KR101944104B1

KR101944104B1 - 마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR101944104B1
Application number: KR1020170069265A
Authority: KR
Inventors: 박부수; 한은진; 이상희; 권순규; 김진하; 박종진
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2019-01-30
Anticipated expiration: 2037-06-02
Also published as: CN110832065A; WO2018221815A1; MX2019012882A; CN110832065B; EP3633023A4; JP2020516304A; EP3633023B1; JP6934066B2; KR20180132393A; US11859226B2; US20200263216A1; EP3633023A1

Abstract

본 발명은 신규하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

Description

마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 {Strain of Microbacterium genus and method for producing psicose using the same}

본 발명은 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

사이코스(psicose)는 과당(D-fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)이다. 과당과 비교할 때 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으나, 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않으며, 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있다. 따라서, 당뇨병 환자용 음식품 또는 수신용 음식품 등에 사용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부 지방 축적 억제를 할 수 있는 등 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능을 가지고 있으므로, 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당 알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. 이에 사이코스는 다이어트 감미료로서 관심이 높아지고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 필요하다.

종래의 사이코스 제조 방법은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법과 같은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 것이었다. 그러나 화학적 합성에 의할 경우, 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 과정 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 단점이 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 것과 같은, 과당을 기질로 하여 효소 반응에 의하여 사이코스를 제조하는 생물학적 방법이 연구되고 있다.

그러나 기존의 기능이 밝혀진 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 비특이적 반응과 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않다. 또한, 기존의 효소들은 높은 온도에서 안정성이 떨어지거나 느린 반응 속도로 인해 산업화에 적용되는 사이코스 생산의 수율이 낮고 제조원가가 상승하는 문제가 있었다. 따라서 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 조건 하에서 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 일 예는 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환활성을 갖는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주, 상기 균주의 배양물, 및/또는 상기 균주의 파쇄물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 과당을 사이코스로 전환하는 효소를 생산하는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 신규 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주 (예컨대, Microbacterium oxydans 또는 Microbacterium phyllosphaerae)를 분리 및 동정하였으며, 상기 균주의 균체를 사용하여 과당에서 사이코스로의 전환능을 확인하고, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체 반응의 최적 온도, 최적 반응 시간을 확인하여 사이코스를 효율적으로 대량 생산하기 위한 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 예에서, 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 가진 마이크로박테리움 속 균주를 제공한다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 또는 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae) 균주일 수 있으며, 예를 들어 상기 마이크로박테리움 속 균주는 기탁번호 KCCM12033P인 Microbacterium Oxydans SYG-A1 또는 기탁번호 KCCM12034P인 Microbacterium phyllosphaerae SYG-A2 균주일 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 것을 특징으로 한다. 상기 사이코스 전환능은 상기 마이크로박테리움 속 균주가 과당을 사이코스로 전환시키는 효소를 생산함으로써 얻어지는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 전환능이 높은 효소를 생산하거나, 사이코스 전환 효소를 대량으로 생산하여 우수한 사이코스 전환능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

상기 사이코스 전환능은 30℃ 이상의 온도, 또는 40℃ 이상의 온도 조건하에서 활성을 갖는 것일 수 있으며, 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 65 내지 75℃, 예를 들어, 70℃의 온도 조건에서 최대 활성을 나타내는 것일 수 있다.

또한, 상기 균주가 반응 기질인 과당과 반응하는 경우, 반응 시간은 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 또한, 반응 시간이 48시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당과 70℃의 온도에서 18시간 반응 시 상대 전환활성(relative activity)이 9 내지 30%, 바람직하게는 9 내지 25%, 더욱 바람직하게는 9 내지 20%일 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로박테리움 옥시단스 균주는 70℃의 온도에서 18시간 반응 시 상대 전환활성이 9 내지 15%, 바람직하게는 9 내지 12%일 수 있으며, 상기 마이크로박테리움 필로스패래 균주는 70℃의 온도에서 18시간 반응 시 상대 전환활성이 15 내지 30%, 바람직하게는 15 내지 25%, 더욱 바람직하게는 15 내지 20%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 사이코스 전환능을 갖는 마이크로박테리움 속 균주에 관한 사항은 상기 사이코스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 또는 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae) 균주일 수 있으며, 예를 들어 상기 마이크로박테리움 속 균주는 기탁번호 KCCM12033P인 Microbacterium Oxydans SYG-A1 또는 기탁번호 KCCM2034P인 Microbacterium phyllosphaerae SYG-A2 균주일 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 배양물은 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 또한, 상기 파쇄물은 상기 마이크로박테리움 속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.

