JP2000514919A

JP2000514919A - 少くとも三分枝の連鎖オリゴ糖を持つ癌特異的抗原の検定による癌の検出

Info

Publication number: JP2000514919A
Application number: JP10504169A
Authority: JP
Inventors: ロビンズ，フィリップス，ダブリュ．; プラカッシュ，サダーナ
Original assignee: ミレニアムファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2000-11-07
Also published as: EP0912890A1; US6203999B1; EP0912890A4; AU3312397A; US5902725A; CA2259501A1; WO1998000711A1; AU720802B2

Abstract

(57)【要約】前立腺の癌を検定する一つの方法であって、少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原に関してヒトから誘導される試料を検定することを含む前立腺の癌を検定する方法。この検定は少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合するが一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない結合分子を使用する。このような結合分子はＰＨＡ−Ｌなどのようなレクチンあるいは少くとも三分枝であるオリゴ糖に対する抗体である。

Description

【発明の詳細な説明】少くとも三分枝の連鎖オリゴ糖を持つ癌特異的抗原の検定による癌の検出発明の分野この発明は癌免疫検定の分野に関する。特異的には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の検出のための免疫検定法が提供される。この発明の免疫検定は正常前立腺特異的抗原と異常前立腺特異的抗原、すなわち前立腺の癌の存在に関係のあるＰＳＡを識別する。発明の背景前立腺癌のマーカーとしてＰＳＡが広く受け入れ使用されているにも拘らず、この分子はこれまで完全に特徴付けられていなかった。過去の研究はしかしアミノ酸およびｃＤＮＡ配列技術を用いてＰＳＡが分子のペプチド成分として２６，０７９ダルトンの分子量を持ち２３７個のアミノ酸を含むことを確証した。イオン噴霧質量分光測定（ＩＳＭＳ）により検出された優勢なＰＳＡ分子種は２８，４３０個の相対分子質量にあり、それはＰＳＡが８．３％の炭水化物の全重量パーセンテージに対し、２，３５１の分子量を持つ炭水化物残基を含むことを示した（ベレンジャー、Ａ．、他、前立腺、２７巻：１８７−１９７ページ（１９９５年））。ＰＳＡはカリクレイン状セリンタンパク質分解酵素であり、それは良性および悪性を問わずすべての型の前立腺組織の上皮細胞により独占的に生産される。生理学的には、それは精液内に高い濃度で存在し、精液凝塊の原因となる高分子量のタンパク質をより小さなポリペプチドに切断するように機能する（エスターリング、Ｊ．Ｅ．、細胞生化学ジャーナル、補遺、１６Ｈ：３１−４３ページ（１９９２年））。前立腺特異的抗原はワン、Ｍ．Ｃ．、他、泌尿器科学調査、１７巻：１５９ページ（１９７９年）により初めて記載された。それは前立腺上皮の分泌であり、また前立腺癌細胞により生産される。ＰＳＡはタンパク質分解酵素活性を持つ糖タンパク質モノマーとして特徴付けられた。もっと最近では抗原のアミノ酸配列が報告され（ワット、Ｗ．Ｋ．、他、全米科学アカデミー紀要、８３巻：３１６６ページ（１９８６年））、またＰＳＡの遺伝子がクローンされた（ランドウォール、Ａ．、生化学生物物理学研究通信、１６１巻、１１５１ページ（１９８９年））。さまざまな炭水化物マーカーがヒト癌の臨床特性における炭水化物情報の重要性を明らかにするために使用されてきた。その結果として、一次腫瘍の炭水化物プロフィルが相互に関連していない腫瘍の悪性度分類、転移潜在能および予後と相関してきた。腫瘍形成は細胞面炭水化物構造における変化と通常関連しており、また腫瘍関連炭水化物マーカーはヒト癌の診断および追跡検査で利用されてきた（箱森、Ｓ．、先端癌研究、５２巻：２５７−３３１ページ（１９８９））。最近では、腫瘍細胞面の炭水化物構造が腫瘍細胞の転移潜在能と関連することが示されている。炭水化物信号の転移潜在能との関連はまず実験システムで明らかにされた。