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JP2023171870A - 硫酸化多糖の製造方法及びｐａｐｓの製造方法 - Google Patents

硫酸化多糖の製造方法及びｐａｐｓの製造方法 Download PDF

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Kenta FUKUNAGA
彬 西原
Aki NISHIBARA
崚介 加藤
Ryosuke Kato
将宏 倉都
Masahiro KURATSU
幹朗 林
Mikiaki Hayashi
信一 橋本
Shinichi Hashimoto
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Abstract

【課題】本発明は微生物又はその処理物の代謝活性を利用したＰＡＰＳの生産／再生系と、硫酸化酵素を発現する微生物又はその処理物若しくは抽出物を、硫酸マグネシウムなど安価原料を混合して反応させることで、簡便に硫酸化多糖を製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は安価な原料から実用的なＰＡＰＳを製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含み、かつ細胞形質膜が物質透過性である形質転換体（ａ）又はその処理物を用意する工程及びＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源、前記形質転換体（ａ）又はその処理物を含む反応液を用いて、ＰＡＰＳの生産反応を行う工程を含む、硫酸化多糖の製造方法及びＰＡＰＳの製造方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明はＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼ（Ａｄｅｎｙｌｓｕｌｆａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）を発現させたコリネバクテリウム属細菌を用いて、グルコース、アデニンといった安価原料から３’－ホスホアデノシン ５’－ホスホ硫酸（以下ＰＡＰＳ）を製造する方法、および該コリネバクテリウム属細菌及び各種硫酸化酵素を発現させた原核生物に属する微生物を用い、硫酸化多糖を製造する方法に関するものである。
ＰＡＰＳは微生物から高等生物まで広く存在し、生体内で硫酸基供与体として機能する補酵素であり、高等生物ではコンドロイチン硫酸やヘパラン硫酸といったグリコサミノグリカンの生合成に必要とされる。硫酸化された生体内代謝物は種々の生理機能を有することが知られており、ＰＡＰＳ自体にも育毛剤（特許文献１）、保湿作用を有する皮膚外用剤（特許文献２）等の用途が期待されている。
ＰＡＰＳを生産する方法としてはＡＴＰを原料に精製された酵母由来ＡＴＰスルフリラーゼ、アオカビ由来ＡＰＳキナーゼ、および大腸菌由来ピロホスファターゼを用いる方法（非特許文献１）、同じくＡＴＰを原料に好熱菌由来の耐熱性ＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼおよび酵母由来ピロホスファターゼを用いる方法（特許文献３）、アデノシン ５’－モノリン酸（以下ＡＭＰ）を原料に耐熱性細菌由来のＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼ、および緑膿菌由来ポリリン酸キナーゼを用いる方法（特許文献４）などが知られている。
一方、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの変異株を用い、キシレンや界面活性剤で菌体の膜を処理して透過性を付与することで、グルコース、アデニン等の安価原料を用いてＡＴＰを工業的に生産する方法が知られている（非特許文献２）。
ＰＡＰＳは非常に不安定な化合物であり、粗酵素を用いる方法においても大腸菌を宿主に組換え発現させた耐熱性細菌由来のＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼの粗酵素を調製し、反応の前に加熱処理を行い、大腸菌由来の夾雑酵素活性を抑えることでＰＡＰＳを生産している（特許文献４）。
ＰＴＬ８には、大腸菌の粗酵素液中ではＰＡＰＳが分解されることが記載されている。大腸菌はＰＡＰＳの分解に関わるいくつかの酵素を有しており、それらの酵素の遺伝子を欠損させることでＰＡＰＳの分解を抑制することができる。
硫酸化された多糖であるヘパリンは主要な抗凝固薬であり、血栓閉塞症、播種性血管内凝固症候群の利用や人工透析、体外循環での凝固防止などに用いられる。工業的には主にヘパリンは豚の腸粘膜から抽出、精製される。２００８年に豚由来ヘパリンへの不純物混入を原因とする死亡事故が発生したことから、製造管理／品質管理された非動物由来のヘパリン生産の研究開発が行われている。
具体例としてグラム陰性の微生物の莢膜多糖であるＮ－アセチルヘパロサン（以降、「ヘパロサン」と略記する。）を発酵生産して精製したものを化学的にＮ－脱アセチル化、Ｎ－硫酸化し、その後酵素的にエピマー化することで豚由来品と同等の構造、抗凝固活性を有するヘパリンを生産する（特許文献５～７、非特許文献３及び４）。
その他の有用な硫酸化多糖としてはコンドロイチン硫酸が知られており、関節痛の医薬品や角膜表層保護の点眼薬として用いられている。コンドロイチン硫酸は種々の動物組織から抽出、精製されたものが利用されているが、ヘパリンと同様にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の莢膜多糖を原料に硫酸化酵素を用いて生産する方法が近年報告されている（非特許文献５及び６）。
微生物の莢膜由来の多糖を原料に精製された酵素を用いて硫酸化を行う方法では硫酸化酵素の反応において硫酸基供与体となるＰＡＰＳが補酵素として必要となる。上記の微生物の莢膜由来の多糖を原料とする硫酸化多糖の製造方法では基質多糖へのＰＡＰＳの硫酸基転移で生成する３’－ホスホアデノシン ５’－リン酸（以下ＰＡＰ）にｐ－ニトロフェニル硫酸の硫酸基を酵素的に転移することでＰＡＰＳに再生し、多糖の酵素的な硫酸化反応を進行させている（特許文献６、非特許文献３）。
国際公開第２０１２／０５７３３６号 日本国特開２０１２－２０１６６５号公報 日本国特開平５－１３７５８８号公報 日本国特許第４５０５０１１号公報 日本国特許第５８３０４６４号公報 米国特許８，７７１，９９５号明細書 国際公開第２０１８／０４８９７３号 国際公開第２０２０／０１３３４６号
Glycobiology vol. 21 no. 6 pp. 771-780, 2011 Biosci. Biotechnol. Biochem. 65(3), 644-650, 2001 Carbohydrate Polymers 122 (2015) 399-407 Advanced Drug Delivery Reviews 97 (2016) 237-249 Metabolic Engineering 27 (2015) 92-100 Biotechnology and Bioengineering 115 (2018) 1561-1570
上記した非特許文献１並びに特許文献１及び２に記載の従来のＰＡＰＳを生産する方法は、いずれの方法もＡＴＰやＡＭＰといった比較的高価なヌクレオチドを原料としており、精製された酵素、もしくは菌を培養した後、菌体を分離し、超音波処理等よる菌体破砕、遠心分離により調製された粗酵素を用いており、工業的なスケールの実施は容易ではない。
一方、上述の通り、ＰＡＰＳの生産についてはＡＴＰもしくはＡＭＰを原料にして精製酵素、もしくは粗酵素を用いる方法が知られているが、微生物そのものを用いてＰＡＰＳを生産した例はこれまでに知られていない。また、上記したように、ＰＡＰＳは非常に不安定な化合物であり、従来技術においては、粗酵素を用いる場合には、加熱処理により夾雑酵素活性を抑えている等の煩雑な工程がなされている。
上記をかんがみると、コリネバクテリウム属細菌を宿主にＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼを発現させるだけで、ＡＴＰを工業的に生産する方法と類似の方法でＰＡＰＳを生産できるとは予測し難い。なぜなら、大腸菌と同様に、コリネバクテリウム属細菌もまたＰＡＰＳの分解に関わるいくつかの酵素を有しているからである。
また、上述したように、従来の酵素的な多糖の硫酸化方法では硫酸化酵素を発現する微生物を培養して、集菌し、超音波破砕等で調製した菌体破砕液から精製した複数の酵素を利用しており、工業的なスケールで実施することは容易ではなかった。また原料として高価なＰＡＰＳやｐ－ニトロフェニル硫酸が必要であった。
したがって、本発明は微生物又はその処理物の代謝活性を利用したＰＡＰＳの生産／再生系と、硫酸化酵素を発現する微生物又はその処理物若しくは抽出物、硫酸マグネシウムなど安価原料を混合して反応させることで、簡便に硫酸化多糖を製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は安価な原料から実用的なＰＡＰＳを製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、以下の（１）及び（２）の知見に基づき、本発明を完成させた。
（１）ＡＴＰ生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を宿主に組換えＤＮＡ手法によりＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼの活性の強化を行った菌株を培養した後、界面活性剤等で膜透過性を付与し、グルコース、アデニン等の原料を添加することにより、従来の方法と比較して安価、簡便にＰＡＰＳを製造できる。
（２）（１）に記載のＡＴＰスルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼの活性の強化を行った菌株をＰＡＰＳの生産／再生反応を担う微生物菌体として用い、エピメラーゼ及び／又は硫酸化酵素を発現する原核生物に属する微生物に膜透過性を付与して混合反応を行うことで、酵素の精製やＰＡＰＳを添加することなく、菌体と硫酸マグネシウムなど安価原料を用いて硫酸化多糖を生産できる。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
１．以下の工程（１－１）及び（１－２）を含む、硫酸化多糖の製造方法。
（１－１）コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ａ）又はその処理物を用意する工程
（１－２）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及び前記形質転換体（ａ）又はその処理物を含む反応液を用いて、ＰＡＰＳの生産反応を行う工程
２．さらに工程（２－１）及び（２－２）を含む、前記１に記載の硫酸化多糖の製造方法。
（２－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（２－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、Ｃ５－エピマー化をする工程
３．発現可能に導入された硫酸転移酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物若しくは抽出物により硫酸化をする工程を含む、請求項１又は２に記載の硫酸化多糖の製造方法。
４．さらに工程（３－１）及び（３－２）を含む前記３に記載の硫酸化多糖の製造方法。
（３－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、２－Ｏ－硫酸化をする工程
５．さらに工程（３´－１）～（３´－３）を含む、前記３又は４のいずれか１に記載の硫酸化多糖の製造方法。
（３´－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３´－２）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３´－３）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物および前記形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化をする工程
６．さらに工程（４－１）及び（４－２）を含む、前記３～５のいずれか１に記載の硫酸化多糖の製造方法。
（４－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（４－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、６－Ｏ－硫酸化をする工程
７．さらに工程（５－１）及び（５－２）を含む前記３～６のいずれか１に記載の硫酸化多糖の製造方法。
（５－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（５－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、３－Ｏ－硫酸化をする工程
８．ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、
コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ａ）又はその処理物と、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物、
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物および
原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも１と、を反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法。
９．ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、
前記形質転換体（ａ）又はその処理物と、前記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、前記８に記載の硫酸化多糖の製造方法。
１０．ヘパリンを製造する方法である、前記１～９のいずれか１に記載の硫酸化多糖の製造方法。
１１．以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＰＡＰＳの製造方法。
（ｉ）コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物を用意する工程
（ｉｉ）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及び工程（ｉ）で用意した前記形質転換体又はその処理物を含む反応液を用いてＰＡＰＳの生産反応を行う工程
本発明の硫酸化多糖の製造方法によれば、微生物の代謝活性を利用したＰＡＰＳの生産／再生系と、硫酸化酵素を発現する微生物又はその処理物若しくは抽出物を用いることにより、簡便かつ安価に硫酸化多糖を製造できる。また、本発明のＰＡＰＳの製造方法によれば、微生物又はその処理物の代謝活性を利用することにより、簡便かつ安価にＰＡＰＳを製造できる。さらに、本発明の方法においてコリネバクテリウム属細菌を用いることにより、ＰＡＰＳの分解を阻止するための複雑な遺伝子改変は不要である。
図１は、エシェリヒア・コリ Ｋ５株の染色体上のヘパロサン合成遺伝子クラスターの模式図を示す。 図２は、ヘパロサン生産に関わる酵素の模式図を示す。 図３は、ヘパロサンの生合成経路の模式図を示す。 図４は、Ｎ－スルフォヘパロサンの２－Ｏ－硫酸化反応試験における反応液上清中に含まれるＰＡＰＳ濃度の経時変化を示す図である。 図５は、Ｎ－スルフォヘパロサンの２－Ｏ－硫酸化反応試験の不飽和２糖ＨＰＬＣ分析におけるΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳの面積比の経時変化を示す図である。 図６は、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化反応試験における反応液上清中に含まれるＰＡＰＳ濃度の経時変化を示す図である。 図７は、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化反応試験の不飽和２糖ＨＰＬＣ分析におけるΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮ，６Ｓの面積比の経時変化を示す図である。 図８は、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ位、３－Ｏ位硫酸化反応試験における反応液上清中に含まれるＰＡＰＳ濃度の経時変化を示す図である。 図９は、ＰＡＰＳ生産試験における反応液上清中に含まれるＰＡＰＳ濃度の経時変化を示す図である。