본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 마이크로박테리움 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

상기 조성물에서 마이크로박테리움 속 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 1mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 1 내지 50mg(dcw)/ml 일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산율이 증가될 수 있다.

따라서 상기 마이크로박테리움 속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 마이크로박테리움 속 균주와 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가 시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.

상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다.

예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(sodium alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다.

일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대, 약 2.5%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피 배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주를 이용하여 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제안되는 사이코스를 생산하는 방법은 완충 용액을 사용하지 않고 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 것이 가능하므로, 보다 간편한 방법으로 사이코스를 높은 수율로 생산할 수 있다는 장점이 있다.

상기 사이코스 전환능을 갖는 마이크로박테리움 속 균주 및 이를 포함하는 사이코스 생산용 조성물에 관한 사항은 상기 사이코스 생산 방법에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당-함유 기질과 반응시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당-함유 기질과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)-함유 기질을 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 과당-함유 기질과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당-함유 기질을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 45 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충 용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 65 내지 75℃, 예를 들어, 70℃의 조건하에서 수행될 수 있다.

또한, 상기 반응은 pH 6.5 내지 9.0, 예컨대, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0 또는 8.5 내지 9.0의 조건하에서 수행될 수 있다. 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능하다.

본 발명은 신규 하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 마이크로박테리움 속 균주는 산업적으로 유용한 범위의 온도에서 안정성을 가지며, 과당으로부터 높은 수율로 사이코스를 생산하는 활성을 가지므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)으로 확인한 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium oxydans 균주의 온도에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium phyllosphaerae 균주의 온도에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium oxydans 균주의 반응시간에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium phyllosphaerae 균주의 반응시간에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1. 과당을 사이코스로 전환하는 미생물의 분리

과당을 사이코스로 전환하는 균주를 분리하기 위해 1% (w/v) 사이코스가 첨가된 Mineral salt broth (KH2PO4 2.4 g/L, K2HPO4 5.6 g/L, (NH4)2SO4 2.6 g/L, MgSO47H2O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L)를 사용하였다.

과수원 또는 기름진 토양이나 치즈, 우유, 식용꽃, 인삼, 브로콜리를 1g을 채취하고 MSP broth에 첨가 후 30℃에서 24시간 배양하여 증균을 실시하였다. 그 다음, 배양액 100 μL(microliter)를 취해 한천 배지에 도말한 후 30℃에서 콜로니가 확인될 때까지 배양하였다. 상기 한천 배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별하여 MSP broth에 접종 후, 30℃에서 24시간 진탕배양하고 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50 mM PIPES(piperazine-N, N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액(pH 7.0) 100 μL에 넣어 부유시키고, 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하여 파쇄액을 수득하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10 mM 과당 및 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로 전환되었는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 10cm의 실리카겔(Silica gel 60F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 부비피로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 10분간 3번씩 전개하여 수행하였다.

상기 TLC 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 0.1%(w/v) 사이코스가 첨가된 MS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며, 원심분리 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 넣어 부유시키고, 70℃에서 1시간 동안 반응하였다.

그 다음, 상기 반응 결과물을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었고, 수 천종의 균주 중에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 2종을 최종 선정하였다.

실시예 2. 사이코스 전환 활성을 갖는 균주의 동정

실시예 1에서 분리된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 확인하였다. 분리 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'→3')은 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.

상기 서열번호 1의 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 갖는 균주는 Microbacterium Oxydans DSM20578와 78.76% 동일함을 확인하였고, Microbacterium Oxydans SYG-A1로 명명하고, 2017년 05월 26일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12033P를 부여 받았다.

또한 상기 서열번호 2의 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 갖는 균주는 Microbacterium phyllosphaerae P369/016(NP_025405.1)와 100% 동일함을 확인하였고, Microbacterium phyllosphaerae SYG-A2 로 명명하고, 2017년 05월 26일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12034P를 부여 받았다.

