KR101455624B1 - 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 - Google Patents
기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 생산방법에 관한 것으로서, 과당을 사이코스로 효율적으로 전환하여 사이코스를 생산할 수 있는 장점을 가지고 있다.
Description
본 발명은 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 생산방법에 관한 것이다.
사이코스(D-psicose)는 과당(D-fructose)의 C-3 에피머(epimer)로서, 자연계에 매우 드물게 극소량이 존재하는 단당류이다. 배당체인 사이코푸라닌(psicofuranine)의 당부분에서 유래되었으며, 커피나 식탁용 소스, 무화과 등에도 소량 발견되기도 한다. 특히 우수한 감미질과 설탕 대비 70%의 당도를 지니면서도 설탕 대비 0.3%의 에너지를 내는 특징은 매우 중요한 장점 중의 하나이며 당알코올류인 자일리톨, 만니톨, 말티톨, 소르비톨 등과 달리 과량 섭취에 따른 설사와 같은 부작용도 없다(Food Sci Technol Res 12:137-143, 2006).
최근 이를 이용한 기능성에 관련한 보고에 비하여, 양산과 관련한 기술이 개발되지 않아서 이에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 기존의 사이코스 생산은 주로 화학적 기술에 기반하였다. Bilik 등(Chem Zvesti 28:106-109, 1973)은 몰리브산 이온의 촉매 작용을 통하여 과당으로 사이코스를 생산하였으며 McDonald(Carbohydr Res 5:106-108, 1967)는 화학적 기법을 이용하여 1,2:4,5-di-o-isopropylidene-beta-D-fructopyranose를 사이코스로 전환하여 생산하였고, Doner(Carbohydr Res 70:209-216, 1979)는 과당을 에탄올과 트리에틸아민(triethylamine)과 함께 끓여 사이코스의 생산을 시도하였다. 그러나 이러한 화학적 기술은 많은 생산비용과 정제비용이 발생되며 생산물의 안전성 등에서 문제가 있어 왔다.
이에 생물학적 방법 특히, 효소의 촉매 작용을 이용한 생산 기술들이 꾸준히 연구되어 왔다. Ishida 등(J Ferment Bioeng 83:529-534, 1997)은 슈도모나스 치코리(Pseudomonas cichorii) ST-24의 타가토스(tagatose) 에피머화 효소를 이용한 사이코스의 생산을 확인하였다. 대한민국 특허등록 제0744479호(발명의 명칭: 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산방법)에는 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 이용한 사이코스의 생산방법이 게시되어 있다. 대한민국 특허등록 제0832339호(발명의 명칭: 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 균주와 이를 이용한 사이코스 생산법)에는 시노리조비움 속(Sinorhizobium sp.) YB-58 균주의 배양 및 배양된 균체를 이용한 사이코스의 생산방법이 게시되어 있다. Zhang 등(Biotechnol Lett 31:857-862, 2009)은 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)의 D-타가토스-3-에피머화 효소를 이용한 사이코스의 생산을 보고하였으며, Mu 등(J Agric Food Chem 59:7785-7792, 2011)은 클로스트리디움 셀룰로라이티쿰(Clostridium cellulolyticum) H10 균주의 D-사이코스-3-에피머화 효소의 사이코스 생산과 관련한 특성을 보고하였다.
이에 본 발명자들은 생물학적 기술을 기반으로 하는 희귀당의 효율적 생산에 소용되는 효소 자원의 탐색을 통하여 기존에 알려진바 없는 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 통한 사이코스의 효율적 생산을 확인하였으며 이를 통하여 사이코스를 생산하는 새로운 효소와 생산방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 사이코스(D-psicose) 전환능을 지닌 신규 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase) 및 이를 이용하여 과당을 사이코스(D-psicose)로 전환하여 사이코스를 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 균주로부터 유래한 서열번호 2의 아미노산서열을 포함하는 사이코스(D-psicose) 전환능을 지닌 신규 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase) 및 이를 이용하여 과당을 사이코스(D-psicose)로 전환하여 사이코스를 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 상세한 설명 중 사용되는 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적 지식을 가진 자가 이해하고 있는 통상적 의미를 가진다.
한편, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하였다.
