９Ｂ１０を除去する。 （４）ヤギポリクロナール抗ＰＳＡ：アルカリホスファターゼ接合体をマトリ ックスに加え、抗体−抗原−抗体複合体に結合させる。 （５）マトリックスを洗浄して未結合物質を除去する。 （６）基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）をマトリック スに加えると、表面結合アルカリホスファターゼが非蛍光発生ＭＵＰを４−メチ ルウンベリフェロン センブリで測定する。 上記の検定の工程は別々に行ったが、サンプルの代わりに遊離ＰＳＡを含有す るキャリブレーターおよび対照を同時に使用した。サンプル（すなわちパネル） の読取り値をキャリブレーターから読み取って（表１）、ＰＳＡ値を求めたとこ ろ、表２および表３に報告するとおりになった。 上記の表から、検定における遊離ＭＡＢ ９Ｂ１０の量が増えるとキャリブレ ーション曲線の信号が減り、サンプルパネル値が高くなることがわかる。ＭＡＢ ９Ｂ１０がパネルの値に及ぼす影響は、１０μｇ／ｍｌ付近で飽和するようで ある。上記の実験を、ＭＡＢ ９Ｂ１０の代わりにＭＡＢ ５Ａ１０を使って繰 り返し行ったが、同じ様な結果が出た。 次の実験では、前記の検定希釈剤中のＭＡＢ ９Ｂ１０が １０μｇ／ｍｌという飽和レベルを使って、遊離ＰＳＡと複合体ＰＳＡの間のバ イアスを実証した。遊離ＰＳＡを含有するサンプルを精製したＡＣＴと混和して 、複合体を形成させた。精製ＰＳＡおよびＡＣＴはマルモ大学のＨａｎｓ Ｌｉ ｌｊａ博士から入手した。ＰＳＡおよびＡＣＴの精製ならびにＰＳＡとＡＣＴの 複合体の生成はすでに述べられているとおりである（Ａ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓ ｏｎらによるＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４巻７５５〜７６３頁（１９９ ０年））。精製した精液ＰＳＡを７．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％ アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に入れ、これに １００モル倍過剰の精製ＡＣＴを混和した。ＰＳＡの対照サンプルをＡＣＴの代 わりに緩衝液と混和した。これらのサンプルを３５℃で一晩インキュベートし Ａ Ａｓｓａｙに以下の修正を施した方法でで検定した。 １０の入った検定希釈剤（すなわち検定希釈剤に１０μｇ／ｍＬの９Ｂ１０を添 加） Ｂ Ｈ５０プローブ抗体ならびにＭＡＢ Ｈ１１７捕捉抗体（すなわちＨ１１７ 被覆微粒子および標識Ｈ５０を使用） 前述のようにして検定を行った。表４に、遊離ＰＳＡサンプルおよびＡＣＴを 添加したＰＳＡサンプルで得られたＰＳＡの量を示す。ＰＳＡ対照に比べて、Ａ ＣＴを含有するサンプルで検出されたＰＳＡの量が少ない場合、バイアスが生じ ているのを示す。 表４のデータから、ＭＯＮＯ検定法（ＭＡＢ Ｈ５０をプローブ抗体とし、Ｍ ＡＢ Ｈ１１７を捕捉抗体とする）にはバイアスがないことがわかる。それに対 して、ＭＯＬＹ検定法 ％のバイアスが見られ、この検定法に遊離ＭＡＢ ９Ｂ１０を加えるとそのバイ アスが劇的に減少することがわかる。 ＭＯＮＯ検定法でＭＡＢ Ｈ５０を捕捉抗体として、ＭＡＢ Ｈ１１７をプロ ーブ抗体として利用して前記の実験を繰り返し行った。このようなＭＯＮＯ検定 法でもバイアスが生じ、また検定希釈剤に遊離９Ｂ１０を加えるとそのバイアス を無くすことができるのがわかった。 実施例II キャリブレーターおよび対照として有用なＰＳＡ−ＨＥ抗体複合体 ＨＥ_PSA抗体をＰＳＡと混和するとＰＳＡ−ＨＥ_PSA抗体複合体が形成され、そ こでは隠れるエピトープはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体と同様にブロックされる。この 物質を、ＰＳＡ検定でキャリブレーターまたは対照として利用することができる 。 