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TWI535445B - Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法 - Google Patents

Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法 Download PDF

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TWI535445B
TWI535445B TW100100942A TW100100942A TWI535445B TW I535445 B TWI535445 B TW I535445B TW 100100942 A TW100100942 A TW 100100942A TW 100100942 A TW100100942 A TW 100100942A TW I535445 B TWI535445 B TW I535445B
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Description

Wnt拮抗劑及治療和篩選方法 相關應用之相互參考
本申請案主張2010年1月12日提出申請之美國臨時申請案號61/294,270、2010年10月15日提出申請之美國臨時申請案號61/393,675及2010年12月17日提出申請之美國臨時申請案號61/424,408的優先權，其全部內容皆納為本文之參考資料。
本發明提供用於治療癌症和其他與Wnt相關之疾病或病症的新穎組成物和方法，以及用於鑑定額外之新穎治療劑的新穎篩選方法。特別是，本發明提供包含用於治療實體瘤及其他與Wnt相關之疾病和病況的可溶性受體蛋白質之Wnt拮抗劑。
癌症為已開發國家中的一個主要死亡原因，僅在美國每年即有超過百萬人被診斷罹患癌症且造成50萬人死亡。總體而言，據估計每3人中超過1人在其一生中會發展出某種形式之癌症。癌症有超過200種不同的類型，其中四種-乳癌、肺癌、大腸直腸癌和前列腺癌-佔了新病例的一半以上(Jemal et al.,2009,Cancer J. Clin.,58:225-249)。
Wnt傳信途徑已被鑑定為癌症療法的潛在標的。Wnt傳信途徑為胚胎模式形成、胚胎後期組織維護及幹細胞生物學之數種關鍵調節因子。更具體地說，Wnt傳信在產生細胞極性和細胞命運特化(包括幹細胞群之自我更新)上扮演重要角色。Wnt途徑未受控管地活化與許多人類癌症有關，癌症中腫瘤細胞之命運發展可被改變以維持其未分化和增生狀態。因此，癌變可經由奪取控制正常發展之恆定機制及由幹細胞進行之組織修復來進行(reviewed in Reya & Clevers,2005,Nature,434:843-50;Beachy et al.,2004,Nature,432:324-31)。
Wnt傳信途徑首先係在發展突變體無翅(wg)果蠅及小鼠原癌基因int-1(現在稱為Wnt1)中闡明(Nusse & Varmus,1982,Cell,31:99-109;Van Ooyen & Nusse,1984,Cell 39:233-40;Cabera et al.,1987,Cell,50:659-63;Rijsewijk et al.,1987,Cell 50:649-57)。Wnt基因編碼分泌型脂質修飾之糖蛋白，其中19種已在哺乳動物中鑑定出。這些分泌型配體活化由Frizzled(FZD)受體家族成員及低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5或6(LRPS/6)所組成的受體複合物。該FZD受體為G-蛋白偶聯受體(GPCR)超家族的七次跨膜結構區蛋白且含有一個大胞外N端配體結合區，此結合區具有10個經保留之半胱胺酸，稱為富含半胱胺酸之結構區(CRD)或Fri結構區。有十種人FZD受體，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同FZD CRD對特殊Wnt具有不同之結合親和力(Wu & Nusse 2002,J. Biol. Chem.,277:41762-9)，且FZD受體已被分類成下述活化典型β-連鎖蛋白(β-catenin)途徑者及活化非典型途徑者(Miller et al.,1999,Oncogene,18:7860-72)。為了形成與FZD配體結合之受體複合物，FZD受體與LRP5/6，單次跨膜蛋白(single-pass transmembrane protein))(具有四個胞外EGF樣結構區，被6個YWTD胺基酸重複子分隔)交互作用(Johnson et al.,2004,J. Bone Mineral Res.,19:1749)。
受體結合時典型Wnt傳信途徑被活化係經由胞漿蛋白Dishevelled(Dsh)直接與FZD受體交互作用介導，此可使細胞質穩定及β-連鎖蛋白積累。無Wnt信號時，β-連鎖蛋白係局部位於包含腫瘤抑制蛋白腺瘤結腸息肉(APC)和Axin的細胞質破壞複合物中。這些蛋白質作為關鍵支架以允許糖原合成酶激酶3β(GSK3β)結合β-連鎖蛋白並將其磷酸化，且將其標記以經由泛素/蛋白酶體途徑降解。Dsh活化造成GSK3β磷酸化以及該破壞複合物之分解。然後，累積之細胞質β-連鎖蛋白被轉運入細胞核，在該處與TGF/LEF族之DNA結合蛋白交互作用以活化轉錄作用。
除了典型傳信途徑外，Wnt配體亦活化β-連鎖蛋白倚賴性途徑(Veeman et al.,2003,Dev. Cell,5:367-77)。非典型Wnt傳信涉及多種過程，但最令人信服的為經由類似於果蠅平面細胞極性(PCP)途徑之機制涉入原腸運動。其他潛在之非典型Wnt傳信機制包括鈣流、JNK以及小G蛋白和異三聚體G蛋白二者。拮抗性通常可在典型和非典型途徑之間觀察到，而且有證據指出非典型傳信可遏制癌細胞形成(Olson & Gibo,1998 Exp. Cell Res.,241:134;Topol et al.,2003,J. Cell Biol.,162:899-908)。因此，在某些情況下，FZD受體係作為典型Wnt傳信途徑之負向調節子。例如：當與FZD1共同表現時，FZD6經由TAK1-NLK途徑壓制經Wnt3a誘導之典型傳信(Golan et al.,2004,JBC 279:14879-88)。類似地，FZD2顯示出在Wnt5a的存在下經由TAK1-NLK MAPK級聯反應拮抗典型之Wnt傳信(Ishitani et al.,2003,Mol. Cell. Biol.,23:131-39)。
典型Wnt傳信途徑亦在維持小腸和大腸幹細胞群中扮演核心角色，此途徑之不適當活化在大腸直腸癌中扮演重要角色(Reya & Clevers,2005,Nature,434:843)。小腸之吸收上皮細胞係排列成絨毛和腺窩。幹細胞存在於腺窩中，慢慢地分裂以產生快速增殖細胞，使遷出腺窩之所有分化的細胞群佔據小腸絨毛。Wnt傳信之級聯反應在控制沿著腺窩-絨毛軸之細胞命運中具有主導作用，對維持幹細胞群是必要的。經由同源重組遺傳性喪失TCF7/2(Korinek et al.,1998,Nat. Genet.,19:379)或過度表現Dickkopf-1(Dkk1)(一種強力之分泌型Wnt拮抗劑)(Pinto et al.,2003,Genes Dev.,17:1709-13;Kuhnert et al.,2004,PNAS,101:266-71)來破壞Wnt傳信會造成小腸幹細胞群竭盡。
Wnt傳信在癌症中之角色首先係由確定Wnt1(原先為int1)為乳腺腫瘤中之致癌基因而被揭露，該乳腺腫瘤係經由在附近插入小鼠病毒轉形而成(Nusse & Varmus,1982,Cell 31:99-109)。至今已累積更多Wnt傳信在乳癌中之角色的證據。例如：β-連鎖蛋白轉殖基因在乳腺中過度表現造成過度增生及腺癌(Imbert et al.,2001,J. Cell Biol. 153:555-68;Michaelson & Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，然而喪失Wnt傳信會擾亂正常之乳腺發育(Tepera et al.,2003,J. Cell Sci.,116:1137-49;Hatsell et al.,2003,J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58)。最近,乳腺幹細胞已被證明係由Wnt傳信活化(Liu et al.,2004,PNAS,101:4158-4163)。在人類乳癌中，β-連鎖蛋白之積累涉及超過50%之癌症中的Wnt傳信活化，雖然並未鑑定出特定之基因突變，但觀察到Frizzled受體表現上調(Brennan & Brown,2004,J. Mammary Gland Neoplasia,9:119-31;Malovanovic et al.,2004,Int. J. Oncol.,25:1337-42)。
大腸直腸癌最常經由活化Wnt傳信級聯反應中之突變起動。全部大腸直腸癌中約有5-10%為遺傳性，主要形式之一為家族性腺瘤性息肉病(FAP)，此為一種體染色體顯性遺傳疾病，其中約80%受影響之個體中之腺瘤樣息肉(APC)基因含有胚系突變。其他Wnt途徑組成分(包括Axin的及β-連鎖蛋白)中亦被鑑定出突變。個別腺瘤為含有第二個去活化之等位基因的上皮細胞無性繁殖瘤，而大量FAP腺瘤透過致癌基因和/或腫瘤抑制基因的額外突變不可避免地造成腺癌發展。再者，Wnt傳信途徑活化(包括APC及β-連鎖蛋白中之功能獲得突變(gain-of-function mutation))可在小鼠模型中誘導增生發展及腫瘤生長(Oshima et al.,1997,Cancer Res,57:1644-9;Harada et al.,1999,EMBO J.,18:5931-42)。
本發明提供多種結合一或多種人Wnt蛋白之作用劑(包括，但不限於：可溶性FZD受體及其他包含Fri結構區之作用劑)，以及使用那些作用劑之新穎方法。本發明進一步提供將該作用劑投予需要彼等之個體以使用該作用劑來治療癌症的方法。於一些體系中，該方法包含抑制癌細胞生長。於某些體系中，該Wnt結合劑為一種Wnt拮抗劑。本發明亦提供篩選這類Wnt結合劑的新穎方法。同樣地，本發明提供編碼該作用劑之多核苷酸、製造該作用劑之方法，以及各種包含該作用劑之組成物。
因此，於一觀點中，本發明提供一種抑制腫瘤生長的方法。於某些體系中，該方法包含將腫瘤與有效量之結合一或多種Wnt蛋白(例如，人Wnt蛋白)的作用劑接觸。該方法可在活體內或體外進行。於某些體系中，該腫瘤係在個體中，而腫瘤與作用劑之接觸包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。
於另一觀點中，本發明提供降低包含癌幹細胞之腫瘤中的癌幹細胞發生頻率之方法。因此，本發明亦提供降低腫瘤之致瘤性的方法。於一些體系中，該方法包含將腫瘤與有效量之結合一或多種Wnt蛋白(例如，人Wnt蛋白)的作用劑接觸。該方法可在活體內或體外進行。例如：該接觸可包含投予具有腫瘤之人類有效量之Wnt結合劑。
於另一觀點中，本發明提供誘導腫瘤中之細胞分化，或誘導腫瘤中之分化標記表現的方法。於某些體系中，該方法包含將腫瘤與有效量之結合一或多種Wnt蛋白(例如，人Wnt蛋白)的作用劑接觸。該方法可在活體內或體外進行。
再於另一觀點中，本發明提供治療個體中之癌症的方法，其包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。
於一另外之觀點中，本發明提供治療個體內之疾病的方法，其中該疾病與Wnt傳信活化相關，該方法包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。
於另一觀點中，本發明提供治療個體中之病症的方法，其中該病症之特徵為幹細胞和/或祖細胞之水準提高，該方法包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該Wnt結合劑為一種多肽。於某些體系中，該作用劑為一種可溶性受體。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該作用劑包含結合一或多種Wnt蛋白之FZD受體的Fri結構區，或FZD Fri結構區之片段。於某些體系中，該FZD受體為人FZD受體。例如：該Fri結構區可能來自一人FZD4或人FZD5。於某些替代體系中，該作用劑為可包含結合一或多種Wnt蛋白之人FZD8受體的Fri結構區或該Fri結構區之片段。於某些體系中，該Wnt結合劑為一種可溶性FZD受體。於替代之體系中，該Wnt結合劑不包含FZD受體之Fri結構區。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該作用劑包含結合一或多種Wnt蛋白之可溶性Frizzled相關蛋白(SFRP)之結構區，或SFRP Fri結構區之片段。於某些體系中，該SFRP為人SFRP。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該作用劑包含結合一或多種Wnt蛋白之Ror蛋白的Fri結構區，或Ror Fri結構區之片段。於某些體系中，該Ror蛋白為人Ror蛋白。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該作用劑進一步包含人Fc區。於某些體系中，該Wnt結合劑為一種融合蛋白。於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：1。於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：46。於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：48。於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：50。於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：50及選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：50及選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：71。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：53及選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：53及選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。於一些體系中，該Wnt結合劑(信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：71。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該Wnt結合劑結合一或多種、二或多種、三或多種、或四或多種選自下列群組之人Wnt蛋白：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a及Wnt10b。於某些體系中，該作用劑結合Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a及Wnt7b。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該作用劑為Wnt拮抗劑。於某些體系中，該作用劑抑制Wnt傳信。於某些體系中，該作用劑抑制Wnt典型Wnt傳信。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該腫瘤或癌症為選自下列群組之腫瘤/癌症：大腸直腸腫瘤/癌症、胰臟腫瘤/癌症、肺腫瘤/癌症、卵巢腫瘤/癌症、肝腫瘤/癌症、乳房腫瘤/癌症、腎臟腫瘤/癌症、前列腺腫瘤/癌症、胃腸瘤/癌症、黑色素瘤、子宮頸腫瘤/癌症、膀胱腫瘤/癌症、膠質母細胞瘤及頭頸部腫瘤/癌症。
於上述各觀點以及此處提供之其他觀點的某些體系中，該方法進一步包含將腫瘤與第二治療劑接觸，或將第二治療劑投予該個體。於某些體系中，該第二治療劑為一種化學治療劑。於某些體系中，該第二化學治療劑為一種抗代謝物(如：吉西他濱(gemcitabine))或抗有絲分裂劑(如：紫杉烷，諸如太平洋紫杉醇)。
於另一觀點中，本發明提供包含選自下列群組之序列的多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66，以及產製該多肽之細胞及包含該多肽之組成物。亦提供包含該多肽及藥學上可接受之載體的醫藥組成物。此外，本發明亦提供包含編碼選自下列群組之多肽的多核苷酸之多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66，或者具有SEQ ID NO：2之序列者。同樣地，本發明提供包含該多核苷酸之載體和細胞。
於一另外之觀點中，本發明提供篩選作用劑之抗腫瘤活性和/或抗癌幹細胞之活性的方法。於某些體系中，該方法包含將已暴露於一種作用劑之第一實體腫瘤(例如：一種包含癌幹細胞之實體腫瘤)中的一或多種分化標記和/或一或多種幹細胞性標記的水準與尚未暴露於該作用劑之第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準相比較。於一些體系中，該方法包含：(a)令第一實體腫瘤暴露於該作用劑，但第二實體腫瘤則不；(b)評估在第一和第二實體腫瘤中之一或多種分化標記和/或一或多種幹細胞性標記的水準；及(c)將第一實體腫瘤中之一或多種分化標記的水準與第二實體腫瘤中之一或多種分化標記的水準相比較。於某些體系中，(a)該第一實體腫瘤中之一或多種分化標記相對於該第二實體腫瘤所增加的水準表示該作用劑之抗腫瘤或抗癌幹細胞活性；和/或(b)該一或多種幹細胞標記相對於該第二實體腫瘤所降低之水準表示該作用劑之抗腫瘤或抗癌幹細胞活性。於某些體系中，該作用劑結合一或多種Wnt蛋白。於某些體系中，該作用劑為可溶性FZD受體。於某些替代體系中，該作用劑為一種抗體，諸如抗FZD或抗Wnt抗體。於某些替代之體系中，該作用劑為小分子。
根據馬庫西(Markush)群組或其他替代分組法描述本發明之觀點或體系時，本發明不僅包含作為一個整體之上列全部群組，亦個別包含該群組之各成員以及該主要群組之所有可能的子群組，還有缺少一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除一或多個本發明所主張之任何群組成員。
發明之詳細說明
本發明提供新頴之作用劑，包括，但不限於結合一或多種人Wnts之包含人Frizzled(FZD)受體的Fri結構區、人分泌型Frizzled相關蛋白(SFRPs)，或Ror蛋白質的多肽。本發明亦提供包含該Wnt結合劑之相關多肽和多核苷酸、組成物以及製備Wnt結合劑的方法。本發明進一步提供使用Wnt結合劑之方法，諸如抑制腫瘤生長、治療癌症、誘導分化以及減少致瘤性的方法。本發明亦提供篩選用於鑑定具有抗腫瘤活性和/或抗癌幹細胞之活性的新穎Wnt結合劑作用劑之方法。
製造包含人FZD8之Fri結構區及Fc結構區之Wnt結合劑，此文中稱之為FZD8-Fc或FZD8-Fc(54F03)(實例1)。產生多種FZD8-Fc蛋白之變異體(實例10)。製造顯示出N端具有約95%或更高之同質性的FZD8-Fc蛋白(實例16)。使用數種FZD8-Fc變異體在顯示出FZD8-Fc變異體之半衰期至少為100小時之大鼠中進行藥物動力學研究(實例2和12；第1圖和表4)。以FZD8-Fc變異體54F15及54F16在猴子體內進行藥物動力學研究，其證明這些蛋白質具有至少100個小時之半衰期(實例13和表5)。以單獨之FZD8-Fc(54F03)或FZD8-Fc與化學治療劑之組合治療時顯示出可減少胰臟腫瘤、乳房腫瘤和結腸腫瘤的生長(實例3、5、6和8及第2、10、11B和13A圖)。此外，治療顯示出可減少胰臟模型中之CD44+細胞之百分比並降低癌幹細胞之發生頻率(實例3和8以及第3、4和13B圖)。以單獨之FZD8-Fc(54F03)或FZD8-Fc與化學治療劑之組合治療時顯示出可增加胰臟腫瘤細胞及結腸腫瘤細胞之細胞分化(實例4、7和9及第5-9、12、14和15圖)。以FZD8-Fc變異體治療時顯示出可抑制結腸及胰臟腫瘤生長，抑制程度係取決於該變異體(實例14、15和17及第17、18和21圖)。以FZD8-Fc變異體54F03及變異體54F16治療時顯示出可減少胰臟腫瘤中之CD44hi細胞以及CD44+CD202+細胞之百分比(實例15及第19圖)。
I.定義
此處所使用之“拮抗劑”一詞包括任何部分或完全阻斷、抑制或中和蛋白質(例如：癌幹細胞標記)之表現或生物活性的分子。阻斷、抑制或中和生物活性包括，但不限於抑制腫瘤生長。“拮抗劑”一詞包括任何部分或完全阻斷、抑制或中和Wnt途徑之生物活性的分子。合適之拮抗劑分子包括，但不限於天然FZD受體蛋白(包括可溶性FZD受體以及SFRPs之衍生物和Ror蛋白質之衍生物)之片段和/或胺基酸序列變異體。
“經分離”之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物為處於自然界中不存在之形式中的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括那些已被純化到一定程度使其不再為可在自然界中發現之形式。於一些體系中，經分離之抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物為大致上純質。
此處所使用之“大致上純質”係指一種物質，其至少為50%純質(即，不含污染物)，較佳地，至少為90%純質，更佳地，至少為95%純質，更佳地，至少為98%純質，再更佳地，至少為99%純質。
此處所使用之“可溶性受體”一詞係指在該受體之第一跨膜結構區前之受體蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式從細胞分泌出。於一些體系中，該受體蛋白為一種FZD受體。於一些體系中，該受體蛋白為一種Ror受體。
此處所使用之“FZD可溶性受體”一詞係指在該受體之第一跨膜結構區前之人FZD受體蛋白的N端胞外片段，其可以可溶性形式從細胞分泌出。包含整個N端胞外結構區(ECD)(此處稱為“FZD ECD”)以及較小片段之兩種FZD可溶性受體均在設想範圍內。此處亦揭示包含Fri結構區之FZD可溶性受體(此處稱為“FZD Fri”)。與包含整個FZD ECD之可溶性受體相比較，FZD Fri可溶性受體可顯示改變之生物活性(例如：蛋白質半衰期增加)。蛋白質半衰期可經由以聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)共價修飾來進一步增加。FZD可溶性受體包括FZD ECD或Fri結構區，其在框構內鏈接其他功能和結構蛋白，包括，但不限於人Fc區域(例如：來自免疫球蛋白IgGI、IgG2、IgG3的、IgG4的、IgA1、IgA2、IgD、IgE的或IgM之人Fc)；蛋白標籤(例如：myc、FLAG、GST)；其他內源性蛋白或蛋白片段；或任何其他有用之蛋白質序列，包括介於FZD ECD或Fri結構區與連接之蛋白質之間的任何連接子區。於某些體系中，FZD受體之Fri結構區係直接鏈接人Fc區。於某些體系中，該FZD受體之Fri結構區係鏈接人IgG1Fc(此處稱為“FZD Fri.Fc”)。於一些體系中，FZD受體之Fri結構區係以肽連接子鏈接人Fc區。FZD可溶性受體亦包括含有胺基酸插入、缺失、取代和/或保存性取代之變異體蛋白。
此處所使用之“連接子”或“連接子區”一詞係指插入第一多肽(例如：FZD組成分)與第二多肽(例如：Fc區)之間的連接子。於一些體系中，該連接子為肽連接子。連接子不應對多肽之表現、分泌或生物活性有不利影響。較佳地，連接子不具抗原性且不引發免疫反應。
此處所使用之“癌症”和“癌性”等詞係指或描述哺乳動物中之生理狀況，其中一細胞群之特點為細胞生長不受管控。據了解癌症一詞包含Wnt倚賴性癌症。癌症之實例包括，但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。這類癌症更特別之實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝臟癌症、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、大腸直腸癌、皮膚癌、黑色素瘤、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細胞癌症及各類頭頸部癌。
“增生症”和“增生性疾病”等詞係指與異常細胞增殖相關之疾病，諸如癌症。
此處所使用之“腫瘤”和“贅瘤”係指由過度細胞生長或增殖(無論是良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括癌前病變)產生之任何組織團塊。於某些體系中，該腫瘤為一種上皮細胞腫瘤。於某些體系中，該腫瘤為一種Wnt依賴性腫瘤。
此處所使用之“個體”一詞係指任何動物(如：哺乳動物)，包括，但不限於人類、非人類靈長類動物、犬、貓、齧齒類，等其為特定治療的接受者。通常，此處之“個體”和“患者”等詞在指人類個體可交換使用。