실시예 3. 상기 균주의 균체 반응을 이용한 최적 온도 조건 확립

상기에서 분리된 균주를 다양한 온도 조건하에서 균체와 기질을 반응시키고 그에 따른 사이코스 전환 활성을 비교하였다.

400g/L 과당과 1mM 망간 금속이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH7.0)에 상기 실시예 1에서 분리된 2개 균주의 균체 농도를 5mg(dcw)/mL로 하여, 55 내지 80℃ 범위에서 온도를 변화시키면서 1시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였으며, 얻어진 결과를 아래 표와 도 2(M. oxydans SYGA1) 및 도 3(M. phyllosphaerae SYGA2)에 나타내었다.

반응 온도(℃)	M. oxydans SYGA1 Relative activity (%)	M. phyllosphaerae SYGA2 Relative activity (%)
50	59	65
60	95	95
70	100	100
80	45	55

상기 표 1, 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이 M. oxydans SYG-A1 및 M.phyllosphaerae SYGA2모두 70℃의 온도까지는 반응 온도가 증가함에 따라 상대 활성이 증가하였고, 80℃의 온도에서 상대 활성이 감소함을 확인하였다. 또한 상기 균주는 70℃의 온도에서 최대 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4. 사이코스 생산성 검토

반응 시간에 따른 최대 생산성을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 2개균주의 균체 농도 20mg/mL, 과당 농도 400g/L 온도 70℃ 및 pH 7.0 조건하에서 반응 시간별 활성을 확인하였다. 상기 반응은 12시간 동안 진행하였으며, 2시간 간격으로 사이코스 생산성을 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과를 아래 표와 도 4 및 도 5에 나타내었다.

반응 시간(hr)	M. oxydans SYG-A1 Relative activity (%)	M. phyllosphaerae SYG-A2 Relative activity (%)
1	5.9	6
3	6.5	8
5	7.5	10.5
7	8.8	15
18	10.3	18.8

상기 표 2 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 Microbacterium Oxydans SYG-A1는 반응 시간이 지날수록 사이코스 전환률이 점점 증가함을 확인하였다. 특히 70℃의 온도에서 18시간 반응 후 사이코스 전환율이 약 10.3%로 나타났으며, 이때 생산된 사이코스는 약 28g/L로 확인되었다. 또한 상기 표 2 및 도 5에서 확인 할 수 있는 바와 같이 Microbacterium phyllosphaerae SYGA2는 반응 시간이 지날수록 사이코스 전환률이 점점 증가함을 확인하였다. 특히 70℃의 온도에서 18시간 반응 후 사이코스 전환율이 약 18.8%로 나타났으며, 이때 생산된 사이코스는 약 52g/L로 확인되었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12033P

