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WO2011111874A1 - 細胞膜透過性ダンベル型rnaおよびその製造方法 - Google Patents

細胞膜透過性ダンベル型rnaおよびその製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2011111874A1
WO2011111874A1 PCT/JP2011/056492 JP2011056492W WO2011111874A1 WO 2011111874 A1 WO2011111874 A1 WO 2011111874A1 JP 2011056492 W JP2011056492 W JP 2011056492W WO 2011111874 A1 WO2011111874 A1 WO 2011111874A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strand
modified
cell membrane
cell
dbrna
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/056492
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
阿部洋
伊藤嘉浩
阿部奈保子
烏田美和子
中嶋裕子
須賀晶子
高橋政代
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人理化学研究所 filed Critical 独立行政法人理化学研究所
Publication of WO2011111874A1 publication Critical patent/WO2011111874A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular

Definitions

  • the present invention relates to a cell membrane-permeable dumbbell-type single-stranded circular RNA and a method for producing the same.
  • RNA interference methods are roughly classified into a method using chemically synthesized double-stranded RNA and a method using a plasmid vector.
  • RNA interference technology using the latter plasmid vector is widely used as biotechnology and is mainly used for basic biology experiments.
  • RNA interference technology is applied to drug development, it seems to be desirable to use the former chemically synthesized double-stranded RNA because the method using a plasmid vector has a problem of safety to the human body.
  • chemically synthesized double-stranded RNA has in vivo instability, that is, it has a problem that it is easily degraded by intracellular enzymes (nucleases).
  • RNA strand into which a non-natural nucleic acid has been introduced has been developed in order to increase the stability of double-stranded RNA in cells.
  • the stability is increased, but the biological activity is lowered. It was.
  • the toxicity given to non-natural nucleic acids is unknown, and its application to pharmaceuticals has been difficult.
  • RNA used for RNA interference is double-stranded RNA having a blunt end or protruding end, RNA having a hairpin structure in which one of double-stranded RNA ends is in a loop shape (Patent Document 1), There is a circular RNA having a stem composed of about 19 base pairs and two loops and having a chemically modified polynucleotide (Patent Document 2). Further, although an RNA-DNA chimera dumbbell-type nucleic acid is disclosed (Patent Document 3), this nucleic acid is not used for RNA interference, and the RNA portion of the dumbbell-type nucleic acid is cleaved by an enzyme in the cell to produce anti-antibody.
  • Patent Document 3 discloses that a nucleic acid has a dumbbell-type structure, and thus has high resistance to nucleolytic enzymes in cells, and stably exists in cells until ribonuclease H acts. It is disclosed that only when a portion is excised, a single-stranded oligonucleotide containing an antisense DNA portion is released into the cell, so that the antisense effect per dose is considered to be increased.
  • an oligonucleotide is synthesized linearly to form a stem portion and a hairpin loop portion, and one place of the target circular dumbbell oligonucleotide (the above hairpin)
  • a circular dumbbell-shaped circular nucleic acid is prepared by obtaining a nick dumbbell-shaped oligonucleotide to which the end of the loop portion is not bonded and ligating the 5 ′ end with ligase (Patent Literature). 3).
  • RNA interference action in a sustained and sustained manner.
  • An object of the present invention is to provide a dumbbell-type single-stranded circular RNA having cell membrane permeability and a method for producing the same.
  • the present inventors can impart cell membrane permeability to the DbRNA by binding a cell membrane permeable peptide to a loop portion of a dumbbell-shaped single-stranded circular RNA (hereinafter referred to as “DbRNA”). Furthermore, it was found that the loop portion of DbRNA is cleaved in the cell to generate a functional double-stranded RNA, which causes the RNA interference effect and the control of the biological action of the target gene, thereby completing the present invention. It came. That is, the present invention includes the following inventions.
  • [1] comprising a sense strand sequence, an antisense strand sequence complementary to the sense strand sequence, and two loop sequences that are the same or different that bind both strands between the sense strand and the antisense strand,
  • the sense strand and the antisense strand pair to form a stem, and one or two of the loop sequences are modified with one or more cell membrane-permeable peptides,
  • a cell membrane-permeable peptide-modified dumbbell-shaped single-stranded circular RNA that has a two-loop sequence in a cell and generates a functional double-stranded RNA.
  • the cell membrane-permeable peptide-modified dumbbell-type single-stranded circular RNA according to any one of [1] to [3] is added to a human-derived cell, and the RNA is added without using another intracellular delivery system.
  • a method of suppressing expression of a gene encoding the protein in vitro which comprises introducing into the cell, thereby disabling target RNA in the cell and inhibiting translation into the protein.
  • the cell membrane-permeable peptide-modified dumbbell-type single-stranded circular RNA according to any one of [1] to [3] is added to a non-human animal, plant, or cell thereof, and the RNA is delivered to another intracellular delivery system.
  • a method for suppressing the expression of a gene encoding the protein which comprises introducing the protein into the cell without using the protein, thereby disabling target RNA in the cell and inhibiting translation into the protein.
  • DbRNA to which the cell membrane permeability was provided and its manufacturing method can be provided.
  • DbRNA can be produced by modifying the loop portion with a cell membrane permeable peptide and can be taken up into the cell by itself. Therefore, it is not necessary to use other intracellular delivery systems such as conventional viral vectors and cationic liposomes whose safety is questioned.
  • it is specifically recognized by in vivo enzyme dicer in the incorporated cells, and the loops on both sides are cleaved to become functional RNA duplexes, so that the RNA interference effect and the biological action of the target gene Can cause control.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2010-054740 which is the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1 shows the flow of synthesis of TAT peptide-modified DbRNA via maleimide modification.
  • FIG. 2 shows the structure (a) and sequence (b) of the TAT peptide modified DbRNA. Among the sequences shown in (b), the underlined sequence is a sequence forming a loop part, and the site shown in bold indicates the amino modification site.
  • FIG. 3 shows the analysis result of maleimide modification reaction of DbRNA by reverse phase HPLC. Peak 1: maleimide; peak 2: amino-modified DbRNA; peak 3: maleimide-modified DbRNA. (0% -80% CH3CN / 50 mM TEAA buffer)
  • FIG. 4 shows the analysis result of TAT peptide-modified DbRNA by 10% denaturing PAGE.