＜形質転換体＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、１）ＰＡＰＳの供給／再生を、菌体を用いた反応により行うことを特徴とする。本発明の方法は、２）Ｃ５－エピマー化、３）２－Ｏ－硫酸化、４）６－Ｏ－硫酸化及び５）３－Ｏ－硫酸化の少なくとも１を、菌体を用いた反応により行うことが好ましい。以下各反応に用いる形質転換体（ａ）～（ｅ）について説明する。
＜＜形質転換体（ａ）：ＰＡＰＳの供給／再生＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、ＰＡＰＳの供給／再生は、コリネバクテリウム属に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ａ）又はその処理物により行う。
コリネバクテリウム属細菌の種としては、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）］、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）が挙げられる。
コリネバクテリウム属細菌の菌株としては、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ） ＡＴＣＣ ６８７１， ＡＴＣＣ ６８７２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ２１５１１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ ＡＴＣＣ １５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ ＡＳ１．５４２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０２０， ＡＴＣＣ １３０３２， ＡＴＣＣ １３０６０， ＡＴＣＣ １３８６９， ＦＥＲＭ ＢＰ－７３４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ ＡＴＣＣ １５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ １７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ） ＡＪ１２３４０ （ＦＥＲＭ ＢＰ－１５３９）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ ＡＴＣＣ １３８６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ １４０２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ １３８２６， ＡＴＣＣ １４０６７， ＡＪ１２４１８ （ＦＥＲＭ ＢＰ－２２０５）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ １３８６９、が挙げられる。
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる［Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)］。
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より入手可能である。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して株を得られる（https://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手できる。コリネバクテリウム属細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。
本発明においては、コリネバクテリウム属細菌にＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を発現可能に導入する。
ＡＴＰスルフリラーゼは、下記反応式により硫酸塩からＡＰＳ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’－ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ）を生成する。
Figure 2023171870000001
ＡＴＰスルフリラーゼの一態様としては、ＭＥＴ３が挙げられる。ＡＴＰスルフリラーゼの由来としては特に限定されず、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ又はＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ由来のものが挙げられ、この中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来であることが好ましい。
ＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号２２で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号２２で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＡＴＰスルフリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号２２で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＡＴＰスルフリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
形質転換体におけるＡＴＰスルフリラーゼ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中のＡＴＰスルフリラーゼ活性値の上昇により確認する。ＡＴＰスルフリラーゼの活性は文献[Medina D. C. et al., Temperature effects on the allosteric transition of ATP sulfurylase from Penicillium chrysogenum. Arch. Biochem.Biophys. 1;393(1):51-60 (2001)]に記載の方法で確認できる。
本発明における同一性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997),Genome Res., 7, 649 (1997),http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
ＡＰＳキナーゼは、下記反応式によりＡＰＳからＰＡＰＳを生成する。
Figure 2023171870000002
ＡＰＳキナーゼの一態様としては、ＭＥＴ１４が挙げられる。ＡＰＳキナーゼの由来としては特に限定されず、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ又はＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ由来のものが挙げられ、この中でもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来であることが好ましい。
ＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子としては、配列番号２３で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号２３で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＡＰＳキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号２３で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＡＰＳキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
形質転換体におけるＡＰＳキナーゼ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中のＡＰＳキナーゼ活性値の上昇により確認する。ＡＰＳキナーゼの活性は文献［Renosto F. et al., Adenosine 5'-phosphosulfate kinase from Penicillium chrysogenum. Purification and kinetic characterization. J. Biol.Chem. 259(4):2113-2123 (1984)］に記載の方法により確認できる。
コリネバクテリウム属細菌へのＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子の導入は、上記したＤＮＡを各々宿主の染色体に組み込むか、または、宿主で増幅できる適切なプラスミドベクターにクローニングして宿主に導入すればよい。
プラスミドベクターは、コリネバクテリウム属細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであればよい。その具体例としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）２２５６由来のｐＡＭ３３０［日本国特開昭５８－６７６９９号公報］、［Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）］及び［Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）］、コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ３０５８由来のｐＨＭ１５１９［Miwa,K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol.Chem. 48:2901-2903（1984）］及びｐＣＲＹ３０［Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）］、コリネバクテリウム グルタミカム Ｔ２５０由来のｐＣＧ４［日本国特開昭５７－１８３７９９号公報］、［Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）］、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ１４、ｐＡＧ５0［日本国特開昭62-166890号公報］、ｐＥＫ０、ｐＥＣ５、ｐＥＫＥｘ１［Eikmanns,B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene,102:93-98 （1991）］等が挙げられる。
プロモーターとしては、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。例えば、コリネバクテリウム グルタミカムＲ由来のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼＡ遺伝子（ｇａｐＡ）のプロモーターＰｇａｐＡ、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍｄｈ）のプロモーターＰｍｄｈ、ラクテートデヒドロゲナーゼＡ遺伝子（ｌｄｈＡ）のプロモーターＰｌｄｈＡ等が挙げられる。
ターミネーターとしては、例えば、大腸菌ｒＲＮＡオペロンのｒｒｎＢ Ｔ１Ｔ２ ターミネーター、大腸菌のｔｒｐＡ ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のｔｒｐ ターミネーター等が挙げられる。
本発明の一態様においては、ＰＡＰＳの分解に関わる酵素の遺伝子の発現が減弱されていない。ＰＡＰＳの分解に関わる酵素の遺伝子の例には、ｃｙｓＱ遺伝子及びＣＰ０１８５０遺伝子が含まれる。形質転換体（ａ）の一態様としては、ｃｙｓＱ遺伝子及びＣＰ０１８５０遺伝子から選択される少なくとも１つの発現が減弱されていない。
＜＜形質転換体（ｂ）：Ｃ５－エピマー化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、Ｎ－スルフォヘパロサンのＣ５－エピマー化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物により行う。
Ｃ５－エピメラーゼは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基のイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基への異性化を触媒できるものであれば特に制限されない。Ｃ５－エピメラーゼは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。Ｃ５－エピメラーゼとしては、例えば、ヒトのＣ５－エピメラーゼを利用することができる。
Ｃ５－エピメラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号２４で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号２４で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＣ５－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号２４で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつＣ５－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
形質転換体におけるＣ５－エピメラーゼ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中のＣ５－エピメラーゼ活性値の上昇により確認する。Ｃ５－エピメラーゼ活性は文献［Babu P. et al., A rapid, nonradioactive assay for measuring heparansulfate C-5 epimerase activity using hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry. Methods. Mol. Biol. 1229:209-219 (2015)］に記載の方法により測定できる。
以下、硫酸転移酵素を発現する形質転換体について説明する。本発明の硫酸化多糖の製造方法において、該形質転換体に発現可能に導入された硫酸転移酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体又はその処理物若しくは抽出物により硫酸化が行われる。本発明において、硫酸転移酵素とは、硫酸基を多糖に転移して硫酸化多糖を生成するものであれば特に制限されないが、例えば、２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（２－ＯＳＴ）、６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（６－ＯＳＴ）、３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（３－ＯＳＴ）が挙げられる。
＜＜形質転換体（ｃ）：２－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、２－Ｏ－硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（２－ＯＳＴ）をコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物により行う。
