KR101755349B1

KR101755349B1 - L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 및 그를 이용하여 l-쓰레오닌을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101755349B1
Application number: KR1020150144319A
Authority: KR
Inventors: 정기용; 조승현; 손승주; 이광호; 이지선
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-10-15
Also published as: WO2017065457A1; KR20170044523A

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물, 및 그를 이용한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 및 그를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법{Microorganism producing L-threonine and process for producing L-threonine using the same}

L-쓰레오닌은 사료 첨가제, 의약 원료 또는 식품 원료 등으로 널리 사용되는 아미노산으로서 미생물을 이용한 발효 방법으로 대량 생산되고 있다.

미생물을 이용한 목적 물질의 생산방법은 주로 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 발현이 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 한편으로, 목적 물질의 고수율 생산을 위해서는 충분한 에너지의 생성 및 유지가 필요하기 때문에, 생체 내에서 NADH, NADPH 및 아데노신-5'-트리포스페이트(Adenosine-5'-triphosphate: ATP)의 형태의 에너지를 확보하는 접근 방법도 이용되고 있다.

미생물 내의 NAD(H) 수준을 증가시키는 방법으로는 데 누보(de novo) 생합성 과정이나 살비지(salvage) 과정에 관여하는 유전자를 강화시켜 합성을 증가시키는 방법과 NAD(H)의 분해 경로를 감쇄(attenuation) 또는 결실(deletion)시켜 강화시키는 방법이 알려져 있다(Metabolic Engineering, 2002, 4, 238-247). 한편, CobB는 탈초산화효소 또는 탈숙신화효소로서, 히스톤 H4 단백질의 초산화된 라이신과 복합체를 이루는 것이 알려져 있으며, Zn²⁺ 결합 부위가 존재한다고 알려져 있다(J Mol Biol, 2004, 337(3);731-41).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생합성에 필요한 NAD(H)를 증가시키기 위해 노력한 결과, cobB 유전자를 발굴하였으며, 당해 유전자를 조작하여 L-쓰레오닌의 생산 수율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 CobB 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "CobB 단백질"은 라이신 탈아세틸화효소(protein lysine deacetylase) 및/또는 라이신 탈숙시닐화효소(protein lysine desuccinylase) 를 의미할 수 있으며, 탈초산화 반응이나 탈숙신화 반응시 NAD(H)를 보조인자로서 사용하는 클라스 III 시르투인(sirtuin) 단백질을 의미할 수 있다. 상기 CobB는 효소의 이름이 상이하더라도, 그와 유사한 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속유래의 효소일 수 있다. 구체적으로상기 CobB 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CobB 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 CobB 단백질은 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 기능을 나타내는 것이라면 제한 없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 상기 CobB 단백질은 야생형 CobB 단백질에 비하여 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 포함하는 것으로 이해된다.

아울러, 본 발명의 상기 CobB 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열 및 이와 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, 상기 cobB 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다. 상기 cobB 유전자는 상기 CobB 단백질과 동일하거나 상응하는 기능을 나타내는 단백질을 코딩하는 것이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 유전자라면, 야생형 cobB 유전자에 비하여 일부 뉴클레오티드 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 유전자도 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명에서 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미한다. 즉, 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 당해 기술분야에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 본래 미생물이 변형되기 전 상태 또는 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성의 수준을 의미한다.

본 발명에서 용어 "단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된"은 미생물에서 언급된 단백질이 전혀 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 전혀 활성을 가지지 않는 것 또는 내재적 활성에 비해 단백질의 활성이 약화 또는 제거된 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어, 단백질 활성의 "약화" 또는 "제거"는 해당 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 내재적 수준보다 감소하거나 또는 전혀 존재하지 않는 것을 의미한다.

상기 단백질의 활성을 불활성화하는 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 감소되거나 존재하지 않도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 그의 일부 또는 전체 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 예를 들면, 1 내지 700개, 1 내지 500개, 1 내지 300개, 1 내지 100개, 또는 1 내지 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상동 재조합에 의해 상기 단백질을 불활성화시켰다.

또한, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 뉴클레오티드 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성이 더욱 감소되도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물" 또는 "L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 L-쓰레오닌 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-쓰레오닌의 생산능이 없는 천연형 균주에 쓰레오닌의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.