  • FIG. 5 shows the structure and sequence of siRNA used as a control and DbRNA without TAT peptide modification (Db23).
  • FIG. 6 shows the evaluation result of the RNA interference effect by comparing the expression level of luciferase.
  • each sample is as follows from the left side of the figure: buffer only (control); siRNA mixed with transfection reagent (25 nM siRNA w / TR) (positive control); DbRNA mixed with transfection reagent (25 nM) Db23 w / TR (positive control); siRNA only (200 nM siRNA w / o TR); DbRNA only (200 nM Db23 w / o TR); DbRNA mixed with TAT peptide (TAT + 200 nM) SiRNA mixed with TAT peptide (TAT + 200 nM siRNA); TAT peptide modified DbRNA (25 nM TAT-Db23); TAT peptide modified DbRNA (100 nM TAT-Db23); Plastid qualified DbRNA (200nM TAT-Db23).
  • FIG. 7 shows the flow of synthesis of TAT peptide-modified DbRNA via iodoacetyl modification.
  • FIG. 8 shows the results of ion-exchange HPLC analysis of amino-modified DbRNA, iodoacetylated DbRNA and TAT peptide-modified DbRNA.
  • FIG. 9 shows the analysis result of TAT peptide-modified DbRNA by 10% denaturing PAGE. 1: amino modified DbRNA; 2: iodoacetylated DbRNA; 3: TAT peptide modified DbRNA.
  • FIG. 10 shows the structure (a) and sequence (b) of TAT-dbGSK.
  • FIG. 11 shows the result of double staining of BrdU / GS (glutamine synthetase) in retinal tissues with TAT-Db23 (200 nM) added (control) (A) or TAT-dbGSK (200 nM) added (B). Shown: BrdU (red) labels the nuclei of proliferated cells (arrows), GS (green) is a marker for Mueller glial cells.
  • DbRNA includes a stem formed by pairing a sense strand sequence homologous to a base sequence of a target RNA or a part thereof and an antisense strand sequence complementary to the sense strand sequence, the sense strand and the antisense strand It includes two loops formed by a base sequence that is between and does not form a complementary strand.
  • the length of the stem is not particularly limited, and the length may be determined according to the type or structure of the target RNA. For example, the length is 19 to 31 base pairs, preferably 21 to 25 base pairs, more preferably 22 to 24. It consists of base pairs, more preferably 23 base pairs.
  • the length of the loop is preferably 2 to 20 bases, more preferably 6 to 12 bases.
  • the entire single-stranded circular RNA is preferably formed of 42 to 102 bases.
  • the base sequences and lengths of the two loop portions may be the same or different.
  • the sense strand of DbRNA has a sequence complementary to the target RNA (for example, mRNA or its precursor RNA).
  • the base sequence of the DbRNA loop is not particularly limited, and examples thereof include UUCAGAGA, UGUGCUGUC (M. Miyagishi et al., Oligonucleotides 2003, 13: 1-7) and the like.
  • the loop of DbRNA is modified with a cell membrane permeable peptide.
  • modification refers to binding of a protein, peptide, chemical substance, compound or the like having a specific function to a nucleic acid sequence constituting a DbRNA loop.
  • modification and “binding” are used interchangeably.
  • the “cell membrane permeable peptide” means a peptide having a function of imparting a cell membrane permeability to the protein or the like by modifying the protein, peptide, or low molecular weight compound with the peptide and introducing the protein into the cell.
  • cell membrane permeable peptides generally include basic peptides rich in arginine and lysine, and are not particularly limited, and include known peptides having this function, such as HIV-1 TAT peptide, HIV-1 Rev peptide. , FHV Coat peptide, BMV Gag peptide, HTLV-II Rex peptide, CCMV Gag peptide, P22 N peptide, ⁇ N peptide, ⁇ 21N peptide, yeast PRP6 peptide, human U2AF peptide, Antennapedia peptide, VP22 peptide and the like.
  • it is an HIV-1 TAT peptide.
  • the “TAT peptide” is a peptide sequence containing a large amount of basic amino acids derived from amino acid residues 48 to 60 of the TAT protein that is a transcriptional activator of HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1). N-terminal) - 48 Gly-Arg-Lys -Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln 60 - having a (C-terminal) (SEQ ID NO: 1).
  • the “TAT peptide” includes an amino acid sequence having at least 10 consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having the cell membrane permeation function.
  • the “TAT peptide” includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has the above-mentioned cell membrane permeation function.
  • Cell membrane permeable peptides may be obtained from naturally occurring sources, or may be produced using genetic engineering techniques or chemical synthesis.
  • the cell membrane permeable peptide is bound to the loop of DbRNA. Since the loop part is cleaved and removed by enzymes such as Dicer in the cell, the stem acts as a functional double-stranded RNA, that is, siRNA or miRNA, when it exerts RNA interference action or biological action of the target gene.
  • the bound cell membrane-penetrating peptide hardly affects the action.
  • the cell membrane permeable peptide may be bound to only one loop in one DbRNA, or may be bound to both loops.
  • One or a plurality of cell membrane permeable peptides may be bound to one loop.
  • “Plurality” means 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or more.
  • the binding site of the cell membrane permeable peptide in the loop is not particularly limited, but a site away from the stem is considered preferable.
  • the number and binding position of cell membrane permeable peptides bound to the loop are appropriately determined within a range that does not interfere with the desired RNA interference action or the control action of the biological action of the target gene.
  • the cell membrane permeable peptide is bound to one of the loops at the most distal position from the stem.
  • the cell membrane permeable peptide is bound to the loop of DbRNA using a covalent bond or a non-covalent bond as described in detail in the following DbRNA production method and Examples.
  • the loop of DbRNA may be chemically modified. For example, when modified with polyethylene glycol having a molecular weight of about 2000 to 5000, the stability of DbRNA in vivo can be improved.