２－ＯＳＴは、ＩｄｏＡ残基のＯ－２位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、２－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。２－ＯＳＴとしては、例えば、ハムスター由来の２－ＯＳＴを利用することができる。
２－ＯＳＴをコードする遺伝子としては、配列番号１９で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号１９で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ２－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号１９で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ２－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
形質転換体における２－ＯＳＴ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中の２－ＯＳＴ活性値の上昇により確認する。２－ＯＳＴ活性は文献[Zhang J. et al., High cell density cultivation of recombinant Escherichia coli strains expressing 2-O-sulfotransferase and C5-epimerase for the production of bioengineered heparin. Appl. Biochem. Biotechnol.175(6):2986-2995 (2015)]に記載の方法で確認することができる。
＜＜形質転換体（ｄ）：６－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、６－Ｏ－硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（６－ＯＳＴ）をコードする遺伝子を含む形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物により行う。
６－ＯＳＴは、Ｎ－硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基のＯ－６位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。６－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。６－ＯＳＴとしては、例えば、ハムスター由来の６－ＯＳＴ－１やマウス由来の６－ＯＳＴ－３が挙げられる。
６－ＯＳＴをコードする遺伝子としては、配列番号２５で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号２５で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ６－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号２５で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ６－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
形質転換体における６－ＯＳＴ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中の６－ＯＳＴ活性値の上昇により確認する。６―ＯＳＴの活性は文献[Zhang J. et al., High cell density cultivation of a recombinant Escherichia coli strain expressing a 6-O-sulfotransferase for the production of bioengineered heparin. J. Appl. Microbiol. 118(1):92-98(2015)]に記載の方法で確認することができる。
＜＜形質転換体（ｅ）：３－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法において、３－Ｏ－硫酸化は、原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼ（３－ＯＳＴ）をコードする遺伝子を含む形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物により行う。
３－ＯＳＴは、Ｎ－硫酸化・６－Ｏ－硫酸化グルコサミン残基のＯ－３位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。３－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。３－ＯＳＴとしては、例えば、マウス由来の３－ＯＳＴ－１を利用することができる。
３－ＯＳＴをコードする遺伝子としては、配列番号２６で示される塩基配列が挙げられる。また、配列番号２６で示される塩基配列と好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ３－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；配列番号２６で示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであり、かつ３－ＯＳＴ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
形質転換体における３－ＯＳＴ活性は、該形質転換体の細胞抽出液中の３－ＯＳＴ活性値の上昇により確認する。３－ＯＳＴ活性は文献[Jin W. et al., Increased soluble heterologous expression of a rat brain 3-O-sulfotransferase 1 - A key enzyme for heparin biosynthesis.Protein Expr. Purif. 151:23-29 (2018)]に記載の方法で確認することができる。
＜＜原核生物に属する微生物＞＞
本発明において形質転換体の宿主として用いる原核生物に属する微生物としては、本発明所定の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属に属する微生物などの細菌が挙げられ、エシェリヒア属細菌が好ましく用いられる。
本発明に用いるエシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、文献［Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt(ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.］に記載されたものが挙げられる。
エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）やＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ ４７０７６）等のエシェリヒア・コリＫ－１２株；エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ ２３５０６）；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株；エシェリヒア・コリＮｉｓｓｌｅ １９１７株（ＤＳＭ ６６０１）；およびそれらの派生株が挙げられる。
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より入手可能である。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して株を得られる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号 Ｃ６０００－０３）。
遺伝子を発現可能に導入することを目的に、原核生物に属する微生物の形質転換に用いるベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであることが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカー又は文献［Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)］に記載の他の遺伝子を有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターとしては、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等が挙げられる。
エシェリヒア・コリ属細菌において自律複製可能なベクターとしては、具体的には例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社）、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３－２（クロンテック社）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０が挙げられる。
プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。
ターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、Ｔ４ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、ｔｅｔターミネーター、およびｔｒｐＡターミネーターが挙げられる。
上記した形質転換体（ｂ）～（ｅ）において、原核生物に属する微生物に導入された各遺伝子は、２種以上が一つの形質転換体に導入されていてもよい。具体的には例えば、Ｃ５－エピメラーゼをコードする遺伝子と２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子とを１つの原核生物に属する微生物に導入し、１つの形質転換体としてもよい。
＜＜形質転換体の処理物＞＞
本発明における形質転換体の処理物とは、菌体の細胞形質膜が物質透過性であるものをいう。本発明において、細胞形質膜が物質透過性であるとは、小型（イオン等）、大型（タンパク質等）の種々の分子が細胞膜を拡散により通過して自由に出入りさせることができることをいう。本発明における形質転換体の処理物は、膜透過性付与のための処理により増殖能を失った休止菌体であることが好ましい。
形質転換体の処理物としては、例えば、形質転換体である菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の固定化物などの酵素源として該菌体の培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、該菌体の超音波処理物及び該菌体の機械的摩砕処理物が挙げられる。
細胞形質膜を物質透過性とする方法としては、例えば、化学的処理、機械的処理が挙げられる。本発明の製造方法において、形質転換体の細胞形質膜を物質透過性とするタイミングとしては、本発明の効果を奏する限り、各形質転換体の細胞形質膜を予め物質透過性としておいてもよいし、反応に用いる形質転換体同士を接触させて反応させる際でもよく、特に限定されない。
化学的処理としては、例えば、界面活性剤を用いる方法、有機溶媒を用いる方法、酵素を用いる方法、が挙げられる。界面活性剤としては、（イオン性界面活性剤と比較して）タンパク質などに対する作用がより温和であることから非イオン性界面活性剤が好ましい。当該界面活性剤としては、例えば、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（３－Ｄ－ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（３－Ｄ－ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬＢＬ－９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）ＬａｕｒｙｌＥｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ－８］、ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ等が挙げられる。
有機溶媒としては、例えば、Ｂｅｎｚｅｎｅ、Ｔｏｒｕｅｎｅ、Ｘｙｌｅｎｅ、その他アルコール類などが挙げられる。酵素としては、例えば、リゾチーム、アクロモペプチダーゼなどが挙げられる。
上記物質による処理の濃度、温度、時間などの条件は細胞の種類により異なり、所望の解析を行うのに適当な条件を設定しなければならないが、一般的な処理濃度としては、１０～１０００μｇ／ｍｌ、より一般的には２０～２００μｇ／ｍｌであり、温度としては２～３７℃、時間としては１～３０分間である。
機械的処理としては、例えば、超音波処理、機械的摩砕処理が挙げられる。
＜＜形質転換体の抽出物＞＞
本発明における形質転換体の抽出物としては、例えば、形質転換体である菌体から得られる粗酵素抽出物、上記処理（例えば、化学的処理又は機械的処理）した菌体から得られる精製酵素、上記した形質転換体又はその処理物を培養した培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物が挙げられる。また、形質転換体の抽出物としては、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物も包含される。
＜＜形質転換方法及び形質転換体の培養方法＞＞
形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などが挙げられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる［Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 (1990)］。
形質転換体は、各反応に先立ち微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養することにより増殖させることが好ましい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
炭素源はＡＴＰ源となりうる。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、１種を単独で使用でき、または２種以上を混合してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約０．１～１０（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ－アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約０．１～１０（ｗ／ｖ ％）とすればよい。
無機塩類としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト等の硫酸イオン源のほかに、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硝酸第一鉄、塩化ナトリウム、または炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約０．０１～１（ｗ／ｖ％）とすればよい。
栄養物質としては、例えば、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられるが、通常、約０．１～１０（ｗ／ｖ％）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のｐＨは約６～８が好ましい。
好ましい微生物培養培地としては、Ａ培地〔Inui, M. et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol.7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔Omumasaba, C.A. et al.,Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol.8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。具体的な培養条件としては、例えば、培養温度としては約１５～４５℃、培養時間としては約１～７日が挙げられる。