본 발명에서 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물은 본 발명의 CobB 단백질의 활성이 불활성화될 수 있는 L-쓰레오닌을 생산하는 모든 미생물을 포함할 수 있다. 그 예로 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있으나, 그에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물일 수 있으며, 더 구체적으로는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서 CobB 단백질의 활성이 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 미생물 또는 배지로부터 L-쓰레오닌을 수득하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 또한 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 L-쓰레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간, 또는 10 내지 72 시간일 수 있다. L-쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌을 수득하는 단계는, 미생물 또는 배지, 구체적으로는 배양한 미생물 또는 미생물 세포가 제거된 배지 또는 배양물 전체로부터 L-쓰레오닌을 분리하여 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리하여 수득하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 미생물 세포가 제거된 배지 또는 배양물 전체로부터 생산된 L-쓰레오닌을 분리하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 단백질 침전제에 의한 처리(예, 염석법), 원심분리, 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 겔여과를 포함한 크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 및 이들의 방법을 조합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 분리하는 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에서의 CobB 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물을 사용하면 세포 내 NAD(H) 수준이 증가하여 고효율 및 고수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 균주의 세포내 NAD(H) 수준을 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 균주의 세포내 NAD(H) 수준을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. cobB 가 결실된 대장균 균주의 제작

1. 대장균 야생형 균주에 cobB 가 결실된 균주의 제작

본 실시예에서는 야생형 대장균 균주인 대장균 W3110(ATCC 39936)에서 cobB 유전자를 상동 재조합에 의하여 결실시켜 cobB 유전자가 결실된 균주를 제작하였다. 대장균에서 cobB 유전자는 단백질 라이신 탈아세틸화효소(protein lysine deacetylase) 활성 및/또는 단백질 라이신 탈숙시닐화효소(protein lysine desuccinylase) 활성을 갖는 CobB 단백질을 코딩하는 것으로 알려져 있다. 결실되어질 상기 cobB 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

대장균 W3110에서 상동 재조합에 의하여 cobB 유전자를 결실시키는 구체적인 과정은 다음과 같다. 유전자 cobB의 결실을 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한, 1-단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였다(Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97:6640-6645).

먼저, 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커인 pUCprmfmloxP의 클로람페니콜 유전자는 다음과 같이 제조하였다. rmf 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 단편 0.3 kb를 얻기 위해, Genomic-tip 시스템(Qiagen, 독일)을 이용하여 대장균 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 상기를 증폭시키기 위한 PCR은 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 KpnI과 EcoRV로 절단하고 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 용리하여 0.3Kb 크기의 Prmf 단편을 수득하였다. 이후에, 상기 수득한 Prmf 단편 및 pUC19 (New England Biolabs, USA) (Accession Number L09137)을 각각 제한효소 KpnI과 SmaI으로 절단하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC-Prmf 플라스미드를 제작하였다. 다음으로, 돌연변이 loxP-CmR-loxP 카세트와 rmf 유전자의 프로모터를 동시에 가지는 벡터 pUCprmfmloxP를 제작하기 위해, pACYC184 플라스미드(New England Biolab, USA)(Accession Number X06403)를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여, 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하여, 1.1kb의 PCR 산물을 얻었다. 상기 pUC-Prmf 벡터와 pACYA184를 주형으로한 PCR에서 얻은 1.1kb의 DNA를 각각 제한효소 NdeI/KpnI으로 절단한 후 라이게이션 반응을 수행하고 얻어진 라이게이션 산물을 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 통상의 방법으로 정확하게 라이게이션된 DNA를 가진 세포주를 선별하고 이의 배양액으로부터 플라스미드 pUCprmfmloxP를 분리 정제하였다.

이후에, cobB 유전자의 일부분과 pUCprmfmloxP의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합을 이용하여 pUCprmfmloxP를 주형으로 하고, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 1차 중합효소 연쇄반응에 의해 약 1.3 kb의 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에서의 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 수득된 PCR 산물의 5' 및 3' 영역의 20 bp의 염기서열을 포함하는 서열번호 9 및 10의 프라이머 조합을 이용하여, 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 하여, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 2차 중합효소 연쇄반응에 의해, 약 1.3 kb의 2차 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 2차 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에서의 전기영동 후 용리하여 재조합에 사용하였다.