特に顕著なものはアスパラギン連鎖オリゴ糖のβ１→６分岐であり、それは腫瘍細胞数を増加した（山下、Ｋ．、他、生物学化学ジャーナル、２５９巻：１０８３４−１０８４０ページ（１９８４年）、およびネズミ黒色腫および線維肉腫の転移において（デニス、Ｊ．Ｗ．、他、サイエンス、２３６巻：５８２−５８５ページ（１９８７年））。Ｎ−連鎖糖鎖形成は前駆体オリゴ糖の発生期あるいは新しく合成されたタンパク質の受容されるアスパラギン残基への移転に伴いすべての高次の真核生物細胞におけるのと同じように哺乳類細胞において開始される。続くこのオリゴ糖の修飾変更は成熟糖タンパク質に見出される極端に相違するＮ −連鎖オリゴ糖を生成する。ゴルジ酵素への立体接近可能性は与えられたＮ−連鎖多糖の処理がオリゴマンノース段階で停止するかもしくは更に進行するかどうかを決定するように見える（シーア、Ｐ．、他、生物学化学ジャーナル、２５８巻：２５５５−２５６１ページ（１９８３年））。しかし種々様々な二分枝、三分枝および四分枝複合多糖が合成される処理の後期の段階の調節についてはほんの僅かしか理解されていない。この調節はとりわけ興味深いものがある。というのはそれは多くの分化細胞で変更され（フレージー、Ｔ．、ネイチャー、３１４巻：５３−５７ページ（１９８５年））あるいは腫瘍形成物に形質転換された細胞で変更され（ウォーレン、Ｌ．、他、生化学生物物理学公式記録、５１６巻：９７−１２７ページ（１９７８年））、Ｎ−連鎖オリゴ糖組成物への移行に帰着する。これは生理学的に重要な結果を持つものと見られる。というのは変更されたタンパク質糖鎖形成は癒着、転移および免疫認識などの経過に影響を与え得るからである。（ハッバード、Ｓ．Ｃ．、生物化学ジャーナル、２６２巻、（３４）：１６４０３−１６４１１ページ（１９８７年））。提案されたＰＳＡの炭水化物構造は２個の分枝それぞれの末端にシアル酸基を持つＮ−アセチルラクトースアミン型の二分枝Ｎ−連鎖オリゴ糖である。ＰＳＡ分子の約７０％はコア・キトビオース成分にフコース基を含む。ＰＳＡは唯一のＮ−連鎖を含み、これはアスパラギン⁴⁵に連鎖する（ワット、他、全米科学アカデミー紀要、８３巻、３１６６−３１７０ページ（１９８６年）：シャラー、他、ヨーロッパ生化学ジャーナル、１７０巻、１１１−１２０ページ（１９８７年）；リーグマン、他、生化学生物物理学研究通信、１５５巻、１８１−１８８ページ（１９８８年）；ファン・ハルビーク、分子生物学の方法、ジョーンズ、他、編、トトワ、ニュージャージー、ハマナ・プレス、１１５−１４８ページ（１９９３年）；ランドウォール、他、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、２１４巻、３１７− ３２２ページ（１９８７年）。ファン・ハルビーク、他はこのタンパク質が構造がその炭水化物組成物で異なるいくつかのイソ型よりなることを示唆している。提案されたＰＳＡの炭水化物構造は、タンパク質内の唯一の糖鎖形成部位が占められていることを確認する。この糖鎖形成部位はタンパク質のアミノ酸配列に基づいて容易に確認することができる。すなわちＰＳＡの唯一の共通ＡＳＮ−Ｘ −ＳＥＲ／ＴＨＲ配列は残基４５−４６−４７（ＡＳＮ−ＬＹＳ−ＳＥＲ）で見出される（ベレンジャー、他）ＰＳＡの炭水化物側鎖の構造における完全な特徴付けはベレンジャー他により決定された。前立腺の癌は長い間予測し難い疾患であり、異なった型の処置結果を評価する際の健全な治療上の決定をきわめて困難にするものと見做されてきた。前立腺癌は潜在的致死性ヒト悪性疾患の中でも、癌として認識できる組織学的変化の高い有病率と臨床疾病でのずっと低い有病率との間に大きな相違があるという点でユニークなものである。前立腺の腺癌が潜伏および臨床形態で存在するという概念は疫学、病理学および臨床証拠で支持される。前立腺癌のこれらの相違する徴候が構成的および細胞学的特徴になるけれども、それらは病巣の量、悪性度分類および侵入力などのようなある種の病理的特徴の差異によりある程度までお互いを識別することができる。前立腺癌はアメリカの男性の間でもっとも広く行きわたった癌となり、肺癌だけがそれより多い死亡原因となっている（ボアリング、Ｃ．Ｃ．、癌統計、４１巻：１９−３６ページ（１９９１年））。年齢特異的死亡率は過去５０年にわたりゆっくり上昇しており、アメリカ黒人では白人で見出される割合のほぼ倍である（カーター、Ｈ．Ｂ．、前立腺、１６巻：３９−４８ページ（１９９０年））。前立腺癌は５５歳以上の男性のすべての死亡の３％近くの原因となっている（サイドマン、Ｈ．