본 발명은 현재 특성이 규명되지 않은 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 슈가 에피머화 효소(sugar epimerase) 가상 단백질(hypothetical protein)의 유전자(서열번호 1)를 클로닝하고 상기 유전자를 포함하는 단백질 발현벡터를 제작한 후 해당 발현벡터를 통하여 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 슈가 에피머화 효소를 과발현시킨 후 효소의 특성 확인을 통하여 상기 슈가 에피머화 효소의 우수한 과당:사이코스 간의 전환 활성을 확인하였고, 상기 슈가 에피머화 효소의 사이코스-3-에피머화 활성을 통하여 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 그 기능이 규명된 사이코스-3-에피머화 효소는 종래의 사이코스-3-에피머화 기능성이 보고된 효소들의 아미노산 서열과는 매우 낮은 상동성을 보이고 있다. 즉, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 사이코스-3-에피머화 효소(ZP 08527376)와는 49%, 클로스트리디움 셀룰로라이티쿰(Clostridium cellulolyticum)의 사이코스-3-에피머화 효소(YP 002505284)와는 53%, 슈도모나스 치코리(Pseudomonas cichorii)의 사이코스-3-에피머화 효소(O 50580)와는 38%, 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)의 타가토스-3-에피머화 효소(YP 355181)와는 32%의 상동성을 보이는데 불과하다.
본 발명의 사이코스-3-에피머화 효소의 특성 규명은 아래와 같이 이루어지는 것이 바람직하다. 사이코스의 생산에 사용 가능한 효소 단백질의 탐색 중에 본 사이코스-3-에피머화 효소의 유전자를 지닌 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 균주로부터 해당 유전자의 PCR(polymerase chain reaction)을 통하여 유전자의 증폭된 산물을 얻는다. 다음으로, 얻어진 유전자의 증폭 산물을 적절한 단백질 발현벡터에 삽입시켜 사이코스-3-에피머화 효소를 포함하는 재조합 단백질 발현벡터를 제작하고, 본 재조합 단백질 발현벡터로 적절한 미생물을 형질전환시키고 본 발명의 효소의 발현을 위한 발효 배지에서 배양 후 과발현된 효소를 정제하여 금속 조효소, 최적 pH, 최적 온도 등을 확인하는 데에 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 사이코스 생성능을 지닌 사이코스-3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에 국한되지 않으며, 과당을 사이코스로 전환시켜줄 수 있는 경우 서열번호 1에서 일부 아미노산을 치환(substitution), 삽입(insertion), 소실(deletion)시킨 경우에도 사용이 가능하다.
본 발명의 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 유래의 신규의 사이코스-3-에피머화 효소는 사이코스를 대량 생산하는 과정에 있어서 친환경적이고 생산성에 있어 유용성을 나타내며, 효소 개량을 위한 유용한 유전자원으로 이용될 수 있는 장점을 가지고 있다.
도 1은 서열번호 1의 사이코스-3-에피머화 효소의 정제 과정 중에 분획들 중 이미다졸 농도가 각각 50mM(lane 3), 150mM(lane 4), 250mM(lane 5), 1000mM(lane 6)인 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 것을 도식화한 것이다. lane 1은 정제전 세포파쇄액, lane 2는 정제전 세포파쇄액의 정제 레진 통과 후 용액(Flow-through)을 나타낸다.
도 2는 서열번호 1의 정제 분획을 이용한, 과당에서 사이코스로의 전환활성을 HPLC 크로마토그램으로 분석한 것이다.
도 3은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3의 각각에 해당하는 사이코스-3-에피머화 효소를 대장균체에서 발현시킨 후, 해당 대장균을 파쇄시킨 용액과 과당을 반응시킨 반응액 상의 사이코스 생성 유무를 박층형크로마토그래피(TLC)를 이용하여 확인한 결과이다(a: 세포파쇄액, b: 세포파쇄액 중 원심분리 후 상층액, c: 세포파쇄액 중 원심분리 후 펠렛).
도 4는 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 정제 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 것을 도식화한 것이다(M: 단백질 크기 마커, CL: 서열번호 2가 발현된 대장균 파쇄액의 원심분리 후 상등액, FT: CL의 컬럼 통과 후 용액, 50, 100, 250: 컬럼 세척(50mM) 및 목적 단백질의 용출(100mM, 250mM)에 사용된 이미다졸의 농도, f1~f8: 위에 표시된 이미다졸 농도에 따라 용출된 효소의 분획 번호).
도 5는 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 온도 특성을 확인한 결과이다.
도 6은 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 pH 특성을 확인한 결과이다.
도 7은 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 금속이온 요구 특성을 확인한 결과이다.