그 후, Datsenko KA 등이 개발한 1-단계 불활성화 방법에 따라 pKD46 벡터(Accession Number AY048746)로 형질전환된 대장균 W3110(이하, 'pKD46-도입된 대장균 W3110' 이라 한다)를 컴페턴트(competent)한 상태로 제조한 후, 상기 2차 PCR 산물을 pKD46-도입된 대장균 W3110에 전기천공법을 통해 도입하였다. 다음으로, 상기 2차 PCR 산물과 pKD46-도입된 대장균 W3110을 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 재조합 균주를 선별하였다. 다음으로, 상기 재조합 균주에서 클로람페니콜 마커 유전자를 제거하기 위하여, 먼저 상기 재조합 균주에서 pKD64 벡터를 제거하였다. 이후, Cre-재조합효소 유전자를 갖는 pJW168 벡터(Gene, (2000) 247,255-264)를 상기 pKD64 벡터가 제거된 재조합 균주에 도입하고, 도입한 pJW168 벡터로부터 Cre-재조합효소를 발현시키기 위하여 pJW168 벡터가 도입된 재조합 균주를 암피실린을 포함한 LB배지에서 30℃로 배양하였다. 이후, 상기 배지에 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside:IPTG)를 도말하여 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 Cre-재조합효소에 의해 mutant loxP 위치에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜 마커 유전자가 제거된 것이다. 이후, 상기 클로람페니콜 마커 유전자가 제거된 균주를 42℃에서 배양하여 pJW168 벡터를 제거하였고, 최종적으로 수득된 균주를 W3110_△cobB로 명명하였다. 이후, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 얻어진 약 0.5 kb PCR 산물에 의해 cobB 유전자가 결실되었다는 것을 확인하였다.

상기 CobB 단백질의 활성이 불활성화된 상기 W3110_△cobB 를CA03-8300로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 05일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11630P를 부여받았다.

2. 쓰레오닌 대사 경로가 강화된 균주에서 cobB 결실된 균주의 제작

본 실시예에서는 쓰레오닌 대사 경로를 강화한 균주에서 cobB의 결실 효과를 확인하기 위해서 pACYC184-thrABC 벡터를 제작하였고, 이 벡터를 상기 실시예 1에서 제작된 W3110_△cobB 균주에 도입하여 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC를 제작하였다.

구체적으로, 상기 벡터 pACYC184-thrABC는 다음과 같은 방법으로 제작되었다. L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KCCM 10541(대한민국 특허 등록번호 제10-0576342호)의 유전체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 14의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 수득한 DNA 단편을 분리 정제하고, HindIII 효소로 절단한 후 다시 정제하여 thrABC DNA단편을 준비하였다. pACYC184 벡터를 HindIII 효소로 절단한 후 정제하여 준비하고, 상기 thrABC DNA단편과 라이게이션하여 pACYC184-thrABC 벡터를 제작하였다. 이렇게 제작된 벡터를 W3110 및 W3110_△cobB 균주에 전기천공법을 통해 도입하였고 각각 W3110/pACYC184-thrABC 및 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC로 명명하였다.

3. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 결실된 균주의 제작

본 실시예에서는 쓰레오닌을 생산하는 대장균인 KCCM10541(대한민국 특허 등록번호 제10-0576342호)을 모균주로 하여 실시예 1의 1과 동일한 방법으로 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 결실 균주를 제작하였고, 그를 KCCM10541_△cobB로 명명하였다.

실시예 2. cobB 결실된 균주의 L-쓰레오닌 생산성 및 NAD(H) 수준 분석

1. 대장균 야생형 균주 및 쓰레오닌 대사 경로 강화 균주에서 cobB 결실된 균주의 L-쓰레오닌 생산성 분석

상기 실시예 1의 1 및 2에서 제조한 재조합 미생물을 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크 250ml에서 배양하여 L-쓰레오닌 생산성 향상을 확인하였다.

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
KH₂PO₄	2 g
(NH₄)₂SO₄	25 g
MgSO₄·H₂O	1 g
FeSO₄·H₂O	5 mg
MnSO₄·H₂O	5 mg
DL-메티오닌	0.15 g
효모액기스	2 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

33℃의 배양기(incubator) (진탕 배양기, 제이오텍社) 에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 W3110, W3110_△cobB, W3110/pACYC184-thrABC 및 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC 균주 각각을 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 L-쓰레오닌의 생산성을 분석하였으며, 그의 결과를 표 2에 나타내었다.　