精液ＰＳＡをｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水に入 れたものを１０倍過剰にある９Ｂ１０と混和し、２〜８℃で一晩インキュベート する。インキュベートした後、ＰＳＡ− で０、２、１０、３０、６０および１００ｎｇ／ｍＬに希釈す で使って、ＰＳＡ上のＨＥをマスクすることでＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を模倣する 。 実施例III ＰＳＡ ＨＥおよびＰＳＡ非ＨＥに対するポリクロナール抗体を選択するための 遊離ＰＳＡへのＨＥ抗体の架橋 本実施例では、前記図２のパートＢで示した分別方法の実行について説明する 。方法を説明するのにＭＡＢ ５Ａ１０を使用するが、これの代わりにどのよう なＨＥ_PSA抗体でも、たとえばＭＡＢ ９Ｂ１０などを使用することができる。 最初の工程では、製造業者の推奨事項に従って臭化シアン活性化セファロース −４Ｂに５Ａ１０を架橋させる。（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ ｐｈｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、スウェーデン、２３〜３０頁 （１９９３年））。 その手順は次のとおりである。 アフィニティーカラム用の５Ａ１０を０．１Ｍリン酸水素ナトリウム（Ｎａ₂ ＨＰＯ₄）と混和し、ｐＨを９．０に調整する。それから５Ａ１０を臭化シアン 活性化セファロース−４Ｂゲルと、ゲル１ｍＬに対して５Ａ１０を２ｍｇの割合 で混ぜる。混合液を静かに振盪させながら２〜８℃で一晩インキュベートする。 ５Ａ１０をセファロースゲルに結合させた後、ゲルを０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （ｐＨ８．０）で洗浄して未結合リガンドを除き、それから１Ｍエタノールアミ ン（ｐＨ８．０）と２〜８℃で混和して、ゲル中に残っている活性基をブロック する。ゲルを蒸留水または脱イオン水で洗浄してから、０．１Ｍ酢酸ナトリム緩 衝液と１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）、および０．１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄と１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で交互に２回洗浄する。カラムにＰＢＳ溶液（０．０１ Ｍ ＮａＨＰＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を充填して洗浄し、次 いで０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出する。それから カラムを０．１％アジ化ナトリウムを含有 するｐＨ７．２のＰＢＳで洗浄する。５Ａ１０アフィニティーカラムは２〜８℃ で保存する。 手順の次の工程では、ＰＳＡをセファロース４Ｂ−５Ａ１０に結合させてから 、化学的架橋によって５Ａ１０−ＰＳＡ複合体を安定させる。ＰＳＡが５Ａ１０ に結合すると、ＰＳＡ上のＨＥがブロックされるので、ＨＥは他のＨＥ_PSA抗体 と結合できない。架橋剤としてジメチルパレミデート（ＤＭＰ）を使って不溶性 蛋白を架橋する手順については、すでに述べられている（Ｃ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅ ｒらによるＪ．Ｂｉoｌ．Ｃｈｅｍ．２５巻１０７６６〜１０７６９頁（１９８ ２年））。 その手順は次のとおりである。 カラムからセファロース４Ｂ−５Ａ１０ゲルを取り除き、それをメスシリンダ ーに入れる。ゲルが落ち着いたならば、残留緩衝液を除く。パックされたゲル１ ｍＬにつき精製ＰＳＡ１０ｍｇを、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で 最初の濃度が２ｍｇ／ｍＬで加える。三角フラスコに移し、静かに振盪させなが ら２〜８℃で一晩インキュベートする。 