＜硫酸化多糖の製造方法＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法の一態様は、ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、上記形質転換体（ａ）又はその処理物と、上記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも１とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法である。
本発明の硫酸化多糖の製造方法の一態様としては、例えば、ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、上記形質転換体（ａ）又はその処理物と、上記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを含む反応液を用いて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法が挙げられる。
また、本発明の硫酸化多糖の製造方法の一態様は、ＰＡＰＳ及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、上記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも１を反応液に含有させて、硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法である。
本発明の製造方法において、各形質転換体は、反応液に初期に添加してもよいし、逐次添加してもよいし、これらを組み合わせてもよい。各形質転換体を初期に反応液に添加する態様としては、具体的には例えば、ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、上記形質転換体（ａ）又はその処理物と、上記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを反応液に初期に含有させて硫酸化多糖を生成する態様が挙げられる。
本発明の硫酸化多糖の製造方法においては上記形質転換体（ａ）又はその処理物と、上記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを用いて、１）形質転換体（ａ）又はその処理物によるＰＡＰＳの供給／再生、２）形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物によるＣ５－エピマー化、３）形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物による２－Ｏ－硫酸化、４）形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物による６－Ｏ－硫酸化及び５）形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物による３－Ｏ－硫酸化を行うことができる。
以下、各工程に分けて説明するが、２）Ｃ５－エピマー化、３）２－Ｏ－硫酸化、４）６－Ｏ－硫酸化及び５）３－Ｏ－硫酸化の順序については、所望の硫酸化多糖が得られる限り、特に制限されない。
また、以下においては１）ＰＡＰＳの供給／再生、２）Ｃ５－エピマー化、３）２－Ｏ－硫酸化、４）６－Ｏ－硫酸化及び５）３－Ｏ－硫酸化について、各反応に分けて説明するが、これらの反応は２以上を同時に行ってもよい。例えば、形質転換体（ａ）又はその処理物と、形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを全て含む反応液を用いてこれらの反応を同時に行ってもよい。
本発明の硫酸化多糖の製造方法により製造される硫酸化多糖としては、ヘパリンが挙げられる。
＜＜ＰＡＰＳの供給／再生＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程（１－１）及び（１－２）を含むことを特徴とする。
（１－１）コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ａ）又はその処理物を用意する工程
（１－２）ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源、前記形質転換体（ａ）又はその処理物を含む反応液を用いて、ＰＡＰＳの生産反応を行う工程
形質転換体（ａ）又はその処理物によって発現されるＡＴＰスルフリラーゼ及びＡＰＳキナーゼと、ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源とが形質転換体（ａ）又はその処理物内で反応し、ＰＡＰＳが生産される。ＰＡＰＳは、硫酸化多糖の製造において、硫酸基の供与体として機能する。また、形質転換体（ａ）又はその処理物により生産されたＰＡＰＳが硫酸化多糖の製造方法に用いられることによりＰＡＰが得られ、形質転換体（ａ）又はその処理物によって当該ＰＡＰからＰＡＰＳを製造できる。したがって、反応液に形質転換体（ａ）又はその処理物を含有させことにより、ＰＡＰＳの供給／再生が可能となる。
＜＜Ｃ５－エピマー化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程（２－１）及び（２－２）を含むことが好ましい。
（２－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（２－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、Ｃ５－エピマー化をする工程
工程（２－２）においては、Ｃ５－エピメラーゼを発現する形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物により、Ｎ－スルフォヘパロサンのＣ５－エピマー化が行われる。
＜＜２－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程（３－１）及び（３－２）を含むことが好ましい。
（３－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、２－Ｏ－硫酸化をする工程
工程（３－２）においては、形質転換体（ａ）又はその処理物により生産されるＰＡＰＳを硫酸基供与体として用い、２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼを発現する形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物によりＮ－スルフォヘパロサンの２－Ｏ－硫酸化が行われる。また、反応液中に工程（２－２）で生産された硫酸化多糖が存在する場合には、当該工程で生産された硫酸化多糖の２－Ｏ－硫酸化が行われる。例えば、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンの２－Ｏ－硫酸化が行われる。
上記したＣ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化は同時に行ってもよい。すなわち、本発明の硫酸化多糖の製造方法の一態様としては、以下の工程（３´－１）～（３´－３）を含むことが好ましい。
（３´－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３´－２）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（３´－３）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物および前記形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物を前記反応液に含有させて、Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化をする工程
＜＜６－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程（４－１）及び（４－２）を含むことが好ましい。
（４－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（４－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、６－Ｏ－硫酸化をする工程
工程（４－２）においては、形質転換体（ａ）又はその処理物により生産されるＰＡＰＳを硫酸基供与体として用い、６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼを発現する形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物により、Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化が行われる。
また、反応液中に工程（２－２）、工程（３－２）又は工程（３’－３）で生産された硫酸化多糖が存在する場合には、当該工程で生産された硫酸化多糖の６－Ｏ－硫酸化が行われる。
例えば、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化が行われる。２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化が行われる。
また、Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ－硫酸化が行われる。
＜＜３－Ｏ－硫酸化＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、以下の工程（５－１）及び（５－２）を含むことが好ましい。
（５－１）原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物を用意する工程
（５－２）Ｎ－スルフォヘパロサンの存在下、前記形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物を反応液に含有させて、３－Ｏ－硫酸化をする工程
工程（５－２）においては、形質転換体（ａ）又はその処理物により生産されるＰＡＰＳを硫酸基供与体として用い、３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼを発現する形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物により、Ｎ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。
また、反応液中に工程（２－２）、工程（３－２）、工程（３’－３）又は工程（４－２）で生産された硫酸化多糖が存在する場合には、当該工程で生産された硫酸化多糖の３－Ｏ－硫酸化が行われる。
例えば、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。
Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化及び２－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。Ｃ５－エピマー化及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。２－Ｏ－硫酸化及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、２－Ｏ－硫酸化及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。
また、Ｃ５－エピマー化、２－Ｏ－硫酸化、及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンが存在する場合には、Ｃ５－エピマー化、２－Ｏ－硫酸化、及び６－Ｏ－硫酸化されたＮ－スルフォヘパロサンの３－Ｏ－硫酸化が行われる。
＜＜反応条件＞＞
上記した１）ＰＡＰＳの供給／再生、２）Ｃ５－エピマー化、３）２－Ｏ－硫酸化、４）６－Ｏ－硫酸化及び５）３－Ｏ－硫酸化の反応条件について以下説明する。
反応液のｐＨは約６～８が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの水溶液等を用いて、ｐＨコントローラーで、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、２０～５０℃が好ましく、２５～４７℃がより好ましい。また、反応時間は約１～７日間が好ましく、約１～３日間がより好ましい。培養は、バッチ式、流加式、連続式のいずれでもよい。中でもバッチ式が好ましい。
通気条件反応は、還元条件又は微好気的条件で行ってもよい。還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約－２００ｍＶ～－５００ｍＶが好ましく、－２５０ｍＶ～－５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬で推定できるが、正確には酸化還元電位差計を用いて測定できる。還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。
具体的には、蒸留水等を加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、シスチン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
反応途中での還元条件を維持する場合は、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。
反応途中で微好気条件を維持する場合は、通気量を０．５ｖｖｍ等の低値又はそれ以下とし、攪拌速度を５００ｒｐｍ等の低値又はそれ以下の条件で反応させることができる。場合によっては、反応開始後、適当な時間で通気を遮断し、攪拌速度を１００ｒｐｍ又はそれ以下の条件で嫌気度を向上させた状態と組み合わせて反応することもできる。
＜＜硫酸化多糖の回収＞＞
上記のようにして培養することにより、反応液中に硫酸化多糖が生産される。反応液を回収することにより硫酸化多糖を回収できるが、さらに、公知の方法で硫酸化多糖を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、例えば、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
＜＜Ｎ－スルフォヘパロサンの調製＞＞
本発明の硫酸化多糖の製造方法に用いるＮ－スルフォヘパロサンは、ヘパロサンが脱アセチル化、脱ポリマー化及びＮ－硫酸化されたものである。ヘパロサンの製造及びヘパロサンからＮ－スルフォヘパロサンの製造は公知の方法（例えば、国際公開第２０１８／０４８９７３号）により行うことができる。
ヘパロサンの製造方法としては、例えば、以下の（ａ１）の遺伝子改変を有し、かつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物を培地で培養し、ヘパロサンを培地中に生成させること、及び該培地よりヘパロサンを回収することを含む、製造方法が挙げられる。
（ａ１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変前記原核生物に属する微生物は、前記（ａ１）に加えて、さらに以下の（ａ２）及び（ａ３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有していてもよい。
（ａ２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（ａ３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変
ｋｐｓＳ遺伝子は、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩＩの遺伝子群のうち、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉにコードされる遺伝子である。ｋｐｓＳは、ヘパロサン合成の開始に関与しており、ヘパロサン生産において、ｋｐｓＳはｋｐｓＣとともに、内膜のホスファチジルグリセロールに複数のＫｄｏリンカーを付加する役割を果たす。
