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JP2018500027A - リガンド修飾二本鎖核酸 - Google Patents

リガンド修飾二本鎖核酸 Download PDF

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JP2018500027A JP2017532021A JP2017532021A JP2018500027A JP 2018500027 A JP2018500027 A JP 2018500027A JP 2017532021 A JP2017532021 A JP 2017532021A JP 2017532021 A JP2017532021 A JP 2017532021A JP 2018500027 A JP2018500027 A JP 2018500027A
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Abstract

本発明は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’伸長部を含み、且つリガンドにコンジュゲートした複数のヌクレオチドを更に含む二本鎖核酸分子、及び二本鎖核酸分子の使用方法を提供する。センス鎖がテトラループを形成するリガンド修飾オリゴマーは、強力で安定した新規ＲＮＡ干渉剤をもたらす。これらのｄｓＮＡ分子は、標準的なヌクレオチド合成方法及びシステムを用いて、リガンド修飾単量体、ヌクレオチド類似体単量体、修飾ヌクレオチド単量体などを含む複数のヌクレオチドを使用して合成される。

Description

関連出願の相互参照
本明細書と同時に出願された本明細書の付属書類、並びに米国特許第８，５１３，２０７号明細書、米国特許第８，３４９，８０９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１／０２８８１４７号明細書は、本明細書によって全体として参照により援用される。
本願は、両方ともに２０１４年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０９２，２４１号明細書及び米国仮特許出願第６２／０９２，２３８号明細書、並びに両方ともに２０１５年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／１８７，８４８号明細書及び米国仮特許出願第６２／１８７，８５６号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、本明細書によって全体として参照により援用される。
２５〜３５ヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤が、哺乳類細胞における標的遺伝子発現の有効な阻害薬として記載されている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号明細書及び同第２００５／０２７７６１０号明細書）。かかる長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のダイサー酵素によってプロセシングされると考えられることから、かかる薬剤は「ダイサー基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤と呼ばれる。ＤｓｉＲＮＡ剤の幾つかの修飾構造については、既に記載がなされている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書）。
本発明は、２１〜８３ヌクレオチドを含むセンス鎖；１５〜３９ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；１５〜３５塩基対の長さを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖；ステムが１〜２０ヌクレオチドの塩基対合領域を含み、且つテトラループが４個の非対合ヌクレオチドを含む、センス鎖によって形成されるステム及びテトラループ、を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を提供し；ここでアンチセンス鎖は、第２鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、そのため二本鎖核酸が哺乳動物又は哺乳類細胞に導入されると標的遺伝子発現が低下し；及びセンス鎖は少なくとも１つのリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、１５〜３０ヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド又は１９〜２４ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
一実施形態において、センス鎖は、１９〜３０ヌクレオチド又は１９〜３６ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
別の実施形態において、二重鎖は、１５〜２２ヌクレオチド又は１５〜３０ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端との間に不連続部を含むか、又はセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端との間に不連続部を含む。
別の実施形態において、不連続部はいずれの側にもホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが隣接する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡの少なくとも一方の鎖は３’伸長部を含む。
別の実施形態において、３’伸長部は、１〜２、１〜４、又は１〜６ヌクレオチドの長さを有する。
別の実施形態において、３’伸長部は、１〜１０、１０〜２０又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
別の実施形態において、ステムは少なくとも１５ヌクレオチドの塩基対合領域を含み、且つ１つ以上のミスマッチを更に含む。
別の実施形態において、ステムは少なくとも１５ヌクレオチドの塩基対合領域を含み、且つ１〜１０個の連続又は非連続ミスマッチを更に含む。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドの数は、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０ヌクレオチドである。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここでｄｓＮＡは、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０個のスペーサーヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここで各リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは第２のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドと少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドで隔てられている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは隣接している。
本発明は、ステム及びループを含むｄｓＮＡを提供し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドはステム上にある。
ステムは、２、３、４個又はそれ以上のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含み得る。それらのリガンドのうちの少なくとも１つ又はそれらのリガンドの各々が、ステムのヌクレオチドに対し、そのヌクレオチドのリボース上の２’ヒドロキシルを介してコンジュゲートし得る。ステムのヌクレオチドにコンジュゲートしているリガンドは、ＧａｌＮＡｃ、マンノース−６−リン酸又はこれらの組み合わせであり得る。ステムは、３、４個又はそれ以上のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むことができ、それらのリガンドの各々はＧａｌＮＡｃである。２個以上、例えば、２、３、又は４個のリガンドがステムの単一のヌクレオチドに結び付いていてもよい。２個以上、例えば、２、３、又は４個のＧａｌＮＡｃリガンドがステムの単一のヌクレオチドに結び付いていてもよい。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドはｄｓＮＡのステム又はループ上にある。
別の実施形態において、リガンドはヌクレオチドの糖及び／又は塩基にコンジュゲートしている。
別の実施形態において、リガンドは、親油性物質、ステロイド、タンパク質、ビタミン、炭水化物、及びテルペンからなる群から選択される。
別の実施形態において、リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸（ａｄａｍａｎｔｉｎｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、胆汁酸、ＰＥＧ、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール、ペプチド、ペプチド模倣体、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イオドース、グルコース、タロース、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖、エンドソーム分解性成分、ウバオール、ヘコゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン、トリテルペンサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、カチオン性脂質、及び抗体からなる群から選択される。
別の実施形態において、リガンドはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。
別の実施形態において、リガンドは、単量体又はモノアンテナリー、バイアンテナリー及びトリアンテナリーＧａｌＮＡｃを含むＡＳＧＰｒ模倣体を含む。ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ模倣体の好適な例は当該技術分野において公知であり、国際公開第２０１５／００６７４０号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の１３〜２５頁にある表２、表２ａ、表３及び表３ａを参照することができる。これらの表に開示されるＧａｌＮＡｃリガンドは、好適なリンカーを使用して本発明のｄｓＮＡ分子とのコンジュゲーションに用いることができ、本発明の範囲内にあると見なされるものとする。
別の実施形態において、リガンドはコレステロールを含む。
別の実施形態において、リガンドはマンノース−６−リン酸を含む。
別の実施形態において、リガンドはリンカーを介して前記ヌクレオチドに付加している。
別の実施形態において、リンカーは遊離可能なリンカーである。
別の実施形態において、リンカーは５〜９０原子長である。
別の実施形態において、リンカーはトリアゾール環及びアミド官能基を含む。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの生物学的に不安定な結合を有し、この生物学的に不安定な結合は前記ｄｓＮＡのヌクレオチドの塩基をリンカーに結び付ける。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの生物学的に不安定な結合を有し、この生物学的に不安定な結合は前記ｄｓＮＡのヌクレオチドの糖をリンカーに結び付ける。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの生物学的に不安定な結合を有し、この生物学的に不安定な結合はリガンドをリンカーに結び付ける。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの生物学的に不安定な結合を有し、この生物学的に不安定な結合はリンカーの末端にない。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも３つの生物学的に不安定な結合を有し、ここでは第１の生物学的に不安定な結合がリガンドをリンカーと結び付け、第２の生物学的に不安定な結合が第１及び第３の生物学的に不安定な結合間にあり、且つ第３の生物学的に不安定な結合がリガンドとリンカーとを結び付ける。
別の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの生物学的に不安定な結合を有し、この生物学的に不安定な結合は加水分解性エステル結合である。
別の実施形態において、５’一本鎖伸長部は、１〜１０、１０〜２０又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、前記ｄｓＮＡのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、糖修飾ヌクレオチド、骨格修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及び非ヌクレオシド類似体からなる群から選択される。
別の実施形態において、ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）又はアンロックド核酸（ＵＮＡ）である。
別の実施形態において、前記ｄｓＮＡの少なくとも一方の鎖は３’伸長部を含む。
別の実施形態において、３’オーバーハングは、１〜２、１〜４又は１〜６ヌクレオチドの長さを有する。
別の実施形態において、前記３’伸長部の少なくとも１つのヌクレオチドは糖及び／又は骨格修飾を含む。
別の実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは糖及び／又は骨格修飾を含む。
別の実施形態において、１つ以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）修飾からなる群から選択される糖修飾を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ホスホネート、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、ＳＡＴＥ（Ｓ−アシル−２−チオエチル）修飾リン酸、ＢＭＥＧ（イソブチリルメルカプトエチルグリコール）修飾リン酸及び二環式フラノース類似体修飾からなる群から選択される骨格修飾を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、少なくとも１個のホスホロチオエート連結を含有する領域を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、１〜５、１〜１０又は１〜２０個のホスホロチオエート連結を含有する領域を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、少なくとも２個の連続したホスホロチオエート連結を含有する領域を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル及びペンタセニルからなる群から選択される核酸類似体を含む。
別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は二重鎖領域において最大の相補性となるように整列している。
別の実施形態において、ｄｓＮＡはダイサー切断基質である。
別の実施形態において、ｄｓＮＡはダイサー切断基質でない。
別の実施形態において、前記アンチセンス鎖の１〜３０個の連続３’末端ヌクレオチドは前記センス鎖と対合せず、１〜３０ヌクレオチドの３’一本鎖伸長部を形成する。
別の実施形態において、３’一本鎖伸長部は、１〜１０、１０〜２０又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
別の実施形態において、二重鎖は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、３’伸長部は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、５’伸長部は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、及びヌクレオチド類似体からなる群から選択される１個以上のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、５’一本鎖伸長部は少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、５’一本鎖伸長部は少なくとも１個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、５’一本鎖伸長部は、１〜５、１〜１０又は１〜２０個のホスホロチオエート連結を含む。
別の実施形態において、５’一本鎖伸長部は少なくとも２個の連続ホスホロチオエート連結を含む。
別の実施形態において、リガンドは非核酸部分である。
別の実施形態において、リガンドはペプチド又は有機化合物である。
別の実施形態において、有機化合物は色素である。
別の実施形態において、有機化合物はコレステロールである。
別の実施形態において、非核酸部分は検出可能標識を含む。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したときアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に対して増加した結合親和性を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した細胞標的化を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した細胞取り込みを有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき向上した送達を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した安定性を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加したトラッキングを有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき標的に対して増加した結合親和性を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき低下した免疫原性を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき改善された薬物動態特性を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡは、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき改善された体内分布特性を有する。
別の実施形態において、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端は非修飾リン酸を含有する。
別の実施形態において、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端は化学修飾されたリン酸を含有する。
別の実施形態において、３’伸長部はホスホロチオエート修飾を含む。
別の実施形態において、二重鎖は脱塩基ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、センス鎖は、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる。
別の実施形態において、アンチセンス鎖は、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる。
別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる。
別の実施形態において、センス鎖は、修飾ヌクレオチドの非存在下でヌクレアーゼ分解に耐性を示す。
別の実施形態において、アンチセンス鎖は、修飾ヌクレオチドの非存在下でヌクレアーゼ分解に耐性を示す。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは２つ以上のリガンド種を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡはＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド及びコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡはＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド及びマンノース−６−リン酸コンジュゲート型ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド、マンノース−６−リン酸コンジュゲート型ヌクレオチド、葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチド及び／又はコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、少なくとも２個のリガンドにコンジュゲートしたヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは２つ以上のリンカー種を含む。
別の実施形態において、リンカーは、生理的条件下で切断可能な少なくとも１つの化学結合を有する。
別の実施形態において、リンカーは、生理的条件下で加水分解可能な少なくとも１つのエステル結合を有する。
別の実施形態において、リンカーは、生理的条件下で加水分解可能な少なくとも１つのアミド結合を有する。
別の実施形態において、リンカーが切断されると、ｄｓＮＡ分子のヌクレオチドにコンジュゲートしたリガンドのうちの少なくとも１つが遊離する。
本発明はまた、１５〜８５ヌクレオチドの範囲の鎖長を有し、且つセンス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端に位置する一本鎖伸長部を有するリガンド修飾オリゴヌクレオチドも提供し、有効なＲＮＡ干渉剤である。１つ以上の修飾ヌクレオチド、リン酸骨格修飾、及び／又はヌクレオチド類似体を一本鎖伸長ｄｓＮＡの一本鎖領域内に含めると、例えば、向上した有効性（効力の向上及び／又は効果持続期間の改善を含む）、認識ドメインの提示、及び一本鎖ヌクレオチド領域に関連する他の属性を含め、かかる修飾ｄｓＮＡ分子に特定の利点を付与することができる。
本発明は、１５〜８５ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；１５〜８５ヌクレオチドを含むセンス鎖；１５〜３５個の塩基対合したヌクレオチドの長さを有する、前記センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖；前記ｄｓＮＡの少なくとも一方の鎖上にある５’一本鎖伸長部であって、１〜５０ヌクレオチドの長さを有する伸長部、を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を提供し；ここで前記第２鎖は、前記第２鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、そのため前記二本鎖核酸が哺乳動物又は哺乳類細胞に導入されると標的遺伝子発現が低下し；及び前記伸長部はリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、１９〜２４ヌクレオチド又は１９〜３０ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
別の実施形態において、センス鎖は、１９〜３０又は１９〜３６ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
別の実施形態において、二重鎖は、１５〜２２又は１５〜３０ヌクレオチドの長さ範囲を有する。
別の実施形態において、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドの個数は、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０である。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し；ここでｄｓＮＡは、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０個のスペーサーヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は５’伸長部に３個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここで各リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは第２のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドと少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドで隔てられている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは隣接している。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は５’伸長部に４個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は５’伸長部にリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、スペーサーで互いに隔てられている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は５’伸長部にリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、１個のスペーサーで互いに隔てられている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は５’伸長部にリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、２個以上のスペーサーで互いに隔てられている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、５’伸長部のヌクレオチドにコンジュゲートしたトリアンテナリーＧａｌＮＡｃを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、５’伸長部のヌクレオチドにコンジュゲートしたバイアンテナリーＧａｌＮＡｃを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、５’伸長部のヌクレオチドにコンジュゲートしたモノアンテナリーＧａｌＮＡｃを有する。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有し、ここで各リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは第２のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドと少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドで隔てられている。
別の実施形態において、リガンドは前記ヌクレオチドの糖及び／又は塩基にコンジュゲートしている。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、式Ｉ［式中：
Ｍはヌクレオチドであり；
Ｘはリガンドであり；
Ｌは、ＭとＸとをつなぎ合わせる任意選択のリンカーであり；
Ｓ１及びＳ２はヌクレオチドスペーサーであり；
Ｐは、リガンド修飾ヌクレオチド（ＸＬＭ）及びＳ１ヌクレオチドスペーサーで形成される単位であり；
ａは各Ｐにつき独立に１〜４であり；
ｎは１〜１０であり；各ｚは各Ｐにつき独立に０〜１０であり；
ｂ及びｃの各々は０〜３５であり、ここでｂ及びｃの一方は０であり；
Ｅは１〜５０個のヌクレオチドＭを含む５’伸長部であり；及び
ＯはｄｓＮＡ分子である］によって表される構造を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、以下の式ＩＩ：
［式中：
Ｂは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成された二重鎖であり；
Ｍはヌクレオチドであり；
Ｘはリガンドであり、且つｙの値は０〜４であり；
Ｌは任意選択のリンカーであり；
Ｏは、Ｂ及びＥを含むｄｓＮＡであり
Ｓは任意選択のスペーサーヌクレオチドであり；
及びｏ１及びｏ２の各々の値は独立に１〜２０であり；
及びｔの各々の値は独立に３〜８であり；
Ｃ１及びＣ２はステム二重鎖を形成し、且つＤはループであり；
Ｅは、Ｄ、Ｃ１、及びＣ２の各々を含むステム−ループであり；
各Ｐは、ひとまとめにＸ−Ｌ−Ｍ（各々がリガンド修飾ヌクレオチドを表す）であり；
ｒ１及びｒ２は各々独立に０〜２０であり；及び各ｗは独立に０〜８であり；且つ
ｏ１はｚ１＋ｒ１の合計であり；ｏ２はｚ２＋ｒ２の合計であり；ｔはｚ＋ｗの合計である］によって表される構造を有する。
別の実施形態において、ｒ１、ｒ２及びｗは各々独立にゼロであってもよく、但し、ｒ１、ｏ１、ｒ２、ｏ２、ｔ及びｗのうちの少なくとも１つはゼロより大きいものとする。
別の実施形態において、センス鎖はステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝０、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝０、ｗ＝１−４及びｔ＝４］を含む。
別の実施形態において、センス鎖はステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝１〜４、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝０、ｗ＝０及びｔ＝４］を含む。
別の実施形態において、センス鎖はステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝０、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝１〜４、ｗ＝０及びｔ＝４］を含む。
別の実施形態において、リンカー（Ｌ）は、アルキル、アルケニル、芳香族化合物、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ）、置換アルキル、及び置換アルケニルからなる群から選択される骨格を含み、ここで１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＯ）、Ｐ、Ｐ（Ｏ４）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）、及びＰＥＧの１つ以上が割り込んでいるか、又はそれが末端にあってもよい。
別の実施形態において、（Ｏ）は、各々がリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び非ヌクレオシド類似体からなる群から独立して選択される複数のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ホスホネート、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、モルホリノ、ＳＡＴＥ（Ｓ−アシル−２−チオエチル）修飾リン酸及びＢＭＥＧ（イソブチリルメルカプトエチルグリコール）修飾リン酸及び二環式フラノース類似体からなる群から選択されるリン酸骨格を含む。
別の実施形態において、リンカーＬは、式ＩＩＩ：
［式中、ｉは１〜１０であってもよく、且つｋは１〜１０個の炭素原子であってもよい］を含む。
別の実施形態において、リンカーは式ＩＶの構造［式中、ｎは１〜４０である］を含む。
別の実施形態において、リガンドは、親油性物質、ステロイド、タンパク質、ビタミン、炭水化物、及びテルペンからなる群から選択される。
別の実施形態において、リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸（ａｄａｍａｎｔｉｎｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、胆汁酸、ＰＥＧ、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール、ペプチド、ペプチド模倣体、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イオドース、グルコース、タロース、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖、エンドソーム分解性成分、ウバオール、ヘコゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン、トリテルペンサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、カチオン性脂質、及び抗体からなる群から選択される。
別の実施形態において、Ｏは、修飾塩基及び／又は修飾糖部分を含む少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、修飾糖部分は、２’−ヒドロキシル、３’−ヒドロキシル、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される。
別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル及びペンタセニルからなる群から選択される塩基類似体を含む。
式ＩＩの別の実施形態において、Ｄは前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の５’末端でＰに共有結合的に結合しており、式中、ｂ及びｃは各々ゼロであり；ａは１であり；ｎは４であり、且つｚは、Ｐの各単位についてそれぞれ２、２、２、及び１である。
式ＩＩの別の実施形態において、Ｄは前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の５’末端でＰに共有結合的に結合しており、式中、ａは１であり、ｎは４であり、且つｂ、ｃ及びｚの各々はゼロである。
式ＩＩの別の実施形態において、Ｄは前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の５’末端でＰに共有結合的に結合しており、式中、ａは１であり；ｎは３であり；ｃ及びｚの各々はゼロであり；且つｂは１〜１１である。
式ＩＩの別の実施形態において、Ｐは、Ｐを含有しない二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）と比較したとき、ｄｓＮＡ（Ｏ）の細胞取り込みを増加させる。
式ＩＩの別の実施形態において、センス鎖とアンチセンス鎖とは少なくとも２１塩基対の二重鎖（Ｄ）を形成する。
別の実施形態において、リンカー（Ｌ）は、アルキル、アルケニル、芳香族化合物、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ）、置換アルキル、及び置換アルケニルからなる群から選択される骨格を含み、ここで１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）、及びＰＥＧの１つ以上が割り込んでいるか、又はそれが末端にあってもよい。
本発明はまた、細胞における標的遺伝子の発現を低減する方法も提供し、この方法は、細胞における標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の本発明のｄｓＮＡに細胞を接触させるステップを含む。
本発明はまた、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減する方法も提供し、この方法は、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の本発明のｄｓＮＡを前記哺乳動物に投与するステップを含む。
本発明はまた、対象の細胞における標的遺伝子の発現を低減するための医薬組成物も提供し、前記組成物は、前記細胞又は動物における標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の本発明のｄｓＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含む。
本発明はまた、本明細書に開示されるとおりのｄｓＮＡとその使用説明書とを含むキットも提供する。
本発明はまた、リンカーを介してコンジュゲートしたヌクレオチドとリガンドとを含むリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドも提供し、ここでリンカーは、
からなる群から選択され、ここで前記リガンドは前記ヌクレオチドの糖又は塩基にコンジュゲートしており；及び前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは、請求項１に記載のｄｓＮＡの合成に用いられる。
本発明はまた、ｄｓＮＡの効力及び半減期を、前記ｄｓＮＡのヌクレオチドにリガンドをコンジュゲートすることによって増加させる方法も提供し、ここで前記リガンドは、コレステロール、マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）、ＧａｌＮＡｃ及び葉酸塩からなる群から選択される。
本発明はまた、本発明のｄｓＮＡの作製方法も提供し、この方法は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドからなる群から選択される複数のヌクレオチドを提供するステップであって、１個以上のヌクレオチドがリガンドにコンジュゲートしている、ステップ；及びリガンドにコンジュゲートしていないヌクレオチドとリガンドにコンジュゲートしているヌクレオチドとを含み、それらのヌクレオチドが所定のパターンであるｄｓＮＡを合成するステップであって、それによってｄｓＮＡを作製するステップを含む。
一実施形態において、リンカー（Ｌ）は、式Ｖの構造：
［式中：
Ｍは、ｄｓＮＡの一部であるヌクレオチド又は非ヌクレオチド分子であり；
Ｖは、Ｍがヌクレオチドであるとき、ヌクレオチドの２’又は３’位で、リン酸で、又は核酸塩基でＭに付加し、又はＶは、Ｍが非ヌクレオチド分子であるとき、酸素、窒素、炭素又は硫黄原子のいずれかを含有する化学結合を介してＭに付加し；
Ｖ及びＷは、各々独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、又はＮＨＲ’であり、
Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル又はアリールであり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、又はハロゲン化Ｃ１〜Ｃ６アルカニルであり、及びＲ２が、アリール、ヘテロアリール、シクロヘキサン、ｔ−ブタン、アダマンタン又はトリアゾールである場合に、Ｒ２のうちの１つは、
のうちの１つで置換されていてもよく、又はＲ１及びＲ２は、各々独立して、アリール、ヘテロアリールであり、これらのいずれか一方が、Ｈ、Ｍｅ、ＯＭｅ、ハロゲン化物、−ＮＨＸ［式中、Ｘ＝Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６］のうちの１つ以上で置換されていてもよく、又はＲ１及びＲ２は組み合わせになって、
［ＱはＨ又は生理学的に許容可能な塩、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２）ｍ−アリール又は（ＣＨ２）ｍ−ヘテロアリール［式中、ｍは１〜１０である］である］を含む任意選択で置換されているＣ３〜Ｃ７複素環を形成し、及びｎ＝０〜１０であり、且つ上記の環状化合物のいずれも、１〜３個の独立に選択されるＣｌ、Ｆ、ＣＦ３、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、アリール又はＯＹ、（Ｃ＝Ｏ）ＯＹ、ＮＹ２又はＣ（＝Ｏ）ＮＨＹ［式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル又はアリールである］で置換されていてもよく；
ＳＰはスペーサーであり、前記スペーサーは、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族化合物、複素環、置換アルキル、置換アルケニル、及び置換アルキニルを含み、ここで１つ以上のメチレンは、
を含め、Ｐ（Ｏ）Ｈ、Ｐ（Ｏ２）、Ｐ（Ｏ４）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｙｌｃｏｌ）（ＰＥＧ）、ＯＹ、Ｓ、Ｓ（ＯＹ）、ＳＯ２（Ｙ）、（Ｃ＝Ｏ）ＯＹ、ＮＹ２、ＮＨ、ＮＨ−（Ｃ＝ＯＹ）［式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル又はアリールである］のうちの１つ以上が割り込んでいるか、又はそれが末端にあってもよく、
Ｘは、ＧａｌＮＡｃ、Ｄ−マンノース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−フコース、ポリオール類又は以下に示す式Ｚ
［式中、ｂはＣＦ３であり、式中、ａは、ＣＦ３、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族化合物、複素環、置換アルキル、置換アルケニル、及び置換アルキニルであり、且つｂは、Ｐ（Ｏ）Ｈ、Ｐ（Ｏ２）、Ｐ（Ｏ４）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｙｌｃｏｌ）（ＰＥＧ）、Ｏｃ’、Ｓ、Ｓ（Ｏｃ’）、ＳＯ２（ｃ’）、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｃ’、ＮＹ２、ＮＨ、ＮＨ−（Ｃ＝Ｏｃ’）［式中、ｃ’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルカニル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル又はアリールである］のうちの１つ以上が割り込んでいるか、又はそれが末端にある１つ以上のメチレンである］からなる群から選択されるリガンドである］を含む。
別の実施形態において、リンカー（Ｌ）は、式ＶＩの構造：
［式中：
Ｂは核酸塩基又はＨであり；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ１）、又はＣＨ２であり；
Ｖ及びＷは、各々独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｈ、又は任意選択で置換されているＣ１〜６アルキルであるか、又は
Ｒ１及びＲ２は組み合わせになって、任意選択で置換されているＣ３〜７ヘテロシクリルを形成し；
ｍ及びｎは、各々独立して、１〜２０であり、
Ｘは、ＧａｌＮＡｃ、葉酸塩、マンノース−６−リン酸及びコレステロールからなる群から選択されるリガンドである］を含む。
別の実施形態において、リンカー（Ｌ）は、式ＶＩＩの構造：
［式中：
Ｂは核酸塩基であり；
ｍ及びｎは、各々独立して、１〜２０であり；
Ｘは、構造
を有する］を含む。
別の実施形態において、リンカー（Ｌ）は式ＸＩＩＩの構造：
［式中：
Ｂは核酸塩基又はＨであり；且つ
ｎは１〜２０である］を含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、式ＩＸの構造：
を有するホスホラミダイトシントンを用いる固相オリゴヌクレオチド合成によって組み込まれた少なくとも１つのリガンド修飾ヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子は、式Ｘの構造：
を有するホスホラミダイトシントンを用いる固相オリゴヌクレオチド合成によって組み込まれた少なくとも１つのリガンド修飾ヌクレオチドを含む。
本発明はまた、式ＸＩの構造：
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供し、前記リガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンは、請求項１に記載のｄｓＮＡの合成に用いられる。
本発明はまた、式ＸＩＩの構造
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供し、前記リガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンは、請求項１に記載のｄｓＮＡの合成に用いられる。
一実施形態において、本ｄｓＮＡ分子は、固相オリゴヌクレオチド合成によって組み込まれた前記リンカー（Ｌ）からなる少なくとも１つのリガンド修飾ヌクレオチドを含む。
本発明はまた、式ＸＩＩＩの構造
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供する。
本発明はまた、式ＸＩＶの構造
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供する。
本発明はまた、式ＸＶの構造
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供する。
本発明はまた、式ＸＶＩの構造
を含むリガンドコンジュゲート型ホスホラミダイトシントンも提供する。
実施形態の前述の特徴は、添付の図面を併せて参照しながら以下の詳細な説明を参照することにより、更に容易に理解されるであろう。
例示的一本鎖伸長ダイサー基質の幾つかの実施形態構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示す。図１Ａにおいて、パネルＡは、一本鎖伸長部を有しないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有する。パネルＣは例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有し、その一本鎖伸長領域と相補的なショートオリゴ（「不連続相補体」；図示のとおり不連続３’パッセンジャー相補体）を伴う。パネルＤは例示的「パッセンジャー鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはパッセンジャー鎖３’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有する。パネルＥは「パッセンジャー鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはパッセンジャー鎖５’オーバーハング１〜５０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有する。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対においては、上側の鎖がパッセンジャー鎖であり、下側の鎖がガイド鎖である。白色＝ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド）。図１Ｂは、例示的一本鎖伸長ダイサー基質のヌクレオチド修飾及び修飾パターンを示す。パネルＡは、一本鎖伸長部を有しないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはガイド鎖５’オーバーハング１〜５０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有する。パネルＣは例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはガイド鎖５’オーバーハング１〜５０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有し、その一本鎖伸長領域と相補的なショートオリゴ（「不連続相補体」；図示のとおり不連続３’パッセンジャー相補体）を伴う。パネルＤは例示的「パッセンジャー鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤を示し、これはパッセンジャー鎖３’オーバーハング１〜５０ヌクレオチド長（図示するものは１５ヌクレオチド）を有する。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対においては、上側の鎖がパッセンジャー鎖であり、下側の鎖がガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小さい矢印＝ダイサー切断部位；大きい矢印＝不連続部。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的なガイド鎖のヌクレオチド残基を始点（位置１Ａ）とする位置；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基を始点（位置１Ｂ）とする位置；Ｃ＝一本鎖伸長領域と相補的なショートオリゴの５’末端ヌクレオチドを始点（位置１Ｃ）とする位置；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基を始点（位置１Ｄ）とする位置；Ｅ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基を始点（位置１Ｅ）とする位置；Ｆ＝アンチセンス鎖５’一本鎖オーバーハングに連続した５’末端ヌクレオチドを始点（位置１Ｆ）とする位置。小さい矢印は予想されるダイサー切断部位を示す；大きい矢印は不連続部を示す。 例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長を有する（図示するものは１０〜１５ヌクレオチド）。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；淡黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記センス鎖のヌクレオチド残基を始点（位置１Ａ）とする位置；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基を始点（位置１Ｂ）とする位置。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。 例示的「パッセンジャー鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はパッセンジャー鎖３’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長を有する（図示するものは、１０〜１５ヌクレオチド）。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；淡黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記センス鎖のヌクレオチド残基を始点（位置１Ａ）とする位置；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基を始点とする位置。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。 例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長を有する。ＤＰ１３０１Ｐによって表される修飾パターンを含むパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ １３３８Ｇによって表される修飾パターンを含むガイド鎖とを有する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成した。加えて、ＤＰ１３０１Ｐで表される修飾パターンを含むパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ１３３８Ｇによって表される修飾パターンを含むガイド鎖と、ＤＰ１３７２Ｐ及びＤＰ１３７３Ｐよって示される修飾パターンを含む「不連続３’パッセンジャー相補」鎖とを有する一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成した。ＤＰ１３７０Ｇで表される修飾を含むガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤を基準として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；淡黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。 例示的「パッセンジャー鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はパッセンジャー鎖３’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長を有する。ＤＰ１ＸＸＸＧによって表される修飾パターンを含むガイド鎖と、ＤＰ１ＹＹＸＰ；ＤＰ１ＹｘｘＰ；及びＤＰ１ＹｘｘＰによって表される修飾パターンを含むパッセンジャー鎖とを有する一本鎖パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成した。ＤＰ１３０１Ｐで表される修飾を含むパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤を基準として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；淡黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。 ＫＲＡＳ−２４９Ｍを標的化する例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の配列、構造、及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はガイド鎖５’オーバーハング１〜１５ヌクレオチド長を有する。ＤＰ １３０１ Ｐによって表されるパッセンジャー鎖（配列番号１３）と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号１５）；ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号１６）；ＤＰ１３４０Ｇ（配列番号１７）；ＤＰ１３４１Ｇ（配列番号１８）；及びＤＰ１３４２Ｇ（配列番号１８）によって表されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成し、試験した。ＤＰ１３０１Ｐによって表されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ １３３６Ｇによって表されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ剤を基準として使用した。不連続相補体の修飾パターンの説明を右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖５’オーバーハング；小文字＝デオキシリボヌクレオチド；大文字＝リボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ１３３６ Ｇは配列番号１４である。 図５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤を使用したＫＲＡＳ−２４９Ｍの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。Ｈｅｌａ細胞をＲＮＡｉＭＡＸ中０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ剤で２４時間処理した。 ＨＰＲＴ １を標的化する例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の配列、構造、及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はガイド鎖５’オーバーハング１〜１５ヌクレオチド長を有する。ＤＰ １００１ Ｐ（配列番号１９）によって表されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３５０Ｇ（配列番号２１）；ＤＰ１３５１Ｇ（配列番号２２）；ＤＰ１３５２Ｇ（配列番号２２）；ＤＰ１３５３Ｇ（配列番号２３）；ＤＰ１３５４Ｇ（配列番号２４）；及びＤＰ１３５５Ｇ（配列番号２４）によって表されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成し、試験した。ＤＰ １００１ Ｐによって表されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ １００２Ｇによって表されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ剤を基準として使用した。不連続相補体の修飾パターンの説明を右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖５’オーバーハング；小文字＝デオキシリボヌクレオチド；大文字＝リボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ １００２Ｇは配列番号２０である。 図７に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤を使用したＨＰＲＴ１の正規化発現倍数を示すヒストグラムである。Ｈｅｌａ細胞をＲＮＡｉＭＡＸ中０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ剤で２４時間処理した。 ＫＲＡＳ−２４９Ｍ又はＨＰＲＴ１を標的化する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤（パッセンジャー鎖＋ガイド鎖）に対するダイサー活性を示すゲルの画像である。処理：２時間、３７℃、Ｔｕｒｂｏ Ｄｉｃｅｒ（１Ｕ／反応）。ゲル：１８％トリス、９０分、１０Ｗ。ローディング：（１μｌ ５０μＭ＋５０μｌ緩衝液及びロード１０μｌ）又は（５μｌ反応＋２０μｌ緩衝液及びロード１０μｌ）。 ガイド鎖伸長部と相補性をなす例示的ショートオリゴ（「不連続相補体」）の配列及び構造を示し、これらのショートオリゴは１〜１６ヌクレオチド長であり、５’ガイド鎖伸長部と塩基対合している。ＤＰ １３６５Ｐ；ＤＰ １３６６Ｐ；ＤＰ１３６７Ｐ；ＤＰ１３６８Ｐ；及びＤＰ１３６９Ｐによって表される不連続相補体を有する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成し、試験した。不連続相補体の修飾パターンの説明を右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖５’オーバーハング；小文字＝デオキシリボヌクレオチド；大文字＝リボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。各オリゴヌクレオチド対の下側鎖は配列番号２７である。 図７に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖並びに図１０に示す不連続相補体を有するＤｓｉＲＮＡ剤を使用したＫＲＡＳ−２４９Ｍの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤に対応する各一組の３本のバー（左から右にＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅ ＲＮＡ）の上部に表示する。Ｈｅｌａ細胞をＲＮＡｉＭＡＸ中０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ剤で２４時間処理した。 図７に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖並びに図１０に示す不連続相補体を有するＤｓｉＲＮＡ剤を使用したＨＰＲＴ１の正規化発現倍数を示すヒストグラムである。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤に対応する各一組の３本のバー（左から右にＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅ ＲＮＡ）の上部に表示する。Ｈｅｌａ細胞をＲＮＡｉＭＡＸ中０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ剤で２４時間処理した。 インビボ実験における例示的一本鎖伸長ダイサー基質の構造及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示す（実験条件：処理：１０ｍｇ／ｋｇ １回注射；標的：ＫＲＡＳ；トランスフェクション：ｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ；組織：肝臓）。パネルＡは、一本鎖伸長部を有しない陰性対照ＤｓｉＲＮＡに使用した修飾パターンを示す。パネルＢは、一本鎖伸長部を有しない陽性対照ＤｓｉＲＮＡに使用した修飾パターンを示す。パネルＣは、一本鎖伸長部を有しない試験ＤｓｉＲＮＡに使用した修飾パターンを示す。パネルＤは、ガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示するものは１０ヌクレオチド）を有する試験「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤に使用した修飾パターンを示す。パネルＥは、ガイド鎖５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示するものは１０ヌクレオチド）を有する試験「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤に使用した修飾パターンを示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対においては、上側の鎖がパッセンジャー鎖であり、下側の鎖がガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；濃黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド（ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小さい矢印＝ダイサー切断部位；大きい矢印＝不連続部。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記センス鎖のヌクレオチド残基を始点（位置１Ａ）とする位置；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基を始点とする位置。小さい矢印は予想されるダイサー切断部位を示す；大きい矢印は不連続部を示す。 ＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ １を標的化する例示的「ガイド鎖伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤の配列、構造、及び予想されるダイサー媒介プロセシングを示し、これらのＤｓｉＲＮＡ剤はガイド鎖５’オーバーハング１〜１５ヌクレオチド長を有する。５’ガイド鎖伸長部配列と塩基対合した、ガイド鎖伸長部と相補性をなす例示的ショートオリゴ（「不連続相補体」）の配列及び構造を示す。ＤＰ １３０１ Ｐによって表される修飾パターンを含むパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ、ＤＰ１３３８Ｇ、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号１６）、ＤＰ１３７１Ｇ（配列番号１６）、及びＤＰ １３５２Ｇによって表される修飾パターンを含むガイド鎖とを有する一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成した。加えて、ＤＰ １３０１ Ｐ（配列番号１３）に示される修飾パターンを含むパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号１５）、ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号１３）、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号１６）、ＤＰ １３７１Ｇ（配列番号１６）、及びＤＰ１３５２Ｇ（配列番号２２）によって表される修飾パターンを含むガイド鎖と；ＤＰ１３７２Ｐ（配列番号２８）及びＤＰ１３７３Ｐ（配列番号２８）によって表される修飾パターンを含む「不連続相補体」鎖とを有する一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡ剤を作成した。ＤＰ １３０１ Ｐ（配列番号１３）によって表される修飾を含むパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤を基準として使用し、ＤＰ１３７０Ｇ（配列番号１３）によって表される修飾を含むガイド鎖を基準として使用した。パッセンジャー鎖、ガイド鎖、及び不連続相補体の投与量を右側に表示する。不連続相補体の修飾パターンの説明もまた右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖５’オーバーハング；小文字＝デオキシリボヌクレオチド；大文字＝リボヌクレオチド。矢印は予想されるダイサー切断部位を示す。配列番号２８は配列番号２９と塩基対合する。ＤＰ１３７０Ｇは配列番号１４である。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した個々の動物の肝臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、肝臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の肝臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、肝臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の肝臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すグラフである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、肝臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した個々の動物の脾臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、脾臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の脾臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、脾臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の脾臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すグラフである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、脾臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した個々の動物の腎臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、腎臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の腎臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すヒストグラムである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、腎臓試料を分析した。 図１４及び／又は図１５に示すパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ剤で処置した動物の腎臓におけるｍＫＲＡＳの正規化発現倍数を示すグラフである。動物はｉｎ ｖｉｖｏ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇのＤｓｉＲＮＡ剤注射で処置し、腎臓試料を分析した。 初代マウス肝細胞培養物におけるＮ−アセチルガラクトサミン含有オリゴマー（ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇ；ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇ；ＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇ及びＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮａｃ：ＤＰ２２８１Ｇ）の活性を示す。パネル１は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇの活性を示し、パネル２は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇの活性を示し、パネル３は濃度に対するＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇの活性を示し、及びパネル４は濃度に対するＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮａｃ：ＤＰ２２８１Ｇの活性を示す。アンチセンス鎖又はセンス鎖の５’伸長部を伴い構築したｄｓＮＡオリゴマーを用いて、種々のクラスのオリゴマーが呈する自己送達活性を調べた（伸長部は０〜４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はトリアンテナリーリガンド並びにテトラループを有するｄｓＮＡオリゴヌクレオチドを含有し、ここでテトラループ、３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はループ上に位置し、又はループ上のトリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミンリガンド、又はステム上に位置する３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド）。 