도 2는 서열번호 1의 정제 분획을 이용한, 과당에서 사이코스로의 전환활성을 HPLC 크로마토그램으로 분석한 것이다.
도 3은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3의 각각에 해당하는 사이코스-3-에피머화 효소를 대장균체에서 발현시킨 후, 해당 대장균을 파쇄시킨 용액과 과당을 반응시킨 반응액 상의 사이코스 생성 유무를 박층형크로마토그래피(TLC)를 이용하여 확인한 결과이다(a: 세포파쇄액, b: 세포파쇄액 중 원심분리 후 상층액, c: 세포파쇄액 중 원심분리 후 펠렛).
도 4는 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 정제 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 것을 도식화한 것이다(M: 단백질 크기 마커, CL: 서열번호 2가 발현된 대장균 파쇄액의 원심분리 후 상등액, FT: CL의 컬럼 통과 후 용액, 50, 100, 250: 컬럼 세척(50mM) 및 목적 단백질의 용출(100mM, 250mM)에 사용된 이미다졸의 농도, f1~f8: 위에 표시된 이미다졸 농도에 따라 용출된 효소의 분획 번호).
도 5는 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 온도 특성을 확인한 결과이다.
도 6은 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 pH 특성을 확인한 결과이다.
도 7은 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 금속이온 요구 특성을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
사이코스-3-에피머화 효소의 생산
사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase)의 확보를 위하여 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) KCTC 5430 균주를 생명공학연구원 생명자원센터에서 분양받았다. 사이코스-3-에피머화 효소를 암호화하는 유전자를 확보하기 위하여 클로스트리디움 볼티에의 유전체(genomic DNA)를 토대로 클로스트리디움 볼티에 ATCC BAA-613의 슈가 에피머화 효소를 암호화하는 것으로 제안된 유전자의 염기서열(CLOBOL_00069)을 기본으로 프라이머(primer)를 설계하고 PCR을 통하여 증폭하였다. 상기 얻어진 증폭산물은 염기서열 제한효소(restriction enzyme)인 BamHI과 SacI을 이용하여 단백질 발현벡터인 pET-21a(+)(Novagen사)에 삽입되었다. 이렇게 얻어진 사이코스-3-에피머화 효소의 재조합 발현벡터인 pET21/CbDPE는 ㈜코스모진텍(서울)을 통하여 염기서열 시퀀싱(sequencing) 작업을 거쳐 예상되는 효소의 발현에 적합하게 제작되었음이 확인되었다. 상기 제작된 발현벡터 pET21/CbDPE는 통상적인 형질전환 방법을 통하여 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) 균주를 형질전환 시키는데 사용되었다. 형질전환된 BL21(DE3) 균주는 LB 배지 내에서 배양한 뒤 글리세롤을 이용하여 냉동보관하였다.
사이코스-3-에피머화 효소를 생산하기 위하여 냉동 보관된 BL21(DE3) 균주는 LB 한천배지에 도말 및 배양한 후 적절한 집락을 선택하여 재조합 벡터의 단백질 발현이 자연유도(autoinduction)가 이루어지는 배지인 MagicMedia(Invitrogen사) 액체 배지에 접종되었다. MagicMedia의 사용설명서에 따라 30℃에서 250rpm의 교반 속도로 24시간 동안 배양하여 BL21(DE3) 균주의 생장과 단백질 대량 발현을 자연유도 하였으며 배양이 종료된 후 600nm에서의 흡광도 값은 5.8이었다. 배양이 끝난 후 사이코스-3-에피머화 효소의 과발현 여부를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동법을 이용하여 확인하였다.
