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KR101203856B1 - 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산 - Google Patents

열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산 Download PDF

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KR101203856B1
KR101203856B1 KR1020110084712A KR20110084712A KR101203856B1 KR 101203856 B1 KR101203856 B1 KR 101203856B1 KR 1020110084712 A KR1020110084712 A KR 1020110084712A KR 20110084712 A KR20110084712 A KR 20110084712A KR 101203856 B1 KR101203856 B1 KR 101203856B1
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김진하
이영미
홍영호
김민회
김성보
박승원
오승현
오덕근
최진근
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씨제이제일제당 (주)
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Abstract

본 발명은 특정한 서열번호의 아미노산을 치환시킴으로써, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 사이코스 에피머화 효소 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합된 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소 변이체 또는 재조합 균주를 이용하여 제조된 고정화 반응기 및 상기 고정화 반응기를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산{D-psicose 3-epimerase variants improved thermostability and continuous production of D-psicose using the variants}
본 발명은 열 안정성을 향상시킨, 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.
D-사이코스(D-psicose)는 천연 물질 내에 거의 존재하지 않거나 또는 소량으로만 존재하기 때문에 희소당(rare sugar) 으로 알려져 있는 단당류로서, 초저열량이면서도 설탕과 유사한 정도의 단맛을 가지고 있어 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다.
사이코스는 과당(fructose)의 에피머로, 감미의 강도와 종류는 과당과 매우 유사하나, 과당과 달리 체내에서 거의 대사되지 않기 때문에 열량이 제로에 가깝고, 지질합성에 관여하는 효소의 활성을 억제하여 복부 비만을 감소시키는 효능을 갖기 때문에, 다이어트 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 설탕 대체 감미료로 널리 이용되고 있는 자일리톨 등과 같은 당 알코올류의 경우 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용을 일으키는 반면, 사이코스는 부작용이 거의 없는 것으로 알려져 있다(Matsue, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, 및 H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., 및 K. Izumori. 2004. D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127).
이와 같은 이유로 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다. 이처럼 사이코스 개발의 필요성이 대두됨에 따라, 종래 생물학적인 방법을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 다양한 연구가 진행되어 왔다. 과당을 사이코스로 전환시킬 수 있는 효소로는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소(D-psicose 3-epimerase) 및 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) 또는 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)유래의 타가토스 에피머화 효소가 알려져 있으며, 사이코스 에피머화 효소가 타가토스 에피머화 효소에 비해 높은 활성을 보이는 것으로 알려져 있다.
코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주는 L-라이신, L-트레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네박테리움 속 균주는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주이고, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다.
1) 대한민국등록특허공보 제10-0744479호 B1 (2007.08.01.공고) 2) 대한민국공개특허공보 제10-2011-0035805호 A (2011.04.06.공개)
본 발명자는 활성은 높으나 열 안정성이 매우 낮아 활용도가 떨어지는, 아그로 박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 문제점을 깨닫고, 이에 오늘날 중요한 식품 소재로 관심도가 높은 사이코스를 산업적으로 대량 생산할 수 있도록, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체를 발명하고 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산 방법을 발명하기에 이르렀다.
구체적으로, 본 발명은 특정한 서열번호의 아미노산을 치환시킴으로써, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 일 양태는 상기의 사이코스 에피머화 효소 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 재조합 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 효소 변이체 또는 재조합 균주를 이용하여 제조된 고정화 반응기 및 상기 고정화 반응기를 이용하여 사이코스를 연속적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 특정한 서열번호의 아미노산을 치환시킴으로써, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기의 사이코스 에피머화 효소 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 재조합된 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 효소 변이체 또는 재조합 균주를 이용하여 제조된 고정화 반응기 및 상기 고정화 반응기를 이용하여 사이코스를 연속적으로 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 과제 해결 수단을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 변이체로서, 아미노산 서열번호(이하, '서열번호') 33번이 이소루신(Ile)에서, 류신(Leu), 시스테인(Cys) 및 발린(Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 서열번호 213번이 세린(Ser)에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공한다.
상기 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 공지의 균주로써, 아그로박테리움 투머파시엔스 ATCC 33970을 사용할 수 있다.
상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소는 대한민국공개특허공보(A) 제10-2011-0035805호의 서열목록 1의 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 상기 "기능성 단편" 이란, 서열목록번호 1의 아미노산 서열에 일부 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실 등에 의한 변이를 포함하나, 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 갖는 단편을 의미한다.