此處所使用之“癌幹細胞”和“CSC”和“腫瘤幹細胞”以及“實體腫瘤幹細胞”可交換使用且係指來自如下述之實體腫瘤的細胞群：(1)具有廣大之增殖能力；(2)具有不對稱細胞分裂之能力以產生一或多種具有降低之細胞增殖或發展潛力的已分化後代；及(3)具有自我更新或自我維護之對稱細胞分裂的能力。與大多數無法形成腫瘤之腫瘤細胞相比較，這些“癌幹細胞”、“CSCs”、“腫瘤幹細胞”或“實體腫瘤幹細胞”之性質賦予那些癌幹細胞在系列移植入免疫功能低下之宿主(如：老鼠)中時形成可觸知之腫瘤的能力。相對於以雜亂無章之方式分化，癌幹細胞進行自我更新以當突變發生時形成具有可隨時間改變之異常細胞類型的腫瘤。
“癌症細胞”和“腫瘤細胞”以及語法等義詞係指源自腫瘤之總細胞群，包括其中包含大量腫瘤細胞群之非致瘤細胞及致瘤幹細胞(此處亦稱為癌幹細胞)。
“致瘤的”一詞係指實體腫瘤幹細胞之功能特性，包括自我更新(產生額外之致瘤性癌幹細胞)及增殖以產生所有其他可令實體腫瘤幹細胞形成腫瘤的腫瘤細胞(引起分化，因而為非致瘤腫瘤細胞)等性質。與非致瘤性腫瘤細胞相比較(其在系列移植時無法形成腫瘤)，這些自我更新和增殖以生成所有其他腫瘤細胞的性質賦予癌幹細胞在系列移植入免疫功能低下之宿主(如：老鼠)時形成可觸知之腫瘤的能力。據觀察，自實體腫瘤取得腫瘤細胞後，非致瘤性腫瘤細胞可在初次移植入免疫功能低下的宿主(如：老鼠)時形成腫瘤，但那些非致瘤性腫瘤在系列移植時不會產生腫瘤。
此處所使用之“可接受之藥學載體”或“藥學上可接受的載體”等詞係指當與醫藥組成物之活性成分，諸如治療性多肽結合時允許該治療性多肽，例如：保留其生物活性的任何物質。此外，“可接受之藥學載體”不會引發接受個體中之免疫反應。於一些體系中，“藥學載劑”可與“藥學載體”交換使用。實例包括，但不限於任何標準之藥學載體，諸如磷酸鹽緩衝之鹽溶液、水和各種油/水乳劑。用於氣溶膠或胃腸道外投藥之稀釋劑的實例為磷酸鹽緩衝之生理鹽水或生理(0.9%)鹽水。
“治療上有效量”一詞係指可有效“治療”個體或哺乳動物中之疾病或病症的作用劑(如：可溶性受體或其他藥物)之量。在癌症之情況中，該作用劑(如：可溶性受體)之治療上有效量可減少癌症細胞的數量；降低腫瘤的大小；降低癌幹細胞之發生頻率；抑制和/或停止癌症細胞浸潤到周圍器官；抑制和/或停止腫瘤轉移；抑制和/或停止腫瘤生長；和/或緩解一或多種與癌症相關的症狀至一定程度。該作用劑(如，可溶性受體)防止現存癌細胞生長和/或殺死現存癌細胞的程度可稱為抑制細胞生長和/或細胞毒性。
此處所使用之“抑制腫瘤生長”一詞係指任何可抑制腫瘤細胞生長之機制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由減緩腫瘤細胞增殖而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由停止腫瘤細胞增殖而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由殺死腫瘤細胞而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由誘導腫瘤細胞凋亡而受到抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由誘導腫瘤細胞分化而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由剝奪腫瘤細胞之營養而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由防止腫瘤細胞移行而受抑制。於某些體系中，腫瘤細胞的生長係經由防止腫瘤細胞入侵而受抑制。
諸如“治療(treating)”和“治療(treatment)”和“治療(to treat)”和“緩解(alleviating)”和“減輕(to alleviate)”等詞係指下列二者：1)治癒、減緩、減輕診斷之病況或病症的症狀和/或停止診斷之病況或病症進展的治療措施，及2)預防或減緩針對之病況或病症的發展之預防或防止措施。因此，需要治療者包括那些已患有該病症者；那些容易患有該病症者；及那些欲預防該病症者。於某些體系中，若該患者顯示出一或多種下列情況，則該個體之癌症被成功地根據本發明之方法“治療”：癌症或腫瘤細胞之數量減少，或完全不存在；腫瘤尺寸減小；抑制或未出現癌症或腫瘤細胞浸潤到周邊器官，包括，例如：癌症擴散到軟組織和骨頭；抑制或未出現腫瘤轉移；抑制或未出現腫瘤或癌症生長；與特定癌症相關之一或多種症狀減輕；發病率和死亡率降低；生活品質改善；致瘤性、致瘤性發生頻率或腫瘤之致瘤能力減少；腫瘤中癌幹細胞之數量或發生頻率減少；致瘤性細胞分化成非致瘤性狀態；或這些效果的一些組合。
此處所使用之“多核苷酸”和“核酸”等詞係指由數個經由磷酸二酯鍵鏈接之核苷酸單位(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或相關之結構變異體)所組成之聚合物，包括但不限於DNA或RNA。該詞涵蓋包含任何具有已知之DNA和RNA鹼基類似物的序列，包括，但不限於：4-乙醯胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-胺基-甲基-2-硫尿嘧啶、β D-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、氧基丁氧核苷(butoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。該核苷酸之序列可被非核苷酸成分打斷。多核苷酸可在聚合化後被進一步修改，諸如與標籤成分共軛結合。其他類型之修改包括，例如：“封端”；以類似物取代一或多種天然產生之核苷酸；核苷酸間修改，諸如不帶電荷之鍵聯(例如：膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸醯胺化物、胺基甲酸酯，等)及帶電之鍵聯(例如：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；懸掛部分，諸如蛋白質(如：核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴胺酸，等)；嵌入物(例如：吖啶、補骨脂內酯，等)；螯合物(如：金屬、放射活性金屬、硼、氧化金屬，等)；烷化劑；修改之鍵聯(例如：α異位性核酸，等)；以及未經修改之多核苷酸形式。此外，任何通常存在於糖中之羥基均可被，例如：膦酸基、磷酸基所取代，以標準之保護基保護，或經活化以製備對額外核苷酸之額外鍵聯，或可共軛結合固相支撐物。該5'和3'端OH可被磷酸化或被胺或具有1至20個碳之有機封端基團部分所取代。其他羥基亦可衍化成標準保護基。多核苷酸亦可含有本技藝中所周知之類似形式的核糖或去氧核糖，包括，例如：2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-異位糖、差向異構糖類，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖(lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、庚酮糖(heptuloses)、無環類似物和無鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵聯可由替代鍵聯基團來取代。這些替代鍵聯基團包括，但不限於其中該磷酸化物被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“醯胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲縮醛”) 所取代之體系，其中各個R或R'係獨立地為H、或經取代或未經取代之烷基(1-20C)，其可選擇地含有醚(--O--)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非所有在多核苷酸中的鍵聯均需要相同。
此處所使用之“載體”一詞係指將DNA段從一個細胞轉移至另一個細胞之核酸分子。“載體”一詞係指一種構造物，其可遞送，較佳地，表現一或多種對宿主細胞重要的基因或序列。載體之實例包括，但不限於病毒載體、裸出之DNA或RNA表現載體、質體、噬菌質體、黏性質粒或噬菌體載體、與陽離子性冷凝劑相關之DNA或RNA表現載體，以及包囊在脂質體中之DNA或RNA表現載體。
此處所使用之“多肽”和“肽”以及“蛋白質”和“蛋白質片段”等詞可交換使用以指任何長度之胺基酸殘基的聚合物。這些名詞適用於其中該聚合物中之一或多個胺基酸殘基為相對應之天然胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物，且此詞亦適用於天然胺基酸聚合物和非天然胺基酸聚合物。該聚合物可為直線型或支鏈型，其可包含經修改之胺基酸，且其可被非胺基酸中斷。這些名詞亦包含已經天然或介入方式修改的胺基酸聚合物；這些修改方式，為例如：形成二硫鍵、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修改，諸如與標示成分共軛結合。該定義亦包括，例如：含有一或多種胺基酸類似物(包括，例如：非天然胺基酸，等)以及其他本技藝已知之修改的多肽。據了解，由於本發明之多肽係以抗體為基礎(至少部分)，於某些體系中，該多肽可能以單鏈或聯結鏈之形式出現。
“胺基酸”一詞係指天然和合成胺基酸，以及功能類似於天然胺基酸之胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然胺基酸為由遺傳密碼編碼，以及那些稍後修改之胺基酸，例如：羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸酯及鄰-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然胺基酸相同之基礎化學構造(例如：結合氫之α碳：羧基、胺基和R基的化合物)，例如：絲胺酸、正白胺酸、蛋胺酸亞碸、蛋胺酸甲基鋶。這類類似物可具有經修改之R基(例如：正白胺酸)或經修改之肽骨架，但保留與天然胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同的構造，但功能類似於天然胺基酸之化學化合物。
多肽或其他作用劑“特異結合”一種蛋白質係指與替代物質(包括不相關的蛋白質)相比較，該多肽或其他作用劑更頻繁地、更迅速地、持續更久地、親和力更強地，或以上述各項之某些組合的方式與該蛋白質反應或結合。於某些體系中，“特異結合”係指，例如：一種作用劑以約0.1mM或更小，但更常為小於約1μM之KD結合一種蛋白質。於某些體系中，“特異結合”係指一種作用劑通常以至少約0.1μM或更小，至少約0.01μM或更小，且其他時間以至少約1nM或更小之KD結合一種蛋白質。由於不同物種中之同源蛋白間的序列一致性，特異結合可包括能辨識超過一種物種中之特定蛋白質(諸如Wnt蛋白)的作用劑。同樣地，由於不同Wnt蛋白在Wnts序列之某些區中的同源性，特異結合可包括能辨識超過一種Wnt蛋白的多肽(或其他作用劑)。據了解，特異結合第一個目標的作用劑可能會或可能不會特異結合第二個目標。因此，“特異結合”並不一定需要(雖然可包括)唯一結合，即，結合單一目標。因此，於某些體系中，作用劑可能特異結合超過一個目標(例如：多種不同之人Wnts)。一般而言，但不一定，提及之結合意指特異性結合。
在二或多種核酸或多肽之背景下，“一致”或“一致性百分比”係指當比較及比對(若必要時，引進溝隙)最大一致性時，在不考慮任何保存性胺基酸酸替代為序列一致性的一部分下，二或多個序列或子序列彼此相同或具有特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基彼此相同。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查測量。可用於比對胺基酸或核苷酸序列之各種演算法和軟體為本技藝所已知。一種這類序列比對演算法的非限制性實例為描述於Karlin et al,1990,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:2264-2268中之演算法，此在Karlin et al.,1993,PNAS 90;5873-5877中有所修改並被納入NBLAST和XBLAST程式中(Altschul et al. 1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。其他可用於比對序列之可公開取得的軟體程式包括，但不限於Gapped BLAST、BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al. 1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(加州南舊金山，Genentech公司)、Megalign(DNASTAR)及Bestfit程式(威斯康辛序列分析包，Unix第8版，遺傳學電腦集團，威斯康辛州，麥迪遜市，University Research Park，575 Science Drive 53711)。
於一些體系中，當使用序列比較演算法或藉由目視檢查來測量時，本發明之二個核酸或多肽大致相同，此意味其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，且於一些體系中，具有至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性。於一些體系中，一致性出現在長度為至少約10、至少約20、至少約40-60、至少約60-80或介於其間之整數之殘基的序列區中。於某些體系中，一致性係出現在超過60-80個殘基長之較長區域(諸如至少約90-100殘基)中。於一些體系中，在相比較之序列的全長(諸如核苷酸序列之編碼區)中，該序列大致上一致。
“保存性胺基酸取代”為其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈之胺基酸殘基替換。具有類似側鏈之胺基酸殘基族群已在本技藝中鑑定出，包括鹼性側鏈(如：賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(如：天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(如；甘胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(如：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸、色胺酸)、β-支鏈型側鏈(例如：蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(如：酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如：苯丙胺酸取代酪胺酸為一種保存性取代。較佳地，多肽序列中之保存性取代及本發明之其他作用劑不會終止含有該胺基酸序列之多肽結合該標的(即，該多肽或其他作用劑結合之一或多種Wnts)。鑑別不會排除標的結合之核苷酸和胺基酸保存性取代的方法為本技藝所周知(見，例如：Brummell et al.,1993,Biochem.,32:1180-87;Kobayashi et al.,1999,Protein Eng. 12:879-84;and Burks et al.,1997 PNAS,94:412-17)。
此處所使用之“約”一詞係指所指明之數字加或減10%。例如：“約10%”表示9%至11%之範圍。
除非另有明確規定，本揭示內容和申請專利範圍中所使用之單數形式“一(a)”“一(an)”及“該(the)”包括複數形式。
據了解，凡是此文中以“包含”一詞描述的體系亦提供以“由...組成”和/或“實質上由...組成”等詞描述的類似體系。
此處用於短語，諸如“A和/或B”中之“和/或”係欲同時包含A和B；A或B；A(單獨)和B(單獨)。同樣地，短語，諸如“A、B和/或C”中之“和/或”一詞係欲涵蓋以下各體系：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)和C(單獨)。
Ⅱ. Wnt結合劑
本發明提供結合(例如：特異結合)一或多種人Wnt蛋白(Wnts)之作用劑。這些作用劑在此稱為“Wnt結合劑”。於某些體系中，該作用劑特異結合一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、或更多Wnt蛋白。藉由非限制性實例說明，該Wnt結合劑可能結合Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a和/或Wnt10b。於某些體系中，該Wnt結合劑結合Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt7b。
於某些體系中，該Wnt結合劑為一種Wnt拮抗劑。於某些體系中，該作用劑抑制Wnt傳信。於一些體系中，該作用劑抑制典型Wnt傳信。
於某些體系中，該Wnt結合劑為一種多肽。於某些體系中，該Wnt結合劑為一種可溶性受體。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含FZD受體之胞外結構區。於一些體系中，該Wnt結合劑包含FZD受體之Fri結構區。於某些體系中，該FZD受體為一種人FZD受體。於某些體系中，該人FZD受體為FZDI、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。於一些替代之體系中，該Wnt結合劑包含一部分SFRP。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SFRP之Fri結構區。於某些體系中，該SFRP為人SFRP。於一些體系中，該人SFRP為SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、或SFRP5。於其他替代體系中，該Wnt結合劑包含Ror蛋白的胞外結構區。於一些體系中，該Wnt結合劑包含Ror蛋白之Fri結構區。於某些體系中，該Ror為人Ror。於一些體系中，該人Ror為Ror1或Ror2。
於某些體系中，該Wnt結合劑為一種可溶性受體。於一些體系中，該Wnt結合劑為一種可溶性蛋白。於某些體系中，該Wnt結合劑為一種可溶性FZD受體。可溶性FZD受體之非限制性實例可在美國專利編號7,723,477中找到，其全部內容納為此文之參考資料。於某些體系中，該Wnt結合劑為可溶性SFRP或可溶性Ror受體。
該FZD 1之Fri結構區約包含SEQ ID NO：27之胺基酸87-237。該FZD2之Fri結構區約包含SEQ ID NO：28之胺基酸24-159。該FZD3之Fri結構區約包含SEQ ID NO：29之胺基酸23-143。該FZD4之Fri結構區約包含SEQ ID NO：22之胺基酸40-170。該FZD5之Fri結構區約包含SEQ ID NO：23之胺基酸27-157。該FZD6之Fri結構區約包含SEQ ID NO：24之胺基酸19-146。該FZD7之Fri結構區約包含SEQ ID NO：25之胺基酸33-170。該FZD8之Fri結構區約包含SEQ ID NO：30之胺基酸28-158胺基酸。該FZD9之Fri結構區約包含SEQ ID NO：31之胺基酸23-159胺基酸。該FZD10之Fri結構區約包含SEQ ID NO：26之胺基酸21-154。各人FZD受體之相對應、預測之Fri結構區係如SEQ ID NO：32-41。各人FZD受體(FZD 1-10)之最小、核心Fri結構區序列係如SEQ ID NO：3-12。各人SFRPs(SFRP1-5)之最小、核心Fri結構區序列係如SEQ ID NO：13-17。人Ror1及Ror2之最小、核心Fri結構區序列係如SEQ ID NO：58及SEQ ID NO：59。熟習本技藝之人士對於相對應於各個Fri結構區之確切胺基酸可能會有不同的理解。因此，上述及此處概述之結構區的N-端或C-端可延長或縮短1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10個胺基酸。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含結合一或多種人Wnt蛋白之人FZD受體的Fri結構區或該Fri結構區之片段或變異體。於某些體系中，該人FZD受體為FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。於某些體系中，該人FZD受體為FZD4。於某些替代之體系中，該人FZD受體為FZD5。於某些其他替代體系中，該人FZD受體為FZD8。於某些體系中，該FZD為FZD4且該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：6或約包含SEQ ID NO：19之胺基酸40至170。於某些體系中，該FZD為FZD5且該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：7或約包含SEQ ID NO：20之胺基酸27-157。於某些體系中，該FZD為FZD7且該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：9或約包含SEQ ID NO：25之胺基酸33至170。於某些體系中，該FZD為FZD8且該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：10或約包含SEQ ID NO：21之28-158。於某些體系中，該FZD為FZD10且該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：12或約包含SEQ ID NO：26之胺基酸21-154。於某些體系中，該Wnt結合劑包含選自SEQ ID NO：3-12之最小Fri結構區序列。於某些體系中，該Wnt結合劑包含選自SEQ ID NO：13-17之最小Fri結構區序列。於某些體系中，該Wnt結合劑包含選自SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59之最小Fri結構區序列。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含任一前述FZD Fri結構區序列之變異體，該變異體含有一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代且可結合Wnt。
於某些替代體系中，該Wnt結合劑包含人SFRP之Fri結構區，或結合一或多種人Wnt蛋白之這類Fri結構區的片段或變異體。例如：於某些體系中，該作用劑包含選自SEQ ID NO：13-17之最小SFRP Fri結構區序列。於某些體系中，該Wnt結合劑包含任一前述SFRP Fri結構區序列之變異體，該變異體含有一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代且保持結合Wnt之能力。
於某些替代體系中，該Wnt結合劑包含人Ror蛋白的Fri結構區，或結合一或多種人Wnt蛋白之該Fri結構區的片段或變異體。例如：於某些體系中，該作用劑包含選自SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59之最小Ror Fri結構區序列。於某些體系中，該Wnt結合劑包含任一前述Ror Fri結構區序列之變異體，該變異體含有一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代且保持結合Wnt之能力。
於某些體系中，該Wnt結合劑(諸如包含人FZD受體或其他可溶性FZD受體的作用劑之最小Fri結構區)進一步包含人Fc區(例如：人IgG1 Fc區)。該Fc區可從任何類別之免疫球蛋白，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE取得。於一些體系中，該Fc區為野生型Fc區。於一些體系中，該Fc區為突變之Fc區。於一些體系中，該Fc區係在N-端被1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸(例如：在絞鏈區)截斷。於一些體系中，絞鏈區中之一個胺基酸被改變以阻擋形成不良之二硫鍵。於一些體系中，半胱胺酸被絲胺酸取代以阻擋形成不良之二硫鍵。於某些體系中，該Fc區包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：42，或SEQ ID NO：43，或係由彼等所組成。
於某些體系中，Wnt結合劑為包含至少一種FZD受體、SFRP或Ror蛋白及Fc區之最小Fri結構區的融合蛋白。此處所使用之“融合蛋白”為一種由核酸分子表現之雜合蛋白，該核酸分子包含具有至少兩個基因之核苷酸序列。於一些體系中，該第一多肽之C-末端係連接該免疫球蛋白Fc區之N端。於一些體系中，該第一多肽(如：FZD Fri結構區)係直接連接Fc區(即，無插入之肽連接子)。於一些體系中，該第一多肽係經由肽連接子連接Fc區。