<실시예 2>
사이코스-3-에피머화 효소의 정제
원심분리를 통하여 상기 실시예 1의 배양된 BL21(DE3) 균체를 회수하고 20mM 트리스(tris) 완충용액을 이용하여 잔여 배지를 세척하였다. 세척된 균체를 재조합 대장균 균체의 파쇄완충용액인 벅버스터 마스터믹스(BugBuster Mastermix, Novagen사)에 현탁하고 상온에서 5분간 반응 후, 얼음에서 30분간 추가로 반응시켜 대장균 균체를 파쇄시켰다. 상기 세포 파쇄물을 4℃, 15,000 X g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.20㎛의 필터로 여과하고 단백질 결합완충용액(20mM TrisHCl, 500mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.9)으로 평형된 컬럼에 통과시켜 정제 작업을 수행하였다. 이때 사용된 컬럼의 충진제는 니켈-나이트릴로트리아세틱산 아가로스(Ni-NTA agarose)였다. 상층액 내의 사이코스-3-에피머화 효소가 결합된 컬럼을 이미다졸(imidazole) 농도가 각각 50mM(lane 3), 150mM(lane 4), 250mM(lane 5), 1000mM(lane 6)로 조절된 단백질 결합완충용액을 이용하여 세척과 용출(elution)을 시도하였다. 컬럼을 통과한 후 모인 분획물의 정제 결과를 SDS-PAGE 전기영동법을 이용하여 확인하여 높은 순도의 사이코스-3-에피머화 효소가 포함된 분획을 수득하여 사용하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다단계의 정제를 하였으나 이미다졸(imidazole) 농도가 250mM로 조절된 단백질 결합완충용액으로 용출한 분획물의 SDS-PAGE의 결과 lane 5에서 화살표로 표시된 유사한 크기의 3종의 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
사이코스-3-에피머화 효소를 이용한 과당의 사이코스로의 전환
상기 실시예 2에서 정제된 3종의 사이코스-3-에피머화 효소의 과당-사이코스 간의 전환활성을 살펴보았다. 2중량%의 과당과 1mM의 염화망간, 75mM의 인산나트륨 버퍼(pH 7.4)로 구성된 반응액 500㎕에 상기 실시예 2의 정제된 3종의 사이코스 3-에피머화 효소 20㎕를 넣고 37℃에서 30분간 반응을 진행하였다. 반응물을 여과한 후, SP0810 컬럼(Shodex사)을 이용하여 굴절율 검출기(refractive index detector)가 장착된 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 장치를 이용하여 분석하였다. 분석 조건은 컬럼오븐의 온도는 80℃이고, 증류수를 분당 1.0㎖의 속도로 흘려보내도록 설정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 반응 전 과당만이 존재하였으나, 반응을 진행한 후 약 17%의 과당이 사이코스로 전환됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
사이코스-3-에피머화 효소의 N 말단 축소형 효소의 생산
상기 실시예 2의 정제된 3종의 단백질로 발현되는 사이코스-3-에피머화 효소의 발현 양태를 단일화시키기 위하여 사이코스-3-에피머화 효소의 아미노산 서열(서열번호 1)을 분석한 결과(개시 아미노산인 Met 이후 아미노산 서열을 읽어가면서 개시 아미노산으로부터 멀지 않은 곳에 위치한 다른 Met들을 찾아보았다. 정확히 기전이 알려져 있지는 않으나, read-through를 통해서 두 번째 혹은 세 번째 Met에서도 아미노산 합성이 개시되거나, 두 번째 또는 세 번째 Met 앞 부분이 잘려나가지는 경우가 있어서 아미노산 서열을 차례로 읽어보았다)를 토대로 N 말단 부위를 축소한 두 가지 형태[서열번호 2:서열번호 1의 N말단에서 10개의 아미노산(MRYFKEEVAG)을 결실, 서열번호 3:서열번호 1의 N말단에서 31개의 아미노산(MRYFKEEVAGMKYGIYFAYWTKEWFADYKKY)을 결실]의 사이코스 3-에피머화 효소를 클로닝하고 발현시켰다.
즉, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3에 해당하는 각각의 사이코스-3-에피머화 효소를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균체에서 발현시킨 후, 해당 대장균을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 파쇄시킨 용액과 2% 과당용액을 37℃에서 30분간 반응시키고 반응액 상의 사이코스 생성 유무를 박층형 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 확인하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3의 각각의 사이코스 3-에피머화 효소 모두 과당에서 사이코스로의 전환활성을 가짐을 알 수 있었다.
<실시예 5>
사이코스-3-에피머화 효소의 반응 온도 및 pH 특성 확인
상기 실시예 4의 서열번호 2로 표시되는 사이코스 3-에피머화 효소가 단일 단백질 형태이고 발현 양상도 우수하여 상기 실시예 4의 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 특성을 확인하기 위하여 온도 조건과 pH 조건을 달리하며 최적 반응 조건을 알아보았다.
5-1. 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 정제
효소특성 확인 작업을 위한 효소의 정제는 상기 실시예 2에서 언급한 것과 유사하게 분획별 이미다졸의 용출 농도차이를 이용하여 정제하였다.