、他、合衆国で癌の偶発的に進化しあるいは死亡する確率、３５巻：３６−５６ページ（１９８５年））。前立腺癌の発生率が他のいずれの癌よりも年齢と共に急速に増加し、またアメリカ人男性の平均年齢が上昇しているために、前立腺癌の患者数はこれから１０年間で劇的に増加するものと推測される。前立腺癌を持つ男性の約３０％は診断時に遠くに転移していた（シュミット、Ｊ．Ｄ．、他、泌尿器学ジャーナル、１３６巻：４１６−４２１ページ（１９８６年））。ホルモン処置（アンドロゲン剥奪）に対する転移の印象的な症候性反応にも拘らず、これらの患者の生存率は暗い。生存の平均期間は３年未満である（アイヤー、Ｄ．Ｐ．、泌尿器病理学：前立腺、フィラデルフィア、ペンシルバニア、リー・アンド・フェビジャー、２４１−２６７ページ（１９７７年））。５年までにこれらの患者の７５％以上また１０年までに９０％以上が癌にかかってというよりも癌で死亡する（シルバーバーグ、Ｅ．、癌、６０巻：６９２−７１７ページ（１９８７年）（補遺））。前立腺癌についての問題は、前立腺癌の多くの形態が潜伏性であり、換言すればそのような形態は検出し難いということである。前立腺癌の臨床証拠を持たない５０歳以上の男性の約３０％は前立腺内に癌病巣を隠している（マクニール、Ｊ．Ｅ．、他、ザ・ランセット、１月号、１１巻：６０−６３ページ（１９８６年））。他の器官では見られない剖検での前立腺癌の著しく高い有病率はそれをもっとも一般的なヒトの悪性疾患にする（ドーム・Ｇ．、癌研究臨床腫瘍学ジャーナル、１０６巻：２１０−２１８ページ（１９８３年））。潜伏癌が悪性疾患発現に必要なすべてではなくいくつかの段階を通して進行するという前立腺癌の病因論における多段階経過という概念に対し強い支持がある（アッター、Ｈ．Ｂ．、他、泌尿器学ジャーナル、１４３巻：７４２−７４６ページ（１９９０年））。前立腺癌の初期検出および特徴付けのためのさまざまな技術が存在するが、問題をかかえていないものは一つもない。前立腺癌は初期症状が殆どない悪名高い沈黙の疾病である。膀胱出口閉塞と係る症状は５０歳以上の男性に一般に存在し、しばしば良性前立腺過形成（ＢＰＨ）であると認められる。指の直腸検査（ＤＲＥ）は伝統的に前立腺癌の検出にもっとも正確な検査であると考えられてきた。ＤＲＥはより感受性でより特異的であり、利用できるさまざまな実験室検査よりもより大きな効果を持つことを実証してきたが、しかし僅かではあるが実験室検査もまた今日臨床使用されている（グイナン、Ｐ．、他、ニューイングランド医学ジャーナル、３０３巻：４９９−５０３ページ、（１９８０年））。ＤＲＥは比較的遅れて癌を検出し、ＤＲＥにより推定される癌の大きさと存在する癌の実際の量との間には弱い相関があるに過ぎない。ＤＲＥのもっとも重大な制約は感受性の欠除（偽陰性の結果）である。例えば癌を示唆する触知可能な異常のない患者で良性前立腺肥大のため行われた経尿道切除の約１０乃至２０％が前立腺の偶発性癌を暴露する。ＤＲＥはスクリーニング研究で見出された２２例の癌の１２例のみを検出したが、一方経直腸超音波検査（ＴＲＵＳ）は２０例を発見した（リー、Ｆ．、他、Ｘ線撮影、１６８巻：３８９−３９４ページ（１９８８年））。かくして、ＤＲＥは相対的に鈍感で非特異的である。触診により検出される癌は比較的大きく、進行中の後期のものでももはや治療できず、またあるものは非常に小さく臨床的には重要でない癌である。前立腺癌を持つ患者は上昇した前立腺特異的抗原水準を有する。４．０乃至１０．０ｎｇ／ｍｌのPＳＡ水準を持つ男性の２６％で癌が検出された。血清ＰＳＡ水準は前立腺癌の量、臨床段階、および病理学段階と一般に相関することが示されてきたが、いずれか一定の量あるいは段階と関連する広い範囲のＰＳＡ値も存在する（ハドソン、Ｍ．Ａ．、泌尿器学ジャーナル、１４２巻：１０１１−１０１７ページ（１９８９年））。しかしＰＳＡは個々の患者にある癌の特性を予示しない。もしＰＳＡの水準が１０．０ｎｇ／ｍｌ以上であるなら、患者の５７％乃至９２％は局所進行性癌を持つであろう。従って一方でより特異的で、１０ｎｇ／ｍｌ以上のＰＳＡ水準の使用は初期検出の有効な技術を提供しない。初期検出のためのこの血清マーカーの使用には他の理論的制約がある。正常血清ＰＳＡ水準は癌の診断を排除しない。偽陰性結果はよくあり、前立腺癌でＸ線前立腺切除を処置された男性の１／３は正常血清水準を有する。偽陽性の結果もまた広く行きわたっており、というのはＰＳＡ水準はＢＰＨあるいは前立腺炎などのような普通の良性条件の男性でもしばしば上昇するからである。