此處所使用之“連接子”一詞係指插入第一多肽(如：FZD成分)和第二多肽(如：Fc區)之間的連接子。於一些體系中，該連接子為肽連接子。連接子不應對多肽之表現、分泌或生物活性有不利的影響。連接子不應有抗原性且不應該引起免疫反應。熟習本技藝之人士已知合適之連接子，其通常包括甘胺酸和絲胺酸殘基之混合物，且通常包括立體上未被遮蔽之胺基酸。可被納入有用之連接子中的其他胺基酸包括蘇胺酸和丙胺酸殘基。連接子之長度可在，例如：1-50個胺基酸、1-22個胺基酸、1-10個胺基酸、1-5個胺基酸或1-3個胺基酸的範圍內。連接子可包括，但不限於SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n(其中n為1-7)、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQ ID NO：60)、LESGGGGVT(SEQ ID NO：61)、GRAQVT(SEQ ID NO：62)、WRAQVT(SEQ ID NO：63)和ARGRAQVT(SEQ ID NO：64)。此處所使用之連接子為一種不包括來自第一多肽(如：FZD Fri結構區)之C端或第二多肽(如：Fc區)之N-端的胺基酸殘基的插入肽序列。
FZD受體、SFRPs和Ror蛋白含有一指導蛋白質運送之信號序列。信號序列(亦稱為信號肽或領導序列)係位於新生多肽之N端。其將多肽瞄準內質網並將蛋白質歸類至其所在，例如：到達細胞器之內部空間、到內膜、到細胞外膜，或經由分泌到達細胞外。大多數信號序列係在蛋白質被運送到內質網後藉由信號肽酶從蛋白質分裂出來。信號序列從多肽裂解通常係發生在胺基酸序列中之特定部位且係取決於信號序列中之胺基酸殘基。雖然通常具有一個特定裂解位點，信號肽酶可能辨識和/或使用超過一個裂解位點，而產生非同質之多肽N端。例如：使用信號序列內之不同裂解位點可能產生具有不同N端胺基酸之多肽。因此，於一些體系中，此處所描述之多肽可能包含具有不同N端之多肽的混合物。於一些體系中，該N端之長度相差1、2、3、4或5個胺基酸。於一些體系中，該多肽大致上同質，即，該多肽具有相同的N端。於一些體系中，該多肽之信號序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)胺基酸取代和/或缺失。於一些體系中，該多肽之信號序列包含之胺基酸取代和/或缺失可容許一個裂解位點佔主導地位，從而產生具有一個N端之大致上同質的多肽。於一些體系中，該信號序列為SEQ ID NO：67(SEQ ID NO：30之胺基酸1-27)。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸25和/或26被不同胺基酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸17、18、19、23、24、25和/或26被不同胺基酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸17、23、24、25和26被不同胺基酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸17被苯丙胺酸或白胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸23被脯胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸24被異白胺酸和苯丙胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸25被纈胺酸、異白胺酸或丙胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸26被組胺酸、酪胺酸或組胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸25被纈胺酸所取代。於一些體系中，SEQ ID NO：67之胺基酸26被白胺酸所取代。於一些體系中，該多肽之信號序列包含選自表1中所列之群組的序列或係由彼等所組成。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含含有FZD結構區組成分及Fc區的第一多肽。於一些體系中，該FZD結構區組成分係來自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。於一些體系中，該Fc區係來自IgG1免疫球蛋白。於一些體系中，該Wnt結合劑包含：(a)第一多肽，其大致上係由選自下列群組之胺基酸所組成：SEQ ID NO:27之X1至Y1、SEQ ID NO:28之X2至Y2、SEQ ID NO:29之X3至Y3、SEQ ID NO:22之X4至Y4、SEQ ID NO:23之X5至Y5、SEQ ID NO:24之X6至Y6、SEQ ID NO:25之X7至Y7、SEQ ID NO:30之X8至Y8、SEQ ID NO:31之X9至Y9及SEQ ID NO:26之X10至Y10；和
(b)第二多肽，其大致上係由SEQ ID NO：43之胺基酸A至B所組成；
其中X1=胺基酸69、70、71、72、73、74、75或76
Y1=胺基酸236、237、238、239、240、241、242或243
X2=胺基酸22、23、24、25、26、27或28
Y2=胺基酸158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171或172
X3=胺基酸18、19、20、21、22、23、24或25
Y3=胺基酸141、142、143、144、145、146、147、148或149
X4=胺基酸38、39、40、41或42
Y4=胺基酸168、169、170、171、172、173、174、175或176
X5=胺基酸25、26、27、28或29
Y5=胺基酸155、156、157、158、159、160、161、162、163或164
X6=胺基酸19、20、21、22、23或24
Y6=胺基酸144、145、146、147、148、149、150、151或152
X7=胺基酸22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34
Y7=胺基酸178、179、180、181、182、183、184、185或186
X8=胺基酸25、26、27、28、29、30或31
Y8=胺基酸156、157、158、159、160、161、162、163或164
X9=胺基酸21、22、23或24
Y9=胺基酸137、138、139、140、141、142、143、144、145或146
X10=胺基酸20、21、22、23、24或25
Y10=胺基酸152、153、154、155、156、157、158、159或160
A=胺基酸1、2、3、4、5或6
B=胺基酸231或232。
於一些體系中，該第一多肽係直接連接第二多肽。於一些體系中，該第一多肽係經由肽連接子連接第二多肽。於一些體系中，該第一多肽係經由肽連接子GRA連接第二多肽。於一些體系中，“大致上包括某些胺基酸”或“大致上由某些胺基酸所組成”之多肽(如：第一或第二多肽)可能在一端或兩端包括一或多個(例如：一、二、三、四或更多)額外之胺基酸，只要該額外之胺基酸不會實質上影響Wnt結合劑的功能。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含：(a)第一多肽，其大致上係由SEQ ID NO:30之胺基酸X至Y所組成；和(b)第二多肽，其大致上係由SEQ ID NO：43之胺基酸A至B所組成；其中該第一多肽係直接連接該第二多肽，且其中
X=胺基酸25、26、27、28、29、30或31
Y=胺基酸156、157、158、159、160、161、162、163或164
A=胺基酸1,2,3,4、5或6
B=胺基酸231或232。
於一些體系中，該第一多肽大致上包含SEQ ID NO：30之胺基酸25-158。於其他體系中，該第一多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸25-158。於一些體系中，該第一多肽大致上包含SEQ ID NO：30之胺基酸28-158。於其他體系中，該第一多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸28-158。於一些體系中，該第一多肽包含SEQ ID NO：30之胺基酸31-158。於一些體系中，該第二多肽包含SEQ ID NO：43之胺基酸1-232。於一些體系中，該第二多肽包含SEQ ID NO：43之胺基酸3-232。於一些體系中，該第二多肽包含SEQ ID NO：43之胺基酸6-232。於一些體系中，該第一多肽為SEQ ID NO：39，而該第二多肽為SEQ ID NO：43。於一些體系中，該第一多肽為SEQ ID NO：39，而該第二多肽為SEQ ID NO：42。於一些體系中，該第一多肽為SEQ ID NO：39，而該第二多肽為SEQ ID NO：18。
於一些體系中，該Wnt結合劑為包含第一多肽和第二多肽之多肽，其中該多肽係選自表2。
於一些體系中，該Wnt結合劑包含選自下列群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：1之序列。於某些替代體系中，該作用劑包含SEQ ID NO：1之序列，此序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代。於某些體系中，該作用劑包含與SEQ ID NO：1具有至少約90%、約95%或約98%之序列一致性的序列。於某些體系中，該SEQ ID NO：1之變異體保持結合一或多種人Wnts的能力。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：46之序列。於一些體系中，該Wnt結合劑為SEQ ID NO：46。於某些替代之體系中，該作用劑包含SEQ ID NO：46之序列，此序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代。於某些體系中，該作用劑包含與SEQ ID NO：46具有至少約90%、約95%或約98%之序列一致性的序列。於某些體系中，該SEQ ID NO：46之變異體保持結合一或多種人Wnts的能力。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：48之序列。於一些體系中，該Wnt結合劑為SEQ ID NO：48。於某些替代之體系中，該作用劑包含SEQ ID NO：48之序列，此序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代。於某些體系中，該作用劑包含與SEQ ID NO：48具有至少約90%、約95%或約98%之序列一致性的序列。於某些體系中，該SEQ ID NO：48之變異體保持結合一或多種人Wnts的能力。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：50之序列。於一些體系中，該Wnt結合劑為SEQ ID NO：50。於某些替代之體系中，該作用劑包含SEQ ID NO：50之序列，此序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代。於某些體系中，該作用劑包含與SEQ ID NO：50具有至少約90%、約95%或約98%之序列一致性的序列。於某些體系中，該SEQ ID NO：50之變異體保持結合一或多種人Wnts的能力。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53之序列。於一些體系中，該Wnt結合劑為SEQ ID NO：53。於某些替代之體系中，該作用劑包含SEQ ID NO：53之序列，此序列包含一或多個(例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十，等)保存性取代。於某些體系中，該作用劑包含與SEQ ID NO：53具有至少約90%、約95%或約98%之序列一致性的序列。於某些體系中，該SEQ ID NO：53之變異體保持結合一或多種人Wnts的能力。
於一些體系中，此處所描述之Wnt結合劑抑制腫瘤或腫瘤細胞生長。於一些體系中，該Wnt結合劑誘導腫瘤中之細胞分化。於一些體系中，該Wnt結合劑誘導腫瘤或腫瘤細胞上之分化標記表現。於某些體系中，該Wnt結合劑降低腫瘤中癌幹細胞之發生頻率。於一些體系中，包含SEQ ID NO：46之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的程度甚於包含SEQ ID NO：1之Wnt結合劑。於一些體系中，包含SEQ ID NO：48之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的程度甚於包含SEQ ID NO：1之Wnt結合劑。於一些體系中，包含SEQ ID NO：50之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的程度甚於包含SEQ ID NO：1之Wnt結合劑。於一些體系中，包含SEQ ID NO：53之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的程度甚於包含SEQ ID NO：1之Wnt結合劑。於一些體系中，此處所描述之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的程度甚於包含FZD結構區組成分、Fc結構區及連接該FZD結構區組成分和Fc結構區之連接子組成分的Wnt結合劑。於一些體系中，該連接子組成分為一種插入肽連接子。
於某些體系中，此處所描述之Wnt結合劑抑制Wnt依賴性腫瘤生長。於一些體系中，該腫瘤為選自下列群組之腫瘤：大腸直腸瘤、結腸瘤、胰臟瘤、肺腫瘤、卵巢瘤、肝臟瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑色素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、膠質母細胞瘤以及頭頸部腫瘤。於某些體系中，該腫瘤為大腸直腸瘤。於某些體系中，該腫瘤為胰臟瘤。於某些體系中，該腫瘤為乳房腫瘤。
於某些體系中係提供包含選自下列群組之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66。於某些體系中，該多肽包含選自下列群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：53。於一些體系中，多肽包含選自下列群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：53。於某些體系中，該多肽包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。於一些體系中，該多肽為SEQ ID NO：50。於某些體系中，該多肽包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列。於一些體系中，該多肽為SEQ ID NO：53。
於某些體系中，該多肽(在信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：50和選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於某些體系中，該多肽(在信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：50和選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，該多肽(在信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：53和選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，該多肽(在信號序列裂解前)包含SEQ ID NO：53和選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，該多肽包含SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：50。於一些體系中，該多肽包含SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：53。於一些體系中，該多肽包含SEQ ID NO：75。於一些體系中，該多肽大致上係由SEQ ID NO：75所組成。
於一些體系中，該多肽為大致上經純化之多肽，其包含選自下列群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：53。於某些體系中，該大致上經純化之多肽至少90%係由具有ASA之N端序列的多肽所組成。於一些體系中，該新生多肽包含選自SEQ ID NO：67-74之信號序列。於一些體系中，該新生多肽包含SEQ ID NO：71之信號序列。於一些體系中，該新生多肽包含一信號序列，此信號序列可產生具有一個N端序列之實質上同質的多肽產物。
於某些替代體系中，該作用劑不包含FZD受體之Fri結構區。
於某些體系中，該Wnt結合劑為一種抗體(例如：特異結合一或多種Wnt蛋白之抗體)。
於某些體系中，該Wnt結合劑包含一免疫球蛋白的Fc區。熟習本技藝之人士將明白本發明之結合劑將包含其中至少一部份之Fc區已被刪除或以其他方式改變以提供所需之生化特性的融合蛋白(諸如當與包含固有或未改變之恆定區的具有大致相同之致免疫性的融合蛋白相比較時，增加之癌症細胞局部化、增加之腫瘤侵透性、降低之血清半衰期或增加之血清半衰期)。Fc區之修改可包括在一或多個結構區中加入、刪除或置換一或多個胺基酸。此處所揭示之經改質的融合蛋白可包括變更或修改一或多個該二個重鏈恆定區(CH2或CH3)或絞鏈區。於其他體系中係移除整個CH2結構區(ΔCH2構造)。於一些體系中係以短胺基酸間隔子(例如：10aa殘基)置換被刪去之恆定區，該短胺基酸間隔子提供一些通常係由缺失之恆定區賦予的分子彈性。
於一些體系中，該經改質之融合蛋白係經遺傳工程處理以直接將CH3結構區與抗體之絞鏈區相連接。於其它體系中係將一肽間隔子插入絞鏈區與經改質之CH2和/或CH3結構區之間。例如：可表現構造物，其中該CH2結構區已被刪除且剩餘之CH3結構區(經改質或未經改質)係以5-20個胺基酸間隔子連接該絞鏈區。可加入能確保恆定區之調控要素保持不受約束且易接近，或該絞鏈區仍保持彈性的這類間隔子。然而，應注意：在某些情況下，胺基酸間隔子可能顯示出具致免疫性且引起對抗該構造物之不必要的免疫反應。因此，於某些體系中，任何加入該構造物中之間隔子將相當地無致免疫性，以維持該經改質之抗體的所需生物品質。
於一些體系中，該經改質之融合蛋白可能僅缺失部分恆定區或幾個或甚至是單一胺基酸被取代。例如：在CH2結構區中之選定區域中的單一胺基酸突變可能就足以大幅減少Fc結合，從而增加癌症細胞局部化和/或腫瘤侵透。類似地，單純地刪除控制欲調控之特定效應子功能(例如：補體C1q結合)的一或多個恆定區之一部分可能是合適的。這類部分刪除恆定區可能改良該抗體之選定的特徵(如：血清半衰期)，但使其他與個體恆定區有關之所欲功能保持完整。此外，正如上文提到，該揭示之融合蛋白的恆定區可透過一或多個胺基酸之突變或取代，增強所產生之構造物的變化形廓來修改。就此而言，破壞由保存性結合位點(例如：Fc結合)提供之活性，但大致上保持經改質之抗體的構形和免疫變化形廓可能是可行的。於某些體系中，該經改質之融合蛋白包含在恆定區中加入一或多個胺基酸，以增強所欲之特性(諸如減少或增加效應子功能)，或供更多之細胞毒素或碳水化合物附著。
本技藝中已知該恆定區介導數種效應子功能。例如：將補體之C1組成分與IgG或IgM抗體(與抗原結合)之Fc區域結合可活化補體系統。活化補體對細胞病原體之調理作用和溶解很重要。補體活化亦刺激炎症反應且亦可能涉及自體免疫過敏。此外，抗體之Fc區可結合表現Fc受體(FcR)之細胞。特異於不同類別之抗體(包括IgG(γ受體)、IgE(s受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體))之Fc受體有多種。抗體結合細胞表面上之Fc受體觸發許多重要且互異之生物反應，包括吞沒和毀壞經抗體包覆之顆粒、清除免疫複合物、由殺手細胞溶解經抗體包覆之標靶細胞(抗體依賴性之經細胞介導的細胞毒性或ADCC)、釋出炎症傳介子、胎盤轉移以及控制免疫球蛋白製造。
於一些體系中，該Wnt結合劑提供改變之效應子功能，其轉而影響投服之作用劑的生物變化形廓。例如，於一些體系中，將恆定區刪除或去活化(透過點突變或其他方式)可能會降低循環之經改質的作用劑(如：Wnt結合劑)的Fc受體結合力，從而增加癌細胞局部化和/或腫瘤侵透。於其它體系中，修改恆定區可增加或降低作用劑之血清半衰期。於一些體系中，該恆定區係經修改以排除二硫鍵或寡糖部分。
於某些體系中，Wnt結合劑不具有通常與Fc區相關之一或多種效應子功能。於一些體系中，該作用劑不具有ADCC活性，和/或無補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。於某些體系中，該作用劑不會結合Fc受體和/或補體因子。於某些體系中，該作用劑不具有效應子功能。
於一些體系中，此處所描述之Wnt結合劑係經修改以降低致免疫性。一般而言，當使用人體蛋白作為治療劑時，免疫反應完全對抗這些蛋白是罕見的。然而，雖然許多融合蛋白包含與自然界中發現之序列相同的多肽序列，數種治療性融合蛋白顯示出在哺乳動物中具有致免疫性。於一些研究中，包含連接子之融合蛋白被發現較不包含連接子之融合蛋白更具致免疫性。因此，於一些體系中係藉由計算方法分析本發明之多肽以預測致免疫性。於一些體系中係分析該多肽是否存有T細胞和/或B細胞抗原決定部位。若鑑定和/或預測出任何T細胞或B細胞抗原決定部位則可能對這些區進行修改(如：胺基酸替換)以破壞或毀壞該抗原決定部位。本技藝已知可用來預測T細胞和/或B細胞抗原決定部位之各種算法和軟體。例如：軟體程式SYFPEITHI、HLA Bind、PEPVAC，RANKPEP，DiscoTope，ElliPro和抗體抗原決定部位預測(Antibody Epitope Prediction)均可公開取得。
於某些體系中係提供製任何造此處所描述之Wnt結合劑或多肽的細胞。於一些體系中係提供包含任何此處所描述之Wnt結合劑或多肽的組成物。於一些體系中，該組成物包含一多肽，其中至少80%、90%、95%、97%、98%、或99%之該多肽具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含一多肽，其中100%之該多肽具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含一多肽，其中至少80%之該多肽具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含一多肽，其中至少90%之該多肽具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含一多肽，其中至少95%之該多肽具有ASA之N端序列。
本發明之多肽可為重組多肽、天然多肽或合成多肽。本技藝中將承認本發明之一些胺基酸序列可被改變，但對蛋白質之結構或功能無顯著影響。若考慮序列中這類差異時，應記住蛋白質上將有決定活性之關鍵區。因此，本發明進一步包括顯示出大致活性之多肽變異體或包括FZD蛋白區、SFRP蛋白或Ror蛋白區(諸如此處所討論之蛋白質部分)的多肽變異體。這類突變包括刪除、插入、倒置、重複子及型態替換。如下文所述，關於何種胺基酸變化可能為表型上沈默的指導可在Bowie et al. 1990,Science,247:1306-10中找到。
當然，熟習本技藝之人士將根據多種因子(包括上文所述者)來製作胺基酸替換之數目。於某些體系中，任何指出之可溶性受體多肽的替換數目將不超過50、40、30、25、20、15、10、5或3。
本發明多肽之片段或部分可用於藉由肽合成方法產生相對應之全長多肽；因此，該片段可作為製造全長多肽之中間體。該多肽之這些片段或部分亦也可稱為“蛋白質片段”或“多肽片段”。
本發明之蛋白片段為可結合一或多種人Wnt蛋白(例如：人FZD受體、人SFRP或 Ror蛋白)之蛋白質的一部分或全部。於一些體系中，該片段對一或多種人Wnt蛋白具有高親和力。此處所描述之融合蛋白的一些片段為包含至少一部分FZD受體、SFRP之胞外部分或Ror蛋白之胞外部分的蛋白質片段(其含有連接免疫球蛋白之至少部分恆定區的結合區，例如：Fc區)。蛋白質片段之結合親和力可在約10-11至10-12M之範圍內，雖然不同大小之片段的親和力可能有很大的不同。於一些體系中，該片段之長度為約100至約200個胺基酸且包含連接免疫球蛋白之至少部分恆定區的結合區。
此處所描述之多肽可藉由本技藝已知之任何合適的方法製造。這類方法之範圍從直接蛋白質合成法至構建編碼多肽序列之DNA序列，以及在合適之宿主內表現那些序列。於一些體系中，DNA序列係採用基因重組技術，藉由分離或合成編碼所欲之野生型蛋白的DNA序列來構建。可選擇地，該序列可藉由定點突變來誘變以提供其功能類似物。見，例如：Zoeller et al.,1984,PNAS,81:5662-66及美國專利編號4,588,585。於一些體系中係利用重組技術，藉由分離超過一種編碼所欲之二種多肽之DNA序列來構建DNA序列並將這些DNA序列連結在一起以產生融合蛋白質。於一些體系中，將兩種多肽融合可在該二種多肽問之交界處(即，DNA序列之連結位點)加入額外之胺基酸。這些額外的胺基酸被認為是一種連接子。於一些體系中，肽連接子係插入該融合蛋白之兩個多肽之間。