一晩インキュベートした後に、ブフナー漏斗で１０容の０．２Ｍトリエタノー ルアミン、ｐＨ９．０（ＴＥＡ）でゲル を２回洗浄する。ゲルをビーカーに移し、ＴＥＡ中に入った４０ｍＭ ＤＭＰ（ ｐＨ９．０）５部を加える。室温で振盪させながら１時間インキュベートする。 ブフナー漏斗を使って１０〜２０容のＴＥＡ（ｐＨ９．０）および１０〜２０容 の０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４％）および０．０２％アジ化ナトリ ウムで洗浄する。 このプロセスの最終工程では、以下のような標準的アフィニティー手順でセフ ァロース４Ｂ−５Ａ１０−ＰＳＡカラム上のＰＳＡに対するポリクロナール抗体 を精製する。 抗ＰＳＡポリクロナール抗体をカラム緩衝液（０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水、 ｐＨ７．４）で１：１希釈する。（ポリクロナール抗体の例としては、ヤギ、ウ サギ、ヒツジ、マウスおよびラットのポリクロナール抗体が挙げられる。）サン プルをゆっくりとカラムに注入する。カラムに結合しなかった蛋白を採集する。 この分画にはＨＥ抗体が入っている。カラムをカラム緩衝液で洗浄し、２８０ｎ ｍで光学密度をモニターする。吸光度がベースラインまで下がったならば、結合 している非ＨＥ抗体を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で素早く溶出さ せる。分画を等容の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に 採集し、素早くｐＨを中性に調整する。精製したＨＥ抗体および非ＨＥ抗体の双 方を希望する緩衝液に対して透析し、０．２ミクロンの滅菌フィルターを通して 濾過してから２〜８℃で保存する。あるいは、抗体は凍結させてもよい。 本明細書で言及するあらゆる公表文献および特許出願は、個別に引例として指 示した場合と同様に、本明細書に参照として引用する。 前述の発明は、明確にしてわかりやすくする目的で図や例を使ってある程度詳 しく述べたが、当業者の技能の範囲内で様々な修正や変更を施すことも添付の請 求の範囲に入るものであることは明らかである。ここに示す基本的発明に対する 明らかな変更を可能にする今後の技術の進歩も請求の範囲に入る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ (72)発明者 キング，キヤロル・エー アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、キヤベル・アベニユー・ 1514 (72)発明者 アレクサンダー，デブラ・ビー アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ホースシユー・レーン・17577 (72)発明者 スミス，アラン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ジオ ン、ウエスト・タルマツジ・10831 (72)発明者 オマロー，スーザン・ビー アメリカ合衆国、イリノイ・60517、ウツ ドブリツジ、ホルシー・ドライブ・6415

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 生体サンプル中の被検体（「Ａ」）を検出もしくは定量するための免疫検 定法であり、該被検体は該サンプル中に遊離体の形（「遊離被検体」）でまたは 結合分子と結合して被検体と結合分子との複合体の形（「｛（Ａ）（結合分子） ｝」）で存在することができ、この方法は、 （ａ）被検体の特定クラスのエピトープに特異な抗体（「αＨＥ」）、被検体 の別のクラスのエピトープに特異な捕捉抗体（「αＮＨＥ」）、および被検体に 特異なプローブ抗体（「αＡ^*」）に被検体を接触させ、ただしプローブ抗体が ポリクロナール抗体であれば被検体はプローブ抗体よりも前に捕捉抗体に接触さ せ、 （ｂ）被検体に結合するαＡ^*の有無または量とサンプル中の被検体の有無ま たは量を関連づけるか、あるいは未結合αＡ^*の量をサンプル中の被検体の有無 または量と関連づける工程から成り、 ただしαｎＨＥは遊離被検体および｛（Ａ）（結合分子）｝の双方と結合でき 、 αＨＥは遊離被検体とは結合できるが｛（Ａ）（結合分子）｝とは結合できな い免疫検定法。 ２． 被検体および結合分子が蛋白である、請求項１に記載の免疫検定法。 ３． プローブ抗体がポリクロナール抗体である、請求項１に記載の免疫検定法 。 ４． 捕捉抗体がモノクロナール抗体である、請求項１に記載の免疫検定法。 ５． さらに、固相からサンプルと未結合αＨＥを分離してから固相にαＡ^*を 加え、次いで未結合αＡ^*を分離して固相に結合しているαＡ^*を検出する工程を 含んで成る、請求項１に記載の免疫検定法。 ６． プローブ抗体が、遊離被検体とは結合するが｛（Ａ）（結合分子）｝とは 結合しない抗体、ならびに被検体および｛（Ａ）（結合分子）｝の双方と結合す る抗体とを含んで成るポリクロナール抗体の集団である、請求項３に記載の免疫 検定法。 ７． αＨＥがＭＡＢである、請求項１に記載の免疫検定法。 ８． プローブ抗体が検出用に標識してある、請求項１に記載 の免疫検定法。 ９． 被検体が血清プロテアーゼであり、結合分子が血清プロテアーゼインヒビ ターである、請求項１に記載の免疫検定法。 １０． 被検体およびそれに対応する結合分子（括弧内）を、プロテインＣ（プ ロテインＣインヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（Ａ ＣＴ）、ＰＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α₂−マクログロブリン）、トロンビン（ 抗トロンビンIII）、Ｃ₁−エステラーゼ（Ｃ₁−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（Ｐ ＡＩ−１）、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α₂−抗プラスミン）、ＰＳ Ａ（α₁−プロテアーゼインヒビター）、ＰＳＡ（プロテインＣインヒビター） 、およびその逆の組み合わせから成る群から選択する、請求項１に記載の免疫検 定法。 １１． 被検体がＰＳＡであり、結合分子がＡＣＴである、請求項１０に記載の 免疫検定法。 １２． αＨＥを９Ｂ１０、５Ａ１０、ＰＳＡ６、ＰＳＡ３０、ＰＳＡ１７、Ｐ ＳＡ１９、ＰＳＡ２０、ＰＳＡ２５から成るＭＡＢの群から選択する、請求項１ １に記載の免疫検定法。 １３． プローブ抗体がＭＡＢ Ｈ５０であり、捕捉抗体が ＭＡＢ Ｈ１１７である、請求項１１に記載の免疫検定法。 １４． サンプル中被検体の検定を実施するためのキットで、被検体はサンプル 中に遊離被検体の形でも、あるいは結合分子と結合して複合体を形成した被検体 −結合分子複合体の形でも存在でき、 （ａ）遊離被検体と結合できるが被検体−結合分子複合体とは結合できない該 被検体に特異な抗体（αＨＥ）、 （ｂ）該被検体に特異な捕捉抗体、および （ｃ）該被検体に特異なプローブ抗体を含んで成るキット。 １５． 被検体がＰＳＡ、結合分子がＡＣＴ、捕捉抗体およびαＨＥがＭＡＢ、 プローブ抗体がポリクロナール抗体である、請求項１４に記載のキット。 １６． さらに、αＨＥに結合した被検体の複合体を含有する容器を含んで成る 、請求項１４に記載のキット。 １７． αＨＥに架橋した被検体を含んで成る複合体で、該被検体は遊離被検体 としても、あるいは結合分子と結合して被検体−結合分子複合体を形成した形で も存在でき、αＨＥは遊離被検体に結合できるが被検体−結合分子複合体とは結 合できない被検体に対する抗体である複合体。 １８． 被検体が血清プロテアーゼであり、結合分子が血清プロテアーゼインヒ ビターである、請求項１７に記載の複合体。 １９． 