初代マウス肝細胞培養物におけるＮ−アセチルガラクトサミン含有オリゴマー（ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇ、ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇ；ＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇ；ＤＰ２４６３Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６４Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６５Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６６Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６７：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮＡｃ：ＤＰ２２８１Ｇ）の活性を示す。パネル１は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇの活性を示し、パネル２は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇの活性を示し、パネル３は濃度に対するＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇの活性を示し、パネル４は濃度に対するＤＰ２４６３Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの活性を示し、パネル５は濃度に対するＤＰ２４６４Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの活性を示し、パネル６は濃度に対するＤＰ２４６５Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの活性を示し、パネル７は濃度に対するＤＰ２４６６Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの活性を示し、及びパネル８は濃度に対するＤＰ２４６７：ＤＰ２３８２Ｇの活性を示し、及びパネル９は濃度に対するＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮａｃ：ＤＰ２２８１Ｇの活性を示す。アンチセンス鎖又はセンス鎖の５’伸長部を伴い構築したｄｓＮＡオリゴマーを用いて、種々のクラスのオリゴマーが呈する自己送達活性を調べた（伸長部は０〜４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はトリアンテナリーリガンド並びにテトラループを有するｄｓＮＡオリゴヌクレオチドを含有し、一部の実施形態においてテトラループは、ループ上に位置する３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド、又はループ上のトリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミンリガンド、又はステム上に位置する３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを有する）。 蛍光偏光計測を用いたＮ−アセチルガラクトサミン含有リガンド（ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇ、ＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇ；ＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇ；ＤＰ２４６３Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６４Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６５Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６６Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２４６７：ＤＰ２３８２Ｇ；ＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮＡｃ：ＤＰ２２８１Ｇ）のＡＳＧＰｒに対する結合親和性を示す。パネル１は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６０Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル２は濃度に対するＤＰ２４２１Ｐ：ＤＰ２４６１Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル３は濃度に対するＤＰ２４２２Ｐ：ＤＰ２４６２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル４は濃度に対するＤＰ２４６３Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル５は濃度に対するＤＰ２４６４Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル６は濃度に対するＤＰ２４６５Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、パネル７は濃度に対するＤＰ２４６６Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、及びパネル８は濃度に対するＤＰ２４６７：ＤＰ２３８２Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示し、及びパネル９は濃度に対するＤＰ２２８６Ｐ−ＧａｌＮＡｃ：ＤＰ２２８１Ｇの対ＡＳＧＰｒ結合親和性を示す。アンチセンス鎖又はセンス鎖の５’伸長部を有するｄｓＮＡオリゴマーを含め、種々のオリゴマー群が呈する結合親和性を調べた（伸長部は３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はトリアンテナリーリガンドを含有する）。ループ上に３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はトリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを伴うか、又はステム上に３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを有するテトラループを形成するｄｓＮＡを含む更なるオリゴマーもまた試験した。 Ｎ−アセチルガラクトサミンＤｓｉＲＮＡコンジュゲートで処置したマウスにおけるＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡノックダウン活性を示す。これらの図中の各コンジュゲートはテトラループを含有するが、ヌクレオチドの修飾は異なる。アンチセンス鎖又はセンス鎖の５’伸長部に３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド、又はトリアンテナリーリガンドが含まれるｄｓＮＡオリゴマーを含め、これらのオリゴマーの幾つかについてのノックダウン効率を調べた。ループ上に３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンド又はトリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミンを含むテトラループを有するｄｓＮＡオリゴヌクレオチド、及びＮ−アセチルガラクトサミンリガンドがテトラループのステム上に位置するもの。 ２５ｍｐｋの投与量のＮ−アセチルガラクトサミンＤｓｉＲＮＡで処置したマウスにおけるＨＡＯ１ ｍＲＮＡノックダウン活性を示す。センス鎖及びアンチセンス鎖の５’伸長部、及びテトラループを含むもの（各々が５’伸長部又はテトラループに付加されたリガンドＮ−アセチルガラクトサミンを有する）を含めた、５’伸長部又はテトラループ構成を含むオリゴマーのノックダウン効率を調べた。ここで３又は４個のリガンド又はトリアンテナリーリガンドの構成は、５’伸長部又はテトラループのステム若しくはループに付加されている。図２９においては、ＰＢＳ試料後の最初の６個のｄｓＮＡ分子がテトラループ分子であり、次の６個のｄｓＮＡ分子が伸長部分子である。６個のテトラループ分子は互いに修飾パターンが異なり、同様に６個の伸長部分子は互いに化学修飾パターンが異なる。修飾パターンの詳細は表３に開示する。 ＨＡＯ１ ＤｓｉＲＮＡ Ｎ−アセチルガラクトサミンコンジュゲートをマウスに投与した用量反応試験の結果を示す。センス鎖又はアンチセンス鎖上に５’伸長部を伴い構築したオリゴヌクレオチドを投与されたマウス、及びテトラループ構成についての用量反応データを示し、ここでは３又は４個のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドが５’伸長部又はテトラループ構成のステム若しくはループに付加されている。 図３１、図３１Ａ、図３１Ｂ、図３１Ｃ、及び図３１Ｄは、本発明の幾つかの実施形態構造を示す。図３１Ａは、５’末端に伸長ループ（領域Ｅ）を含むセンス鎖、センス鎖の一本鎖部分（領域Ｂ）と共にアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域を含有する「ニック入りアンチセンス」ｄｓＮＡを示す。このｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがアンチセンス鎖を切断する（黒色の矢印で図示する）。図３１Ｂは、５’末端に伸長ループ（領域Ｅ）を含むセンス鎖、センス鎖の一本鎖部分と共にアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域（領域Ｂ）、及びアンチセンス鎖上の３’オーバーハング（領域Ｆ、破線の円で囲んで図示する）を含有する「ニック入りアンチセンス」ｄｓＮＡを示す。このｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがアンチセンス鎖を切断する（黒色の矢印で図示する）。図３１Ｃは、３’末端に伸長ループ（領域Ｊ）を含むセンス鎖、及びセンス鎖の一本鎖部分と共にアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域（領域Ｈ）を含有する「ニック入りセンス」ｄｓＮＡを示す。このｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがセンス鎖を切断する（黒色の矢印で図示する）。ダイサー切断部位のすぐ近位にあるヌクレオチドはリボヌクレオチド（灰色）でなければならない。図３１Ｄは、３’末端に伸長ループ（領域Ｊ）を含むセンス鎖、及びセンス鎖の一本鎖部分と共にアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域（領域Ｈ）、及びアンチセンス鎖上の３’オーバーハング（領域Ｆ 破線の円で囲んで図示する）を含有する「ニック入りセンス」ｄｓＮＡを示す。ｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがセンス鎖を切断する（黒色の矢印）。ダイサー切断部位のすぐ近位にあるヌクレオチドはリボヌクレオチド（灰色）でなければならない。 本発明のｄｓＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の５’及び３’末端からヌクレオチドの位置をどのように計算するかを示す。図３２Ａは、テトラループを含む伸長ループをセンス鎖が有する（即ち、不連続部がｄｓＮＡのうちアンチセンス鎖と同じ側にある）場合に、センス鎖及びアンチセンス鎖の５’及び３’末端からヌクレオチドの位置をどのように計算するかを示す。センス鎖上のダイサー切断部位が図示される（短い黒色の矢印）。図３２Ｂは、テトラループを含む伸長ループをアンチセンス鎖が有する（即ち、不連続部がｄｓＲＮＡのうちセンス鎖と同じ側にある）場合に、センス鎖及びアンチセンス鎖の５’及び３’末端からヌクレオチドの位置をどのように計算するかを示す。アンチセンス鎖上のダイサー切断部位が図示される（短い黒色の矢印）。 ｄｓＮＡ分子のうちアンチセンス鎖と同じ側に不連続部が存在する場合の本発明のｄｓＮＡ、即ち、「ニック入りアンチセンスｄｓＮＡ」の例を示す。図３３Ａは、平滑末端を有する本発明の「ニック入りアンチセンス」ｄｓＲＮＡの例を示す。図３３Ｂは、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する本発明の「ニック入りアンチセンス」ｄｓＮＡの例を示す。図３３Ｃは、４ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する本発明の「ニック入りアンチセンス」ｄｓＮＡの例を示す。このｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがアンチセンス鎖を切断する（黒色の矢印）。 ｄｓＮＡ分子のうちセンス鎖と同じ側に不連続部が存在する場合の本発明のｄｓＮＡ、即ち、「ニック入りセンスｄｓＮＡ」の例を示す。図３４Ａは、平滑末端を有する本発明の「ニック入りセンス」ｄｓＲＮＡの例を示す。図３４Ｂは、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する本発明の「ニック入りセンス」ｄｓＮＡの例を示す。図３４Ｃは、４ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する本発明の「ニック入りセンス」ｄｓＮＡの例を示す。ｄｓＮＡが二重鎖化したとき不連続部が存在し、そこでダイサーがセンス鎖を切断する（黒色の矢印）。 本発明のｄｓＮＡにおいて修飾が存在し得る位置を示す。図３５Ａは、分子の領域Ｃにおける２’−Ｏ−メチル修飾（○で図示する）の位置を図示するｄｓＮＡを示す。図３５Ｂは、テトラループを含む伸長ループをセンス鎖が有する（即ち、不連続部がｄｓＮＡのうちアンチセンス鎖と同じ側にある；黒色の矢印で図示する）ｄｓＮＡを示す。図３５Ｂに示すｄｓＮＡにおいて、センス鎖の５’末端はリン酸化されていてもよく（「ｐ−」で図示する）；ガイド鎖の５’末端は脱リン酸化されていてもよく；アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端から１、２、及び３位が２’−Ｏ−メチル（○で図示する）で修飾されていてもよく；及びアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端から５位を始点として奇数の位置が２’−Ｏ−メチル（○で図示する）で修飾されていてもよい。図３５Ｂに示すｄｓＮＡにおいて、センス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端から１１及び１２位にデオキシリボヌクレオチド（●で図示する）を含有し得る。 本発明のｄｓＮＡにおいて修飾が存在し得る位置を示す。図３６Ａは、分子の領域Ｃにおける２’−Ｏ−メチル修飾（○で図示する）の位置を図示するｄｓＮＡを示す。図３６Ｂは、テトラループを含む伸長ループをアンチセンス鎖が有する（即ち、不連続部がｄｓＲＮＡのうちセンス鎖と同じ側にある；黒色の矢印で図示する）ｄｓＮＡを示す。図３４Ｂに示すｄｓＮＡにおいて、センス鎖の５’末端はリン酸化されていてもよく（「ｐ−」で図示する）；ガイド鎖の５’末端は脱リン酸化されていてもよく；アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端から１、２、及び３位が２’−Ｏ−メチル（○で図示する）で修飾されていてもよく；及びアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端から５位を始点として奇数の位置が２’−Ｏ−メチル（○で図示する）で修飾されていてもよい。図３６Ｂに示すｄｓＮＡにおいて、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から３及び４位にデオキシリボヌクレオチド（●で図示する）を含有し得る。 テトラループを含まないｄｓＲＮＡの効果、テトラループ（即ち、ＵＵＣＧ）を含むｄｓＲＮＡの効果、センス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでテトラループ（即ち、ＵＵＣＧ）を含むｄｓＲＮＡの効果、アンチセンス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでテトラループ（即ち、ＵＵＣＧ）を含むｄｓＲＮＡの効果、及びアンチセンス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでの別のテトラループ（即ち、ＧＡＡＡ）の効果を比較する実験において用いられるｄｓＲＮＡコンストラクトを示す。ｄｓＲＮＡの配列は、全てヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ−１ＣＣ；ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ−０００１９４及びＧＩ：１６４５１８９１３）に基づく。 不連続アンチセンス鎖を修飾してＲＮＡｉ経路におけるダイサープロセシング段階及びダイサー切断より下流の段階（例えば、Ａｇｏ２相互作用、標的認識、Ａｇｏ２切断）でのそれらの効果を決定する実験において用いられるｄｓＲＮＡコンストラクトを示す。ｄｓＲＮＡの配列は、全てヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ−１ＣＣ；ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ−０００１９４及びＧＩ：１６４５１８９１３）に基づく。 伸長センス鎖を修飾してＲＮＡｉ経路におけるダイサープロセシング段階及びダイサー切断より上流の段階でのそれらの効果を決定する実験において用いられるｄｓＲＮＡコンストラクトを示す。ｄｓＲＮＡの配列は、全てヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ−１ＣＣ；ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ−０００１９４及びＧＩ：１６４５１８９１３）に基づく。 ダイサーによって作られる切断産物が不連続部の配置によってどのように規定されるかを示す。ニック入りｄｓＮＡ構造は、規定の２１塩基アンチセンス鎖が産生されてＲＩＳＣにロードされるという利点を有するユニークな切断産物を誘導する。ニックを動かすことにより、他の長さのアンチセンス鎖の産生が誘導される。化学修飾によって強制的に非２１ｍｅｒ産物が産生される。 ＤＮＡテトラループ及びＤＮＡ末端がｄｓＲＮＡに対するダイサー活性を制御することを示す。テトラループを含まないｄｓＲＮＡの効果、ＤＮＡテトラループ（即ち、ｄ（ＧＴＴＡ））を含むｄｓＲＮＡの効果、センス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでＤＮＡテトラループ（即ち、ｄ（ＧＴＴＡ））を含むｄｓＲＮＡの効果、アンチセンス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでＤＮＡテトラループ（即ち、ｄ（ＧＴＴＡ））を含むｄｓＲＮＡの効果、及びアンチセンス鎖と同じ側にあるニックとの組み合わせでの別のＤＮＡテトラループ（即ち、ｄ（ＴＴＴＴ））の効果を比較する実験において二本鎖ＲＮＡコンストラクトを使用する。ｄｓＲＮＡの配列は、全てヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ−１ＣＣ；ＮＣＢＩデータベース受託番号ＮＭ−０００１９４及びＧＩ：１６４５１８９１３）に基づく。 リガンドコンジュゲート型設計を示し、ここで本発明のｄｓＮＡ分子はニック入りテトラループとリガンド、例えばＧａｌＮａｃ、コレステロール、葉酸塩、マンノース−６−リン酸とを含む。 ガイド鎖上に５’伸長部を含み、且つリガンド、例えば、ＧａｌＮａｃ、コレステロール、葉酸塩及びマンノース−６−リン酸を含む本発明のリガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子を示す。 パッセンジャー鎖上の５’伸長部と、リガンド、例えば、ＧａｌＮａｃ、コレステロール、葉酸塩及びマンノース−６−リン酸とを含む本発明のリガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子を示す。 ｄｓＮＡ分子上の一本鎖伸長部の可能な反復的組み合わせを示し、伸長部がない末端に１つ又は２つのオーバーハングがあるｄｓＮＡ分子もまた企図される。 本発明のｄｓＮＡを提示する。 本発明のｄｓＮＡを提示する。
本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の単離二本鎖核酸に細胞を接触させるステップを含む、細胞における標的遺伝子の発現を低減するための組成物及び方法を提供する。本発明のテトラループ含有ｄｓＮＡに加えて、本願はまた、アンチセンス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端又はこれらの組み合わせのいずれかに一本鎖ヌクレオチド領域を有するｄｓＮＡも提供し、ここで伸長部には、少なくとも１つの本明細書に定義するとおりのリガンドがコンジュゲートしている。これらの構造は、有効なＲＮＡ干渉剤である（図２５〜図３０及び関連する実施例を参照のこと）。多くの実施形態において、一本鎖伸長部は少なくとも１個の修飾ヌクレオチド及び／又はリン酸骨格修飾を含む。意外にも、本明細書において実証されるとおり、リガンドにコンジュゲートしていても、或いはリガンドがない場合にも、一本鎖伸長ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）又は非ダイサー基質ｓｉＲＮＡは、対応するＤｓｉＲＮＡ又は非ダイサー基質ｓｉＲＮＡと比較したとき有効なＲＮＡ阻害剤である。
ＧａｌＮＡｃなどのリガンドをｄｓＮＡ分子とｄｓＮＡ分子の５’伸長部で又はテトラループ領域にコンジュゲート可能であることにより、例えばＧａｌＮＡｃなどのリガンドに対する肝細胞であり得る目的の領域にｄｓＮＡ分子を送達することが可能になる。ｄｓＮＡ分子とのコンジュゲーションが企図される他のリガンドには、単量体又はモノアンテナリー、バイアンテナリー及びトリアンテナリーＧａｌＮＡｃを含むＡＳＧＰｒ模倣体が含まれる。ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃ模倣体の好適な例は当該技術分野において公知であり、国際公開第２０１５／００６７４０号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の１３〜２５頁にある表２、表２ａ、表３及び表３ａを参照することができる。これらの表に開示されるＧａｌＮＡｃリガンドは、好適なリンカーを使用した本発明のｄｓＮＡ分子とのコンジュゲーションに用いることができ、本発明の範囲内にあると見なされるものとする。
意外な発見として、一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡ剤は、追加的及び／又は個別的な官能基の付加を可能にし、安定化させる修飾（例えば、ＰＳ−ＮＡ部分）又は他の形態の修飾であって、かかる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド伸長ドメインを含有しないＤｓｉＲＮＡと比較したとき更なる機能性を追加する能力及び／又はかかる伸長ＤｓｉＲＮＡの例えば薬物動態、薬力学又は体内分布を向上させる能力を有する修飾の取り込み／パターン形成を可能にする伸長領域を有する機能性ＤｓｉＲＮＡを作成する原動力となる。
同程度の長さのｓｉＲＮＡ剤と比較したときダイサープロセシング後の活性がより高い伸長５’ガイド鎖、伸長３’パッセンジャー鎖、伸長５’パッセンジャー鎖又は伸長３’ガイド鎖を含むＤｓｉＲＮＡの利点は、本明細書に提示する結果によって強調される。ＲＮＡサイレンシング活性の対応する低下を認めることなくＤｓｉＲＮＡ剤の５’ガイド鎖、３’パッセンジャー鎖、５’パッセンジャー鎖又は３’ガイド鎖のいずれを伸長させることも可能であるため、構成の緊密化に起因してＲＮＡサイレンシング活性が妨げられることなく、非伸長分子には追加し得ないある種の官能基をかかる薬剤に付加することが可能になる。
意外な発見として、一本鎖伸長非ダイサー基質が標的遺伝子の発現を低減するとともに、非伸長ｄｓＮＡが、追加的及び／又は個別的な官能基の付加を可能にし、安定化させる修飾（例えば、ＰＳ−ＮＡ部分）又は他の形態の修飾であって、かかる単一のＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド伸長ドメインを含有しない対応する長さのｄｓＲＮＡ剤と比較したとき更なる機能性を追加し、及び／又はかかる伸長ｄｓＮＡの例えば薬物動態、薬力学又は体内分布を向上させるかかる修飾又は付加部分（ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｏｌｅｔｉｅｓ）の取り込み／パターン形成を可能にする伸長領域を有する機能性非ダイサー基質の作成を可能にする。
ダイサープロセシング後のｓｉＲＮＡ剤の活性は同程度の長さのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも高いレベルに保持しつつ、ｄｓＮＡ二重鎖を含有する非ダイサー基質の５’ガイド鎖、３’パッセンジャー鎖、又は５’パッセンジャー鎖のいずれを延長することもできるという新たに見出された能力によってもたらされる利点が、本明細書に提示する結果によって強調される。ＲＮＡサイレンシング活性の対応する低下を認めることなく非ダイサー基質の５’ガイド鎖、３’パッセンジャー鎖、又は５’パッセンジャー鎖のいずれをも伸長可能であることにより、緊密化した構成で存在するときかかる官能基がＲＮＡサイレンシング活性を妨害可能であるため本来は付加できないある種の官能基をかかる薬剤に付加することが可能となり得る。
加えて、一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡ剤は、一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡの一本鎖領域と塩基対合する、例えばガイド５’一本鎖伸長領域と塩基対合する第３のショート（１〜１６ヌクレオチド長）オリゴヌクレオチドを含み得る。この第３のオリゴは、有利には、（ａ）一本鎖伸長部を安定化させる働き、及び（ｂ）標的化用分子（又は他の活性薬剤）を付加し得るとともに、次には（標的化用分子を一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡに直接付加することと対比して）アニーリングによって一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡにつなぎ合わせ得る独立した実体を提供する働きをする。
テトラループは、テトラループを欠くオリゴマーと比較したとき、ヌクレアーゼ耐性の増加を含めた安定性の向上をオリゴマーにもたらす。アンチセンス鎖にニックが存在すると、オリゴマーはｓｉＲＮＡ分子及びダイサー基質の両方として（二重鎖の長さに応じて）働くことができる。オリゴマーは、ニックの存在により、予め切断されたアンチセンス鎖を含み、切断可能なダイサー基質及び／又はダイサー結合基質を提供する。テトラループ構造は、ステム及びループ領域を含め、構造内の種々の位置でリガンドに共有結合的に連結させることができる。意外にも、リガンドを加えてもテトラループ構造は影響を受けない。詳細には、テトラループヌクレオチドが各々リガンドにコンジュゲートした、テトラループ及びニックを含有するオリゴマーは、意外にもｓｉＲＮＡ分子としてのそれらの機能を維持した（例えば、実施例２２〜２４を参照のこと）。オリゴマーにニックが存在すると、アンチセンス鎖への種々の化学修飾を利用することができる。本明細書に開示されるテトラループ構造は、ＲＮＡｉ活性にダイサー切断を必要としない。
テトラループを含む一本鎖非ダイサー基質が有効性の低下を呈しないという意外な発見により、例えば追加的及び／又は個別的な官能基への非ダイサー基質の付加、安定化させる修飾（例えば、ＰＳ−ＮＡ部分）又は他の形態の修飾であって、かかる一本鎖ＤＮＡ伸長ドメインを含有しない対応する長さのｄｓＲＮＡ剤と比較したとき更なる機能性を追加する能力及び／又はかかる薬剤の例えば薬物動態、薬力学又は体内分布を向上させる能力を有する修飾の取り込み／パターン形成に対する余地をもたらす一方で、有効性は保ったままである非ダイサー基質を作成することが可能となる。
本発明の一実施形態において、テトラループはセンス鎖の５’末端に位置する。別の実施形態において、テトラループはセンス鎖の３’末端に位置する。別の実施形態において、テトラループはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。別の実施形態において、テトラループはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＮＡ分子上の任意の位置、５’又は３’末端、センス鎖又はアンチセンス鎖に位置するテトラループは、ＧａｌＮＡｃ、マンノース−６−リン酸、コレステロール及び葉酸塩などの１個以上のリガンドに容易にコンジュゲートすることができる。本明細書には、ｄｓＮＡ合成方法、コンジュゲーション方法、リガンド及びアンチセンス鎖に対するセンス鎖の５’末端又はｄｓＮＡの５’末端に位置するテトラループを含むｄｓＮＡの活性についてのアッセイが提供される。本開示のコンジュゲーション及び合成方法は、センス鎖の３’末端又はアンチセンス鎖の３’末端にテトラループを含むｄｓＮＡ分子の作成用に改変することができる。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。以下の参考文献が、本発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用されるとき、以下の用語は、特に指定のない限り、下記のとおりそれらに帰される意味を有する。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。この用語には、既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基若しくは連結を含有する核酸であって、合成のもの、天然に存在するもの、及び天然に存在しないもので、基準核酸と同様の結合特性を有するもので、且つ場合によっては、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝されるものが包含される。かかる類似体の例としては、限定なしに、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、当該技術分野で認識されているとおり、天然塩基を有するもの（標準）、及び当該技術分野において周知の修飾塩基を有するものを含んで用いられる。かかる塩基は、概してヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、概して塩基；糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドにはまた、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体も含まれる。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基部分が修飾されていないことも、又は修飾されていることもある（同義的に、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えば、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前掲；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０７０６５号パンフレット；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，国際公開第９３／１５１８７号パンフレット；Ｕｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，前掲（全てが本明細書によって参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。修飾ヌクレオチドの公知の例の一部には、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル及びペンタセニルからなる群から選択される塩基類似体が含まれる。糖部分に対する一般的な修飾の一部は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−Ｃｈ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（Ｃｈ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ、又は２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）修飾を含む群から選択される。修飾核酸塩基の他の例は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によって要約されるとおりである。核酸分子に導入し得る塩基修飾の非限定的な例の一部としては、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，ｓｕｐｒａ）。「修飾塩基」とは、この態様においては、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの均等物を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「単量体」は、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。
本明細書で使用されるとき、「二本鎖核酸」又は「ｄｓＮＡ」は、二重鎖を形成する２本のオリゴヌクレオチド鎖を含む分子である。ｄｓＮＡには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせが含まれ得る。ｄｓＮＡ分子はダイサー基質又は非ダイサー基質のいずれであってもよい。ｄｓＮＡ分子がダイサー基質である実施形態では、ｄｓＮＡ分子はダイサー基質ＮＡ（ｄｓｉＮＡ）と称される。ｄｓｉＮＡが複数のＲＮＡを含む実施形態では、それはダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）と称される。ＤｓｉＲＮＡ分子はＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方を含む。ＤｓｉＲＮＡは、ｄｓＮＡの一部であるＤｓｉＮＡの一部である。従って、用語ｄｓＮＡには、ｄｓｉＮＡ、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖及びＤｓｉＲＮＡが包含される。本発明の二本鎖ＮＡには、ＲＮＡ干渉経路のタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びＲＩＳＣに対する基質が含まれる。本発明のｄｓＮＡの例示的構造を図１、Ｂに示す。特定の実施形態において、ｄｓＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）として機能することが可能な領域におけるＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤の第２鎖の推定ダイサー切断部位より５’側の位置にある一本鎖領域とを含む。別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）として機能することが可能な領域におけるＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤の第１鎖の推定ダイサー切断部位より３’側の位置にある一本鎖領域とを含む。別の実施形態において、ｄｓＮＡは、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）であるＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤の第２鎖の推定ダイサー切断部位より３’側の位置にある、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド及び／又はリン酸骨格修飾を含む一本鎖領域とを含む。代替的な実施形態において、本発明は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）であるＲＮＡ二重鎖と、ＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤の第１鎖の推定ダイサー切断部位より５’側の位置にある、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド及び／又はリン酸骨格修飾を含む一本鎖領域とを含むｄｓＮＡを提供する。
本明細書で使用されるとき、用語「オリゴマー」は、「二本鎖核酸」（ｄｓＮＡ）と同義的に使用される。オリゴマー（ｄｓＮＡ分子）は単量体（ヌクレオチド）を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「複数」は、２より大きい数、例えば、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「スペーサー」は、リガンド修飾ヌクレオチドを互いに隔てるヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「遊離可能なリンカー」は、細胞内若しくは動物体内の生理条件下又はインビボ条件下でリガンドをヌクレオチドと結び付ける結合の切断を受けることが可能なリンカーを指す。遊離可能なリンカーには生物学的に不安定なリンカーが含まれ、切断によってｄｓＮＡ分子からリガンドが遊離する。リンカー部分はまた、様々な条件下で切断可能である。好適な切断条件としては、限定はされないが、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離及び置換反応、また連結の熱力学特性を挙げることができる。遊離可能なリンカーは本質的に光解離性であってもよく、ここでリンカーは特定のＵＶ波長の下で切断され、光解離性リンカーを含有する発明を含む本発明のｄｓＮＡを用いて目的の標的細胞又は組織に化合物を送達することができ、続いてＵＶ光源の存在下で遊離させることができる。
本明細書で使用されるとき、用語「生分解性リンカー」は、生分解性であるように設計された、且つある分子を別の分子、例えば生理活性分子に結び付けるリンカーとして働く核酸又は非核酸分子を指す。生分解性リンカーの安定性は、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学修飾ヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル及び他の２’修飾又は塩基修飾ヌクレオチドの様々な組み合わせを用いることによって調節し得る。生分解性リンカーは、二量体、三量体、四量体又はそれより長く、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであってもよく、又はリンベースの連結を含む単一ヌクレオチド長を含んでもよい。生分解性リンカーははまた、核酸骨格、核酸糖、又は核酸塩基修飾も含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「生分解性」は、生体系における分解、例えば酵素分解又は化学分解を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「検出可能標識」は、当該技術分野において公知の任意の好適な標識を指し、限定はされないが、放射標識、化学発光、及び蛍光標識が挙げられる。多くの場合、標識は、標識された核酸分子の細胞取り込みを実質的に改変しないタイプのものである。
本明細書で使用されるとき、用語「色素」は、化学発光又は蛍光のいずれかによって検出することのできる標識を指し、一般的に使用される例としては、限定はされないが、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、ｃｙ３及びｃｙ５等が挙げられる。１つ又は複数の標識によって生成される１つ又は複数のシグナルは、目視（例えば顕微鏡法による）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含め、いかなる方法によって計測されてもよい。いずれにしろ、１つ又は複数の標識によって生成される１つ又は複数のシグナルの計測値を用いて、（ａ）その標識を取り込んだ細胞の数又は割合、（ｂ）個々の細胞又は細胞群が取り込んだ１つ以上の標識の量、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を決定し得る。
本明細書で使用されるとき、用語「半減期」は、分子、例えばｄＮＡ、代謝産物、医薬品、放射性ヌクレオチド、治療用分子、色素又はシグナル伝達分子がその薬理学的、生理学的、若しくは放射線学的活性の半分又はその強度の半分を使用するのにかかる時間を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「リガンド修飾ヌクレオチド」又は「リガンドコンジュゲート型ヌクレオチド」又は「リガンド含有ヌクレオチド」は、リガンドが付加されているヌクレオチドを指して同義的に使用され、付加は、糖若しくは塩基への付加であるか、又はリンカーを使用することによる末端リン酸への付加のいずれかである。
本明細書で使用されるとき、「ＤｓｉＲＮＡ」又はダイサー基質ｓｉＲＮＡ剤は、二重鎖を形成する２本のオリゴヌクレオチド鎖を含む分子である。ＤｓｉＲＮＡ剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせを含み得る。ＤｓｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡｉ干渉経路のダイサー酵素によってプロセシングされることになる。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、推定ダイサー酵素切断部位に直に隣接する部位にデオキシリボヌクレオチド残基を有し得る。例えば、図２に示される全てのＤｓｉＲＮＡ並びに図３に示される６、７、８、９、１０、１１、及び１２番目のＤｓｉＲＮＡにおいて、（第１鎖の５’末端残基を始点１位として）２４位及び２４位より３’側の部位（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０位等）にデオキシリボヌクレオチドが存在し得る。デオキシリボヌクレオチドはまた、第１鎖の２０位と相補的なヌクレオチドから始まる第２鎖上にも、またこのヌクレオチドの５’方向に位置する第２鎖上の位置にもあり得る。従って、本発明の特定の有効なＤｓｉＲＮＡは、かかるＤｓｉＲＮＡの第１鎖内、第２鎖内、及び／又は両方の鎖内へのデオキシリボヌクレオチドの導入開始前は、１９個の二重鎖化したリボヌクレオチドのみを有する。
本明細書で使用されるとき、「二重鎖」は、２つの一本鎖核酸の相互作用によって形成された二重らせん構造を指す。本発明によれば、二重鎖は、ｄｓＮＡのセンス及びアンチセンス、又は標的及びアンチセンス鎖である第１鎖及び第２鎖を含有し得る。二重鎖は、典型的には、互いに対して逆平行の向きの２つの一本鎖核酸間における塩基の対水素結合、即ち「塩基対合」によって形成される。本明細書で使用されるとき、用語「二重鎖」は、鎖の整列した塩基が相補的である場合、それらがワトソン・クリック塩基対となり得るように整列する第１鎖及び第２鎖の領域を指す。用語「二重鎖」は、５’又は３’末端一本鎖ヌクレオチドを成す１つ以上の一本鎖ヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、二重鎖は、完全に（１００％）塩基対合していてもよい整列した第１鎖及び第２鎖の領域、並びに二重鎖の第１鎖５’末端ヌクレオチド及び二重鎖の第１鎖３’末端ヌクレオチドが第２鎖の対応するヌクレオチドとワトソン・クリック型の塩基対合をなしている限りにおいて１、２、３、４、５個又はそれ以上の非対合塩基を含有する整列した第１鎖及び第２鎖の領域を含む。本明細書で使用されるとき、「完全に二重鎖化した」は、対になった５’及び３’末端ヌクレオチドの間にある全てのヌクレオチドが塩基対合していることを指す。本明細書で使用されるとき、「実質的に二重鎖化した」は、鎖間の二重鎖において第１鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０個の非対合塩基対（連続又は非連続）があることを指す。
「実質的に二重鎖化した」との関連で、「連続」、二重鎖化したヌクレオチドに言及するときの「連続」は、他の鎖とワトソン・クリック塩基対合を形成しないセンス鎖又はアンチセンス鎖上の２個より多い一続きの隣接ヌクレオチドを意味する。
「実質的に二重鎖化した」との関連で、二重鎖化したヌクレオチドに言及するときの「非連続」は、２個以上のヌクレオチドによって互いに隔てられているセンス鎖又はアンチセンス鎖上のミスマッチを意味する。
二重鎖における対合は、概してワトソン・クリック塩基対合によって起こり、例えば、グアニン（Ｇ）はＤＮＡ及びＲＮＡにおいてシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し（従って、グアニンデオキシリボヌクレオチドのコグネイトヌクレオチドはシトシンデオキシリボヌクレオチドであり、逆もまた同様である）、アデニン（Ａ）はＤＮＡにおいてチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、及びアデニン（Ａ）はＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対が形成され得る条件としては、生理的条件又は生物学的に関連性のある条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）が挙げられる。更に、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間のスタッキング相互作用によって安定化する。本明細書で使用されるとき、二重鎖は、塩基対合によるか、又はスタッキング相互作用によって構築又は維持され得る。二重鎖は２本の相補的な核酸鎖によって形成され、これらの核酸鎖は実質的に相補的であるか、又は完全に相補的であり得る（下記参照）。
本明細書で使用されるとき、「〜に対応する」又は「〜に対応している」は、第２鎖が１〜６ヌクレオチド長の３’一本鎖オーバーハングを含むように第１鎖１位が前記第２鎖のヌクレオチドと塩基対合するとき第２鎖のヌクレオチド残基が第１鎖の残基と整列するように二重鎖において整列している第１鎖及び第２鎖塩基を指す。「〜に対応する」は、ワトソン・クリック塩基対の形成による対合を必要とするものではなく、むしろ整列した非対合の第１鎖／第２鎖ヌクレオチド並びに整列し且つ塩基対合した第１鎖／第２鎖ヌクレオチドの両方を含む。
「相補的」又は「相補性」とは、ある核酸が別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合又はフーグスティーン塩基対合のいずれかによって１つ又は複数の水素結合を形成し得ることを意味する。本開示の核酸分子に関連して、核酸分子のその相補配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連性のある機能、例えばＲＮＡｉ活性が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ，ｐｐ．１２３−１３３，１９８７；Ｆｒｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７，１９８６；Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５，１９８７を参照のこと）。パーセント相補性は、核酸分子において第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することのできる隣接残基の割合を示す（例えば、第１のオリゴヌクレオチドの合計１０個のヌクレオチド中５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドが１０個のヌクレオチドの第２の核酸配列と塩基対合すると、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性となる）。パーセント相補性が少なくともある特定の割合であることを決定するには、核酸分子において第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することのできる隣接残基の割合を計算し、端数を切り捨てて丸める（例えば、第１のオリゴヌクレオチドの合計２３個のヌクレオチド中１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチドが２３個のヌクレオチドの第２の核酸配列と塩基対合すると、それぞれ５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、及び７４％となり；それぞれ少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、及び７０％の相補性を有する）。本明細書で使用されるとき、「実質的に相補的」は、生物学的条件下でハイブリダイズ能を有するような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％の相補性を有する。加えて、２本の鎖が生物学的条件下でハイブリダイズ能を有するかどうかを、それらのヌクレオチド配列を調べることによって決定する技法は、当該技術分野において周知である。
本明細書で使用されるとき、アンチセンス鎖に関連して「３’領域」は、センス鎖の対応する１〜１９位、１〜２０位又は１〜２１位と整列するアンチセンス鎖のヌクレオチドに対して（アンチセンス鎖上の）３’側遠位にあるアンチセンス鎖の連続ヌクレオチドを指す。誤解を避けるため、「３’領域」は、アンチセンス鎖に言及するとき、アンチセンス鎖とそのコグネイト標的ＲＮＡとの間に形成される二重鎖において推定アルゴノート２（Ａｇｏ２）切断部位より（５’側遠位にある標的ＲＮＡ上のヌクレオチドに対応するアンチセンス鎖上の）３’側遠位にあるアンチセンスヌクレオチドを包含することが意味される。
本明細書で使用されるとき、「シントン」は、目的とする特定の配列を有する修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ分子を作製するため固相合成方法で用いることのできるヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分を意味する。特定の実施形態において、シントンは、リガンド、例えば、ＧａｌＮａｃ、マンノース−６−リン酸、コレステロール又は葉酸塩にコンジュゲートしたヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分であり、ここでコンジュゲートしたヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分は、固相合成において目的の核酸分子の作製に用いることができる。特定の実施形態において、シントンは、ヌクレオチド又は非ヌクレオチド部分のリガンドとのコンジュゲーションに介在するリンカーを更に含む。
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル等）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含めた、飽和脂肪族基を含む。特定の実施形態において、直鎖又は分枝鎖アルキルはその骨格に炭素原子を６個以下（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個以下有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に５又は６個の炭素を有する。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。
更に、特記されない限り、用語アルキルは「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方を含み、このうち後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。シクロアルキル類は、例えば上記に記載する置換基で更に置換されていてもよい。「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」部分は、アリール（例えば、フェニルメチル（ベンジル））で置換されたアルキルである。用語「アルキル」にはまた、天然及び非天然アミノ酸の側鎖も含まれる。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（即ち、非分枝状）非置換アルキル基を意味する。
用語「アルケニル」は、上記に記載したアルキルと長さ及び可能な置換の点で類似した、しかし少なくとも１つの二重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキル又はアルケニル置換シクロアルケニル基、及びシクロアルキル又はシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。特定の実施形態において、直鎖又は分枝鎖アルケニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基はそれらの環構造に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に５又は６個の炭素を有し得る。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含有するアルケニル基を含む。
更に、特記されない限り、用語アルケニルには「非置換アルケニル」及び「置換アルケニル」の両方が含まれ、このうち後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルケニル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。
用語「アルキニル」は、上記に記載したアルキルと長さ及び可能な置換の点で類似した、しかし少なくとも１つの三重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等）、分枝鎖アルキニル基、及びシクロアルキル又はシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。特定の実施形態において、直鎖又は分枝鎖アルキニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含有するアルキニル基を含む。
更に、特記されない限り、用語アルキニルには「非置換アルキニル」及び「置換アルキニル」の両方が含まれ、このうち後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。
炭素の数が特に指定されない限り、「低級アルキル」は、本明細書で使用されるとき、上記に定義するとおりのアルキル基であって、但しその骨格構造に１〜５個の炭素原子を有するものを意味する。「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」は、例えば２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。
用語「アルコキシ」は、酸素原子に共有結合的に連結した置換及び非置換アルキル、アルケニル、及びアルキニル基を含む。アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、及びペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例としては、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボン酸塩、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボン酸塩、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分など、独立して選択される基で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例としては、限定はされないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシ等が挙げられる。
用語「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の任意の元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄及びリンである。
用語「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、−ＯＨ又は−Ｏ−（適切な対イオンを有する）を有する基を含む。
用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素等を含む。用語「過ハロゲン化された」は、概して、全ての水素がハロゲン原子に置き換えられている部分を指す。
用語「置換されている」は、部分上に置くことができ、且つ分子がその意図される機能を果たすことを許容する、独立して選択される置換基を含む。置換基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｓ（Ｏ）１−２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０−３ＣＯ２Ｒ’、又は（ＣＲ’Ｒ’’）０−３０Ｒ’基［式中、各Ｒ’及びＲ’’は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、又はアリール基であるか、又はＲ’及びＲ’’は一緒になってベンジリデン基又は−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基である］が挙げられる。
用語「アミン」又は「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１つの炭素又はヘテロ原子に共有結合している化合物又は部分を含む。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１つの更なるアルキル基に結合している基及び化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が少なくとも２つの更なるアルキル基に結合している基を含む。
用語「エーテル」は、２つの異なる炭素原子又はヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物又は部分を含む。例えば、この用語は「アルコキシアルキル」を含み、これは、別のアルキル基に共有結合している酸素原子に共有結合したアルキル、アルケニル、又はアルキニル基を指す。
本発明の薬剤の第１鎖及び第２鎖（センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、二重鎖化した領域において完全に相補的である必要はない。一実施形態では、アンチセンス鎖のＲＮＡ配列が１個以上のミスマッチ（１、２、３、４、５、６個、連続又は非連続）を含有し、即ち、本発明に係る単離二本鎖核酸の二重鎖化したセンス鎖に対してミスマッチを有し、１個以上（１、２、３、４又は５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個連続又は非連続）の修飾ヌクレオチド（塩基類似体）を含有する。例示的実施形態において、かかるミスマッチは、アンチセンス鎖のＲＮＡ配列の３’領域（上記に定義するとおり）内に存在する。一態様では、２、３、４又は５個のミスマッチ又は塩基類似体を含む修飾ヌクレオチドが、標的ＲＮＡ配列がハイブリダイズしたときにアンチセンス鎖において標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位より３’側にあるアンチセンス鎖のＲＮＡ配列内に組み込まれる。
ＲＩＳＣへのアンチセンス鎖の侵入が、恐らくはＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡの侵入に伴い起こる一部の律速巻き戻し段階への影響によって促進され、又はそれに有利となるように、ミスマッチ又は熱力学的安定性の低下（特にｓｉＲＮＡのセンス領域の３’末端残基／アンチセンス領域の５’末端残基又はその近傍における）を用いることが提案されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そのため、活性な２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するためのアルゴリズム設計に、末端塩基組成が含まれるようになっている（Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤内にかかるミスマッチを含めると、かかる薬剤が天然に存在するｍｉＲＮＡと類似した阻害効果を及ぼすことが可能になり得るとともに、任意選択でそれを天然に存在するｍｉＲＮＡ標的ＲＮＡ（例えば、標的転写物の３’ＵＴＲ領域）に対するのみならず、天然に存在するアンタゴニストｍｉＲＮＡの存在が知られていないＲＮＡ配列に対してもまた仕向けることができる。例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡによっては標的化されないであろう遺伝子／転写物内の反復配列を標的化するため、ｍｉＲＮＡと類似する及び／又はそれとして機能するように設計された、ミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡを合成することができる（例えば、Ｎｏｔｃｈタンパク質内のリピート配列を標的化することができ、ここでＮｏｔｃｈ内の個々のリピートは核酸レベルで互いに異なり得る（例えば、縮重している）が、ミスマッチを許容するとともに、更には対応する完全マッチのｓｉＲＮＡ剤と比べてより広域の阻害効果もまた許容するｍｉＲＮＡ機構を介することにより、それらを有効に標的化することができる）。かかる実施形態において、ミスマッチ含有ＤｓｉＲＮＡ剤が阻害効果を発揮するのに標的ＲＮＡ切断は必要であることも、又は必要でないこともあり得る。
一実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、又はそれとして機能する。「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害又はヘテロクロマチンサイレンシングのいずれかによって標的メッセンジャーＲＮＡの発現を調節する小さい二本鎖ＲＮＡを意味する（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８を参照のこと）。一実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖（例えば第１鎖）又はセンス領域とアンチセンス鎖（例えば第２鎖）又はアンチセンス領域との間又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と対応する標的核酸分子（例えば標的ｍＲＮＡ）との間に部分的な相補性（即ち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的相補性は、二本鎖核酸分子構造内に様々なミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドバルジなど、１、２、３、４、５個又はそれ以上のミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド）を含んでもよく、これによってｍｉＲＮＡのセンス鎖又はセンス領域とアンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間又はｍｉＲＮＡのアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に生じるバルジ、ループ、又はオーバーハングが生じ得る。
幾つもの塩基にわたって塩基対合する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、典型的には生理条件下又は生物学的に関連性のある条件下（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）で決定される。ハイブリダイゼーション条件は、概して一価のカチオン及び生物学的に許容可能な緩衝液を含み、二価カチオン、錯アニオン、例えばグルコン酸カリウムのグルコン酸塩、スクロースなどの非荷電種、及び試料中の水の活性を低下させる不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含むことも、又は含まないこともある。かかる条件には、塩基対の形成が可能となる条件が含まれる。
ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成する一本鎖核酸を解離するのに必要な温度、即ち（融解温度；Ｔｍ）によって測られる。ハイブリダイゼーション条件はまた、塩基対が形成し得る条件でもある。様々なストリンジェンシー条件を用いてハイブリダイゼーションを決定することができる（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。ストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、及び最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれ得る。５０塩基対長未満であることが予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いはずであり、ここでＴｍは以下の式に従い決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ １０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）［式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、及び［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）］。例えばハイブリダイゼーション決定緩衝液を表１に示す。
ハイブリダイゼーション条件に関する有用な変形例は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド鎖」は一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体等）又はこれらの組み合わせを含み得る。かかる修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの向上及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加など、特性上の理由から、天然形態より好ましいこともある。
本発明のある種のｄｓＮＡは、キメラｄｓＮＡである。「キメラｄｓＮＡ」又は「キメラ」は、本発明の文脈上、各々が少なくとも１つのヌクレオチドで構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｄｓＮＡである。キメラｄｓＮＡはダイサー基質又は非ダイサー基質であってもよい。一部の実施形態において、これらのｄｓＮＡは、典型的には、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）分子を形成するリボヌクレオチド（任意選択で修飾リボヌクレオチドを含む）を主として含む少なくとも１つの領域を含有する。このＤｓｉＲＮＡ領域は、１つ以上の有益な特性（例えば、有効性の増加、例えばＤｓｉＲＮＡ活性の効力及び／又は持続期間の増加、例えば培養下の細胞又は対象への投与時にキメラｄｓＮＡを特定の位置に標的化する認識ドメイン又は手段としての機能、官能基、ペイロード、検出／検出可能な部分の付加を改善する伸長領域としての機能、より望ましい修飾及び／又はかかる修飾の間隔の改善を可能にする伸長領域としての機能など）を付与する一本鎖ヌクレオチド領域（「一本鎖伸長領域」）を含む第２の領域に、例えば従来のリン酸結合を介するか、又は修飾リン酸連結（例えばホスホロチオエート）を介して共有結合的に付加される。この第２の領域はまた、修飾又は合成ヌクレオチド及び／又は修飾又は合成デオキシリボヌクレオチドも含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「リボヌクレオチド」は、天然及び合成の非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチドにおける糖部分、塩基部分及び／又はリボヌクレオチド間の連結の変化が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「リボヌクレオチド」は、２’リボース環位に単一のプロトン基を有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドを具体的に除外する。
本明細書で使用されるとき、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、天然及び合成の非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチドにおける糖部分、塩基部分及び／又はデオキシリボヌクレオチド間の連結の変化が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「デオキシリボヌクレオチド」はまた、ｄｓＮＡ剤のダイサー切断を許容しない修飾リボヌクレオチド、例えば、かかる残基の結合でダイサー切断が起こることを許容しない２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド残基等も含む。
本明細書で使用されるとき、用語「ＰＳ−ＮＡ」はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド残基を指す。従って用語「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）及びホスホロチオエート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）の両方を包含する。