  • the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention is a known intracellular delivery system (for example, electroporation method, microinjection method, lipofection method, calcium phosphate method, in particular viral vectors and cationic liposomes) for introducing nucleic acid into cells. Etc.) can be introduced into the cell without using. Introduction of the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention into a cell can be confirmed by comparing the expression level of the target RNA in the cell with the expression level of the cell into which the DbRNA of the present invention has not been introduced.
  • the method for producing a cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention comprises synthesizing a first strand and a second strand, each having a base sequence comprising a base sequence constituting the DbRNA divided into two at arbitrary locations, 5 'end base of the first strand base sequence and 3' end base of the second strand base sequence, and 3 'end base of the first strand base sequence and 5' end of the second strand base sequence. Including simultaneously ligating the bases with a ligase. Furthermore, it further includes binding one or more cell membrane permeable peptides in the base sequence constituting the loop of the first strand and / or the second strand.
  • the sense strand and antisense strand constituting the stem in DbRNA are designed from the base sequence of the target gene so that the target gene can be suppressed.
  • a plurality of sense strands and antisense strands may be prepared and the suppression efficiency may be confirmed respectively, but for example, a design based on an siRNA design algorithm or the like may be used (reference: JA Jaeger et al.). al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-306; DH Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940).
  • the target gene is not particularly limited, and examples thereof include a gene that causes human disease or a gene that is specific to bacteria or viruses that cause human infectious diseases, a gene that regulates cell growth (eg, GSK3 ⁇ gene), and the like.
  • the sequence constituting the loop in DbRNA is not particularly limited as described above, and can be selected from, for example, the sequence UUCAGAGA or UGUGCUGUC. In the sequence constituting the loop, a modified base is introduced at a position where the cell membrane-permeable peptide is bound.
  • One or more modified bases can be introduced depending on the number of cell membrane permeable peptides to be bound.
  • the modified base those known to be useful for internal modification of nucleic acids can be used.
  • biotin-modified bases and / or amino-modified bases known to be useful for internal modification of nucleic acids eg, Biotin-dT, Amino Modifier C2 dT, Amino Modifier C6 dT, Amino Modifier C6 dA, Amino Modifier C6 dC). Etc.
  • the modified base preferably has a spacer having an appropriate length.
  • the spacer can be a hydrocarbon having 3 to 20 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, preferably a linear saturated hydrocarbon.
  • the modified base can be introduced by insertion or substitution at any position of the sequence UUCAGAGA or UGUGCUGUC. As described above, the position and number of modified bases to be introduced are determined and designed as appropriate as long as the cell membrane-permeable peptide added to the loop does not interfere with the desired RNA interference action or the control action of the target gene biological action. can do.
  • the first strand and the second strand are designed by dividing the base sequence of the DbRNA designed to have the above-described stem and loop configuration into two at arbitrary locations, and synthesized separately.
  • the “arbitrary portion” is not particularly limited, and can be selected from the portions constituting the stem and / or the loop.
  • the base sequence constituting one loop is the 5 ′ end of each strand and Located at the 3 'end or at the 3' and 5 'ends, respectively.
  • the sense strand and the antisense strand are inserted in each base sequence of the first strand or the second strand with the base sequence constituting the loop interposed therebetween. There are sequences that make up.
  • Nucleic acid synthesis methods include various methods such as an in vitro transcription synthesis method, a method using a plasmid and a viral vector, and a method using a PCR cassette, and are not particularly limited. However, the purity is high, mass synthesis is possible, and in vivo use is safe.
  • the chemical synthesis method is preferable from the viewpoint of high property and possible chemical modification.
  • the chemical synthesis method includes an H-phosphonate method and a phosphoramidite method, and is not particularly limited, and a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • the ends of base sequences that do not form complementary strands at both ends of the sense strand and the antisense strand are ligated with ligase (eg, T4 RNA ligase, T4 DNA ligase, etc.) to form two loops simultaneously.
  • ligase eg, T4 RNA ligase, T4 DNA ligase, etc.
  • the reaction conditions may be incubated at a low temperature for 20 hours in a buffer containing, for example, polyethylene glycol (PEG), BSA and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • BSA polyethylene glycol
  • the synthesized DbRNA can be recovered and purified by a conventional method (for example, high performance liquid chromatography, PAGE method, etc.).
  • the purity of the recovered and purified DbRNA can be increased by decomposing RNA that has not been cyclized by exonuclease treatment. Binding of the cell membrane-permeable peptide to DbRNA can be appropriately performed based on a known technique with respect to the modified base introduced into the sequence forming the loop. For example, when the introduced base residue is a biotin-modified base, DbRNA and the cell membrane-permeable peptide can be bound by modifying the C-terminus of the cell membrane-permeable peptide with streptavidin.
  • the C-terminus is modified with a thiol group or the C-terminus is modified by modifying the end of the spacer with a maleimide group, iodoacetyl group or thiol group. It can be coupled with a cell membrane permeable peptide modified with a maleimide group or an iodoacetyl group.
  • the single-stranded circular RNA may be chemically modified with polyethylene glycol (PEG) or the like, and the chemical modification is preferably performed on the loop portion.
  • both ends of the PEG are modified to introduce functional groups reactive with the amino group of the base, such as, for example, formyl group, N-hydroxysuccinimide ester group.
  • DbRNA conjugated with cell membrane permeable peptide can be obtained by, for example, precipitation or heat denaturation with ammonium sulfate, PEG, antibody, etc., followed by centrifugation; chromatography step, eg, ion exchange chromatography step, gel filtration chromatography step, reverse phase Chromatography step, hydroxylapatite chromatography step, and affinity chromatography step; isoelectric focusing; gel electrophoresis; and combinations thereof, as well as other known techniques, can be appropriately collected and purified.
  • RNA interference is also referred to as RNA interference (RNAi), and is a phenomenon in which a small RNA molecule having a sequence complementary to a target RNA binds to the target RNA and degrades it or suppresses translation.
  • RNAi RNA interference
  • the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention has a target RNA 24 hours after cell introduction in a cell into which the DbRNA has been introduced, assuming that the expression of the target RNA in a control cell (in which DbRNA is not introduced) is 1. It is preferable that the expression is 0.4 or less.
  • the expression of the target RNA is performed by, for example, transforming a reporter gene (luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, green fluorescence protein (GFP), etc.) into a cell, using the reporter gene mRNA as a target RNA, and expressing the target RNA.