즉, 원심분리를 통하여 상기 실시예 4의 배양된 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소로 형질전환된 BL21(DE3) 균체를 회수하고 20mM 트리스(tris) 완충용액을 이용하여 잔여 배지를 세척한 후, 세척된 균체를 재조합 대장균 균체의 파쇄완충용액인 벅버스터 마스터믹스(BugBuster Mastermix, Novagen사)에 현탁하고 상온에서 5분간 반응 후, 얼음에서 30분간 추가로 반응시켜 대장균 균체를 파쇄시켜 상기 세포 파쇄물을 4℃, 15,000 X g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.20㎛의 필터로 여과하고 단백질 결합완충용액(20mM TrisHCl, 500mM NaCl, 5mM imidazole, pH 7.9)으로 평형된 컬럼에 통과시켜 정제 작업을 수행하였다. 이때 사용된 컬럼의 충진제는 니켈-나이트릴로트리아세틱산 아가로스(Ni-NTA agarose)였다. 상층액 내의 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소가 결합된 컬럼을 이미다졸(imidazole) 농도가 각각 50mM, 150mM, 250mM, 1000mM로 조절된 단백질 결합완충용액을 이용하여 세척과 용출(elution)한 분획물을 SDS-PAGE 전기영동법을 통하여 확인하고, 높은 순도의 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소 분획의 정제도를 확인하고 이후 반응에 사용하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와같이, 서열번호 2의 사이코스 3-에피머화 효소는 싸이즈 마커와의 비교를 통해서 목적하는 단백질이 32~35kDa의 위치에 나타나는 것을 알 수 있고, 단일 밴드로 발현이 되는 것을 확인할 수 있어 단일 단백질 형태이고 발현 양상도 우수하다는 사실을 알 수 있었다.
5-2. 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 온도 특성
특성을 확인하고자 하는 온도로 미리 맞춰 조정된 효소 반응액(2중량% 과당, 1 mM 코발트 2가 양이온, 50mM 인산나트륨 완충용액, pH 7.5) 995㎕에 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소 분획 5㎕를 넣고 30, 40, 50, 60, 70℃에서 각각 5분간 효소 반응을 수행하였으며, 반응 후 반응액을 10분간 끓여서 반응을 종료시켰다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최적 반응 온도는 60℃이며, 이는 비교적 고온에서 활성이 높게 나타난 것으로 대량 생산시 고온 반응에 따른 유동성 및 반응 평형의 측면에서 유의적으로 향상된 결과를 갖게 됨을 알 수 있었다.
5-3. 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 반응 pH 특성
반응 최적 pH 조건은 상기 온도 조건을 확인한 실험과 마찬가지의 조건에서 pH만 인산나트륨 완충용액과 트리스 완충용액을 이용하여 조정한 후 60℃에서 반응을 진행하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최적 pH는 7.5이나 pH 6.5~pH 8.0 사이에서 pH 7.5 대비 85% 전후의 활성을 보여주었다. 이러한 넓은 pH 적응성은 온도 변화나 첨가되는 기질에 따른 pH 변화에도 우월한 반응 적응성을 보여줌을 알 수 있었다.
<실시예 6>
사이코스-3-에피머화 효소의 금속이온 요구 특성 확인
본 발명의 서열번호 2의 사이코스-3-에피머화 효소의 금속이온 요구 특성을 확인하기 위하여 1mM의 동일 농도로 금속이온을 바꾸어가며 실험을 진행하였다. 시험방법은 실시예 5에서 온도 조건을 탐색하기 위한 효소 반응액에 금속 이온만을 바꾸어가며 실험하였다. 바륨(Ba), 칼슘(Ca), 코발트(Co), 구리(Cu), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 니켈(Ni), 아연(Zn)과 같은 금속이온과 금속이온을 넣지 않은 반응액을 이용하여 실험을 진행하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 코발트에서 가장 높은 활성(무처리 대비 8.1배)을 나타냄을 확인할 수 있었다.
<110> KOREA YAKULT CO., LTD.