於一些體系中，編碼所欲之多肽的DNA序列可使用寡核苷酸合成器，藉由化學合成法來構建。這類寡核苷酸可根據所需之多肽的胺基酸序列設計。於一些體系中，該寡核苷酸係經過設計以選擇產製該所欲之重組多肽的宿主細胞所歡迎之密碼子。標準方法可應用於合成編碼所欲多肽的核苷酸序列。例如：可使用完整之胺基酸序列來構建逆轉譯基因。此外，可合成含有編碼特定多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。例如：可合成數種編碼部分所需多肽之小寡核苷酸，再連結之。該個別寡核苷酸通常含有5'或3'懸端以供互補組合。於一些體系中係合成編碼所需之融合蛋白的核苷酸序列以使兩種多肽直接連接，不需插入肽連接子。
一旦組合後(藉由合成、定點突變、基因重組技術或其他方法)，可將編碼所欲之特定多肽的多核苷酸序列插入表現載體中並經操作連接至適合在所需宿主中表現該多肽之表現調控序列。正確之組合可藉由核苷酸定序、限制酶切作圖和/或在合適之宿主中表現生物活性多肽來確認。如本技藝所周知，為了在宿主中高度表現經轉染之基因，必須將該基因經操作連接至可在所選擇之表現宿主中作用之轉錄和轉譯表現調控序列。
於某些體系中係使用重組表現載體來放大和表現編碼此處所描述之Wnt結合劑和多肽的DNA。例如：重組表現載體可為可複製之DNA構造物，其具有編碼包含FZD Fri結構區及Fc區之融合蛋白的合成DNA片段或自cDNA衍生之DNA片段，此DNA片段係可經操作連接至衍生自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適之轉錄或轉譯調控元素上。轉錄單位一般包含下列各項之組合(1)遺傳元素或在基因表現中具有調節作用之元素，例如：轉錄啓動子和/或促進子，(2)轉錄成mRNA及轉譯成蛋白質之結構性或編碼序列，以及(3)合適之轉錄和轉譯起始和終止序列。調控元素可包括操作子序列以控制轉錄。可額外納入在宿主中複製之能力(此通常係由複製起源賦予)及促進識別轉化株之選擇基因。當DNA區在功能上彼此關聯時，其係“經操作性連接”。例如；若信號肽之DNA(分泌領導序列)係以參與多肽分泌之先質表現則其係經操作性連接至該多肽之DNA；若啓動因子控制序列之轉錄則其係經操作性連接至該編碼序列；或者，若核糖體之結合位點的位置可允許轉譯則其係經操作性連接至編碼序列。一般而言，經操作性連接意指連續的，且在分泌領導序列之情況中係指連續的且係在閱讀框構中。於一些體系中，欲用於酵母表現系統中之構造元素可包含能使宿主細胞胞外分泌轉譯蛋白的領導序列。於一些體系中，當重組蛋白表現時不需要領導序列或轉運序列時，其可包括一N端蛋胺酸殘基。此殘基可選擇地接著從該表現之重組蛋白裂解出，以提供最終產品。
表現調控序列及表現載體的選擇係取決於所選擇之宿主。可採用之表現宿主/載體組合有很多種。可用之真核宿主的表現載體包括，例如：包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒之表現調控序列的載體。用於細菌宿主之有用的表現載體包括已知之細菌質體(諸如來自大腸桿菌之質體，包括：pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，以及宿主範圍較廣之載體，諸如M13及其他絲狀單股DNA噬菌體。
用於表現Wnt結合劑之合適宿主細胞包括原核生物、酵母、昆蟲或受適當之啓動因子控制之較高等的真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如：大腸桿菌或桿菌。較高等之真核細胞包括如下述之已建立的哺乳動物起源之細胞株。亦可使用無細胞之轉譯系統。用於細菌、真菌、酵母菌和哺乳動物細胞宿主之適當的選殖和表現載體描述於Pouwels et al.,1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N. Y中，其相關揭示內容納為此文之參考資料。
使用不同哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組多肽。於一些體系中，在哺乳動物細胞中表現重組蛋白較佳，因為這類蛋白質一般都經正確折疊、適當修改且完全為功能性。合適之哺乳動物宿主細胞株之實例包括COS-7(自猴腎衍生)、L-929(自小鼠纖維母細胞衍生)、C127(自小鼠乳房腫瘤衍生)、3T3細胞(自小鼠纖維母細胞衍生)、CHO(自中國倉鼠卵巢衍生)、HeLa細胞(自人類子宮頸癌衍生)和BHK(自地鼠腎臟纖維母細胞衍生)細胞系。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元素，諸如複製起源、連接欲表現之基因的合適啓動子和增強子和其他5'或3'側翼非轉錄序列，以及5'或3'非轉譯序列，諸如必要之核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點、DNA剪接供給體和接受體位點，以及轉錄終止序列。熟習本技藝之人士已知用於在昆蟲細胞中製造異源蛋白之桿狀病毒系統，且於Luckow and Summers,1988,Bio/Technology 6:47中有檢閱資料。
轉形宿主所製造之蛋白質可根據任何適當方法純化。這類標準方法包括色層分析法(如：離子交換，親和力和尺寸排阻管柱色層分析法)、離心、差別溶解度、或任何其他用於純化蛋白之標準技術。可將親和標籤(諸如六聚組胺酸、麥芽糖結合結構區、流感外套序列及穀胱甘肽-S-轉移酶)連接至蛋白質以容許經由通過適當之親和層析柱簡易純化。分離出之蛋白質亦可使用諸如蛋白質水解、質譜分析(MS)、高效液相色層分析法(HPLC)、核磁共振(NMR)及X-射線晶體學這類技術決定物理特徵。
於一些體系中，首先使用市售之蛋白質濃縮過濾器(例如：Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)將來自表現系統(其分泌重組蛋白進入培養培養基中)的上清液濃縮。濃縮步驟之後，將濃縮物施用於合適之純化母質上。於一些體系中，可使用陰離子交換樹脂，例如：具有懸端二乙胺基乙基(DEAE)團之母質或底物。該母質可為烯丙醯胺，瓊脂糖，葡聚醣，纖維素或其他在蛋白質純化普遍採用的類型。於一些體系中可使用陽離子交換步驟。合適之陽離子交換器包括各種含有磺丙基或羧甲基之不溶性基質。於一些體系中，可使用羥基磷灰石(CHT)培養基，包括，但不限於陶瓷羥基磷灰石。於一些體系中可使用一或多種採用疏水性RP-HPLC培養基(例如：具有懸端甲基或其他脂族基團之矽膠)之逆相HPLC步驟來進一步純化融合蛋白。亦可使用一些或全部上述純化步驟的各種組合來提供均質之重組蛋白。
於一些體系中，可藉由，例如：先自細胞小丸萃取，再進行一或多個濃縮、鹽析、水溶液中離子交換和/或尺寸排阻層析步驟來將在細菌培養中產生之重組蛋白分離出。HPLC可用來作為最終純化步驟。用於表現重組蛋白之微生物細胞可藉由任何方便的方法破壞，包括凍融循環、超音波、機械破壞，或使用細胞溶解劑。
本技藝已知之用於純化抗體和其他蛋白的方法還包括，例如：那些描述於美國專利申請案編號2008/0312425；2008/0177048和2009/0187005中者。
此處所描述之多肽可經進一步修改以包含非為該蛋白質之正常部分的額外化學部分。那些衍生部分可改良蛋白質之溶解度、生物半衰期或吸收。該部分亦可減少或排除蛋白質，等之任何不良副作用。對於那些部分之概述可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,University of the Sciences,Philadelphia,2005中找到。
最適合衍化之化學部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物較合適，因為其所連接之蛋白質不會在水性環境(諸如生理環境)中沉澱。於一些體系中，該聚合物對製備治療性產品或組成物而言為藥學上可接受的。熟習本技藝之人士將有能力根據該聚合物/蛋白質共軛物是否將用於治療來選擇所需之聚合物，若是，則考慮所需劑量、循環時間、對蛋白質水解之抗性及其他考量。衍化之有效性可經由投服所需形式之衍生物(即：藉由滲透性幫浦、或注射或輸液，或進一步調製成用於口服、肺或其他遞送途徑)來確定，並測定其效力。合適之水溶性聚合物包括，但不限於：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸類(無論是同聚物或隨機共聚物)、葡聚醣、聚(正-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(如：甘油)、聚乙烯醇及彼等之混合物。聚乙二醇丙醛由於在水中很穩定因此在製造上可具有優勢。
以此方式連接之聚合物分子的數目可以有所不同，且熟習本技藝之人士將有能力決定其對功能之效果。個人可以相同或不同化學部分(如：聚合物，諸如不同重量的聚乙二醇)進行單次衍生化，或可提供二，三，四次或一些衍生化組合。聚合物分子對蛋白質(或肽)分子在反應混合物中之比例如同其濃度般會有所不同。一般來說，最佳比例(就反應效率而言，沒有多餘的未反應之蛋白質或聚合物)將取決於，諸如所需之衍生程度(例如：一、二、三，等)、所選擇之聚合物的分子量、該聚合物是否為分支或不分支以及反應條件等因素。
該聚乙二醇分子(或其他化學部分)連接蛋白質時應考慮對蛋白質之功能性或抗原結構區的影響。熟習本技藝之人士可使用之連接方法有多種。見，例如：EP 0401384，其揭示內容納為此文之參考資料(將PEG與G-CSF耦合)，亦見Malik et al.,1992,Exp. Hematol.,20:1028-35(報告使用三氟代乙烷磺醯氯將GM-CSF聚乙二醇化)。例如：聚乙二醇可經由反應基，諸如游離胺基或羧基共價結合胺基酸殘基。反應基團為那些活化之聚乙二醇分子可與之結合者。具有游離胺基之胺基酸殘基可包括酸賴胺酸殘基和N端胺基酸殘基。那些具有游離羧基者可包括天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基及C端胺基酸殘基。巰基亦可作為一種用於連接聚乙二醇分子的反應基。為了治療目的，可連接至一個胺基上，諸如：連接在N端或賴胺酸基團。若需要結合受體則應該避免連接在對受體結合重要的殘基上。
個人可以專門設計一種胺基端經化學修飾的蛋白質。使用聚乙二醇說明本組成物：個人可從各種不同的聚乙二醇分子(藉由分子重、分支，等)、反應混合物中之聚乙二醇分子對蛋白質(或肽)分子的比例、欲進行之聚乙二醇-化反應的類型及取得所選擇之N端聚乙二醇化蛋白質的方法來選擇。取得N端聚乙二醇化之製品(即，若需要時將此部分與其他單聚乙二醇化之部分分開)的方法可經由從聚乙二醇化之蛋白質分子群純化N端聚乙二醇化物質來進行。選擇性N端化學修飾可經由還原性烷基化反應來完成，該反應係利用特定蛋白質中可用於衍化的不同類型之一級胺基的差別反應性(賴胺酸相對於N端)進行。在適當之反應條件下可達成以含有羰基的聚合物實質上選擇性衍生化蛋白質N端。例如：個人可在能容許個人利用賴胺酸殘基之ε胺基間的pKa差異和蛋白質N端殘基之α胺基間的pKa差異的pH值下進行反應來選擇性地將蛋白質N端聚乙二醇化。藉由這類選擇性衍生化可控制水溶性聚合物連接蛋白質，例如：與聚合物之共軛結合主要係發生在蛋白質N端且其他反應基團(諸如賴胺酸側鏈胺基)並未發生重大修改。使用還原性烷基化，該水溶性聚合物可為上述類型且應該具有用於與蛋白質耦合的單一反應醛。包含單一反應醛之聚乙二醇丙醛可用於此目的中。
聚乙二醇化藉由本技藝已知之任何聚乙二醇化反應進行。見，例如Focus on Growth Factors,1992,3:4-10;EP 0154316，其揭示內容納為此文之參考資料；EP 0401384；以及其他本文中所引用之關於聚乙二醇的出版物。聚乙二醇化反應可以反應性聚乙二醇分子(或類似的反應性水溶性聚合物)經由醯化反應或烷基化反應進行。
因此，欲根據本發明使用之可溶性受體多肽可考慮包括聚乙二醇化之可溶性受體蛋白或變異體，其中該PEG基團係經由醯基或烷基連接。這類產品可經單次聚乙二醇化或多次聚乙二醇化。該聚乙二醇基一般係在胺基酸之α或ε胺基處附著於蛋白質，但亦可考慮PEG基可連接附著在蛋白質之任何胺基酸，而該胺基酸在適當的反應條件具足夠反應性以連接到PEG基團。
用於醯化和烷基化二種方法中之聚合物分子可從如上述之水溶性聚合物中選擇。選擇之聚合物應經過改質以具有單一反應基團，諸如用於醯化之活性酯或用於烷基化的醛，從而可依本方法所提供者控制聚合化的程度。示範之反應性PEG醛為在水中安定之聚乙二醇丙醛，或其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(見美國專利案編號5,252,714)。該聚合物可為有分支或無分支。在醯化反應方面，選擇之聚合物應具有單一反應性酯基。在本還原性烷基化方面，選擇之聚合物應具有單一反應性醛基。一般來說，該水溶性聚合物將不會從天然糖基殘基選擇，因為藉由哺乳動物重組表現系統製造這些通常更加方便。該聚合物可具有任何分子量，且可為分支或不分支。聚乙二醇為一種可用於此處之水溶性聚合物。如此處所使用者，聚乙二醇係欲包含任何已用於衍生其他蛋白質的PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
其他反應參數，諸如溶劑、反應時間、溫度，等，以及純化產品之方式可根據與以水溶性聚合物衍生化之蛋白質相關的發布資訊逐案測定(見此處引用之刊物)。於某些體系中，該Wnt結合劑為非自人FZD或SFRP衍生之多肽。本技藝已知多種用於鑑定和製造以高親和力結合蛋白質標的之多肽的方法。見，例如：Skerra,2007,Curr. Opin. Biotechnol.,18:295-304;Hosse et al.,2006,Protein Science,15:14-27;Gill et al.,2006,Curr. Opin. Biotechnol.,17:653-58;Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76;and Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83，其全部內容各納為此文之參考資料。於某些體系中已使用噬菌體展示技術來鑑別/製造Wnt結合多肽。於某些體系中，該多肽包含選自下列群組之蛋白支架類型：蛋白A、載脂蛋白、纖黏蛋白結構區、錨蛋白同源重複結構區及硫氧化還原蛋白。
於一些體系中，該Wnt結合劑為一種非蛋白分子。於某些體系中，該作用劑為一種小分子。可用於鑑定非蛋白質Wnt結合劑之組合化學庫和技巧為熟習本技藝之人士所已知。見，例如：Kennedy et al.,2008,J. Comb. Chem.,10:345-54;Dolle et al,2007,J. Comb. Chem.,9:855-902;and Bhattacharyya,2001,Curr. Med. Chem.,8:1383-404，其全部內容各納為此文之參考資料。於某些進一步之體系中，該作用劑為碳水化合物、糖胺聚醣、糖蛋白或蛋白聚醣。
於某些體系中，該作用劑為核酸適配子。適配子為根據其結合另一分子之能力選擇(例如：從隨機或誘變庫中選擇)之多核苷酸。於一些體系中，該適配子包含DNA多核苷酸。於某些替代之體系中，該適配子包含RNA多核苷酸。於某些體系中，該適配子包含一或多個經改質之核酸殘基。製造和篩選用於結合蛋白質之核酸適配子的方法為本技藝所周知。見，例如：美國專利案編號5,270,163;5,683,867;5,763,595;6,344,321;7,368,236;5,582,981;5,756,291;5,840,867;7,312,325;和7,329,742、國際專利刊物編號WO 02/077262和WO 03/070984、美國專利申請刊物編號2005/0239134；2005/0124565；和2008/0227735，其全部內容各納為此文之參考資料。
於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約2毫克/公斤至約10毫克/公斤之此處所描述之Wnt結合劑和多肽時，該Wnt結合劑和多肽在大鼠中之半衰期為至少約50小時。於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約10毫克/公斤之Wnt結合劑或多肽時，該Wnt結合劑或多肽在大鼠中之半衰期為至少約50小時。於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約2毫克/公斤至約10毫克/公斤之Wnt結合劑或多肽時，該Wnt結合劑或多肽在大鼠中之半衰期為至少約100小時。於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約10毫克/公斤之Wnt結合劑或多肽時，該Wnt結合劑或多肽在大鼠中之半衰期為至少約100小時。於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約2毫克/公斤至約10毫克/公斤之Wnt結合劑時，該Wnt結合劑在大鼠中之半衰期為至少約120小時。於某些體系中，當經由大鼠尾靜脈投予劑量為約2毫克/公斤至約10毫克/公斤之Wnt結合劑時，該Wnt結合劑和多肽在大鼠中之半衰期為至少約150小時。
於某些體系中，該作用劑為包含人FZD受體之Fri結構區(或結合一或多種Wnts之Fri結構區的片段或變異體)及人Fc區之可溶性FZD受體，且該可溶性FZD受體在活體(例如：小鼠或大鼠)中之半衰期較包含FZD受體之胞外結構區和人Fc區的可溶性FZD受體的半衰期長。
本發明提供製造此處所描述之Wnt結合劑或多肽的細胞。於一些體系中，該細胞製造包含人FZD8之Fri結構區的可溶性Wnt結合劑，其中至少約80%之該Wnt結合劑具有ASA之N端序列。於一些體系中，該細胞製造包含人FZD8之Fri結構區的可溶性Wnt結合劑，其中至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約98%之該Wnt結合劑具有ASA之N端序列。於一些體系中，該細胞為一種哺乳動物細胞。於一些體系中，該細胞製造包含人Fc區之Wnt結合劑。於一些體系中，該細胞製造包含選自下列群組之胺基酸序列的Wnt結合劑：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：1。於一些體系中，該細胞製造包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的Wnt結合劑。於一些體系中，該細胞製造包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的Wnt結合劑。
本發明提供此處所描述之的細胞所製造的Wnt結合劑。
本發明亦提供包含此處所描述之Wnt結合劑或多肽的組成物。於一些體系中，該組成物包含含有人FZD8之Fri結構區的可溶性Wnt結合劑，其中至少約80%之該Wnt結合劑具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含含有人FZD8之Fri結構區的可溶性Wnt結合劑，其中至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約98%之該Wnt結合劑具有ASA之N端序列。於一些體系中，該組成物包含含有人Fc區的Wnt結合劑。於一些體系中，該組成物包含含有選自下列群組之胺基酸序列的Wnt結合劑：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：1。於一些體系中，該組成物包含含有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的Wnt結合劑。於一些體系中，該組成物包含含有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的Wnt結合劑。於一些體系中，此處所描述之組成物進一步包含藥學上可接受之載體。
本發明亦提供包含此處所描述之Wnt結合劑或多肽之組成物的使用方法。
Ⅲ.多核苷酸
於某些體系中，本發明包含多核苷酸，該多核苷酸含有編碼特異結合人Wnt蛋白之多肽或這類多肽之片段的多核苷酸。例如：本發明提供包含編碼可溶性FZD受體或編碼這類可溶性受體之片段的核酸序列之多核苷酸。於一些體系中，本發明提供包含編碼可溶性SFRP、可溶性Ror蛋白或編碼這類可溶性蛋白之片段的核酸序列之多核苷酸。於一些體系中，該多核苷酸包含編碼任何此處所描述之Wnt結合劑的多核苷酸。本發明之多核苷酸可為RNA之形式或DNA之形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成的DNA；且可為雙股或單股，若為單股則可為該編碼股或非編碼(反義)股。
於某些體系中，該多核苷酸係經分離出。於某些體系中，該多核苷酸為實質上純質。
本發明提供一種多核苷酸，其包含編碼含有選自下列群組之序列的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：75。於一些體系中，該多核苷酸進一步包含編碼選自下列群組之多肽信號序列的多核苷酸：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，該多核苷酸進一步包含編碼選自下列群組之多肽信號序列的多核苷酸：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：50之序列的多肽之多核苷酸。於一些體系中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：53之序列的多肽之多核苷酸。於一些體系中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO：75之序列的多肽之多核苷酸。本發明進一步提供包含SEQ ID NO：2之序列的多核苷酸。
本發明提供一種多核苷酸，其包含編碼含有下列各項之多肽的多核苷酸：選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74；人FZD8之Fri結構區；以及人Fc區。於一些體系中，該多核苷酸包含編碼含有SEQ ID NO：71之信號序列；人FZD8之Fri結構區；以及人Fc區之多肽的多核苷酸。
本發明亦提供一種多核苷酸，其包含與具有SEQ ID NO：2之序列的多核苷酸雜合和/或與編碼具有下列序列之多肽的多核苷酸雜合的多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：75。於某些體系中，該雜合係在高度嚴格的條件下進行。
於某些體系中，該多核苷酸包含成熟多肽之編碼序列，該成熟多肽在同一閱讀框構中連結至可協助，例如：多肽(如：領導序列或信號序列，其可作為用來控制多肽從細胞轉運之分泌序列)從宿主細胞表現和分泌的多核苷酸上。具有領導序列之多肽為一種前體蛋白且該領導序列可被宿主細胞裂解以形成該多肽之成熟形式。該多核苷酸亦可編碼為成熟蛋白質加額外之5'端胺基酸殘基的前體蛋白。具有前序列之成熟蛋白為一種前體蛋白且為該蛋白質之去活化形式。該前序列一旦被裂解後仍保留活性成熟蛋白。
於某些體系中，該多核苷酸包含成熟多肽之編碼序列，該成熟多肽在同一閱讀框構中連結至可容許，例如：純化經編碼之多肽的標記序列上。例如：在細菌宿主的情況中，該標記序列可為由pQE-9載體供應之六聚組胺酸標籤以供允許連結該標記之成熟多肽純化，或者，當使用哺乳動物宿主(如：COS-7細胞)時，該標記序列可為流感血凝素蛋白源性之血凝素(HA)標籤。
本發明進一步關於上述之編碼，例如：片段、類似物和衍生物之多核苷酸的變異體。本發明之多核苷酸的片段或部分可用於合成本發明之全長核苷酸。
於某些體系中，本發明提供經分離之多核苷酸，其包含與編碼含有此處所描述之可溶性FZD受體或其他Wnt結合劑的多肽之多核苷酸至少為80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致，且於一些體系中，至少為96%、97%、98%或99%一致的多核苷酸。
具有與參考之核苷酸序列至少為，例如：95%“一致”之核苷酸序列的多核苷酸係欲指該多核苷酸之核苷酸序列與該參考序列相一致，但該多核苷酸序列所含有之該參考核苷酸序列中每100個核苷酸中最多可有五個點突變。換言之，為了取得與參考核苷酸序列具有至少95%一致性之核苷酸序列的多核苷酸，可將該參考序列中至多5%之核苷酸刪除或以另一核苷酸取代，或可將至多為參考序列中全部核苷酸的5%之核苷酸數插入該參考序列中。這些參考序列之突變可出現在該參考核苷酸序列之胺基或羧基端位置或介於那些終端位置之間的任何處，且係個別散置在參考序列中之核苷酸間或在該參考序列內之一或多個連續群體中。
該多核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中包含改變。於一些體系中，該多核苷酸變異體含有可產生沉默胺基酸替換、加入或缺失，但不改變該經編碼之多肽的性質或活性的改變。於一些體系中，核苷酸變異體係由遺傳密碼簡倂性造成之沉默替代產生。於一些體系中，核苷酸變異體包含造成表現差異(例如：增加或減少表現)之核苷酸序列，即使該胺基酸序列未被改變。多核苷酸變異體可因各種原因產生，例如：為特定的宿主將密碼子表現最優化(改變人mRNA中之密碼子成為較受細菌宿主，諸如大腸桿菌偏好者)。
此處所描述之多核苷酸可藉由本技藝已知之任何適當的方法產生。如本文之一些體系中所述，DNA序列係利用基因重組技術，經由分離或合成編碼所欲之野生型蛋白的DNA序列來構建。於一些體系中，DNA序列之構建係利用基因重組技術，經由分離出超過一種編碼所欲之二種多肽的DNA序列，再將這些DNA序列連結在一起以產生融合蛋白。