特定の実施形態において、本発明のキメラＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤は、少なくとも２３ヌクレオチド長の少なくとも１つの二重鎖領域を含み、その中で全ヌクレオチドの少なくとも５０％が非修飾リボヌクレオチドである。本明細書で使用されるとき、用語「非修飾リボヌクレオチド」は、リボース糖の２’位にヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するリボヌクレオチドを指す。
特定の実施形態において、本発明のキメラＤｓｉＲＮＡ／ＤＮＡ剤は、第１鎖上の推定ダイサー切断部位より３’側及び第２鎖上の推定ダイサー切断部位より５’側に位置する、塩基対合した少なくとも２ヌクレオチド長の長さを有する少なくとも１つの領域を含み、ここで塩基対合した少なくとも２ヌクレオチド長のこの領域内の全ヌクレオチドの少なくとも５０％が非修飾デオキシリボヌクレオチドである。本明細書で使用されるとき、用語「非修飾デオキシリボヌクレオチド」は、リボース糖の２’位に単一のプロトンを有するリボヌクレオチドを指す。
本明細書で使用されるとき、アンチセンス鎖、ガイド鎖及び第２のオリゴヌクレオチドは、本発明に係る所与のダイサー基質分子の同じ鎖を指し；一方、センス鎖、パッセンジャー鎖、及び第１のオリゴヌクレオチドは、所与のダイサー基質の同じ鎖を指す。
本明細書で使用されるとき、「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が塩基類似体による修飾ヌクレオチドを含有する場合、その全長にわたって相補的である必要はなく、しかし少なくとも標的ＲＮＡとハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は標的の発現を阻害するのに十分に相補的であり、例えば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％相補的である。
本明細書で使用されるとき、「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が塩基類似体による修飾ヌクレオチドを含有する場合、センス鎖はアンチセンス鎖の全長にわたって相補的である必要はなく、しかし少なくともアンチセンス鎖とのハイブリッド形成能を有し、ひいてはアンチセンス鎖との二重鎖化が可能でなければならない。
本明細書で使用されるとき、「ガイド鎖」は、ｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子の一本鎖核酸分子を指し、これは、ＲＮＡ干渉を生じさせるのに標的ＲＮＡの配列と十分に相補的な配列を有する。一部の実施形態では、ＲＩＳＣへのガイド鎖の取り込みにダイサー切断は不要である。一部の実施形態では、ダイサーによるｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子の切断後にもガイド鎖の断片はＲＩＳＣと会合したまま留まり、ＲＩＳＣ複合体の一成分として標的ＲＮＡと結合して、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの切断を促進する。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
本明細書で使用されるとき、「標的ＲＮＡ」は、標的化された切断又は立体的遮断など、アンチセンス鎖によってガイドされる調節を受け得るＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、例えば、ゲノムウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又は非コードＲＮＡであり得る。好ましい標的は、ＡｐｏＢ、Ｂｃ１２、Ｈｉｆ−１α、サバイビン又はｐ２１ ｒａｓ、例えばＨａ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ又はＮ−ｒａｓなど、疾患関連タンパク質をコードするｍＲＮＡなどのｍＲＮＡである。
本明細書で使用されるとき、「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖の配列と相補的な配列を有する、ｄｓＮＡ又はｄｓＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指す。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
本明細書で使用されるとき、「ダイサー」は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はプレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を切断して、通常３’末端に２塩基オーバーハングを有する約１９〜２５ヌクレオチド長の二本鎖核酸断片にするＲＮアーゼＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明のｄｓＮＡに関連して、本発明のｄｓＮＡのｄｓＲＮＡ領域によって形成される二重鎖はダイサーによって認識され、二重鎖の少なくとも一方の鎖上のダイサー基質である。ダイサーはＲＮＡ干渉経路の最初の段階を触媒し、その結果として標的ＲＮＡの分解が生じる。ヒトダイサーのタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベースに受託番号ＮＰ−０８５１２４（本明細書によって参照により援用される）として提供される。
ダイサー「切断」は以下のとおり決定される（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：１８７−２００（２００８）を参照のこと）。ダイサー切断アッセイでは、ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１単位の組換えヒトダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）含有又は不含の２０μＬの２０ｍＭトリス ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣ１２中、３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＳＲ ９６ウェルプレート（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）を使用して試料を脱塩する。ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェア及びＰａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４ ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）からなるＯｌｉｇｏ ＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）を使用して、ダイサーによる処理前及び処理後の二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレー−イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を行う。このアッセイでは、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ（即ち、ｄｓＲＮＡ単位で２５〜３５、好ましくはｄｓＲＮＡ単位で２６〜３０、任意選択で本明細書に記載されるとおり伸長されている）の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は更には１００％が切断されてより短いｄｓＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ単位で１９〜２３、好ましくは、ｄｓＲＮＡ単位で２１〜２３）になる場合にダイサー切断が起こる。
本明細書で使用されるとき、「ダイサー切断部位」は、ダイサーがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のｄｓＮＡのｄｓＲＮＡ領域）を切断する部位を指す。ダイサーは２つのＲＮアーゼＩＩＩドメインを含有し、それらが典型的にはｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を切断する。ＲＮアーゼＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの間の平均距離が、それが産生するショート二本鎖核酸断片の長さを決め、この距離は様々であり得る（Ｍａｃｒａｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ Ｄｉｃｅｒ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１（５７５８）：１９５−８．）。例えば図２に示されるとおり、ダイサーは、２ヌクレオチド３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を持つ本発明の特定の二本鎖核酸を、アンチセンス鎖の３’末端から取って２１番目のヌクレオチドと２２番目のヌクレオチドとの間の部位、及びセンス鎖の５’末端から取って２１番目のヌクレオチドと２２番目のヌクレオチドとの間の対応する部位で切断すると推定される。図２に示すものと異なるｄｓＮＡ分子の推定上の及び／又は優勢な１つ又は複数のダイサー切断部位も同様に、Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌに記載されるものを含め、当該技術分野で認められている方法によって同定し得る。図２に示されるダイサー切断イベントでは２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡが生じるが、ｄｓＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）のダイサー切断は、１９〜２３ヌクレオチド長のダイサープロセシング後ｓｉＲＮＡ長さを生じさせ得ることが注記される。実際、以下に更に詳細に記載する本発明の一態様では、典型的には好ましくない１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡの優勢なダイサー切り出しを誘導する目的で、ｄｓＮＡ内に二本鎖ＤＮＡ領域が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「オーバーハング」は、ｄｓＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかに２又は４個の遊離端を有する二重鎖との関連で、非対合ヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、オーバーハングはアンチセンス鎖又はセンス鎖上の３’又は５’オーバーハングである。「オーバーハング」及び「伸長部」は全体を通じて同義語として用いられる。
本明細書で使用されるとき、「標的」は、その発現又は活性を調節しようとする任意の核酸配列を指す。詳細な実施形態において、標的は、ＲＩＳＣ複合体のアンチセンス鎖である一本鎖核酸と二重鎖化するＲＮＡを指す。標的ＲＮＡがアンチセンス鎖とハイブリダイズすると、ＲＩＳＣ複合体によるプロセシングが起こる。結果的に、ＲＮＡ又はＲＮＡによってコードされるタンパク質、例えばｍＲＮＡの発現が減少する。
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡプロセシング」は、以下に更に詳細に記載するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＲＮアーゼＨ経路の成分（例えば、ドローシャ、ダイサー、アルゴノート２又は他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼ、及びＲＮアーゼＨ）によって実行されるプロセシング活性を指す（以下の「ＲＮＡプロセシング」の節を参照のこと）。この用語は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後プロセス及び非ＲＩＳＣ媒介又は非ＲＮアーゼＨ媒介プロセスによるＲＮＡの分解とは明示的に区別される。ＲＮＡのかかる「分解」は、例えば脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、及び／又は幾つかのエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼ等）のいずれかによるＲＮＡ本体の一部又は全てのヌクレアーゼ消化など、幾つかの形態をとり得る。
本明細書で使用されるとき、「基準」とは、標準又は対照を意味する。当業者には明らかなとおり、適切な基準は、１つの要素の効果を決定するため唯１つのみの要素が変更される場合である。
本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、フラノース環、又はリン酸基に１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾は、メチルトランスフェラーゼなど、ヌクレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然に存在するものを含む。修飾ヌクレオチドはまた、合成の又は天然に存在しないヌクレオチドも含む。ヌクレオチドにおける合成の又は天然に存在しない修飾としては、２’修飾、例えば、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を有するもの、又は塩基類似体を含むものが挙げられる。本開示に記載されるとおりの２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これらは修飾されていても、又は修飾されていなくてもよい。かかる修飾基については、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号明細書及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号明細書に記載されている。
用語「インビトロ」は、例えば、精製試薬又は抽出物、例えば細胞抽出物が関わる、その当該技術分野で認められている意味を有する。用語「インビボ」もまた、例えば、生細胞、例えば、不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生物体の細胞が関わる、その当該技術分野で認められている意味を有する。
本開示の核酸分子に関連して、ｄｓＮＡのいずれか一方の鎖上の特定の位置にあるヌクレオチドが指定され得る。図１〜図３を参照して、本発明のＤｓｉＲＮＡの位置の表示規則を表２に示す。
本開示の核酸分子に関連して、修飾はｄｓＮＡの鎖上にパターンをもって存在し得る。本明細書で使用されるとき、「交互位置」は、ｄｓＮＡの鎖の規定の長さにわたってヌクレオチドが１つおきに修飾ヌクレオチドであるか、又は各修飾ヌクレオチド間に非修飾ヌクレオチド（例えば非修飾リボヌクレオチド）があるパターン（例えば、５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’；３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’；式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）を指す。修飾パターンは、本明細書に記載される位置付番規則のいずれかに従い５’又は３’末端のいずれかの１番目のヌクレオチド位置を始点とする（特定の実施形態において、１位は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の推定ダイサー切断イベント後の鎖の末端残基を基準として指定される；従って、必ずしも１位が本発明のプロセシング前の薬剤の３’末端又は５’末端残基を成すわけではない）。
表２：鎖位置に関する付番規則の説明
１位：パッセンジャー鎖上にある位置は、上付きの添え字による表示のない番号によって指示される（例えば、１位）。パッセンジャー鎖の１位は５’末端ヌクレオチドであり、但し５’伸長パッセンジャー鎖では５’末端ヌクレオチドは伸長領域に存在し、それに上付きの添え字Ｅを付した最も大きい番号が与えられる（下記及び図１Ａを参照）。
Ａ位：ガイド鎖上にある位置は、上付きの添え字Ａを付して指示される（例えば、１Ａ位）。ガイド鎖は、その３’末端の１番目の塩基対合ヌクレオチドが基準（例えば、１Ａ位）となるように付番される。ガイド鎖が１〜６ヌクレオチドの３’末端一本鎖オーバーハングを含有する場合、それらのヌクレオチドは単に３’末端ガイド鎖非対合又は一本鎖残基と称される。
Ａ１位：ガイド鎖上の伸長５’領域にある位置は、上付きの添え字Ｂを付して表示される（例えば、１Ｂ位は伸長ガイド鎖の５’末端ヌクレオチドを表す（図１Ａを参照））。
Ｃ位：第３のオリゴヌクレオチド上にある位置。第３のオリゴヌクレオチドはガイド鎖の伸長領域と相補的であり、パッセンジャー鎖と不連続である。１Ｃ位（図１Ａを参照）は第３のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｃｌｅｏｔｉｄｅ）の５’末端ヌクレオチドを表す。
Ｄ位：３’伸長パッセンジャー鎖上にある位置で、１Ｄ位が伸長パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基を指す。
Ｅ位：パッセンジャー鎖の５’伸長位置１Ｅの伸長領域上にある位置、これは鎖５’一本鎖伸長部の非対合ヌクレオチドである（図１Ａを参照）。
１Ｅ位：パッセンジャー鎖の１番目の塩基対合ヌクレオチドに連続（即ち隣接）する非対合ヌクレオチドである（図１Ａを参照）。
Ｆ位：５’伸長パッセンジャー鎖の二重鎖領域にある位置で、１Ｆ位が５’パッセンジャー鎖上の１番目の塩基対合ヌクレオチド（５’末端を始点とする）を指す。
交互位置の修飾ヌクレオチドパターンは鎖の全長に延在し得るが、特定の実施形態では、それぞれ少なくとも２、３、４、５、６又は７修飾ヌクレオチドを含有する少なくとも４、６、８、１０、１２、１４ヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「交互の位置ペア」は、ｄｓＮＡの鎖の規定の長さにわたって２つの連続した修飾ヌクレオチドが２つの連続した非修飾ヌクレオチドによって隔てられているパターンを指す（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’；３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’；式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書に記載される位置付番規則のいずれかに従い５’又は３’末端のいずれかの１番目のヌクレオチド位置を始点とする。交互位置の修飾ヌクレオチドパターンは鎖の全長に延在し得るが、好ましくは、それぞれ少なくとも４、６、８、１０、１２又は１４個の修飾ヌクレオチドを含有する少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８ヌクレオチドを含む。上記の修飾パターンは例示であり、本発明の範囲を限定するよう意図されるものではないことが強調される。
本明細書で使用されるとき、「塩基類似体」は、核酸二重鎖に組み込むことのできる修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位（又は核酸二重鎖に組み込むことのできるヌクレオチド糖部分置換における等価な位置）に位置する複素環式部分を指す。本発明のｄｓＮＡにおいて、塩基類似体は概して、一般的な塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ）を除くプリン塩基又はピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡにおける他の塩基又は塩基類似体と二重鎖化し得る。塩基類似体は、本発明の化合物及び方法において有用なもの、例えば、Ｂｅｎｎｅｒに対する米国特許第５，４３２，２７２号明細書及び同第６，００１，９８３号明細書並びにＭａｎｏｈａｒａｎに対する米国特許出願公開第２００８０２１３８９１号明細書（これらは本明細書において参照により援用される）に記載されるものを含む。塩基の非限定的な例としては、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）及びピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、及び３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、及びこれらの構造誘導体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｒｉｖａｔｅｓ）が挙げられる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；及び米国特許第６，２１８，１０８号明細書）。塩基類似体はまた、ユニバーサル塩基であってもよい。
本明細書で使用されるとき、「ユニバーサル塩基」は、修飾ヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の１’位、又はヌクレオチド糖部分置換における等価な位置にある複素環式部分であって、核酸二重鎖に存在するとき二重らせん構造（例えば、リン酸骨格の構造）を改変することなく２種以上の塩基の対向に位置することができるものを指す。加えて、ユニバーサル塩基は、それが存在する一本鎖核酸が標的核酸と二重鎖化する能力を破壊しない。ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸が標的核酸と二重鎖化する能力は、当業者には明らかな方法（例えば、ＵＶ吸光度、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性等）によってアッセイすることができる。加えて、融解温度（Ｔｍ）が核酸二重鎖の安定性と相関付けられることに伴い、二重鎖形成が観察される条件、例えば温度が変化することにより、二重鎖の安定性又は形成が決まり得る。標的核酸と完全に相補的な基準一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸は、相補核酸と形成される二重鎖より低いＴｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生じるようにある塩基で置き換えられている基準一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含有する一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を有する核酸と形成される二重鎖より高いＴｍを有する標的核酸との二重鎖を形成する。
一部のユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下でユニバーサル塩基と塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）の全てとの間に水素結合を形成することによる塩基対合能を有する。ユニバーサル塩基は、１つの単一の相補塩基とのみ塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖において、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上にあるそれと対向するＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵの各々と水素結合を形成しないか、１つの水素結合、又は２つ以上の水素結合を形成し得る。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二重鎖の逆鎖上にあるそれと対向する塩基と相互作用しない。二重鎖において、ユニバーサル塩基との間の塩基対合は、リン酸骨格の二重らせん構造を改変することなく起こる。ユニバーサル塩基はまた、同じ核酸鎖上の隣接ヌクレオチドの塩基ともスタッキング相互作用によって相互作用し得る。かかるスタッキング相互作用は、特に、ユニバーサル塩基が、二重鎖の逆鎖上にあるそれと対向する位置にある塩基といかなる水素結合も形成しない状況において、二重鎖を安定化させる。ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号明細書；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｃｙｃｌｉｃ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｓ ａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｎｏｖ．１１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｄ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｌ．１１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｏｃｔ．１１；２２（２０）：４０３９−４３）。
本明細書で使用されるとき、「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、それらの相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域については二重鎖形成又はワトソン・クリック塩基対合から除外されるような形でハイブリダイズする、核酸の一本鎖によって形成される構造を指す。ループは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、かかる構造にヘアピン、ステムループ、又は伸長ループとして存在する非対合ヌクレオチドが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「伸長ループ」は、ｄｓＲＮＡとの関連では、一本鎖ループと、加えてそのループに隣接する１、２、３、４、５、６個又は最大５５個の塩基対又は二重鎖を指す。伸長ループでは、ループの５’側に隣接するヌクレオチドは、ループの３’側に隣接するヌクレオチドと二重鎖を形成する。伸長ループはヘアピン又はステムループを形成し得る。
本明細書で使用されるとき、「テトラループ」は、ｄｓＲＮＡとの関連では、ワトソン・クリック式にハイブリダイズした隣接ヌクレオチドの安定性に寄与する安定二次構造を形成する４個のヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を指す。理論に制限されるものではないが、テトラループはスタッキング相互作用によって隣接ワトソン・クリック塩基対を安定化させ得る。加えて、テトラループにおけるこれらの４個のヌクレオチド間の相互作用には、限定はされないが、非ワトソン・クリック塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が含まれる（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０ Ａｕｇ．１６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ Ｊｕｌ．１２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、４個のランダムな塩基からなる単純なモデルループ配列から予想されるものと比べて高い隣接二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の増加を付与する。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに対し、１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４中で少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃又は少なくとも７５℃の融解温度を付与し得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせを含み得る。ＲＮＡテトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｎｏｖ．１１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．ＳＨＩＮＪＩ ｅｔ ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００））。
本明細書で使用されるとき、「増加する」又は「向上する」は、アッセイにおける基準と比較して少なくとも５％だけ正に変化することを意味する。変化はアッセイの基準と比較して２倍又は３倍又は４倍又は５倍又は１０倍又は１００倍、又は５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、又は更には１００％であり得る。「ダイサー切断が向上する」とは、ある量のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子がダイサーによってプロセシングされたときに、より多くのダイサー切断ｄｓＲＮＡ産物が生じること、本開示のインビボ又はインビトロアッセイにおける同量の基準ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子のプロセシングと比較してダイサー切断反応がより急速に起こること、又はダイサー切断が、ｄｓＮＡ内の特異的な好ましい部位で切断するように及び／又は好ましい切断産物集団（例えば、本明細書に記載されるとおりのＤＮＡ残基を含むことによる）のより高い発生率を生じさせるように仕向けられることを意味する。一実施形態において、ｄｓＮＡ分子のダイサー切断の向上又は増加は、適切な基準ｄｓＮＡ分子で観察されるレベルを上回る。別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子のダイサー切断の向上又は増加は、不活性な又は減弱化した分子で観察されるもののレベルを上回る。本発明のリガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡの結合親和性に言及するときの増加とは、例えばリガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡが、リガンドにコンジュゲートしていないが同じ標的に向かうｄｓＮＡの２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上の親和性でその標的に結合することを意味する。細胞取り込みに言及するときの増加とは、例えば、細胞によって例えば受容体媒介エンドサイトーシスで取り込まれるリガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡの量が、リガンドにコンジュゲートしていないｄｓＮＡの２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上であることを意味する。トラッキングに言及するときの増加とは、ｄｓＲＮＡの進行又は動きをより容易に決定し得ることを意味する。
本明細書で使用されるとき、「低下する」は、アッセイにおける基準と比較して少なくとも５％だけ負に変化することを意味する。変化はアッセイの基準と比較して２倍又は３倍又は４倍又は５倍又は１０倍又は１００倍又はそれ以上、又は５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、又は更には１００％であり得る。「発現が低下する」とは、遺伝子の発現、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくは等価なＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、本開示のインビボ又はインビトロアッセイにおいて核酸分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子又はｄｓＲＮＡ含有分子）が存在しない場合に観察されるもの未満に低下することを意味する。一実施形態において、ｄｓＮＡ分子による阻害、下方調節又は低下は、不活性な又は減弱化した分子の存在下で観察される当該のレベル未満である。別の実施形態において、ｄｓＮＡ分子による阻害、下方調節、又は低下は、例えばスクランブル配列又はミスマッチを含むｄｓＮＡ分子の存在下で観察される当該のレベル未満である。別の実施形態において、本開示の核酸分子による遺伝子発現の阻害、下方調節、又は低下は、核酸分子の存在下では、その非存在下と比べてより大きい。
本明細書で使用されるとき、「細胞」は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）及び真核生物細胞（例えば、哺乳類又は植物細胞）の両方を含むことが意図される。細胞は体細胞又は生殖系列由来の細胞であってもよく、全能性細胞又は多能性細胞であってもよく、及び分裂細胞又は非分裂細胞であってもよい。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来してもよく、又はそれを含んでもよい。従って、用語「細胞」は、その通常の生物学的な意味を保持することが意図され、例えば、トリ、植物、及び哺乳動物、例えば、ヒト、雌ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコなど、任意の生物に存在し得る。特定の態様の範囲内では、用語「細胞」は、具体的には、本開示の単離ｄｓＮＡ分子を１つ以上含有するヒト細胞などの哺乳類細胞を指す。詳細な態様では、細胞はｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ含有分子をプロセシングして標的核酸のＲＮＡ干渉を生じさせ、且つＲＮＡｉに必要なタンパク質及びタンパク質複合体、例えばダイサー及びＲＩＳＣを含有する。
本明細書で使用されるとき、「動物」とは、哺乳動物、ブタ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、雌ウシ、ラット又はより好ましくはヒトを含めた多細胞真核生物を意味する。本発明の方法は、一般に、本明細書における式の構造の薬剤など、本明細書における薬剤の有効量を、哺乳動物、例えば、ブタ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、雌ウシ、ラット又はより好ましくはヒトを含めた、それを必要としている対象（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。かかる治療は、好適には、疾患、又はその症状に罹患しているか、それを有するか、それに罹り易いか、又はそれのリスクがある対象、特にヒトに投与され得る。
「薬学的に許容可能な担体」とは、本開示の核酸分子がそれらの所望の活性に最も好適な物理的位置に有効に分布することを可能にする組成物又は製剤を意味する。
本発明は、真核細胞における標的遺伝子の発現を低下させる能力を有する、同じ薬剤内に二本鎖ＮＡ（「ｄｓＮＡ」）二重鎖と一本鎖伸長領域との両方−多くの実施形態において、ｄｓＤＮＡ二重鎖−を含む組成物、及びそれらの調製方法に関する。ｄｓＮＡ領域の鎖の一方は、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの破壊を誘導することができる約１５〜約２２ヌクレオチドの範囲の長さを有するヌクレオチド配列領域を含有する。かかる薬剤のｄｓＤＮＡ二重鎖領域は、必ずしも標的ＲＮＡと相補的であるとは限らず、従って、そのような場合、標的ＲＮＡの破壊を誘導する能力を有するヌクレオチド配列の領域の標的ＲＮＡハイブリダイゼーションを増強しない。本発明の二本鎖ＮＡは、化学的に連結した鎖を有することができ、及び／又は第１鎖と第２鎖とを連結するテトラループを任意選択で含む伸長ループもまた有することができる。一部の実施形態において、テトラループを含有する伸長ループは、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、又は両方にある。一部の実施形態において、テトラループを含有する伸長ループは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、又は両方にある。一部の実施形態において、ｄｓＮＡ剤はダイサー基質であり、ダイサーによって切断される。他の実施形態において、ｄｓＮＡ剤はダイサー基質ではなく、ダイサーによって切断されない。一部の実施形態において、長さ１５〜８５ヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖が長さ１５〜３５塩基対の二重鎖を形成する。一部の実施形態において、二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方又は両方に位置する１〜５０ヌクレオチドの伸長部を含有する。この実施形態において伸長部は、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の５’末端又は両方にあり得る。別の実施形態において伸長部は、センス鎖の３’末端又はアンチセンス鎖の３’末端又は両方にあり得る。別の実施形態において、伸長部は、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端又は両方にある。前記実施形態のｄｓＮＡ剤はまた、少なくとも１つのリガンド修飾ヌクレオチドも含む。
一実施形態において、本発明のｄｓＮＡは、１５〜８５ｎｔ長（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９ ３０、３１、３２、３３、３４、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４ｎｔ長）を含む二本鎖ＲＮＡ二重鎖領域を含み、ここでは少なくとも１つのリガンド修飾ヌクレオチドがある。
本発明に係る「伸長」ｄｓＮＡ剤は、「ガイド伸長した」もの（ダイサー基質におけるアンチセンス鎖の関与に必要な１５〜３５塩基アンチセンス配列に加えて分子上に存在するアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチド領域）又は「パッセンジャー伸長した」もの（ダイサー基質におけるセンス鎖の関与に必要な１５〜３５塩基センス配列に加えて分子上に任意選択で存在するセンス鎖の３’末端のヌクレオチド領域；又はダイサー基質におけるセンス鎖の関与に必要な１５〜３５塩基配列に加えてセンス鎖上に任意選択で存在するセンス鎖の５’末端のヌクレオチド領域）であり得る。従って、本明細書で使用されるとき、用語「伸長した」は、１〜６個の一本鎖ヌクレオチドのアンチセンス（又は第２鎖、又はガイド鎖）３’オーバーハングを指すよう意図するものではない；むしろ「伸長した」は、本明細書で使用されるとき、ダイサー基質分子の反対側の端部、即ち、５’伸長センス鎖又はアンチセンス鎖（伸長領域は１〜５０、好ましくは１０〜１５ヌクレオチド長である）又は３’伸長センス鎖（伸長領域は１〜３０、好ましくは１０〜１５ヌクレオチド長である）を指す。５’伸長アンチセンス鎖は一本鎖であってもよく、任意選択で、アンチセンス鎖の５’伸長一本鎖領域と相補的、好ましくは完全に（１００％）相補的な第３の核酸分子と二重鎖化していてもよい。従って、一部の実施形態において、即ち第３の核酸分子が存在する場合、アンチセンス鎖の５’伸長領域は一本鎖ではなく、むしろ二重鎖、又は二本鎖領域である。好ましくは、本発明によれば、第３の核酸分子、即ち５’伸長アンチセンス領域と相補的なセンス領域は、コグネイト５’伸長アンチセンス領域が存在しない限り存在しない。
本発明の伸長ｄｓＮＡ剤は、本明細書に定義するとおりの伸長部を欠くｄｓＮＡと比べて、かかる薬剤の以下の特質を強化し得る：インビトロ有効性（例えば、効力及び効果持続期間）、インビボ有効性（例えば、効力、効果持続期間、薬物動態、薬力学、細胞内取り込み、毒性低下）。特定の実施形態において、第１鎖又は第２鎖の５’伸長領域は、任意選択で、追加の薬剤、例えばアプタマー又はその断片；又は能力を有する天然の若しくは外因的に導入された部分に対する結合部位（例えば「デコイ」結合部位）を提供し得る。従ってこれらの部分は、結合部位を介して非配列選択的にも又は配列特異的にも伸長部に結合することができる。例えば、ｄｓＮＡの伸長領域は、１つ以上の転写因子認識配列及び／又はプローブ、マーカー等に対する配列特異的認識ドメインを含むように設計することができる）。
好ましい実施形態において、二本鎖核酸剤は、薬剤にさらなる機能性を付与するリガンドにコンジュゲートしている。例えば、この分子は、５’伸長部でＮ−アセチルガラクトサミンなどのリガンドとコンジュゲートしていてもよく、このリガンドは、肝臓の細胞及び組織に対する特異的標的化をもたらす。リガンドは５’伸長部の塩基構造に直接コンジュゲートすることも、又はリンカーを介してコンジュゲートすることもできる。リンカーは、例えばビシンなど、遊離可能なリンカーであってもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「薬物動態」は、薬物が体によって吸収され、分布し、代謝され、及び排出される過程を指す。本発明の特定の実施形態において、適切な対照ｄｓＮＡと比べた５’伸長第２鎖又は３’伸長第１鎖ｄｓＮＡ剤の薬物動態の向上は、かかる薬剤の吸収及び／又は分布の増加、及び／又はかかる薬剤を投与された対象からのかかる５’第２鎖伸長ｄｓＮＡ剤又は３’第１鎖伸長ｄｓＮＡ剤の代謝及び／又は排出の遅延を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「薬力学」は、薬物が生体に及ぼす作用又は効果を指す。本発明の特定の実施形態において、適切な対照ｄｓＮＡと比べた５’第２鎖伸長ｄｓＮＡ剤又は３’第１鎖伸長ｄｓＮＡ剤の薬力学の向上は、かかる薬剤を投与された対象に対するそれぞれ５’第２鎖伸長ｄｓＮＡ剤又は３’第１鎖伸長ｄｓＮＡ剤の、適切な対照ｄｓＮＡと比べて増加した（例えば、より強力な又はより長い）作用又は効果を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「安定化」は、選択の環境内（例えば細胞内又は生物体内）における薬剤の持続性が向上した状態を指す。特定の実施形態において、本発明の５’第２鎖伸長ｄｓＮＡ又は３’第１鎖伸長ｄｓＮＡ剤は、適切な対照ｄｓＮＡと比べて安定性の向上を呈する。かかる安定性の向上は、分解酵素（例えばヌクレアーゼ）又は他の薬剤に対するかかる薬剤の耐性の向上によって実現し得る。
本発明に係る５’アンチセンス伸長ｄｓＮＡの上記に記載した特質に加えて、１０〜３０、好ましくは１０〜１５ヌクレオチドの任意選択の第３の核酸センス分子が、存在する場合には、ｄｓＮＡを安定化させ、及び／又は効力を増加させ、作用又は効果を延長し、薬力学的又は薬理学的効果を向上させ、及び／又はアプタマー若しくはその断片などの追加的な薬剤（又はその一部）を提供し；又は天然若しくは外因的に導入された部分（例えば標識）の結合部位（例えば「デコイ」結合部位）を提供する。
ＤＳｉＲＮＡの設計／合成
これまでに、２５〜約３０ヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡ）が、予想外にも、１９〜２３ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ剤と比較したとき効力及び作用持続時間の点で有効なＲＮＡ阻害結果をもたらすことが示された。ｄｓＲＮＡプロセシング機構の根底にある理論によって拘束されることを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種は細胞の細胞質においてダイサー酵素の基質として働くものと考えられる。ダイサーは、本発明のｄｓＮＡをより短いセグメントに切断することに加え、切断されたｄｓＮＡに由来する一本鎖切断産物が、標的遺伝子の又はそれに由来する細胞質ＲＮＡの破壊に関与するＲＩＳＣ複合体に取り込まれるのを促進すると考えられる。先行研究（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書）は、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（具体的にはＤｓｉＲＮＡ剤）の切断性がｄｓＲＮＡ種の効力及び作用持続時間の増加に対応することを示している。本発明は、少なくとも一部には、好ましいダイサー切断産物種が生じるようにダイサー切断部位を指図するＲＮＡ阻害剤の設計を提供する。
ＤｓｉＲＮＡプロセシングのモデルでは、ダイサー酵素がＤｓｉＲＮＡ剤に結合し、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖のダイサーＰＡＺドメイン関連３’オーバーハング配列から１９〜２３ヌクレオチド取った位置でＤｓｉＲＮＡの切断が生じる。このダイサー切断イベントにより、それまでパッセンジャー（センス）鎖の３’末端及びガイド（アンチセンス）鎖の５’末端に位置していた二重鎖化した核酸が切り出される。ＤｉＲＮＡの切断では、典型的には、各末端に２塩基オーバーハングを含む１９ｍｅｒ二重鎖がもたらされる。ここで図２にモデル化されるとおり、このダイサー切断イベントにより、ＲＩＳＣ成分として標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害を指図する能力を有する２１〜２３ヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖が生じる（又は、場合によってより長いガイド鎖３’オーバーハングが存在すると、ダイサー切断によって２４〜２７ヌクレオチドガイド鎖が生じ得る）。
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、二重鎖化した領域において完全に相補的である必要はない。一実施形態において、センス鎖の３’末端は１つ以上のミスマッチを含有する。一態様では、センス鎖の３’末端に約２個のミスマッチが組み込まれる。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、２５〜６６ヌクレオチド長の範囲の２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ分子であり、互いにアニールしたとき、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）に２個のヌクレオチドミスマッチを有する。ＲＩＳＣへのアンチセンス鎖の侵入が、恐らくはＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡの侵入に伴い起こる一部の律速巻き戻し段階への影響によって促進され、又はそれに有利となるように、ミスマッチ又は熱力学的安定性の低下（特に３’−センス／５’−アンチセンス位置における）を用いることが提案されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そのため、活性な２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ二重鎖を選択するためのアルゴリズム設計に、末端塩基組成が含まれるようになっている（Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。この実施形態のｄｓＲＮＡ領域のダイサー切断では、それらのミスマッチを含有する短い端部の末端配列は、アンチセンス鎖と非対合のまま残るか（３’−オーバーハングの一部となる）、又は全て切断されて最終的な２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡから除かれることになる。従って、これらの特定の形態の「ミスマッチ」は、ＲＩＳＣの最終的なＲＮＡ成分においてミスマッチとしては存続しない。ダイサー基質のセンス鎖の３’末端における塩基ミスマッチ又はセグメントの不安定化がＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することによって改善したという知見は、２５〜３０ｍｅｒ ｄｓＲＮＡ（本明細書では「ＤｓｉＲＮＡ」とも称される；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００５／０２７７６１０号明細書、同第２００５／０２４４８５８号明細書及び同第２００７／０２６５２２０号明細書）の設計及び使用について記載する先行研究の意外な発見であった。ミスマッチを有する薬剤の例示的なミスマッチ塩基対又はゆらぎ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｕ及びＩ：Ｃである。かかる薬剤の塩基対強度はまた、例えば、グアニン及びアデニンヌクレオチドの２−アミノ修飾又は２，６−ジアミノ修飾を含め、かかる薬剤のヌクレオチドの修飾によって減少させることもできる。本発明のダイサー基質及び非ダイサー基質分子は、以下に企図する構造のいずれを有することもできる。図４３〜図４６は、伸長部を含む本発明のｄｓＮＡ分子を提示する。図４７は、アンチセンス鎖の５’又は３’末端又は両方の末端に位置するテトラループを含むｄｓＮＡ分子を提示する。
ｄｓＮＡ剤の例示的構造
本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＮＡを含み、即ち、本発明のｄｓＮＡはインビボでプロセシングされて活性低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を生じる。ｄｓＮＡはダイサーによってプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡとなり、これがＲＩＳＣに組み込まれる。一部の実施形態において、本発明のｄｓＮＡ分子はダイサーによっては切断されず、しかしなおもＲＩＳＣに組み込まれる。ｄｓＮＡは、本明細書で以下にｄｓｉＲＮＡについて記載する構造のいずれを有することもできる。
一態様において、本発明は、少なくとも８連続リボヌクレオチドを有する、第１鎖又は第２鎖を有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明のｄｓＮＡ剤は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個又はそれ以上（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２６個、又はそれ以上、最大で鎖の完全長）のリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート連結）を有する。特定の実施形態において、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドは連続している。
一態様において、本発明は、推定センス鎖ダイサー切断部位の３’側及び対応して推定アンチセンス鎖ダイサー切断部位の５’側に位置する二本鎖核酸の領域内に１個の以上のデオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用組成物を提供する。一実施形態において、パッセンジャー鎖位置２４位からパッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基までに対応し、ひいてはそれらと塩基対合したガイド鎖ヌクレオチドの間にある（端点を含む）ガイド鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、二本鎖核酸は、推定センス鎖ダイサー切断部位の３’側及び対応して推定アンチセンス鎖ダイサー切断部位の５’側に位置する二本鎖核酸の領域内に１つ以上の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドを有する。
特定の実施形態において、本発明のｄｓＮＡ剤は、以下の例示的構造のいずれを有することもできる：
一つのかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５‘−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−３’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一つのかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−Ｚｍ（Ｚ）２Ｚｍ（Ｚ）２Ｚｍ（Ｚ）２Ｚｍ（Ｚ）２５Ｎ−３’
３’−Ｙ（Ｚ）２５Ｎ−５’
式中、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体又は２’−フルオロ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である修飾ヌクレオチド、Ｚｍは、任意選択でヌクレオチドの糖又は塩基を介してＧａｌＮａｃとコンジュゲートしたチミン又はアデノシンであるリガンド修飾ヌクレオチドであり、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一つのかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−Ｚｍ（Ｚ）Ｚｍ（Ｚ）Ｚｍ（Ｚ）Ｚｍ（Ｚ）２５Ｎ−３’
３’−Ｙ（Ｚ）２５Ｎ−５’
式中、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体又は２’−フルオロ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である修飾ヌクレオチド、Ｚｍは、任意選択でヌクレオチドの糖又は塩基を介してＧａｌＮａｃとコンジュゲートしたチミン又はアデノシンであるリガンド修飾ヌクレオチドであり、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０ヌクレオチド、又は任意選択で１〜１５ヌクレオチド、又は任意選択で１〜１０ヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一つのかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む
５’−（Ｚｍ）４（Ｚ）２５Ｎ−３’
３’−Ｙ（Ｚ）２５Ｎ−５’
式中、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体又は２’−フルオロ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である修飾ヌクレオチド、Ｚｍは、任意選択でヌクレオチドの糖又は塩基を介してＧａｌＮａｃとコンジュゲートしたチミン又はアデノシンであるリガンド修飾ヌクレオチドであり、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０ヌクレオチド、又は任意選択で１〜１５ヌクレオチド、又は任意選択で１〜１０ヌクレオチドである。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一つのかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−（Ｚｍ）４（Ｚ）８Ｎ（Ｚ）２５ＮＤＤ−３’
３’−ＤＤＹ（Ｚ）２５Ｎ−５’
式中、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体又は２’−フルオロ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体及び／又は２’−フルオロ単量体である修飾ヌクレオチド、Ｚｍは、任意選択でヌクレオチドの糖又は塩基を介してＧａｌＮａｃとコンジュゲートしたチミン又はアデノシンであるリガンド修飾ヌクレオチドであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０ヌクレオチド又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０ヌクレオチド、又は任意選択で１〜１５ヌクレオチド、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
関連する実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
上記に示す構造のいずれにおいても、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、任意選択でリン酸基を含む。別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０ヌクレオチド又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｅ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、「｜」＝不連続部、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
別のかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｅ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、「１」＝不連続部、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
関連する実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
別のかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
関連する実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
更なる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
別のかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
別のかかる実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。ある実施形態では、Ｎは少なくとも９個の連続ホスホロチオエート連結を含む。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
上記に示す構造のいずれにおいても、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、任意選択でリン酸基を含む。
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｅ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、「｜」＝不連続部、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体は、ここで上記の概略図に示す下部鎖よりむしろ、上部鎖に沿った交互の残基に位置する。
一実施形態において、ダイサー切断の特異的誘導によって機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含む伸長ｄｓＮＡ剤が提供される。かかる分子の例示的構造を以下に示す：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
上記の構造は、ダイサーが最大２１ｍｅｒの二重鎖をその主要なプロセシング後形態として切断するようにモデル化される。上記の構造の下部鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基に２つのデオキシリボヌクレオチド残基を配置すると、オフターゲット効果が低下する可能性がある（先行研究により、少なくともアンチセンス鎖の５’末端から２番目の２’−Ｏ−メチル修飾がオフターゲット効果を低減することが明らかになっていることに伴う；例えば、米国特許出願公開第２００７／０２２３４２７号明細書を参照のこと）。
関連する実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＤＤ｜ＥＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
関連する実施形態において、ｄｓＮＡは以下を含む：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＤＤＺＮ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤＸＸ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、及び「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５である。一実施形態において、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。或いは、下部鎖がセンス鎖であり、上部鎖がアンチセンス鎖である。
上記に示す構造のいずれにおいても、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、任意選択でリン酸基を含む。
一実施形態において、本発明は、第２鎖の対応するヌクレオチドと対合した第１鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に非対合塩基を有しない完全に二重鎖化した領域を含む第１鎖と第２鎖との間に実質的に二重鎖化した領域を有する二本鎖核酸を提供する。別の実施形態において、本発明は、第２鎖の対応するヌクレオチドと対合している第１鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドとの間に、１、２、３、又は５個の非対合塩基を含む実質的に二重鎖化した領域を有する二本鎖核酸を提供する。一部の実施形態において、非対合塩基は連続している。他の実施形態において、非対合塩基は連続していない。
本明細書で使用されるとき「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖の１、２、３又は４個のミスマッチ塩基対又は５又は６又は７又は８又は９又は１０又は１１又は１２又は１３又は１４又は１５又は２０又は３０個のミスマッチ塩基対を含有する「ミスマッチ許容領域」を有するＤｓｉＲＮＡを指し、ここでかかるミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡ内においてＤｓｉＲＮＡの二本鎖領域の両端の２つの末端塩基対間（従ってその２つの末端塩基対を含まない）にある１つ又は複数の位置に位置する。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位の位置に関連して本明細書で定義される「ミスマッチ許容領域」内に位置する。ミスマッチ許容領域は、標的鎖の推定Ａｇｏ２切断部位「の上流」に位置する。これに関連して「上流」とは、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二重鎖の最も５’側の部分と理解されるものとし、ここで５’は、ＤｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の向きを参照する。従って、ミスマッチ許容領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流にある；或いは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖を参照するとき、ミスマッチ許容領域はまた、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位と相補的な塩基、即ち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の最も３’側の部分（ここではアンチセンス鎖の１位がアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである）の下流に位置すると記述することもできる。
一実施形態において、例えば、ミスマッチ許容領域は、二重鎖のセンス鎖の５’末端を始点とするヌクレオチドから数えたとき塩基対３〜９の間（端点を含む）に位置する。従って、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右側伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対を有する（ここで１位はセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、９位は、センス鎖配列に対応する標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ５’側にあるセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、センス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するのみならず、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列ともまたミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われており、且つ相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間でも同様に失われている）。代替的実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するのみであり、その対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドとはなおも塩基対合する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われているが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間の相補性は維持されている）。
上記に記載したとおりのミスマッチ許容領域内（ミスマッチ領域内）に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の３、４、５、６、７、８又は９位のいずれか１つにミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は更には３個の追加的なミスマッチ塩基対を更に含むことができる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加的なミスマッチ塩基対は、センス鎖の３、４、５、６、７、８及び／又は９位（及びアンチセンス鎖の対応する残基）に存在する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に１個の追加的なミスマッチ塩基対が存在する一実施形態において、センス鎖の２個のミスマッチ塩基対が、例えばセンス鎖の４位及び６位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチはアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にもまた存在する）。
２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。或いは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、３及び６位にミスマッチヌクレオチドを有するが、４及び５位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、センス鎖３及び６位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の２個の残基（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対間に０、１、２、３、４又は５個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ってトリプレットで）存在し得る。或いは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、３、４及び８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、５、６及び７位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、センス鎖３及び４位のミスマッチ残基は互いに隣接しており、他方、センス鎖４及び８位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の３個の残基（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３又は４個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ってクアドルプレットで）存在し得る。或いは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、３、５、７及び８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、４及び６位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、センス鎖７及び８位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、センス鎖３及び５位のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている−同様に、５及び７位のセンス鎖のミスマッチ残基もまた、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）センス鎖の４個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２又は３個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左側伸長ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ許容領域を含む（ここでは１位がアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１３位が、アンチセンス鎖においてアンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ３’（下流）側にあるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に対してアンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するのみならず、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われており、且つ相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間でも同様に失われている）。代替的実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するのみであり、その対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドとはなおも塩基対合する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われているが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間の相補性は維持されている）。