要約すると、ＰＳＡ水準は前立腺癌の早期検出に特に有用であり、とりわけＤＲＥあるいはＴＲＵＳと併用する場合には有用であることを証明している。しかしＰＳＡ水準検出は存在するものが癌でありＢＰＨあるいは前立腺炎ではないことを確実にするために、ＤＲＥあるいはＴＲＵＳと併用されねばならない。ＴＲＵＳの導入は前立腺の内科解剖学構造および病変を見るのに効果的な方法を医師に提供した。ＴＲＵＳは前立腺癌をいくつかの大きな系列に選別するために使用され、ＤＲＥと比べた時一致して検出を増加することが示されてきた。ＴＲＵＳは骨盤野のソノグラフをとることにより行われまた前立腺癌の初期検出でのＴＲＵＳのもっとも重要な用途は前立腺の指向性針生検のガイドとしてである（リー、Ｆ．、他、放射線医学、１７０巻：６０９−６１５ページ（１９８９年））。ＰＳＡ検査は前立腺癌の患者の転移あるいは持続性疾病の検出次いで手術あるいは医学治療に著しい価値を持つことができる（ラング、Ｐ．Ｈ．、他、泌尿器学、３３巻（６．補遺）：１３ページ（１９８９年）およびキリアン、Ｃ．Ｆ．、他、癌研究、４５巻：８８６ページ（１９８５年））。処置に続くＰＳＡの持続的上昇あるいは処置後基線ＰＳＡ水準の上昇は再発性あるいは残存疾病を示唆している（ブローワー、Ｍ．Ｋ．、他、泌尿器学、３３巻（５．補遺）：１１ページ（１９８９年））。ＰＳＡは前立腺特異的であるけれども、それは前立腺癌特異的ではない。その結果、良性前立腺過形成、前立腺炎および梗塞形成などの良性条件、並びに前立腺上皮内新形成がＰＳＡの血清水準上昇と関連することがあり得る（オスターリング、Ｊ．Ｅ．、細胞生化学ジャーナル、補遺、１６Ｈ：３１− ４３ページ（１９９２年））。ＰＳＡの血清水準の測定は前立腺癌および前立腺組織の良性発育不全の診断に広く使用される。この血清マーカーが価値のあるのはそれが対象となる組織からのみ誘導されるが、血清内のＰＳＡの増加水準が良性対悪性変化の完全に明白な診断を許さないためである。従って非侵入技術を通じて前立腺癌の正確な診断を得るための技術が必要となる。更に患者の生物学的試料から誘導されるＰＳＡの変更された形態の検出を経て前立腺癌を診断する明らかな必要性も存在する。この発明の一つの見地に従って、少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ抗原の存在と関連する癌、例えば前立腺癌を検定する方法が提供される。この方法は、一つの抗原、例えば少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原などのためヒトから誘導された試料を検定することを含む。ここで使用される「前立腺特異的抗原」あるいは「前立腺の特異的抗原」（ＰＳＡ）という用語は、殆ど独占的にヒト前立腺上皮細胞により発現される約２６，０７９ダルトンの分子量を持つ２３７残基タンパク質分解酵素あるいはその誘導体もしくは類似体を意味する。ここで使用される「分枝」という用語は、例えばＰＳＡのＡ_sp ⁴⁵などのアミノ酸残基に付加されたＮ−連鎖オリゴ糖の連鎖数を意味する。「分枝」の用語には二−、三−、および四−などの接頭辞が前につけられる。これらの接頭辞はオリゴ糖の分枝数を引用する。この発明に従って検出される前立腺癌は転移性前立腺癌および非転移性前立腺癌を含む。この発明の範囲はいずれか特殊な理論的類推に限定されるものではないが、二分枝オリゴ糖のみを持つ普通のＰＳＡとは異なり、前立腺癌からのＰＳＡが二分枝および三分枝オリゴ糖の混合物を持つということを出願人は予期せずに発見した。このような三分枝オリゴ糖はＡ_sp ⁴⁵などのＰＳＡのアミノ酸残基に連鎖するが、それは腫瘍形成形質転換と関連する。少くとも三分枝であり、ＰＳＡのアスパラギン４５などのアミノ酸残基にＮ− 連鎖しているオリゴ糖の存在を決定するために、前立腺特異的抗原が患者から誘導される生物学的試料から分離される。生物学的試料は必ずしもそれに限定されないが、血清、血漿、前立腺液、精液、尿、および骨髄液を含む。生物学的試料からのＰＳＡの分離に続き、少くとも三分枝であるＮ−連鎖オリゴ糖の存在が決定される。ＰＳＡの分離は従来の技術に習熟した人に公知である数多くの方法で行われる。サムブルック、他、分子クローニング・実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年を参照されたい。この開示はここでその全体が引用例として組み込まれている。