於一些體系中，可使用寡核苷酸合成器，藉由化學合成來構建DNA序列。這類寡核苷酸可根據所需多肽之基酸序列來設計。標準方法可應用在合成編碼所欲多肽之多核苷酸序列。例如：可使用完整的胺基酸序列來構建逆轉譯基因。此外，可合成含有編碼特定多肽之核苷酸序列的DNA寡聚體。例如：可合成數個編碼所需多肽之部分的小寡核苷酸，然後將其連結。個別寡核苷酸通常包含用於互補組合之5'或3'懸端。於一些體系中係合成編碼所需之融合蛋白的核苷酸序列，如此該兩種多肽係直接連接，而無插入肽連接子。
一旦組合後(藉由合成、定點突變、基因重組技術或其他方法)，可將編碼所欲之特定多肽的多核苷酸序列插入表現載體中並經操作性連接至適合在所需宿主中表現該多肽之表現調控序列。正確之組合可藉由核苷酸定序、限制酶切作圖和/或在合適之宿主中表現生物活性多肽來確認。如本技藝所周知，為了在宿主中高度表現經轉染之基因，必須將該基因操作性連接至可在所選擇之表現宿主中作用之轉錄和轉譯表現調控序列。
本發明提供包含此處所描述之多核苷酸的載體。本發明亦提供包含該載體或此處所描述之載體或多核苷酸的細胞。
Ⅳ.　醫藥組成物
本發明進一步提供包含結合一或多種Wnt蛋白之作用劑(如：可溶性FZD受體)和/或為Wnt拮抗劑之醫藥組成物。於一些體系中，該醫藥組成物包含如此處所描述之Wnt結合劑和多肽。這些醫藥組成物可用於抑制腫瘤細胞生長及治療人類患者之癌症。於一些體系中，如此處所描述之Wnt結合劑可用於製造治療癌症之藥物。
經由將本發明之純化的作用劑或拮抗劑與藥學上可接受的載體、賦形劑和/或安定劑合倂來製備為無菌凍乾粉末、水溶液，等形式之供儲存和使用的調製劑(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,University of the Sciences,Philadelphia,2005)。合適之載體、賦形劑或安定劑包含非毒性緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽類，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及蛋胺酸；防腐劑(例如：十八烷基二甲苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯札氯銨；氯化苄氧乙銨；苯酚、丁基醇或苄基醇；對羥基過苯甲酸烷基酯，諸如對羥基過苯甲酸甲酯或對羥基過苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和鄰-甲酚)；低分子量多肽(諸如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；碳水化合物類，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽之抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物(如：鋅-蛋白質複合物)；和/或非離子性界面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本發明之醫藥組成物可以任何數目之方式投服以供局部或系統性治療。投藥可為局部投藥(諸如黏膜，包括陰道和直腸投遞)，諸如透皮貼片、膏劑、塗劑、乳膏、凝膠、滴液、栓劑、噴霧、液體和粉末；肺部投藥(例如：經由吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括藉由霧化器；經由氣管內、鼻內、表皮和透皮途徑)；口服；或經由腸胃道外途徑投藥，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或經由顱內途徑(例如：鞘內或腦室)投藥。
治療性調製劑可為單位劑型。這類調製劑包括用於口服、經由腸胃道外或直腸途徑投服或用於經由吸入投服之片劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液或在水或非水性培養基中之懸浮液，或栓劑。在固體組成物(諸如片劑)中，該主要活性成分係與藥用載體混合。習知之壓片成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠以及其他稀釋劑(例如：水)以形成含有本發明之化合物或其非毒性藥學上可接受之鹽的均勻混合物之固態預製組成物。然後，將該固態預製組成物再細分為上述類型之單位劑型。該新穎組成物之片劑、丸劑，等可經塗層或經複合以提供可賦予長效優勢之劑型。例如；該片劑或丸劑可包含由外成分覆蓋之內組成物。此外，該兩種成分可藉由腸衣層分開，該腸衣層可用來抵抗崩解並可允許內成分完整通過胃部或延遲釋出。可用於此類腸衣層或塗層之材料有多種，包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及醋酸纖維素這類物質之混合物。
藥學調製劑包括與脂質體複合之本發明的拮抗劑(如：Wnt結合劑)(Epstein et al.,1985,PNAS,82:3688;Hwang et al.,1980,PNAS,77:4030；及美國專利編號4,485,045和4,544,545)。美國專利5,013,556中揭示其循環時間增加之脂質體。脂質體可經由逆相蒸發包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及聚乙二醇衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組成物來產生。將脂質體通過具有界定之孔徑的過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
該拮抗劑(如：Wnt結合劑)亦可包在微膠囊中。這類微膠囊係藉由，例如：凝聚技術或界面聚合法，例如：分別使用羧甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，在膠體藥物遞送系統(例如：脂質體、白蛋白微球、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊)或在粗乳劑中製備(如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,University of the Sciences Philadelphia,2005中所描述者)。
此外，可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該作用劑之固態疏水聚合物的半滲透性基質，該基質為成型製品之形式(如：薄膜或微膠囊)。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠，諸如聚(2-羥乙基-丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利編號3,773,919)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-醋酸乙烯酯、可降解之乳酸-甘醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-甘醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林所組成之注射微球)、蔗糖醋酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
本發明之Wnt結合劑(包括可溶性受體)可用於多種應用中，包括，但不限於治療性處理方法(諸如治療癌症)。於某些體系中，該作用劑可用於抑制Wnt傳信(例如：典型Wnt傳信)、抑制腫瘤生長、誘導分化、縮少腫瘤體積、降低癌幹細胞發生頻率和/或降低腫瘤之致瘤性。使用方法可為玻管中、體外或體內的方法。於某些體系中，該Wnt結合劑或多肽為其所結合之一或多種人Wnt蛋白的拮抗劑。
於某些體系中，該Wnt結合劑或拮抗劑可用於治療與Wnt傳信活化相關之疾病。於特殊體系中，該疾病為一種依賴Wnt傳信之疾病。於特殊體系中，該Wnt傳信為典型Wnt傳信。於某些體系中，該Wnt結合劑或拮抗劑可用於治療特徵為幹細胞和/或祖細胞水準提高的病症。
於某些體系中，該以Wnt結合劑或拮抗劑(如：可溶性FZD受體、SFRP源性蛋白或可溶性Ror受體)治療之疾病為一種癌症。於某些體系中，該癌症之特徵為Wnt依賴性腫瘤。於某些體系中，該癌症之特徵為表現該一或多種Wnt結合劑(如可溶性受體)所結合之Wnt。
於某些體系中，該以Wnt結合劑或拮抗劑治療之疾病不是癌症。舉例而言，該疾病可為一種代謝病症，諸如肥胖或糖尿病(例如：第Ⅱ型糖尿病)(Jin T.,2008,Diabetologia,51:1771-80)。或者，該疾病可能為骨骼病症，諸如骨質疏鬆症、骨關節炎或類風濕關節炎(Corr M.,2008,Nat. Clin. Pract. Rheumatol.,4:550-6;Day et al.,2008,Bone Joint Surg. Am.,90 Suppl 1:19-24)。該疾病亦可能為一種腎臟病症，諸如多囊性腎病(Harris et al.,2009,Ann. Rev. Med. 60:321-37;Schmidt-Ott et al.,2008,Kidney Int.,74:1004-8;Benzing et al.,2007,J. Am. Soc. Nephrol.,18:1389-98)。或者，可治療眼部病症，包括，但不限於黃斑變性及家族性滲出性玻璃體視網膜病變(Lad et al.,2009,Stem Cells Dev.,18:7-16)。亦可治療心血管疾病，包括心肌梗塞、動脈粥樣硬化和瓣膜疾病(Al-Aly Z.,2008,Transl. Res.,151:233-9;Kobayashi et al.,2009,Nat. Cell Biol.,11:46-55;van Gijn et al.,2002,Cardiovasc. Res.,55:16-24;Christman et al,,2008,Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol.,294:H2864-70)。於一些體系中，該疾病為一種肺部病症，諸如特發性肺動脈高血壓或肺纖維化(Laumanns et al.,2008,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,2009,40: 683-91;Knigshoff et al.,2008 PLoS ONE,3:e2142)。於一些體系中，該以Wnt結合劑治療之疾病為一種肝臟疾病，諸如肝硬化或肝纖維化(Cheng et al.,2008,Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.,294:G39-49)。
本發明提供治療癌症之方法，其包含投與個體(例如：需要治療之個體)治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該癌症為選自下列群組之癌症：大腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤及頭頸癌。於某些體系中，該癌症為胰臟癌。於某些體系中，該癌症為大腸直腸癌。於某些體系中，該癌症為乳癌。於某些體系中，該個體為人類。
本發明進一步提供使用此處所描述之Wnt結合劑抑制腫瘤生長的方法。於某些體系中，該抑制腫瘤生長的方法包含令腫瘤或腫瘤細胞與Wnt結合劑在玻管中接觸。例如：將表現標靶Wnt之永生化細胞株或癌細胞株在添加Wnt結合劑以抑制腫瘤細胞生長的培養基中培養。於一些體系中係自患者樣本(諸如，例如：組織活體切片、胸腔積液，或血液樣本)分離出腫瘤細胞並在添加Wnt結合劑以抑制腫瘤細胞生長的培養基中培養之。
於一些體系中，該抑制腫瘤生長的方法包含令腫瘤或腫瘤細胞與Wnt結合劑(如：FZD可溶性受體)在體內接觸。於某些體系中係在動物模型中令腫瘤或腫瘤細胞與Wnt結合劑接觸。例如：可將Wnt結合劑投至已在免疫功能低下之小鼠(例如：NOD/SCID小鼠)中生長之表現一或多種Wnts的異種移植體上以抑制腫瘤生長。於某些體系中，自患者樣本(諸如，例如：組織活體切片、胸腔積液，或血液樣本)分離出癌幹細胞並將其注射入免疫功能低下之小鼠中，再投予該小鼠Wnt結合劑以抑制腫瘤細胞生長。於一些體系中係在將致瘤性細胞引入動物之同時或不久之後投予該動物Wnt結合劑，以防止腫瘤生長。於一些體系中該Wnt結合劑係在致瘤性細胞已生長成特定大小的腫瘤後投予，以作為一種治療劑。
於某些體系中，該抑制腫瘤生長的方法包含投予個體治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該個體為人類。於某些體系中，該個體具有腫瘤或已移除腫瘤。
本發明亦提供降低包含癌幹細胞之腫瘤中的癌幹細胞之發生頻率的方法，該方法包括投予個體治療上有效量之Wnt結合劑。此外，亦提供誘導個體中之腫瘤細胞分化的方法，其中該方法包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。於一些體系中，用於誘導腫瘤中之分化標記表現的方法包含投予個體治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該個體為人類。
於某些體系中，該腫瘤為其中Wnt傳信活躍的腫瘤。於某些體系中，該活躍之Wnt傳信為典型Wnt傳信。於某些體系中，該腫瘤為一種Wnt依賴性腫瘤。例如：於一些體系中，該腫瘤對軸抑制素(axin)過度表現敏感。於某些體系中，該腫瘤在腺瘤性息肉(APC)腫瘤抑制基因中不包含失活突變(如：截斷突變)或在β-連環素基因中不包含活化突變。於某些體系中，該腫瘤表現一或多個Wnt基因標記(gene signature)之基因。於某些體系中，該個體中正接受治療之癌症涉及這類腫瘤。
於某些體系中，該腫瘤表現一或多種該Wnt結合劑結合之人Wnt蛋白。於某些體系中，該腫瘤過度表現人Wnt。
於某些體系中，該腫瘤為選自下列群組之腫瘤：大腸直腸瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤、卵巢瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑色素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、膠質母細胞瘤和頭頸腫瘤。於某些體系中，該腫瘤為大腸直腸瘤。於某些體系中，該腫瘤為胰臟腫瘤。於某些體系中，該腫瘤為乳房腫瘤。
本發明亦提供抑制細胞中Wnt傳信的方法，其包含令細胞與有效量之Wnt結合劑接觸。於某些體系中，該細胞為腫瘤細胞。於某些體系中，該方法為一種活體內方法，其中該令細胞與作用劑接觸之步驟包含投予該個體治療上有效量之作用劑。於一些替代體系中，該方法為玻管內或體外方法。於某些體系中，該受抑制之Wnt傳信為典型Wnt傳信。於某些體系中，該Wnt傳信係藉由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b和/或Wnt10b傳信。於某些體系中，該Wnt傳信係藉由Wnt1、Wnt3a、Wnt7b和/或Wnt10b傳信。
此外，本發明提供降低腫瘤在個體中之致瘤性的方法，其包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該腫瘤包含癌幹細胞。於某些體系中係經由投服Wnt結合劑來降低該腫瘤中之癌幹細胞的發生頻率。
因此，本發明亦提供降低腫瘤中之癌幹細胞的發生頻率之方法，該方法包含令腫瘤與有效量之Wnt結合劑(例如：可溶性FZD受體、可溶性Ror受體或SFRP-Fc融合蛋白)接觸。
本發明進一步提供將致瘤性細胞分化成非致瘤性細胞的方法，其包含令致瘤性細胞與Wnt結合劑接觸(例如：經由投予個體Wnt結合劑來進行，其中該個體具有包含致瘤性細胞之腫瘤或已切除這類腫瘤)。於某些體系中，該致瘤性細胞為胰臟腫瘤細胞。於某些替代之體系中，該致瘤性細胞為結腸腫瘤細胞。
本發明亦提供此處所描述之Wnt結合劑於誘導細胞(包括，但不限於腫瘤細胞)分化的用途。例如：本發明設想誘導細胞分化的方法，該方法包含令細胞與有效量之此處所描述之Wnt結合劑(例如：可溶性FZD受體、可溶性Ror受體或SFRP-Fc融合蛋白)接觸。本發明亦提供誘導個體中之腫瘤中的細胞分化之方法，其包含投予個體治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該腫瘤為胰臟腫瘤。於某些其他體系中，該腫瘤為結腸腫瘤。
本發明進一步提供治療個體中之疾病或病症的方法，其中該疾病或疾病係與Wnt傳信活化有關和/或特徵為幹細胞和/或祖細胞水準提高。於一些體系中，該治療方法包含投予該個體治療上有效量之Wnt結合劑。於某些體系中，該Wnt傳信為典型Wnt傳信。
該Wnt結合劑或拮抗劑係根據已知方法，以適當之醫藥組成物形式投予病人。合適之投服方法包括，但不限於靜脈內(以大丸藥形式小鼠或在一段時間內連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、動脈內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。
於某些體系中，除了投服Wnt結合劑外，該治療方法進一步包含在投服Wnt結合劑之前、同時和/或隨後投服第二個治療劑(如：抗癌劑)。本發明亦提供包含該Wnt結合劑與第二種治療劑之醫藥組成物。
吾人將可察知，Wnt結合劑與第二種治療劑之組合可以任何順序或同時投服。於選定之體系中，該Wnt結合劑將投予已預先接受第二種治療劑治療的患者。於某些其他體系中，該Wnt結合劑及第二種治療劑將實質上同時或並行投藥。例如：可在個體接受第二種治療劑之療程(如：化療)的同時投予個體Wnt結合劑。於某些體系中，該Wnt結合劑將在以第二種治療劑治療的一年內投藥。於某些替代體系中，該Wnt結合劑將在以第二種治療劑進行之任何治療的10、8、6、4或2個月內投藥。於某些其他體系中，該Wnt結合劑將在以第二種治療劑進行之任何治療的4、3、2或1週內投藥。於一些體系中，該Wnt結合劑將在以第二種治療劑進行之任何治療的5、4、3、2或1天內投藥。吾人將可進一步察知，該二種作用劑或治療可在數小時或數分鐘內(即，實質上同時)投予個體。
以至少兩種治療劑進行之合倂療法經常使用藉由不同作用機制作用的作用劑，雖然這並非必要的。使用具不同作用機制之作用劑的合倂療法可能造成加成或協同效應。合倂療法可能允許各作用劑之使用劑量低於單一療法中所使用之劑量，從而降低毒性副作用。合倂療法可能降低發展出抗藥性癌細胞的可能性。於一些體系中，合倂療法包含影響(例如：抑制或殺死)非致瘤性細胞之治療劑及影響(例如：抑制或殺死)致瘤性CSCs之治療劑。
有用之治療(例如：抗癌)劑類別包括，例如：抗微管蛋白劑、歐利史汀(auristatins)、DNA小溝區結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(如：鉑複合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)和三核鉑複合物及卡鉑)、蒽環類、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝劑、化療增敏劑、倍癌黴素(duocarmycins)、依托泊苷(etoposides)、氟化嘧啶、離子載體、拉克左素(lexitropsins)、亞硝基脲、順鉑(platinols)、執行化合物(performing compound)、嘌呤抗代謝劑、嘌呤黴素(puromycins)、輻射增敏劑、類固醇、紫杉烷類、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼、等。於某些體系中，該第二種治療劑為一種抗代謝劑、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。
可與Wnt結合劑組合投服之治療劑包括化學治療劑。因此，於一些體系中，該治療方或涉及合倂投服本發明之Wnt結合劑與化學治療劑或多種不同化學治療劑之混合物。以Wnt結合劑治療可在投予化學療法之前、同時或隨後發生。本發明所考慮之化學療法包括本技藝已知之化學物質或藥物且可從市面上購得，諸如吉西他濱、依立替康、阿黴素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環磷醯胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、細胞毒素(cytoxin)、太平洋紫杉醇、甲胺蝶呤、順鉑、馬法蘭(melphalan)、長春新鹼和卡鉑。合倂用藥可以包括共同投藥(無論是在單一之藥學調製劑中或係使用分開之調製劑)，或以任何順序連續投藥，但一般係在一段期間內，從而使所有活性劑可以同時發揮其生物活性。這類化學治療劑之製備方法和給藥時間表可根據製造商之指示或由技術熟練的從業人員根據經驗決定。這類化學療法之製備方法及給藥時間表亦描述於Chemotherapy Service Ed.,M. C. Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,Md(1992)中。
可用於本發明之化學治療劑亦包括，但不限於烷基化劑，諸如噻替哌及環磷醯胺；磺酸烷酯，諸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和比波舒凡(piposulfan)；氮雜環丙烷，諸如苯柔多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基多巴(meturedopa)及普力多巴(uredopa)；乙烯亞胺及甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、鹽酸二氯甲基二乙胺氧化物、馬法蘭、新恩比興(novembichin)、苯芥膽固醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末；亞硝基脲，諸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福替目丁(fotemustine)、洛莫司汀、嘧啶亞硝脲(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素、蒽黴素(authramycin)、重氮乙醯絲胺酸、博來黴素(bleomycins)、放線菌素(cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、更生黴素、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-合氧基-L-正白胺酸、阿黴素、表阿黴素、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、紫菜黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，諸如甲胺蝶呤反5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)，甲胺蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲喋呤(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、氮雜胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)，去氫睾内酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如福林葉酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷醯胺(aldophosphamide)葡糖苷；胺基乙醯丙酸；安ㄚ啶(amsacrine)；貝曲布索(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；廸氟法邁(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵，羥基脲，香菇多醣；氯尼達明(lonidamine)；丙酮雙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)，吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細格孢氮雜酸(tenuazonic acid)；三乙撐亞胺苯醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；聚胺酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴脫氧己六醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；嘉胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；塞替派；類毒素，例如：太平洋紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇(TAXOTERE)、苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春新鹼；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；異長春花鹼；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；柔紅黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO);維甲酸；爾泊黴素(esperamicins)；卡培他濱；及上述任一項之藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑還包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素，包括，例如：他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林及戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一項之藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