  • a reporter gene luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, green fluorescence protein (GFP), etc.
  • the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention is an intracellular delivery system that has been conventionally used in the introduction of nucleic acids into cells in vitro and in vivo, such as an electroporation method, a microinjection method, a lipofection method, calcium phosphate. It can be introduced into cells without using a method, particularly a viral vector or cationic liposome, and the target RNA can be disabled and the translation into protein can be continuously inhibited. As the cells, human cells or non-human cells can be used.
  • a sample containing cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA is prepared by dialysis, pH adjustment, etc. so as to be compatible with the living body.
  • the method for introduction into animals or plants is not particularly limited, and includes, for example, local administration, intravenous administration, and a method using a gene gun.
  • a method that does not use microorganisms is preferable from the viewpoint of safety. .
  • siRNA RNA induced silencing complex
  • the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention can be used in plants, animals (eg, mammals including humans, pets, livestock, etc.), and their cells, and has a wide range of applications particularly in the fields of medicine and agriculture. Be expected.
  • the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA of the present invention is used for various purposes such as elucidation of the function of a specific gene or protein at the plant or animal level or plant or animal cell level, for example, elucidation of the function by a knockout method. can do.
  • this invention contains the pharmaceutical composition which contains cell membrane permeation
  • the amount of the cell membrane-permeable peptide-modified DbRNA added to the pharmaceutical composition can be adjusted according to the type and purpose of the composition, and is 0.01% by weight, 0.1% by weight, for example, with respect to the total amount of the composition. 0.5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90% by weight and 100% by weight, but not limited thereto.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention include liquid preparations (solutions, suspensions, emulsions, etc.), solid preparations (lyophilized preparations etc. prepared at the time of use), and the like.
  • Parenteral administration is preferable, and includes, for example, local administration directly administered to the affected area, transmucosal administration such as pulmonary administration, nasal administration, intravenous administration and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain excipients (eg, physiological saline, sterilized water, Ringer's solution), buffers, isotonic agents, stabilizers, etc., depending on the formulation, dosage form, etc. .
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be changed according to the sex, weight, age, severity, symptoms, etc. of the patient.
  • the application of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but for example, treatment of diseases such as cancer, for example, suppression of functions of genes and proteins specifically expressed in cancer cells, causative bacteria or viruses of infectious diseases Examples thereof include suppression of functions of genes and proteins that are specifically expressed, and promotion or inhibition of cell proliferation.
  • diseases such as cancer
  • suppression of functions of genes and proteins specifically expressed in cancer cells for example, suppression of functions of genes and proteins specifically expressed in cancer cells, causative bacteria or viruses of infectious diseases Examples thereof include suppression of functions of genes and proteins that are specifically expressed, and promotion or inhibition of cell proliferation.
  • TAT peptide The sequence of the TAT peptide, which is a cell membrane-permeable peptide used in this example, is shown below. (N-terminal) 47 Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg57-Cys (C-terminal) (SEQ ID NO: 2) This is a cysteine introduced at the C-terminus of the amino acid sequence of residues 47-57 of wild type HIV-1 TAT protein. The synthesis of the peptide was requested from PH Japan. Synthesis of TAT peptide-modified DbRNA via maleimide modification The flow of synthesis of TAT peptide-modified DbRNA via maleimide modification is shown in FIG.
  • TAT peptide-modified DbRNA is synthesized by reacting DbRNA whose loop portion is amino-modified with a maleimide group, and further reacting the maleimide group with a thiol group contained in the cysteine of the TAT peptide.
  • the structure and sequence of the TAT peptide-modified DbRNA are shown in FIGS. 2 (a) and (b).
  • the underlined sequence is a sequence that forms a loop portion, and the site shown in bold indicates the amino modification site. Synthesis of DbRNA in which the loop portion is amino-modified can be performed based on the method described in JP 2008-278784 A.
  • RNA amidite used TBDMS protector (Proligo), and 5 'phosphorylation used Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research).
  • Amino-Modifier C6-dT was introduced into the amino modification site of the loop part. Deprotection was performed by PAGE purification according to a conventional method.
  • the enzyme reaction was performed using 2 ⁇ M RNA double strand, 2.0 units / ⁇ l T4 RNA ligase, 0.006% BSA, 25% PEG 6000, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 1 mM ATP. With a reaction scale of 25 ⁇ l. Specifically, first, in 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl 2 , 20 mM DTT, 2 mM ATP buffer (2 ⁇ buffer) so that the 5 ′ phosphorylated RNA duplex becomes 4 ⁇ M.
  • a maleimide compound is reacted with the amino group of DbRNA in which the loop portion is amino-modified to synthesize maleimide-modified DbRNA.
  • Sulfo-SMCC Sulfo-N-Succinimidyl 4- (Maleimidemethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • the loop portion was amino-modified DbRNA was dissolved in 5 mM Sulfo-SMCC, 75 mM NaB buffer (pH 8.5) and shaken at room temperature for 3 hours. Thereafter, the reaction mixture was concentrated with Amicon Ultra-0.5 (Millipore) to remove unreacted Sulfo-SMCC, followed by isopropanol precipitation, and DbRNA whose loop portion was modified with maleimide was recovered. The progress of the reaction was confirmed by reverse phase HPLC (FIG. 3).
  • the maleimide group of DbRNA in which the loop part was modified with maleimide was reacted with the thiol group of the TAT peptide (included in cysteine at the C-terminal) to synthesize TAT peptide-modified DbRNA.
  • the loop part was dissolved in 1 mM TAT peptide, 0.01 M NaB buffer (pH 8.5) so that the DbRNA modified with maleimide was 3.69 ⁇ M, and shaken at room temperature for 12 hours. After the reaction, the reaction solution was directly applied to 10% denatured PAGE to confirm the progress of the reaction (FIG. 4).
  • TAT peptide-modified DbRNA is referred to as “TAT-Db23” in the present specification and drawings.
  • siRNA and DbRNA not modified with the TAT peptide (hereinafter referred to as “Db23”) were used as controls.
  • the structure and sequence of siRNA and Db23 are shown in FIG.