例えば、ＰＳＡは硫酸アンモニウムあるいはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンあるいは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む方法により分離精製される。必要とあればタンパク質の形態形成を完成するために、タンパク質の折り重ね段階を使用することができる。最後に最終精製段階のために高性能液体クロマトグラフィーを使用することができる。この発明の望ましい実施例において、ＰＳＡは優先的に固体支持体と結合し、ＰＳＡのエピトープを認識する抗体の使用を通じて分離される。抗体は多クローン性あるいは単クローン性であり、望ましくは単クローン性である。結合ＰＳＡは次いで少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合する化合物あるいは結合分子と接触される。このような化合物は一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない。少くとも三分子であるオリゴ糖と結合するが一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない化合物あるいは結合分子の例は、必ずしもそれに限定されないが、赤インゲンマメ（学名Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）から得るレクチンＰＨＡ−Ｌ、および少くとも三分枝であるオリゴ糖に特異的に結合する抗休である。このような抗休は従来の技術で公知の手順で調製される。このようなレクチンもまたビオチンで標識されあるいは連珠アガロースで架橋されシグマ（社）から得ることができる。ＰＨＡ−Ｌはまたフー、他、分析生化学、１巻、５３−６３ページ（１９９２年１０月）に記載されている。少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合する結合分子は検出可能マーカーあるいは標識と接合される。このような検出可能マーカーあるいは標識の例は必ずしもそれに限定されないが、蛍光標識、放射性同位元素、例えばヨウ素、コバルトあるいはトリチウムの同位元素、スピン標識、化学発光材料、酵素、吸収染料、ビオチン、あるいは着色粒子を含む。結合ＰＳＡが標識結合分子と接触された後、遊離（未結合）結合分子は結合された結合分子から分離される。少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原の存在は次いで少くとも三分枝であるオリゴ糖に結合される結合分子の標識を検出することにより決定され、前記オリゴ糖は前立腺特異的抗原に連鎖する。そのような存在は従来の技術に習熟した人にとって公知の手段により決定され、そのような手段は使用される標識の型に依存する。標識の存在は、そのような構造の存在が前立腺癌を暗示すると共に、結合ＰＳＡが少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を含むことを示している。この発明のも一つの見地に従って、少くとも三分枝であるオリゴ糖に連鎖する前立腺特異的抗原を検出するためのキットあるいはパッケージが提供される。このキットは（ａ）結合剤で支持される固体支持体、とりわけ、前立腺特異的抗原のエピトープを認識する抗体、および（ｂ）結合分子が少くとも三分枝であり一分枝あるいは二分枝でないオリゴ糖と結合する例えば前に記載した通りの標識を持つ結合分子を含む。使用される固体支持体は、必ずしもそれに限定されないが、セルロース材料で作られたもの例えば紙、セルロース、およびセルロース誘導体例えば酢酸セルロースおよびニトロセルロース；シリカ；ガラス繊維；無機材料例えば不活性化アルミニウム、珪藻土、あるいは塩化ビニル−プロピレンコポリマーおよび塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーなどのポリマーから作られた多孔ポリマー基質に一様に分散された他の無機細分材料；綿；ナイロン；多孔ゲル例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン、およびゼラチン；ポリマー状フィルム例えばポリアクリルアミド；磁粉；マイクロタイタ平板；ポリスチレン管；タンパク質結合膜；セファデックス（ニュージャージー、ピスケータウェー、ファーマシア・ファイン・ケミカルズ，インコーポレイテッド）；トリスアクリル（ポインテット−ジラード）；シリコン粒子；ポリスチレン粒子；塩化ビニル粒子；ラテックス粒子；および多孔繊維基質を含む。