於某些體系中，該化學治療劑為一種拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑為干擾拓撲異構酶(如：拓撲異構酶1或Ⅱ)之作用的化學治療劑。拓撲異構酶抑制劑包括，但不限於：阿黴素HCl、柔紅黴素檸檬酸鹽、米托蒽醌HCl、放線菌素D、依托泊苷、拓撲替康HCl、替尼泊苷(VM-26)及伊立替康。於某些體系中，該第二種治療劑為伊立替康。於某些體系中，該欲治療之腫瘤為大腸直腸腫瘤且該第二種治療劑為一種拓撲異構酶抑制劑(諸如伊立替康)。於一些體系中，將Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53且該第二種治療劑為伊立替康。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：75且該第二種治療劑為依立替康。
於某些體系中，該化學治療劑為一種抗代謝劑。抗代謝劑為一種化學物質，其結構類似於正常生化反應所需之代謝物，但與該代謝物不同之處足以干擾細胞之一或多種正常功能(諸如細胞分裂)。抗代謝劑包括，但不限於：吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺蝶呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟(tegafur)、阿糖胞苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、潘托史汀(pentostatin)、氟達拉濱(fludarabine)磷酸鹽和克拉屈濱(cladribine)，以及這些中任一項之藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。於某些體系中，該第二種治療劑為吉西他濱。於某些體系中，該欲治療之腫瘤為胰臟腫瘤且該第二種治療劑為抗代謝劑(如：吉西他濱)。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53且該第二種治療劑為吉西他濱。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：75且該第二種治療劑為吉西他濱。
於某些體系中，該化學治療劑為一種抗有絲分裂劑，包括，但不限於結合微管蛋白之作用劑。藉由非限制性之實例說明，該作用劑包含紫杉烷。於某些體系中，該作用劑包含太平洋紫杉醇或多西紫杉醇，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇之藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。於某些體系中，該作用劑為太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、與白蛋白結合之太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。於某些替代之體系中，該抗有絲分裂劑包含長春生物鹼，諸如長春新鹼、長春花鹼、長春瑞濱或長春地辛，或彼等之藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。於一些體系中，該抗有絲分裂劑為一種Eg5動蛋白之抑制劑或有絲分裂激酶之抑制劑，諸如Aurora A或Plkl。於某些體系中，該與Wnt結合劑或多肽合倂投服之化學治療劑包含抗有絲分裂劑，該癌症或正接受治療之腫瘤為乳癌或乳房腫瘤。於某些體系中，該欲治療之腫瘤為乳房腫瘤且該第二種治療劑為太平洋紫杉醇。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53且該第二種治療劑為太平洋紫杉醇。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：75且該第二種治療劑為太平洋紫杉醇。
於某些體系中，該治療涉及合倂投服本發明之Wnt結合劑和放射療法。以Wnt結合劑治療可在投予放射療法之前、同時和/或隨後發生。任何用於這類放射療法之給藥時間表可依熟練之從業人員的決定來使用。
於一些體系中，該第二種治療劑包含抗體。因此，治療可能涉及合倂投服本發明之Wnt結合劑與針對腫瘤相關抗原之抗體(包括，但不限於結合EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、Notch和/或VEGF之抗體)。例如：美國專利編號7,750,124中描述抗-DLL4抗體，其全部內容納為此文之參考資.料。其他抗DLL4抗體描述於，例如：國際專利刊物編號WO 2008/091222和WO 2008/0793326，以及美國專利申請案編號US 2008/0014196、US 2008/0175847、US 2008/0181899和US 2008/0107648(其全部內容各納為此文之參考資料)中。於某些體系中，該第二種治療劑為一種作為血管生成抑制劑之抗體(如：抗VEGF抗體)。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53且該第二種治療劑為抗-VEGF抗體。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：75且該第二種治療劑為抗-VEGF抗體。於某些體系中，該第二種治療劑為一種Notch傳信抑制劑。於一些體系中，該第二種治療劑為抗-Notch抗體。示範之抗-Notch抗體描述於，例如：美國專利申請刊物編號US 2008/0131434(其全部內容納為此文之參考資料)中。於某些體系中，該第二種治療劑為貝伐單抗(AVASTIN)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)或西妥昔單抗(ERBITUX)。合倂投藥可包括共同投藥(無論是在單一藥學調製劑中或使用分開的調製劑)，或以任何順序連續投藥，但一般係在一段期間內，從而使所有活性劑可以同時發揮其生物活性。
此外，治療可包括投服一或多種細胞因子(如：淋巴因子、介白素、腫瘤壞死因子和/或生長因子)，或可以伴隨使用外科手術切除腫瘤或癌細胞或任何其他主治醫生認為必要之療法。
在治療該疾病方面，本發明之作用劑的適當劑量取決於欲治療之疾病的類型、疾病之嚴重程度和進程、疾病之反應性、投服該作用劑係為了治療或預防目的、先前療法、病人之臨床病史，等，均由主治醫生酌情權衡。該作用劑可一次投服或在持續數天至數個月的系列治療中投服，或投服直到病癒或達到疾病狀態減輕(如：腫瘤的大小縮小)。最理想之給藥時間表可從測量藥物在病人體內積聚的情況計算出且將根據個別作用劑之相對效力而有不同。投藥之醫師可輕鬆地確定最佳劑量、給藥方法和重複率。於某些體系中，每公斤體重之劑量為從0.01微克到100毫克且可每天、每週、每月或每年投藥一次或多次。於某些體系中，可溶性受體或其他Wnt結合劑之劑量係從每公斤體重約0.1毫克至約20毫克。於某些體系中係每週投服一次Wnt結合劑。於某些體系中係每兩週或每三週投服一次Wnt結合劑。治療醫師可根據測得之藥物在體液或組織中的停留時間和濃度估算重複給藥率。
本發明進一步提供篩選作用劑抑制Wnt傳信之效力、抗腫瘤活性和/或對抗癌幹細胞之活性的方法。於某些體系中，該方法包含比較已接觸該作用劑之第一實體腫瘤(例如：包含癌幹細胞之實體腫瘤)中之一或多種分化標記和/或一或多種幹細胞性標記之水準與未曾接觸該作用劑之第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準。於一些體系中，該方法包含：(a)令第一實體腫瘤接觸該作用劑，但第二實體腫瘤則不；(b)評估第一和第二實體腫瘤中之一或多種分化標記和/或一或多種幹細胞性標記的水準；及(c)比較第一實體腫瘤中之一或多種分化標記之水準與第二實體腫瘤中之一或多種分化標記的水準。於某些體系中，該(a)相對於第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準而言，該第一實體腫瘤中的一或多種分化標記之水準增加表示具有抗腫瘤(或抗癌幹細胞)活性；且(b)一或多種幹細胞性標記之水準降低表示具抗腫瘤(或抗癌幹細胞)活性。於某些體系中，該作用劑結合一或多種Wnt蛋白。於某些體系中，該作用劑為FZD可溶性受體。於某些方法中，該作用劑為一種抗體，諸如抗Wnt抗體。
其他篩選作用劑之方法包括，但不僅限於包含比較已接觸一種作用劑之第一實體腫瘤中的一或多種分化標記之水準與未曾接觸該作用劑之第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準之方法。於某些體系中，該方法包括包含：(a)令第一實體腫瘤接觸該作用劑，但第二實體腫瘤則不；(b)評估第一和第二實體腫瘤中之一或多種分化標記的水準；及(c)比較第一實體腫瘤中之一或多種分化標記之水準與第二實體腫瘤中之一或多種分化標記的水準。於某些體系中，該作用劑為Wnt結合劑。於某些體系中，該作用劑為典型Wnt傳信途徑之抑制劑。於某些體系中，該作用劑抑制一或多種人Wnt蛋白結合一或多種人FZD受體。於某些體系中，相對於第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準，第一實體腫瘤中的一或多種分化標記之水準增加表示具有對抗實體腫瘤幹細胞(CSCs)的效力。於某些替換體系中，相對於第二實體腫瘤中的一或多種分化標記的水準，第一實體腫瘤中的一或多種分化標記(即，負分化標記)之水準降低表示具有抗實體腫瘤幹細胞之效力。
於某些體系中，該在篩選方法中之實體腫瘤為胰臟腫瘤。於某些體系中，該實體腫瘤為胰臟腫瘤且該一或多種分化標記可包含一或多種黏蛋白(如：Muc16)、一或多種細胞角蛋白(如：CK20)和/或嗜鉻粒蛋白A(CHGA)。
於某些替代體系中，在該篩選方法中之實體腫瘤為結腸腫瘤。於一些體系中，該實體腫瘤為結腸腫瘤且該一或多種分化標記可能包括一或多種細胞角蛋白(如：細胞角蛋白7或CK20)。
於某些體系中，該用於此處所描述之篩選方法中之一或多種幹細胞性標記包括ALDH1A1、APC、AXIN2、BMI1、CD44、FGF1、GJB1、GJB2、HES1、JAG1、LGR5、LHX8、MYC、NANOG、NEUROD1、NEUROG2、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PROCR、RARRES1、RARRES3、RBP2、SOX1、SOX2、ASCL2、TDGF1、OLFM4、MSI1、DASH1、EPHB3和/或 EPHB4。於某些體系中，二或多種幹細胞性標記、三或多種幹細胞性標記、四或多種幹細胞性標記、五或多種幹細胞性標記、六或多種或十或多種幹細胞性標記係選自下列群組：ALDH1A1、APC、AXIN2、BMI1、CD44、FGF1、GJB1、GJB2、HES1、JAG1、LGR5、LHX8、MYC、NANOG、NEUROD1、NEUROG2、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PROCR、RARRES1、RARRES3、RBP2、SOX1、SOX2、ASCL2、TDGF1、OLFM4、MSI1、DASH1、EPHB3及EPHB4。
於某些體系中，該用於篩選方法中之一或多種分化標記包括ALDOB、BMP2、BMP7、BMPR1B、CEACAM5、CEACAM6、CDX1、CDX2、CLCA2、COL1A2、COL6A1、CHGA、CSTA、CST4、CK20、DAB2、FABP4、GST1、KRT4、KRT7、KRT15、KRT17、KRT20、LAMA1、MUC3A、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、NDRG2、PIP、PLUNC、SPRR1A、REG4、VSIG1和/或 XAF1。於某些體系中，用於篩選方法中之二或多種、三或多種、四或多種、五或多種、六或多種或十或多種分化標記係選自下列群組：ALDOB、BMP2、BMP7、BMPR1B、CEACAM5、CEACAM6、CDX1、CDX2、CLCA2、COL1A2、COL6A1、CHGA、CSTA、CST4、CK20、DAB2、FABP4、GST1、KRT4、KRT7、KRT15、KRT17、KRT20、LAMA1、MUC3A、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、NDRG2、PIP、PLUNC、SPRRIA、REG4、VSIG1及XAF1。
其他胰臟及結腸以及其他腫瘤類型之可能的分化標記為熟習本技藝之人士所已知。此外，可能之分化標記於篩選方法中的用途可由熟習本技藝之人士以一或多種此處所描述之可溶性FZD受體(諸如FZD8-Fc)治療需要之腫瘤類型，然後再評估該標記在經治療之腫瘤中相對於對照組中的表現變化來輕鬆地評估。這類方法之非限制性實例可，例如：在下列具體實例中找到。
本發明進一步提供用於製造可溶性Wnt結合劑之方法。於某些體系中，該方法包含製造在細胞中包含人FZD8之Fri結構區的可溶性Wnt結合劑(其中該Wnt結合劑之至少80%具有ASA之N端序列)，該方法包含使用選自下列群組之信號序列：SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。於一些體系中，信號序列的SEQ ID號：71。在一些實施，該Wnt結合劑之至少約90%、至少約95%或至少約98%具有ASA之N端序列。於一些體系中，該細胞為哺乳動物細胞。於一些體系中，該Wnt結合劑包含人Fc區。於一些體系中，該Wnt結合劑包含選自下列群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：1。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：53。於一些體系中，該Wnt結合劑包含SEQ ID NO：50。於一些體系中，該細胞包含一多核苷酸，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO：75之序列之多肽的多核苷酸。
此處所描述之實例和體系可被理解僅係用於說明且熟習本技藝之人士鑑於這些實例和體系將可聯想各種修改或變化且其係包括在本申請案之精神和範圍內。
實例1
FZD8-Fc之製造方法
將編碼FZD8-Fc(54F03)之cDNA分殖入pEE14.4表現載體(Lonza)中，以HindIII和EcoRI酶切。選殖後，以PvuI酶切以將該pEE14.4-FZD8-Fc DNA線性化，隨後再採用標準程序，藉由電穿孔法將其引入GS-CHOK1細胞中。取得表現FZD8-Fc之穩定選殖株，並將其在不含血清之培養基中增殖。使用與蛋白A共軛結合之樹脂，藉由親和性捕捉來純化FZD8-Fc。SDS-PAGE分析結果揭露其純度大於98%且內毒素水準低於1EU/毫克蛋白質。
該FZD8-Fc之胺基酸序列為SEQ ID NO：1且該編碼FZD8-Fc之多核苷酸序列為SEQ ID NO：2。
實例2
大鼠中之FZD8-Fc的藥物動力學
在兩週之藥物動力學(PK)研究中使用2毫克/公斤及10毫克/公斤之劑量在大鼠中評估FZD8-Fc(54F03)之藥物動力學。經由尾靜脈投予在各組中之5隻雄性Sprague Dawley大鼠劑量為2毫克/公斤或10毫克/公斤之FZD8-Fc，追踪兩週並在1、24、48、72、96、168、240和336小時之時間點收集樣本。在各時間點收集1毫升血液入鉀-EDTA管中並進行離心。收集血漿上清液並冷凍之，直至分析該樣本。
定量存在於各時間點之血漿中的FZD8-Fc融合蛋白之水準並計算該兩種劑量之FZD8-Fc的半衰期。如第1圖中所示，據估計，劑量為2毫克/公斤之FZD8-Fc的半衰期為163小時，在10毫克/公斤時為157小時。
實例3
FZD8-Fc在胰臟腫瘤模型中之抗腫瘤活性
在胰臟腫瘤模型中以FZD8-Fc抑制腫瘤生長。在PN4胰臟腫瘤異種移植模型中評估FZD8-Fc(54F03)之抗腫瘤活性。將分離之OMP-PN4細胞(50,000/動物)經由皮下途徑注射入6-8週齡之雄NOD/SCID小鼠中。每週監測腫瘤生長，一旦可觸知腫瘤時即開始測量腫瘤。在第50天，將具有平均腫瘤體積為137立方毫米之小鼠隨機分成4組，每組10隻。為動物注射對照組抗體、FZD8-Fc(15毫克/公斤)、吉西他濱(2毫克/公斤)或FZD8-Fc與吉西他濱之組合。投服FZD8-Fc和吉西他濱係經由注射入腹膜內腔進行，每週一次(吉西他濱)或每週兩次(FZD8-Fc)。每週測量腫瘤兩次並使用公式1/2(a×b2)(其中a=長度且b=寬度)測定腫瘤體積。數據以平均值及平均值±S.E.M.表示。使用Student雙尾檢定、非配對t試驗比較群組平均值。概率(p)值<0.05被解釋為具顯著差異。
如第2圖所示，以FZD8-Fc治療可使腫瘤生長減少66%(p<0.001)。此外，相對於以單獨之FZD8-Fc治療，以FZD8-Fc和吉西他濱治療使腫瘤生長減少29%(相對於單獨之FZD8-Fc，p=0.04)(第2圖)。因此，FZD8-Fc可以單一作用劑及與吉西他濱組合之形式在PN4胰臟腫瘤模型中顯示出抗腫瘤生長活性。
以FZD8-Fc治療之PN4腫瘤中CD44hi族群減少。在研究結束時(第85天)收成來自上述OMP-PN4異種移植研究之對照組及經治療之腫瘤。處理腫瘤並將其分解成單一細胞。將源自各治療組之5個腫瘤的單細胞懸浮液匯集，然後將匯集之樣本在冰上與選擇性結合老鼠細胞之抗體(α-老鼠CD45-生物素1:200稀釋液和大鼠α-老鼠H2Kd-生物素1:100稀釋液，加州聖地牙哥，BioLegend)一起培育30分鐘，再添加經抗生蛋白鏈菌素標示之磁珠(加州，卡爾斯巴德，Invitrogen公司)。藉由磁鐵之協助去除老鼠細胞。為了分析人體細胞表面標記，以直接與螢光染料共軛結合之抗-ESA(加州Hayward，Biomeda)及抗-CD44(加州聖荷西，BD生物科學)抗體將單一腫瘤細胞懸浮液染色。使用存活力染料DAPI來排除死亡細胞。使用FACS Aria儀器(新澤西州，富蘭克林湖市，Becton Dickinson公司)進行流式細胞分析。使用側向散射和前向散射變化形廓來排除細胞團塊。
分析以對照抗體治療之腫瘤揭露出12.7%之大塊腫瘤群同時表現出高水準之ESA和CD44二者。如第3圖所示，該雙陽性群未顯著受到以單獨之吉西他濱(13.9%)治療影響，但以FZD8-Fc或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療時可縮小該雙陽性群(分別為1.9%和1.7%)。
藉由限數稀釋檢測來分析經FZD8-Fc治療之PN4腫瘤。限數稀釋檢測(LDA)可用來評估治療劑對實體瘤腫瘤癌幹細胞及包含該癌幹細胞之腫瘤的致瘤性之效果。這類檢測可用來測定以FZD8-Fc融合蛋白或其他治療劑治療之動物的腫瘤中之癌幹細胞的發生頻率，並與對照組動物之腫瘤中的癌幹細胞之發生頻率相比較。
在研究結束(第85天)時收成來自上述PN4異種移植研究之對照組及經治療之腫瘤。處理腫瘤並將其分解成單一細胞。將來自各治療組之5個腫瘤的單一細胞懸浮液匯集，然後將匯集樣本在冰上與選擇性結合老鼠細胞之抗體(α-老鼠CD45-生物素1:200稀釋液及大鼠α-老鼠H2Kd-生物素1:100稀釋液，加州聖地牙哥，BioLegend)一起培育30分鐘，再添加經抗生蛋白鏈菌素標示之磁珠(加州，卡爾斯巴德，Invitrogen公司)。藉由磁鐵之協助去除老鼠細胞。收成、計算懸浮液中之人類細胞並對細胞表面標記進行染色，將在FACS緩衝液中之合適的細胞劑量(30、90和270個細胞)與Matrigel以1:1混合並該混合物經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中(每一治療組每一劑量10隻小鼠)。令腫瘤生長4個月。
在所需之時間點，在所有經注射以FZD8-Fc治療之腫瘤細胞的組中測定具有可偵測之腫瘤的小鼠百分比，並與對照組中具有可偵測之腫瘤的小鼠百分相比較。例如：測定經注射125個以對照抗體治療之腫瘤細胞的小鼠中具有可偵測之腫瘤的小鼠數目並將此數目與經注射125個以FZD8-Fc治療之腫瘤細胞的小鼠中具有可偵測之腫瘤的小鼠數目相比較。
在注射細胞後第75天，各組中之腫瘤侵染率如下：對照組-30隻小鼠中有7隻；FZD8-Fc-30隻小鼠中有3隻；吉西他濱-30隻小鼠中有7隻；FZD8-Fc與吉西他濱-30隻小鼠中有0隻(第4圖)。FZD8-Fc組及合倂治療組中之腫瘤侵染率降低表示FZD8-Fc可降低PN4胰臟腫瘤中之癌幹細胞的發生頻率。從評估CD44的表現及限數劑量稀釋分析得到的證據透露出FZD8-Fc治療可以減少PN4胰臟腫瘤中之癌幹細胞的發生頻率。
癌幹細胞(CSC)之發生頻率可使用L-CalcTM軟體(幹細胞科技公司(StemCell Technologies)；www.stemcell.com)計算出。簡單地說，基於泊松(Poisson)統計，若37%動物無法發展腫瘤，則在已知之注射的細胞數中正好存在一個癌幹細胞。以對照組抗體治療之組別中CSC之發生頻率為1:280，以吉西他濱治療之組別中CSC之發生頻率為1:476，以FZD8-Fc治療之組別中CSC之發生頻率為1:881，而以FZD8-Fc與吉西他濱合倂治療之組別中CSC之發生頻率為1:3763。由於即使是在最高細胞劑量下腫瘤在此組中之侵染率是零，此數字可能無法準確地確定。
實例4
藉由FZD8-Fc增加胰臟腫瘤之細胞分化
以FZD8-Fc治療之PN4和PN8腫瘤中細胞分化增加。在研究結束(第85天)時收成來自上述OMP-PN4異種移植研究(實例3)之對照組和經治療之腫瘤。將腫瘤在福馬林中固定，包埋在石蠟中並切成4微米厚之切片。脫蠟和水化後，在室溫下，以醋酸水溶液處理切片5分鐘。然後，以在3%醋酸水溶液中之1%阿爾新藍(alcian blue)處理切片30分鐘，再以水洗淨。將切片在中性快速紅中進行複染色、脫水並固定之。使用此方法，在組織樣本中的涎黏蛋白(sialomucins)染上藍色，且背景顯示為粉紅色或紅色。
與以對照抗體或吉西他濱治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療PN4腫瘤使表現涎黏蛋白的細胞增加(第5圖，其中該涎黏蛋白顯示出為暗灰色)。以FZD8-Fc和吉西他濱合倂治療亦增加PN4胰臟腫瘤中之涎黏蛋白的表現。因此，以FZD8-Fc治療PN4腫瘤可增加表現涎黏蛋白之已分化細胞的發生頻率。類似的結果可在PN8胰臟腫瘤之異種移植模型中見到(第6圖)。
以FZD8-Fc治療之PN13腫瘤中細胞分化增加。亦在OMP-PN13胰臟腫瘤異種移植模型中評估FZD8-Fc之細胞分化能力。將經分離之OMP-PN13細胞(每隻動物50，000個)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。每週監測腫瘤生長，一旦可觸知腫瘤時即開始測量腫瘤。在第40天，將平均腫瘤體積為114立方毫米之小鼠隨機分成4組，每組10隻。為動物注射對照抗體或FZD8-Fc(15毫克/公斤)。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc和對照抗體，每週兩次。治療19天後，切除腫瘤並採用標準技術進行免疫組織化學分析。簡單地說，將腫瘤在福馬林中固定，包埋在石蠟中並切成4微米厚之切片。脫蠟和水化後，將腫瘤切片在Tris緩衝液(pH 9.5)中進行抗原擷取流程(retrieval process)。將切片與過氧化氫(密蘇里州聖路易市，Sigma-Aldrich公司)一起培育10分鐘以阻斷內源性過氧化物酶。將在阻斷緩衝液(在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐溫20)中稀釋200倍之抗Ki67抗體(Dako，選殖株MIB-1)添加到各切片中並培育1小時。在PBST中輕洗玻片3次，每次5分鐘。將與HRP(ImmPRESSTM抗-老鼠，加州柏寧頓Vector Laboratories公司)共軛結合之抗老鼠二級抗體加至玻片上並培育30分鐘。以PBST清洗多次後，添加Vector Nova Red受質(加州柏寧頓，Vector Laboratories公司)以定位Ki67抗原。在室溫下，以醋酸水溶液處理切片5分鐘。然後，以在3%醋酸水溶液中之1%阿爾新藍處理切片30分鐘，再以水洗淨。將切片在中性快速紅中進行複染色、脫水及固定。使用此方法，在組織樣本中的涎黏蛋白染上藍色，且增殖之細胞被標記為暗紅色。
與以對照抗體治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療PN13腫瘤使表現涎黏蛋白的細胞增加。Ki67的表現指出以FZD8-Fc治療PN13腫瘤亦使細胞增殖減少。第7圖顯示來自經FZD8-Fc治療之腫瘤的組織中，增殖之細胞數量明顯減少(由黑點確定)。因此，以FZD8-Fc治療PN13腫瘤可減少細胞增殖並增加表現黏蛋白之已分化細胞之發生頻率。