상기 사이코스 에피머화 효소 변이체는, 상기의 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중, 특정 서열 번호의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 갖는 효소를 의미한다.
상기 사이코스 에피머화 효소 변이체는, 보다 바람직하게는, 서열번호 33번이 이소루신에서 류신으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 사이코스 에피머화 효소의 변이체는, 서열번호 33번이 이소루신에서, 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환되고, 서열번호 213번이 세린에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공한다.
상기 사이코스 에피머화 효소 변이체는, 보다 바람직하게는, 서열번호 33번이 이소루신에서 류신으로 치환되고, 서열번호 213번이 세린에서 시스테인으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 사이코스 에피머화 효소 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다(도 1).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-ATPE-2를 제공한다.
상기 재조합된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-ATPE-2는 부다페스트 조약에 따라 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 8월 18일자로 수탁번호 KCCM 11204P로 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 재조합된 코리네박테리움 글루타미쿰 pFIS-1-ATPE-2를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 재조합된 코리네박테리움 글루타미쿰 pFIS-1-ATPE-2를 고정화시킨 담체로 충진한 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는, 사이코스 생산용 고정화 반응기를 제공한다.
상기 "고정화 반응기"란, 사이코스를 생산하기 위한 반응이 담체에 고정화된 균주 또는 효소에 의해, 또는 담체에 고정화된 균주 또는 효소가 충진된 컬럼을 통해 일어나는 반응기를 의미한다. 즉, 고정화는 생물학적 활성을 제공하는 물질, 이 경우, 사이코스 에피머화 효소 또는 이를 포함하는 균주가 담체에 고정화되었다는 것을 의미한다.
상기 효소 변이체 또는 재조합 균주를 고정화시키는 담체는, 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 효소 또는 균주의 고정화 용도로 사용할 수 있는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산나트륨(sodium alginate)를
사용할 수 있다.
알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누론산(β-D-mannuronic acid) 및 글루론산(α-L-gluronic acid)으로 구성되며, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균체나 효소가 안정적으로 고정화될 수 있어 유리하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 고정화 반응기에 과당 용액을 공급하여 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "반감기"는 효소 또는 효소 변이체의 효소 반응 초기의 상대적 활성을 100으로 하였을 때, 상기 상대적 활성이 50이 되기까지 걸리는 기간을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "운전 안정성"은 목적 산물(본원에서는 사이코스)을 연속적으로 생산하기 위하여 반응기를 초기 활성 대비 적합한 수준의 생산성을 유지하면서 운전할 수 있는 것을 의미하며, 보통 운전 기간(시간 단위 등)으로 표시된다.
본 발명은 특정한 서열번호의 아미노산을 치환시켜서, 효소 활성은 저하되지 않으면서도 열 안정성은 현저히 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공함으로써, 오늘날 중요한 식품 소재로 각광받고 있는 사이코스를 보다 효율적으로 대량 생산해 낼 수 있도록 하는 이점을 갖는다.
구체적으로, 야생형 사이코스 에피머화 효소에 비하여 일반적인 효소 반응 온도에서 훨씬 연장된 반감기를 갖는 효소 변이체를 제공함으로써, 사이코스를 생산함에 있어서, 한번 만들진 사이코스 에피머화 효소를 보다 오랜 기간 동안 사용할 수 있도록 하여, 생산 시간 및 비용의 절감으로 생산 효율을 높여주는 이점을 갖는다.
또한, 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 발현할 수 있도록 재조합된 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 재조합 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-ATPE-2를 제공하고, 상기 효소 변이체 또는 상기 재조합 균주를 이용하여 고정화 반응기를 형성하여, 사이코스를 연속적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 이점을 갖는다.
도 1은 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 DSC(differential scanning calorimeter)를 이용한 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 야생형 및 변이체(S213C, I33L, 및 I33L-S213C)의 겉보기 융해 프로파일을 나타낸 그래프이다. 이 그래프의 피크 부분은 효소의 겉보기 융해온도를 나타낸다.