一実施例において、固体支持体は０．１乃至１０ミクロンの径を持つポリスチレン、塩化ビニル、あるいはラテックスの合成顕微粒子を含む。も一つの選択肢として、２個の検定が行われる。第一の検定は阻害検定を含む。この検定では、少くとも三分枝であるオリゴ糖に結合し一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない前に記載したもののような化合物あるいは結合分子が前立腺特異的抗原を含んでいるのではないかと考えられる試料の第一の部分の予め定められた量と一緒に保温される。このような保温の後、試料は固体支持体で支持された抗体と接触する。単クローン性あるいは多クローン性抗体である支持抗体は前立腺特異的抗原のエピトープを認識し、少くとも三分枝であるオリゴ糖がもしも前立腺特異的抗原に存在するならばそれは少くとも三分枝である前立腺特異的抗原のオリゴ糖の近位にあり、これによりＰＳＡの支持抗体との結合が少くとも三分枝であるオリゴ糖に結合する化合物により阻害される。少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原がもしもその試料に存在するならば、そのような前立腺特異的抗原は少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合する化合物あるいは結合分子の事前の結合のために支持抗体と結合できないであろう。もしも少くとも三分枝であるオリゴ糖を含まない試料に存在する前立腺特異的抗原がある場合には、そのような前立腺特異的抗原は固体支持体と結合するであろう。かくして、支持抗体と結合するいずれかの前立腺特異的抗原は少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持たない前立腺特異的抗原である。結合ＰＳＡは次いで遊離ＰＳＡから分離される。試料は次いで前立腺特異的抗原のエピトープを認識する標識抗体と接触される。かくして標識抗体は支持抗体により結合された前立腺特異的抗原と結合する。結合標識抗体は次いで遊離標識抗体から分離される。前立腺特異的抗原に対する結合標識抗体の量が次いで決定される。サンドイッチ検定である第二の検定において、固体支持体に支持される前立腺特異的抗原に対する抗体が前立腺特異的抗原を含むと考えられる試料の第二の部分に接触される。この第二の部分は第一の部分と同一量の試料を含む。試料が固体支持体と接触した後、前立腺特異的抗原に対する標識抗体が加えられ、結合標識抗体の量が決定される。第一検定および第二検定での結合標識抗体の量が同じであるなら、少くとも三分枝であるオリゴ糖に連鎖する前立腺特異的抗原は試料に存在しない。第二検定における結合標識抗体の量が第一検定のそれよりも大きければ、少くとも三分枝であるオリゴ糖に連鎖する前立腺特異的抗原は試料に存在する。かくして、この発明の更なる見地に従って、少くとも三分枝であるオリゴ糖に連鎖する前立腺特異的抗原を検出するキットあるいはパッケージが提供される。このキットは一対の固体支持体を含む。各支持体は結合剤、とりわけ前立腺特異的抗原のエピトープを認識する抗体を含む。エピトープはもしそのようなオリゴ糖が前立腺特異的抗原に存在するならば少くとも三分枝であるオリゴ糖の近位に位置する。キットは更に少くとも三分枝であるオリゴ糖に結合するが一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない前に記載されたもののような結合分子を含む。キットはまた前立腺特異的抗原のエピトープを認識する認識抗体を含む。も一つの選択肢として、前立腺特異的抗原を含むと考えられる試料が前立腺特異的抗原を認識する抗体を使用する免疫沈降あるいは免疫親和精製を受ける。分離された前立腺特異的抗原は次いでゲル電気泳動、例えば硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を受け、また適切な膜、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移される。適切な帯が次いで膜から切除され、エキソグリコシダーゼあるいはエキソグリコシダーゼとノイラミニダーゼの組合せで処理されオリゴ糖を前立腺特異的抗原から放出する。オリゴ糖は次いで標識され次いでゲル上のオリゴ糖の分離を通じて分析される。ゲルは次いで少くとも三分枝であるオリゴ糖の存在を分析される。