  • siRNA and Db23 can be prepared using RNA having the sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 and SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, based on a known technique (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-278784).
  • RNA mix was adjusted so that various RNA + Opti-MEM (and transfection reagent (Lipofectamine 2000) as necessary) were 50 ⁇ L / well in total.
  • RNA mix and cells were mixed at 50 ⁇ L / well, allowed to stand for 10 minutes, and then seeded in a 96-well plate. Thereafter, incubation was performed at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2.5 hours, and DMEM medium supplemented with 20% FBS and 1 ⁇ penicillin-streptomycin was added to each well.
  • the luciferase expression level was quantified by solubilizing the cells using the Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega) according to the attached protocol (conditions—reagent volume: 30 ⁇ l; delay time: 2 seconds; read) time: 10 seconds; instrument: Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter).
  • buffer only control
  • siRNA or Db23 mixed with transfection reagent positive control
  • siRNA or Db23 only siRNA or Db23 mixed with TAT peptide were also evaluated.
  • the emission intensity of firefly luciferase was corrected by the emission intensity of Renilla luciferase which is an internal standard. The results are shown in FIG.
  • RNA interference The expression level of luciferase when each sample is added is shown relative to the expression level of luciferase when the buffer alone (control) is added. From this result, it was shown that siRNA or Db23 introduced alone without using a transfection reagent does not show RNA interference, and therefore, RNA alone does not cause intracellular introduction. Moreover, since siRNA or Db23 only mixed with the TAT peptide does not show RNA interference action, it was shown that RNA is not taken up into cells only by mixing the TAT peptide and RNA. On the other hand, TAT-Db23 did not show RNA interference at 25 nM, but showed RNA interference at 100 nM and 200 nM.
  • the RNA can be introduced into cells without a transfection reagent. It can be said that 200 nM TAT-Db23 exhibits almost the same effect as positive control Db23. As described above, the cell membrane permeability was successfully imparted to DbRNA by adding the TAT peptide.
  • TAT peptide-modified DbRNA via iodoacetyl modification The flow of synthesis of TAT peptide-modified DbRNA via iodoacetyl modification is shown in FIG.
  • the TAT peptide-modified DbRNA via iodoacetyl modification is synthesized by iodoacetylating DbRNA having a loop modified with amino and then reacting the iodoacetyl group with the thiol group contained in the cysteine of the TAT peptide.
  • DbRNA whose amino acid is modified in the loop portion (prepared in the same manner as in Example 1 above) is dissolved in 20 ⁇ L of 0.1 M sodium borate buffer so that the concentration is 50 ⁇ M, and 2 ⁇ L of 50 mM iodoacetyl NHS ester is dissolved. In addition, the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours. Thereafter, 4 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2) and 80 ⁇ L of 2-propanol were added, mixed, incubated at ⁇ 30 ° C. for 1 hour, centrifuged (20,000 g, 4 ° C., 30 minutes), and iodoacetylated DbRNA was added. Collected (yield 79%).
  • TAT peptide modification of iodoacetylated DbRNA was performed. Specifically, it was dissolved in 25 ⁇ L of 2M TEAA buffer so that the iodoacetylated DbRNA was 1 ⁇ M, 350 ⁇ L formamide and 0.5 ⁇ L 5 mM TAT peptide were added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. Thereafter, 4 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2) and 80 ⁇ L of 2-propanol were added, mixed, incubated at ⁇ 30 ° C. for 1 hour, centrifuged (20,000 g, 4 ° C., 30 minutes), and TAT peptide-modified DbRNA was added. It was collected.
  • TAT peptide-modified DbRNA was purified by HPLC using an ion exchange column (TOSOH TSK gel DEAE-2SW column No. M0009, Part No. 07168) (0-80% 1M sodium perchlorate, 20 mM Tris- Cl (pH 6.8), 50% formamide / 20 mM Tris-Cl (pH 6.8), 50% formamide) (88% yield).
  • the amino-modified DbRNA, iodoacetylated DbRNA and TAT peptide-modified DbRNA were each analyzed by HPLC using an ion exchange column (TOSOH TSK gel DEAE-2SW column No. M0009, Part No.
  • TAT peptide-modified DbRNA (lane 3) is TAT peptide-modified because the band is shifted to the polymer side compared to amino-modified DbRNA (lane 1) and iodoacetylated DbRNA (lane 2). I was able to confirm.
  • TAT peptide-modified DbRNA targeting GSK3 ⁇ gene 5′-phosphorylated RNA used as a raw material for TAT peptide-modified DbRNA targeting GSK3 ⁇ gene was synthesized based on a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-278784). ).
  • the structure and sequence of a TAT peptide-modified DbRNA targeting the GSK3 ⁇ gene are shown in FIGS. 10 (a) and (b).
  • the underlined sequence is a sequence forming a loop portion, and the site shown in bold indicates the amino modification site.
  • two RNA sequences SEQ ID NOs: 9 and 10 shown in FIG.
  • RNA amidite TBDMS protector (Proligo) and 5 ′ phosphorylation were performed using Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research). Amino-Modifier C6-dT was introduced into the amino modification site of the loop part. Deprotection was performed by PAGE purification according to a conventional method. Synthesis of TAT peptide-modified DbRNA using the RNA sequence was performed via iodoacetyl modification, as in Example 2 above.
  • TAT-dbGSK The obtained TAT peptide-modified DbRNA targeting the GSK3 ⁇ gene is hereinafter referred to as “TAT-dbGSK” in the present specification and drawings.
  • GSK3 ⁇ gene expression inhibition experiment by TAT-dbGSK Inhibition of GSK3 ⁇ gene expression in retinal cells promotes cell proliferation due to activation of the Wnt / ⁇ -catenin pathway, resulting in regeneration of retinal tissue. (Osakada et al. The Journal of Neuroscience (2007) 27 (15): 4210-4219).
  • the inhibitory effect of TAT-dbGSK on GSK3 ⁇ gene expression was evaluated using retinal cell proliferation as an index depending on whether or not TAT-dbGSK was added to the retinal tissue culture system.
  • the cells were cultured for 4 days at 35.5 ° C. with 5% CO 2 .