도 3은 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 야생형 및 변이체(S213C, I33L, 및 I33L-S213C)의 분자 모델링 결과를 나타내는 그림이다. (가) 및 (나)는 각각 야생형 및 I33L-S213C 변이체의 이차 구조를 나타낸 것이고, (다) 및 (라)는 각각 야생형 및 S213C 변이체의 아미노산 서열 213번째의 아미노산(야생형의 경우 세린(Ser), S213C 변이체의 경우 시스테인(Cys)) 주변의 추정상의 수소 결합을 나타낸 것이며, (마) 및 (바)는 각각 야생형 및 I33L 변이체의 방향족 그룹간의 상호 작용을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 양태에 따른 방법에 있어서, 변이체를 이용한 고정화 반응기의 반응 온도 50℃에서의 운전 안정성을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예 및 비교 시험예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 비교 시험예는 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소의 활성 측정 방법
사이코스 에피머화 효소의 활성은 과당을 기질로 이용하여 측정하였다. 20mM 기질이 함유된 50mM PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액 pH 8.0 중에 상기 효소 또는 상기 효소를 포함하는 시료를 첨가하고 50℃에서 10분간 반응시킨 후, 상기 반응액에 최종 농도가 200mM이 되도록 염산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 과당과 사이코스의 농도는 RI(Refractive Index) 검출기가 장착된 HPLC로 측정하였다. HPLC 분석은 80℃로 설정된 컬럼(BP-100 Ca2 +carbohydrate column)에 시료를 주입한 후 이동상 용매로 증류수를 0.5 ml/min의 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다. 효소 단위(unit)는 pH 8.0 및 50℃ 조건에서 분당 1 마이크로몰(μmole)의 사이코스를 생산하는 양으로 정의하였다.
실시예 1
무작위적인 변이를 일으키는 방법(random mutagenesis)에 의한, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체의 제조
아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens) ATCC 33970 유래의 사이코스 에피머화 효소(대한민국공개특허공보(A) 제10-2011-0035805호의 서열목록 1의 아미노산 서열과 동일)를 주형으로 하여 에러-프론 중합효소연쇄반응법(error-prone PCR)을 통하여 사이코스 에피머화 효소의 변이체 라이브러리를 구성하였다.
구체적으로, 1000개의 염기쌍 당 2 내지 3개의 변이가 일어나게 하는, 일반적인 PCR 돌연변이 유발 키트(PCR mutagenesis kit)를 이용하였다. NcoI 및 PstI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고 중합효소연쇄반응을 수행하여 사이코스 에피머화 효소의 변이체를 코딩하는 유전자 라이브러리를 구성한 다음, 이를 E. coli BL21에 삽입하였다.
상기 사이코스 에피머화 효소의 변이체 유전자를 포함하고 있는 pTrc99A 플라스미드를 가지고 있는 E. coli BL21을, 50μg/ml의 앰피실린을 함유하고 있는 LB배지에 접종하고 37℃에서 6시간 동안 배양한 다음, 이를 일부 취하여 50μg/ml의 앰피실린 및 0.1mM의 IPTG를 포함하고 있는 배지로 옮겨 37℃에서 6시간 동안 배양하여 효소의 발현을 유도하였다. 배양액을 60℃에서 5분간 열처리를 하고 최종 농도가 15mM이 되도록 과당을 넣어 50℃에서 30분간 반응시킨 다음, 일반적인 과당 분석 키트(fructose assay kit)를 이용하여 남아있는 과당의 양을 측정하여, 총 5000개의 변이주 중에서 야생형 효소와 비교할 때 약 1.2배의 활성을 보이는 변이주 150개를 선별하였다.
상기 선별된 150개의 변이주를 다시 상기와 같은 방법으로 효소의 발현을 유도하였다. 배양된 세포는 초음파 처리를 수행하여 파쇄하였고, 상기 세포 파쇄액을 원심분리하여 사이코스 에피머화 효소를 포함하는 상등액을 수득한 다음, 앞서 기술한 "사이코스 에피머화 효소의 활성 측정 방법"을 이용하여 이의 효소 활성을 측정하였다. 측정 결과, 55℃의 반응 온도에서 높은 반감기를 보이는 23종의 변이체를 재선별하였다.