被検体およびそれに対応する結合分子（括弧内）を、プロテインＣ（プ ロテインＣインヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（Ａ ＣＴ）、ＰＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α₂−マクログロブリン）、トロンビン（ 抗トロンビンIII）、Ｃ₁−エステラーゼ（Ｃ₁−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（Ｐ ＡＩ−１）、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α₂−抗プラスミン）、ＰＳ Ａ（α₁−プロテアーゼインヒビター）、ＰＳＡ（プロテインＣインヒビター） 、およびその逆の組み合わせから成る群から選択する、請求項１７に記載の複合 体。 ２０． 被検体に対するポリクロナール抗体を分別する方法で、被検体は遊離被 検体としても、あるいは被検体と結合分子の複合体（「被検体−結合分子複合体 」）としても存在でき、 （ａ）ポリクロナール抗体を被検体−結合分子複合体もしくはＨＥ抗体に結合 している被検体（「被検体−ＨＥ抗体複合体」）のいずれかに、ポリクロナール 抗体が結合できるよう十分な時間接触させ、 （ｂ）未結合ポリクロナール抗体または結合ポリクロナール抗体あるいはその 両者を採集する工程を含んで成り、 ただしＨＥ抗体は遊離被検体とは結合するが被検体−結合分子複合体とは結合 せず、 結合したポリクロナール抗体は遊離被検体と被検体−結合分子複合体の双方を 認識し、また未結合ポリクロナール抗体は遊離被検体を認識するが被検体−結合 分子複合体は認識せず、 被検体は生体サンプル中に存在する抗原で結合分子は生体サンプルに内在性の 蛋白である方法。 ２１． 被検体およびその結合分子（括弧内）を、プロテインＣ（プロテインＣ インヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（ＡＣＴ）、Ｐ ＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α₂−マクログロブリン）、トロンビン（抗トロンビ ンIII）、Ｃ₁−エステラーゼ（Ｃ₁−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（ＰＡＩ−１） 、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α₂−抗プラスミン）、ＰＳＡ（α₁−プ ロテアーゼインヒビター）、ＰＳＡ（プロテインＣインヒビター）、およびその 逆の組み合わせから成る群から選択する、請求項２０に記載の方法。 ２２． 複合体を付着させる固相で、 （ａ）被検体−結合分子複合体、 （ｂ）被検体−ＨＥ抗体複合体、 （ｃ）αｎＨＥ１−被検体−αＨＥ複合体から成る群から選択し、 ただし被検体は生体サンプル中に存在する抗原で結合分子は生体サンプルに内 在性の蛋白であり、 被検体は結合分子に結合して被検体−結合分子複合体を形成し、 ＨＥ抗体は遊離被検体とは結合するが被検体−結合分子複合体とは結合せず、 αＨＥは被検体上のＨＥと呼ばれるエピトープと結合する抗体であり、 αｎＨＥ１は被検体上のｎＨＥと呼ばれるエピトープと結合する抗体である固 相。 ２３． 被検体およびその結合分子（括弧内）を、プロテインＣ（プロテインＣ インヒビター）、エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（ＡＣＴ）、Ｐ ＳＡ（ＡＣＴ）、ＰＳＡ（α₂−マクログロブリン）、トロンビン（抗トロンビ ンIII）、Ｃ₁−エステラーゼ（Ｃ₁−インヒビター）、ｔ−ＰＡ（ＰＡ Ｉ−１）、ｕＰＡ（ＰＡＩ−１）、プラスミン（α₂−抗プラスミン）、ＰＳＡ （α₁−プロテアーゼインヒビター）、ＰＳＡ（プロテインＣインヒビター）、 およびその逆の組み合わせから成る群から選択する、請求項２２に記載の固相。 ２４． 結合分子に架橋する被検体で、該被検体は生体サンプル中に遊離被検体 としても、あるいは生体サンプルに内在性の結合分子に結合した形でも存在する ことのできる被検体。