  • the insert with the neuronal retina was transferred to an empty 6-well dish, and 10 ⁇ L of TAT-db23 or TAT-dbGSK solution diluted with HBSS was applied onto the neuronal retina twice every 30 minutes. I put it.
  • the insert was returned to the dish containing the culture solution again, and fixed on 3 days at 4 ° C. using Superfix (KURABO) on the 4th day of culture, and the tissue was embedded in paraffin to prepare a section.
  • KURABO Superfix
  • rat anti-BrdU serotec, OBT0030
  • mouse anti-Glutamine synthetase Mcillipore
  • Alexa Fluor 546 goat anti-rat IgG and Alexa Fluor 8 were used as secondary antibodies.
  • FIG. Compared with the case where TAT-db23 (control) was added, more BrdU-labeled (red) cells were observed in the retinal tissue to which TAT-dbGSK was added (arrows in the figure). This result suggests that TSK-dbGSK RNA interference action inhibited GSK3 ⁇ gene expression and promoted retinal cell proliferation. From the above, it was revealed that TAT-dbGSK effectively causes RNA interference in target cells without using other compounds that impart cell membrane permeability.
  • DbRNA that generates functional double-stranded RNA such as siRNA or miRNA can be introduced into a cell without using a viral vector or a cationic liposome, and causes RNA control in the cell safely and efficiently. Can do. Therefore, the present invention is expected as a new therapeutic agent for diseases such as cancer. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　細胞膜透過能が付与されたDbRNAおよびその製造方法を提供すること。　DbRNAのループ部分を細胞膜透過性ペプチドで修飾することによって得られる、細胞膜透過能が付与されたDbRNA。

Description

細胞膜透過性ダンベル型ＲＮＡおよびその製造方法
　本発明は、細胞膜透過性ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡおよびその製造方法に関する。
　これまでのＲＮＡ干渉法は、化学合成した二本鎖ＲＮＡを用いる方法とプラスミドベクターを用いる方法に大別される。後者のプラスミドベクターを用いたＲＮＡ干渉技術は、バイオテクノロジーとして汎用され、主に基礎生物学実験に用いられている。しかし、ＲＮＡ干渉技術を医薬品開発に応用する場合、プラスミドベクターを用いた方法は人体への安全性が問題となるため、前者の化学合成した二本鎖ＲＮＡを用いることが望ましいようである。
　しかしながら、化学合成した二本鎖ＲＮＡは、生体内不安定性、すなわち、細胞内の酵素（ヌクレアーゼ）で分解されやすいという問題があった。そこで、細胞内での二本鎖ＲＮＡの安定性を高めるために非天然核酸を導入したＲＮＡ鎖が開発されたが、安定性は高くなるが、生物活性は下がってしまうことが問題となっていた。さらに、非天然核酸が与える毒性も未知であり、医薬品への応用は難しかった。
　ＲＮＡ干渉法に用いる二本鎖ＲＮＡの形態は、平滑末端または突出末端を有する二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ末端の一方がループ状になっているヘアピン構造を有するＲＮＡ（特許文献１）、約１９塩基対からなるステムと２個のループを有し、かつ化学修飾ポリヌクレオチドを有する環状ＲＮＡ（特許文献２）などがある。
　また、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラのダンベル型核酸が開示されているが（特許文献３）、この核酸はＲＮＡ干渉に用いられるものではなく、細胞内でダンベル型核酸のＲＮＡ部分が酵素で切断されてアンチセンスＤＮＡ部分が細胞内のｍＲＮＡに結合して阻害するものである。特許文献３には、核酸がダンベル型構造を有することにより、細胞内での核酸分解酵素耐性が高く、リボヌクレアーゼＨが作用するまでは細胞内で安定に存在し、リボヌクレアーゼＨの作用により相補的ＲＮＡ部分が切除されて、はじめて、アンチセンスＤＮＡ部分を含む一本鎖オリゴヌクレオチドが細胞内に遊離されるので、投与量当たりのアンチセンス効果が高くなると考えられることが開示されている。
　また、ダンベル型構造の環状核酸の合成方法については、例えば、線状にオリゴヌクレオチドを合成して、ステム部分とヘアピンループ部分を形成させ、目的とする環状ダンベル型オリゴヌクレオチドの１箇所（上記ヘアピンループ部分の反対側の末端）が結合されていないニックダンベル型オリゴヌクレオチドを得、その５’末端をリガーゼでライゲーションさせることにより、環状ダンベル型環状核酸を調製することが開示されている（特許文献３）。
　さらに、ダンベル型構造の環状核酸については、相補鎖を形成しない塩基配列を両端に有するセンス鎖とアンチセンス鎖を別々に合成して、両端の塩基にリガーゼを同時に作用させることにより、意外にも、従来の方法に比べて高収率で一本鎖環状ＲＮＡが得られ、かつ、得られた一本鎖環状ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を持続的、徐放的に発揮することが開示されている（特許文献４）。
　一方、ＲＮＡはそれ自体で細胞内に取り込まれないため、標的細胞付近まで送達されても、そこから効率的に細胞内に導入されない。今日、ウイルスやカチオン性リポソームを用いた様々なＲＮＡの細胞内デリバリーシステムが開発されているものの、ウイルス感染による副作用やカチオン性リポソームが有する細胞毒性が問題となっている。そのため生体投与可能な高い安全性をもった細胞内デリバリーシステムの開発が切望されている。
　当該課題を解決すべく、ＴＡＴペプチドで修飾したｓｉＲＮＡが開示されるものの（非特許文献１，２）、未だダンベル型一本鎖環状ＲＮＡについての報告はない。
特表２００３−５０２０１２号公報 特開２００６−２７１３８７号公報 特開平１１−１３７２６０号公報 特開２００８−２７８７８４号公報
Ｎｉｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．６ｅ５８ Ｃｈｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１，１１６５−１１７５，Ａｕｇｕｓｔ，２００４．