ｋｐｓＳ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｐｓＳ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５２６５９．１として登録されている。
ｋｐｓＳ遺伝子としては、配列番号２７に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２７に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を増大させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤは、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩＩの遺伝子群のうち、ＲｅｇｉｏｎＩＩにコードされる遺伝子である。図２に示すように、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤは、ヘパロサンの合成に関与しており、糖を付加してヘパロサンを合成する役割を果たす。
ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。ｋｆｉＡはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７１１．１；ｋｆｉＢはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＥ５５８２４．１；ｋｆｉＣはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７０９．１；ｋｆｉＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７０８．１として登録されている。
ｋｆｉＡ遺伝子としては、配列番号２８に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を増大させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
ｋｆｉＢ遺伝子としては、配列番号２９に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号２９に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を増大させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
ｋｆｉＣ遺伝子としては、配列番号３０に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３０に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を増大させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
ｋｆｉＤ遺伝子としては、配列番号３１に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３１に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を増大させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
図３にヘパロサンの生合成経路の模式図を示す。ＧｌｍＳは、ヘパロサンの前駆体であるＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン供給経路の第１酵素でありフルクトース－６－リン酸からグルコサミン－６－リン酸への反応を触媒する酵素である。ＹｈｂＪは、ＧｌｍＳをネガティブに制御する酵素である。
ｙｈｂＪ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｙｈｂＪ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＥ７７２４９．１として登録されている。
ｙｈｂＪ遺伝子としては、配列番号３２に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３２に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有する原核生物に属する微生物において発現量を低下させた際に該微生物のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。
上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、例えば、上記した各遺伝子の塩基配列を用いたＢＬＡＳＴ検索やＦＡＳＴＡ検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、各遺伝子のホモログは、例えば、細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、該遺伝子によりコードされるタンパク質の元の機能（例えば、活性や性質）が維持されている限り、該遺伝子のバリアントであってもよい。該遺伝子のバリアントによりコードされるタンパク質が元の機能を維持しているか否かは、具体的には例えば、元の機能がヘパロサンの生産能を向上する機能である場合、該遺伝子のバリアントをヘパロサンの生産能を有する原核生物に属する微生物に導入して、元の機能を有するか否かを確認できる。
上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子のバリアントは、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することによって取得することができる。また、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子のバリアントは、例えば、変異処理によっても取得され得る。
上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
また、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、各遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いることができる。プローブとして３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、表１～３の遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
変異処理としては、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ分子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、上記（ａ１）～（ａ３）における各遺伝子を保持する微生物を、Ｘ線、紫外線、またはＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤によって処理する方法等の方法が挙げられる。
＜＜＜遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変＞＞＞
「遺伝子の発現の増大」とは、非改変株と比較して該遺伝子の発現が上昇することをいう。遺伝子の発現の増大の一態様としては、例えば、非改変株と比較して、該遺伝子の発現が好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇していることが挙げられる。
また、「遺伝子の発現が増大する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が増大する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。なお、「遺伝子の発現が増大する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」、「遺伝子の発現が上昇する」ともいう。
遺伝子の発現の増大は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組換えを利用して行うことができる（Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。
例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。
また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやＭｉｎｉ－Ｍｕを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（日本国特開平２－１０９９８５号公報）。
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ等によって確認できる。
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。形質転換の方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用できる。
ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであることが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子又は文献［Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)］に記載の他の遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターとしては、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等が挙げられる。
エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとしては、具体的には例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社）、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３－２（クロンテック社）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０が挙げられる。
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、本発明における遺伝子改変を有する原核生物に属する微生物に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとしては、具体的には例えば、Ｔ７ターミネーター、Ｔ４ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、ｔｅｔターミネーター、およびｔｒｐＡターミネーターが挙げられる。
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
また、２以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムＤＮＡや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、ＰＣＲにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい［Gene, 60(1), 115-127 (1987)］。
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。
「より強力なプロモーター」としては、例えば、公知の高発現プロモーターであるｕｓｐＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｈｒプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｐｏＨプロモーター、ＰＲプロモーター、およびＰＬプロモーターが挙げられる。
また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第２０００／１８９３５号）。
高活性型プロモーターとしては、各種ｔａｃ様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やｐｎｌｐ８プロモーター（国際公開第２０１０／０２７０４５号）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、公知の文献［Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)等］に記載されている。
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列［リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう］をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。
「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる［Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235］。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（５’－ＵＴＲ）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（国際公開第２００５／０１０１７５号）により行うことができる。
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。具体的には例えば、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法［Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)］や、ファージを用いる方法［Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)］が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」［http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)］に開示されている。
また、遺伝子の発現の増大は、遺伝子の発現を増大させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。上記のような遺伝子の発現を増大させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、該遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。ｍＲＮＡの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる［Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001］。ｍＲＮＡの量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
タンパク質の量が上昇したことは、例えば、抗体を用いてウェスタンブロットによって確認できる。タンパク質の量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
タンパク質の活性が増大したことは、例えば、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性の増大としては、タンパク質の活性が、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。
上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、上記した（ａ１）及び（ａ２）の各遺伝子の発現増強に利用できる。
ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｐｓＳ遺伝子の発現調節領域の改変及びコピー数を高める遺伝子改変の少なくとも一方であることが好ましい。ヘパロサン生産遺伝子群としては、ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ遺伝子が存在するが、本発明者らは、実施例において後述するように、これらの中でも特にｋｐｓＳ遺伝子のみの発現を増大することにより、顕著なヘパロサンの生産向上効果が得られることを見出したものである。したがって、ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大する遺伝子改変としては、特に、ｋｐｓＳ遺伝子のコピー数を高める遺伝子改変がより好ましい。
ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現調節領域の改変及び該遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方であることが好ましい。ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子は図１に示すようにオペロンを構成しており、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子により構成されるオペロン全体を強化する遺伝子改変が好ましく、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子の発現調節領域の改変がより好ましい。
＜＜＜遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変＞＞＞
上記した（ａ３）のｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主である原核生物に属する微生物のゲノムＤＮＡのうちｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、ｙｈｂＪに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させることが挙げられる。
本発明の方法において、ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに加える改変の形態は、前記ｙｈｂＪに相当する遺伝子がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態であれば特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。
ｙｈｂＪに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態としては、例えば、次の（I）から（III）のいずれか１の改変が例示できる。
（I）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（II）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（III）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
ｙｈｂＪ遺伝子の機能の欠損としては、例えば、非改変株と比較して、ｙｈｂＪの活性が好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが挙げられる。ｙｈｂJの活性は、ｇｌｍＳの発現量をノーザンブロット法、ウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる[Kalamorz F. et al, (2007) “Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.” Mol Microbiol.65(6):1518-33]。
本発明の硫酸化多糖の製造方法は、上記したヘパロサンの製造方法により得られるヘパロサンを公知の方法により化学修飾して得られたＮ－スルフォヘパロサンを反応液に用いることができる。
＜ＰＡＰＳの製造方法＞
本発明のＰＡＰＳの製造方法は、ＡＴＰ源、硫酸イオン源、上記した形質転換体（ａ）又はその処理物を含む反応液に含有させて、ＰＡＰＳの生産反応を行うことを特徴とする。すなわち、本発明のＰＡＰＳの製造方法は、下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
（ｉ）コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含み、かつ細胞形質膜が物質透過性である形質転換体又はその処理物を用意する工程
（ｉｉ）ＡＴＰ源、硫酸イオン源及び工程（ｉ）で用意した前記形質転換体又はその処理物を含む反応液を用いてＰＡＰＳの生産反応を行う工程
本発明のＰＡＰＳの製造方法によれば、ＡＴＰスルフリラーゼ及びＡＰＳキナーゼを発現するコリネバクテリウム属細菌の形質転換体又はその処理物を用いて、菌体反応によりＰＡＰＳを製造することができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのＤＥ３化プラスミドの構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ野生株ＡＴＣＣ ６８７２の染色体上のｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ間にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むλＤＥ３を挿入するためのプラスミドを以下の通り構築した。ｇｌｔＤ側を増幅するためのプライマーを２種［ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿１（配列番号１）とｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿２ＢＸ（配列番号２）］、ならびに、ｐｕｒＴ側を増幅するためのプライマーを２種［ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿３ＢＸ（配列番号３）とｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿４（配列番号４）］、デザインした。
その際、１回目のＰＣＲで増幅したｇｌｔＤ側断片とｐｕｒＴ側断片を連結する２回目のＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）を行うために、ｇｌｔＤ側断片増幅用の３’プライマー（ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿２ＢＸ；配列番号２）の５’側にｐｕｒＴ側断片増幅用の５’プライマー（ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿４；配列番号４）の３’側約２５塩基の相補的な配列を付加した。さらにｇｌｔＤ側断片増幅用の５’プライマー（ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿１）とｐｕｒＴ側断片増幅用の３’プライマー（ｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ＿４）の５’側にＩｎ ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇのため配列が付加してある。またλＤＥ３を挿入するためにｇｌｔＤ側、ｐｕｒＴ側の連結部分にＢｇｌ ＩＩおよびＸｈｏ Ｉ認識配列が付加されている。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓの野生型株であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ６８７２株（以下、ＡＴＣＣ ６８７２株という）の染色体ＤＮＡを斎藤らの方法［Biochim. Biophys. Acta 72, 619(1963)］に従って調製した。
該染色体ＤＮＡを鋳型として用い、ｇｌｔＤ側およびｐｕｒＴ側を増幅させる１回目のＰＣＲを行い、ｇｌｔＤ側の約０．８ｋｂのＤＮＡ断片およびｐｕｒＴ側の約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次いで、これらのｇｌｔＤ側断片とｐｕｒＴ側断片を連結する２回目のＰＣＲを行い、約１．６ ｋｂのＤＮＡ断片（ｇｌｔＤ－ＢＸ－ｐｕｒＴ）を得た。
カナマイシン耐性遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのベクターｐＨＳＧ２９９［Gene, 61, 63,(1987)］のＰｓｔＩ切断部位に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩ ＤＮＡ断片［Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)］を連結したプラスミドｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩで切断後、上記で取得したｇｌｔＤ－ＢＸ－ｐｕｒＴ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結した。該反応産物を用い、常法［Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed.,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press］に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α［東洋紡社製］を形質転換した。
得られた菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。コロニーＰＣＲにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（寒天を含まない以外はＬＢ寒天培地と同じ組成の培地）に植菌して終夜培養し、得られた培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、ｐＥＳＢ３０に約１．６ ｋｂのｇｌｔＤ－ＢＸ－ｐｕｒＴ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。
続いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型にＤＥ３－ｆｏｒ＿Ｘｈｏ（配列番号５）、ＤＥ３－ｒｅｖ＿Ｂｇｌ（配列番号６）のプライマーを用いて４．５ｋｂのλＤＥ３断片をＰＣＲで増幅した。ＤＥ３－ｆｏｒ＿ＸｈｏにはＸｈｏ Ｉ認識配列が、ＤＥ３－ｒｅｖ＿ＢｇｌにはＢｇｌ ＩＩ認識配列が付加されている。この断片とｐＥＳＢ３０に約１．６ｋｂのｇｌｔＤ－ＢＸ－ｐｕｒＴ断片が挿入された構造を有するプラスミドをＸｈｏ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩで消化した後、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）により連結した。
上記と同様にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、得られた菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、ｐＥＳＢ３０上の約１．６ｋｂのｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ間に４．５ｋｂのλＤＥ３断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。同プラスミドをｐＣ－ＤＥ３と命名した。
［実施例２］Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのλＤＥ３挿入株の造成
レストらの方法［Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)］に従って電気穿孔法にてＡＴＣＣ ６８７２株にｐＣ－ＤＥ３を導入し、カナマイシン耐性株を選択した。該カナマイシン耐性株の１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション［Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed.,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press］により調べたところ、ｐＣ－ＤＥ３がＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確認された。
該形質転換株（一回組換え体）をＳｕｃ寒天培地〔スクロース１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、スクロースを自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［J. Bacteriol., 174, 5462 (1991)］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型とλＤＥ３挿入型間での２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この相同組み換えの際には、野生型の構造もしくはｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ間にλＤＥ３断片が挿入された株のいずれかが、ｓａｃＢとともに脱落する。このとき野生型構造がｓａｃＢとともに脱落した株では、λＤＥ３挿入型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体をＤＥ３－ｆｏｒ＿ＸｈｏおよびＤＥ３－ｒｅｖ＿Ｂｇｌのプライマーを用いてコロニーＰＣＲによりＡＴＣＣ ６８７２のｇｌｔＤ－ｐｕｒＴ間にλＤＥ３が挿入された菌株を得た。本菌株はＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）と命名した。
［実施例３］ＭＥＴ３－ＭＥＴ１４の発現用ＤＮＡ断片を有するプラスミドの構築
プラスミドｐＣＳ２９９Ｐ［Appl.Microbiol.Biotech.,63,592(2004)］をＢａｍＨＩで消化した。ｐＥＴ２１ｂを鋳型にｐＣＥＴ＿Ｆｗ２（配列番号７）およびｐＣＥＴ＿Ｒｖ２（配列番号８）でＰＣＲを行い、ｌａｃＩ－ＰＴ７を含むＤＮＡ断片を取得した。これらをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該反応産物を用い、常法に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換して２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で培養し形質転換株を選択した。コロニーＰＣＲにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、ｐＣＳ２９９Ｐに約１．９ ｋｂのｐＥＴ２１ｂ由来ｌａｃＩ－ＰＴ７ ＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。同プラスミドをｐＣＥＴ２１２と命名した。
続いてｐＣＥＴ２１２のＴ７プロモーター下流にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＭＥＴ３およびＭＥＴ１４が挿入されたプラスミドを構築した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ株（以下Ｓ２８８Ｃとする）の染色体ＤＮＡからＭＥＴ３側を増幅するためのプライマーを２種（ＭＥＴ３＿１（配列番号９）とＭＥＴ３＿２（配列番号１０））、ならびに、ＭＥＴ１４を増幅するためのプライマーを２種（ＭＥＴ１４＿３（配列番号１１）とＭＥＴ１４＿４（配列番号１２））、デザインした。