재선별된 23종의 변이체의 유전자를 pTrc99A로부터 pET-24a(+)로 옮기고 이를 이용하여 E. coli BL21를 형질전환시켰다. 상기 재조합 균주 E. coli BL21를 50μg/ml의 카나마이신을 포함하는 LB배지를 이용하여 37℃에서 배양하였으며, OD600이 0.6이 되었을 때 최종농도 0.1mM이 되도록 IPTG(Isopropyl-beta-thiogalactopyranoside)를 주입하여 16℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수거한 후 300mM의 KCl 및 10mM 이미다졸을 포함하고 있는 50mM 인산염 완충용액에 재현탁하고, 상기 현탁액에 초음파 처리를 수행하여 세포를 파쇄시켰다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 사이코스 에피머화 효소를 포함하는 상등액을 수득하고 금속이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 효소 내의 이미다졸은 탈염 카트리지(desalting cartridge)를 이용하여 제거되었다.
재선별된 23종 변이체의 55℃에서의 반감기를 측정하여, 그 중 반감기가 가장 높은 변이체 5종을 선별하였다. 상기 선별된 5종의 변이체 및 야생형의, 상대 활성 및 55℃에서의 반감기는 하기 표 1에 나타낸다.
사이코스 에피머화 효소 상대 활성(%) 반감기(분)
야생형 100±0.5 10±2.3
S8T 29±0.5 15±0.3
I33L 88±3.3 64±0.2
G67C 8±0.0 132±0.4
V96A 51±0.5 18±0.2
S213C 103±0.4 28±0.7
반감기의 측정 결과, G67C > I33L > S213C > V96A > S8T의 순서로 높은 반감기를 보였으며, 이 중 효소의 활성까지 함께 고려할 때, I33L 및 S213C 두 종의 변이체를 가장 바람직한 변이체로 선정하였다.
여기서 I33L을 예로 들어 본원 명세서에서 사용된 효소 변이체의 명칭을 설명하면, 숫자 33은 사이코스 에피머화 효소 야생형을 기준으로 아미노산 서열의 33번째 아미노산이 치환되었다는 의미이고, 숫자 양 옆의 알파벳 I, L은 각각 아미노산의 머리글자를 의미하는 것으로, 이를 종합하면 I33L은 33번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 류신(Leu)으로 치환되었음을 의미하는 것이다.
실시예 2
경험적 설계 방법(rational design)에 의한, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체의 제조
상기 실시예 1에 따라, 열 안정성이 증가됨과 동시에 활성을 크게 저하시키지 않는 변이체로서 S213C와 I33L을 선정하였다. 이를 바탕으로 하여 아미노산 서열 33번과 213번에 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 수행하였다.
구체적으로, 극성이면서 전하를 가지지 않는 213번 세린(Ser)을, 극성이면서 전하를 가지지 않는 아미노산인 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met); 비극성 아미노산인 프롤린(Pro); 음전하를 띠는 잔기인 글루탐산(Glu); 및 양전하를 띠는 잔기인 라이신(Lys)으로 각각 치환하였다.
비극성 잔기인 33번 이소루신은 극성이면서 전하를 가지지 않는 잔기인 시스테인; 비극성 잔기인 발린(Val), 류신, 프롤린; 음전하를 띠는 잔기인 글루탐산; 양전하를 띠는 잔기인 라이신으로 각각 치환하였다.
상기 치환된 각각의 변이체 및 야생형의 상대적 활성 및 55℃에서의 반감기를 측정하였다.
그 결과 효소의 활성에 크게 영향을 주지 않으면서 열 안정성이 증가된 변이체로 I33L, I33C, I33V 및 S213C를 얻었다. 또한, S213C 및, 효소의 활성 및 열 안정성을 종합하여 볼 때 서열번호 33번의 치환 중 가장 바람직한 I33L을 조합한 변이체를 제작하여, 활성도 뛰어나면서 열 안정성이 현저히 증가된 사이코스 에피머화 효소 변이체(I33L-S213C)를 얻었다.
하기의 표 2는 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 야생형, 33번 또는 213번 아미노산이 치환된 변이체 및 33번과 213번 아미노산이 모두 치환된 변이체 I33L-S213C의 상대 활성 및 55℃에서의 반감기를 나타낸 것이다.