균주	L-쓰레오닌(g/L)
W3110	0.00
W3110_△cobB	0.01
W3110/pACYC184-thrABC	1.42
W3110_△cobB/pACYC184-thrABC	1.89

표 2에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 W3110 균주는 48시간 배양하였을 경우 L-쓰레오닌을 전혀 생산하지 못했으나, W3110_△cobB 균주는 소량이기는 하나 0.01 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 또한 쓰레오닌 생합성 경로를 강화한 W3110/pACYC184-thrABC 균주의 경우, 1.42g/L의 쓰레오닌을 생산한 반면, W3110_△cobB/pACYC184-thrABC 균주는 1.89g/L의 쓰레오닌을 생산하여 생산된 쓰레오닌 농도가 33% 증가했음을 확인하였다.

2. 대장균 야생형 균주에서 cobB 가 결실된 균주의 NAD (H) 수준 평가

본 실시예에서는 실시예 1의 1에서 제작된 균주 W3110_△cobB를 이용하여 세포내 NAD(H) 수준을 측정하였다.

구체적으로, Bioassay systems사에서 개발한 NAD/NADH 측정키트(EnzyChrom^TM NAD+/NADH Assay Kit (ECND-100))를 사용하였다(Mol Cancer Ther.,2008, 7(1):110-120). 삼각플라스크 250ml에 포함된 실시예 2의 1에서 사용된 글루코오스가 포함된 LB 액체 배지에 실시예 1의 W3110 및 W3110_△cobB를 각각 밤새 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 상층액을 제거하고 ice-cold PBS를 이용하여 수득된 균체를 세척하고, NADH/NAD 추출 완충액(Permeable buffer)을 10분간 상온과 저온에서 처리하고 교반하여 세포 내의 NAD(H)가 세포 외부로 스며 나오게 하였다. 그 후, 다시 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분석 완충액(Assay buffer), 반응효소, 에탄올, PMS, 및 MTT를 섞은 뒤, 흡광기를 이용하여 OD₅₆₅를 측정하여 NAD(H)를 정량하였다. 상기 과정을 3회 반복 후 실험 결과의 평균값을 측정하였다.

그 결과, 일구체예에 따른 대장균 W3110_△cobB에서 세포내 NAD(H) 수준이 야생형 대장균 W3110에 비해 10% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도1).

3. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 가 결실된 균주의 쓰레오닌 생성능 평가

상기 실시예 1의 3에서 제조한 cobB 유전자 결실주인 KCCM10541_△cobB와 모균주인 KCCM10541의 쓰레오닌 생산 역가를 측정하기 위하여 상기 실시예 2의 1에서와 같은 방법으로 쓰레오닌 수율을 측정하였다.

균주	L- 쓰레오닌 (g/L)
KCCM10541	30.4
KCCM10541_△cobB	36.1

표 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 KCCM10541에 비해 KCCM10541_△cobB에서 쓰레오닌 농도가 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

4. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 가 결실된 균주의 NAD (H) 수준 평가

상기 실시예 1의 3에서 제조한 cobB 유전자 결실주인 KCCM10541_△cobB와 모균주인 KCCM10541의 세포내 NAD(H) 수준을 평가하기 위하여 상기 실시예 2의 2에서와 같은 방법으로 NAD(H) 수준을 측정하였다.

그 결과, 일구체예에 따른 대장균 KCCM10541_△cobB에서 세포내 NAD(H) 수준이 모균주인 대장균 KCCM10541에 비해 14% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도2).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11630P