　本発明は、細胞膜透過能が付与されたダンベル型一本鎖環状ＲＮＡおよびその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ（以下、「ＤｂＲＮＡ」と記載する）のループ部分に細胞膜透過性ペプチドを結合することによって、当該ＤｂＲＮＡに細胞膜透過能を付与することができると共に、さらに、細胞内ではＤｂＲＮＡのループ部分の切断が起こり、機能性二本鎖ＲＮＡが生成し、ＲＮＡ干渉効果や標的遺伝子の生物学的作用の制御を引き起こすことを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］　センス鎖配列と、該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列と、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じか又は異なる２つのループ配列とを含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が対合してステムを形成し、該ループ配列の１つ又は２つが１又は複数の細胞膜透過性ペプチドによって修飾されていることを特徴とし、ならびに細胞膜透過能を有し、かつ細胞内で該２つのループ配列が切除されて機能性二本鎖ＲＮＡを生じさせる、細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
［２］　細胞膜透過性ペプチドが、ＨＩＶ−１　ＴＡＴタンパク質に由来するペプチドを含む、［１］の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
［３］　いずれかのループの、ステムより最も遠位の一箇所が細胞膜透過性ペプチドによって修飾されている、［１］または［２］の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
［４］　以下の（ａ）~（ｃ）の工程を含む、［１］~［３］のいずれかの細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡの製造方法：
　（ａ）［１］~［３］のいずれかの細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡを構成する塩基配列を任意の箇所で２つに分けてなる塩基配列をそれぞれ有する、第一鎖および第二鎖をそれぞれ合成する工程であって、第一鎖および／または第二鎖が有するループ配列を構成する塩基配列中に１又は複数の修飾塩基を導入することを含む、上記工程；
　（ｂ）第一鎖の塩基配列の５’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の３’末端の塩基、および第一鎖の塩基配列の３’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結する工程であって、その際、第一鎖および第二鎖が有するループ配列を構成する塩基配列はそれぞれまたは一緒になってループを形成し、ならびに第一鎖内もしくは第二鎖内または第一鎖と第二鎖との間で、互いに相補的関係にある塩基配列が対合してステムを形成する、上記工程；ならびに
　（ｃ）修飾塩基に対して細胞膜透過性ペプチドを結合する工程。
［５］　［１］~［３］のいずれかの細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡをヒト由来の細胞に添加して、該ＲＮＡをその他の細胞内デリバリーシステムを用いることなく該細胞内に導入し、それによって該細胞内の標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をｉｎ　ｖｉｔｒｏで抑制する方法。
［６］　［１］~［３］のいずれかの細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡを非ヒト動物、植物又はそれらの細胞に添加して、該ＲＮＡをその他の細胞内デリバリーシステムを用いることなく該細胞内に導入し、それによって該細胞内の標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
　本発明により、細胞膜透過能が付与されたＤｂＲＮＡおよびその製造方法を提供することができる。
　特に、ＤｂＲＮＡは、ループ部分を細胞膜透過性ペプチドによって修飾することにより作製され、それ自体で細胞内に取り込まれることができる。そのため、安全性が疑問視される従来のウイルスベクターやカチオン性リポソームなどのその他の細胞内デリバリーシステムを用いる必要がない。
　また、取り込まれた細胞内では生体内酵素ダイサーなどに特異的に認識されて、両側のループ部が切断されて機能性ＲＮＡ二本鎖になるため、ＲＮＡ干渉効果や標的遺伝子の生物学的作用の制御を引き起こすことができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０５４７４０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１はマレイミド修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成の流れを示す。
　図２は、ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの構造（ａ）および配列（ｂ）を示す。（ｂ）に示す配列のうち、下線の配列がループ部を形成する配列であり、太字で示した部位がアミノ修飾部位を示す。
　図３は、逆相ＨＰＬＣによるＤｂＲＮＡのマレイミド修飾反応の解析結果を示す。ピーク１：マレイミド；ピーク２：アミノ修飾したＤｂＲＮＡ；ピーク３；マレイミド修飾したＤｂＲＮＡ。（０％−８０％　ＣＨ３ＣＮ／５０ｍＭ　ＴＥＡＡバッファー）
　図４は、１０％変性ＰＡＧＥによるＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの解析結果を示す。ａ：ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ（ＴＡＴ−Ｄｂ２３）；ｂ：マレイミド修飾したＤｂＲＮＡ；ｃ：アミノ修飾したＤｂＲＮＡ。
　図５は対照として用いたｓｉＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾されていないＤｂＲＮＡ（Ｄｂ２３）の構造および配列を示す。
　図６はルシフェラーゼ発現量の比較によるＲＮＡ干渉効果の評価結果を示す。各サンプルは図中左側より以下のとおり：バッファーのみ（コントロール）；トランスフェクション試薬と混合させたｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ　ｓｉＲＮＡ　ｗ／Ｔ．Ｒ．）（ポジティブコントロール）；トランスフェクション試薬と混合させたＤｂＲＮＡ（２５ｎＭ　Ｄｂ２３　ｗ／Ｔ．Ｒ．）（ポジティブコントロール）；ｓｉＲＮＡのみ（２００ｎＭ　ｓｉＲＮＡ　ｗ／ｏ　Ｔ．Ｒ．）；ＤｂＲＮＡのみ（２００ｎＭ　Ｄｂ２３　ｗ／ｏ　Ｔ．Ｒ．）；ＴＡＴペプチドと混合させたＤｂＲＮＡ（ＴＡＴ＋２００ｎＭ　Ｄｂ２３）；；ＴＡＴペプチドと混合させたｓｉＲＮＡ（ＴＡＴ＋２００ｎＭ　ｓｉＲＮＡ）；ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ（２５ｎＭ　ＴＡＴ−Ｄｂ２３）；ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ（１００ｎＭ　ＴＡＴ−Ｄｂ２３）；ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ（２００ｎＭ　ＴＡＴ−Ｄｂ２３）。
　図７はヨードアセチル修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成の流れを示す。