以FZD8-Fc治療之PN13腫瘤中Muc16染色增加。取得來自以對照抗體或FZD8-Fc治療之PN13腫瘤的腫瘤切片並依上述處理。在此實例中，將在阻斷緩衝液(在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐溫20)中稀釋200倍之抗-Muc16(麻省劍橋，Abcam)抗體添加到各切片中並培育1小時。利用上述之免疫組織化學議訂計劃偵測結合之抗體。
與以對照抗體治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療PN13腫瘤使表現Muc-16之細胞增加(第8圖，暗染色)。
以FZD8-Fc治療之PN13腫瘤中CK20染色增加。依上述取得並處理腫瘤切片。在此實例子中，將在阻斷緩衝液(在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐溫20)中稀釋200倍之抗-CK20(選殖株Ks20.8，加州卡平特里亞(Carpinteria)，Dako)抗體添加到各切片中並培育1小時。利用上述之免疫組織化學檢測議訂計劃偵測結合之抗體。
與以對照抗體治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療PN13腫瘤使表現CK20之細胞增加(第9圖，暗染色)。
實例5
藉由FZD8-Fc抑制體內乳房腫瘤生長
將經分離之PE13乳房腫瘤細胞(每隻動物50,000個)經由皮下注射入NOD/SCID小鼠之乳脂肪墊中。每週監測小鼠並令腫瘤生長直到腫瘤體積為106立方毫米。在注射細胞後27天，將小鼠隨機分為4個治療組(n=10隻小鼠/組)並以對照抗體、FZD8-Fc(54F03)、紫杉醇或FZD8-Fc與紫杉醇之組合治療之。經由腹膜內途徑投予劑量為7.5毫克/公斤之紫杉醇，每週一次，以及經由腹膜內途徑投予劑量為5毫克/公斤之FZD8-Fc，每週二次。在第10圖所指出之日子測量腫瘤。
相對於對照抗體組，以單一作用劑形式之FZD8-Fc治療時可觀察到腫瘤生長減少20%(p=0.002)。此外，與以單獨之紫杉醇治療相比較，以FZD8-Fc與紫杉醇之組合治療時可使腫瘤生長減少55%(p=0.003)(第10圖)。
實例6
藉由FZD8-Fc抑制體內結腸腫瘤生長
分析多劑量之FZD8-Fc(54F03)和給藥攝生法對C28結腸腫瘤異種移植之生長的效果。將經分離之C28細胞(每隻動物10,000個)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。第2天，將小鼠隨機分成6組，每組10隻。為動物注射對照抗體或下列劑量之FZD8-Fc：1.5毫克/公斤(每週二次)、5毫克/公斤(每週一次及二次)和15毫克/公斤(每週一次及二次)。經由注射入腹膜內腔來投服抗體及FZD8-Fc。每週監測腫瘤生長且一旦可觸知腫瘤時即開始測量腫瘤。每週測量腫瘤兩次並依此處之描述測定腫瘤體積。
如第11A圖所示，與以對照抗體治療組相比較，以15毫克/公斤之FZD8-Fc(每週二次)治療可使腫瘤生長減少83%(p<0.001)。此外，與以對照抗體治療組相比較，以評估之最低劑量的FZD8-Fc(每週二次1.5毫克/公斤)治療可使腫瘤生長減少52%(第11A圖)。因此，為單一作用劑形式之FZD8-Fc可在OMP-C28結腸腫瘤模型中顯示出劑量依賴性之抗腫瘤生長活性。
分析FZD8-Fc(54F03)與化學治療劑組合時對C28結腸腫瘤異種移植生長之效果。將經分離之C28結腸腫瘤細胞(10,000個細胞)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。令腫瘤生長21天，直至腫瘤平均體積達到128立方毫米。將小鼠隨機分組(每組10隻)，並以FZD8-Fc(54F03)(15毫克/公斤，每週一次)、伊立替康(15毫克/公斤，每週一次)及FZD8-Fc與依立替康之組合或對照抗體治療之。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc和對照抗體。監測腫瘤生長並在指定的時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。數據以平均值±S.E.M.表示。
如第11B圖所示，與對照抗體(-■-)治療組相比較，以單一作用劑形式之FZD8-Fc(-▲-)治療可使腫瘤生長減少66%(p<0.001)。此外，與以對照抗體治療組相比較，以FZD8-Fc與伊立替康之組合(-●-)治療可使腫瘤生長減少76%(P<0.001)，此數值高於單獨使用任一作用劑。因此，FZD8-Fc以及FZD8-Fc與化學治療劑之組合可在OMP-C28結腸腫瘤模型中顯示出抗腫瘤生長活性。
實例7
藉由FZD8-Fc增加結腸腫瘤之細胞分化
以FZD8-Fc增加在C28腫瘤中之CK20染色。在研究結束時收成來自上述(實例6)C28異種移植研究中的對照腫瘤和經治療之腫瘤。切除腫瘤並採用標準技術進行免疫組織化學分析。簡單地說，將腫瘤在福馬林中固定，包埋在石蠟中並切成4微米厚之切片。脫蠟和水化後，將腫瘤切片在Tris緩衝液(pH 9.5)中進行抗原擷取流程。將切片與過氧化氫(密蘇里州聖路易市，Sigma-Aldrich公司)一起培育10分鐘以阻斷內源性過氧化物酶。將在阻斷緩衝液(在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐溫20)中稀釋200倍之抗-CK20抗體(選殖株Ks20.8，Dako，加州Carpinteria)添加到各切片中並培育1小時。在PBST中清洗玻片3次，每次5分鐘。將與HRP(ImmPRESSTM抗-老鼠免疫球蛋白，加州柏寧頓，Vector Laboratories公司)共軛結合之抗老鼠二級抗體添加至玻片上並培育30分鐘。以PBST清洗多次後，加入Vector Nova Red受質(加州柏寧頓，Vector Laboratories公司)以定位CK20抗原。
與以對照抗體治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療C28腫瘤使表現CK20之細胞增加(第12圖，暗染色)。
實例8
FZD8-Fc在胰臟腫瘤模型中之抗腫瘤活性
在PN21胰臟腫瘤模型中藉由FZD8-Fc抑制腫瘤生長。在PN21胰臟腫瘤異種移植模型中評估FZD8-Fc(54F03)之抗腫瘤活性。將分離之OMP-PN21細胞(每隻動物50,000個)經由皮下途徑注射入6-8週齡之雄NOD/SCID小鼠中。每週監測腫瘤生長，一旦可觸知腫瘤時即開始測量腫瘤。在第36天，將平均腫瘤體積為144立方毫米之小鼠隨機分成4組，每組9隻。為動物注射對照抗體、FZD8-Fc(15毫克/公斤)、吉西他濱(2毫克/公斤)或FZD8-Fc與吉西他濱之組合。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc和吉西他濱，每週一次。每週測量腫瘤兩次，並依此處之描述測定腫瘤體積。
如第13A圖所示，與對照組相比較，以FZD8-Fc治療使腫瘤生長減少66%(p<0.00 1)。此外，與以任一單獨作用劑治療相比較，以FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療時腫瘤生長減少較多(相對於吉西他濱，p=0.001)。因此，FZD8-Fc作為單一作用劑或與吉西他濱組合時可在PN21胰臟腫瘤模型中顯示出抗腫瘤生長活性。
藉由限數稀釋檢測來分析經FZD8-Fc治療之PN21腫瘤。如上述實例3中所述，使用限數稀釋檢測來評估以單獨之FZD8-Fc或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療時對PN21胰臟腫瘤模型中之實體瘤腫瘤癌幹細胞的效果。
在研究結束時收成來自上述PN21異種移植研究之對照組和經治療之腫瘤。處理腫瘤並將其分解成單一細胞。將來自各治療組之5個腫瘤的單細胞懸浮液匯集，然後將匯集樣本在冰上與選擇性結合老鼠細胞之抗體(α-老鼠CD45-生物素1:200稀釋液及大鼠α-老鼠H2Kd-生物素1:100稀釋液，加州聖地牙哥，BioLegend)一起培育30分鐘，再添加經抗生蛋白鏈菌素標示之磁珠(加州，卡爾斯巴德，Invitrogen公司)。藉由磁鐵之協助去除老鼠細胞。收成、計算懸浮液中之人類細胞並對細胞表面標記進行染色，將在FACS緩衝液中之合適的細胞劑量(30、90和270個細胞)與Matrigel以1:1混合並經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中(每一治療組每一劑量10隻小鼠)。令腫瘤生長4個月。
在需要之時間點，在注射經治療之腫瘤細胞的所有組中測定具有可偵測之腫瘤的小鼠百分比，並與對照組中具有可偵測之腫瘤的小鼠百分相比較。例如：測定在經注射125個以對照抗體治療之腫瘤細胞的小鼠中具有可偵測之腫瘤的小鼠數目並將此數目與已注射125個以FZD8-Fc治療之腫瘤細胞的小鼠中具有可偵測之腫瘤的小鼠數目相比較相比較。
在注射細胞後第72天，測定各組中之腫瘤侵染率並使用L-CalcTM軟體(StemCell技術公司；www.stemcell.com)計算癌幹細胞之發生頻率。如第13B圖所示，與以對照抗體治療相比較，以FZD8-Fc治療可降低癌幹細胞之發生頻率至1:976，約降低4倍。相反地，以吉西他濱治療使癌幹細胞之發生頻率略為增加。明顯地，與以對照抗體治療相比較，以FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療可將癌幹細胞之發生頻率降低至1:5472，幾乎降低25倍。令人驚訝地，與單獨以FZD8-Fc治療相比較，以FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療時癌幹細胞之發生頻率降低之程度高出約5.5倍，雖然事實上吉西他濱顯示出實際上增加癌幹細胞二發生頻率。
實例9
以FZD8-Fc增加PN21腫瘤之細胞分化。亦在OMP-PN21胰臟腫瘤異種移植模型中評估FZD8-Fc之細胞分化能力。收成來自實例8中所描述之研究的PN21腫瘤並將其在福馬林中固定，包埋在石蠟中並切成4微米厚之切片。脫蠟及水化後，將腫瘤切片在Tris緩衝液(pH 9.5)中進行抗原擷取流程。將切片與過氧化氫(密蘇里州聖路易斯，Sigma-Aldrich公司)一起培育10分鐘以阻斷內源性過氧化物酶。將在阻斷緩衝液(在PBS中，3%NHS、1%BSA、0.1%吐溫20)中稀釋200倍之抗Ki67抗體(選殖株MIB-1，Dako，加州卡平特里亞)添加到各切片中並培育1小時。在PBST中輕洗玻片3次，每次5分鐘。將與HRP(ImmPRESSTM抗-老鼠，加州柏寧頓Vector Laboratories公司)共軛結合之抗老鼠二級抗體加至玻片上並培育30分鐘。以PBST清洗多次後，加入Vector Nova Red受質(加州柏寧頓，Vector Laboratories公司)以定位Ki67抗原。在室溫下，以醋酸水溶液處理切片5分鐘。然後，以在3%醋酸水溶液中之1%阿爾新藍處理切片30分鐘，再以水洗淨。將切片在中性快速紅中進行複染色、脫水及固定。使用此方法，在組織樣本中的涎黏蛋白染上藍色，且背景出現粉紅色或紅色。
與以對照抗體治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc治療PN21腫瘤使表現涎黏蛋白的細胞增加(第14圖，深灰色染色)。與以對照抗體或單獨之吉西他濱治療之腫瘤相比較，以FZD8-Fc或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療PN21腫瘤使表現涎黏蛋白的細胞增加(第15圖)。Ki67的表現指出以FZD8-Fc或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療PN21腫瘤亦使細胞增殖減少。因此，以FZD8-Fc(單獨或與吉西他濱組合)治療PN21腫瘤可減少細胞增殖並增加表現黏蛋白之分化細胞之發生頻率。
實例10
FZD8-Fc變異體之製造方法
FZD8-Fc變異體之製造方法。在DNA2.0(加州，Menlo Park)製造FZD8-Fc的變異體。DNA2.0合成並組合短單股寡核苷酸以製造不同之FZD8-Fc變異蛋白，54F05、54F08、54F09、54F12、54F13、54F14、54F15、54F16、54F17、54F18、54F19、54F20、54F21和54F22。接著，將組合好之寡核苷酸選殖並驗證序列。
實例11
藉由FZD8-Fc變異體抑制Wnt傳信
使用螢光素酶報告基因檢測在玻管內測定FZD8-Fc變異體阻斷或抑制Wnt傳信途徑活化的能力。將STF293細胞在輔以抗生素和10%胎牛血清的DMEM中培養。以含有七份TCF轉錄反應要素複本(其連接至螢火蟲螢光素酶報告基因之啓動子上游)的報告基因載體穩定轉染STF293。此構造物測量典型Wnt傳信途徑之活性。將這些細胞以每槽10,000細胞加入培養盤中。經過隔夜培育後，將FZD8-Fc變異體或對照老鼠JAG1-Fc與以Wnt3A調整之培養基一起加入。該FZD8-Fc變異體及JAG1-Fc之使用濃度為20、4、0.8、0.16、0.03、0.006、0.0012、及0.0003微克/毫升。將這些細胞培養在從穩定表現Wnt3a之L細胞製備的25%Wnt3A調節培養基中。培養一整夜(約18小時)後，使用Steady-Glo螢光素酶檢測試劑盒(威斯康辛州麥迪遜市，Promega公司)測量螢光素酶之水準。
測定FZD8-Fc變異體之阻斷活性並以與各檢測中所運行之相同參考標準(設定為100%)比較的相對活性呈現於表3中。
實例12
FZD8-Fc變異體在大鼠中之藥物動力學
在兩週藥物動力學(PK)研究中評估數種FZD8-Fc變異體在大鼠中之藥物動力學。評估之FZD8-Fc變異體為54F03、54F09、54F12、54F13、54F15和54F16。經由尾靜脈投予各組中5隻雄性Sprague Dawley大鼠10毫克/公斤之FZD8-Fc變異體，追踪兩週並在1、24、48、72、96、168、240和336小時之時間點採集樣本。在各時間點收集1毫升血液至鉀-EDTA管中並離心。收集血漿上清液並冷凍之，直至分析樣本。
定量各時間點之血漿中所存在之FZD8-Fc變異蛋白的水準並計算各FZD8-Fc變異體之半衰期。FZD8-Fc變異體之半衰期顯示於表4中。
實例13
FZD8-Fc變異體在食蟹猴中之藥物動力學
將4隻青年期/成年期雄性未曾經過處置之食蟹猴隨機分為兩組，每組二隻並經由靜脈注射(IV)投予劑量為30毫克/公斤之FZD8-Fc變異體54F16或FZD8-Fc變異體54F15的大丸藥。每天觀察動物之死亡率以及痛苦和和不愉快之徵兆兩次(上午和下午)。每天在籠邊觀察一般健康和外觀一次。在給藥當天，於給藥後1和4小時觀察每隻動物之死亡率以及痛苦和和不愉快之徵兆。記錄在整個研究持續時間中注意到之任何不尋常的觀察。在給藥當天及採血結束時測量體重。在給藥前及給藥後1、6、12、24、48、72、96、168、240和336小時經由注射器和針頭自股靜脈收集血液(約0.5毫升)，並將其轉移入含有EDTA K3抗凝劑之管中，以供進行PK分析。此外，在給藥前及給藥後336小時經由注射器和針頭自股靜脈收集血液(約0.5毫升)，並將其轉移入不含抗凝劑之管中，以供進行抗藥物抗體(ADA)之分析。收集血漿上清液並冷凍之，直到分析樣本。進行HTRF(均相時間分辨螢光)免疫分析以測定動物血漿樣本中之FZD8-Fc濃度以供PK分析。使用大丸藥1V投藥模型，以PhoenixTM WinNonlin 6.0版，藉由非房室分析(NCA)來分析血漿中之FZD-Fc濃度對時間之變化。
定量各時間點之血漿中所存在的FZD8-Fc變異體水準(第16圖)並計算FZD8-Fc變異體54F15和54F16之半衰期。如表5中所示，據估計，在30毫克/公斤之劑量下，FZD8-Fc變異體54F15之半衰期為102小時，而FZD8-Fc變異體54F16在30毫克/公斤之劑量下，半衰期估計為137小時。
實例14
藉由FZD8-Fc變異體抑制體內結腸腫瘤生長
將分離之C28結腸腫瘤細胞(10,000個)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。令腫瘤生長28天直到腫瘤達到平均體積為145立方毫米。將小鼠隨機分配(n=9隻小鼠/組)並以劑量為15毫克/公斤之FZD8-Fc變異體或對照抗體治療之，每週二次。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc變異體及對照抗體。監測腫瘤生長並在指定的時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。數據以平均值±S.E.M.表示。
變異體54F12和54F13對腫瘤生長無明顯影響，腫瘤體積大致上與以對照抗體治療之小鼠中的腫瘤相同。相反地，如第17圖所示，與以對照抗體治療者相比較，以變異體54F03、54F09、54F15及54F16治療可使腫瘤生長減少約56%、70%、64%和70%(分別)。因此，FZD8-Fc變異體之抗腫瘤生長活性似乎受到FZD8部分與Fc部分間之交界處的胺基酸序列影響。此外，由於在此模型中，為IgG2融合蛋白之二種變異體(54F12和54F13)並未抑制腫瘤生長，抗腫瘤生長活性似乎受Fc區之來源影響。
實例15
藉由FZD8-Fc變異體抑制體內胰臟腫瘤生長
將分離之PN4胰臟腫瘤細胞(10,000個細胞)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。令腫瘤生長36天直到腫瘤達到平均體積為112立方毫米。將小鼠隨機分配(n=10隻小鼠/組)並以劑量為15毫克/公斤之FZD8-Fc變異體或對照抗體治療之，每週二次。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc變異體及對照抗體。監測腫瘤生長並在指定的時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。數據以平均值±S.E.M.表示。
與以對照抗體治療之小鼠體內的腫瘤相比較，變異體54F12和54F13降低腫瘤生長少於20%。與以對照抗體治療相比較，以FZD8-Fc變異體54F03、54F09、54F15及54F16治療時可降低腫瘤生長約20%至60%。如第18圖所示，變異體54F09和54F16降低腫瘤生長的程度分別為最大量45%(p<0.00 1)和60%(p<0.001)。因此，FZD8-Fc變異體之抗腫瘤生長活性似乎受到FZD8部分與Fc部分間之交界處的胺基酸序列影響。如實例14中所知，由於在此模型中，為IgG2融合蛋白之二種變異體(54F12和54F13)之抗腫瘤生長活性較為IgG1融合蛋白之FZD8-Fc變異體為弱，抗腫瘤生長活性似乎受Fc區之來源影響。
收成來自上述帶有腫瘤之小鼠的胰臟腫瘤細胞並將其切碎成約1立方毫米片段，再在37℃/5%CO2下，以每10毫升之300微克/毫升膠原酶及200 U/毫升脫氧核糖核酸酶I中加入1克腫瘤片段之比例進行酶解2小時並藉由10毫升移液管間歇混合，以分散細胞。加入等體積之FACS緩衝液(1×漢克氏(Hanks)緩衝之鹽溶液(HBSS)、2%經熱滅活之胎牛血清(FCS)及2mM HEPES pH7.4)以停止分解。將細胞通過40微米尼龍過濾器過濾並經由在150×g離心5分鐘收集之。將紅血球在冰上於含有氯化銨之低張緩衝液中溶解2分鐘，並以過量FACS緩衝液再次清洗細胞，將細胞以1x107細胞/毫升之濃度再懸浮於FACS緩衝液中。
以5微克/毫升生物素化之抗老鼠H-2Kd(選殖株SFI-1.1，加州聖地牙哥，Biolegend)、2.5微克/毫升生物素化之抗小鼠CD45(30-F11，Biolegend)及抗生蛋白鏈菌素-PerCP-Cy5.5(加州聖地牙哥，eBioscience)(1:200稀釋)為新鮮製備之單細胞懸浮液染色20分鐘。以10倍體積之FACS緩衝液清洗兩次以去除未結合之抗體。為了分析人類細胞表面標記，以1:50稀釋之抗-ESA-FITC(加州Auburn，Miltenyi生物技術公司)、1:100稀釋之抗人CD44-PE-Cy7(加州聖地牙哥，eBioscience)及1:5稀釋之抗人CD201-PE(BD Bioscience)為腫瘤單細胞懸浮液染色。清洗細胞，將其再懸浮於含有2.5微克/毫升之4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的FACS緩衝液中。使用以單螢光色染色之細胞進行儀器校正。在細胞分選期間排除任何剩餘之老鼠細胞(H-2Kd和CD45為陽性)和死細胞(DAPI陽性)。使用雙黏體辨別出入限制(doublet discrimination gating)來排除細胞雙黏體和團塊。
如第19圖所示，與以對照抗體治療之小鼠相比較，以FZD8-Fc變異體54F03和54F16治療攜帶腫瘤的小鼠可降低CD44hi細胞之百分比。雖然CD201+CD44+細胞之百分比小，與以對照抗體治療之小鼠相比較，以FZD8-Fc變異體54F03和54F16治療攜帶腫瘤的小鼠可降低CD201+CD44+細胞之百分比。CD44顯示出為致瘤細胞之標記(如：癌幹細胞)。此外，於一些體系中，為CD44hiCD201+之細胞被發現較CD44hiCD201-細胞更具致瘤性。因此，重要的是，FZD8-Fc變異體可降低CD44hi與CD44hiCD201+二種細胞群之百分比，從而降低在經治療之小鼠中的致瘤細胞的百分比或數目。
實例16
N端之特性描述
FZD8蛋白中之正確的信號序列裂解位點預測係介於胺基酸25(丙胺酸)與胺基酸26(丙胺酸)之間；此位點之裂解遺留下ASA之N端。使用質譜分析並與在預測位點裂解之FZD8-Fc蛋白的理論質量相比較以測定FZD8-Fc蛋白之質量。
依上述，在DNA2.0(加州Menlo Park)製造帶有經改質之信號序列的其他FZD8-Fc變異體。DNA2.0合成並組合短單股寡核苷酸以製造FZD8-Fc變異蛋白，54F23至54F35。接著，選殖該組合之寡核苷酸並驗證序列。
使用QIAGEN maxi-prep試劑盒，依照製造商之議訂計劃製備各FZD8-Fc變異體之質體DNA。使用FreeStyleTMMAX試劑(生命技術)和293FS細胞表現各變異體。令細胞生長至對數期並稀釋成1x106細胞/毫升。在各反應方面，將315微克之質體DNA在5毫升之OptiMEM Pro中稀釋。在不同試管中，將315微升之FreeStyleTMMAX試劑在5毫升OptiMEM Pro中稀釋。將該稀釋之FreeStyleTMMAX試劑一滴滴地加入DNA中，在室溫下培育15分鐘以將質粒DNA與FreeStyleTMMAX試劑複合。然後，將DNA-試劑複合物加入250毫升之293FS細胞中。令表現反應物生長7-10天，此時，經由離心和過濾來收成反應物。採用5毫升HiTrap MAbSelect SURE柱，藉由親和純化法純化各FZD8-Fc變異體。簡單地說，將收成之培養基通過已以結合緩衝液平衡之管柱。以結合緩衝液清洗管柱以去除未結合之物質，然後，以洗提緩衝液洗提FZD8-Fc蛋白。然後，將洗提之樣本透析入適合用於質譜分析之緩衝液中。
在37℃下，以三(2-羧乙基)膦(TCEP)還原約250微克之各FZD8-Fc樣本30分鐘以分開抗體之重鏈和輕鏈。然後，在37℃下，以碘乙醯胺處理還原之樣本30分鐘，以將其烷基化。將樣本通過NAP-5柱(GE Health Care)以將緩衝液改為10mM Tris-HCl(pH7.4)。改變緩衝液之後，以内切葡聚糖酶PNGaseF進行去糖基化。將樣本在37℃下，以1:200之比例(酶：樣本)培育一整夜。加入酸以終止反應。將該經還原、烷基化及去糖基化之FZD8-Fc樣本裝填入小瓶中以使用Waters UPLCTM及電噴霧-QToF質譜儀進行液態色層分析-質譜分析(LC/MS)。使用三氟醋酸銫離子串，以Waters LockSprayTM雙電噴霧離子源進行各樣本分析之質量校準。
關於N端序列，如第20A圖所示，以異質混合物之形式製造帶有與天然序列相同之信號序列的FZD8-Fc蛋白(54F16)。存在於樣本中之蛋白質的質量比例等於在胺基酸25和26之間裂解，帶有ASA之N端序列的蛋白質(波峰在41704.0)。然而，超過50%之蛋白質係以不同質量之形式(波峰在41918.2)存在。此波峰最可能代表在胺基酸22和23之間裂解的蛋白質；在此位點裂解遺留具AAAASA之N端序列(SEQ ID NO：76)。
產生具有信號序列SEQ ID NO：68至SEQ ID NO：74之FZD8-Fc變異體，從細胞培養中純化並依上述藉由質譜分析之。據觀察，具有信號序列SEQ ID NO：70至SEQ ID NO：74之變異體產生幾乎完全同質之蛋白質樣本(第20B-20E圖顯示數個代表性結果)。帶有信號序列SEQ ID NO：71之包含SEQ ID NO：53的FZD8-Fc變異體54F26主要(超過95%)以在胺基酸25和26之間裂解，帶有ASA之N端序列的蛋白質(波峰在41930.1)形式存在(第20B圖)。類似之結果亦見於包含SEQ ID NO：53及信號序列SEQ ID NO：72之變異體(54F28，第20C圖)、包含SEQ ID NO：53及信號序列SEQ ID NO：73之變異體(54F30，第20D圖)及包含SEQ ID NO：53及信號序列SEQ ID NO：74之變異體(54F32，第20E圖)。類似之結果可在從瞬時及穩定轉染製造之蛋白質中觀察到。
實例17
藉由FZD8-Fc變異體抑制體內結腸腫瘤生長