上記に記載したとおりのミスマッチ許容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１位にミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は更には３個の追加的なミスマッチ塩基対を更に含み得る。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加的なミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び／又は２１位に（及びセンス鎖の対応する残基に）存在する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に１個の追加的なミスマッチ塩基対が存在する一実施形態において、アンチセンス鎖のそれらの２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１４位及び１８位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチはまた、センス鎖の対応するヌクレオチド残基にも存在する）。
２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３及び１６位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１４及び１５位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１３及び１６位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の２個の残基は、これらのミスマッチ塩基対間に０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってトリプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１４及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１５、１６及び１７位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１３及び１４位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１４及び１８位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の３個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４、５又は６個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってクアドルプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１５、１７及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１４及び１６位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１７及び１８位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１３及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている−同様に、アンチセンス鎖１５及び１７位のミスマッチ残基もまた、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の４個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４又は５個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
更なる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左側伸長ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有する（ここでは１位がアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１１位が、アンチセンス鎖においてアンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ３’（下流）側にあるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に対してアンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するのみならず、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われており、且つ相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間でも同様に失われている）。代替的実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するのみであり、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチドがその対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドとなおも塩基対合する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われているが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間の相補性は維持されている）。
上記に記載したとおりのミスマッチ許容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９位にミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は更には３個の追加的なミスマッチ塩基対を更に含み得る。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加的なミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び／又は１９位に（及びセンス鎖の対応する残基に）存在する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に１個の追加的なミスマッチ塩基対が存在する一実施形態において、アンチセンス鎖のそれらの２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１４位及び１８位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチはまた、センス鎖の対応するヌクレオチド残基にも存在する）。
２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１２及び１５位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１３及び１４位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１２及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の２個の残基は、これらのミスマッチ塩基対間に０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってトリプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１４及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１５、１６及び１７位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１３及び１４位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１４及び１８位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の３個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４、５又は６個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってクアドルプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１５、１７及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１４及び１６位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１７及び１８位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１３及び１５位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている−同様に、アンチセンス鎖１５及び１７位のミスマッチ残基もまた、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の４個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４又は５個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
更なる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、左側伸長ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有する（ここでは１位がアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１５位が、アンチセンス鎖においてアンチセンス鎖配列と十分に相補的な標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ３’（下流）側にあるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に対してアンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するのみならず、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われており、且つ相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間でも同様に失われている）。代替的実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドはＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するのみであり、この同じアンチセンス鎖ヌクレオチドがその対応する標的ＲＮＡ配列ヌクレオチドとなおも塩基対合する（従って、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性はＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で失われているが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＲＮＡ配列との間の相補性は維持されている）。
上記に記載したとおりのミスマッチ許容領域内に単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３位にミスマッチヌクレオチド残基を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、１、２又は更には３個の追加的なミスマッチ塩基対を更に含み得る。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２又は３個の追加的なミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２及び／又は２３位に（及びセンス鎖の対応する残基に）存在する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に１個の追加的なミスマッチ塩基対が存在する一実施形態において、アンチセンス鎖のそれらの２個のミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１６位及び２０位の両方のヌクレオチドに存在し得る（ミスマッチはまた、センス鎖の対応するヌクレオチド残基にも存在する）。
２個のミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対合するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１６及び２０位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１７、１８及び１９位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１６及び２０位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の２個の残基は、これらのミスマッチ塩基対間に０、１、２、３、４、５、６又は７個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
３個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってトリプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１６、１７及び２１位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１８、１９及び２０位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖１６及び１７位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１７及び２１位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の３個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４、５又は６個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
４個のミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤について、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってクアドルプレットで）存在し得る。或いは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１７、１９、２１及び２２位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１８及び２０位には有しないＤｓｉＲＮＡｍｍについて、アンチセンス鎖２１及び２２位のミスマッチ残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１７及び１９位のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている−同様に、アンチセンス鎖１９及び２１位のミスマッチ残基もまた、センス鎖の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の４個の残基は、これらのミスマッチ塩基対のうちの任意の２個の間に０、１、２、３、４又は５個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
明確にするため、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤内のミスマッチヌクレオチド残基の位置は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方の５’末端残基を基準として付番される。アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域（ミスマッチ領域）内に位置する位置の付番は、推定Ａｇｏ２切断部位に対するアンチセンス鎖の５’末端の近接性の違いに応じてシフトし得る。従って、アンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれか一方の範囲内における好ましいミスマッチ部位の位置はまた、推定Ａｇｏ２切断部位に対するかかるミスマッチの許容される近接性としても同定することができる。従って、好ましい一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ５’（上流）側にあるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ａｇｏ２切断部位の２ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の３ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の４ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の５ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の６ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の７ヌクレオチドだけ５’（上流）側、推定Ａｇｏ２切断部位の８ヌクレオチドだけ５’（上流）側、又は推定Ａｇｏ２切断部位の９ヌクレオチドだけ５’（上流）側にあるセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
例示的な単一ミスマッチ含有５’ガイド一本鎖伸長ＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、以下の構造を含む（かかるミスマッチ含有構造はまた、本明細書に示す他の例示的ＤｓｉＲＮＡ構造に組み込まれてもよい）。
５’−ＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＭＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５であり、及び「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールしたときに本来は相補的である鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ又は非天然若しくは修飾核酸）。かかる薬剤の残基のいずれも、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であり得る−上記に示すとおり、下部（第２）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体の交互配置もまた、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に用いることができる。上記のミスマッチ構造について、上部鎖がセンス鎖であり、下部鎖がアンチセンス鎖である。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列を参照すると存在するが、必ずしもＤｓｉＲＮＡの２本の鎖内でミスマッチ塩基対として存在するとは限らないミスマッチを含有することができる−従って、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第１鎖と第２鎖との間で完全な相補性を有し得るが、標的ＲＮＡを参照するとなおもミスマッチ残基を有する（これは、特定の実施形態において、有効性及び／又は効力及び／又は効果持続期間を促進するのに有利であり得る）。特定の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡ配列との間にミスマッチが出現する場合、ミスマッチの位置は、アンチセンス鎖内において標的領域の推定Ａｇｏ２切断部位の５’側に位置するセンス鎖の配列に対応する位置にある（例えば、アンチセンス鎖内において標的配列の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的なアンチセンス残基の３’側に位置するアンチセンス鎖残基）。
標的配列を参照したとき単一ミスマッチ残基を有する例示的２５／２７ｍｅｒ ＤｓｉＲＮＡは、以下の好ましい構造を含む；
標的ＲＮＡ配列：５’−．ＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．ＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ −３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸＺＮ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である０〜１０個のＲＮＡ単量体を含む任意選択のオーバーハングドメインであり−特定の実施形態において、「Ｙ」は、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体である１〜４個のＲＮＡ単量体を含むオーバーハングドメインであり、「Ｚ」＝ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、「Ｎ」＝１〜５０又はそれ以上、但し任意選択で１〜３０、又は任意選択で１〜１５、又は任意選択で、１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５又はそれ以上、但し任意選択で０、１、２、３、４、又は５であり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｅ」＝鎖がアニールしたとき本来は相補的である（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対合（水素結合）しないが、任意選択で対応する「Ｂ」残基（「Ｂ」残基もまた、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は非天然若しくは修飾核酸である）と塩基対合する核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ又は非天然若しくは修飾核酸）。かかる薬剤の残基のいずれも、任意選択で２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体であり得る−例えば、上記に示すとおり、下部（第２）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単量体の交互配置、又は２’−Ｏ−メチル及び／又は本明細書に記載されるとおりの他の修飾の他のパターンもまた、上記のＤｓｉＲＮＡ剤に用いることができる。
上記に例示する構造に加え、本発明のＤｓｉＲＮＡはまた、標的ＲＮＡ配列との更なるミスマッチを形成する１、２又は３個の追加的な残基も有し得る。かかるミスマッチは連続していてもよく、又は標的ＲＮＡ配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい。マッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられている場合、ミスマッチ残基は、一本鎖内においてかかるミスマッチ形成残基の間が１、２、３、４、５、６、７又は更には８塩基対合ヌクレオチドの間隔で互いに隔てられていてもよい。
上述のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関して、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（しかし対応するセンス鎖ヌクレオチドとのミスマッチは形成しても、又はしなくてもよい）アンチセンス鎖ヌクレオチドに好ましいＤｓｉＲＮＡ内の位置は、ＤｓｉＲＮＡの推定Ａｇｏ２切断部位と相補的なアンチセンス鎖配列の３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖領域内にある。従って、好ましい一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的ＲＮＡ配列に対する）ミスマッチヌクレオチドの位置は、アンチセンス鎖配列内において対応する標的ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のすぐ３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的ＲＮＡ配列に対する）ミスマッチヌクレオチドは、対応する推定Ａｇｏ２切断部位より２ヌクレオチドだけ３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２切断部位より３ヌクレオチドだけ３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２切断部位より４ヌクレオチドだけ３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２切断部位より５ヌクレオチドだけ３’（下流）側、推定Ａｇｏ２切断部位より６ヌクレオチドだけ３’（下流）側、推定Ａｇｏ２切断部位より７ヌクレオチドだけ３’（下流）側、推定Ａｇｏ２切断部位より８ヌクレオチドだけ３’（下流）側、又は推定Ａｇｏ２切断部位より９ヌクレオチドだけ３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に配置される。
アンチセンス鎖の２個のミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡ剤において（ここでミスマッチ形成ヌクレオチドは標的ＲＮＡ配列に対するミスマッチ形成である）、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置に）存在し得る。或いは、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列と塩基対合するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３及び１６位（アンチセンス鎖の５’末端（１位）を始点として）にミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが、１４及び１５位には有しないＤｓｉＲＮＡについて、センス鎖１３及び１６位のミスマッチ残基は、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチ塩基対を形成する２個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の２個の残基は、これらのミスマッチ形成塩基対の間に０、１、２、３、４又は５個の（標的ＲＮＡ配列に対する）マッチ塩基対が位置して存在し得る。
３個のミスマッチ形成塩基対（標的ＲＮＡ配列に対するミスマッチ形成）を有する特定のＤｓｉＲＮＡについて、ミスマッチ形成ヌクレオチドは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ってトリプレットで）存在し得る。或いは、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１４及び１８位にミスマッチヌクレオチドを有するが、１５、１６及び１７位には有しないＤｓｉＲＮＡについて、アンチセンス鎖１３及び１４位のミスマッチ形成残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１４及び１８位のミスマッチ形成残基は、標的ＲＮＡの対応する残基とマッチ塩基対を形成する３個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の３個の残基は、これらのミスマッチ形成塩基対のうちの任意の２つの間に０、１、２、３又は４個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
４個のミスマッチ形成塩基対（標的ＲＮＡ配列に対するミスマッチ形成）を有する特定のＤｓｉＲＮＡについて、ミスマッチ形成ヌクレオチドは連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ってクアドルプレットで）存在し得る。或いは、標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列とマッチ塩基対を形成するヌクレオチドによって間が隔てられていてもよい（例えば、１３、１５、１７及び１８位にミスマッチ形成ヌクレオチドを有するが、１４及び１６位には有しないＤｓｉＲＮＡについて、アンチセンス鎖１７及び１８位のミスマッチ形成残基は互いに隣接しているが、アンチセンス鎖１３及び１５位のミスマッチ形成残基は、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている−同様に、アンチセンス鎖１５及び１７位のミスマッチ形成残基もまた、標的ＲＮＡ配列の対応する残基とマッチ塩基対を形成する１個のヌクレオチドによって間が隔てられている）。例えば、対応する標的ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ許容領域内に位置する）アンチセンス鎖の４個の残基は、これらのミスマッチ形成塩基対のうちの任意の２つの間に０、１、２又は３個のマッチ塩基対が位置して存在し得る。
上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ及び他のＤｓｉＲＮＡ構造は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤及びＤｓｉＲＮＡ剤の特定の構造を例示するために記載される。上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ及びＤｓｉＲＮＡ構造の設計は、例えば、以下に示すＤｓｉＲＮＡｍｍ形態の伸長ＤｓｉＲＮＡ剤（例えば、ミスマッチ含有ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤の設計を含む）の作成に適合させることができる。上記に例示したとおり、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間に単一のミスマッチ（又は２、３又は４個のミスマッチ）を有するが、しかし任意選択でＤｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖配列間には完全な相補性を保持してもよいＤｓｉＲＮＡもまた設計することができる。
更に、以下に例示するＤｓｉＲＮＡ剤はまた、その二本鎖及び／又は標的ＲＮＡ整列構造内に挿入／欠失（インデル）構造も有し得ることが注記される。従って、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば、標的ＲＮＡ配列と比較してアンチセンス鎖配列に、及び／又はセンス鎖配列と比較してアンチセンス鎖配列に、インデル変異を有するように設計することができ、ここでかかるインデルヌクレオチドを置くのに好ましい位置は、ミスマッチ塩基対及び／又はミスマッチ形成塩基対の配置について上記に記載した位置と一致する。
特定の実施形態において、任意の上記構造の「Ｄ」残基は、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡ又はＰＳ−ＲＮＡを含む。任意選択で、任意の上記構造の「Ｄ」残基は、ダイサー切断を阻害する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においてＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５塩基対長を有し、アンチセンス鎖が２塩基３’−オーバーハングを含む４２ヌクレオチド長を有し（従ってこのＤｓｉＲＮＡ剤はセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に５’オーバーハング１５ヌクレオチド長を有する）、且つデオキシリボヌクレオチドがセンス鎖の２４及び２５位に位置し（センス鎖の５’の１位から付番する）、各々がアンチセンス鎖のコグネイトヌクレオチドと塩基対合した、非対称構造を有する。５’オーバーハングは修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及び／又はリン酸骨格修飾、好ましくはホスホロチオエートを含む。
別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が４０ヌクレオチド長を有し、アンチセンス鎖が２塩基３’−オーバーハングを含む２７ヌクレオチド長を有し（従ってこのＤｓｉＲＮＡ剤はセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に３’オーバーハング１５ヌクレオチド長を有する）、且つデオキシリボヌクレオチドがセンス鎖の２４及び２５位に位置し（センス鎖の５’の１位から付番する）、各々がアンチセンス鎖のコグネイトヌクレオチドと塩基対合した、ある構造を有する。３’オーバーハングはデオキシリボヌクレオチド及び／又はリン酸骨格修飾、好ましくはメチルホスホネートを含む。
ｄｓＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する主な要因の一つは、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、分解を防ぐには、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾が決定的に重要である（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＥＲＩ−１と呼ばれるＲＮアーゼ−Ｔファミリーヌクレアーゼが同定されており、これはｓｉＲＮＡの調節及び分解に関与する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。この遺伝子は、マウスにおけるＴｈｅｘ１（ＮＭ−０２０６７）又はヒトにおけるＴＨＥＸ１（ＮＭ−１５３３３２）としても知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与する；これはまた、ｓｉＲＮＡにおける３’−オーバーハングの分解も媒介するが、二重鎖ＲＮＡを分解させることはない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。従って、本発明のｄｓＮＡを含め、ｄｓＲＮＡの３’末端安定化が安定性を改善するであろうと予想することは妥当である。
ＸＲＮ１（ＮＭ−０１９００１）は、Ｐボディ内にある５’−３’エキソヌクレアーゼであり、ｍｉＲＮＡによって標的化されるｍＲＮＡの分解に関係しているとされており（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）、また、ｓｉＲＮＡが指図するとおりの内部切断によって惹起された分解の完了にも関与し得る。ＸＲＮ２（ＮＭ−０１２２５５）は、核ＲＮＡプロセシングに関与する特徴的な５’−３’エキソヌクレアーゼである。現在のところｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分解又はプロセシングに関係しているとはされていないが、これらは両方ともに、ＲＮＡを分解することのできる既知のヌクレアーゼであり、考察上重要であり得る。
ＲＮアーゼＡは、ＲＮＡを分解する哺乳動物における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。これはｓｓＲＮＡに特異的であり、ピリミジン塩基の３’末端で切断する。血清中でインキュベートした後質量分析法を行うことにより、ＲＮアーゼＡ切断と一致するｓｉＲＮＡ分解産物を検出することができる（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。３’−オーバーハングは、ＲＮアーゼ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からＲＮアーゼＡが枯渇すると、ｓｉＲＮＡの分解が減少する；この分解は、実にいくらかの配列選好性を示し、末端にポリＡ／Ｕ配列を有する配列に関しては悪くなる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これは、二重鎖のうち安定性の低い領域が「呼吸」していて、ＲＮアーゼＡによる分解に利用可能な一過性の一本鎖種をもたらす可能性を示唆している。ＲＮアーゼＡ阻害薬を血清に加えてｓｉＲＮＡの寿命及び効力を改善することができる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
２１ｍｅｒでは、ホスホロチオエート又はボラノホスフェート修飾がヌクレオシド間リン酸連結を直接安定化させる。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡはヌクレアーゼ耐性が極めて高く、サイレンシング剤として効力があり、且つ比較的非毒性である。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは標準的な化学合成方法を用いて製造することができず、代わりにインビトロ転写（ＩＶＴ）によって作製する（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４ ａｎｄ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、ＲＮＡ二重鎖のいかなる所望の位置にも容易に置くことができ、標準的な化学合成方法を用いて作製することができるが、しかしＲＮＡサイレンシング活性を保つＲＮＡ二重鎖内にかかる修飾を使用可能かについては、制限があり得る。
特定の実施形態において、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域が少なくとも１つのホスホロチオエート骨格修飾を有する。一部の実施形態において、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域のあらゆる連結がホスホロチオエート骨格修飾を有する。一部の実施形態において、ガイド鎖の末端５’ヌクレオチドの連結を除き、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域のあらゆる連結がホスホロチオエート骨格修飾を有する。特定の実施形態において、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域が少なくとも１つのメチルホスホネート骨格修飾を有する。一部の実施形態において、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域のあらゆる連結がメチルホスホネート骨格修飾を有する。一部の実施形態において、ガイド鎖の末端５’ヌクレオチドを除き、パッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域のあらゆる連結がホスホロチオエート骨格修飾を有する。
しかしながら、ＰＳ修飾は用量依存的毒性を示し、そのため多くの研究者がｓｉＲＮＡにおける限定的な組み込みを推奨しており、歴史的にはヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’末端が支持されていることが注記される（Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００３；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。より広範囲に及ぶＰＳ修飾は強力なＲＮＡｉ活性に適合し得る；しかしながら、糖修飾（２’−Ｏ−メチルＲＮＡなど）の使用が優れていることもある（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
リボースの２’位に種々の置換を置くことができ、これは概して二重鎖の安定性（Ｔｍ）を高め、且つヌクレアーゼ耐性を大幅に改善し得る。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳類リボソームＲＮＡ及びトランスファーＲＮＡに見られる天然に存在する修飾である。ｓｉＲＮＡ中の２’−Ｏ−メチル修飾は公知であるが、しかし効力を保つためには二重鎖内における修飾塩基の正確な位置が重要であり、ＲＮＡを完全に２’−Ｏ−メチルＲＮＡに置換すると、ｓｉＲＮＡは不活性になる。例えば、交互の２’−Ｏ−メチル塩基を用いるパターンは、非修飾ＲＮＡと等価な効力を有することができ、且つ血清中で非常に安定している（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾もまた、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｄｓＮＡ）機能と適合する；これは、最も一般的には（試薬のコスト及び入手し易さに起因して）ピリミジン部位に置かれ、プリン位置の２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせることができる；２’−Ｆプリンが利用可能であり、これもまた使用することができる。この種の重度に修飾された二重鎖は、インビトロでＲＮＡｉを強力に惹起することができ（Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋｒａｙｎａｃｋ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，２００６）、インビボで使用したときパフォーマンスを改善し、且つ作用持続時間を延ばすことができる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ）。交互の２’−Ｆ及び２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含有する極めて強力なヌクレアーゼ安定性の平滑末端１９ｍｅｒ二重鎖がＡｌｌｅｒｓｏｎによって教示されている。この設計では、Ｃｚａｕｄｅｒｎａが用いたのと同じパターンで２’−Ｏ−Ｍｅ残基が交互に配置されるが、しかしながら残りのＲＮＡ残基は２’−Ｆ修飾塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙが用いた極めて強力なヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡは、極めて強力なヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡをインビボで用いた。２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ及び２’−Ｆ ＲＮＡに加えて、この二重鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、逆位脱塩基残基、及び３’末端ＰＳヌクレオシド間連結を含む。広範な修飾には特定の利益があるが、二重鎖のより限定的な修飾もまたインビボパフォーマンスを改善することができ、これはより単純であるとともに、製造コストも低い。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）はインビボで二重鎖を用いており、ほとんどが、２個の２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ塩基及び限定的な３’末端ＰＳヌクレオシド間連結を含むＲＮＡであった。
ロックド核酸（ＬＮＡ）及びアンロックド核酸（ＵＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｄｓＮＡ）の安定化に使用することのできる別の２’修飾クラスである。効力を保持するＬＮＡ組み込みパターンは２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｆ塩基と比べて限られており、そのため限定的な修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。限定的な組み込みであっても、ＬＮＡ修飾を用いると、インビボでのｄｓＲＮＡパフォーマンスを改善することができ、またオフターゲット効果プロファイルも変化し、又は改善し得る（Ｍｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
細胞又は生きている動物に導入された合成核酸は「外来性」と認識され、免疫応答を惹起し得る。免疫刺激はオフターゲット効果の主要なクラスを成し、これが実験結果を劇的に変化させ、細胞死をもたらすことさえあり得る。自然免疫系は、これらの反応を媒介するＤＮＡ及びＲＮＡと特異的に相互作用する一群の受容体分子を含み、それらは細胞質に位置するものもあれば、エンドソームに存在するものもある（Ｍａｒｑｕｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５；Ｓｃｈｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。カチオン性脂質又はリポソームによってｓｉＲＮＡを送達すると、ｓｉＲＮＡが細胞質及びエンドソームの両方の区画に曝露され、インビトロ及びインビボの両方で１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を惹起するリスクが最大となる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ；Ｓｉｏｕｄ ａｎｄ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３；Ｓｉｏｕｄ，２００５；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。細胞内で転写されるＲＮＡは免疫原性が低く（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、脂質ベースの方法を用いて送達したとき免疫原性である合成ＲＮＡが、機械的手段によって細胞に導入された場合には、インビボであっても免疫刺激を回避し得る（Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、脂質ベースの送達方法は簡便、有効で、広く用いられている。特に、あらゆる細胞型が存在し、且つ免疫応答が生じるリスクが最も高いインビボ適用に対し、免疫応答を防ぐ何らかの総合的戦略が求められている。化学修飾されたＲＮＡの使用は、これらの問題の多く、又は更には全てを解決し得る。
ある種の配列モチーフは他と比べて明らかに免疫原性が高いが、一般に自然免疫系の受容体は、原核生物ＲＮＡと比べて哺乳類ＲＮＡにより一般的に見出されるある種の塩基修飾の存在又は非存在を区別するように思われる。例えば、プソイドウリジン、Ｎ６−メチル−Ａ、及び２’−Ｏ−メチル修飾塩基は「自己」として認識され、合成ＲＮＡにこれらの残基を含めると、免疫検出を回避する助けとなり得る（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００５）。非修飾ＲＮＡとして強力な免疫刺激性を示す配列を広範囲に２’修飾すると、マウスへの静脈内投与時の免疫応答を遮断し得る（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５ｂ）。しかしながら、免疫検出の回避に広範囲の修飾は不要であり、インビトロ及びインビボの両方で１型ＩＦＮ応答を遮断するには、ｓｉＲＮＡ二重鎖の一本鎖における僅か２個の２’−Ｏ−メチル塩基の置換が十分であり得る；修飾Ｕ及びＧ塩基が最も有効である（Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。更なる利点として、２’−Ｏ−メチル塩基の選択的な組み込みにより、オフターゲット効果の大きさを低減することができる（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。従って、２’−Ｏ−メチル塩基の使用は、インビボ適用が意図されるあらゆるｄｓＲＮＡについて免疫応答の遮断手段として考慮されるべきものであり、ヌクレアーゼ安定性の改善及びオフターゲット効果の可能性の低減という更なる利点を有する。
免疫刺激によって細胞死が起こり得るが、細胞生存の評価は、ＩＦＮ応答の誘導をモニタするのに適切な方法ではない。ＩＦＮ応答は細胞死がなくても存在することがあり、細胞死はＩＦＮ惹起がない場合にも標的のノックダウンによって起こり得る（例えば、標的遺伝子が細胞の生存に必須である場合）。関連性のあるサイトカインを培養培地で直接計測することができ、かかるアッセイの実施をルーチン化する種々の市販キットが存在する。多数の異なる免疫エフェクター分子を計測し得るが、通常、スクリーニング目的には、トランスフェクション後４時間及び２４時間のＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６レベルを調べることで十分である。カチオン性脂質はある種の細胞においていかなる核酸カーゴもなしに免疫応答を惹起し得るため、「トランスフェクション試薬のみの対照」を含めることが重要である。細胞培養作業に関しては、ＩＦＮ経路誘導の対照を含めることを考慮しなければならない。ＩＦＮ応答を惹起するリスクが最も高いインビボでの核酸投与時は常に、免疫刺激に関して試験することが不可欠である。
本発明のｄｓＮＡは、本明細書において以下にＤｓｉＲＮＡについて記載する修飾パターンのいずれを有することもできる。本発明のｄｓＮＡ剤には、ｄｓＮＡ剤がダイサーの基質として働くことを妨げるような修飾でない限り、修飾を含めることができる。実際、本発明の一つの意外な発見は、先述のｄｓＮＡ分子にアンチセンス鎖の５’伸長一本鎖ヌクレオチド領域又はセンス鎖の３’伸長一本鎖ヌクレオチド領域を付加することができ、それによってＲＮＡｉの有効性及び持続期間の増進がもたらされるという点であり、但しかかる伸長は伸長分子のなかでダイサープロセシングを妨げない領域（例えば、センス鎖のダイサー切断部位の３’側／アンチセンス鎖のダイサー切断部位の５’側）において行われるものとする。一実施形態において、ｄｓｉＮＡ剤のダイサープロセシングを増進する１つ以上の修飾が作製される。第２の実施形態において、より有効なＲＮＡｉを生じさせる１つ以上の修飾が作製される。第３の実施形態において、より高いＲＮＡｉ効果を補助する１つ以上の修飾が作製される。第４の実施形態において、細胞に送達される各ｄｓＮＡ剤分子当たりの効力を高める１つ以上の修飾が作製される。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端領域及び５’末端領域の両方又は場合によっては配列内の様々な位置に組み込むことができる。上記に指摘した制約を考慮した上で、任意の数及び組み合わせの修飾をｄｓＮＡ剤に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同じであっても、又は異なってもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格、及びこれらの組み合わせに対する修飾が企図される。いずれの５’末端も、リン酸化することができる。
リン酸骨格に企図される修飾の例としては、ホスホネート類、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、及びリン酸トリエステル修飾、例えば、アルキルホスホトリエステル類、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸、モルホリノ、二環式フラノース類似体などが挙げられる。糖部分に企図される修飾の例としては、２’−アルキルピリミジン、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、アミノ、及びデオキシ修飾などが挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照のこと）。塩基類に企図される修飾の例としては、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン類、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどが挙げられる。ロックド核酸、即ちＬＮＡ、アンロックド核酸、即ちＵＮＡもまた、組み込むことができる。他の多くの修飾が公知であり、上記の基準が満たされる限り用いることができる。修飾の例はまた、米国特許第５，６８４，１４３号明細書、同第５，８５８，９８８号明細書及び同第６，２９１，４３８号明細書並びに米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号明細書にも開示されている。他の修飾が、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００），Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００１）に開示されている。
企図される１つ以上の修飾は、いずれの鎖にも組み込むことができる。ｄｓＮＡ剤における修飾の配置は、より高い効力及び安定性の付与、毒性の低減、ダイサープロセシングの増進、及び免疫応答の最小化を含め、ｄｓＮＡ剤の特徴に大きい影響を及ぼし得る。一実施形態では、アンチセンス鎖又はセンス鎖又は両方の鎖が１つ以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖が２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖（ｓｔａｎｄ）が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含有する。アンチセンス鎖はまた、追加的な２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドも含み得る。
特定の実施形態では、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域、パッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域、又はパッセンジャー鎖の５’一本鎖伸長領域が、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド、任意選択で２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域又はパッセンジャー鎖の３’一本鎖伸長領域のあらゆるヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチド、任意選択で２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域に相補的なオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド、任意選択で２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ガイド鎖の５’一本鎖伸長領域に相補的なオリゴヌクレオチドのあらゆるヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、任意選択で２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを有する。
本発明の特定の実施形態において、ｄｓｉＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを増進する１つ以上の特性を有する。これらの実施形態によれば、ｄｓｉＮＡ剤は、それがダイサーによってプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡを生じるような十分な長さ及び以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）ｄｓｉＮＡ剤が非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する、及び（ｉｉ）ｄｓｉＮＡ剤が、センス鎖上に、ダイサー結合及び活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡ領域のプロセシングの向きを指図する修飾３’末端を有する。特定のかかる実施形態では、センス鎖のうち推定ダイサー酵素切断部位より３’側にある領域及びアンチセンス鎖のうち推定ダイサー酵素切断部位の５’側にある対応する領域における１つ以上の塩基対合デオキシリボヌクレオチドの存在もまた、かかる分子をダイサー酵素切断の適切な向きに向ける働きをし得る。
特定の実施形態において、一本鎖アンチセンス伸長領域の長さは、１〜３０ヌクレオチド、１〜１５ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、１１〜１５ヌクレオチドである。従って、本発明の一本鎖伸長ｄｓＮＡは、アンチセンス／ガイド鎖の５’末端又はセンス／パッセンジャー鎖の３’末端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長又はそれ以上）の一本鎖伸長領域を有し得る。
一部の実施形態において、二本鎖核酸の最も長い鎖は３６〜６６ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ｄｓＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端がセンス鎖の３’末端にオーバーハングし、又はアンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端にオーバーハングするような構造を有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’伸長部は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長又はそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長又はそれ以上）を有し、任意選択で１０〜３０ヌクレオチド、例えば１５ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｄｓＮＡ剤は、センス鎖の３’末端がアンチセンス鎖の５’末端にオーバーハングし、及びアンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端にオーバーハングするような構造を有する。特定の実施形態において、センス鎖の３’伸長部は１〜３０ヌクレオチドであり、任意選択で１０〜３０ヌクレオチド、例えば１５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’伸長部は１〜１０ヌクレオチドであり、任意選択で１〜６ヌクレオチド、好ましくは１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。別の実施形態において、ＤｓＮＡ剤は、センス鎖の５’末端がアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングするような構造を有する。特定の実施形態において、センス鎖の５’オーバーハングは４〜３０ヌクレオチドであり、任意選択で１０〜３０ヌクレオチド、例えば１５ヌクレオチドである。センス鎖及びアンチセンス鎖の両方がまた、５’リン酸を有してもよい。図３４、図３５及び図３６に示されるとおり、センス鎖及びアンチセンス鎖の異なる５’及び３’末端における伸長部特徴の反復的組み合わせもまた、本発明において企図される。
特定の実施形態において、本発明のｄｓＮＡのセンス鎖は少なくとも２５ヌクレオチドの全長を有する（例えば、センス鎖は、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド又はそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド又はそれ以上）の長さを有する）。特定の実施形態において、センス鎖の長さは、２５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、例えば２６〜３０ヌクレオチド、又は、２７〜３０ヌクレオチド長である。関連する実施形態において、アンチセンス鎖は少なくとも３６ヌクレオチドの長さを有する（例えば、センス鎖は、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６ヌクレオチド又はそれ以上（例えば、６７、２８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０ヌクレオチド又はそれ以上）の長さを有する）。特定のかかる実施形態において、アンチセンス鎖は、３７〜５７ヌクレオチド長、又は３７〜５２ヌクレオチド長、又は３７〜４７ヌクレオチド長、又は４２〜６２ヌクレオチド長、又は４２〜５７ヌクレオチド長、又は４２〜４７ヌクレオチド長の長さを有する。
特定の実施形態において、本発明のＤｓＮＡのセンス鎖は、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０ヌクレオチド又はそれ以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０ヌクレオチド又はそれ以上））の全長を有する。特定の実施形態において、センス鎖の長さは、２５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、任意選択で３５〜５５ヌクレオチド、４０〜５５ヌクレオチド長、４０〜６０ヌクレオチド長、又は、４５〜６０ヌクレオチド長である。関連する実施形態において、アンチセンス鎖は、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、又はそれ以上（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチド）の長さを有する。特定のかかる実施形態において、アンチセンス鎖は２７〜３２ヌクレオチド長の長さを有する。
特定の実施形態において、センス鎖のうち推定ダイサー酵素切断部位の３’側にある領域及びアンチセンス鎖のうち推定ダイサー酵素切断部位の５’側にある対応する領域における１つ以上の塩基対合したデオキシリボヌクレオチドの存在が、かかる分子のダイサー酵素切断を誘導する働きをし得る。本発明の例示される特定の薬剤は、センス鎖の５’末端の１位から数えたとき２４位又はそれより３’側に位置するセンス鎖デオキシリボヌクレオチドを有し、センス鎖のこの２４位又はそれより３’側のデオキシリボヌクレオチドはアンチセンス鎖のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合しているが、一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド残基を例えばセンス鎖の２０位に含めることにより、ダイサーがより短い産物、例えば１９ｍｅｒ又は２０ｍｅｒを切断するように誘導することもまた可能である。かかる２０位デオキシリボヌクレオチドはアンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと塩基対合し、それによって最も高頻度に見られるダイサー産物として１９ｍｅｒのダイサー媒介切り出しを誘導する（アンチセンス鎖もまた、アンチセンス残基のすぐ３’側に、かかる実施形態におけるセンス鎖の２０位デオキシリボヌクレオチド残基と塩基対合する１個又は２個のデオキシリボヌクレオチド残基を含み、アンチセンス鎖のダイサー切断を更に誘導することが注記される）。かかる実施形態において、二本鎖ＤＮＡ領域（ダイサー切断を遮断する修飾核酸を含む）は、ダイサー切断によって通常好ましくないダイサー切断産物長さであるものが生じるように誘導するため、概して１又は２塩基対より長い長さ（例えば、３〜５塩基対又はそれ以上）を有することになる。また、２０ｍｅｒ ｓｉＲＮＡのダイサー切り出しを誘導する同様の手法をとることもでき、ここでセンス鎖の１番目のデオキシリボヌクレオチド残基の位置（センス鎖の５’末端にある１位からセンス鎖を見たとき）は、２１位に存在する。
特定の実施形態において、本発明のＤｓＮＡ剤は、概して、ヌクレオチド位置の約５〜約１００％（例えば、ヌクレオチド位置の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）に修飾ヌクレオチドを含み得る。所与のｓｉＮＡ分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、そのｓｉＮＡに存在するヌクレオチドの総数に依存する。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾割合は、一本鎖ｓｉＮＡ分子に存在するヌクレオチドの総数を基準とし得る。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合；修飾割合は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖との両方に存在するヌクレオチドの総数を基準とし得る。加えて、所与のｓｉＮＡ分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージはまた、そのｓｉＮＡに存在するプリン及びピリミジンヌクレオチドの総数に依存することもあり、例えば、ここではｓｉＮＡ分子に存在する全てのピリミジンヌクレオチド及び／又は全てのプリンヌクレオチドが修飾されている。場合によっては、更にはセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の１００％が完全に修飾されていてもよい。
特定の実施形態において、ＤｓｉＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシング用に修飾され、即ち、ＤｓｉＮＡ剤は、センス鎖修飾によってダイサー結合及びプロセシングの向きを指図するように設計される。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害を有する分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、通常ｄＮＭＰに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を２−ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。他のヌクレオチド修飾因子としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシリボヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子、又は２個のヌクレオチド修飾因子がセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを置換する。立体障害を有する分子が利用される場合、それらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付加される。従って、修飾因子が組み込まれても鎖の長さは変化しない。別の実施形態において、本発明は、ＤｓｉＮＡ剤の２個のＤＮＡ塩基を置換してアンチセンス鎖のダイサープロセシングの向きを指図することを企図する。本発明の更なる実施形態において、２個の末端ＤＮＡ塩基がセンス鎖の３’末端上の２個のリボヌクレオチドと置換されてセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に二重鎖の平滑末端を形成し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、ＤＮＡが平滑末端にあり、且つＲＮＡ塩基がオーバーハング末端にある非対称組成物である。本発明の特定の実施形態において、センス鎖の３’末端の最後から２番目及び最後の位置の修飾ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド）は、アンチセンス鎖の対応する修飾ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド）（任意選択で、センス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する本発明のＤｓｉＮＡ剤では、アンチセンス鎖の５’末端の最後から２番目及び最後の残基）と塩基対合する。
本発明のＤｉＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、細胞の細胞質に見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。加えて、ＤｓｉＮＡ剤のこれらの配列のうちの一方、特にアンチセンス鎖の領域は少なくとも１９ヌクレオチドの配列長さを有し、ここでこれらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１ヌクレオチド領域にあり、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に対し、かかる標的ＲＮＡとアニールし及び／又はそのレベルを低下させるのに十分に相補的である。