사이코스 에피머화 효소 상대 활성(%) 반감기(분)
야생형 100±0.5 10±2.3
I33L 88±3.3 63±0.2
I33C 83±2.0 24±0.6
I33V 92±2.2 12±0.4
I33E ND ND
I33K ND ND
I33P ND ND
S213C 103±0.4 28±0.7
S213P 95±0.9 6±0.2
S213T 68±0.3 5±0.1
S213M 22±1.9 3±0.3
S213E 19±0.0 3±0.1
S213K ND ND
I33L-S213C 74±1.1 265±2.3
비교 시험예 1
사이코스 에피머화 효소 야생형 및 실시예 2에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체의 겉보기 융해 온도의 비교
사이코스 에피머화 효소 야생형과 실시예 2에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체인 I33L, S213C 및 I33L-S213C의 열 안정성을 판단하기 위해, 각각의 효소(또는 변이체)의 겉보기 융해 온도(apparent melting temperature(Tm))를 측정하였다.
측정 결과, 야생형 < S213C < I33L < I33L-S213C의 순서로 겉보기 융해 온도가 증가함을 확인할 수 있었다(도 2). 구체적으로, 야생형과 비교하여, S213C의 경우 약 3.1oC, I33L의 경우 약 4.3oC, I33L-S213C의 경우 약 7.6℃ 증가된 겉보기 융해 온도를 보였다.
비교 시험예 2
사이코스 에피머화 효소 야생형 및 실시예 2에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체의 효소 반응 속도의 비교
사이코스 에피머화 효소 야생형 및 실시예 2에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체인 I33L, S213C 및 I33L-S213C의 효소 반응 속도를 측정하기 위하여, 각각의 효소(또는 변이체)를 반응 온도 50℃에서 효소의 동적 매개변수(kinetic parameters) 값을 계산하였다.
그 측정 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
사이코스 에피머화 효소 Km(mM) kcat(min-1) kcat/Km
야생형 44±0.4 4338±6 99±0.9
S213C 42±1.0 4194±63 101±3.0
I33L 40±0.7 4240±65 105±2.5
I33L-S213C 31±0.1 4135±99 134±3.2
각 효소의 동적 매개 변수 값을 측정한 결과, 야생형 및 변이체 I33L, S213C는 유사한 값을 보인 반면, I33L-S213C는 이보다 약 1.4배 증가된 효소 촉매 효율(kcat/Km)을 보였다. 그 이유는 I33L-S213C가 다른 변이체나 야생형에 비해 추가적인 수소 결합을 형성하고, 야생형에서는 발견할 수 없었던 방향족 그룹간의 새로운 쌓임 상호작용을 형성하기 때문에, 이로 인하여 더욱 단단하고 조밀한 구조가 형성된 결과, 기질과의 친화도가 증가하게 되기 때문이라고 판단된다(도 3).
보다 구체적으로 설명하자면, 분자 모델링 결과에 비추어 볼 때 효소의 활성부위가 아닌 표면에 위치하고 있는 아미노산 잔기인 213번 세린 및 33번 이소루신을 가진 야생형과 달리, I33L-S213C에서는 213번 시스테인(Cys)과 33번 류신(Leu)이 coiled-coil 상호 작용을 형성하고 있음을 알 수 있었다(도 3의 (가), (나)). 이와 같은 coiled-coil 상호 작용은 단백질의 구조를 안정하게 만든다고 알려져 있다.
또한, 야생형에서 213번 세린은 두 개의 추정상의 수소 결합(putative hydrogen bond)을 형성하나, 이를 시스테인으로 치환시킨 S213C의 경우, 추정상의 수소 결합이 여섯 개로 증가함을 알 수 있었다(도 3의 (다), (라)). 이 역시 단백질의 구조를 더욱 조밀하게 만들어 열 안정성을 증가시킬 수 있게 도와주는 역할을 한다고 판단된다.
또한, 분자 모델에서 야생형은 방향족 그룹간의 상호 작용을 가지고 있지 않는 것으로 보이는 반면, 변이체 I33L에서는 방향족 그룹간의 쌓임 상호 작용이 나타남을 확인할 수 있었다(도 3의 (마), (바)). 이러한 방향족 그룹간의 쌓임 상호작용 또한 열 안정성을 증가시킨 요인으로 판단된다.