將分離之C28結腸腫瘤細胞(10,000個細胞)經由皮下注射入6-8週齡之雄性NOD/SCID小鼠中。令腫瘤生長56天直到腫瘤達到平均體積為175立方毫米。將小鼠隨機分配(n=10隻小鼠/組)並以劑量為15毫克/公斤之FZD8-Fc構造物54F03、54F23、54F26或對照抗體治療之，每週二次。經由注射入腹膜內腔來投服FZD8-Fc變異體及對照抗體。監測腫瘤生長並在指定的時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。數據以平均值±S.E.M.表示。
FZD8-Fc變異體54F23和54F26主要係以帶有胺基酸ASA之N端的同質蛋白質混合物之形式產生，而54F03係以帶有胺基酸ASA及AAAASA之N端的異質性蛋白質混合物的形式產生。如圖21所示，治療三週後，與以對照抗體治療組相比較，以FZD8-Fc變異體54F03、54F23和54F26治療可分別降低腫瘤生長48%、57%和52%。
此處所引用之所有刊物、專利、專利申請案、網站及登記編號/數據庫序列(包括多核苷酸及多肽序列)之全部內容均納為此文中所有目的之參考，其程度猶如各出版物、專利、專利申請案、網站或登記編號/數據庫序列被具體及個別指明納為參考。
第1圖.　大鼠中之FZD8-Fc(54F03)的藥物動力學。投予單劑量(10毫克/公斤)之FZD8-Fc後評估FZD8-Fc之藥物動力學性質。在投藥後1、24、48、72、96、168、240和336小時測定FZD8-Fc的血清濃度。
第2圖.藉由FZD8-Fc(54F03)治療來抑制PN4胰臟腫瘤增長。經由皮下途徑將PN4胰臟腫瘤細胞注射入NOD/SCID小鼠中。以FZD8-Fc(-▲-)、吉西他濱(-■-)、FZD8-Fc與吉西他濱之組合(-△-)或對照抗體(-●-)治療小鼠。顯示之數據為治療後幾天之腫瘤體積(立方毫米)。
第3圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN4腫瘤中之CD44hi細胞群減少。將以對照抗體、FZD8-Fc、吉西他濱或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療之腫瘤細胞表面染色以檢測ESA和CD44。在各治療組方面，在染色前匯集來自五個腫瘤之單一細胞懸浮液。
第4圖.經FZD8-Fc(54F03)治療之PN4胰臟腫瘤的體內限數稀釋分析。
第5圖.以FZD8-Fc(54F03)治療之PN4胰臟腫瘤中細胞分化增加。以阿爾新藍(alcian blue)將經對照抗體、FZD8-Fc、吉西他濱或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療之PN4腫瘤的石蠟切片染色，以檢測表現黏蛋白之細胞。
第6圖.以FZD8-Fc(54F03)治療之PN8胰臟腫瘤中細胞分化增加。以阿爾新藍將經對照抗體、FZD8-Fc、吉西他濱或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療之PN8腫瘤的石蠟切片染色，以檢測表現黏蛋白之細胞。
第7圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN13胰臟腫瘤中細胞分化增加且增殖減少。以阿爾新藍將經對照抗體或FZD8-Fc治療之PN13腫瘤的石蠟切片染色，以檢測表現黏蛋白之細胞。此外，將切片染色以檢測Ki67(活躍增殖細胞之標記)。
第8圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN13胰臟腫瘤中Muc16染色增加。將經對照抗體或FZD8-Fc治療之PN13腫瘤的石蠟切片染色以檢測Muc16蛋白。
第9圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN13胰臟腫瘤中CK20染色增加。將經對照抗體或FZD8-Fc治療之PN13腫瘤的石蠟切片染色，以檢測CK20蛋白。
第10圖.以FZD8-Fc(54F03)與太平洋紫杉醇之組合治療後PE13乳房腫瘤生長受抑制。將PE13乳房腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以對照抗體(-●-)、FZD8-Fc(-□-)、太平洋紫杉醇(-▲-)或FZD8-Fc與太平洋紫杉醇之組合(-○-)治療小鼠。數據顯示治療後幾天之腫瘤體積(立方毫米)。
第11圖. FZD8-Fc(54F03)以劑量依賴方式抑制C28結腸腫瘤生長。將C28結腸腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以FZD8-Fc，1.5毫克/公斤，每週兩次(-▲-)，5毫克/公斤，每週一次(-▼-)，5毫克/公斤，每週兩次(-○-)，15毫克/公斤，每週一次(-□-)或15毫克/公斤，每週兩次(-△-)或對照抗體(-■-)治療小鼠。數據顯示治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)(第11A圖)。以FZD8-Fc與伊立替康(irinotecan)之組合抑制結腸腫瘤生長。以FZD8-Fc(-▲-)、依立替康(-▼-)、FZD8-Fc與依立替康之組合(-●-)或對照抗體(-■-)治療小鼠。數據顯示治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)(第11B圖)。
第12圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後C28腫瘤中CK20染色增加。將經對照抗體或FZD8-Fc治療之C28腫瘤的石蠟切片染色，以檢測CK20蛋白。
第13圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN21胰臟腫瘤生長受抑制且癌幹細胞發生頻率降低。將PN21胰臟腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以FZD8-Fc(-▼-)、吉西他濱(-▲-)、FZD8-Fc與吉西他濱之組合(-■-)或對照抗體(-●-)治療小鼠。數據顯示治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)(第13A圖)。經FZD8-Fc治療之PN21胰臟腫瘤的體內限數稀釋分析(第13B圖)。
第14圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN21胰臟腫瘤中細胞分化增加。以阿爾新藍將經對照抗體或FZD8-Fc治療之PN21腫瘤的石蠟切片染色，以檢測黏蛋白。
第15圖.以FZD8-Fc(54F03)治療後PN21胰臟腫瘤中細胞分化增加且增殖減少。以阿爾新藍將經對照抗體、FZD8-Fc、吉西他濱或FZD8-Fc與吉西他濱之組合治療之PN21腫瘤的石蠟切片染色，以檢測黏蛋白。此外，將切片染色以檢測Ki67(活躍增殖細胞之標記)。
第16圖.　猴子體內FZD8-Fc變異體之藥物動力學。投服單一劑量(30毫克/公斤)之FZD8-Fc變異體54F15和54F16後評估該變異體之藥物動力學性質。在投藥後之1、6、12、24、48、72、96、168、240和336小時測定54F15(-○-)和54F16(-◆-)之血清濃度。
第17圖.　以FZD8-Fc變異體治療後C28結腸腫瘤生長之抑制情形。將C28結腸腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以對照抗體(-X-)、54F03(-□-)、54F09(-▲-)、54F12(-▼-)、54F13(-◆-)、54F15(-○-)或54F16(-△-)治療小鼠。顯示之數據為治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)。
第18圖.　以FZD8-Fc變異體治療後PN4胰臟腫瘤生長受抑制。將PN4胰臟腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以對照抗體(-●-)、54F03(-■-)、54F09(-▼-)、54F12(-○-)、54F13(-▲-)、54F15(-□-)或54F16(-◆-)治療小鼠。顯示之數據為治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)。
第19圖.　以FZD8-Fc變異體54F03和54F16治療後PN4腫瘤中CD44hi和CD44+CD201+細胞減少。將以對照抗體、FZD8-Fc變異體54F03或變異體54F16治療之腫瘤細胞表面染色以檢測ESA、CD44和CD201並藉由FACS分析。
第20圖. FZD8-Fc蛋白之N端特徵。藉由質譜儀分析FZD8-Fc變異體並顯示54F16(第20A圖)、54F26(第20B圖)、54F28(第20C圖)、54F30(第20D圖)以及54F32(第20E圖)之結果。
第21圖.　以FZD8-Fc變異體治療後C28結腸腫瘤生長之抑制情形。將C28結腸腫瘤細胞經由皮下注射入NOD/SCID小鼠中。以對照抗體(-■-)、54F03(-△-)、54F23(-▼-)或54F26(-○-)治療小鼠。顯示之數據為治療後數天之腫瘤體積(立方毫米)。
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<212>　PRT
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<223>　FZD8-Fc胺基酸序列變異體54F03(無預測之信號)
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<221>　MISC_FEATURE
<223>　介於該融合蛋白之FZD8序列與Fc序列之間的GRA連接子序列
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<221>　MISC_特性
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<400>　25
<210>　26
<211>　227
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD10 ECD
<400>　26
<210>　27
<211>　321
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD1 ECD
<400>　27
<210>　28
<211>　250
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD2 ECD
<400>　28
<210>　29
<211>　204
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD3 ECD
<400>　29
<210>　30
<211>　277
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD8 ECD
<400>　30
<210>　31
<211>　230
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人FZD9 ECD
<400>　31
<210>　32
<211>　151
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD1 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：27之胺基酸87-237
<400>　32
<210>　33
<211>　136
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD2 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：28之胺基酸24-159
<400>　33
<210>　34
<211>　121
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD3 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：29之胺基酸23-143
<400>　34
<210>　35
<211>　131
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD4 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：22之胺基酸40-170
<400>　35
<210>　36
<211>　131
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD5 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：23之胺基酸27-157
<400>　36
<210>　37
<211>　127
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD6 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：24之胺基酸19-146
<400>　37
<210>　38
<211>　138
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD7 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：25之胺基酸33-170
<400>　38
<210>　39
<211>　131
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD8 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：30之胺基酸28-158
<400>　39
<210>　40
<211>　137
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD9 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：31之胺基酸23-159
<400>　40
<210>　41
<211>　134
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　無預測之信號之人FZD10 Fri結構區胺基酸序列；SEQ ID NO：26之胺基酸21-154
<400>　41
<210>　42
<211>　230
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　人IgG1 Fc區
<400>　42
<210>　43
<211>　232
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　人IgG1 Fc區
<400>　43
<210>　44
<211>　224
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　人IgG2 Fc區
<400>　44
<210>　45
<211>　364
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F03；無信號；替代裂解
<400>　45
<210>　46
<211>　364
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F09
<400>　46
<210>　47
<211>　367
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F09
<400>　47
<210>　48
<211>　361
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F15
<400>　48
<210>　49
<211>　364
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F15
<400>　49
<210>　50
<211>　361
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F16,54F17,54F18,54F23,54F25,54F27,54F29,54F31,及54F34(無預測信號)
<400>　50
<210>　51
<211>　363
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F16
<400>　51
<210>　52
<211>　388
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F16(帶有信號)
<400>　52
<210>　53
<211>　363
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F19,54F20,54F24,54F26,54F28,54F30,54F32,54F34及54F35
<400>　53
<210>　54
<211>　366
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F19胺基酸序列(無預測之信號序列；替代裂解)
<400>　54
<210>　55
<211>　366
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F20(無預測之信號)；替代裂解
<400>　55
<210>　56
<211>　406
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人ROR1 ECD
<400>　56
<210>　57
<211>　403
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　帶有信號之人ROR2 ECD
<400>　57
<210>　58
<211>　127
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　h-ROR1最小Fri結構區
<400>　58
<210>　59
<211>　127
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　h-ROR2最小Fri結構區
<400>　59
<210>　60
<211>　8
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　連接子
<400>　60
<210>　61
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　連接子
<400>　61
<210>　62
<211>　6
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　連接子
<400>　62
<210>　63
<211>　6
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　連接子
<400>　63
<210>　64
<211>　8
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　連接子
<400>　64
<210>　65
<211>　360
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F34(無信號)
<400>　65
<210>　66
<211>　358
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F33(無信號)
<400>　66
<210>　67
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　67
<210>　68
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　68
<210>　69
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　69
<210>　70
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　70
<210>　71
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　71
<210>　72
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　72
<210>　73
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　73
<210>　74
<211>　27
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　信號
<400>　74
<210>　75
<211>　390
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　FZD8-Fc變異體54F26(帶有信號)
<400>　75
<210>　76
<211>　6
<212>　PRT
<213>　人工合成序列
<220>
<223>　N端
<400>　76

Claims (18)

  1. 一種Wnt結合劑，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：53。
  2. 一種多肽，其包含(a)如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑和(b)選自下述之信號序列：SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74。
  3. 如申請專利範圍第2項之多肽，其包含信號序列SEQ ID NO：72。
  4. 一種細胞，其產製如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑。
  5. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第2或3項之多肽。
  6. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑，其中該Wnt結合劑分子之至少約80%具有丙胺酸(Ala)-絲胺酸(Ser)-丙胺酸(Ala)(ASA)之N端胺基酸序列。
  7. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑和藥學上可接受之載體。
  8. 一種多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑的多核苷酸。
  9. 一種多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第2或3項之多肽的多核苷酸。
  10. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第8或9項之 多核苷酸。
  11. 一種如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑於製造藥物之用途，該藥物係用於治療癌症。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該治療包含施予第二治療劑。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該第二治療劑係化學治療劑。
  14. 如申請專利範圍第11至13項中任一項之用途，其中該癌症係選自：大腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、肝細胞癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤及頭頸癌。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌症係胰臟癌。
  16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌症係卵巢癌。
  17. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌症係肝細胞癌。
  18. 一種產製如申請專利範圍第1項之Wnt結合劑之方法，該方法包含於細胞內表現多肽，該多肽包含SEQ ID NO：53和選自下述之信號序列：SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74，其中藉由該細胞產製之Wnt結合劑分子的至少約80%具有丙胺酸(Ala)-絲胺酸(Ser)-丙胺酸 (Ala)(ASA)之N端胺基酸序列。
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