本発明のＤｓｉＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖のうちセンス鎖の推定ダイサー切断部位の３’側及びアンチセンス鎖の推定ダイサー切断部位の５’側にある任意の位置にある１つ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基対を有し得る。特定の実施形態において、センス鎖の２４〜２７位の１、２、３又は４つ全て（センス鎖の５’末端における１位を始点とする）がデオキシリボヌクレオチドであり、これの各デオキシリボヌクレオチドがアンチセンス鎖の対応するデオキシリボヌクレオチドと塩基対合する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’領域（例えば、アンチセンス鎖のうち所与のＤｓｉＮＡ分子についての推定ダイサー切断部位の５’側に位置する領域）のデオキシリボヌクレオチドは、ＤｓｉＮＡ剤が仕向けられる標的ＲＮＡと相補的でない。関連する実施形態では、アンチセンス鎖のうちＤｓｉＮＡ剤の推定ダイサー切断部位の５’側に位置する領域全体が、ＤｓｉＮＡ剤が仕向けられる標的ＲＮＡと相補的でない。特定の実施形態では、アンチセンス鎖のデオキシリボヌクレオチド又はアンチセンス鎖のうちＤｓｉＮＡ剤の推定ダイサー切断部位の５’側に位置する領域全体が、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡとの間のアニーリングを可能にするのに十分な条件下でアンチセンス鎖が標的ＲＮＡとアニールしたとき、ＤｓｉＮＡのアンチセンス鎖と標的ＲＮＡとのアニーリングを増進するのに十分な標的ＲＮＡに対する相補性を有しない（例えば、ＤＮＡ伸長領域を欠いている「コア」アンチセンス鎖配列も、ＤＮＡ伸長領域の配列で同様に伸長した同じ「コア」アンチセンス鎖配列と等しく十分に標的ＲＮＡとアニールする）。
ＤｓＮＡ剤はまた、以下の追加的な特性の１つ以上も有し得る：（ａ）アンチセンス鎖が典型的２１ｍｅｒからの右又は左シフトを有する、（ｂ）鎖が完全には相補的でないこともあり、即ち、鎖が単純なミスマッチ対合を含有し得る、及び（ｃ）センス鎖の５’末端にロックド核酸及びアンロックド核酸（ＵＮＡ）などの塩基修飾が含まれ得る。「典型的」２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは従来技術を用いて設計される。一つの技法では、通常、種々の部位が並行して、又は同じ標的に特異的な幾つかの異なるｓｉＲＮＡ二重鎖を含有するプールが、それらの試薬のうちの１つが有効であることを期待して試験される（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。他の技法は、活性ＲＮＡｉエフェクター分子が得られる可能性を高める設計ルール及びアルゴリズムを用いる（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選択が開発されている（米国特許出願公開第２００５／００４２６４１ Ａ１号明細書）。潜在的標的部位はまた、二次構造予測によっても分析することができる（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。次にこの２１ｍｅｒを使用して、２１ｍｅｒの５’末端に３〜９個の追加的なヌクレオチドを含むように右シフトが設計される。これらの追加的なヌクレオチドの配列は、どの配列を有してもよい。一実施形態において、加えられるリボヌクレオチドは標的遺伝子の配列に基づく。この実施形態であっても、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間の完全な相補性は必要ない。
本発明のＤｓＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。それらは、生物学的条件下でアニールし且つ標的配列と十分に相補的なｓｉＲＮＡを生じるダイサーに対する基質を提供するのに実質的に相補的であれば十分である。ロックド核酸、即ちＬＮＡ、アンロックド核酸（ＵＮＡ）は、当業者に周知である（Ｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋｕｒｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｃｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，２００１；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。一実施形態において、センス鎖の５’末端にＬＮＡが組み込まれる。別の実施形態において、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むように設計された二重鎖においてセンス鎖の５’末端にＬＮＡが組み込まれる。
特定の実施形態において、本発明のＤｓＮＡ剤は、センス鎖が２７塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が２９塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する非対称構造を有する。かかる薬剤は、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜４個のデオキシリボヌクレオチドを有してもよく、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。他の実施形態では、センス鎖が２８塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が３０塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する。かかる薬剤は、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜５個のデオキシリボヌクレオチドを有してもよく、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。更なる実施形態では、センス鎖が２９塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が３１塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する。かかる薬剤は、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜６個のデオキシリボヌクレオチドを有してもよく、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。更なる実施形態では、センス鎖が３０塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が３２塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する。かかる薬剤は、任意選択で、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜７個のデオキシリボヌクレオチドを有し、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。他の実施形態では、センス鎖が３１塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が３３塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する。かかる薬剤は、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜８個のデオキシリボヌクレオチドを有してもよく、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。更なる実施形態では、センス鎖が３２塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が３４塩基対長及び２塩基３’−オーバーハングを有する。かかる薬剤は、任意選択で、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜９個のデオキシリボヌクレオチドを有し、これらのデオキシリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。特定の更なる実施形態では、センス鎖が３３塩基対長を有し、且つアンチセンス鎖が、２塩基３’−オーバーハングを伴う３５塩基対長を有する。かかる薬剤は、任意選択で、センス鎖の３’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の３’側の領域）に１〜１０個のデオキシリボヌクレオチドを有し、これらのうちの少なくとも１つはアンチセンス鎖の５’末端領域（具体的には、推定ダイサー切断部位の５’側の領域）のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合している。なおも他の実施形態では、これらのＤｓＮＡ剤の任意のものが、センス鎖の３’末端に、アンチセンス鎖のコグネイトデオキシリボヌクレオチドと塩基対合し得る２個のデオキシリボヌクレオチドを更に含有する非対称構造を有する。
２個の別個のオリゴヌクレオチドを含有する特定のＤｓＮＡ剤組成物を第３の構造によって連結することができる。第３の構造はＤｓＮＡ剤に対するダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの標的化された破壊を妨げない。一実施形態において、第３の構造は化学的連結基であってもよい。多くの好適な化学的連結基が当該技術分野において公知であり、使用することができる。或いは、第３の構造は、ｄｓＮＡ組成物を構成する２つのオリゴヌクレオチドをアニールしたときにヘアピン構造が作り出されるような形でＤｓＮＡ剤の２つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造はＤｓＮＡ剤に対するダイサー活性を遮断せず、標的ＲＮＡの標的化された破壊を妨げない。
特定の実施形態において、本発明のＤｓＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを増進する幾つかの特性を有する。かかる実施形態によれば、ＤｓＮＡ剤は、それがダイサーによってプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じるような十分な長さ及び以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）ＤｓＮＡ剤が非対称であり、例えばセンス鎖上に３’オーバーハングを有する、及び（ｉｉ）ＤｓＮＡ剤が、アンチセンス鎖上に、ダイサーがｄｓＲＮＡ領域に結合してそれを活性ｓｉＲＮＡにプロセシングする向きを指図する修飾３’末端を有する。これらの実施形態によれば、ＤｓＮＡ剤の最も長い鎖は２５〜４３ヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は２５〜３９ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２６〜４３ヌクレオチドを含む。得られるｄｓＮＡはセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有し得る。オーバーハングは１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。アンチセンス鎖又はセンス鎖はまた、５’リン酸も有し得る。
特定の実施形態において、本発明のＤｓＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを増進する幾つかの特性を有する。かかる実施形態によれば、ＤｓＮＡ剤は、それがダイサーによってプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じるような十分な長さ及び以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）ＤｓＮＡ剤が非対称であり、例えばセンス鎖上に５’オーバーハングを有する、及び（ｉｉ）ＤｓＮＡ剤が、アンチセンス鎖上に、ダイサーがｄｓＲＮＡ領域に結合してそれを活性ｓｉＲＮＡにプロセシングする向きを指図する修飾３’末端を有する。これらの実施形態によれば、ＤｓＮＡ剤の最も長い鎖は２５〜４３ヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は２５〜４３ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２５〜３９ヌクレオチドを含む。得られるｄｓＮＡはセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有し得る。オーバーハングは１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。アンチセンス鎖又はセンス鎖はまた、５’リン酸も有し得る。
特定の実施形態において、ＤｓｉＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシング用に修飾され、即ち、ＤｓｉＮＡ剤は、ダイサー結合及びプロセシングの向きを指図するように設計される。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害を有する分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、通常ｄＮＭＰに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を２−ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。他のヌクレオチド修飾因子としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシリボヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子、又は２個のヌクレオチド修飾因子がセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを置換する。立体障害を有する分子が利用される場合、それらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付加される。従って、修飾因子が組み込まれても鎖の長さは変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサープロセシングの向きを指図するためｄｓＮＡの２個のＤＮＡ塩基を置換することを企図する。更なる実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端上の二重鎖の平滑末端を形成する２個のリボヌクレオチドの代わりにセンス鎖の３’末端に２個の末端ＤＮＡ塩基が位置し、且つ２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端にＤＮＡがあり、且つオーバーハング末端にＲＮＡ塩基がある非対称組成物である。
特定の他の実施形態において、ＤｓｉＮＡ剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシング用に修飾され、即ち、ＤｓｉＮＡ剤は、ダイサー結合及びプロセシングの向きを指図するように設計される。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド、及び蛍光分子などの立体障害を有する分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、通常ｄＮＭＰに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を２−ヒドロキシエトキシメチル基で置換する。他のヌクレオチド修飾因子としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを挙げることができる。一実施形態において、デオキシリボヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子が利用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子、又は２個のヌクレオチド修飾因子がアンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドを置換する。立体障害を有する分子が利用される場合、それらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付加される。従って、修飾因子が組み込まれても鎖の長さは変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサープロセシングの向きを指図するためｄｓＮＡの２個のＤＮＡ塩基を置換することを企図する。更なる発明において、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端上の二重鎖の平滑末端を形成する２個のリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’末端に２個の末端ＤＮＡ塩基が位置し、且つセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングが位置する。これもまた、平滑末端にＤＮＡがあり、且つオーバーハング末端にＲＮＡ塩基がある非対称組成物である。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、細胞の細胞質に見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。加えて、ｄｓＮＡのこれらの配列のうちの一方、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長さを有し、ここでこれらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の３’末端に隣接し、且つＲＮＡ干渉を誘導するのに十分な標的ＲＮＡのヌクレオチド配列との相補性を有する。
加えて、ＤｓｉＮＡ剤構造は、ダイサー切断によって生じるオリゴヌクレオチドが遺伝子発現の阻害において最も有効であることが確実となるように最適化することができる。例えば、本発明の一実施形態において、ＤｓｉＮＡ剤構造の２７〜３５ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、ここでは遺伝子発現を阻害すると予想される２１〜２２ｂｐセグメントがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。アンチセンス鎖の５’末端に位置する残りの塩基はダイサーによって切断され、切り捨てられることになる。この切断される部分は相同であっても（即ち、標的配列の配列に基づく）、又は非相同であってもよく、核酸鎖の伸長のため加えられ得る。本発明で意外にも突き止められたとおり、かかる伸長は、塩基対合したＤＮＡ残基（二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長部）で行うことができ、対応する二本鎖ＲＮＡ：ＲＮＡ伸長ＤｓｉＮＡ剤と比べて有効性又は効果持続期間が改善した伸長ＤｓｉＮＡ剤がもたらされ得る。
米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書は、２７ｍｅｒ ＤｓＮＡが、化学修飾がなくても、同等の２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ組成物と比べて血清中安定性の改善を示すことを開示している。アンチセンス鎖に２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含めるなど、米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書及び本実施例に詳述されるようなパターンでのＤｓＮＡ剤の修飾は、５’リン酸の付加と併せたとき、ＤｓＮＡ剤の安定性を改善し得る。合成ＲＮＡ二重鎖の全ての鎖に５’−リン酸を付加することは、幾らか限られた程度のヌクレアーゼ安定性を付与するための安価な生理的方法であり得る。
本発明のＤｓＮＡ剤の化学修飾パターンは、かかる薬剤の有効性を増進するように設計される。従って、かかる修飾は、ＤｓＮＡ剤の効力の低下を回避し；ＤｓＮＡ剤のダイサープロセシングの妨害を回避し；ＤｓＮＡ剤の生体液中での安定性を改善し（ヌクレアーゼ感受性を低下させる）；又は自然免疫系による検出を遮断又は回避するように設計される。かかる修飾はまた、毒性を回避し、且つ本発明のこのＤｓＮＡ剤のコスト又は製造の容易さへの影響の増大を回避するようにも設計される。
ＲＮＡプロセシングｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉのプロセスは、細胞における長いｄｓＲＮＡ分子の存在によって惹起される。ＲＮＡｉの開始段階でこれらのｄｓＲＮＡ分子がダイサー（２つのＲＮアーゼＩＩＩ様ドメインを含有する保存されている酵素ファミリー）によって切断され、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子干渉ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）になる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．２００１）。このｓｉＲＮＡは、１９〜２１塩基対の二重鎖領域及び各鎖上の２ヌクレオチドの３’オーバーハングによって特徴付けられる。ＲＮＡｉのエフェクター段階で、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多量体タンパク質複合体に組み込まれ、ここでｓｉＲＮＡは、分解する完全に相補的なｍＲＮＡ基質を選択するためのガイドとして働く。分解は、ｓｉＲＮＡと相補的な領域内のｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼによる切断によって開始される。より正確には、ｍＲＮＡは、ガイドｓｉＲＮＡの５’末端から１０ヌクレオチドの位置で切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００；Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｃｅｌｌ １０７：３０９−３２１；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｃｅｌｌ １１０：５６３−５７４）。この切断に関与するエンドヌクレアーゼは、アルゴノート２と同定された（Ａｇｏ２；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０５：１４３７−４１）。
ｍｉＲＮＡ
ヒトｍｉＲＮＡの大多数（７０％）−及び恐らくは他の哺乳動物のｍｉＲＮＡの大多数−はイントロン及び／又はエクソンから転写され、及び約３０％は遺伝子間領域に位置する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００４，１４（１０Ａ），１９０２−１９１０）。ヒト及び動物においては、ｍｉＲＮＡは通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され（Ｆａｒｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５，３１０（５７５５），１８１７−１８２１）、一部の例ではｐｏｌ ＩＩＩによって転写される（Ｂｏｒｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，１３（１２），１０９７−１１０１）。ウイルスがコードする特定のｍｉＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され（Ｐｆｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５，２（４），２６９−２７６；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１５），９５５６−９５６５）、一部はウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームに位置する（Ｐｆｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５，２（４），２６９−２７６；Ｓａｍｏｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５，７９（１４），９３０１−９３０５）。ｍｉＲＮＡ転写は、大きいモノシストロン性、バイシストロン性又はポリシストロン性一次転写物（プリｍｉＲＮＡ）の産生をもたらす。単一のプリｍｉＲＮＡは、長さが約２００ヌクレオチド（ｎｔ）〜数キロベース（ｋｂ）の範囲であり、５’の７−メチルグアノシン（ｍ７）キャップと３’のポリ（Ａ）テールとの両方を有し得る。特徴として、成熟ｍｉＲＮＡ配列は、プリｍｉＲＮＡ内の不完全なステム−ループ配列の領域に局在化している（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００４，１６（６），８６１−８６５）。
核におけるｍｉＲＮＡ成熟の第一段階は、ＲＮアーゼＩＩＩドローシャ−ＤＧＣＲ８核マイクロプロセッサ複合体によるプリｍｉＲＮＡの認識及び切断であり、これにより、５’末端に一リン酸及び３’末端にヒドロキシル基を含む２ｎｔオーバーハングを有する、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる約７０ｎｔのヘアピン含有前駆体分子が放出される（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２００４，１０（１２），１９５７−１９６６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００３，４２５（６９５６），４１５−４１９；Ｋｉｍ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，６（５），３７６−３８５）。次の段階は、キャリアータンパク質であるエクスポーチン−５による核から細胞質へのプレｍｉＲＮＡの核輸送である（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００３，１７（２４），３０１１−３０１６，Ｂｏｈｎｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２００４，１０（２），１８５−１９１）。エクスポーチン−５及びＧＴＰ結合型のその補因子Ｒａｎは、一緒になって２ヌクレオチド３’オーバーハング及び隣接するステム（プレｍｉＲＮＡの特徴である）を認識及び結合する（Ｂａｓｙｕｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３，３１（２２），６５９３−６５９７，Ｚａｍｏｒｅ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００１，８（６），１１５８−１１６０）。細胞質でＧＴＰ加水分解によってプレｍｉＲＮＡの放出が生じ、次にはこれが細胞エンドヌクレアーゼＩＩＩ酵素ダイサーによってプロセシングされる（Ｂｏｈｎｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．）。ダイサーは、当初は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するｓｉＲＮＡの生成におけるその役割が認められた。ダイサーはその補因子ＴＲＢＰ（Ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃｈｅｎｄｒｉｍａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００５，４３６（７０５１），７４０−７４４）及びＰＡＣＴ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ−ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．２００６，２５（３），５２２−５３２）と協働する。これらの酵素は、プレｍｉＲＮＡヘアピンの基部にある３’側２ヌクレオチドオーバーハングに結合して末端ループを取り除き、両末端が５’一リン酸、３’２ヌクレオチドオーバーハング及び３’ヒドロキシル基を有する約２１ｎｔのｍｉＲＮＡ二重鎖中間体をもたらす。次に、その５’末端の安定性がエネルギー的に低いｍｉＲＮＡガイド鎖がＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）への取り込みに選択され、一方「パッセンジャー」鎖は遊離して分解される（Ｍａｎｉａｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．２００５，１９（２４），２９７９−２９９０；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０４（６７７５），２９３−２９６）。ＲＩＳＣの組成は未だ完全には定義付けられていないが、重要な要素がアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーのメンバーである（Ｍａｎｉａｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．；Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００４，１５（２），１８５−１９７）。
次には成熟ｍｉＲＮＡがＲＩＳＣを相補ｍＲＮＡ種に誘導する。標的ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡを備えたＲＩＳＣと完全な相補性を有する場合、ｍＲＮＡが切断及び分解されることになる（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００３，１００（１７），９７７９−９７８４；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７（５５ ８９），２０５６−２０６０）。しかし哺乳類細胞における最も一般的な状況としては、ｍｉＲＮＡは不完全な相補性のｍＲＮＡを標的化してそれらの翻訳を抑制することにより、対応するタンパク質の発現の低下を生じさせる（Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４，３０４（５６７０），５９４−５９６；Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２１６（２），６７１−６８０）。ｍｉＲＮＡの５’領域、特に、シード領域と呼ばれる、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７又は８（５’末端の１位を始点とする）におけるｍｉＲＮＡと標的配列とのマッチは、ｍｉＲＮＡ標的化に本質的に重要であり、このシードマッチはまた、ｍｉＲＮＡ標的化のコンピュータ予測において広く用いられる基本原理にもなっている（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００５，１２０（１），１５−２０；Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２００５，３（３），ｅ８５）。ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ二重鎖のｍｉＲＮＡ調節は、３’ＵＴＲにおける複数の相補部位によって主に媒介されるが、多くの例外がある。ｍｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び／又はコード領域も結合し、同様の結果をもたらし得る（Ｌｙｔｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７，１０４（２３），９６６７−９６７２）。
ＲＮアーゼＨ
ＲＮアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖におけるＲＮＡの３’−Ｏ−Ｐ結合を切断して３’−ヒドロキシル及び５’−リン酸末端産物を生じさせるリボヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨは非特異的エンドヌクレアーゼであり、酵素結合二価金属イオンの助けを借りて、加水分解機構によるＲＮＡの切断を触媒する。ＲＮアーゼＨファミリーのメンバーは、古細菌及び原核生物から真核生物まで、ほぼ全ての生物に見られる。ＤＮＡ複製の間に、ＲＮアーゼＨは、岡崎フラグメント生成のプライミングに関与するＲＮＡプライマーを切断すると考えられている；しかしながら、ＲＮアーゼＨ酵素は、より一般的には、十分な長さの任意のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列（例えば、典型的には、哺乳動物における４塩基対長又はそれ以上のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド配列）の切断に用いられ得る。
マイクロＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ様治療薬
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、鋳型転写物の３’ＵＴＲに結合することによって作用し、従ってその鋳型転写物によってコードされるタンパク質の発現を、古典的ＲＮＡ干渉に関連する、しかしそれとは異なる機構によって阻害することが記載されている。具体的には、ｍｉＲＮＡは、その安定性を低下させるよりむしろ、標的転写物の翻訳を低減することによって作用すると考えられる。天然に存在するｍｉＲＮＡは、典型的には長さ約２２ｎｔである。これらは、低分子一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）約７０ｎｔ長として知られるより大きい前駆体に由来すると考えられる。
３’ＵＴＲの範囲内（又は標的転写物内の別の場所、例えば、例えばＮｏｔｃｈの反復エレメント及び／又はＮｏｔｃｈファミリーの転写物内）で結合し、翻訳を阻害するｓｉＲＮＡなど、より具体的にはｍｉＲＮＡなどの干渉剤は、ｓｉＲＮＡ／鋳型（ｍｉＲＮＡ／鋳型）二重鎖に多数のミスマッチを許容することができ、特に二重鎖の中心領域の範囲内におけるミスマッチを許容することができる。実際に、天然に存在するｓｔＲＮＡは高頻度でかかるミスマッチを呈し、インビトロで翻訳を阻害することが示されているｍｉＲＮＡもまた同様であるため、一部のミスマッチは望ましい、又は必須であり得るというエビデンスがある（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，９：１−２０）。例えば、標的転写物とハイブリダイズしたとき、かかるｍｉＲＮＡは高頻度で、ミスマッチ領域によって隔てられた完全な相補性の２つのストレッチを含む。このようなハイブリダイズした複合体は、通常、ヌクレオチド対を含む完全な相補性の２つの領域（二重鎖部分）と、例えば、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｕ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｇ：−、Ａ：−、Ｕ：−、Ｃ：−等であり得る少なくともシングルミスマッチ塩基対とを含む。かかるミスマッチヌクレオチドは、特にタンデムに存在する場合（例えば、２、３又は４ヌクレオチドのミスマッチ範囲）にはバルジを形成することができ、これはかかるバルジの両側に位置する二重鎖部分を隔てるものであり得る。種々の構造が可能である。例えば、ｍｉＲＮＡは複数の非一致（ミスマッチ）範囲を含み得る。非一致（ミスマッチ）範囲は、標的及びｍｉＲＮＡの両方が非対合ヌクレオチドを含むという意味の対称性を有する必要はない。例えば、一方の鎖のみが非対合ヌクレオチドを含む構造が記載されている（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．）。典型的には、ｍｉＲＮＡ剤内の完全な相補性のストレッチは、少なくとも５ヌクレオチド長、例えば、６、７ヌクレオチド長又はそれ以上であり、一方でミスマッチ領域は、例えば、１、２、３、又は４ヌクレオチド長であり得る。
一般に、任意の特定のｓｉＲＮＡが、（ｉ）標的転写物の安定性を低下させる、多くの場合にｓｉＲＮＡと標的との間の完全な相補性が好ましい「古典的」ｓｉＲＮＡ経路を介すること、また（ｉｉ）標的転写物の翻訳が阻害される「代替的」経路（概して動物におけるｍｉＲＮＡ経路として特徴付けられる）によることの両方によって、遺伝子発現を阻害する機能を果たし得る。概して、特定のｓｉＲＮＡによって機構（ｉ）を介して標的化される転写物は、機構（ｉｉ）を介して標的される転写物と異なり得るが、単一の転写物が古典的経路及び代替的経路の両方の標的として働き得る領域を含有し得ることも可能である（用語「古典的」及び「代替的」は、単に便宜上用いられるに過ぎず、概して歴史上の動物細胞におけるかかる機構の発見のタイミングを反映するものと考えられ、いずれか一方の機構の重要性、有効性、又は他の特徴を反映するものではないことに留意されたい）。ｓｉＲＮＡ設計の一つの共通目標は、潜在的に機構（ｉｉ）を介して誘発される効果を含めたオフターゲット効果を最小限に抑えつつ、機構（ｉ）を介して高い特異性で単一の転写物を標的化することであった。しかしながら、本発明の目標の中には、天然に存在するｍｉＲＮＡの活性を模倣するため、或いは、対応するｍｉＲＮＡが現在のところ知られていない標的ＲＮＡに対する薬剤を作り出すため、設計上ミスマッチ残基を有するＲＮＡ干渉剤を提供することがあり、かかるミスマッチを含有するＤｓｉＲＮＡ剤（例えばＤｓｉＲＮＡｍｍ剤）の阻害及び／又は治療効果／効力は、かかるミスマッチを許容し、実際にはかかるミスマッチによって増進する可能性がある。
ｍｉＲＮＡ剤がミスマッチヌクレオチドを許容すること（及び、実際に細胞における上記機構（ｉｉ）の存在及び天然の利用）は、機構（ｉ）を介して作用する完全に相補的なｓｉＲＮＡの「古典的」利用にとって有利な、及び／又はそれを拡大する形でのｍｉＲＮＡの使用を示唆する。ｍｉＲＮＡは天然に存在する分子であるため、ｍｉＲＮＡを治療剤として適用することには特徴的な利点があるものと思われる。ｍｉＲＮＡは、何億年も進化的にその機能が「微調整」されることによって恩恵を受けている。従って、配列特異的な「オフターゲット」効果が天然に存在するｍｉＲＮＡで問題となることはなく、ひいては、天然に存在するｍｉＲＮＡを模倣するように設計された本発明の特定の合成ＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤）においても問題となることはないはずである。加えて、ｍｉＲＮＡは、上方制御及び下方制御の両方を駆動して（場合によっては、細胞内で両方の機能を同時に果たし、単一のｍｉＲＮＡが複数の標的ＲＮＡに対して広域的に作用して）遺伝子群の発現を調節するように進化しており、その結果、複雑な細胞機能を正確に調節できるようになっている。天然に存在するｍｉＲＮＡのかかる置換は、正常な増殖、アポトーシス、細胞周期、及びその他の、１つ以上のｍｉＲＮＡの下方制御によって影響を受けている細胞機能を回復させる目的で、罹患組織に合成ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ模倣体（例えば、特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ）を導入することを伴い得る。特定の例では、これらのｍｉＲＮＡ調節経路の再活性化によって有意な治療反応が生じている（例えば、心肥大に関するある研究では、ｍｉＲＮＡ発現カセットのアデノウイルス媒介送達によってｍｉＲ−１３３を過剰発現させると、アゴニスト誘発性心肥大から動物が保護された一方、アンタゴｍｉｒによる野生型マウスのｍｉＲ−１３３の相反的な低下によって肥大マーカーの増加が生じた（Ｃａｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：６１３−６１８））。
現在まで、６００個を超えるｍｉＲＮＡが、ヒトゲノム内でコードされるものとして同定されており、かかるｍｉＲＮＡは核及び細胞質内のタンパク質の組み合わせによって発現し、プロセシングされる。ｍｉＲＮＡは脊椎動物の間で高度に保存されており、全哺乳類遺伝子の約２％を占める。各ｍｉＲＮＡが複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個又は更には数十〜数百個の異なる遺伝子の発現を調節するものと見られるため、ｍｉＲＮＡは「マスタースイッチ」として機能して、複数の細胞経路及び過程を効率的に調節し、連係させることができる。ｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子の発現を連係させることにより、胚発生、免疫、炎症、並びに細胞の成長及び増殖において重要な役割を果たす。
発現及び機能研究から、特定のｍｉＲＮＡの発現の変化が種々のヒト疾患に決定的に重要であることが示唆される。増大しつつあるエビデンスが示すところによれば、特定のｍｉＲＮＡを疾患細胞及び組織に導入することにより、有利な治療反応を生じさせ得る（Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．１２：１１５−２７）。ある種のｍｉＲＮＡは腫瘍抑制因子としての役割が明らかであるため、ｍｉＲＮＡ療法の有望さは恐らく癌において最も高い。ｍｉＲＮＡベースの療法の例えば癌に対する理論的根拠は、少なくとも一部には、以下の観察によって裏付けられる。
（１）ｍｉＲＮＡは罹患組織では正常組織と比べて高頻度で誤制御され、発現レベルが変化する。幾つもの研究が、対応する正常組織と比べた癌性組織におけるｍｉＲＮＡレベルの変化を明らかにしている。多くの場合、発現の変化は、特定のｍｉＲＮＡの発現の増加又は低下につながる遺伝子突然変異の結果である。ユニークなｍｉＲＮＡ発現シグネチャを有する疾患は診断及び予後判定マーカーとして利用することができ、本発明のＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ）剤によって標的化することができる。
（２）誤制御されたｍｉＲＮＡは、癌遺伝子又は腫瘍抑制因子として機能することによって癌の発育に寄与する。癌遺伝子は、その過剰発現又は不適切な活性化が発癌につながる遺伝子として定義される。腫瘍抑制因子は、細胞が癌性になるのを防ぐために必要な遺伝子である；腫瘍抑制因子の下方制御又は不活性化は、よく見られる癌誘導因子である。両タイプの遺伝子とも好ましい薬物標的に相当し、従って標的化することは、特定の癌の分子基盤に対して特異的に作用し得る。発癌性ｍｉＲＮＡの例はｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−１７−９２であり；ｌｅｔ−７は腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡの例である。
（３）前臨床動物試験においては、ｍｉＲＮＡを投与すると、腫瘍成長の阻止又は低減によって治療反応が生じる。科学文献は、インビトロで、及び動物モデルにおいてもまた、ｍｉＲＮＡ機能の回復によって癌細胞の成長を防止又は低減し得ることを実証する概念実証研究を提供する。十分に特徴付けられた例は、乳癌及び肺癌モデルにおけるｌｅｔ−７の抗腫瘍活性である。ｌｅｔ−７を模倣するように設計された本発明のＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ）を使用してかかる癌を標的化することができ、また、本明細書に記載されるＤｓｉＲＮＡ設計パラメータを使用して、対応する天然に存在するｍｉＲＮＡが知られていない標的ＲＮＡ（例えば、Ｎｏｔｃｈ又は他の転写物内のリピート）に対する新規ＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡｍｍ）剤を作成し、リード治療化合物、例えば、前臨床動物モデルで腫瘍量を低減することが可能な薬剤をスクリーニングすることも可能である。
（４）所与のｍｉＲＮＡが複数の細胞経路を制御し、従って優れた治療活性を有し得る。その生物学に基づけば、ｍｉＲＮＡはゲノムの「マスタースイッチ」として機能して、複数の遺伝子産物を調節し、複数の経路を連係させることができる。ｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子は、多くが製薬業界によって個々に薬物標的として探究されている従来の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子をコードする遺伝子を含む。従って、ｍｉＲＮＡ療法薬は、複数の疾患及び／又は癌関連遺伝子を標的化することにより、ｓｉＲＮＡ及び他の形態のリード化合物よりも優れた活性を有し得る。ｍｉＲＮＡの誤調節が高頻度で腫瘍発生プロセスの初期イベントであるという観察を所与とすれば、欠損したｍｉＲＮＡを補充するｍｉＲＮＡ療法薬は、最適な療法であり得る。
（５）ｍｉＲＮＡは天然の分子であり、従って非特異的副作用を誘発しにくい。何百万年にもわたる進化が、ｍｉＲＮＡの調節ネットワークの発達を助け、ｍｉＲＮＡと標的メッセンジャーＲＮＡとの相互作用を微調整してきた。従って、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ誘導体（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡを模倣するように設計されたＤｓｉＲＮＡ）が適切なコンテクストで適用されたときの配列特異的「オフターゲット」効果は、例えあったとしても、僅かであり得る。
ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの物理的特徴は類似している。従って、ｓｉＲＮＡ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ）の送達に有効な技術は、合成ｍｉＲＮＡ（例えば、本発明の特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ）の送達においても同様に有効である。
ｄｓＮＡ剤のコンジュゲーション及び送達
特定の実施形態において、本発明は、疾患又は障害を有する又はそれを発症するリスクがある対象の治療方法に関する。かかる実施形態において、ｄｓＮＡは、疾患又は障害を制御する新規治療剤として作用し得る。本方法は、患者（例えばヒト）に本発明の医薬組成物を投与して、標的ＲＮＡの発現、レベル及び／又は活性を低減することを含む。標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現、レベル及び／又は活性もまた、本発明のＤｓＮＡによって低減し得る。
疾患又は障害の治療においては、疾患又は障害を呈するか、又はそれに関連する細胞又は組織に、ＤｓｉＲＮＡを接触させることができる。例えば、標的ＲＮＡ配列の全て又は一部と実質的に同一のＤｓＮＡをインビボ又はインビトロのいずれかで罹患細胞、疾患関連細胞又は感染細胞に接触させ、又は導入してもよい。同様に、標的ＲＮＡ配列の全て又は一部と実質的に同一のＤｓＮＡを、疾患又は障害を有する又はそれを発症するリスクがある対象に直接投与してもよい。
本発明のＤｓＮＡ剤の治療使用は、複数の異なるＤｓＮＡ剤配列を含むＤｓＮＡ剤の製剤の使用を伴うものであり得る。例えば、本明細書に記載される薬剤の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上等を組み合わせて、例えば、１つ以上の標的ＲＮＡの複数の異なる領域を標的化する製剤を作製することができる。本発明のＤｓＮＡ剤はまた、ＤｓＮＡ剤のいずれか一方の鎖が独立に標的ＲＮＡの２つ以上の領域を標的化するように構築されてもよい。標的核酸分子の２つ以上の領域を標的化する多官能性ＤｓＮＡ分子の使用は、ＲＮＡレベル及び発現の強力な阻害をもたらすものと思われる。例えば、本発明の単一の多官能性ＤｓＮＡコンストラクトは、標的核酸分子の保存されている領域及び可変的な領域の両方を標的化することができ、従って、例えば、ウイルスの異なる株変異体、又は単一の標的遺伝子によってコードされるスプライス変異体を下方制御又は阻害することが可能である。
本発明のＤｓＮＡ剤は、別の部分（例えばペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、色素、コレステロールなど）とコンジュゲート（例えば、そのセンス鎖又はアンチセンス鎖のその５’又は３’末端に）していても、又はコンジュゲートしていなくてもよい。このようにしてＤｓＮＡ剤を修飾すると、対応する非コンジュゲートＤｓＮＡ剤と比較したとき、得られるＤｓＮＡ剤誘導体の細胞取り込みを改善し、又は細胞標的化活性を増強することができ、細胞内のＤｓＮＡ剤誘導体を追跡するのに有用であり、又は対応する非コンジュゲートＤｓＮＡ剤と比較してＤｓＮＡ剤誘導体の安定性が改善される。本発明のｄｓＮＡは、ＧａｌＮＡｃ、葉酸塩、コレステロール、マンノース−６−リン酸にコンジュゲートされる。一実施形態において、本発明の単一のｄｓＮＡは、２つ以上のＧａｌＮＡｃ分子及び２つ以上の葉酸塩分子及び２つ以上のコレステロール分子及び２つ以上のマンノース−６−リン酸分子又は全ての任意の組み合わせを含む。
ＧａｌＮＡｃリガンドは、ヌクレオシド単量体の核酸塩基（即ち実施例６に示されるとおりチミジンのＣ５位置）に付加し得るのみならず、リンカーで２’−ＯＨ（又は３’−ＯＨ）を介してリボース糖にもまた付加し得る。コンジュゲーション部位としての２’−ＯＨは、テトラループＤｓｉＲＮＡの場合に特に有用であり、なぜならループの４つのヌクレオチドの２’−ＯＨは溶媒に露出し、その結晶構造に基づいた安定したループの形成に必要な水素結合及び塩基スタッキングに関与しないためである。
様々なリンカーを使用してリガンドを本発明のｄｓＮＡ剤にコンジュゲートし得る。当該技術分野で広く用いられているリンカーを使用してリガンドをｄｓＮＡ分子にコンジュゲートすることができ、それらのリンカーの幾つかを表４及び表５に例示する。リガンドとｄｓＮＡ分子とのコンジュゲーションには、これらのリンカーのいずれを用いてもよい。
詳細には、アセタールリンカーを使用したｄｓＮＡ剤が、クリックリンカーに匹敵するインビトロ細胞及びインビボ標的化及びノックダウン効力を実証した。リンカーを２’−ＯＨに導入するために用いられるアセタール化学は、従来のアルキル化条件と比較してはるかに穏やかである；従って、２’位への選択的なコンジュゲーションが可能となる。これにより、時間のかかる２’及び３’異性体の混合物の分離をしなくて済み、収率が大幅に改善される。
ＲＮＡｉインビトロアッセイによるＤｓｉＲＮＡ活性の評価
任意選択で、無細胞系においてＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを用いてｄｓＮＡコンストラクトを評価することができる。例えば、かかるアッセイは、標的ＲＮＡに対するｄｓＮＡ剤での使用に適合させた、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記載されるシステム、及びＴｕｒｂｏ Ｄｉｃｅｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を含めた市販のキットを含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を使用して、インビトロでＲＮＡｉ活性を再構成する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた適切なプラスミドからのインビトロ転写によるか、又は化学合成によって作成する。緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムなど）中において９０℃で１分間、続いて３７℃で１時間インキュベートすることにより、センス及びアンチセンスｄｓＮＡ鎖（例えば各２０ｕＭ）をアニールし、次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ７．４の３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）に希釈する。アニーリングは、ＴＢＥ緩衝液中アガロースゲル上でゲル電気泳動し、臭化エチジウムで染色することによってモニタし得る。絨毛膜を除去して溶解させた、発酵糖蜜寒天に収集したＯｒｅｇｏｎ Ｒハエの受精後０〜２時間の胚を使用して、ショウジョウバエのライセートを調製する。このライセートを遠心し、上清を単離する。アッセイは、５０％ライセート［ｖｏｌ／ｖｏｌ］とＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度）とｄｓＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含有する１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液とを含有する反応混合物を含む。この反応混合物はまた、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び１００ｕＭの各アミノ酸も含有する。酢酸カリウムの最終濃度は１００ｍＭに調整する。この反応物を氷上で予めアセンブルし、２５℃で１０分間プレインキュベートした後、ＲＮＡを加え、次に２５℃で更に６０分間インキュベートする。４容積の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応をクエンチする。標的ＲＮＡ切断をＲＴ−ＰＣＲ解析又は当該技術分野において公知の他の方法によってアッセイし、反応からＤｓｉＲＮＡが省かれている対照反応物と比較する。
或いは、内部標識したアッセイ用標的ＲＮＡを［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でのインビトロ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに通し、更なる精製なしに標的ＲＮＡとして使用する。任意選択で、標的ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して５’−３２Ｐ末端標識される。上記に記載したとおりアッセイを実施し、標的ＲＮＡ及びＲＮＡｉによって生じた特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフ上に可視化する。インタクトな対照ＲＮＡ又はｄｓＮＡのない対照反応からのＲＮＡ及びアッセイによって生じた切断産物に相当するバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量化により、切断率を決定する。
本発明の二本鎖核酸分子（ｄｓＮＡ）組成物がタンパク質合成を阻害する能力は、当該技術分野において公知の技法を用いて、例えば、遺伝子転写又はタンパク質合成の阻害を検出することにより、計測することができる。標的ＲＮＡのレベル又は活性は、当該技術分野において現在公知の、又は今後開発される任意の好適な方法によって決定することができる。標的ＲＮＡ及び／又は標的ＲＮＡの発現の計測に用いられる方法が、標的ＲＮＡの性質に依存するであろうことは理解され得る。例えば、標的ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、用語「発現」は、標的ＲＮＡに由来するタンパク質又はＲＮＡ／転写物を指し得る。そのような場合、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに対応するＲＮＡの量を計測することによるか、又は当該タンパク質の量を計測することによって決定し得る。タンパク質は、染色法若しくは免疫ブロット法によるか、又はタンパク質が計測可能な反応を触媒する場合には反応速度を計測することによるなど、タンパク質アッセイで計測することができる。かかる方法はいずれも当該技術分野において公知であり、用いることができる。標的ＲＮＡレベルを計測する場合、ＲＮＡレベルの検出に当該技術分野で認められている任意の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法等）を用いることができる。本発明のｄｓＮＡ剤でウイルスＲＮＡを標的化する際にはまた、対象、組織、インビトロ或いはインビボでの細胞、又は細胞抽出物における標的ウイルスレベルの低減におけるｄｓＮＡ剤の有効性の計測もまた、標的ウイルスＲＮＡレベルの低減の程度の決定に用い得ることも予想される。細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物又は任意の他の好適な供給源材料に対し、上記の計測のいずれを行うこともできる。
ヌクレアーゼ耐性アッセイ
ｄｓＮＡ分子のヌクレアーゼ耐性は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７２ｍＭ ＣａＣｌ、及び１４ｍＭ ＭｇＣｌ２の緩衝液、最終容積５０μｌ中５×１０−３単位／ｍｌのヘビ毒ホスホジエステラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して、０．１μＭオリゴヌクレオチドでアッセイする。Ｂａｌ３１ヌクレアーゼアッセイについては、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液（最終容積＝１００μｌ）中２×１０−３単位／ｍｌ Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、０．１μＭオリゴヌクレオチドでｄｓＮＡ分子のヌクレアーゼ安定性をアッセイする。いずれのヌクレアーゼアッセイについても、指示された時点で５μｌ反応アリコートを取り出し、ブロムフェノールブルー及びキシレンシアノールゲル追跡用色素を含有する等容積の８０％ホルムアミドに添加し、次に９５℃で２分間加熱する。次にアリコートを変性ポリアクリルアミド電気泳動法による分析まで−２０℃で保管する。定量化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で実施する。同じプロトコルをリソソーム抽出物及びエンドソーム抽出物で繰り返して、リソソーム環境に対するｄｓＮＡ分子のヌクレアーゼ耐性を模擬することができる。
細胞取り込みアッセイ
細胞取り込み実験は、Ｔｓ’ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ−Ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ，ＹＥＥ（ａｈ−Ｇａ１ＮＡｃ）ｓ ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９５，６，６９５−７０１に記載されるプロトコルに従い実施した。
核酸、ベクター、及び宿主細胞の導入方法
本発明のＤｓＮＡ剤は、細胞へと直接（即ち細胞内に）導入されてもよく；又は細胞外の空洞、間質腔の中、生物の循環中に導入されても、経口的に導入されてもよく、若しくは核酸を含有する溶液浴に細胞又は生物を入れることによって導入されてもよい。血管循環又は血管外循環、血液又はリンパ系、及び脳脊髄液は、核酸を導入し得る部位である。
本発明のＤｓＮＡ剤は、核酸を含有する溶液の注入、核酸によって被覆された粒子のボンバードメント、核酸の溶液中への細胞又は生物の浸漬、又は核酸の存在下における細胞膜の電気穿孔を含め、当該技術分野において公知の核酸送達方法を用いて導入することができる。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなど、核酸を細胞に導入するための当該技術分野において公知の他の方法を用いてもよい。核酸は、以下の活性、即ち細胞による核酸取り込みの向上又は他の形での標的ＲＮＡの阻害増加の１つ以上を果たす他の成分と共に導入し得る。
標的ＲＮＡを有する細胞は、生殖細胞系列又は体細胞、全能性又は多能性細胞、分裂又は非分裂細胞、実質又は上皮細胞、不死化又は形質転換細胞などであり得る。細胞は幹細胞又は分化細胞であってもよい。分化している細胞型としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血球細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞が挙げられる。
詳細な標的ＲＮＡ配列及び送達されるＤｓＮＡ剤材料の用量に応じて、この過程は標的ＲＮＡの部分的又は完全な機能喪失をもたらし得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％又はそれ以上におけるＲＮＡレベル又は発現（ＲＮＡ発現又はコードされたポリペプチド発現のいずれも）の低下又は損失が、典型的である。標的ＲＮＡレベル又は発現の阻害とは、ＲＮＡ又はＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルが存在しないこと（又はその観察可能な低下）を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子に対する効果を示すことなく標的ＲＮＡを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞又は生物の外面的な特性（以下で例に示すとおり）を調べることによるか、又はＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）などの生化学的技法によって確認することができる。本発明のＤｓＮＡ剤による１つ又は複数の標的ＲＮＡ配列の阻害はまた、癌治療についての腫瘍サイズ、ウイルス感染症についてのウイルス負荷／力価など、計測可能な表現型に対するかかるＤｓＮＡ剤の投与効果に基づきインビボ又はインビトロのいずれかで計測することもできる。ウイルス感染症に関しては、ウイルス負荷又は力価の低下には、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％又はそれ以上の低下が含まれてもよく、多くの場合に対数単位で計測され、例えば、本発明のＤｓＮＡ剤を細胞、組織、又は対象に投与することによって、ウイルス負荷又は力価の１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍の低下が実現し得る。
細胞株又は全生物におけるＲＮＡ媒介阻害に関しては、タンパク質産物のアッセイが容易なレポーター又は薬剤耐性遺伝子の発現を計測することができる。かかるレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択可能なマーカーが利用可能である。アッセイによっては、遺伝子発現量の定量化により、本発明による処理のない細胞と比較したとき１０％、３３％、５０％、９０％、９５％又は９９％より高い阻害程度を決定することが可能となる。
注入材料の用量が低く、及びＲＮＡサイレンシング剤投与後の時間が長いほど、阻害される細胞の割合が低くなり得る（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、又は９５％）。細胞における遺伝子発現の定量化は、標的ＲＮＡの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳レベルで同程度の阻害量を示し得る。例として、阻害効率は、細胞における遺伝子産物の量を評価することにより決定してもよく；阻害性ＤｓＮＡに用いられる領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブでＲＮＡを検出してもよく、又は当該領域のポリペプチド配列に対して産生される抗体で翻訳後のポリペプチドを検出してもよい。
ＤｓＮＡ剤は、細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量を導入し得る。材料の用量が高いほど（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）、より有効な阻害が生じ得る；また、特定の適用には、低い用量が有用となることもある。
ＲＮＡ干渉に基づく療法
周知のとおり、ＲＮＡｉ法は、多種多様な生物の多種多様な遺伝子に適用可能であり、これらのコンテクストの各々で本開示の組成物及び方法を利用することができる。本開示の組成物及び方法によって標的化し得る遺伝子の例としては、細胞にとって天然である遺伝子である内因性遺伝子又は細胞にとって通常天然でない遺伝子が挙げられる。限定なしに、これらの遺伝子には、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、血管新生を誘導する分子を発現する遺伝子、接着分子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼの遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞周期調節遺伝子、ＥＧＦ及びＥＧＦ受容体を発現する遺伝子、ＭＤＲ１遺伝子などの多剤耐性遺伝子が含まれる。
より具体的には、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞タンパク質（例えば、核タンパク質、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、又は膜結合タンパク質）のアミノ酸配列を指定し得る。別の実施形態において、本発明の標的ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質又は分泌タンパク質）のアミノ酸配列を指定し得る。本明細書で使用されるとき、タンパク質の「アミノ酸配列を指定する」という語句は、ｍＲＮＡ配列が遺伝子コードの規則に従いアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。例示を目的として、以下のタンパク質クラスを列挙する：発生タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害薬、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｐａｘファミリーメンバー、ウィングドヘリックスファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカイン及びこれらの受容体、成長／分化因子及びこれらの受容体、神経伝達物質及びこれらの受容体）；癌遺伝子によってコードされるタンパク質（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ Ｉ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）；腫瘍抑制因子タンパク質（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ Ｉ、ＮＦ２、ＲＢ Ｉ、ＴＰ５３、及びＷＴＩ）；及び酵素（例えば、ＡＣＣシンターゼ及びオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ（ｄｅｘｔｒｉｉｎａｓｅ）、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプン合成酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ（ｈｅｒｎｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節物質合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ）。
一態様において、本発明の標的ｍＲＮＡ分子は、病理学的状態に関連するタンパク質のアミノ酸配列を指定する。例えば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（例えば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝染、又は感染の維持に関与するウイルスタンパク質）、或いは宿主への病原体の侵入、病原体若しくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製若しくは組み込み、宿主における感染の確立若しくは伝播、又は次世代の病原体の集合を促進する宿主タンパク質であり得る。病原体としては、ＲＮＡウイルス、例えば、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レトロウイルス、例えばレンチウイルス、又はＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ヘパドナウイルスなどが挙げられる。更なる病原体としては、細菌類、真菌類、蠕虫類、住血吸虫及びトリパノソーマ類が挙げられる。他の種類の病原体としては、哺乳類転移因子を挙げることができる。或いは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質又は自己免疫疾患関連タンパク質であり得る。
標的遺伝子は任意の生物に由来し、又はそれに含まれてもよい。生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルス又は真菌であり得る。例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
ｄｓＮＡ分子の安定性プロファイル、薬物動態（ｐｈａｒａｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）、細胞標的化能力及び体内分布特性は、限定はされないが、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｃｈｉｕ ＭＨ，Ｔａｍｕｒａ Ｔ，Ｗａｄｈｗａ ＭＳ，Ｒｉｃｅ ＫＧ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９４ Ｊｕｎ １０；２６９（２３）：１６１９５−２０２）によって教示されるプロトコルに基づく方法を含めた、当該技術分野において公知の好適な方法によって評価される。１２５Ｉ（ヨウ化ナトリウム）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０、クロラミンＴ、メタ重亜硫酸ナトリウム、ヘパリン、ＢＳＡ、ＨＥＰＥＳ、コラゲナーゼ、塩酸ケタミン、キシラジン塩酸塩（ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ）及びＩＣＲマウスは、商業的供給業者から入手される。
ｄｓＮＡ分子の放射標識
ＧａｌＮａｃ、コレステロール、葉酸塩又はマンノース−６−リン酸などのリガンドにコンジュゲートした本発明のｄｓＮＡ分子を、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．によって記載される手順を用いて１２５Ｉで標識する。放射性ヨウ素化ｄｓＮＡをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０カラム（０．８×２５ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）で溶出し、０．５ｍｌ画分に収集する。例えばＧａｌＮＡｃリガンドを含む各ヨウ素化ｄｓＮＡの純度を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートの原点に１μｌ（２ｎＣｉ）をスポッティングすることによって分析し、各ｄｓＮＡに最適化した比の酢酸エチル：酢酸：ピリジン：水で展開する。室温にて１２時間オートラジオグラフィーで露光した後、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で定量的デンシトメトリーを実施する。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用してデンシトメトリートレースを積分し、各ヨウ素化オリゴヌクレオチドについて＞９５％純度を確立する。