수탁일자 : 2017.5.26

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12034P

수탁일자 : 2017.5.26

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Strain of Microbacterium genus and method for producing psicose using the same <130> DPP20172132KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1409 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microbacterium oxydans 16sRNA <400> 1 nngngcgnct tancatgcag tcgaacggtg aagcagagct tgctctgtgg atcagtggcg 60 aacgggtgag taacacgtga gcaacctgcc cctgactctg ggataagcgc tggaaacggc 120 gtctaatact ggatatgtga cgtgaccgca tggtctgcgt ctggaaagaa tttcggttgg 180 ggatgggctc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg 240 gtagccggcc tgagagggtg accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300 gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcggaagc ctgatgcagc aacgccgcgt 360 gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct cttttagcag ggaagaagcg aaagtgacgg 420 tacctgcaga aaaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc 480 aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt 540 gaaatccgga ggctcaacct ccggcctgca gtgggtacgg gcagactaga gtgcggtagg 600 ggagattgga attcctggtg tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg 660 cgaaggcaga tctctgggcc gtaactgacg ctgaggagcg aaagggtggg gagcaaacag 720 gcttagatac cctggtagtc caccccgtaa acgttgggaa ctagttgtgg ggtccattcc 780 acggattccg tgacgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840 ctaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg 900 atgcaacgcg aagancctta ccaaggcttg acatatacga gaacgggcca gaaatggtca 960 actctttgga cactcgtaaa caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020 ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgttctatg ttgccagcac gtaatggtgg 1080 gaactcatgg gatactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1140 atgcccctta tgtcttgggc ttcacgcatg ctacaatggc cggtacaaag ggctgcaata 1200 ccgcgaggtg gagcgaatcc caaaaagccg gtcccagttc ggattgaggt ctgcaactcg 1260 acctcatgaa gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt gaatacgttc 1320 ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcaagtc atgaaagtcg gtaacacctg aagccggtgg 1380 cctaaccctt gtgaggagcc tcaagngat 1409 <210> 2 <211> 1478 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microbacterium phylloshaerae 16sRNA <400> 2 gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggtgaagccc agcttgctgg 60 gtggatcagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagcaacc tgcccctgac tctgggataa 120 gcgctggaaa cggcgtctaa tactggatac gagtagcgac cgcatggtca gttactggaa 180 agatttattg gttggggatg ggctcgcggc ctatcagctt gttggtgagg taatggctca 240 ccaaggcgtc gacgggtagc cggcctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac 300 ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat 360 gcagcaacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttt agcagggaag 420 aagcgaaagt gacggtacct gcagaaaaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480 taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt 540 tgtcgcgtct gctgtgaaat ccggaggctc aacctccggc ctgcagtggg tacgggcaga 600 ctagagtgcg gtaggggaga ttggaattcc tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag 660 gaggaacacc gatggcgaag gcagatctct gggccgtaac tgacgctgag gagcgaaagg 720 gtggggagca aacaggctta gataccctgg tagtccaccc cgtaaacgtt gggaactagt 780 tgtggggtcc attccacgga ttccgtgacg cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg 840 agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggcggagc 900 atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata tacgagaacg 960 ggccagaaat ggtcaactct ttggacactc gtaaacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgtt ctatgttgcc 1080 agcacgtaat ggtgggaact catgggatac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct tgggcttcac gcatgctaca atggccggta 1200 caaagggctg caataccgcg aggtggagcg aatcccaaaa agccggtccc agttcggatt 1260 gaggtctgca actcgacctc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct 1320 gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc aagtcatgaa agtcggtaac 1380 acctgaagcc ggtggcctaa cccttgtgga gggagccgtc gaaggtggga tcggtaatta 1440 ggactaagtc gtaacaaggt agccgtaccg gaaggtgc 1478

Claims

과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 사이코스 전환 효소, 상기 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 과당-함유 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법으로서,
상기 과당-함유 기질과 반응시키는 단계는 60 내지 80℃의 조건 하에서 수행되며,
상기 마이크로박테리움 속 균주는 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 및 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이며, 코발트 이온 및 망간 이온에 의해 사이코스 전환활성이 증가하는 것인,
과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은, 망간 및 코발트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당과 70℃의 온도에서 18시간 반응 시 상대 전환활성(relative activity)이 9 내지 30%인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 과당-함유 기질과 반응시키는 단계는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 폴리오럼(ctezrium foliorum) 균주가 생산하는 사이코스 전환 효소, 상기 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 과당-함유 기질과 혼합하여 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 사이코스 전환 효소, 또는 상기 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주의 균체가 고정화된 담체에, 과당-함유 기질을 접촉하여 수행하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 과당-함유 기질은 40 내지 75%(w/w)의 농도의 과당을 함유하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 완충용액을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 65 내지 75℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 1 내지 48시간 동안 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 균주는 기탁번호 KCCM12033P를 가지는 균주이고, 상기 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae) 균주는 기탁번호 KCCM12034P를 가지는 균주인, 사이코스를 생산하는 방법.
과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 사이코스 전환 효소, 상기 사이코스 전환 활성을 갖는 마이크로박테리움 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 생산용 조성물로서,
상기 마이크로박테리움 속 균주는 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 및 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이며, 코발트 이온 및 망간 이온에 의해 사이코스 전환활성이 증가하며, 60 내지 80℃의 조건 하에서 사이코스 전환 활서을 갖는 것인, 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 생산용 조성물.
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제11항에 있어서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당과 70℃의 온도에서 18시간 반응 시 9 내지 30%의 상대 전환활성을 갖는 것인, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans) 균주는 기탁번호 KCCM12033P를 가지는 균주이고, 상기 마이크로박테리움 필로스패래(Microbacterium phyllosphaerae) 균주는 기탁번호 KCCM12034P를 가지는 균주인, 조성물.
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