その際、１回目のＰＣＲで増幅したＭＥＴ３断片とＭＥＴ１４断片を連結する２回目のＰＣＲ （ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）を行うために、ＭＥＴ３増幅用の３’プライマー（ＭＥＴ３＿２；配列番号１０）の５’側にＭＥＴ１４増幅用の５’プライマー（ＭＥＴ１４＿３；配列番号１１）の５’側約１５塩基の相補的な配列を、ＭＥＴ１４＿３の５’側にＭＥＴ３＿３の５’側約１５塩基の相補的な配列を付加した。さらにＭＥＴ３増幅用の５’プライマー（ＭＥＴ３＿１）とＭＥＴ１３増幅用の３’プライマー（ＭＥＴ１４＿４）の５’側にＩｎ ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇのため配列が付加してある。Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、ＭＥＴ３およびＭＥＴ１４を増幅させる１回目のＰＣＲを行い、ＭＥＴ３の約１．５ ｋｂのＤＮＡ断片および下流域の約０．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次いで、これらのＭＥＴ３断片とＭＥＴ１４断片を連結する２回目のＰＣＲを行い、約２．１ ｋｂのＤＮＡ断片（ＭＥＴ３－ＭＥＴ１４）を得た。このＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）で精製した後、Ｎｄｅ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉで消化したｐＣＥＴ２１２にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該反応産物を用い、常法に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。得られた菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。コロニーＰＣＲにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、ｐＣＥＴ２１２に約２．１ ｋｂのＭＥＴ３－ＭＥＴ１４断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。本プラスミドをｐＳＣ－３－１３と命名した。ｐＳＣ－３－１３をＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）に形質転換することでＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのＰＡＰＳ生産菌ＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３株を得た。
［実施例４］シャペロンタンパク質発現用ＤＮＡ断片を有するプラスミドの構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡを鋳型にＧｒｏ＿Ｆ（配列番号１３）およびＧｒｏ＿Ｒ（配列番号１４）でＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＳ－ＧｒｏＥＬを含むＤＮＡ断片を取得した。次にｐＫＤ４６［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645(2000)］を鋳型にＡｒａＣ＿ＰａｒａＢ＿Ｆ（配列番号１５）およびＡｒａＣ＿ＰａｒａＢ＿Ｒ（配列番号１６）でＰＣＲを行い、ＡｒａＣ＿ＰａｒａＢを含むＤＮＡ断片を取得した。ｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型にｐＣＤＦ－ＳｍＯｒｉ－Ｆ（配列番号１７）およびｐＣＤＦ－ＳｍＯｒｉ－Ｒ（配列番号１８）でＰＣＲを行い、ストレプトマイシン耐性遺伝子とＣｏｌｄＤＦ複製開始点を含むＤＮＡ断片を取得した。これらをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該反応産物を用い、常法に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換して５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地で培養し形質転換株を選択した。コロニーＰＣＲにより目的クローンを選抜後、該形質転換株を５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）によりプラスミドを調製した。塩基配列解析により、該プラスミドは、ｐＣＤＦ－Ｄｕｅｔ１に約１．２ ｋｂのｐＫＤ４６由来ＡｒａＣ－ＰａｒａＢ ＤＮＡ断片と約２．０ ｋｂのＢＬ２１（ＤＥ３）由来ＧｒｏＥＳ－ＧｒｏＥＬ ＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。同プラスミドをｐＧｒｏ（Ｓｍ）と命名した。
［実施例５］Ｃ５－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、２ＯＳＴ、６ＯＳＴ－３、３ＯＳＴ－１を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの造成
ヒト由来Ｃ５－ｅｐｉｍｅｒａｓｅの触媒ドメイン領域（Ｅ５３－Ｎ６０９）を文献記載［Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 339, Issue 2, 13 January 2006,Pages 597-602］の方法によりｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングを行い、ＭＢＰ－Ｃ５を造成した。ＭＢＰ－Ｃ５をｐＧｒｏ７（タカラバイオ社）とともにＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換を行い、Ｃ５－ｅｐｉｍｅｒａｓｅを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７株を造成した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現用にコドン最適化を行ったチャイニーズハムスター由来の２－Ｏ－ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ １の触媒ドメイン（Ｒ５１－Ｎ３５６）の塩基配列を配列番号１９に示した。人工合成した上記配列を鋳型に配列番号２０と２１に記載のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ断片をｐＥＴ－Ｈｉｓ６－ＭＢＰ－ＴＥＶ－ＬＩＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ）にＬｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９； ４９８： １０５－１１５］によりクローニングを行い、Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴを造成した。Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴをｐＧｒｏ（Ｓｍ）とともにＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換を行い、２ＯＳＴを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）株を造成した。
マウス由来６－Ｏ－ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ３の触媒ドメイン（Ｐ１２０－Ｌ４２４）を文献記載［Chemistry & Biology Volume 14, Issue 9, 21 September 2007, Pages 986-993］の方法によりｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングを行い、ＭＢＰ－６ＯＳＴ３を造成した。ＭＢＰ－６ＯＳＴ３をｐＧｒｏ７（タカラバイオ社）とともにＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換を行い、６ＯＳＴ－３を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７株を造成した。
マウス由来３－Ｏ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの触媒ドメイン（Ｇ４８－Ｈ３１１）を文献記載［J Biol Chem. 2004 Jun 11;279(24):25789-97］の方法によりｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングを行い、ＨＩＳ－３ＯＳＴ１を造成した。ＨＩＳ－３ＯＳＴ１をｐＧｒｏ（Ｓｍ）とともにＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に形質転換を行い、３ＯＳＴ１を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）株を造成した。
［実施例６］Ｎ－スルフォヘパロサン、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの調製
ヘパロサンの発酵生産はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ５株もしくはＮｉｓｓｌｅ株を用い、特許文献［ＷＯ２０１８／０４８９７３ Ａ１］に記載の方法で行った。得られたヘパロサンは同文献に従い、化学的に脱アセチル化処理、脱ポリマー化を行った後、化学的にＮ－硫酸化を行った。その後、エタノール沈殿で分画を行い、Ｎ－スルフォヘパロサンを得た。得られたＮ－スルフォヘパロサンは同文献に従い、酵素反応によるウロン酸残基Ｃ５位のエピメリ化と２－Ｏ位の硫酸化を行ったのち、エタノール沈殿で分画を行い、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンを得た。
［実施例７］ＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３の培養
実施例３で得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３株を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＢＹ－Ｇｌｕｃｏｓｅ寒天培地［グルコース１０ｇ、普通ブイヨン培地（極東製薬工業社製）２０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）２０ｇを水１Ｌに含む培地］に植菌して、３０℃で一晩培養した。
プレート２枚分の菌体を、２Ｌ容三角フラスコ中３５０ｍｌの第一次種培地［グルコース ５０ｇ／Ｌ、ハイポリペプトン（日本製薬株式会社）１０ｇ／Ｌ、酵母エキス（アサヒ社製）１０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、尿素 ０．５ｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン ０．０３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．０１ｇ／Ｌ、ビオチン ４０μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ０．００５ｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．００５ｇ／Ｌ、ｐＨ ７．２に水酸化ナトリウムで調整し、オートクレーブを用いて１２２℃２０分で殺菌後、Ｌ－システイン ０．１ｇ／Ｌ、チオ硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ、カナマイシン ０．１ｇ／Ｌとなるように別添加した培地］に植菌し、３０℃にて攪拌速度２２０ｒｐｍで２４時間培養した。
上記の培養液３００ｍｌを、６Ｌ容培養槽中１７００ｍｌの第二次種培地［グルコース １０００ｇ／Ｌ、フルクトース ４ｇ／Ｌ、酵母エキス（アサヒ社製）１０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．２５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１水和物 ２．１ｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．０１５ｇ／Ｌ、ビオチン ４０μｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．００５ｇ／Ｌ、アデカノールＬＧ－１０９（アデカ社製） １ｍｌ／Ｌ、ｐＨ ７．２に水酸化ナトリウムで調整し、尿素 ３．２ｇ／Ｌとなるよう別添加した後、オートクレーブを用いて１２２℃２０分で殺菌し、チアミン塩酸塩 ０．１ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン ０．３ｇ／Ｌ、チオ硫酸ナトリウム ２．５ｇ／Ｌ、カナマイシン ０．２ｇ／Ｌとなるように別添加した培地］に植菌し、３０℃、攪拌速度６５０ｒｐｍ、通気量２Ｌ／分の培養条件下、１８％アンモニア水でｐＨを６．８に調整しつつ２４時間培養した。
上記の培養液３００ｍｌを、６Ｌ容培養槽中１７００ｍｌの本槽培地［ＫＨ２ＰＯ４ １０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１水和物 １ｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン ０．０２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００５ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ、ビオチン １５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．００５ｇ／Ｌ、尿素 ２ｇ／Ｌ、アデカノールＬＧ－１０９（アデカ社製） １ｍｌ／Ｌ、オートクレーブを用いて１２２℃２０分で殺菌した後、グルコース １２５ｇ／Ｌ、フルクトース ２５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．０１５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ０．００５ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン ０．１５ｇ／Ｌ、チオ硫酸ナトリウム ２．５ｇ／Ｌ、カナマイシン ０．２ｇ／Ｌとなるよう別添加した培地］に植菌し、３０℃、通気量２Ｌ／分の培養条件下、溶存酸素量が１ｐｐｍを下回らないよう撹拌速度を６５０ｒｐｍから９００ｒｐｍの間で調整し、１８％アンモニア水でｐＨを６．８に調整しつつ２５時間培養した。
この間、培養開始６時間後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加、培養開始１０時間後にビオチン１００μｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．０１５ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．０１５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ０．００５ｇ／Ｌとなるように追加添加した。培養終了後、遠心分離器にて培養液を菌体と培養上清に分離し、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、－８０℃で凍結した。
［実施例８］Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７、ＲＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）の培養
実施例５で得られたＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＴＢ培地が入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＴＢ培地が５００ｍＬが入ったバッフル付き三角フラスコに１．２％接種し、３７℃で６時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと終濃度４ｍＭのアラビノースを添加し、２８℃で２０時間培養した。その後、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、－８０℃で凍結した。