ｄｓＮＡ分子のインビトロ安定性アッセイ
各放射性ヨウ素化オリゴ糖（１．５μｌ、７５ｎＣｉ）を１００μｌのヘパリン添加全マウス血液に添加し、３７℃でインキュベートする。１０、２０、及び３０分及び１、２、３、４、５、及び６時間でタイムポイント（１０μｌ）を取り出し、上記に記載したとおりＴＬＣ及び定量的オートラジオグラフィーを用いて分析する。
薬物動態分析
３〜４匹のマウスでｄｓＮＡの薬物動態を実施する。マウスを麻酔し、デュアル頸静脈カニューレ挿入を実施する。ＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡを左静脈に投与する一方、１、３、６、１０、１５、２０、３０、４０、及び６０分で右静脈から血液タイムポイントを取る。ダイレクトγ−カウントによって経時的血液タイムポイントを分析し、その後、６０μｌの水及び２００μｌのアセトニトリルを添加することにより、血液からｄｓＮＡを抽出する。１０分間（１３，０００×ｇ）の遠心によってタンパク質を沈殿させて、
式１．Ｃｂ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ
及び５０μｌの８０ｖ／ｖ％アセトニトリルでペレットを２回洗浄すると、８０％の放射能の回復が得られる。抽出物を合わせ、Ｃｅｎｔｒａ−Ｖａｐにおいて減圧下で蒸発乾固させ、３μｌの水中に再構成する。１μｌをＴＬＣプレートにスポッティングし、次にそれを展開して上記に記載したとおりオートラジオグラフィーにかけることにより、各タイムポイントを分析する。各オリゴ糖のトリプリケートデータセットの時間に対するダイレクト血液カウントから薬物動態パラメータを導き出し、次に平均して、平均値及び標準偏差を求める。ＰＣＮＯＮＬＩＮ（ＳＣＩ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）で積分式１によって記述される２コンパートメントオープンモデルを用いて、個々のデータセットの繰り返し非線形最小二乗法フィットを達成する。
Ｃｂは、オリゴ糖の血中濃度である。Ａ及びＢは定数であり、α及びβは、血漿濃度対時間プロファイルにおける急速減衰相及び緩速減衰相の傾きを特徴付ける混成一次速度定数である。平均滞留時間（ＭＲＴ）は、式２に従い計算される：
平均滞留時間（ＭＲＴ）は、オリゴ糖がマウス体内にあった平均時間である（Ｒｉｅｇｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．ＢｉｏＰｈａｒｍ．８，５０９−５３４，１９８０）。全身クリアランス（Ｃｌｔｂ）は式３を用いて計算され、定常状態時の分布容積（Ｖｄｓｓ）は式４に従い計算される（Ｂｅｎｅｔ ａｎｄ Ｇａｌｅａｚｚｉ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，６８，１０７１−１０７４，１９７９）。
式４ Ｖｄｓｓ＝ＣＬｔｂ＊ＭＲＴ
全身オートラジオグラフィー
本発明のｄｓＮＡの標的化及び／又は体内分布は、以下に記載される方法を含めた、当該技術分野において公知の好適な方法によって決定される。
塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及び塩酸キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔する。右頸静脈にシングルシラスティックカテーテルを挿入し、ＧａｌＮＡｃリガンドを有する放射性標識ｄｓＮＡ（０μｌ、７μＣｉ、生理食塩水中）の静脈内ボーラス用量を投与し、その後、カテーテルを取り外し、静脈を結紮する。３０分後、フェノバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）の致死注射によってマウスを安楽死させる。犠牲後直ちに、マウスをヘキサンドライアイス浴（−７０℃）に５分間浸し、４％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースブロックにマウントし、次にそれを−２０℃に冷却する。−１５℃の温度でクライオミクロトーム（ＬＫＢ ２２５０、スウェーデン）でマウスの正中線に近接して２５μｍの縦断切片を切り出す。これらの切片を粘着テープ（Ｓｃｏｔｃｈ ８１０，３Ｍ Ｃｏ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で収集し、−１５℃で２４時間脱水し、次にＰｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒを用いてオートラジオグラフィーに４８時間かける。
ｄｓＮＡの体内分布アッセイ
上記に記載したとおりマウスを麻酔し、続いてシングルカニューレを右頸静脈に挿入する。ｄｓＮＡ（１５μｌ、２μＣｉ、生理食塩水中）を静脈内投与し、３０分間体内分布させた後、頸椎脱臼によってマウスを犠牲にする。主要な器官（肝臓、肺、脾臓、胃、腎臓、心臓、大腸、及び小腸）を採取し、生理食塩水でリンスし、ダイレクトγカウントによって全放射能を計測した。放射能レベルが分布範囲の指標となり、ｄｓＮＡ分子が高濃度化している組織はどれかを決定することが可能になる。
細胞標的化及び送達
上記に記載するアッセイに基づく最適体内分布時間を選択し、ｄｓＮＡ分子の注入を分析する。全身オートラジオグラフィー分析では、全ての組織をスクリーニングして主要な体内分布部位を同定することが可能である。解剖した組織のダイレクトγカウントを用いて全身オートラジオグラフィーによる観察結果を確認する。定量的体内分布解析を用いて、ＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡ分子の肝臓標的化効率を決定する。肝非実質細胞と肝実質細胞との放射線量比から、ｄｓＮＡの細胞標的化が確立される。
結合親和性アッセイ：
結合親和性は、当該技術分野で十分に確立された幾つかの方法によって計測される。結合親和性の計測方法の一つは、実施例２０に示されるとおりの蛍光偏光による。同様に用いられる別の方法は、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｏｔｅｎｃｙ １０−ｆｏｌｄ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊｕｌ；４２（１３）：８７９６−８０７．）によって教示されている。
マウス初代肝細胞（１００ｎｍｏｌ ＡＧＰ）における競合アッセイ用のα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）の脱シアル化及び１２５Ｉ標識を、１Ｕノイラミニダーゼアガロースを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中３７℃で１６時間インキュベートする。シアル酸アッセイ又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のいずれかによって脱シアル化を確認する。一塩化ヨウ素を用いたヨウ素化を、Ａｔｓｍａ ｅｔ ａｌ（Ａｔｓｍａ Ｄ．Ｅ．，Ｋｅｍｐｅｎ Ｈ．Ｊ．，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ Ｗ．，ｖａｎ‘ｔ Ｈｏｏｆｔ ，Ｆ．Ｍ．，Ｐａｕｗｅｌｓ Ｅ．Ｋ．，Ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ａｎｄ ｆｒｏｚｅｎ ｐｌａｓｍａ ａｆｔｅｒ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｂｙ ｓｅｖｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１；３２：１７３−１８１）によって記載されるとおり達成する。１ミリリットルの脱シアル化α１−酸性糖タンパク質（ｄｅ−ＡＧＰ、１ｍｇ／ｍｌ）及び０．２５Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１０）中の１Ｍグリシン０．２ｍｌを、０．２５Ｍ ＮａＯＨ（２５μｌ／ｍｇタンパク質）中１０ｍＭ塩化ヨウ素溶液（７μｌ／ｍｇタンパク質）、Ｎａ１２５Ｉ（２．５μｌ／ｍｇタンパク質）及び１Ｍグリシンの混合物に添加する。室温で１０分間インキュベートした後、３ｋＤａ ＭＷＣＯスピンカラムを使用して混合物を２回濃縮することにより、１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰを遊離１２５Ｉと分離する。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＥＣ−３カラム（７．８×３００ｍｍ）及びβ−ＲＡＭカウンターを備えたＨＰＬＣシステムで標識効率及び純度に関してタンパク質を試験する。
１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及びＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡを利用した競合実験を以下のとおり実施する−単離したばかりのマウス肝細胞（１０６細胞／ｍｌ）を６ウェルプレートの２ｍｌの適切な成長培地中にプレーティングする。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１×非必須アミノ酸及び１×ピルビン酸ナトリウムを含有するウィリアム培地で初代肝細胞を培養する。細胞を３７℃、それぞれ５％及び１０％ＣＯ２で１６〜２０時間インキュベートする。次に、実験に先立ち細胞をＦＢＳ不含培地で洗浄する。細胞を、２％ＦＢＳ、１０−８Ｍ １２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及び１０−１１〜１０−５Ｍの範囲の濃度のＧａｌＮＡｃ含有ｄｓＮＡを含む適切な成長培地を含有する１ｍｌ競合混合物と共に３７℃で３０分間インキュベートする。１０−２Ｍ ＧａｌＮＡｃ糖の存在下で非特異的結合を決定する。細胞をＦＢＳ不含培地で２回洗浄して未結合の１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及び競合ＧａｌＮＡｃ−ｄｓＮＡを除去する。１％β−メルカプトエタノールを含有するＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液を使用して細胞を溶解する。ライセートを短い１０分間凍結融解サイクル後に丸底アッセイチューブに移し、γ−カウンターでアッセイする。非特異的結合を減じた後、１２５Ｉタンパク質カウントを最も低いＧａｌＮＡｃ−ｄｓＮＡ濃度カウントの値で除す。非線形回帰アルゴリズムを用いてシングルサイト競合結合式に従い阻害曲線をフィッティングする。
免疫原性アッセイ
合成ｓｉＲＮＡ二重鎖は、哺乳動物における全身投与後及び初代ヒト血液細胞培養物において高レベルの炎症性サイトカイン及びＩ型インターフェロン、詳細にはインターフェロン−αを誘導することができる。免疫原性レベルは、上記に記載したとおり種々の濃度の目的のｄｓＮＡ分子の投与前及び投与後にインターフェロン−αの量を計測することによって決定される。合成ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、陽性対照としてのＰＢＭＣにおける免疫応答を誘発する。２４時間のインキュベーション後、培養上清を収集し、供給業者の指示に従いサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＩＮＦ−αをアッセイする。
医薬組成物
特定の実施形態において、本発明は、本発明のＤｓＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＮＡ剤試料は、好適に製剤化して、遺伝子サイレンシングが起こるべきである場合にそれを誘導するのに十分な分量の試料を細胞に入らせることが可能な任意の手段によって細胞の環境中に導入することができる。ｄｓＮＡの多くの製剤が当該技術分野において公知であり、ｄｓＮＡが作用できるように標的細胞に入り込める限り、使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号明細書及び同第２００５／００５４５９８ Ａ１号明細書を参照のこと。例えば、本発明のＤｓＮＡ剤は、リン酸緩衝生理食塩水溶液などの緩衝溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドに製剤化することができる。カチオン性脂質を用いたＤｓＮＡ剤の製剤を使用すると、細胞へのＤｓＮＡ剤のトランスフェクションを促進することができる。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン分子（国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）を使用することができる。好適な脂質としては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、又はＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられ、これらは全て、製造者の指示に従い使用することができる。
かかる組成物は、典型的には核酸分子と薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」には、医薬品投与に適合した、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。補助活性化合物もまた、組成物に配合することができる。
医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用に用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張化剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数用量バイアルに封入することができる。
注射用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調合用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、易注射針通過性が存在する程度に流動性があるべきである。組成物は製造及び保管条件下で安定しているべきであり、細菌類及び真菌類などの微生物の汚染作用を防ぐものでなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）など）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、及び塩化ナトリウムなど、糖類、多価アルコール類を組成物に含めることが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めると、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に挙げた一つの成分又は成分の組み合わせと共に、所要量の活性化合物を配合し、続いて滅菌ろ過することによって調製し得る。概して、分散液は、塩基性分散媒及び上記に挙げたものからの必要な他の成分を含有する無菌媒体中に活性化合物を配合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥によって活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過したその溶液から生じさせることである。
経口組成物は、概して不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口治療薬投与の目的では、活性化合物は賦形剤と共に配合して、錠剤、トローチ、又はカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤としての使用向けの液体担体を用いて調製することもできる。組成物の一部として、薬剤適合性を有する結合剤、及び／又はアジュバント材料が含まれてもよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、又は同様の性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料などの香味剤。
吸入による投与については、化合物は、好適な噴射剤を含む加圧容器又はディスペンサー（例えば二酸化炭素などの気体、又はネブライザー）からのエアロゾルスプレーの形態で送達される。かかる方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されるものが含まれる。
全身投与はまた、経粘膜的又は経皮的手段によってもよい。経粘膜又は経皮投与については、透過させようとする関門に対する適切な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は当該技術分野において概して公知であり、例えば経粘膜投与には、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー又は坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与については、活性化合物は、当該技術分野において概して公知のとおり、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、又はクリームとして製剤化される。
化合物はまた、直腸送達用に坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリド類などの従来の坐薬基剤と共に）又は停留浣腸の形態で調製することもできる。
化合物はまた、限定はされないが、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学的トランスフェクション）；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス媒介送達）；ｏｒ Ｐｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ ａｔ Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）に記載される方法を含めた、当該技術分野において公知の方法を用いたトランスフェクション又は感染によって投与することもできる。
化合物はまた、ＤＮＡワクチンなど、核酸剤の投与に好適な任意の方法によって投与することもできる。これらの方法としては、遺伝子銃、バイオインジェクター、及び皮膚パッチ並びに無針法、例えば、米国特許第６，１９４，３８９号明細書に開示されるマイクロパーティクルＤＮＡワクチン技術、及び米国特許第６，１６８，５８７号明細書に開示されるとおりの粉末形態のワクチンによる哺乳類経皮無針ワクチン接種が挙げられる。加えて、特にＨａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０に記載されるとおり、鼻腔内送達が可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書に記載されるとおり）及びマイクロカプセル化もまた用いることができる。生分解性の標的化可能なマイクロパーティクル送達システムもまた用いることができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書に記載されるとおり）。
一実施形態において、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出製剤など、化合物が体内から急速に排出されることを防ぎ得る担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、及びポリ乳酸など、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤は、標準的な技法を用いて調製することができる。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるとおりの、当業者に公知の方法によって調製することができる。
かかる化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈する化合物が用いられてもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するため、かかる化合物を罹患組織部位に標的化する送達システムを設計するよう注意しなければならない。
ヒトでの使用に向けた様々な範囲の投与量の製剤化には、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを使用することができる。かかる化合物の投与量は、好ましくは毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。本発明の方法で用いられる任意の化合物について、治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるとおりのＩＣ５０（即ち、症状の最大半量阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が実現するように用量が製剤化され得る。かかる情報を用いると、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって計測し得る。
本明細書に定義するとおり、核酸分子の治療有効量（即ち、有効投与量）は、選択の核酸に依存する。例えば、ＤｓＮＡ剤をコードするプラスミドが選択される場合、約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単回投与量が投与されてもよく；一部の実施形態では、１０、３０、１００、又は１０００ｐｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００ｎｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００μｇ、又は１０、３０、１００、又は１０００ｍｇが投与されてもよい。一部の実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与することができる。組成物は１日１回以上〜週１回以上（隔日１回を含む）投与することができる。当業者は、対象を有効に治療するのに必要な投与量及びタイミングには、限定はされないが、疾患又は障害の重症度、前治療、対象の全般的な健康及び／又は年齢、及び他の既存疾患を含めた特定の要因が影響し得ることを理解するであろう。更に、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、又は抗体による対象の治療は単回治療を含んでもよく、又は好ましくは、一連の治療を含んでもよい。
ＤｓＮＡ剤を細胞の環境中に導入する方法は、細胞のタイプ及びその環境の構成に依存し得ることが理解され得る。例えば、細胞が液体中に見られるとき、一つの好ましい製剤は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ中など、脂質製剤を伴うものであり、ＤｓＮＡ剤を細胞の液体環境に直接加えることができる。脂質製剤はまた、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射によるか、或いは経口的に又は吸入若しくは当該技術分野において公知のとおりの他の方法によるなどして動物に投与することもできる。製剤が哺乳動物及びより具体的にはヒトなどの動物への投与に好適である場合、製剤はまた、薬学的に許容可能でもある。オリゴヌクレオチドの投与用の薬学的に許容可能な製剤は公知であり、使用することができる。場合によっては、ＤｓＮＡ剤を緩衝液又は生理食塩水中に製剤化して、卵母細胞を用いた研究の場合のように、その製剤化されたＤｓＮＡ剤を細胞に直接注入することが好ましいこともある。ＤｓＮＡ剤二重鎖の直接注入もまた行われ得る。ｄｓＮＡ（例えばＤｓＮＡ剤）を導入する好適な方法については、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号明細書を参照されたい。
好適な量のＤｓＮＡ剤が導入されなければならず、これらの量は標準方法を用いて実験的に決定することができる。典型的には、細胞の環境内における個々のＤｓＮＡ剤種の有効濃度は約５０ナノモル濃度以下、１０ナノモル濃度以下であり、又は約１ナノモル濃度以下の濃度の組成物を使用することができる。別の実施形態では、多くの状況で、約２００ピコモル濃度以下、更には約５０ピコモル濃度以下、約２０ピコモル濃度以下、約１０ピコモル濃度以下、又は約５ピコモル濃度以下の濃度を利用する方法を用いることができる。
本方法は、細胞が生存できる任意の細胞外マトリックスにＤｓＮＡ剤組成物を加えて実施することができ、但し、ＤｓＮＡ剤組成物は、その効果を及ぼすのに十分な量のＤｓＮＡ剤が細胞に侵入し得るように製剤化されるものとする。例えば、本方法は、液体培養培地又は細胞成長培地などの液体中、組織外植片、又は哺乳動物及び特にヒトなどの動物を含めた全生物に存在する細胞での使用に適している。
標的ＲＮＡのレベル又は活性は、当該技術分野において現在公知の、又は今後開発される任意の好適な方法によって決定することができる。標的ＲＮＡ及び／又は標的ＲＮＡの発現の計測に用いられる方法が、標的ＲＮＡの性質に依存するであろうことは理解され得る。例えば、標的ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、用語「発現」は、標的ＲＮＡに由来するタンパク質又はＲＮＡ／転写物を指し得る。そのような場合、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに対応するＲＮＡの量を計測することによるか、又は当該タンパク質の量を計測することによって決定し得る。タンパク質は、染色法若しくは免疫ブロット法によるか、又はタンパク質が計測可能な反応を触媒する場合には反応速度を計測することによるなど、タンパク質アッセイで計測することができる。かかる方法はいずれも当該技術分野において公知であり、用いることができる。標的ＲＮＡレベルを計測する場合、ＲＮＡレベルの検出に当該技術分野で認められている任意の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法等）を用いることができる。本発明のｄｓＮＡ剤でウイルスＲＮＡを標的化する際にはまた、対象、組織、インビトロ或いはインビボでの細胞、又は細胞抽出物における標的ウイルスレベルの低減におけるＤｓＮＡ剤の有効性の計測もまた、標的ウイルスＲＮＡレベルの低減の程度の決定に用い得ることも予想される。細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物又は任意の他の好適な供給源材料に対し、上記の計測のいずれを行うこともできる。
標的ＲＮＡの発現が低下しているかどうかの決定は、ＲＮＡレベルの変化を確実に検出し得る任意の好適な方法によることができる。典型的には、この決定は、未消化ＤｓＮＡを細胞の環境へと、当該のＤｓＮＡ剤の少なくとも一部分が細胞質に侵入するように導入し、次に標的ＲＮＡレベルを計測することにより行われる。同一の未処理細胞で同じ計測を行い、各計測から得られた結果を比較する。
ＤｓＮＡ剤は、薬理学的有効量のＤｓＮＡ剤と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物として製剤化することができる。薬理学的又は治療的有効量とは、意図した薬理学的、治療的又は予防的結果を生じさせるのに有効なＤｓＮＡ剤の量を指す。語句「薬理学的有効量」及び「治療的有効量」又は単に「有効量」は、意図した薬理学的、治療的又は予防的結果を生じさせるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患又は障害に関連する計測可能なパラメータの少なくとも２０％の低下があるときに所与の臨床治療が有効であると見なされる場合、当該の疾患又は障害の治療に対する薬物の治療有効量は、当該パラメータの少なくとも２０％の低下を生じさせるのに必要な量である。
本発明の好適に製剤化された医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、腟内及び局所（頬側及び舌下を含む）投与を含め、非経口経路によるなど、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与することができる。一部の実施形態において、医薬組成物は静脈内又は非経口部位内（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）注入又は注射によって投与される。
一般に、ｄｓＮＡの好適な投与量単位は、レシピエントの体重１キログラム当たり１日０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、又は体重１キログラム当たり１日０．０１〜２０マイクログラムの範囲、又は体重１キログラム当たり１日０．０１〜１０マイクログラムの範囲、又は体重１キログラム当たり１日０．１０〜５マイクログラムの範囲、又は体重１キログラム当たり１日０．１〜２．５マイクログラムの範囲となり得る。ｄｓＮＡを含む医薬組成物は、１日１回投与することができる。しかしながら、この治療剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される２、３、４、５、６回又はそれ以上の部分用量を含む投与量単位で投与されてもよい。その場合、各部分用量に含まれるｄｓＮＡは、１日の総投与量単位を達成するため対応して少なくなければならない。投与量単位はまた、例えば、数日の期間にわたってｄｓＮＡの持続的で一貫した放出をもたらす従来の徐放製剤を使用して、数日間にわたる単回投与用に配合することもできる。徐放製剤は当該技術分野において周知である。この実施形態において、投与量単位は、対応して１日用量を複数分含有する。製剤に関わらず、本医薬組成物は、治療下の動物又はヒトにおける標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な分量のｄｓＮＡを含有しなければならない。本組成物は、複数のｄｓＮＡ単位の合計が一緒になって十分な用量を含有するような方法で配合することができる。
細胞培養アッセイ及び動物試験からデータを得て、ヒトに好適な投与量範囲を製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０（公知の方法によって決定されるとおり）を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。本発明の方法で用いられる任意の化合物について、治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるとおりのＩＣ５０（即ち、症状の最大半量阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲が実現するように用量が製剤化され得る。かかる情報を用いると、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中ｄｓＮＡレベルは、標準方法、例えば高速液体クロマトグラフィーによって計測し得る。
医薬組成物は、投与指示書と共にキット、容器、パック、又はディスペンサーに含まれ得る。
治療方法
本発明は、全体又は一部において、標的ＲＮＡの発現及び／又はかかる標的ＲＮＡの存在（例えば、ウイルス感染、ウイルスゲノム、カプシド、宿主細胞成分の標的ＲＮＡの存在等との関連で）によって引き起こされる疾患又は障害のリスクがある（又はそれに罹り易い）対象を治療する予防的及び療法的方法の両方を提供する。
「治療」、又は「治療する」は、本明細書で使用されるとき、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患に罹り易い素因を治癒し、治し、改善し、軽減し、変化させ、修復し、回復させ、向上させ又はそれに影響を与える目的で、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状又は疾患若しくは障害に罹り易い素因を有する患者に治療剤（例えば、ＤｓＮＡ剤又はそれをコードするベクター若しくはトランス遺伝子）を適用又は投与すること、或いは患者由来の単離組織又は細胞株に治療剤を適用又は投与することとして定義される。
一態様において、本発明は、治療剤（例えば、ＤｓＮＡ剤又はそれをコードするベクター若しくはトランス遺伝子）を対象に投与することにより、上記に記載したとおりの疾患又は障害を対象において予防する方法を提供する。疾患のリスクがある対象は、例えば、本明細書に記載されるとおりの任意の診断又は予後判定アッセイ又はそれらの組み合わせによって同定することができる。予防的薬剤の投与は、疾患又は障害が予防され、或いはその進行が遅延するように、対象における例えばウイルス粒子の検出前、或いは疾患又は障害に特徴的な症状が現れる前に行われ得る。
本発明の別の態様は、対象を療法的に治療する方法、即ち、疾患又は障害の症状の発生を変化させる方法に関する。これらの方法はインビトロで（例えば、細胞をＤｓＮＡ剤と共に培養することにより）、或いはインビボで（例えば、ＤｓＮＡ剤を対象に投与することにより）、実施することができる。
予防的及び療法的治療方法の両方に関して、かかる治療は、ファーマコゲノミクスの分野から得られる知識に基づき具体的に調整又は改良され得る。「ファーマコゲノミクス」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子配列決定、統計遺伝学、及び遺伝子発現解析などのゲノミクス技術を臨床開発中及び市販の薬物に適用することを指す。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対するその反応を決定するか（例えば、患者の「薬物反応表現型」、又は「薬物反応遺伝子型」）についての研究を指す。従って、本発明の別の態様は、個々の予防的又は療法的治療を本発明の標的ＲＮＡ分子又は標的ＲＮＡモジュレーターのいずれかで当該の個々の薬物反応遺伝子型に従い調整する方法を提供する。ファーマコゲノミクスによれば、臨床医又は医師は、その治療が最も有益となるであろう患者に予防的又は療法的治療を標的化し、毒性薬物関連副作用を被るであろう患者の治療を回避することが可能になる。
治療剤は適切な動物モデルで試験することができる。例えば、本明細書に記載されるとおりのＤｓＮＡ剤（又はそれをコードする発現ベクター又はトランス遺伝子）を動物モデルで使用して、前記薬剤による治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。或いは、治療剤を動物モデルで使用して、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。例えば、薬剤を動物モデルで使用して、かかる薬剤による治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。或いは、薬剤を動物モデルで使用して、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。
本発明の実施には、特に指示されない限り、当該分野の技能の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学の従来技術が用いられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（定期更新を含む）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ．Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照のこと。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を用い得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は説明を目的とするに過ぎず、限定することを意図するものではない。
本発明は以下の実施例を参照して説明され、これらの実施例は例示として提供されるものであり、いかなる形であれ本発明を限定することは意図されない。当該技術分野において周知の標準的な技法又は以下に具体的に記載される技法を利用した。
実施例１ 合成方法
オリゴヌクレオチド合成、インビトロ及びインビボ使用
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）によりＨＰＬＣ精製した。全てのオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ分析による化学的純度及び質量分光分析による完全長鎖純度に基づき品質管理リリースした。使用前に等量の各鎖を混合し、ＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で短時間１００℃に加熱して、次に混合物を室温に放冷することにより、二重鎖ＲＮＡ ＤｓＮＡを調製した。
細胞培養及びＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）に３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。図７、図９、図１２、及び図１３のＲＮＡトランスフェクションについては、０．１ｎＭの最終濃度の指示されるとおりのＤｓＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者の指示に従いＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。簡潔に言えば、各ＤｓＮＡの２．５４、の０．０２０４ストック溶液を４６．５４、のＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１４、のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合した。得られた５０４、混合物を１２ウェルプレートの個々のウェルに加え、室温で２０分間インキュベートしてＤｓＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方で、ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、３６７細胞／μＬの最終濃度で培地中に再懸濁した。最後に、４５０４、の細胞懸濁液を各ウェルに添加し（最終容積５００μＬ）、プレートをインキュベーターに２４時間置いた。
ＲＮＡ単離及び分析、インビトロ
細胞を２ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、３０μＬの最終容積に溶出させた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びランダムヘキサマーを製造者の指示に従い使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡの３０分の１（０．６６μＬ）を、３．３３４、のＨ２Ｏ並びにヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１（受託番号ＮＭ−０００１９４）及びＳＦＲＳ９（受託番号ＮＭ−００３７６９）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブ：
（配列番号１）Ｈｕ ＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５１７ ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧ
（配列番号２）Ｈｕ ＨＰＲＴリバースプライマーＲ５９１ ＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧ
（配列番号３）Ｈｕ ＨＰＲＴプローブＰ５５４ Ｃｙ５−ＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴ−ＩＢＦＱ
（配列番号４）Ｈｕ ＳＦＲＳ９フォワードプライマーＦ５６９ ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴ
（配列番号５）Ｈｕ ＳＦＲＳ９リバースプライマーＲ７１２ ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＡ
（配列番号６）Ｈｕ ＳＦＲＳ９プローブＰ６４４ ＨＥＸ−ＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡ−ＩＢＦＱ
を含有する１４、の３０４混合物と共に、５４、のｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した。
インビボ試料調製及び注入
ＤｓＮＡをＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）で製造者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）に従い製剤化した。簡潔に言えば、マウスのＮ匹／群及び使用するマウスの体重を決定し、次に治療する各マウス群に必要なＤｓＮＡ量を計算した。１０ｍｇ／ｋｇ投与量で２５ｇ／マウスの４匹のマウスに１ｍｌ ＩＶＦ−オリゴが十分であった。１ｍｇ ＤｓＮＡを１ｍｌ Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）に加え、ローテータにて室温で３０分間混合した。１４ｍｌの５％グルコースを使用して製剤化したＩＶＦ−ＤｓＮＡを希釈し、５０ｋＤａ分子量カットオフスピンコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ）にかけた。スピンコンセントレータは、ＩＶＦ−ＤｓＮＡの容積が１ｍｌ未満に減少するまで４０００ｒｐｍ、４℃で約２時間スピンさせた。回収されたＩＶＦ−ＤｓＮＡを５％グルコースで１ｍｌに希釈し、動物注射の準備を整えた。
動物注射及び組織回収
ケタミン／キシラジンをｉ．ｐ．注射することによって動物に外科麻酔をかけた。注射前に各マウスを秤量した。製剤化したＩＶＦ−ＤｓＮＡを１００ｕｌ／１０ｇ体重でｉ．ｖ．注射した。２４時間後、ＣＯ２吸入によってマウスを犠牲にした。分析用の組織を採取し、２ｍｌ ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）が入ったチューブに入れ、室温で３０分間回転させた後、４℃で一晩インキュベートした。続いて使用時まで、組織を−８０℃に保存した。
組織ＲＮＡ調製及び定量化
約５０〜１００ｍｇの組織片をＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）で１ｍｌ ＱＩＡｚｏｌ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）にホモジナイズした。次に製造者のプロトコルに従い全ＲＮＡを単離した。簡潔に言えば、０．２ｍｌクロロホルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＱＩＡｚｏｌ（商標）ライセートに添加し、ボルテックスすることにより激しく混合した。１４，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間スピンした後、水相を収集し、０．５ｍｌのイソプロパノールと混合した。更に１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ＲＮＡペレットを７５％エタノールで１回洗浄し、短時間乾燥させた。単離したＲＮＡを１００μｌ ＲＮアーゼフリー水に再懸濁し、ＲＮｅａｓｙ（商標）全ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＳＶ ９６全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造者のプロトコルに従いクリーンアップに供した。
第１鎖ｃＤＮＡ合成、インビボ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びオリゴｄＴを製造者の指示に従い使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡの４０分の１（０．６６μＬ）を３．３３μＬのＨ２Ｏ並びにマウス遺伝子ＨＰＲＴ−１（受託番号ＮＭ−０１３５５６）及びＫＲＡＳ（受託番号ＮＭ−０２１２８４）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブ：
（配列番号７）Ｍｍ ＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５７６ ＣＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴ
（配列番号８）Ｍｍ ＨＰＲＴリバースプライマーＲ６６４ ＣＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣ
（配列番号９）Ｍｍ ＨＰＲ ｏｂｅ Ｐ６１６ Ｃｙ５−ＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧ−ＩＢＦＱ
（配列番号１０）Ｍｍ ＫＲＡＳ フォワードプライマー Ｆ２７５ ＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣ
（配列番号１１）Ｍｍ ＫＲＡＳ リバースプライマー Ｒ３９０ ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴ
（配列番号１２）Ｍｍ ＫＲＡＳ プローブ Ｐ２９７ ＦＡＭ−ＣＧＡＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴ−ＩＢＦＱ
を含有する１μＬの３μＭ混合物と共に５４、のＩＱ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した。
定量ＲＴ−ＰＣＲ
Ｃ１０００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えたＣＦＸ９６リアルタイムシステムを使用して増幅反応を行った。ＰＣＲ条件は以下であった：９５℃で３分；次にサイクル処理９５℃で１０秒；５５℃で１分を４０サイクル。各試料についてトリプリケートで試験した。ＨＰＲＴ実験については、相対ＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルをＳＦＲＳ９ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、トランスフェクション試薬＋対照ミスマッチ二重鎖で治療したか、又は未治療の対照試料で得られたｍＲＮＡレベルと比較した。ＫＲＡＳ例については、相対ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルをＨＰＲＴ−１ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、５％グルコースで治療したマウスからの対照試料で得られたｍＲＮＡレベルと比較した。データはＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ バージョン１．０（インビトロ実施例）又は１．５（インビボ実施例）ソフトウェアを使用して分析した。
実施例２ 一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤の有効性
一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤について、配列特異的標的ｍＲＮＡ阻害の有効性を調べた。具体的には、５’一本鎖ガイド伸長部を有するＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ標的化ＤｓｉＲＮＡ二重鎖を２０ｎＭの一定濃度でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、２４時間後にＨＰＲＴ発現レベルを計測した（図７及び図９）。トランスフェクションはデュプリケートで実施し、各デュプリケートをそれぞれＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ発現に関してｑＰＣＲによってトリプリケートでアッセイした。
これらの条件下で（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は、二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥ、ＤＮＡ１５ＰＳ、ＲＮＡ１５ＰＳ、及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’ＯＭＥによって約６０〜８５％低下した（図７）。これに対して、一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖はＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現を約９０％低下させた。従って、一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖は、ＫＲＡＳ−２４９のサイレンシングにおいて一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖と同程度に有効であった。全ての一本鎖伸長二重鎖が一本鎖伸長領域にホスホロチオエート骨格修飾を含有した。１０ヌクレオチド一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は約７５〜８５％低下した。１５ヌクレオチド一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は６０〜７０％低下した。概して、１０ヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖は、５’ガイド伸長部に存在するヌクレオチドに関わらず、１５ヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖と比べてＫＲＡＳ標的遺伝子発現をより大きく低下させた。詳細には、デオキシリボヌクレオチドを含有するガイド伸長部を有する二重鎖のサイレンシング活性は、リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含有する二重鎖と比較して、１５ヌクレオチドの増加した長さに対する感受性がより高かった。ＫＲＡＳ−２４９の遺伝子発現を標的化する実験で使用した、ダイサーによる５’ガイド鎖伸長二重鎖のプロセシングもまた、インビトロアッセイによって示された（図１０）。
同様に、同じ条件下で（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＨＰＲＴ１遺伝子発現は、二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥ、ＤＮＡ１５ＰＳ、ＲＮＡ１５ＰＳ、及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’ＯＭＥによって約６５〜８５％低下した（図９）。これに対して、一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖はＨＰＲＴ１遺伝子発現を約９０％低下させた。従って、一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖は、ＨＰＲＴ１のサイレンシングにおいて一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖と同程度に有効であった。全ての一本鎖伸長二重鎖が一本鎖伸長領域にホスホロチオエート骨格修飾を含有した。１０ヌクレオチド一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は約８０〜８５％低下した。１５ヌクレオチド一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖ＤＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ、ＲＮＡ１０ＰＳ−２’−ＯＭＥについては、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は６０〜８０％低下した。概して、１０ヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖は、５’ガイド伸長部に存在するヌクレオチドに関わらず、１５ヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖と比べてＫＲＡＳ標的遺伝子発現をより大きく低下させた。詳細には、デオキシリボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含有するガイド伸長部を有する二重鎖のサイレンシング活性は、リボヌクレオチドを含有する二重鎖と比較して、１５ヌクレオチドの増加した長さに対する感受性がより高かった。ＨＰＲＴ１の遺伝子発現を標的化する実験で使用した、ダイサーによる５’ガイド鎖伸長二重鎖のプロセシングもまた、インビトロアッセイによって示された（図１０）。
一本鎖ガイド伸長部を有する二重鎖は、それぞれＫＲＡＳ−２４９及びＨＰＲＴ１のサイレンシングにおいて一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖と同程度に有効であったことから、この発見は、一本鎖ガイド伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤を有効性の損失なしに修飾することを可能にする。
実施例３ 一本鎖伸長部に相補的なショートオリゴヌクレオチドと組み合わせた一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤の有効性
一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤について、一本鎖伸長部に相補的なショートオリゴと組み合わせた配列特異的標的ｍＲＮＡ阻害の有効性を調べた。具体的には、１５ヌクレオチド不連続相補体を含む１５ヌクレオチド長の５’一本鎖ガイド伸長部を有するＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ標的化ＤｓｉＲＮＡ二重鎖を２０ｎＭの一定濃度でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、２４時間後にＨＰＲＴ発現レベルを計測した（図１２及び図１３）。トランスフェクションはデュプリケートで実施し、各デュプリケートをそれぞれＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ発現に関してｑＰＣＲによってトリプリケートでアッセイした。
これらの条件下で（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現は、不連続相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＤＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５、及び２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下における二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４０）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）、ＲＮＡ１５ＰＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）によって約１５〜６０％低下した（図１２）。一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖はＫＲＡＳ−２４９遺伝子発現を約８５％低下させた。全ての一本鎖伸長二重鎖が一本鎖伸長領域にホスホロチオエート骨格修飾を含有した。概して、リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖は、不連続相補体の存在に関わらず、デオキシリボヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖と比べてＫＲＡＳ標的遺伝子発現をより大きく低下させた。二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４０）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）、ＲＮＡ１５ＰＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）については、遺伝子発現の低下は、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５不連続相補体を伴う又は伴わない場合に同等であった。
同様に、同じ条件下で（０．１ｎＭ二重鎖、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション）、ＨＰＲＴ１遺伝子発現は、不連続相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＤＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５、及び２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下における二重鎖ＤＮＡ１５ＰＳ（１００１＋１３５３）、ＲＮＡ１５ＰＳ（１００１＋１３５４）、及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’ＯＭＥ（１００１＋１３５５）によって約３０〜８５％低下した（図１３）。一本鎖ガイド伸長部のない二重鎖はＨＰＲＴ１遺伝子発現を約９０％低下させた。全ての一本鎖伸長二重鎖が一本鎖伸長領域にホスホロチオエート骨格修飾を含有した。概して、リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖は、不連続相補体の存在に関わらず、デオキシリボヌクレオチドガイド伸長部を有する二重鎖と比べてＫＲＡＳ標的遺伝子発現をより大きく低下させた。二重鎖ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）は、いかなる不連続相補体も含まない同じ二重鎖ＲＮＡ１５ＰＳ（１３０１＋１３４１）及びＲＮＡ１５ＰＳ−２’−ＯＭＥ（１３０１＋１３４２）と比較して、不連続相補体ＲＮＡ１５、ＰＳ−ＲＮＡ１５、ＰＳ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ１５の存在下で遺伝子発現の低下の増進を示した。
実施例４ ＤｉＲＮＡ剤のインビボ有効性
ＤＮＡ二重鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤について、単回投与プロトコル又は反復投与プロトコル（例えば、ｉｎｖｉｖｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ中１０ｍｇ／ｋｇ単回注射）のいずれかで配列特異的標的ｍＲＮＡ阻害のインビボ有効性を調べた。注射後２４時間に肝臓、腎臓、脾臓及びリンパ節組織におけるＫＲＡＳの発現を計測し、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）をトリプリケートで実施してＫＲＡＳ発現を評価した。これらの条件下で、一本鎖ガイド伸長ＤｓｉＲＮＡ剤は、調べた全ての組織で統計学的に有意なレベルのＫＲＡＳ標的遺伝子阻害を呈した。かかる一本鎖ガイド伸長部ＤｓｉＲＮＡで治療した組織のＫＲＡＳパーセント阻害レベルは、肝臓（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）、脾臓（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％），），腎臓（１９１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％），）及びリンパ節（１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％））であった。従って、多くの組織型にわたって本発明の伸長ＤｓｉＲＮＡのインビボ有効性が実証された。
本発明の伸長ダイサー基質剤がインビボで特定の標的遺伝子の遺伝子発現を低下させる能力の更なる実証を、本発明のＤｓｉＲＮＡをマウス又は他の哺乳類対象に全身的に（例えば、ｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．注射によって）、或いは組織への直接注射（例えば、眼、脊髄／脳／ＣＮＳ等への注射）で投与することによって実施した。更なる標的ＲＮＡレベルの計測を標準方法によって標的細胞に対して実施した（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）製剤（チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム）と、続くｑＲＴ−ＰＣＲ）、（例えば、肝細胞及び／又は腎細胞のＲＮＡレベルをマウスの注射後にアッセイした；眼細胞を対象の眼注射後にアッセイした；又は脊髄／脳／ＣＮＳ細胞を対象のそれの直接注射後にアッセイした）。
任意のかかる更なるインビボ実験においては、本発明の伸長ダイサー基質剤（例えば、ガイド５’伸長又はパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ）は、適切な対照（例えば、媒体単独対照、無作為化二重鎖対照、異なる標的ＲＮＡ対照に対する二重鎖等）と比較したとき、本発明の伸長ダイサー基質剤の投与時にＲＮＡレベルの統計学的に有意な低下が観察された場合に、有効なインビボ剤であると見なすことができる。概して、かかる比較に割り当てられたｐ値（例えば、対応のない片側ｔ検定によって求められる）が０．０５未満であった場合、本発明の伸長ダイサー基質剤（例えば、ガイド５’伸長又はパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ剤）は有効なＲＮＡ干渉剤であると見なした。或いは、それ未満であれば本発明の伸長ダイサー基質剤が有効なＲＮＡ干渉剤であると分類されるｐ値閾値は、例えば０．０１、０．００１等に設定してもよく、それによってよりストリンジェントなフィルタリングを提供し、よりロバストな差を特定し、及び／又は複数の仮説検証を調整するなどすることができる。伸長ダイサー基質剤の有効なものと有効でないものとを区別するため、絶対活性レベル限界値もまた設定することができる。例えば、特定の実施形態において、本発明の有効な伸長ダイサー基質剤は、インビボで標的ＲＮＡレベルの統計学的に有意な低下を示すのみならず、例えば、適切な対照と比較したとき、調べた組織又は細胞における標的ＲＮＡレベルの少なくとも約１０％の低下、約１５％の低下、少なくとも約２０％の低下、約２５％の低下、約３０％の低下等もまたもたらすものであった。従って、本発明の伸長ダイサー基質剤（例えば、ガイド５’伸長及びパッセンジャー３’伸長ＤｓｉＲＮＡ剤）の更なるインビボ有効性試験を実施した。
一本鎖伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤（図１４及び図１５）は、インビボで肝臓、脾臓、及び腎臓において配列特異的標的ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を有効に阻害した。肝臓では、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）が、グルコース単独対照に対して正規化したとき、５’パッセンジャー伸長部を含まないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と比較されるとおりＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害を示した（図１６〜図１８）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の肝臓において少なくとも７５〜９０％であった。肝臓における５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）の阻害量は、５’パッセンジャー伸長部のないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と同等であり、これは陰性グルコース対照と比較して有意であった。
脾臓では、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ １０Ｍ）はまた、グルコース単独対照に対して正規化したとき、５’パッセンジャー伸長部を含まないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と比較されるとおりＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害を示した（図１９〜図２１）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の脾臓において少なくとも９０〜９５％であった。脾臓における５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）の阻害量は、５’パッセンジャー伸長部のないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と同等であり、これは陰性グルコース対照と比較して有意であった。
腎臓では、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ １０Ｍ）は、グルコース単独対照に対して正規化したとき、５’パッセンジャー伸長部を含まないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と比較されるとおりＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害を示した（図２２〜図２４）。ＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の阻害は、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ１０Ｍ）を注射した動物の腎臓において少なくとも２０〜４０％であった。それにも関わらず、５’パッセンジャー伸長ＤｓｉＲＮＡ剤１３７１（ＰＳ ３Ｍ）及び１３３９（ＰＳ １０Ｍ）の阻害量は、５’パッセンジャー伸長部のないＤｓｉＲＮＡ剤Ｋ２４９Ｍ及び１３７０（３Ｍ）と同等であった。これらの実験では、５’パッセンジャー伸長部のないＤｓｉＲＮＡ剤Ｍ９７Ｍであって、且つＫＲＡＳに対して配列特異的でないＤｓｉＲＮＡ剤を、陽性対照として使用した。
一本鎖ガイド伸長部を有するＤｓｉＲＮＡ剤は、インビボでのＫＲＡＳのサイレンシングにおいて一本鎖ガイド伸長部のないＤｓｉＲＮＡ剤と同程度に有効であったことから、この発見は、ＤｓｉＲＮＡ剤をインビボでの有効性の損失なしに一本鎖ガイド伸長部で修飾することを可能にする。
本明細書において言及する全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技術水準を示すものである。本開示に引用される参考文献は全て、各参考文献が個々に全体として参照により援用されていると見なすのと同程度に参照によって援用される。
当業者は、本発明が、主題の実施、及び言及される目標及び利点並びにそれに固有のものの達成に良く適合していることを容易に理解するであろう。ここで好ましい実施形態を代表するものとして本明細書に記載する方法及び組成物は例示であり、本発明の範囲の限定として意図されるものではない。当業者にはそれらにおける変更及び他の使用が想起され、それらは本発明の趣旨の範囲内に包含され、特許請求の範囲によって定義される。
当業者には、本明細書に開示される発明に対して、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく様々な置換及び修飾を行い得ることは容易に明らかであろう。従って、かかる追加の実施形態は、本発明及び以下の特許請求の範囲内にある。本発明は、当業者に、ＲＮＡｉ活性の媒介活性が向上した核酸コンストラクトの作成に向けて本明細書に記載される化学修飾の様々な組み合わせ及び／又は置換を試験することを教示する。かかる活性の向上には、安定性の向上、バイオアベイラビリティの向上、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞応答の活性化の向上が含まれ得る。従って、本明細書に記載される具体的な実施形態は限定するものではなく、当業者は、ＲＮＡｉ活性が向上したＤｓｉＲＮＡ分子の同定に向けて過度の実験を行うことなく本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを試験し得ることを容易に理解し得る。
本明細書に例示的に記載される本発明は、好適には、本明細書に具体的に開示されない任意の１つ又は複数の要素、１つ又は複数の限定はなしに実施することができる。従って、例えば、本明細書における各例で、用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれかを、他の２つの用語のうちの一方と置き換えることができる。用いられている用語及び表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、かかる用語及び表現の使用において、図示及び記載される特徴の任意の均等物又はその一部を除外する意図はなく、しかし特許請求される本発明の範囲内で様々な改良例が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の任意選択の特徴、改良例及び変形例が当業者によって用いられてもよく、かかる改良例及び変形例は、本説明及び添付の特許請求の範囲によって定義されるとおりの本発明の範囲内にあると考えられることが理解されなければならない。
加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は他の代替要素群によって記載される場合、当業者は、従って本発明がそのマーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又は部分的なメンバー群によっても記載されることを認識するであろう。