この発明は少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原の検出を通じて前立腺の癌の診断と関連して説明されてきたけれども、この発明の方法は少くとも三分枝でありまた前立腺の癌以外の癌、例えば乳癌および結腸癌と関連する連鎖オリゴ糖を持つ抗原を検出するのに使用される。このような抗原は少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺癌特異的抗原の検出と関連してこれまでに記載されたもののような方法により検出される。この発明はこれから下記の実施例と関連して説明されるであろう。しかしこの発明の範囲はそれにより限定されることを意図しない。実施例１ＬＮＣａＰ細胞系（ヤング、他、癌研究、５１巻、３７４８−３７５２ページ（１９９１年７月１５日）が１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０で成長し、５０乃至１００ｎＭアンドロゲン（５−β−１７β−ｏ１−３−ｏｎｅ）で刺激された。馴化培地は刺激の１−２週後に収集され、分泌ＰＳＡがハイブリテック・タンデム−Ｅ・ＰＳＡエリザキットで推定された。馴化培地からの分泌ＰＳＡは免疫沈降あるいは商業的に得られる多クローン性抗ヒトＰＳＡ抗体を用いる免疫親和精製により精製された。正常ＰＳＡあるいはＬＮＣａＰ細胞系から精製されたＰＳＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥを受け、ＰＶＤＦ膜に一晩移された。膜は０．１％のポンソーＳで染色され、適切な帯は切除され、次いでＡｓｎ連鎖オリゴ糖を糖ペプチドおよび糖タンパク質のβ−アスパルチルグリコシルアミンで切断するエキソグリコシダーゼペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）のみ、あるいはＰＮＧａｓｅＦとノイラミニダーゼ３（Ｇｌｙｋｏ）との組合せのいずれか処理された。放出されたオリゴ糖は発蛍光団８−アミノナフタリン１，３，６−トリスルホン酸塩（ＡＮＴＳ）で標識され、またスタック、他、糖生物学、２巻、１号、８５−９２ページ（１９９２）にも記載され、更にポリアクリルアミドゲル電気泳動、すなわちＰＡＧＥによる発蛍光団標識オリゴ糖の分析を伴うＦＡＣＥとしても知られる発蛍光団補助炭水化物電気泳動により分析された。ＦＡＣＥは更にジャクソン、分析生化学、２１６巻、２４３−２５２ページ（１９９４年）、およびフー、染色体ジャーナル、７０５Ａ巻、８９−１０９ページ（１９９５年）に記載されている。図１はＰＮＧａｓｅＦによりＰＶＤＦ結合前立腺特異的抗原からオリゴ糖を放出し、オリゴ糖をＡＮＴＳで標識し、またオリゴ糖をオリゴ糖ＰＡＧＥにより分離することで得られた結果を示す。オリゴ糖マーカーはレーン１で示される。レーン２はＡＮＴＳ標識デキストラン標準（Ｇｌｙｋｏ）である。レーン３および４は正常ＰＳＡから放出されたオリゴ糖を示す。レーン５および６は形質転換ＰＳＡ（すなわち前立腺癌細胞からのＰＳＡ）から放出されたオリゴ糖を表現する。図２は正常ＰＳＡおよび少くとも三分枝であるオリゴ糖を持つＰＳＡからのオリゴ糖のＰＡＧＥ分析の結果を示す。オリゴ糖はＰＮＧａｓｅＦによりＰＶＤＦ膜結合ＰＳＡから放出され次いでノイラミニダーゼ３で処理された。ＡＮＴＳ標識試料はオリゴ糖ＰＡＧＥにより分離された。レーン１はデキストラン標準（Ｇｌｙｋｏ）である。レーン２および８はノイラミニダーゼ３で処理された正常ＰＳＡからのオリゴ糖である。レーン３は正常ＰＳＡからのオリゴ糖である。レーン４はフコースがＰＳＡのコア・キトビオース成分から除去されなかったＰＳＡからのアジアロ二分枝オリゴ糖である。レーン５はフコースがフコースを持つコア・キトビオース成分から除去されたＰＳＡからのアジアロ二分枝オリゴ糖である（Ｇｌｙｋｏ）。レーン６はアジアロ三分枝オリゴ糖マーカーである。レーン７はノイラミニダーゼ３で処理された形質転換ＰＳＡから放出されたオリゴ糖である。実施例２ＰＳＡに対する抗体は９６ウエルマイクロタイタ平板の表面に予備結合される。１００μｌの血清のアリコートおよび１００μｌの希釈剤（０．３％のウシ血清アルブミン、ｐＨ７．２および窒化ナトリウム、０．０５％を持つＰＢＳ）がウエルに加えられる。マイクロタイタ平板は次いで１時間３７℃で保温される。溶液は次いで捨てられ、またウエルは４回２５０μｌの希釈剤で室温で洗浄される。ジゴキシゲニン標識レクチンＰＨＡ−Ｌの溶液２００μｌが２μｇ／ｍｌの濃度で各ウエルに加えられる。