<120> Novel D-psicose-3-epimerase from Clostridium bolteae having
production of functional rare sugar D-psicose and production
method of D-psicose using thereof
<130> P13-10
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> D-psicose-3-epimerase from Clostridium bolteae
<400> 1
Met Arg Tyr Phe Lys Glu Glu Val Ala Gly Met Lys Tyr Gly Ile Tyr
1 5 10 15
Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Phe Ala Asp Tyr Lys Lys Tyr Met
20 25 30
Asp Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Asp Val Leu Glu Ile Ser Cys Ala
35 40 45
Ala Leu Arg Asp Val Tyr Thr Thr Lys Glu Gln Leu Ile Glu Leu Arg
50 55 60
Glu Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Val Leu Thr Ala Gly Tyr Gly Pro
65 70 75 80
Thr Lys Ala Glu Asn Leu Cys Ser Glu Asp Pro Glu Ala Val Arg Arg
85 90 95
Ala Met Thr Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro Lys Leu Gln Leu Met Asp
100 105 110
Ile His Ile Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser Tyr Trp Pro Val Asp Phe
115 120 125
Thr Ile Asn Asn Asp Lys Gln Gly Asp Arg Ala Arg Ala Val Arg Asn
130 135 140
Leu Arg Glu Leu Ser Lys Thr Ala Glu Glu Cys Asp Val Val Leu Gly
145 150 155 160
Met Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr Ile Leu Asn Thr Cys Glu
165 170 175
Glu Ala Ile Asp Phe Val Asp Glu Ile Gly Ser Ser His Val Lys Ile
180 185 190
Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Thr Asn Met Ala Asp
195 200 205
Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Gly His Leu His Leu Gly Glu
210 215 220
Gln Asn Arg Leu Val Pro Gly Lys Gly Ser Leu Pro Trp Ala Glu Ile
225 230 235 240
Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln Gly Ala Ala Val Met Glu
245 250 255
Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Ile Gly Ser Glu Ile Lys Val Trp
260 265 270
Arg Asp Met Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Asp Arg Asp Ala
275 280 285
Lys Gly Ala Leu Glu Phe Cys Arg His Val Phe Gly Ile
290 295 300
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> D-psicose-3-epimerase from Clostridium bolteae
<400> 2
Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Phe Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Lys Tyr Met Asp Lys Val Ser Ala Leu Gly Phe Asp Val
20 25 30
Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Arg Asp Val Tyr Thr Thr Lys Glu
35 40 45
Gln Leu Ile Glu Leu Arg Glu Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Leu Val Leu
50 55 60
Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Thr Lys Ala Glu Asn Leu Cys Ser Glu Asp
65 70 75 80
Pro Glu Ala Val Arg Arg Ala Met Thr Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro
85 90 95
Lys Leu Gln Leu Met Asp Ile His Ile Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Pro Val Asp Phe Thr Ile Asn Asn Asp Lys Gln Gly Asp Arg
115 120 125
Ala Arg Ala Val Arg Asn Leu Arg Glu Leu Ser Lys Thr Ala Glu Glu
130 135 140
Cys Asp Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr
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Ile Leu Asn Thr Cys Glu Glu Ala Ile Asp Phe Val Asp Glu Ile Gly
165 170 175
Ser Ser His Val Lys Ile Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Thr Asn Met Ala Asp Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Gly
195 200 205
His Leu His Leu Gly Glu Gln Asn Arg Leu Val Pro Gly Lys Gly Ser
210 215 220
Leu Pro Trp Ala Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Ala Ala Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Ile Gly
245 250 255
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Ala Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Cys Arg His Val
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<223> D-psicose-3-epimerase from Clostridium bolteae
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Arg Ala Met Thr Phe Phe Lys Asp Leu Leu Pro Lys Leu Gln Leu Met
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Asp Ile His Ile Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser Tyr Trp Pro Val Asp
85 90 95
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Trp Arg Asp Met Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Asp Arg Asp
245 250 255
Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Cys Arg His Val Phe Gly Ile
260 265 270
Claims (5)
- 서열번호 1의 아미노산서열로 이루어진 사이코스(D-psicose) 전환능을 지닌 신규 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase).
- 제1항에 있어서,
상기 사이코스-3-에피머화 효소는 클로스트리디움 볼티에(Clostridium bolteae) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase).
- 제1항 또는 제2항의 사이코스-3-에피머화 효소를 이용하여 과당을 사이코스(D-psicose)로 전환하여 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이코스의 생산방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 사이코스-3-에피머화 효소는 서열번호 2의 아미노산서열로 이루어진 사이코스(D-psicose) 전환능을 지닌 신규 사이코스-3-에피머화 효소(D-psicose-3-epimerase).
- 제4항의 사이코스-3-에피머화 효소를 이용하여 과당을 사이코스(D-psicose)로 전환하여 사이코스를 생산하는 것을 특징으로 하는 사이코스의 생산방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130040400A KR101455624B1 (ko) | 2013-04-12 | 2013-04-12 | 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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