本発明の記載との関連における（特に以下の特許請求の範囲との関連における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書に特に指示されない限り、又は文脈上明確に否定されない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に注記されない限り、オープンエンド形式の用語（即ち、「限定はされないが、〜を含む」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に特に指示されない限り、単にその範囲内にある各個別の値に個々に言及するのを省略する方法として役立つことが意図されるに過ぎず、各個別の値は、それが本明細書に個々に記載されたかのように本明細書に援用される。本明細書に記載される方法は全て、本明細書に特に指示されない限り、又はその他、文脈上明確に否定されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される全ての例、又は例示用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明の理解をより容易にすることを意図しているに過ぎず、特に注記されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中のいかなる用語も、任意の特許請求されない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈されてはならない。
本明細書には、本発明者らにとって公知の本発明の実施に最良の形態を含め、本発明の実施形態が記載される。前述の説明を読めば、当業者には、それらの実施形態の変形例が明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてかかる変形例を用いることを予想し、且つ本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものと別様に実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により認められているとおりの本明細書に添付された特許請求の範囲に記載される主題の全ての改良例及び均等物を含む。更に、それらの可能な全ての変形例における上述の要素の任意の組み合わせが、本明細書に特に指示されない限り、又はその他、文脈上明確に否定されない限り、本発明に包含される。
実施例５．インビトロ細胞培養アッセイによる標的ＲＮＡの核酸阻害の評価
本発明のｄｓＲＮＡをヒトヘパトーマ（Ｈｕｈ７）細胞に投与し、続いてヒトヘパトーマ（Ｈｕｈ７）細胞において標的ｍＲＮＡのレベルを計測して、標的転写物に対する本発明のｄｓＲＮＡの標的発現の低下に関するインビトロ有効性を評価する。
ヒト標的遺伝子ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０００１９４及びＧＩ：１６４５１８９１３）に特異的な二本鎖ＲＮＡについて、ヒトヘパトーマ（Ｈｕｈ７）細胞における有効性を試験する。前出の標的遺伝子は、当該技術分野で認められている「ハウスキーピング」遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子は、ヒト肝細胞において標的遺伝子が強力で一様な発現を有するよう確実にすること、及び種間の発現レベルのばらつきを最小限に抑えることの二重の目的から標的遺伝子として選択される。本発明の幾つかの実施形態が、比較の基準として用いられる対照ｄｓＲＮＡを含め、図３７、図３８、図３９及び図４１に示される。ＨＰＲＴ１を標的化する特定のｄｓＲＮＡが、例えば、図３７、図３８、図３９、及び図４１に示される。ＧＡＰＤＨ、ＬＭＮＡ、ＨＮＲＰＡ１及びＡＴＰ１Ｂ３を標的化するｄｓＲＮＡの特定の配列も、ヒト肝細胞においてそのそれぞれの転写物を標的化するため、同様に構築し得る。
ＲＮＡに標的化されたｄｓＮＡ分子を本明細書に記載されるとおり設計して合成する。これらの核酸分子は、遺伝子発現を低下させる能力及びダイサー切断活性について、例えば以下の手順を用いてインビボで試験することができる。ｄｓＮＡの有効性の試験には、２つのフォーマットが用いられる。例えばヒトヘパトーマ（Ｈｕｈ７）細胞を使用して細胞培養物で試薬を試験して、ＲＮＡ及びタンパク質阻害の程度を決定する。本明細書に記載されるとおりｄｓＮＡ試薬は特定の標的に仕向けられる。好適なトランスフェクション剤によってこれらの試薬を例えば培養表皮角化細胞に送達した後、ＲＮＡ阻害を計測する。標的ＲＮＡの相対量を計測し、リアルタイムＰＣＲによる増幅モニタリング（例えば、ＡＢＩ ７７００ ＴＡＱＭＡＮ）を用いて対アクチンと比較する。比較は、無関係の標的又は同じ全長及び化学を有するが各位置で無作為に置換されている無作為化ｄｓＮＡ対照に対して行われるオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して行う。標的に仕向けられる一次及び二次リード試薬を最適化する。最適なトランスフェクション剤濃度の選択後、リードｄｓＮＡ分子でＲＮＡ経時的阻害を実施する。加えて、細胞プレーティングフォーマットを用いてＲＮＡ阻害を決定することができる。
ｄｓＮＡコンストラクトについて、例えば以下のプロトコルを用いて標的ＲＮＡ発現の低下における有効性を試験する。細胞をプレーティングし、約２４時間後、トランスフェクション時点で細胞が７０〜９０％コンフルエントであるように９６ウェルプレートに５，０００〜７，５００細胞／ウェル、１００ｕｌ／ウェルでトランスフェクトする。トランスフェクションについては、アニールしたｄｓＮＡをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と５０μｌ／ウェルの容積で混合し、室温で２０分間インキュベートする。このｄｓＮＡトランスフェクション混合物を細胞に添加して、１５０ｕｌの容積中最終ｄｓＮＡ濃度を５０ｐＭ、２００ｐＭ、又は１ｎＭにする。各ｄｓＮＡトランスフェクション混合物につきトリプリケートで試験する。細胞は、継続的なＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物の存在下において３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間時点で、処理細胞の各ウェルからＲＮＡを調製する。細胞試料の遠心後、上清をトランスフェクション混合物と共に取り出して廃棄し、細胞を溶解させて、各ウェルからＲＮＡを調製する。標的遺伝子及び正規化用の全てに対する対照遺伝子（例えば、アクチン又は３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）について、定量的方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット）によって処理後の標的ＲＮＡレベル又は発現を評価する。或いは、細胞を溶解させて、各ウェルから全タンパク質を調製する。処理後の標的タンパク質レベル又は発現をウエスタンブロットによって評価し、シグナルを定量化する。トリプリケートデータを平均し、各処理の標準偏差を決定する。正規化データをグラフにし、適切な対照ｄｓＲＮＡ（例えば、逆位対照ｄｓＲＮＡ）と比較した本発明のｄｓＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの低下パーセントを決定する。
従って、本発明のニック入りｄｓＲＮＡ、例えば、ニック入りテトラループ構造は、基準ｄｓＲＮＡと比較して、細胞における特定の標的の遺伝子発現を低下させることが示され得る。テトラループを有するニック入りｄｓＲＮＡはダイサーによる切断が増進されていることが予想される。従って、ニック入りテトラループ構造を有する本発明のｄｓＲＮＡは、基準ｄｓＲＮＡと比較して標的遺伝子の発現を低下させ、且つダイサーによる切断を増進する。本発明のニック入りテトラループ構造に包含される構造を有するｄｓＮＡは、ヒトヘパトーマ（Ｈｕｈ７）細胞における標的遺伝子のインビトロ発現のロバストに有効な配列特異的阻害薬である。
実施例６．インビトロアッセイによる血清安定性の評価
ｄｓＮＡ剤を５０％ウシ胎仔血清中において３７℃で様々な時間にわたって（最長２４時間）インキュベートすることにより、ｄｓＮＡ剤の血清安定性を評価する。血清を抽出し、ＰＡＧＥを用いて２０％非変性ゲル上で核酸を分離し、Ｇｅｌｓｔａｒ染色で可視化する。ｄｓＮＡ（任意選択で修飾有り及び無し）について、ヌクレアーゼ分解からの相対的保護レベルを評価する。
実施例７．テトラループを有するニック入りｄｓＲＮＡのインビボアッセイ
本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を低下させるための組成物を提供し、これは、それを必要としている対象の標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の、テトラループを有するニック入りｄｓＲＮＡに、細胞を接触させることを含む。本発明のｄｓＲＮＡをマウスに全身投与し、続いて治療したマウスの肝臓試料における標的ｍＲＮＡのレベルを計測する。この試験は、標的転写物に対する本発明のｄｓＲＮＡのインビボ有効性を評価する。
以下のマウスハウスキーピング標的遺伝子に特異的な二本鎖ＲＮＡ剤について、マウス肝臓における有効性を試験する：ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０１３５５６）；グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−００８０８４）；ラミンＡ（ＬＭＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０１９３９０）；ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＰＡ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０１０４４７）及びＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送、β３ポリペプチド（ＡＴＰ１Ｂ３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−００７５０２；ＡＴＰ１Ｂ３ ｍＲＮＡ内で２つの異なる位置が標的化された）。
そのそれぞれの転写物を標的化するためアンチセンス鎖上に以下の配列のいずれか一つを含有する、本発明のｄｓＲＮＡの構造、例えばニック入りテトラループ構造を有する、ＨＰＲＴ１、ＧＡＰＤＨ、ＬＭＮＡ、ＨＮＲＰＡ１及びＡＴＰ１Ｂ３を標的化するｄｓＲＮＡの特定の配列を構築する：
ＨＰＲＴ１アンチセンス配列：３’−ＵＵＣＧＧＵＣＵＧＡＡＡＣＡＡＣＣＵＡＡＡＣＵＵＵＡＡ−５’
ＧＡＰＤＨアンチセンス配列：３’−ＡＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＧＡＧＵＧＵＵＡＡＡＧＧＵＡＧＧ−５’
ＬＭＮＡアンチセンス配列：
３’−ＣＵＣＧＡＡＣＵＧＡＡＧＧＵＣＵＵＣＵＵＧＵＡＡＡＵＧ−５’
ＨＮＲＰＡ１アンチセンス配列：
３’−ＧＵＣＣＵＧＡＣＡＵＡＡＡＣＡＣＵＧＡＵＵＡＡＣＡＵＡ−５’
ＡＴＰ１Ｂ３アンチセンス配列：
３’−ＡＵＣＣＣＵＡＵＧＵＵＡＣＣＡＵＧＧＡＡＣＧＧＵＵＧＵ−５’
ＡＴＰ１Ｂ３アンチセンス配列：
３’−ＧＧＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＵＧＵＵＵＡＵＡＧＣＡＣＡ−５’
凡例：大文字＝ＲＮＡ残基
体重約２５グラムのマウス（ＣＤ−１雌）を購入し、飼育し、治療して、犠牲にする。
ニック入りｄｓＲＮＡが標的転写物の発現を低下させるインビボ有効性を確立する一方で最適ニック入りｄｓＲＮＡ用量及び試料採取時間もまた確立するため実施される初期用量範囲探索及び時点選択試験。これは、例えば（ＨＰＲＴ１）を標的化する２つの独立した活性配列について行われる。試験するｄｓＲＮＡの種々の用量（５０及び２００μｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１用量当たり２．５ｍＬ総容積）中に溶解し、マウスに単回ハイドロダイナミック注入として尾静脈から投与する。以下の時点で、投与したマウスから肝臓試料を採取する：投与後２４、４８及び７２時間、及び７日。各群合計４匹の動物をｄｓＲＮＡで治療して、各投与量／時点につき少なくとも３匹の動物を評価できることを確実にする。
この試験はまた、以下の条件も用いて実施する。試験するｄｓＲＮＡの用量（２００μｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１用量当たり２．５ｍＬ総容積）に溶解し、マウスに単回ハイドロダイナミック注入として尾静脈から投与する。投与後２４時間で、投与したマウスから肝臓試料を採取する。各群合計７匹の動物をそれぞれのｄｓＲＮＡ剤で治療する。
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を用いて標的ｍＲＮＡレベルを評価する。オリゴｄＴ及びランダムヘキサマープライミングの混合物を使用してｃＤＮＡを合成する。ｑＰＣＲ反応はトリプリケートで実行する。クローニングした線状化アンプリコン標的から得た標準曲線ランに対する外挿によって絶対定量化を実施する。対照を１００％として使用してデータを正規化する。１００％対照値を求めるため平均した、標的ｍＲＮＡ特異的ＤｓｉＲＮＡ剤を投与しない全てのマウスに関する標的ｍＲＮＡ発現計測値を対照遺伝子発現レベルと設定することにより、データを正規化する（例えば、ＧＡＰＤＨ ＤｓｉＲＮＡを注射したマウスについて、ＨＰＲＴ１、ＬＭＮＡ、ＨＮＲＰＡ１、ＡＴＰ１Ｂ３−１及びＡＴＰ１Ｂ３−３マウスのセットを全て陰性対照として使用して、正規化した基礎ＧＡＰＤＨレベルを求める。従って、各試験アームにつき７匹の試験マウス及び３５匹の対照マウスがいる）。結果の有意性の評価において、Ｐ値は対応のない片側ｔ検定を用いて計算する。０．０５未満の値を統計学的に有意であると見なす。
治療したマウスの肝臓試料では、本発明のニック入りテトラループｄｓＲＮＡによる治療に起因して、標的ｍＲＮＡレベルの低下が観察される。これらの試験の結果は、ＨＰＲＴ１標的配列に対するｄｓＲＮＡ剤が、５０マイクログラム及び２００マイクログラム又は他の濃度、例えば１μｇ〜５００μｇ、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００μｇで投与したときインビボで標的ｍＲＮＡレベルを低下させることを示し、投与後２４時間で、遺伝子転写物レベルを低減しないと思われる対照と比較したとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％の標的遺伝子転写物発現レベルの低下が観察される。
実施例８．リガンド誘導体の合成
この実施例でＧａｌＮａｃと称されるリガンドＮ−アセチルガラクトサミンの誘導体を、スキームＩ：（２１０頁を参照）
に従い合成した。
ａ．Ｄ２の合成
フラスコに、撹拌子、ベンジルアルコール（９０ｍＬ，９４ｇ、０．８７ｍｏｌ、８．０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ 無水）、δ−バレロラクトン（１０．０ｍＬ、１０．８ｇ、０．１０８ｍｏｌ、１．０当量、Ａｌｆａ、受領時のまま使用）、及びＤｏｗｅｘ ５０Ｗ８Ｘ−１００樹脂（２０７ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた。このフラスコに、Ｎ２（窒素）注入針を備えたゴムセプタムを装着し、フラスコを７５℃に予熱した油浴中に置いた。混合物を４時間激しく撹拌し、次に油浴の電源を切り、溶液を一晩撹拌させておき、Ｎ２（窒素）下で室温に冷却した。澄明な無色の溶液をろ過してＤＯＷＥＸビーズを取り出し、ビーズ及びフィルタをＤＣＭでリンスした。ロータリーエバポレータでろ液を濃縮して（ジクロロメタン）ＤＣＭを除去した。混合物を３バッチのシリカゲル（ＩＳＣＯ）でフラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）精製した（各々３３０ｇシリカゲルカラム（３バッチ全てについて、同じカラムを再使用した）。３３０ｇカラム、５％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）／ヘキサンで平衡化した）。各ランについてカラムに３３〜３５ｍＬの反応液を注入し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン５％〜１００％で溶出させた。ＵＶ２５４ｎｍ、２８０ｎｍ。３つのカラムからの所望の画分を全て合わせ、蒸発させると、Ｄ２が無色の液体として得られた：１５．８２ｇ（０．０７６ｍｏｌ、７０％）。これをシリカゲルでのＦＣ：２２０ｇカラムによって再精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン５％〜７０％、２５４ｎｍ、２８０ｎｍで溶出させた。所望の画分を合わせ、蒸発させると、無色の液体が得られ、これを完全真空下で２４時間乾燥させると、Ｄ２ １２．６０ｇ（５６％）が、次のステップで使用するのに十分な純度の無色の液体として得られた。
ｂ．Ｇ１’の合成
４ｇスケール：
オーブン乾燥したフラスコに、ＧａｌＮＡｃ（Ｇ１）（４．３６０ｇ、１１．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）及び撹拌子を入れた。１，２−ジクロロエタン（Ａｌｄｒｉｃｈ．無水、２６ｍＬ）を添加すると、乳状の懸濁液が得られた。この混合物に、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）（Ａｌｆａ、２．８ｍＬ、１分かけて）を室温、Ｎ２下でシリンジによって添加した。この混合物を室温で３０分間撹拌したが、不均一なままであった。フラスコを５０℃に予熱した油浴中に置いた。数分以内に反応混合物は均一になった。９５分間加熱した後、油浴の電源を切り、フラスコを室温に一晩放冷した。２１時間後、アリコートを取り出し、ＣＨ３ＣＮで希釈し、質量分析（ＭＳ）によって確認した。ＣＩ ＰＯＳ：３６２．１（１０）、３３０．１（１００）、２１０．１（２０）、１６８．１（１２）、１５０．１（２８）。
この反応液（琥珀色）を、１３０ｍＬの氷冷飽和ＮａＨＣＯ３水溶液が入った５００ｍＬ分液漏斗に注ぎ入れ、反応フラスコをＤＣＭ（１００ｍＬ）でリンスした。ガス発生が弱まった後、相を分離した（下部の有機相は混濁した黄色であり、上部の水相はやや呈色した乳状であった）。水相をＤＣＭ（１×５０ｍＬ）で抽出した。合わせたＤＣＭ相をＨ２Ｏ（１２０ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ水溶液（１２０ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ相（澄明、淡黄色）をＮａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し（約１００ｍＬのＤＣＭでＮａ２ＳＯ４をリンスした）、ロータリーエバポレータによって濃縮すると、琥珀色の油が得られた。これを完全真空下に室温で一晩乾燥させて（約３．７ｇ）、次にフリーザーに保存した。この材料を更なる精製なしに次のステップで使用した。
２０ｇスケール：
ジクロロメタン（１２０ｍＬ）中ガラクトサミンペンタアセテート（Ｇ１）（２０．０ｇ、５１．０ｍｍｏｌ、１．０当量、ＬＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の混合物に、室温でＴＭＳＯＴｆ（１４．０ｍＬ、７７．０ｍｍｏｌ、１．５当量、Ａｌｆａ）を添加し、反応物を加熱還流し、還流させながら９０分間撹拌した。続いて混合物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物を氷冷重炭酸ナトリウム溶液に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させてろ過した。ロータリーエバポレータで濃縮した後、濃いオレンジ色のゴム（約１６ｇ）として予想生成物Ｇ１’が得られた。この粗生成物を更なる精製なしに使用した。
ｃ．Ｇ２の合成
５−ヒドロキシペンタン酸（ｈｙｄｒｏｘｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）ベンジルエステルＤ２（１２．４４ｇ、５９．７３ｍｍｏｌ、１．７５当量）を１，２−ジクロロエタン（８０ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ 無水）に溶解し、この溶液を粗ＧａｌＮＡｃ誘導体（Ｇ１’）（１１．２４ｇ、３４．１３ｍｍｏｌ、１．００当量）に添加した。この溶液が均一になったところで、それに乾燥３Å分子篩（１０．５ｇ、ビーズ）を添加した。この混合物をＮ２下に室温で３０分間撹拌した。ＴＭＳＯＴｆ（３．２ｍＬ、１８ｍｍｏｌ、０．５２当量）をシリンジによって添加した。この混合物をＮ２下に室温で一晩撹拌した。反応をＭＳ（ＣＩ ＰＯＳ）、及びＴＬＣ（シリカゲル、１００％ＥｔＯＡｃ、ＰＭＡ又はＨ２ＳＯ４／ＭｅＯＨで染色）によってモニタした。ＭＳ ＰＯＳ：６３８．３（１５）、５３８．２（１００）、４３８．２（１０）、３３０．１（４０）。室温で２４時間後、反応をワークアップした。琥珀色の溶液を１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液が入った分液漏斗に注ぎ、フラスコ及び篩を８０ｍＬのＤＣＭでリンスし、それもまた分液漏斗に添加した。相を分離し、水相を１×８０ｍＬ ＤＣＭで抽出した。合わせた有機相をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。琥珀色の有機相を乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し（紙）、蒸発させると、粘稠性の琥珀色液体が得られた：２６．５４ｇ（１４５％）。この粗試料をシリカゲル（ＩＳＣＯ）：３３０ｇカラムでのＦＣによって直接精製し、化合物を平衡化したカラムに注入し、８ｍＬ ＤＣＭでリンスし；０％〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＵＶ２５４ｎｍ、２８０ｎｍで溶出させた。所望の画分を合わせ、蒸発させると、ほぼ無色の粘稠液が得られた：１３．５２ｇ（７４％）。この材料は少量のＧａｌＮＡｃ−ＯＢｎ（Ｍ＋１＝４３８）及び少量の「二量体」及び「三量体」（ペンタン酸の相同体）誘導体（Ｍ＋１＝７３８及び６３８）で汚染されていた。
ｄ．Ｇ２’の合成
出発物質Ｇ２（２．４２ｇ、４．５０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）に溶解し、この溶液をＰａｒｒジャーに入れた。５％Ｐｄ／Ｃ（５９２ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｇｕｓｓａ Ｅ１００２ Ｕ／Ｗ、湿潤）を添加した。このジャーをＰａｒｒ水添器に置き、ジャーの排気及びＨ２充填を４回行った。次にジャーを４８ｐｓｉ（水素）Ｈ２に加圧し、室温で一晩振盪した。１８時間後、反応を停止させた。ジャーの排気及びＮ２充填を４回行った。反応混合物のアリコートを取り出し、ろ過し、ＭｅＯＨで希釈し、ＭＳによって確認した。ＭＳ ＰＯＳ：４４８．２（１００）、３３０．１（６５）、２１０．１（７）、１５０．１（８）；ＭＳ ＮＥＧ：５６０．２（５）、４４６．２（１００）。反応を完了し、クリーニングした。反応混合物をセライトでろ過し、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）でリンスした。澄明な無色のろ液を蒸発させて、完全真空下に室温で乾燥させると、無色の泡／ガラス固体：１．７０ｇ（８４％）のＧ２’が得られた。
ｅ．Ｇ３の合成
ジクロロメタン（１００ｍＬ）中Ｇ２’（２ｇ、４．４７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＥＤＣ（３．０８ｇ、１６．０６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（０．７７ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物をロータリーエバポレータ（４０℃）で濃縮し、残渣を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、蒸発させた。この粗Ｇ３を次のステップに精製なしに使用した（１．４ｇ、５７％）。
実施例９．多価リガンド誘導体の合成
その一例は、トリアンテナリーＧａｌＮａｃであり、これらの分枝ＧａｌＮａｃ誘導体の合成をスキームＩＩに示す（２１１〜２１３頁を参照）。
ａ．Ｔ５の合成 （３−［２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−（２−カルボキシエトキシ）−２−（２−カルボキシエトキシメチル）−プロポキシ］プロパン酸）
フラスコに、３，３’−（（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−２−（（２−カルボキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ジプロピオン酸（Ｔ４）（４．３９ｇ、９．３１ｍｍｏｌ、１．０当量）（ＣＡＳ登録番号：２００１３３−１６−０）及びＤＭＦ（４４ｍＬ）を入れ、均一溶液を得た。ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．５９ｇ、９．３０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＮ２下に室温で添加し、混合物を均一になるまで約１分間撹拌した。ＤＩＥＡ（９．５ｍＬ、５４．５ｍｍｏｌ、５．９当量）をシリンジによって添加した。ＨＢＴＵ（１１．７０ｇ、３０．９ｍｍｏｌ、３．３当量）を一度に添加した。この反応混合物を均一になるまで１〜２分間撹拌した。フラスコを氷水浴に浸し、ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン（５．８０ｍＬ、３３．２ｍｍｏｌ、３．６当量）をシリンジで約５分かけてゆっくりと添加した。浴を置いたまま反応液（澄明な淡黄色〜琥珀色）をＮ２下２４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（３５０ｍＬ）で反応液を希釈し、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×１５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）、及び飽和ＮａＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、蒸発させると、粘稠性の琥珀色の液体が得られた。粗材料をＳｉＯ２（ＩＳＣＯ）でＦＣ精製した。ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ ０％〜２０％、次に１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させると、ほぼ無色の粘着性の泡／油：７．１７ｇ（８２％）Ｔ５がもたらされた。
ＣＡＳ登録番号：１１６２０６９−３１−９
ｂ．Ｔ８の合成 ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０−アミノ−１０−（１３，１３−ジメチル−５，１１−ジオキソ−２，１２−ジオキサ−６，１０−ジアザテトラデシル）−５，１５−ジオキソ−８，１２−ジオキサ−４，１６−ジアザノナデカン−１，１９−ジイル）ジカルバメート
Ｔ５（２．８４ｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を室温でＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、この溶液をＰａｒｒジャーに入れた。５％Ｐｄ／Ｃ（０．６６７０ｇ、Ｄｅｇｕｓｓａ Ｅ１００２ Ｕ／Ｗ、湿潤、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。ジャーをＰａｒｒ水添器に置き、排気及びＨ２充填を４回行った。ジャーを４７ｐｓｉ Ｈ２に加圧し、室温で６時間振盪した。ジャーの排気及びＮ２充填を４回行った。反応混合物をセライトでろ過し、約２００ｍＬ ＭｅＯＨでセライトをリンスした。やや混濁したろ液を幾らかのＣＨ２Ｃｌ２を含むろ紙でろ過してリンスし、得られた澄明なろ液を蒸発させて、完全真空下で乾燥させると、泡状固体：２．３８ｇ（９８％）Ｔ８が得られた。
ｃ．Ｔ９の合成 メチル１５，１５−ビス（１３，１３−ジメチル−５，１１−ジオキソ−２，１２−ジオキサ−６，１０−ジアザテトラデシル）−２，２−ジメチル−４，１０，１７−トリオキソ−３，１３，２０，２３，２６，２９，３２−ヘプタオキサ−５，９，１６−トリアザペンタトリアコンタン−３５−オエート（Ｔ９）：
フラスコに、３−オキソ−２、６、９、１２、１５、１８−ヘキサオキサヘニコサン−２１−オイック酸（５３２．０ｍｇ、４．０６ｍｍｏｌ、１．０当量、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ）、Ｔ８（３．３８５ｇ、４．１２ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＢＴＵ（１．８８８ｇ、４．９８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７１０．３ｍｇ、４．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）、及びＤＭＦ（１５ｍＬ）を入れた。この混合物を澄明且つ均一になるまでＮ２下で数分間撹拌した。これに、ＤＩＥＡ（１．６ｍＬ、９．１９ｍｍｏｌ、２．３当量）をシリンジで１分かけて添加した。この反応液をＮ２下室温で４１時間撹拌した。溶液をＣＨ２Ｃｌ２（１８０ｍＬ）で希釈し、１：１Ｈ２Ｏ／飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×７０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（７０ｍＬ）、及び飽和ＮａＣｌ水溶液（８０ｍＬ）で洗浄した。合わせた水相をＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）で抽出し、このＣＨ２Ｃｌ２相をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。合わせたＣＨ２Ｃｌ２相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させてろ過し、蒸発させると、油が得られた。この粗油をＳｉＯ２（ＩＳＣＯ）でＦＣ精製し、（ＭｅＯＨ中０．７Ｍ ＮＨ３）／ＣＨ２Ｃｌ２、０％〜１０％で溶出させると、油として１．６０４ｇ（３５％）のＴ９が得られた。
ｄ．Ｔ１０の合成 （メチル３０−アミノ−２１，２１−ビス（（３−（（３−アミノプロピル）アミノ）−３−オキソプロポキシ）メチル）−１９，２６−ジオキソ−４，７，１０，１３，１６，２３−ヘキサオキサ−２０，２７−ジアザトリアコンタノエートトリス（２，２，２−トリフルオロ酢酸）塩（Ｔ１０）：
１００ｍＬ丸底フラスコの中において、Ｔ９（１．５ｇ、１．３１５ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（６ｍＬ）及びジクロロメタン（２４ｍＬ）の混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレータによって濃縮し、粗生成物を真空下で一晩乾燥させた。精製は不要であり、粗Ｔ１０（１．５５ｇ、収率：定量的）を次のステップで直接使用した。
ｅ．３ＧＴ２の合成−メチルエステル：
０℃（氷水浴）のジクロロメタン（４５ｍＬ）中Ｔ１０（１．５５ｇ、１．３１５ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（２．２９ｍＬ、１３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を５分間撹拌した。Ｇ３を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、水相をジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて蒸発させた。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（グラジエント溶離法０％〜４０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で残渣を精製した。３ＧＴ２−メチルエステルが白色の泡（１．４ｇ、５１％）として得られた。
ｆ．３ＧＴ３の合成：
３ＧＴ２−メチルエステル（１．４ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ）の溶液に溶解し、ＬｉＯＨ一水和物（１．１ｇ、２６．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。この反応混合物をロータリーエバポレータで濃縮し、次にＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈した。この混合物をｐＨ＝３〜４になるまで１Ｎ ＨＣｌで酸性化した。混合物をＣ１８（８０ｇ）カラムにロードし、逆相クロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）（０％〜６０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏのグラジエント溶離法）によって精製した。凍結乾燥後、３ＧＴ３が無色の固体として得られた（６３４ｍｇ、５５％）。
ｇ．トリアンテナリーＧａｌＮＡｃリガンド（３ＧＴ５Ｓ）の合成：
ＤＭＦ（３ｍＬ）中３ＧＴ３（３６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の混合物に、ＥＤＣ（５．９６ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（６．９９ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレータ（４０℃）で濃縮し、残渣をＣ１８（１３ｇ）カラムにロードし、逆相クロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）（Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）〜６０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）のグラジエント溶離法）によって精製した。凍結乾燥後、３ＧＴ５Ｓがオフホワイトの固体として得られた（２１ｍｇ、５５％）。
実施例１０．核酸塩基を介して連結したＧａｌＮＡｃを有するＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲートホスホロアミダイト単量体の合成
以下のスキームＩＩＩは、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体（Ｄ６）の合成に関わるステップを示す。Ｄ３は商業的に得たもので、Ｃ５のメチル基に付加されたリンカーを有する修飾チミジンである。
ａ．Ｄ４の合成
メタノール（２４ｍＬ）中（Ｅ）−３−（１−（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−イル）−Ｎ−（６−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ヘキシル）アクリルアミド（Ｄ３）（４．５５ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、１当量、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の溶液に、３６ｍＬの濃水酸化アンモニウム溶液（Ｆｉｓｈｅｒ）を５〜１０分かけて添加した。この溶液を室温で撹拌し、ＭＳ及びＴＬＣによってモニタした（シリカゲル、１００％ＥｔＯＡｃ又は１０％（ＭｅＯＨ中７Ｍ ＮＨ３）／ＤＣＭのいずれかで溶出し、及びＵＶ又はリンモリブデン酸（ＰＭＡ）若しくはＨ２ＳＯ４／ＭｅＯＨのいずれかによる染色で可視化した）。２４時間後、なおも少量のＳＭが残っていた。Ｋ２ＣＯ３（２２２ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ、０．２８当量）を添加した。この反応混合物を更に１５時間撹拌し、１５時間経った時点で更なるＫ２ＣＯ３（１０３ｍｇ、０．７４８ｍｍｏｌ、０．１３当量）を添加した。溶液を室温で３時間撹拌した。揮発分をロータリーエバポレータ（浴温＜３３℃）で蒸発させた。ＭＳ ＣＩ ＰＯＳ：７９５（１）、７５３．３（５）、６９９．３（１００）、３０３．１（２０）。残渣を、音波処理を伴い約１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（約７ｍＬ）に溶解し、この溶液を、平衡化したＩＳＣＯカラム：８０ｇカラム（ＩＳＣＯ Ｇｏｌｄ）に入れ、（ＭｅＯＨ中７Ｍ ＮＨ３）／ＤＣＭ０．７５％〜１５％で溶出させた。ＵＶ２８０ｎｍ、２５４ｎｍ。所望の画分を合わせて蒸発させると泡の固体が得られ、これをオフホワイトの粉末に砕き、これを完全真空下に室温で数日間乾燥させると、Ｄ４：４．１７ｇ（定量的）が得られた。
ｂ．Ｄ５の合成
５−（（（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−３−アセトアミド−４、５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ペンタン酸（Ｇ２’）（１．６０ｇ、３．５８ｍｍｏｌ、１．２０当量）を室温で１２ｍＬの乾燥ＤＭＦに（短時間の音波処理を伴い）溶解した。この溶液に、トリエチルアミン（０．６０ｍＬ、１．４４当量、Ａｌｄｒｉｃｈ 無水）、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）（０．４５９ｇ、１．００当量、ＣＨＥＭ−ＩＭＰＥＸ）、ＣＭＣ（１．６５ｇ、１．３０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びアミンＳＭ（Ｄ４）（２．０９ｇ、２．９９ｍｍｏｌ、１．０当量）をこの順序で添加した。１２ｍＬの乾燥ＤＭＦを添加して、フラスコをリンスした。溶液を短時間音波処理して僅かに残るＳＭａｍｉｎｅ（Ｄ４）を溶解した。澄明な溶液をＮ２下室温で一晩撹拌し、ＴＬＣによってモニタした（シリカゲル、１００％ＥｔＯＡｃ又は１０％（ＭｅＯＨ中７Ｍ ＮＨ３）／ＤＣＭのいずれかで溶出し、及びＵＶ又はＰＭＡ若しくはＨ２ＳＯ４／ＭｅＯＨのいずれかによる染色で可視化した）。１９時間後、ロータリーエバポレータで反応液を濃縮してほぼ全てのＤＭＦを除去すると（水浴温＜３９℃）、スラリーが得られた。これをＭｅＯＨ（数ｍＬ）及びＤＣＭ（６ｍＬ）中に溶解し、平衡化したＩＳＣＯカラムに入れ、フラッシュクロマトグラフィー：１２０ｇシリカゲル、ＤＣＭ中０．５％〜１４％（ＭｅＯＨ中２．３Ｍ ＮＨ３）によって精製した。ＵＶ ２１４ｎｍ、２５４ｎｍ。所望の画分を合わせ、蒸発させると、Ｄ５：２．３６ｇ（７０％）が得られた。
ｃ．Ｄ６の合成
Ｄ５（２．２４ｇ、１．９９ｍｍｏｌ、１当量）を室温でＮ２下にジクロロメタン（３０ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ．無水）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１．４０ｍＬ、８．１８ｍｍｏｌ、４．１２当量、Ａｌｄｒｉｃｈ．無水）を添加した。この溶液を数分間撹拌し、次に２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．９０ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ、２．０当量、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をシリンジで約１分間かけて滴下して添加した。得られた澄明なほぼ無色の溶液を室温で撹拌し、ＴＬＣ：１０％（ＭｅＯＨ中７Ｍ ＮＨ３）／ＤＣＭ又は１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ；ＵＶ、ＰＭＡ又はＨ２ＳＯ４／ＭｅＯＨによってモニタした。３時間後にごく少量のＤ５が残った（Ｄ６はＤ５と比べてＲｆが高い）。４．５時間後、反応液を１ｍＬ ＭｅＯＨでクエンチし、５分間撹拌した。次に約５ｍＬ容積になるまで濃縮し、平衡化したカラムに入れ、シリカゲル（ＩＳＣＯ）：１２０ｇカラムでＦＣ精製し、２％〜６０％［２０％（ＭｅＯＨ中２．３３Ｍ ＮＨ３）］／ＤＣＭで溶出させた。所望の画分を合わせ、蒸発させると、ほぼ無色のガラス質の泡状固体が得られ、これを完全真空下に室温で乾燥させると、１．５６ｇ（５９％）のＤ６が得られた。
実施例１１．ループに４個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）リガンドを有するステム−ループを含むｄｓＮＡの合成
ループの単量体にＧａｌＮＡｃリガンドがコンジュゲートしているステム−ループオリゴマーをスキームＡに従い生成した（２２５〜２２６頁を参照）。
ａ．センス鎖Ａ２の合成
１５ｍＬＦａｌｃｏｎチューブにおいて、化合物Ａ１（３０ｍｇ、０．００２５２ｍｍｏｌ）を、脱気した３：１ジメチルアセトアミド／脱イオン水（７５０μＬ）に溶解した。２ｍＬシンチレーションバイアルにおいてアジド−Ｐｅｇ１１−アミン（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、注文番号１０５２４、４６ｍｇ、（０．００８０６ｍｍｏｌ）を、脱気した３：１ジメチルアセトアミド／脱イオン水（１５０μｌ）に溶解した。２ｍＬシンチレーションバイアルにおいて、臭化銅（Ｉ）硫化ジメチル錯体１６．６ｍｇ、０．０８０６ｍｍｏｌ）を、脱気したアセトニトリル（３００μＬ）に溶解した。
ｐｅｇ−アジド溶液をＲＮＡ溶液に添加し、続いてＣｕＢｒを溶液／スラリーとして添加した。ＣｕＢｒ試薬を添加すると、反応液の色が緑色乃至青色に変わった。この反応混合物を振盪機において４０℃で１時間加熱し、ＬＣ−ＭＳ（２〜４０％水／ＡＣＮ＋１００ｍＭ ＨＦＩＰ及び８．３ｍＭトリエチルアミン勾配、２分間、ＢＥＨ Ｃ１８ ２．１×５０ｍｍ）によって反応をモニタした。
ＬＣ−ＭＳによって所望の生成物が観察された。０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８（５ｍｌ）で反応をクエンチした。この反応物を振盪機に１５分間入れ、次に１５ｍＬ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ膜を使用して水（１×）で透析した（４２００ｒｐｍ、１５分、４℃）。
反応混合物をイオン対形成クロマトグラフィー（５〜２５％水／アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム含有、３５分間、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ １９×１５０ｍｍ）によって精製した。生成物画分をプールし、１５ｍＬ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ膜を使用して水で３回透析し（４２００ｒｐｍ、１５分間、４℃）、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて凍結乾燥すると、無定形の白色固体、化合物Ａ２（１８ｍｇ）が得られた。
ｂ．センス鎖Ａ３の合成
１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルにおいて、化合物Ｏｒｇａｎｉｘ １（２７．６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（２００ｕＬ）に溶解した。別個の１５ｍｌ ｆａｌｃｏｎチューブにおいて、化合物Ａ２（５０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を水（２０００ｕＬ）に溶解し、ＤＭＳＯ（２００ｕＬ）で希釈した。Ｇ３を含有する溶液を、化合物Ａ２を含有する溶液に添加し、続いてトリエチルアミン（３０．６７ｕｌ）を添加した。
得られた溶液を振盪機に置き、所望の生成物の形成に関してＵＰＬＣ−ＭＳによってモニタした。反応混合物をイオン対形成クロマトグラフィー（５〜４０％水／アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム含有、３５分間、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ １９×１５０ｍｍ）によって精製した。生成物画分をプールし、１５ｍＬ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ膜を使用して水で３回透析し（４２００ｒｐｍ、１５分、及び４℃）、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて凍結乾燥すると、無定形の白色固体、センス鎖Ａ３が得られた。
ｃ．二重鎖Ａ５の合成
センス鎖Ａ３（１３．０８ｍｇ）をＤＩ水（５ｍｌ）に溶解し、水（０．８１２ｍｌ）中のアンチセンス鎖Ａ４（Ａ３に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）、商業的に入手した）（０．８１２ｍｇ）が入ったバイアルに添加した。得られた溶液を混合し、９０℃に３分間加熱し、室温に５分間放冷した。この溶液を凍結乾燥すると、無定形の白色固体として二重鎖、二重鎖Ａ５が得られた。
実施例１２．ループに３個のＧａｌＮａｃリガンドを有するステム−ループｄｓＮＡの合成
ループにＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するステム−ループオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮａｃコンジュゲートステム−ループオリゴマーの合成を示し、ここでＧａｌＮａｃ単量体はループに限定され、２３３〜２３４頁に示されるとおり個数は３個である（スキームＢ）。
センス鎖Ｂ１及びセンス鎖Ｂ３の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンスＢ４と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｂ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ２の合成と同様の方法で合成した。センス鎖Ｂ３は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｂ５は、上記に記載したとおりの化合物Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１３．ループに分枝状ＧａｌＮＡｃリガンドを有するステム−ループｄｓＮＡの合成
ループにＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するステム−ループオリゴマーを生成した。スキームＣは、ＧａｌＮａｃコンジュゲートステム−ループオリゴマーの合成を示し、ここでＧａｌＮａｃ単量体はループに限定され、スキームＣ（２３５〜２３６頁を参照）に３ＧＴ３として示されるとおりのトリアンテナリーＧａｌＮＡｃリガンドを含有する。
センス鎖Ｃ１及びＣ３の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｃ４と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｃ２は、上記に記載したとおりの化合物Ａ２の合成と同様の方法で合成した。
１５ｍｌ ｆａｌｃｏｎチューブにおいて、センス鎖Ｃ２（２４ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を水（４００ｕＬ）に溶解し、次にＤＭＳＯ（１０００ｕｌ）で希釈した。別個の１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルにおいて、化合物３ＧＴＳ（４０．７９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１５０ｕＬ）に溶解した。３ＧＴＳを含有するこの溶液に、ＤＭＳＯ（５０ｕｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．２ｕｌ、０．０４７ｍｍｏｌ）中ＨＡＴＵ（（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシジヘキサフルオロホスフェート、８．９３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、この反応混合物に、センス鎖Ｃ２を含有する溶液を添加した。
反応混合物を振盪機に置き、所望の生成物の形成に関してＵＰＬＣ−ＭＳによってモニタした。反応混合物をイオン対形成クロマトグラフィー（５〜４０％水／アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム含有、３５分間、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ １９×１５０ｍｍ）によって精製した。生成物画分をプールし、１５ｍＬ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ膜を使用して水で３回透析し（４２００ｒｐｍ、１５分、及び４℃）、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて凍結乾燥すると、無定形の白色固体、センス鎖Ｃ３が得られた。二重鎖Ｃ５は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１４．ステムに４個のＧａｌＮＡｃリガンドを有するステム−ループｄｓＮＡの合成
ステムにＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するステム−ループオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮａｃコンジュゲートステム−ループオリゴマーの合成を示し、ここでＧａｌＮａｃ単量体はステムに限定され、２３７〜２３８頁に示されるとおり、個数は４個である（スキームＤ）。
センス鎖Ｄ１及びＤ３の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｄ４と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｄ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ２の合成と同様の方法で合成した。センス鎖Ｄ３は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｄ５は、上記に記載したとおりの化合物Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１５ アンチセンス鎖の５’伸長部に複数のＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡオリゴマーの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部領域にＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはアンチセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個である（スキームＥ、２３９〜２４０頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、アンチセンス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。
アンチセンス鎖Ｅ１及びＥ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（センス鎖Ｅ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。アンチセンス鎖Ｅ２は、上記に記載したとおりのスキームと同様の方法で合成した。二重鎖Ｅ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１６．センス鎖の５’伸長部に複数のＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長部領域にＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個である（スキームＦ、２４１〜２４２頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、センス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。
センス鎖Ｆ１及びＦ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｆ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｆ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｆ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１７．スペーサーによって隔てられているセンス鎖の５’伸長部上に１個のスペーサーによって隔てられている複数のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長部領域にスペーサーによって隔てられているＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個である（スキームＧ、２４３〜２４４頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、センス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。スペーサーによって隔てられているＧａｌＮＡｃリガンドを含む伸長部はまた、アンチセンス鎖の５’領域に置くこともできる。
センス鎖Ｇ１及びＧ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｇ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｇ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｇ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１８．センス鎖の５’伸長部上に２個のスペーサーによって隔てられている複数のＮ−アセチルガラクトサミンリガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長部領域に２個のスペーサーによって隔てられているＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個である（スキームＨ、２４５〜２４６頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数、スペーサーの個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、センス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。スペーサーによって隔てられているＧａｌＮＡｃリガンドを含む伸長部はまた、アンチセンス鎖の５’領域に置くこともできる。
センス鎖Ｈ１及びＨ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｈ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｈ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｈ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例１９．センス鎖の５’伸長部に複数のスペーサーによって二重鎖と隔てられている複数のＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡオリゴマーの合成
センス鎖の５’伸長部領域に複数のスペーサーによって二重鎖領域と隔てられているＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個であり、複数のスペーサーによって二重鎖と隔てられている（スキームＩ、２４７〜２４８頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数、スペーサーの個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、センス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。スペーサーによって二重鎖と隔てられているＧａｌＮＡｃリガンドを含む伸長部はまた、アンチセンス鎖の５’領域に置くこともできる。
センス鎖Ｉ１及びＩ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｉ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。センス鎖Ｉ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｉ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例２０．アンチセンス鎖の５’伸長部に２個のスペーサーによって隔てられている複数のＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡオリゴマーの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部領域に２個のスペーサーによって隔てられているＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはアンチセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個である（スキームＪ、２４９〜２５０頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数、スペーサーの個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、アンチセンス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。スペーサーによって隔てられているＧａｌＮＡｃリガンドを含む伸長部はまた、センス鎖の５’領域に置くこともできる。
アンチセンス鎖Ｊ１及びＪ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｊ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。アンチセンス鎖Ｊ１、Ｊ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｊ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例２１ アンチセンス鎖の５’伸長部に複数のスペーサーによって二重鎖と隔てられている複数のＧａｌＮＡｃリガンドを有するｄｓＮＡオリゴマーの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部領域に複数のスペーサーによって二重鎖領域と隔てられているＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体を有するｄｓＮＡオリゴマーを生成した。以下のスキームは、ＧａｌＮＡｃリガンドを含むｄｓＮＡオリゴマーの合成を示し、ここでリガンドはアンチセンス鎖の５’領域の伸長部に限定され、個数は４個であり、複数のスペーサーによって二重鎖と隔てられている（スキームＫ１、２５２〜２５３頁を参照）。しかしながら、ＧａｌＮａｃコンジュゲート単量体の個数、スペーサーの個数は異なってもよく、ＧａｌＮＡｃリガンドの位置もまた、アンチセンス鎖に沿ったどこにでも異なってよい。スペーサーによって二重鎖と隔てられているＧａｌＮＡｃリガンドを含む伸長部はまた、センス鎖の５’領域に置くこともできる。
アンチセンス鎖Ｋ１及びＫ２の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）（アンチセンス鎖Ｋ３と称される）は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって入手した。アンチセンス鎖Ｋ１及びＫ２は、上記に記載したとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成した。二重鎖Ｋ４は、上記に記載したとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成した。
実施例２２．培養下のマウス肝細胞に対するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＤｓｉＲＮＡのインビトロ自己送達
８〜１０週齢のＣＤ−１又はＣ５７−ＢＬ／６雌マウスを使用して初代肝細胞を調製した。イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を用いてマウスを麻酔した。麻酔後、腹腔を開き、大静脈に１８ゲージカテーテルを挿管し、門脈を切断して肝臓から血液を排出させた。肝臓を灌流緩衝液［ＨＢＳＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）］によって５ｍｌ／分の流量で５〜１０分間、潅流液が澄明になるまで灌流した。次に肝臓を３７℃のコラゲナーゼ緩衝液ＩＩ［ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）、０．８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］によって５〜１０分間灌流した。消化した肝臓を冷溶液ＩＩＩ［ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）］に移し、細かく刻んだ。細胞懸濁液を７０μｍメッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通し、５０×ｇで３分間遠心した。上清を廃棄し、ペレットを冷溶液ＩＩＩで更に２回洗浄し、続いて解凍及びプレーティング補助剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むウィリアム緩衝液で１回洗浄した。肝細胞の生存度及び濃度は、トリパンブルー色素排除法及び血球計のカウントによって推定した。コラーゲンＩ被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に細胞をウェル当たり５×１０４細胞の濃度でプレーティングし、加湿雰囲気下３７℃、５％ＣＯ２で４〜５時間インキュベートした。培地を、維持補助剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むウィリアム培地に交換し、その培地に様々な濃度のＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴヌクレオチドを添加して、細胞を２４時間インキュベートした後、培地を新しくし、細胞を更に２４時間成長させた。次に細胞を溶解させて、ＳＶ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＲＮＡを精製し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ第１鎖合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＲＮＡを逆転写した。
標的遺伝子の相対量をＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６システムでの多重ｑＰＣＲによって計測し、多重ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。未治療対照と比べた選択の転写物の残留パーセントを計算し、非線形回帰によってＩＣ５０値を推定した。選択の化合物／コンジュゲートのインビトロ自己送達（トランスフェクション剤を使用しない）データの例を図２５Ａ及び図２５Ｂに示す。図２５Ａは、伸長部を有するｄｓＮＡ分子の活性を示し、図２５Ｂは、テトラループを有するｄｓＮＡ分子の活性を示す。伸長部分子は、図中の図形的凡例（ｄｉｇｒａｍａｔｉｃ ｋｅｙｓ）によって示されるとおり、修飾のパターン及び性質が互いに異なる。同様に図２５Ｂのテトラループ分子も、修飾のパターン及び性質が互いに異なる。ｄｓＮＡ分子の配列情報は表３に示す。これらのデータは、５’伸長部及びニック入りテトラループを含むＧａｌＮＡｃ ｄｓＮＡコンジュゲートが培養下の初代肝細胞に低いｎＭ ＩＣ５０で自己送達することを実証した。
実施例２３．ＣＤ３０１に対するインビトロ無細胞結合
一価及びトリアンテナリーのＮ−アセチルガラクトサミンコンストラクトの結合を、蛍光偏光競合結合アッセイを用いて推定した。トレーサーリガンドは、カスタム合成したＦＩＴＣ−トリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミンコンストラクト、３ＧＴ１’−ＦＩＴＣであった。４μｇ／ｍｌの一定濃度のマクロファージアシアロ糖タンパク質受容体、ＣＤ３０１（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び５０ｎＭ ３ＧＴ１’−ＦＩＴＣを２５℃で結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中において様々な濃度の本発明のｄｓＮＡと共にインキュベートした。３０分後にＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で蛍光偏光計測を行った。ｄｓＮＡコンジュゲートの結合は、ＣＤ３０１からの３ＧＴ１’−ＦＩＴＣの変位による偏光単位の低下として推定した。各ｄｓＮＡコンジュゲートの相対的結合は、非線形回帰及びＩＣ５０値の計算によって推定される。選択の化合物／コンジュゲートのインビトロ結合データの例を図１３に示す。これらのデータは、５’伸長部及びニック入りテトラループをベースとするｄｓＮＡコンジュゲートがＡＳＧＰｒに有効に結合し、多くの場合に、トリスリンカーベースのトリアンテナリーＧａｌＮＡｃ（ＤＰ２４６５Ｐ：ＤＰ２３８２Ｇ）と比較したときより良好な結合親和性を示したことを実証した。
アセタールリンカーを介してＧａｌＮＡｃリガンドに連結したｄｓＮＡコンジュゲート（合成については実施例２５を参照）と、２’−トリアゾールリンカーを介してＧａｌＮＡｃリガンドに連結したｄｓＮＡコンジュゲートとのＣＤ３０１に対する無細胞結合は同等であった（図４８）。これらの２つのｄｓＮＡ剤は同じ核酸配列及びＧａｌＮＡｃリガンドを含有し、これらの２つの薬剤の間で異なるのはリンカーのみであった。図４８からの２’−トリアゾールリンカーを含むｄｓＮＡコンジュゲートと、同じトリアゾールリンカーを含むが図４８のアセタールリンカーと同じＰＥＧリンカー長さを有するｄｓＮＡコンジュゲートとの無細胞結合もまた、同等であった（図４９を参照）。これは、２’−トリアゾールリンカーの代わりにアセタールリンカーを使用しても、ｄｓＮＡコンジュゲートの結合は損なわれなかったことを示している。標的のノックダウン又は受容体との結合の点で、ｄｓＮＡ分子の活性はリンカーの長さの増加又は減少に起因する影響を大きくは受けなかったことが指摘される点は興味深い。アセタールリンカーが核酸合成の厳しさを生き残ることができ、且つインビボ／インビトロ条件下でなおも機能性であって、受容体にコンジュゲートを送達したことが分かった点は意外であった（図４８〜図５０を参照）。
トリアゾールリンカーを含むがリンカーのＰＥＧセグメントの長さが異なる上記に記載する２つのｄｓＮＡ ＧａｌＮＡｃのインビトロノックダウン効力を試験した。図５０は、これらの２つのｄｓＮＡコンジュゲートがマウスにおいて同等の固有のノックダウン効力を有したことを示し、リンカーのＰＥＧ長さを変更してもｄｓＮＡ剤のインビボ機能は変化しなかったことを実証している。
ＧａｌＮＡｃリガンド、ＧａｌＮＡｃ含有単量体、及びＧａｌＮＡｃオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を以下の例及び合成スキームに記載する。以下に記載する化合物及び／又はコンジュゲートに用いる具体的なオリゴヌクレオチド配列は、表３に示す。
実施例２４．ＲＮＡｉ安定性、免疫原性、及び活性のインビボ評価
野生型の又は罹患した遺伝子操作マウスに、２００ｕｌ未満の容積で皮下注射又は静脈内注射によって投与した。動物の行動学的又は生理学的変化を観察した。薬物動態学的及び薬力学的分析のため、指示されるとおりの最終投与後２４〜１６８時間で動物をＣＯ２窒息によって犠牲にした。血液及び組織試料を標準手順に従い採取した。ｍＲＮＡ分析のため、組織は、後に標準プロトコルに従いＲＴ−ｑＰＣＲを実施するまでフリーザーに保存した。ウェスタン及び免疫組織化学分析用の凍結組織もまた採取した。試験経過中は尿試料を採取し、酵素法又はＬＣ／ＭＳ法を用いて代謝産物に関してアッセイした。サイトカイン、血球細胞カウント及び血液化学分析を標準手順に従い行った。選択の化合物／コンジュゲートのインビボデータの例を図２７、図２８、図２９及び図３０に示す。これらのデータは、センス鎖における５’伸長部及びニック入りテトラループコンストラクトを含むＧａｌＮＡｃ ｄｓＮＡコンジュゲートが、マウスにおいて皮下及び静脈内投与時にインビボで標的ｍＲＮＡのノックダウン活性を示すことを実証した。
実施例２５．２’−アセタールリンカーを介して連結したＧａｌＮＡｃを有するＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート型ホスホロアミダイト単量体の合成
ＧａｌＮＡｃリガンドは、ヌクレオシド単量体の核酸塩基（即ち実施例８、９に示されるとおりチミジンのＣ５位置）に付加し得るのみならず、リンカーで２’−ＯＨ（又は３’−ＯＨ）を介してリボース糖にもまた付加し得る。コンジュゲーション部位としての２’−ＯＨは、テトラループＤｓｉＲＮＡの場合に特に有用であり、なぜならループの４つのヌクレオチドの２’−ＯＨは溶媒に露出し、その結晶構造に基づいた安定したループの形成に必要な水素結合及び塩基スタッキングに関与しないためである。リンカーを２’−ＯＨに導入するために用いられるアセタール化学（以下のスキームＩＶ〜ＶＩに図示される、２１５〜２１７頁を参照のこと）は、従来のアルキル化条件と比較してはるかに穏やかである；従って、２’位への選択的なコンジュゲーションが可能となる。これにより、時間のかかる２’及び３’異性体の混合物の分離をしなくて済み、収率が大幅に改善される。化合物２〜４の合成をスキームＩＶに示し、化合物５〜９の合成をスキームＶに示し、及び化合物１０及び１１の合成をスキームＶＩに示す（２１５〜２１７頁を参照）。