マイクロタイタ平板は次いで１時間３７℃で保温される。溶液は次いで捨てられ、また各ウエルは４回２５０μｌの希釈剤で室温で洗浄される。各ウエルは次いでジオキシゲニンに対するペルオキシダーゼ標識抗体１５０ｍＵ／ｍｌを含む溶液に接触される。平板は次いで１時間３７℃で保温される。溶液は次いで捨てられ、また各ウエルは４回２００μｌの希釈剤で室温で洗浄される。２００μｌのペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ、ベーリンガー・マンハイム）が次いで各ウエルに加えられ、また平板は３０乃至６０分室温で保存される。約４９０ｎｍの基準波長で、４０５ｎｍでのエリザ読み取り装置を用いる吸光度が次いで各試料で測定される。しかしこの発明の範囲は前に記載の特異的な実施例に限定されるものでないことは理解されねばならない。この発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、しかもなお以下の請求の範囲内に存在する。

Claims

【特許請求の範囲】１．前立腺の癌を検定する一つの方法であって、少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原に関してヒトから誘導した試料を検定することを含む前立腺の癌を検定する方法。２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記試料の前記検定が、（ａ）前記前立腺特異的抗原を前記試料から分離し、（ｂ）前記分離された前立腺特異的抗原を、少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合するが、一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない結合分子に接触させ、（ｃ）前立腺特異的抗原と結合する前記結合分子の存在を決定する、ことを含むことを特徴とする方法。３．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記結合分子がＰＨＡ−Ｌであることを特徴とする方法。４．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記試料からの前記前立腺特異的抗原の前記分離が前立腺特異的抗原のエピトープを認識する抗体に前記試料を接触させることを含むことを特徴とする方法。５．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記試料の前記検定が、（ａ）第一検定において、前立腺特異的抗原を含むと考えられる試料を、少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合するが一分枝あるいは二分枝であるオリゴ糖とは結合しない結合分子と一緒に保温し、（ｂ）前記試料を固体支持体で支持された抗体に接触させ、前記支持抗体は前立腺特異的抗原にも存在するとすれば、少くとも三分枝であるオリゴ糖への前記結合分子の結合により遮断される前立腺特異的抗原のエピトープを認識し、（ｃ）前記支持抗体に結合する前立腺特異的抗原の量を決定し、（ｄ）第二検定において、前記支持抗体を、前記試料の前記予め定められた量と接触させ、前記第二部分の前記予め定められた量は前記第一部分の予め定められた量と同一であり、（ｅ）前記第二検定で結合前立腺特異的抗原の量を決定し、また（ｆ）前記第一検定での前記結合前立腺特異的抗原の量を前記第二検定での結合前立腺特異的抗原の量と比較することにより少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ前立腺特異的抗原の存在を決定する、ことを含むことを特徴とする方法。６．少くとも三分枝であるオリゴ糖に連鎖する前立腺特異的抗原を検出するための一つのキットであって、（ａ）前立腺特異的抗原のエピトープを認識する抗体、（ｂ）前記抗体を支持する固体支持体、および（ｃ）少くとも三分枝であるオリゴ糖と結合するが二分枝あるいは一分枝であるオリゴ糖とは結合しない結合分子、を含む前立腺特異的抗原を検出するためのキット。７．請求の範囲第６項記載のキットであって、ここで前記結合分子がＰＨＡ−Ｌであることを特徴とするキット。８．少くとも三分子である連鎖オリゴ糖を持つ抗原の存在と関連する癌を検出する一つの方法であって、少くとも三分枝である連鎖オリゴ糖を持つ抗原に関してヒトから誘導された試料を検定することを含む癌を検出する方法。