実施例５で得られたＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ） 株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＴＢ培地が入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＴＢ培地が５００ｍＬが入ったバッフル付き三角フラスコに１．２％接種し、３０℃で１２時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと終濃度４ｍＭのアラビノースを添加し、２８℃で２０時間培養した。その後、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、－８０℃で凍結した。
実施例５で得られたＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＴＢ培地が入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＴＢ培地が５００ｍＬが入ったバッフル付き三角フラスコに１．２％接種し、３７℃で４時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと終濃度４ｍＭのアラビノースを添加し、２８℃で２０時間培養した。その後、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、－８０℃で凍結した。
実施例５で得られたＲＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）株を５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＴＢ培地が入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液を５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＴＢ培地が５００ｍＬが入ったバッフル付き三角フラスコに１．２％接種し、３７℃で４時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと終濃度４ｍＭのアラビノースを添加し、２８℃で２０時間培養した。その後、該培養液を遠心分離しペレットを湿菌体として取得、－８０℃で凍結した。
［実施例９］ＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３およびＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）を用いたＮ－スルフォヘパロサンの２－Ｏ位硫酸化反応試験
実施例７、８で得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）の凍結菌体を、凍結菌体重量が３３３ｇ／Ｌとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３菌体懸濁液３０ ｍｌ、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－Ｃ５＿ｐＧｒｏ７菌体懸濁液６ ｍｌおよびＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／Ｈ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ） 菌体懸濁液６ｍｌを２５０ｍｌ容培養槽中１８ｍｌの反応液［グルコース６０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ８．７５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．３ｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．２ｇ／Ｌ、アデニン４．０５ｇ／Ｌ、塩化ベンザルコニウム１．２５ｇ／Ｌ、アデカノールＬＧ－１０９（アデカ社製） １ｍｌ／Ｌ、Ｎ－スルフォヘパロサン（実施例６で作製された）１ｇ／Ｌを含む水溶液］に添加し、３７℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量０．７５ｍＬ／分の培養条件下、２．８％濃度アンモニア水溶液でｐＨを６．５に調整しつつ２２時間反応した。この間、反応開始６時間後にグルコース６０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．０ｇ／Ｌ、アデニン２．７ｇ／Ｌとなるよう追加添加した。
反応中適宜サンプリングを行い、反応液を取得した。取得した反応液を適当に希釈したのち遠心分離し、島津製作所製のＨＰＬＣにてＵＶ検出器により２５４ｎｍの吸光度を測定することによりＰＡＰＳの検出、定量を行った。結果を図４に表わす。また、特許文献［ＷＯ２０１８／０４８９７３ Ａ１］に従い、酵素消化による不飽和２糖生成およびＨＰＬＣによる分析を行った。
すなわち、取得した反応液を遠心分離し、得られた上清を１０分間８０℃で加熱保持する事によりタンパクの変性を行った。タンパク変性後の溶液を遠心分離し、得られた上清を、分子量３ｋフィルターデバイス（メルク社製）を用いて限外ろ過することによって、脱塩した。脱塩後の溶液をヘパリナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（シグマ社製その他が利用可能）をそれぞれ０．５Ｕ／ｍｌを含むヘパリナーゼ反応液［５０ｍＭ 酢酸アンモニウム、２ｍＭ 塩化カルシウムからなる組成］に供し３５℃２時間酵素消化させた。酵素消化後の溶液を１５分間９５℃で保持することによりヘパリナーゼの不活化を行った。
ヘパリナーゼの不活化後の溶液を島津ＨＰＬＣおよび強アニオン交換カラム（ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ－ＳＡＸ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ， ４．０×２５０ｍｍ， ５μｍ、ウォーターズ社製）を用いた移動相Ａ［１．８ｍＭ リン酸２水素ナトリウムを含み、リン酸でｐＨ３．０へ調整された水溶液］と移動相Ｂ［１．８ｍＭ リン酸２水素ナトリウム、１Ｍ 過塩素酸ナトリウムを含み、リン酸でｐＨ３．０へ調整された水溶液］のグラディエント溶出モード分析へ供することにより、不飽和２糖分析を行った。
ＵＶ検出器により２３２ｎｍの吸光度を測定することにより不飽和２糖の検出を行った。不飽和２糖標品（Ｉｄｕｒｏｎ社製）との比較によりΔＵＡ－ＧｌｃＮＳとΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳの保持時間を確認した。検出されたΔＵＡ－ＧｌｃＮＳとΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳの合計面積に対するΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳの面積比を求めることにより、２－Ｏ－硫酸化を確認した。結果を図５に示す。
［実施例１０］ＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３およびＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７を用いた２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ位硫酸化反応試験
実施例７、８で得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７の凍結菌体を、凍結菌体重量が３３３ ｇ／Ｌとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３菌体懸濁液３０ｍｌ、Ｏｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７菌体懸濁液６ｍｌおよび蒸留水６ｍｌを２５０ｍｌ容培養槽中１８ｍｌの反応液［グルコース６０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ８．７５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．３ｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．２ｇ／Ｌ、アデニン４．０５ｇ／Ｌ、塩化ベンザルコニウム１．２５ｇ／Ｌ、アデカノールＬＧ－１０９（アデカ社製） １ｍｌ／Ｌ、２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサン（実施例６で作製された）０．５ｇ／Ｌを含む水溶液］に添加し、３２℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量０．７５ｍＬ／分の培養条件下、２規定水酸化カリウムの水溶液でｐＨを７．４に調整しつつ２２時間反応した。
この間、反応開始６時間後にグルコース６０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．０ｇ／Ｌ、アデニン２．７ｇ／Ｌとなるよう追加添加した。反応中適宜サンプリングを行い、反応液を取得した。実施例９と同様の手法を用いて、ＰＡＰＳの検出、定量を行った。結果を図６に表わす。
また、実施例９と同様の手法を用いて、反応後の糖鎖に含まれる硫酸化組成の分析を行った。不飽和２糖標品（Ｉｄｕｒｏｎ社製）との比較によりΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳとΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮ，６Ｓの保持時間を確認した。検出されたΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮＳとΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮ，６Ｓの合計面積に対するΔＵＡ，２Ｓ－ＧｌｃＮ，６Ｓの面積比を求めることにより、６－Ｏ－硫酸化を確認した。結果を図７に示す。
［実施例１１］ＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ－３－１３およびＯｒｉｇａｍｉ－Ｂ（ＤＥ３）／ＭＢＰ－６ＯＳＴ３＿ｐＧｒｏ７、ＲＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）を用いた２－Ｏ－硫酸化Ｎ－スルフォヘパロサンの６－Ｏ位、３－Ｏ位硫酸化反応試験
実施例１０で示された条件にて２２時間反応を行った。この間、反応開始３時間後に、実施例８で得られたＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）の凍結菌体を、凍結菌体重量が３３３ ｇ／Ｌとなるようそれぞれ蒸留水にて懸濁し調製された菌体懸濁液を６ｍｌ添加した。反応中適宜サンプリングを行い、反応液を取得した。実施例９と同様の手法を用いて、ＰＡＰＳの検出、定量を行った。結果を図８に示す。
反応終了後、反応液を遠心分離し、得られた上清を適当に希釈した後に、ＢＩＯＰＨＥＮ（商標） ＡＮＴＩ－ＩＩａ測定キット（ハイフェンバイオメド社製）を用いて抗ＩＩａ活性の測定を行い、３－Ｏ－硫酸化を確認した。また、ＲＩＬ／ＨＩＳ－３ＯＳＴ１＿ｐＧｒｏ（Ｓｍ）非添加のネガティブコントロールとして実施例１０の反応後溶液の抗ＩＩａ活性の測定も行った。検量線の作成にはＢＩＯＰＨＥＮ（商標） ＵＦＨ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ハイフェンバイオメド社製）を用いた。結果を表１に示す。
Figure 2023171870000003
［実施例１２］
実施例７で得られたＡＴＣＣ ６８７２（ＤＥ３）／ｐＳＣ３－１３の凍結菌体を、凍結菌体重量が３３３ｇ／Ｌとなるよう蒸留水にて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。こうして得られた菌体懸濁液３０ｍｌを２５０ｍｌ容培養槽中３０ｍｌの反応液［グルコース６０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ８．７５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌ、Ｄ－パントテン酸カルシウム ０．３ｇ／Ｌ、ニコチン酸 ０．２ｇ／Ｌ、アデニン４．０５ｇ／Ｌ、塩化ベンザルコニウム０．６２５ｇ／Ｌ、アデカノールＬＧ－１０９（アデカ社製） １ｍｌ／Ｌ、を含む水溶液］に添加し、３２℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量０．７５ｍＬ／分の培養条件下、２規定水酸化カリウム水溶液でｐＨを７．４に調整しつつ２２時間反応した。
この間、反応開始６時間後にグルコース６０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．１９ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３．７５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．０ｇ／Ｌ、アデニン２．７ｇ／Ｌとなるよう追加添加した。反応中適宜サンプリングを行い、反応液を取得した。
取得した反応液を適当に希釈したのち遠心分離し、島津製作所製のＨＰＬＣにてＵＶ検出器により２５４ｎｍの吸光度を測定することによりＰＡＰＳの検出、定量を行った。結果を図９に表わす。
以上の通り、グルコース、アデニン、硫酸マグネシウムなどを原料にＰＡＰＳを生産、再生できるコリネバクテリウム属細菌と硫酸化酵素を発現する原核生物に属する微生物を添加し、反応せしめることで、多糖類から硫酸化多糖を効率よく製造できた。
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。本出願は、２０２０年４月３日付けで出願された国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０１５３８８）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (2)

  1. ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、
    コリネバクテリウム属細菌の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子及びＡＰＳキナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ａ）又はその処理物と、
    原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入されたＣ５－エピメラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｂ）又はその処理物若しくは抽出物と、
    原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された２－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｃ）又はその処理物若しくは抽出物、
    原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された６－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｄ）又はその処理物若しくは抽出物および
    原核生物に属する微生物の形質転換体であって、少なくとも前記形質転換体に発現可能に導入された３－Ｏ－スルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｅ）又はその処理物若しくは抽出物から選ばれる少なくとも１と、を反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、硫酸化多糖の製造方法。
  2. ＡＴＰ又はＡＴＰ源、硫酸イオン源及びＮ－スルフォヘパロサンの存在下、
    前記形質転換体（ａ）又はその処理物と、前記形質転換体（ｂ）～（ｅ）又はそれらの処理物若しくは抽出物とを反応液に含有させて硫酸化多糖を生成する、請求項１記載の硫酸化多糖の製造方法。
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