실시예 3
실시예 2에 따른 I33L-S213C 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 균주의 제조 및 배양
(1) 재조합 균주의 제조
상기 실시예 2에 따른 I33L-S213C 변이체의 DNA를 주형으로 하고, 각각 PstI과 XbaI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합연쇄반응을 통해 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 사이코스 에피머화 효소를 대량 발현하기 위하여, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 박테리아에서 유래된 셔틀벡터pCJ-1(2004년 11월 6일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁, 수탁번호 KCCM-10611)에 제한 효소 PstI과 XbaI으로 절단된 상기 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 재조합 발현 벡터 pFIS-1-ATPE-2(도 1)를 제작하였다. 재조합 발현 벡터를 전기천공을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032에 형질전환에 의해 도입하여 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 재조합 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-ATPE-2라 명하고, 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2011년 8월 18일자로 수탁번호 KCCM 11204P로 기탁하였다.
(2) 재조합 균주의 배양
상기 (1)에서 얻어진 재조합 균주를 각각 10㎍/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10g/L, Bacto-yeast extract 5g/L, NaCl 5g/L, Soytone 5g/L)에 초기 농도 OD600 = 0.1로 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 사이코스 에피머화 효소 변이체의 발현을 유도하였다. 상기에서 수득된 배양액을 10㎍/ml 농도의 카나마이신을 함유한 변이 배지(포도당 8 g/L, 소이톤(soytone) 20g/L, (NH4)2SO4 10g/L, KH2PO4 1.2g/L, MgSO4 1.4g/L)를 담은 발효기에 OD600 = 0.6으로 접종하고 30℃에서 20시간 동안 배양하였다.
실시예 4
실시예 3에 따른 재조합 균주의 고정화 및 고정화 반응기를 통한 사이코스의 연속적 제조
상기 실시예 3에 따라 재조합 균주를 배양한 후, 상기 배양액의 원심분리에 의해 균체를 회수하고, 회수된 세포가 20%가 되도록 50 mM EPPS 완충 용액(pH 8.0)에 현탁시켰다. 상기 현탁된 재조합 균주의 균체를 2%(v/v)의 알긴산나트륨(sodium alginate) 수용액에 첨가하고, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 이용하여 100 mM CaCl2 용액에 떨어뜨려 균체가 알긴산나트륨의 비드에 포집된 균체-알기네이트 결합체를 생성시켰다. 알긴산나트륨에 고정화된 상기 재조합 균주를 충진상 컬럼(packed-bed column) 에 충진하여 형성된 고정화 반응기를 통하여 사이코스를 연속적으로 제조하였다.
비교 시험예 3
사이코스 에피머화 효소 야생형을 사용한 고정화 반응기 및 실시예 4에 따른 고정화 반응기의 운전 안전성 비교
사이코스 에피머화 효소 야생형을 사용한 고정화 반응기 및 실시예 4에 따른 고정화 반응기의 운전 안전성을 측정하기 위하여, 반응 온도를 50℃로 고정하고 각각의 반응기를 통해 두 달간 연속적으로 사이코스 생산을 실시하여 그 활성을 측정하였다. 이 때 과당의 농도는 480g/L이며 유속은 850ml/h 였다.
측정 결과, 야생형을 사용한 고정화 반응기에 비해, 열 안정성 및 효소 활성이 향상된 변이체를 사용한 고정화 반응기의 경우 두 달 이상 높은 운전 안정성을 유지하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 야생형을 사용한 고정화 반응기의 경우 약 30일의 반감기를 가지나, I33L-S213C 변이체를 사용한 고정화 반응기의 경우에는 약 77일의 반감기를 가지는 것으로 나타났다(도 4).
이로써 본 발명에 의할 경우 효소를 보다 장기간 사용할 수 있게 되어 사이코스의 생산 비용을 절감시키는 효과를 가져올 것으로 기대된다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11204P 20110818

Claims (8)

  1. 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 변이체로서, 아미노산 서열번호(이하, '서열번호') 33번이 이소루신(Ile)에서, 류신(Leu), 시스테인(Cys) 및 발린(Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 서열번호 213번이 세린(Ser)에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체.
  2. 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 변이체로서, 서열번호 33번이 이소루신에서, 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환되고, 서열번호 213번이 세린에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제3항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) pFIS-1-ATPE-2.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법.
  6. 제4항에 따른 재조합된 코리네박테리움 글루타미쿰 pFIS-1-ATPE-2를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 고정화시킨 담체로 충진한 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는, 사이코스 생산용 고정화 반응기.
  8. 제7항에 따른 상기 고정화 반응기에 과당 용액을 공급하여 사이코스를 생산하는 방법.






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