ａ．化合物２の合成
２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１０５．０ｇ）、トリエチルアミン（１０１．０ｇ）及びトリフルオロ酢酸エチルをフラスコに加え、この混合物を２４時間撹拌した。ジクロロメタン（１Ｌ）を添加し、この溶液を水（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させると、液体（１６１．０ｇ）が得られた。
ｂ．化合物３の合成
塩化メチレン（２００ｍｌ）中化合物２（１６１．０ｇ）及びパラホルムアルデヒド（２４．０）の混合物を氷浴中で撹拌しながら冷却した。無水塩化水素を混合物全体にわたって３時間発泡させた。反応混合物を室温以下にし、２つの澄明な均一層を分離した。有機層を無水塩化カルシウムで乾燥させて、ロータリーエバポレータで濃縮すると、液体（２０１ｇ）になった。
ｃ．化合物４の合成
得られた化合物３をアセトニトリル（２００ｍｌ）に溶解し、酢酸ナトリウム（１００ｇ）を添加した。混合物を室温で１４時間撹拌した。沈殿物をろ去し；ろ液をロータリーエバポレータで液体になるまで濃縮した。残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）及び水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、ロータリーエバポレータで濃縮すると、液体（１７６．０ｇ）になった（ＭＳ Ｍ−１：２７２．０）。
ｄ．化合物６９の合成
１，２−ジクロロメタン（５００ｍｌ）中ヌクレオシド５（６１．３ｇ）及び化合物４（５５ｇ）の窒素下冷溶液（−１５℃）に四塩化スズ（１８ｍｌ）を添加し、この溶液を−１２℃に２０分間保った。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍｌ）及び塩化メチレン（１Ｌ）を添加し、懸濁液を０℃で２０分間撹拌した。この懸濁液をろ過し、有機層を分離し、水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルでカラムクロマトグラフィー精製した。塩化メチレン−メタノール（１００：０〜９５：５）でカラムを溶出させて、次に適切な画分を蒸発させると、化合物６が泡として得られた（５５．２ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：８２５．４）。
ｅ．化合物７の合成
ヌクレオシド６（５５ｇ）をテトラヒドロフラン（１Ｌ）中０．５Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム三水和物に溶解し、１０分間２０℃に保ち、蒸発乾固させ、クロロホルム（１０ｍｌ）で蒸発させて、シリカゲルを含むカラムに適用した。カラムを塩化メチレン−メタノール（１００：０〜９０：１０）で溶出させて、次に適切な画分を蒸発させると、化合物７が泡として得られた（３０．５ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：５８３．２）。
ｆ．化合物８の合成
ピリジン（２×２０ｍｌ）で蒸発させることによりヌクレオシド７（３０．０ｇ）を乾燥させた。残渣を乾燥ピリジン（３００ｍｌ）に溶解し、ジメトキシトリチル塩化物（１８．２ｇ）を添加し、得られた溶液を２０℃に１６時間保った。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を添加し、３０分後にこの混合物をほぼ乾固するまで真空濃縮した。残渣を塩化メチレン（５００ｍｌ）に溶解し、１０％重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）及び水（２×２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸発させ、トルエン（２×１００ｍｌ）で蒸発させて、シリカゲルでカラムクロマトグラフィー精製した。カラムを塩化メチレン−メタノール（１００：０〜９０：５）で溶出させて、次に適切な画分を蒸発させると、化合物８が泡として得られた（４０．５ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：８８５．３）。
ｇ．ホスホラミダイト［化合物９］の合成
ジメトキシトリチル化誘導体８（４０．０ｇ）をアルゴン下で６００ｍｌジクロロメタンに溶解し、エチル−（ジイソプロピル）アミン（１０ｍｌ）及び２−シアノエチルジイソプロピルホスホラミドクロリダイト（１６．０ｇ）を添加した。この溶液を３時間撹拌した後、ＴＬＣによって反応の完了が示された。１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を添加し、溶液を１０分間撹拌し、塩化メチレン（５００ｍｌ）と炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）とに分配した。有機相を塩化ナトリウム水溶液（２×３００ｍｌ）で洗浄し、水相を塩化メチレン（２００ｍｌ）で逆抽出した。有機物を蒸発させると油が残り、これをシリカゲルでフラッシュ精製すると（ヘキサン−酢酸エチル、２０：８０）、共蒸発後に生成物が泡として得られた（３６．５ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：１０８５．４）。ヌクレオシド１０から上記の記載と同様にして化合物１１を作製した。同様にスキームＶＩＩ（２１８〜２１９頁を参照）及びＶＩＩＩ（２２０頁を参照）は化合物１７の生成を示し、化合物１７の作製に上述の手順を採用することができる。
実施例２６．ループ上にコレステロールリガンドを有するコレステロールコンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
本発明のコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成用に確立されたプロトコルに従い生成し得る。本発明のコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、標準的なクリックケミストリー法又はアミドケミストリー法による固相後コンジュゲーションを用いることによって合成する。一実施形態において、本発明のコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、コレステロールホスホラミダイトを使用した固相合成によって作製する。
ループにコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＬ（２５６〜２５７頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｋ２は、スキームＫｂ（２５４〜２５５頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。一実施形態において、ループにコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡは、例えばスキームＬ１（２５８〜２５９頁を参照）に示されるとおり、アミドケミストリーを用いて生成する。スキームＬ及びＬ１は、コレステロールコンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡの合成を示し、ここでコレステロール単量体はループに限定され、個数はただ１個である。同様にスキームＭ（２６０〜２６１頁を参照）もコレステロールコンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここでコレステロール単量体はループに限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例２７．ステムにコレステロールリガンドを有するコレステロールコンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
ステムにコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＮ（２６２〜２６３頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｋ２は、スキームＫｂに示されるプロトコルに従い生成する。スキームＮ（２６２〜２６３頁を参照）は、コレステロールコンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡの合成を示し、ここでコレステロール単量体はステムに限定され、個数はただ１個である。同様にスキームＯ（２６４〜２６５頁を参照）もコレステロールコンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここでコレステロール単量体はステムに限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及び相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例２８ アンチセンス鎖の５’伸長部にコレステロールリガンドを有するｄｓＮＡの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部にコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子を、例えばスキームＰ（２６６〜２６７頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｋ２は、スキームＫｂ（２５４〜２５５頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成し得る。
スキームＰ１（２６８〜２６９頁を参照）は、コレステロールホスホラミダイトを使用したコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここでコレステロール単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定され、個数はただ１個である。しかしながらコレステロールコンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドは、アンチセンス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、５番目の位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートすることができる。スキームＱ（２７０〜２７１頁を参照）は、クリックケミストリーを用いたｄｓＮＡ分子へのコレステロールの固相後コンジュゲーションを示し、ここでコレステロール単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定されるが、個数は複数個である。スキームＱ１（２７２〜２７３頁を参照）は、コレステロールホスホラミダイトを使用したコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここでコレステロール単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示される二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成するものとする。
実施例２９ センス鎖の５’伸長部にコレステロールリガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長部にコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子を、例えばスキームＲ（２７４〜２７５頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｋ２は、スキームＫｂに示されるプロトコルに従い生成する。
スキームＲ１（２７６〜２７７頁を参照）は、コレステロールホスホラミダイトを使用したコレステロールコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここでコレステロール単量体はセンス鎖の５’伸長部に限定され、個数はただ１個である。しかしながらコレステロールコンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドはセンス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、５番目の位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートされる。先に考察した合成スキームを用いて、コレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドの個数、並びにコレステロールリガンドの位置は変わり、例えばリガンドは、センス鎖に沿ったどこにあってもよい。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３０．センス鎖の５’伸長部に１個以上のスペーサーによって隔てられている複数のコレステロールリガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長領域にコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを有するｄｓＮＡであって、ヌクレオチドが本発明に係るスペーサーによって隔てられているｄｓＮＡを、ＧａｌＮＡｃリガンドを含む同様のｄｓＮＡ分子の合成用に開発されたプロトコルに従い生成する。スキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫ（２４３〜２５４頁を参照）はＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成について記載し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは１個以上のスペーサーによって隔てられている。コレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドは、ステム領域、又はループ領域、センス鎖の５’伸長部、又はアンチセンス鎖の５’伸長部、センス鎖の３’伸長部、又はアンチセンス鎖の３’伸長部又は前記選択肢の任意の組み合わせのいずれかにあってもよい。スキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫはＧａｌＮＡｃリガンドコンジュゲーションに特異的に生成し、コレステロールリガンドコンジュゲートを伴う生成に容易に適合及び改良される。ヌクレオチドに対するリガンドのコンジュゲーション方法は同様であり、クリックケミストリー若しくはアミドケミストリーによる合成後コンジュゲーション又はリガンドホスホラミダイトを用いた固相合成によって行われ得る。
実施例３１．ループ上に葉酸塩を有する葉酸塩コンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成用に確立されたプロトコルに従い生成する。本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、標準的なクリックケミストリー法又はアミドケミストリー法による固相後コンジュゲーションを用いることによって合成する。一実施形態において、本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、葉酸塩ホスホラミダイトを使用した固相合成によって作製する。
ループに葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＵ（２８１〜２８２頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｓ６（クリックケミストリー）又はＳ１３（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＳ（２７８〜２７９頁を参照）及びＴ（２８０頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。化合物Ｔ７及びＳ１３の生成は、先述のとおりのＧａｌＮＡｃコンジュゲートの作製に用いたのと同じプロトコルに従うそれぞれスキームＴ及びＳに示す。一実施形態において、ループに葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡは、例えばスキームＵ１に示されるとおり、アミドケミストリーを用いて生成する。スキームＵ（２８１〜２８２頁を参照）及びＵ１（２８３頁を参照）は、葉酸塩コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡの合成を示し、ここで葉酸塩単量体はループに限定され、個数はただ１個である。同様にスキームＶ（２８４〜２８５頁を参照）及びＶ１（２８６〜２８７頁を参照）は、葉酸塩コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここで葉酸塩単量体はループに限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３２．ステムに葉酸塩を有する葉酸塩コンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
ステムに葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＷ（２８８〜２８９頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物Ｓ６（クリックケミストリー）又はＳ１３（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＳ（２７８〜２７９頁を参照）及びＴ（２８０頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。スキームＷ１（２９０〜２９１頁を参照）は、アミドケミストリーを用いた葉酸塩コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡの合成を示し、ここで葉酸塩単量体はステムに限定され、個数はただ１個である。同様にスキームＸ（２９２〜２９３頁を参照）及びＸ１（２９４〜２９５頁を参照）は、葉酸塩コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここで葉酸塩単量体はステムに限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３３ アンチセンス鎖の５’伸長部に葉酸塩リガンドを有するｄｓＮＡの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部に葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子を、例えばスキームＹ（２９６〜２９７頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成し得る。合成に必要な化合物Ｓ６（クリックケミストリー）又はＳ１３（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＳ（２７８〜２７９頁を参照）及びＴ（２８０頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成し得る。
スキームＹ１（２９８〜２９９頁を参照）は、葉酸塩ホスホラミダイトを使用した葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここで葉酸塩単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定され、個数はただ１個である。しかしながら葉酸塩コンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドは、アンチセンス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、又は５番目の位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートすることができる。スキームＺ（３００〜３０１頁を参照）は、クリックケミストリーを用いたｄｓＮＡ分子への葉酸塩の固相後コンジュゲーションを示し、ここで葉酸塩単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定されるが、個数は複数個である。スキームＺ１（３０２〜３０３頁を参照）は、葉酸塩ホスホラミダイトを用いた葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここで葉酸塩単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定されるが、個数は複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３４ センス鎖の５’伸長部に葉酸塩リガンドを有するｄｓＮＡの合成
本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成用に確立されたプロトコルに従い生成する。本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、標準的なクリックケミストリー法又はアミドケミストリー法による固相後コンジュゲーションを用いることによって合成する。一実施形態において本発明の葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、葉酸塩ホスホラミダイトを使用した固相合成によって作製する。
センス鎖の５’伸長部に葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子は、例えばスキームＡＡ（３０４〜３０５頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成する。合成用の化合物Ｓ６（クリックケミストリー）又はＳ１３（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＳ（２７８〜２７９頁を参照）及びＴ（２８０頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。
スキームＡＡ１（３０６〜３０７頁を参照）は、葉酸塩ホスホラミダイトを使用した葉酸塩コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここで葉酸塩単量体はセンス鎖の５’伸長部に限定され、個数はただ１個である。しかしながら葉酸塩コンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドは、センス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目又は５番目の位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートすることができる。先に考察した合成スキームを用いて、葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドの個数、並びに葉酸塩リガンドの位置を変えてもよく、例えばリガンドは、センス鎖に沿ったどこにあってもよい。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３５．センス鎖の５’伸長部に１個以上のスペーサーによって隔てられている複数の葉酸塩リガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長領域に葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドを有するｄｓＮＡであって、ヌクレオチドがスペーサーによって隔てられているｄｓＮＡを、同様のｄｓＮＡ分子（ここでリガンドはＧａｌＮＡｃである）の合成用に開発されたプロトコルに従い生成する。スキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫ（２４３〜２５４頁を参照）はＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成について記載し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは１個以上のスペーサーによって隔てられている。葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチドは、センス鎖の５’伸長部、アンチセンス鎖の５’伸長部、センス鎖の３’伸長部、又はアンチセンス鎖の３’伸長部又は前記選択肢の任意の組み合わせにあってもよい。ＧａｌＮＡｃリガンドコンジュゲーションに特異的なスキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫは、葉酸塩リガンドコンジュゲートの生成に容易に適合及び改良される。ヌクレオチドへのリガンドのコンジュゲーション方法は類似しており、多くの場合にクリックケミストリー若しくはアミドケミストリーによる合成後コンジュゲーション又はリガンドホスホラミダイトを使用した固相合成によって行われる。スキームＶ（２８４〜２８５頁を参照）及びＶ１（２８６〜２８７頁を参照）は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートに関して先述したとおりのクリックケミストリーを利用する固相後コンジュゲーション法を用いた、ループ上に複数の葉酸塩を有する葉酸塩ニック入りテトラループｄｓＮＡコンジュゲートの合成を示す。
実施例３６．ループ上にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドを有するマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
本発明のマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成用に確立されたプロトコルに従い生成する。本発明のマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子は、標準的なクリックケミストリー法又はアミドケミストリー法による固相後コンジュゲーションを用いることによって合成する。
ループにマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＡＢ（３０８〜３０９頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物１１４（クリックケミストリー）又は化合物１０８（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＩＸ（２２１頁を参照）及びＸ（２２２〜２２３頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。一実施形態において、ループにマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡは、例えばスキームＡＣ（３１０〜３１１頁を参照）に示されるとおり、アミドケミストリーを用いて生成する。スキームＡＢ（３０８〜３０９頁を参照）及びＡＣ（３１０〜３１１頁を参照）は、マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）単量体はループに限定され、合成後方法によって生成する。同様にスキームＡＤ（３１２〜３１３頁を参照）及びＡＥ（３１４〜３１５頁を参照）は、マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用したマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）単量体はループに限定される。スキームＡＤ（３１２〜３１３頁を参照）では、リガンドマンノース−６−リン酸は２’−トリアゾールリンカーを使用してヌクレオチドに連結され、スキームＡＥでは、リガンドマンノース−６−リン酸は２’−アセタールリンカーを使用してヌクレオチドに連結される。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３７．ステムにマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドを有するマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ニック入りテトラループｄｓＮＡの合成
ステムにマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有するステム−ループｄｓＮＡを、例えばスキームＡＦ（３１６〜３１７頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーを用いて生成する。合成に必要な化合物１１４（クリックケミストリー）又は化合物１０８（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＩＸ（２２１頁を参照）及びＸ（２２２〜２２３頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。スキームＡＦ（３１６〜３１７頁を参照）は、クリックケミストリーを用いたマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ステム−ループｄｓＮＡの合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）単量体はステムに限定され、複数個である。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例３８ アンチセンス鎖の５’伸長部にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドを有するｄｓＮＡの合成
アンチセンス鎖の５’伸長部にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子を、例えばスキームＡＧ（３１８〜３１９頁を参照）に示されるとおり、クリックケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成する。合成に必要な化合物１１４（クリックケミストリー）又は化合物１０８（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＩＸ（２２１頁を参照）及びＸ（２２２〜２２３頁を参照）に示されるプロトコルに従い生成する。
スキームＡＧ（３１８〜３１９頁を参照）は、合成後（ｐｏｓｔｓｙｎｔｈｅｉｃ）コンジュゲーションを用いたマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）単量体はアンチセンス鎖の５’伸長部に限定される。しかしながらマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドは、アンチセンス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目又は５番目の位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートすることができる。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート（ｃｏｍｊｕｇａｔｅ）を含有するｄｓＮＡ分子の同様の変形例をスキームＡＩ、ＡＪ、ＡＫ、ＡＬ及びＡＭ（３２２〜３３１頁を参照）に示す。これらは、先述のとおりのＧａｌＮａｃ及びコレステロールコンジュゲート用に設計された同じプロトコルに従い合成される。
実施例３９ センス鎖の５’伸長部にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長部にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有する本発明のｄｓＮＡ分子を、例えばスキームＡＨに示されるとおり、アミドケミストリーによる固相後コンジュゲーションを用いて生成し得る。合成用の化合物１１４（クリックケミストリー）又は化合物１０８（アミドケミストリー）は、それぞれスキームＩＸ及びＸに示されるプロトコルに従い生成し得る。
スキームＡＨ（３２０〜３２１頁を参照）は、アミドケミストリーを用いたマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）単量体はセンス鎖の５’伸長部に限定される。スキームＡＮ（３３２頁を参照）は、マンノース−６−リン酸−アミダイトを用いたマンノース−６−リン酸コンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の固相合成を示し、ここでマンノース−６−リン酸単量体はセンス鎖の５’伸長部に限定される。しかしながらマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型単量体の個数は異なってもよく、例えばリガンドは、センス鎖の５’末端又は３’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、５番目若しくは更なる位置又は５番目の位置を越える位置にコンジュゲートすることができる。先に考察した合成スキームを用いて、マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドの個数、並びにマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドの位置を変えてもよく、例えばリガンドは、センス鎖に沿ったどこにあってもよい。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得られる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示す二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成する。
実施例４０．センス鎖の５’伸長部に１個以上のスペーサーによって隔てられている複数のマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）リガンドを有するｄｓＮＡの合成
センス鎖の５’伸長領域にマンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドを有するｄｓＮＡであって、ヌクレオチドがスペーサーによって隔てられているｄｓＮＡを、同様のｄｓＮＡ分子（ここでリガンドはＧａｌＮＡｃである）の合成用に開発されたプロトコルに従い生成する。スキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫ（２４３〜２５４頁を参照）はＧａｌＮＡｃコンジュゲート型ｄｓＮＡ分子の合成について記載し、ここでリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドは１個以上のスペーサーによって隔てられている。
マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）コンジュゲート型ヌクレオチドは、センス鎖の５’伸長部、又はアンチセンス鎖の５’伸長部、又はセンス鎖の３’伸長部、又はアンチセンス鎖の３’伸長部又は前記選択肢の任意の組み合わせにあってもよい。スキームＧ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫはＧａｌＮＡｃリガンドコンジュゲーションに特異的に生成し、コレステロールリガンドコンジュゲートを伴う生成に容易に適合及び改良される。ヌクレオチドに対するリガンドのコンジュゲーション方法は同様であり、クリックケミストリー若しくはアミドケミストリーによる合成後コンジュゲーション又はリガンドホスホラミダイトを用いた固相合成によって行われ得る。
例えば、スキームＡＩ、ＡＪ及びＡＫ（３２２〜３２７頁を参照）は、マンノース−６−リン酸リガンドを含むｄｓＮＡの合成を示し、ここでリガンドはセンス鎖の５’伸長領域に限定され、それぞれ１個又は２個又はそれより多くのスペーサーによって隔てられている。しかしながらマンノース−６−リン酸コンジュゲート型ヌクレオチドの個数は異なってもよく、マンノース−６−リン酸リガンドの位置もまた異なってもよく、例えば、リガンドはセンス鎖に沿ったどこにあってもよい。１個以上のスペーサーによって隔てられているマンノース−６−リン酸リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドはまた、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’領域に位置してもよい。スキームＡＬ及びＡＭ（３２８〜３３１頁を参照）は、マンノース−６−リン酸リガンドを含むｄｓＮＡの合成を示し、ここでリガンドはアンチセンス鎖の５’伸長領域に限定され、それぞれ２個以上のスペーサーによって隔てられている。
前記スキームに示されるとおりのセンス鎖及びその相補アンチセンス鎖は、商業的製造業者から標準的な固相核酸合成手順を用いた合成によって得ることができる。センス鎖は、先述のとおりのセンス鎖Ａ３の合成と同様の方法で合成する。前記スキームに示される二重鎖は、先述のとおりの二重鎖Ａ５の合成と同様の方法で合成するものとする。
実施例４１．ＧａｌＮＡｃアミダイトシントンの合成
５ｌ Ｈ２Ｏ中２−（２−クロロエトキシ）エタノール（１２４．６ｇ）及びナトリウムアジド（１３０ｇ）を還流させながら一晩加熱した。冷却後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２０００ｍｌ）で抽出し、有機層を合わせ、ブライン、無水Ｎａ２ＳＯ４で洗浄し、ろ過し、減圧下で濃縮すると、２−（２−アジドエトキシ）エタノール、液体１０５ｇが得られた。収率：８０％（スキームＸＩ、２２４頁を参照）。２Ｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中１０５ｇの２−（２−アジドエトキシ）エタノール及び２００ｍＬのＥｔ３Ｎの溶液を窒素雰囲気下で０℃に冷却した。この混合物に３０分の時間をかけてＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）中メタンスルホニルクロリド（１１６ｇ）の溶液を滴下して添加し、この溶液を室温に加温し、１．５時間撹拌した。沈殿物をろ去した後、溶媒を蒸発させ、ｎ−ヘキサン及び酢酸エチルの２：１混合物で溶出するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製すると、２−（２−アジドエトキシ）エチルメタンスルホネートが淡黄色の油として得られた（１２６ｇ）。（スキームＸＩ、２２４頁を参照）。
４Ｌの乾燥ＤＭＥ中１２６ｇの化合物３及び１１６．５ｇのカリウムフタルイミドの溶液を窒素雰囲気下に還流させながら１８時間加熱した。室温に冷却して真空濃縮した後、得られた残渣を酢酸エチル（１０Ｌ）で希釈し、固形物をろ過した。ろ液を真空濃縮し、続いてｎ−ヘキサン及び酢酸エチルの４：１混合物で溶出するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製すると、４が無色の固体として得られた（１０３ｇ）。（スキームＸＩ、２２４頁を参照）。
２０００ｍＬの無水エタノール中１００ｇの化合物４及び４０ｍＬの８０％ヒドラジン水和物の溶液を５５℃で２時間加熱し、その間に白色の沈殿物が形成された。この混合物を室温に冷却して真空濃縮し、その後、粗残渣を２０００ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。沈殿物をろ去した後、溶媒を乾燥させて真空濃縮すると、淡黄色の油が得られ、これを次のステップで更なる精製なしに使用した（４５．７ｇ）。ＭＳ Ｍ＋１：１３１．０。
化合物６（１５７ｇ）を乾燥ジクロロメタン（２Ｌ）に溶解した。トリエチルアミン（１００ｍｌ）及びｄｉｃ（７５．７ｇ）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。ジクロロメタン（５００ｍＬ）中化合物５（４５．７）を添加し、反応混合物を２時間撹拌した。この混合物を水（１Ｌ）で洗浄して濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー精製した。所望の生成物をＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（０：１００〜１０：９０）で溶出させた。適切な画分を蒸発させると、化合物７が固体として得られた（１３８．０ｇ）。ＭＳ Ｍ−１：５５８．２。
５’−ＤＭＴ−Ｎ６−ｂｚ−アデノシン（５５１．７ｇ；８０ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（２８３．２ｇ）、ジブチルスズオキシド（ＤＢＴＯ）（２３８．４ｇ）、及び臭化プロパルギル（３３８ｍｌ）、及び乾燥ＤＭＦ（２．５）の混合物を５０℃で２４時間撹拌した。次に混合物を砕氷上に注いだ。この液体をデカントした。ゴム状マスをジクロロメタン（５Ｌ）に溶解し、有機層を蒸留水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次に濃縮した。粗反応混合物をシリカゲルカラムでクロロホルム：ヘキサン：アセトン（５０：４０：１０〜５０：３０：２０）のグラジエント系を使用して精製した。純５’−ＤＭ Ｔ−２’−０−プロパルギル−Ｎ−ｂｚＡの収率は固体として６０．５ｇであった。ＭＳ Ｍ−１ ７１０．２。
化合物７（７１ｇ）及び化合物８（６０．５ｇ）をＴＨＦ（１Ｌ）に溶解した。ＣｕＳＯＳ４．５Ｈ２Ｏ（２．１）及びアスコルビン酸ナトリウム（２．０）を窒素下で添加した。混合物を一晩撹拌した。水（１Ｌ）中ＥＤＴＡ（５ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。トルエン（１Ｌ）を添加し、２層を分離した。有機層を蒸発させて、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製した。所望の生成物をＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（０：１００〜１０：９０）で溶出させた。適切な画分を蒸発させると、化合物９が固体として得られた（９１．０ｇ）。ＭＳ Ｍ−１：１２６９．６。
ジメトキシトリチル化誘導体９（４０．０ｇ）をアルゴン下で６００ｍｌジクロロメタンに溶解し、エチル−（ジイソプロピル）アミン（１０ｍｌ）及び２−シアノエチルジイソプロピルホスホラミドクロリダイト（１５．０ｇ）を添加した。この溶液を３時間撹拌した後、ＴＬＣによって反応完了が示された。１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を添加し、溶液を１０分間撹拌し、塩化メチレン（５００ｍｌ）と炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）とに分配した。有機相を塩化ナトリウム水溶液（２×３００ｍｌ）で洗浄し、水相を塩化メチレン（２００ｍｌ）で逆抽出した。有機物を蒸発させると油が残り、これをシリカゲル（酢酸エチル）でフラッシュ精製すると、生成物が泡として得られた（３４．５ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：１４６９．６）。
５’−ＤＭＴ−Ｎ２−ｉｂｕＧ（３２８ｇ）、臭化テトラブチルアンモニウム（１７７ｇ）、ＤＢＴＯ（１５０ｇ）、臭化プロパルギル（４２０ｍｌ）及び乾燥ＤＭＦ（１．３Ｌ）の混合物を５０℃で２４時間撹拌した。次に混合物を砕氷上に注いだ。この液体をデカントした。ゴム状マスをジクロロメタン（５Ｌ）に溶解し、有機層を蒸留水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムでクロロホルム：ヘキサン：アセトン：メタノール（５０：３０：２０：０〜５０：３０：２０：２）のグラジエント系を使用して精製した。純５’−ＤＭＴ−２’−０−プロパルギル−Ｎ２−ｉｂｕ−Ｇの収率は、固体として４５．０ｇであった。ＭＳ Ｍ−１ ６９２．２。
化合物７（１８．０ｇ）及び化合物１１（１５．０ｇ）をＴＨＦ（３００ｍｌ）に溶解した。ＣｕＳＯＳ４．５Ｈ２Ｏ（０．６ｇ）及びアスコルビン酸ナトリウム（０．５ｇ）を窒素下で添加した。混合物を一晩撹拌した。水（０．５Ｌ）中ＥＤＴＡ（２．０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。トルエン（０．５Ｌ）を添加し、２層を分離した。有機層を蒸発させて、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製した。所望の生成物をＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（０：１００〜１０：９０）で溶出させた。適切な画分を蒸発させると、化合物９が固体として得られた（２４．０ｇ）。ＭＳ Ｍ−１：１２５１．６。
化合物１２（２４ｇ）をアルゴン下で５００ｍｌジクロロメタンに溶解し、エチル−（ジイソプロピル）アミン（８ｍｌ）及び２−シアノエチルジイソプロピルホスホラミドクロリダイト（１０．０ｇ）を添加した。この溶液を３時間撹拌した後、ＴＬＣによって反応完了が示された。１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を添加し、溶液を１０分間撹拌し、塩化メチレン（５００ｍｌ）と炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍｌ）とに分配した。有機相を塩化ナトリウム水溶液（２×３００ｍｌ）で洗浄し、水相を塩化メチレン（２００ｍｌ）で逆抽出した。有機物を蒸発させると油が残り、これをシリカゲル（酢酸エチル）でフラッシュ精製すると、生成物が泡として得られた（１９．５ｇ）（ＭＳ Ｍ−１：１４５１．６）。
化合物１３の合成についての同じプロトコルを少し変更して用いて、以下の化合物を作製する。
表３．
Ｎ−アセチルガラクトサミンリガンド、Ｎ−アセチルガラクトサミン含有ヌクレオチド、及びＮ−アセチルガラクトサミンオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製は、上記の実施例及び合成スキームに記載される。以下に記載する化合物及び／又はコンジュゲートに使用した具体的なオリゴヌクレオチド配列は、表２に示す。
表４．
本発明に係る有用なリンカーとしては、限定はされないが、表３に提供するリンカーが挙げられる。単一リガンドコンジュゲート型ｄｓＮＡが２種類以上のリンカーを含み得る。
表５．
本発明に係る有用なリンカーとしては、限定はされないが、表４に提供するリンカーが挙げられる。
表４は、以下の式Ｙに示される様々な成分の潜在的なリンカー基の組み合わせを示す。
表４は、様々な成分の潜在的なリンカー基の組み合わせを示す。

Claims (89)

  1. ２１〜８３ヌクレオチドを含むセンス鎖、
    １５〜３９ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖、
    １５〜３５塩基対の長さを有する、前記センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖、
    を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、
    前記ｄｓＮＡが前記センス鎖の５’末端と前記アンチセンス鎖の３’末端との間又は前記センス鎖の３’末端と前記アンチセンス鎖の５’末端との間に不連続部を含み、
    前記センス鎖がテトラループを含み、前記テトラループは少なくとも１つのリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含み、且つ
    前記アンチセンス鎖は前記第２鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、そのため前記二本鎖核酸が哺乳動物又は哺乳類細胞に導入されると標的遺伝子発現が低下する、ｄｓＮＡ。
  2. 前記テトラループが１個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  3. 前記テトラループが２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  4. 前記テトラループが３個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  5. 前記テトラループが４個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  6. 前記リガンドの少なくとも１つが前記テトラループのヌクレオチドに対し、前記ヌクレオチドのリボース上の２’ヒドロキシルを介してコンジュゲートしている、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  7. 各リガンドが前記テトラループのヌクレオチドに対し、前記ヌクレオチドのリボース上の２’ヒドロキシルを介してコンジュゲートしている、請求項６に記載のｄｓＮＡ。
  8. 前記リガンドがＧａｌＮＡｃである、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  9. 前記リガンドがマンノース−６−リン酸である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  10. 前記テトラループが３個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含み、前記リガンドの各々がＧａｌＮＡｃである、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  11. 前記テトラループが４個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含み、前記リガンドの各々がＧａｌＮＡｃである、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  12. 前記テトラループの単一のヌクレオチドに２個以上のリガンドが結び付いている、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  13. 前記テトラループの単一のヌクレオチドに３個のリガンドが結び付いている、請求項１２に記載のｄｓＮＡ。
  14. 前記リガンドの各々がＧａｌＮＡｃである、請求項１３に記載のｄｓＮＡ。
  15. 前記アンチセンス鎖が、１５〜３０ヌクレオチド、１８〜２５ヌクレオチド又は１９〜２４ヌクレオチドの長さ範囲を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  16. 前記センス鎖が、１９〜３０ヌクレオチド又は１９〜３６ヌクレオチドの長さ範囲を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  17. 前記二重鎖が、１５〜２２ヌクレオチド又は１５〜３０ヌクレオチドの長さ範囲を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  18. 前記不連続部が、いずれの側にもホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが隣接する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  19. 前記ｄｓＮＡの少なくとも一方の鎖が３’伸長部を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  20. 前記３’伸長部が、１〜２、１〜４、又は１〜６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１９に記載のｄｓＮＡ。
  21. 前記３’伸長部が、１〜１０、１０〜２０又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１９に記載のｄｓＮＡ。
  22. 前記二重鎖が少なくとも１５ヌクレオチドの塩基対合領域を含み、且つ１つ以上のミスマッチを更に含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  23. 前記二重鎖が少なくとも１５ヌクレオチドの塩基対合領域を含み、且つ１〜１０個の連続又は非連続ミスマッチを更に含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  24. リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドの数が、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０ヌクレオチドである、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  25. 少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＮＡであって、１〜３、１〜６、１〜１０又は１〜２０個のスペーサーヌクレオチドを含むｄｓＮＡ。
  26. 少なくとも２個のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｄｓＮＡであって、各リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドが第２のリガンドコンジュゲート型ヌクレオチドと少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドで隔てられている、ｄｓＮＡ。
  27. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドが前記ｄｓＮＡの二重鎖上にある、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  28. 前記リガンドが前記ヌクレオチドの糖及び／又は塩基にコンジュゲートしている、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  29. 前記リガンドが、親油性物質、ステロイド、タンパク質、ビタミン、炭水化物、及びテルペンからなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  30. 前記リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸（ａｄａｍａｎｔｉｎｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、胆汁酸、ＰＥＧ、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール、ペプチド、ペプチド模倣体、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イオドース、グルコース、タロース、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖、エンドソーム分解性成分、ウバオール、ヘコゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン、トリテルペンサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、カチオン性脂質、及び抗体からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  31. 前記リガンドがＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  32. 前記リガンドがコレステロールである、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  33. 前記リガンドがマンノース−６−リン酸である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  34. 少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  35. 前記ｄｓＮＡのヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、糖修飾ヌクレオチド、骨格修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及び非ヌクレオシド類似体からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  36. 前記ヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）又はアンロックド核酸（ＵＮＡ）である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  37. 少なくとも１つのヌクレオチドが糖及び／又は骨格修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  38. ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）修飾からなる群から選択される糖修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  39. ホスホネート、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、ＳＡＴＥ（Ｓ−アシル−２−チオエチル）修飾リン酸、ＢＭＥＧ（イソブチリルメルカプトエチルグリコール）修飾リン酸及び二環式フラノース類似体修飾からなる群から選択される骨格修飾を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  40. 少なくとも１個のホスホロチオエート連結を含有する領域を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  41. １〜５、１〜１０又は１〜２０個のホスホロチオエート連結を含有する領域を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  42. 少なくとも２個の連続したホスホロチオエート連結を含有する領域を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  43. ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、ピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル及びペンタセニルからなる群から選択される核酸類似体を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  44. 前記センス鎖とアンチセンス鎖とが前記二重鎖領域において最大の相補性となるように整列している、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  45. ダイサー切断基質である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  46. ダイサー切断基質でない、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  47. 前記二重鎖が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  48. 前記３’伸長部が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のｄｓＮＡ。
  49. 前記リガンドが非核酸部分である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  50. 前記リガンドがペプチド又は有機化合物である、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  51. 前記有機化合物が色素である、請求項５０に記載のｄｓＮＡ。
  52. 前記有機化合物がコレステロールである、請求項５０に記載のｄｓＮＡ。
  53. 前記非核酸部分が検出可能標識を含む、請求項４９に記載のｄｓＮＡ。
  54. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したときアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に対して増加した結合親和性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  55. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した細胞標的化を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  56. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した細胞取り込みを有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  57. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した細胞分布を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  58. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき向上した送達を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  59. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含むｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加した安定性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  60. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき増加したトラッキングを有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  61. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき標的に対して増加した結合親和性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  62. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき低下した免疫原性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  63. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき改善された薬物動態特性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  64. 前記リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを含む前記ｄｓＮＡが、リガンドコンジュゲート型ヌクレオチドを欠いているｄｓＮＡと比較したとき改善された体内分布特性を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  65. 前記センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端が非修飾リン酸を含有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  66. 前記センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端が、化学修飾されたリン酸を含有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  67. 前記３’伸長部がホスホロチオエート修飾を含む、請求項１９に記載のｄｓＮＡ。
  68. 前記二重鎖が脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  69. 前記センス鎖が、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  70. 前記アンチセンス鎖が、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  71. センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、最大１００％化学修飾されたヌクレオチドからなる、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  72. 前記センス鎖が、修飾ヌクレオチドの非存在下でヌクレアーゼ分解に耐性を示す、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  73. 前記アンチセンス鎖が、修飾ヌクレオチドの非存在下でヌクレアーゼ分解に耐性を示す、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  74. ２つ以上のリガンド種を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  75. ＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド及びコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  76. ＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド及びマンノース−６−リン酸コンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  77. ＧａｌＮａｃコンジュゲート型ヌクレオチド、マンノース−６−リン酸コンジュゲート型ヌクレオチド、葉酸塩コンジュゲート型ヌクレオチド及び／又はコレステロールコンジュゲート型ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  78. 前記ｄｓＮＡ分子が、少なくとも２個のリガンドにコンジュゲートしたヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  79. 以下の式ＩＩ：
    ［式中：
    Ｂは、前記センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成された二重鎖であり；
    Ｍはヌクレオチドであり；
    Ｘはリガンドであり、且つｙの値は０〜４であり；
    Ｌは任意選択のリンカーであり；
    Ｏは、Ｂ及びＥを含むｄｓＮＡであり
    Ｓは任意選択のスペーサーヌクレオチドであり；
    及びｏ１及びｏ２の各々の値は独立に１〜２０であり；
    及びｔの各々の値は独立に３〜８であり；
    Ｃ１及びＣ２はステム二重鎖を形成し、且つＤはループであり；
    Ｅは、Ｄ、Ｃ１、及びＣ２の各々を含むステム−ループであり；
    各Ｐは、ひとまとめにＸ−Ｌ−Ｍ（各々がリガンド修飾ヌクレオチドを表す）であり；
    ｒ１及びｒ２は各々独立に０〜２０であり；及び各ｗは独立に０〜８であり；且つ
    ｏ１はｚ１＋ｒ１の合計であり；ｏ２はｚ２＋ｒ２の合計であり；ｔはｚ＋ｗの合計である］によって表される構造を有する、請求項１に記載のｄｓＮＡ。
  80. ｒ１、ｒ２及びｗが各々独立にゼロであってもよく、但し、ｒ１、ｏ１、ｒ２、ｏ２、ｔ及びｗのうちの少なくとも１つはゼロより大きいものとする、請求項７９に記載のｄｓＮＡ。
  81. 前記センス鎖がステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝０、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝０、ｗ＝１〜４及びｔ＝４］を含む、請求項７９に記載のｄｓＮＡ。
  82. 前記センス鎖がステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝１〜４、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝０、ｗ＝０及びｔ＝４］を含む、請求項７９に記載のｄｓＮＡ。
  83. 前記センス鎖がステム−ループ構造（Ｅ）［式中、ｙ＝１〜３、ｏ１＝６〜８、ｒ１＝０、ｏ２＝６〜８、ｒ２＝１〜４、ｗ＝０及びｔ＝４］を含む、請求項７９に記載のｄｓＮＡ。
  84. 請求項１に記載のｄｓＮＡと薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  85. 請求項１に記載のｄｓＮＡとその使用説明書とを含むキット。
  86. 細胞における標的遺伝子の発現を低減する方法であって、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の請求項１に記載のｄｓＮＡに細胞を接触させるステップを含む方法。
  87. 哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減する方法であって、前記哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減するのに有効な量の請求項１に記載のｄｓＮＡを前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
  88. ｄｓＮＡの効力及び半減期を、前記ｄｓＮＡのヌクレオチドにリガンドをコンジュゲートすることによって増加させる方法であって、前記リガンドが、コレステロール、マンノース−６−リン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅ）、ＧａｌＮＡｃ及び葉酸塩からなる群から選択される、方法。
  89. ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドからなる群から選択される複数のヌクレオチドを提供するステップであって、
    １つ以上のヌクレオチドがリガンドにコンジュゲートしている、ステップと、
    リガンドにコンジュゲートしていないヌクレオチドとリガンドにコンジュゲートしているヌクレオチドとを含むｄｓＮＡを合成するステップであって、
    前記ｄｓＮＡの前記ヌクレオチドが所定のパターンであり、それにより前記ｄｓＮＡが生成されるステップと、
    を含む、請求項１に記載のｄｓＮＡの生成方法。
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