20141205

<110> CJ corporation <120> Microorganism producing L-threonine and process for producing L-threonine using the same <130> PN108388 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 279 <212> PRT <213> E.coli <400> 1 Met Leu Ser Arg Arg Gly His Arg Leu Ser Arg Phe Arg Lys Asn Lys 1 5 10 15 Arg Arg Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gln Arg Ile Phe Phe Arg Asp Lys 20 25 30 Val Val Pro Glu Ala Met Glu Lys Pro Arg Val Leu Val Leu Thr Gly 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ser Gly Ile Arg Thr Phe Arg Ala Ala Asp 50 55 60 Gly Leu Trp Glu Glu His Arg Val Glu Asp Val Ala Thr Pro Glu Gly 65 70 75 80 Phe Asp Arg Asp Pro Glu Leu Val Gln Ala Phe Tyr Asn Ala Arg Arg 85 90 95 Arg Gln Leu Gln Gln Pro Glu Ile Gln Pro Asn Ala Ala His Leu Ala 100 105 110 Leu Ala Lys Leu Gln Asp Ala Leu Gly Asp Arg Phe Leu Leu Val Thr 115 120 125 Gln Asn Ile Asp Asn Leu His Glu Arg Ala Gly Asn Thr Asn Val Ile 130 135 140 His Met His Gly Glu Leu Leu Lys Val Arg Cys Ser Gln Ser Gly Gln 145 150 155 160 Val Leu Asp Trp Thr Gly Asp Val Thr Pro Glu Asp Lys Cys His Cys 165 170 175 Cys Gln Phe Pro Ala Pro Leu Arg Pro His Val Val Trp Phe Gly Glu 180 185 190 Met Pro Leu Gly Met Asp Glu Ile Tyr Met Ala Leu Ser Met Ala Asp 195 200 205 Ile Phe Ile Ala Ile Gly Thr Ser Gly His Val Tyr Pro Ala Ala Gly 210 215 220 Phe Val His Glu Ala Lys Leu His Gly Ala His Thr Val Glu Leu Asn 225 230 235 240 Leu Glu Pro Ser Gln Val Gly Asn Glu Phe Ala Glu Lys Tyr Tyr Gly 245 250 255 Pro Ala Ser Gln Val Val Pro Glu Phe Val Glu Lys Leu Leu Lys Gly 260 265 270 Leu Lys Ala Gly Ser Ile Ala 275 <210> 2 <211> 840 <212> DNA <213> E.coli <400> 2 atgctgtcgc gtcggggtca tcggttaagt cgttttcgta aaaataaacg ccgcctgcgc 60 gagcgtttgc gtcagcgtat ttttttcaga gataaagtgg tgccggaagc aatggaaaaa 120 ccaagagtac tcgtactgac aggggcagga atttctgcgg aatcaggtat tcgtaccttt 180 cgcgccgcag atggcctgtg ggaagaacat cgggttgaag atgtggcaac gccggaaggt 240 ttcgatcgcg atcctgaact ggtgcaagcg ttttataacg cccgtcgtcg acagctgcag 300 cagccagaaa ttcagcctaa cgccgcgcat cttgcgctgg ctaaactgca agacgccctc 360 ggcgatcgct ttttgctggt gacgcagaat atcgacaacc tgcatgaacg cgcaggtaat 420 accaatgtga ttcatatgca tggggaactg ctgaaagtgc gttgttcaca aagtggtcag 480 gttctcgact ggacaggaga cgttacccca gaagataaat gccattgttg ccagtttccg 540 gcacccttgc gcccgcacgt agtgtggttt ggcgaaatgc cactcggcat ggatgaaatt 600 tatatggcgt tgtcgatggc cgatattttc attgccattg gcacatccgg gcatgtttat 660 ccggcggctg ggtttgttca cgaagcgaaa ctgcatggcg cgcacaccgt ggaactgaat 720 cttgaaccga gtcaggttgg taatgaattt gccgagaaat attacggccc ggcaagccag 780 gtggtgcctg agtttgttga aaagttgctg aagggattaa aagcgggaag cattgcctga 840 840 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for rmf promoter <400> 3 cagaggtacc caggaagccg cttctattgc cagaggtacc ccagcctgtt tacgatgatc 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for rmf promoter <400> 4 gactgatatc gcctcgtttc cctcatactg gactgatatc gtgaccgata gtcagcgagt 60 60 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for pACYC184 <400> 5 atatcatatg taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttatctgccc tgaaccgacg 60 accg 64 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pACYC184 <400> 6 aattccatgg taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgcatca cccgacgcac 60 tttgc 65 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for pUCprmfmloxP <400> 7 tgcgtggtgc ggccttccta catctaaccg attaaacaac agaggttgct aggtgacact 60 atagaacgcg 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pUCprmfmloxP <400> 8 cgcaaattca attaattgcg tccccttgca ggcctgataa gcgtagtgca ggtacccatc 60 agatccacta 70 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer for cobB deletion <400> 9 caatatccac tggtgatggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for cobB deletion <400> 10 atttactacc cgcgaaccac 20 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for confirmation of cobB deletion <400> 11 agggcgcacg ttgagc 16 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for confirmation of cobB deletion <400> 12 gactattgcc aatatg 16 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E.coli KCCM 10541 <400> 13 cgagaagctt agcttttcat tctgactgca 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E.coli KCCM 10541 <400> 14 cgagaagctt attgagataa tgaatagatt 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해서 코딩되는, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균인, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 미생물 또는 배지로부터 L-쓰레오닌을 수득하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법.