　図８はアミノ修飾したＤｂＲＮＡ、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡのイオン交換ＨＰＬＣ分析結果を示す。
　図９は１０％変性ＰＡＧＥによるＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの解析結果を示す。１：アミノ修飾したＤｂＲＮＡ；２：ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡ；３：ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ。
　図１０はＴＡＴ−ｄｂＧＳＫの構造（ａ）および配列（ｂ）を示す。（ｂ）に示す配列のうち、下線の配列がループ部を形成する配列であり、太字で示した部位がアミノ修飾部位を示す。
　図１１は、ＴＡＴ−Ｄｂ２３（２００ｎＭ）添加（コントロール）（Ａ）またはＴＡＴ−ｄｂＧＳＫ（２００ｎＭ）添加（Ｂ）した網膜組織における、ＢｒｄＵ／ＧＳ（グルタミンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）二重染色の結果を示す。ＢｒｄＵ（赤）は増殖した細胞の核を標識する（矢印）。ＧＳ（緑）はミューラーグリア細胞のマーカー。
　ＤｂＲＮＡは、標的ＲＮＡの塩基配列又はその一部に相同なセンス鎖配列と該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列とが対合して形成するステムと、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間にあって相補鎖を形成しない塩基配列が形成する２つのループを含む。
　ステムの長さは特に限定されず、標的ＲＮＡの種類や構造などに応じて長さを決定すればよいが、例えば１９~３１塩基対、好ましくは２１~２５塩基対、より好ましくは２２~２４塩基対、さらに好ましくは２３塩基対からなる。
　ループの長さは、好ましくは２~２０塩基、より好ましくは６~１２塩基からなる。従って、全体の一本鎖環状ＲＮＡは、好ましくは４２~１０２塩基で形成される。
　２つのループ部の塩基配列および長さは、同じでも異なっていてもよい。
　ＤｂＲＮＡのセンス鎖は、標的となるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはその前駆体ＲＮＡ）に相補的な配列を有する。また、ＤｂＲＮＡのループの塩基配列は、特に限定されないが、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、またはＵＧＵＧＣＵＧＵＣ（Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　２００３，１３：１−７）などが挙げられる。
　ＤｂＲＮＡのループは細胞膜透過性ペプチドによって修飾されている。ここで「修飾」とは、ＤｂＲＮＡのループを構成する核酸配列に特定の機能を有するタンパク質、ペプチド、化学物質、化合物などが結合することを指す。よって、本明細書において、「修飾」と「結合」なる用語は、互換的に用いられる。
　「細胞膜透過性ペプチド」は、当該ペプチドによりタンパク質、ペプチド、低分子化合物を修飾することによって当該タンパク質等に細胞膜透過能を付与し、細胞内に導入させる機能を有するペプチドを意味する。細胞膜透過性ペプチドとしては、一般にアルギニンやリジンに富む塩基性ペプチドが挙げられ、特に限定されることなく当該機能を有する公知のものが挙げられ、例えば、ＨＩＶ−１　ＴＡＴペプチド、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖペプチド、ＦＨＶ　Ｃｏａｔペプチド、ＢＭＶ　Ｇａｇペプチド、ＨＴＬＶ−ＩＩ　Ｒｅｘペプチド、ＣＣＭＶ　Ｇａｇペプチド、Ｐ２２　Ｎペプチド、λＮペプチド、φ２１Ｎペプチド、酵母ＰＲＰ６ペプチド、ヒトＵ２ＡＦペプチド、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａペプチド、ＶＰ２２ペプチドなどが挙げられる。好ましくは、ＨＩＶ−１　ＴＡＴペプチドである。
　「ＴＡＴペプチド」は、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス１型）の転写活性化因子であるＴＡＴタンパク質のアミノ酸残基４８−６０残基に由来する塩基性アミノ酸を多く含むペプチド配列であり、（Ｎ末端）−４８Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ６０−（Ｃ末端）（配列番号１）を有する。本発明において「ＴＡＴペプチド」には、上記配列番号１のアミノ酸配列において、連続する少なくとも１０個以上のアミノ酸を含み、かつ上記細胞膜透過機能を有するアミノ酸配列を含む。また本発明において「ＴＡＴペプチド」には、上記配列番号１のアミノ酸配列において、一個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ上記細胞膜透過機能を有するアミノ酸配列を含む。
　細胞膜透過性ペプチドは、天然に存在する供給源から得られたものであっても良いし、遺伝子工学技術または化学合成を使用して生成されたものであっても良い。
　細胞膜透過性ペプチドはＤｂＲＮＡのループに結合される。ループ部は細胞内でダイサーなどの酵素により切断され除去されるので、ステムが機能性二本鎖ＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉作用や標的遺伝子の生物学的作用の制御作用を発揮する際、結合された細胞膜透過性ペプチドが当該作用に影響を与えることはほとんどないと考えられる。
　細胞膜透過性ペプチドは一つのＤｂＲＮＡにおいて、片側のループにのみ結合されていても良いし、両側のループに結合されていても良い。細胞膜透過性ペプチドはループ一つに対して、１または複数個結合されていても良い。「複数個」とは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、またはそれ以上を意味する。ループにおける細胞膜透過性ペプチドの結合部位は特に限定されないが、ステムより離れた箇所が好ましいと考えられる。なお、ループに結合される細胞膜透過性ペプチドの個数や結合位置は、所望されるＲＮＡ干渉作用や標的遺伝子の生物学的作用の制御作用を妨げない範囲で適宜決定される。好ましくは、細胞膜透過性ペプチドはいずれかのループの、ステムより最も遠位の一箇所に結合している。
　細胞膜透過性ペプチドは、下記のＤｂＲＮＡの製造方法および実施例において詳述されるように、共有結合または非共有結合を利用してＤｂＲＮＡのループに結合している。
　更に、ＤｂＲＮＡのループは化学修飾されていてもよく、例えば分子量約２０００~５０００のポリエチレングリコールで修飾すると、生体内でのＤｂＲＮＡの安定性を向上することができる。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、核酸を細胞に導入するための公知の細胞内デリバリーシステム（例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、特にウイルスベクターやカチオン性リポソームなど）を用いることなく、細胞に導入することができる。本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡの細胞への導入は、細胞における標的ＲＮＡの発現量を本発明のＤｂＲＮＡを導入していない細胞における当該発現量と比較することにより確認することができる。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡの製造方法は、ＤｂＲＮＡを構成する塩基配列を任意の箇所で２つに分けてなる塩基配列をそれぞれ有する、第一鎖および第二鎖をそれぞれ合成し、第一鎖の塩基配列の５’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の３’末端の塩基、および第一鎖の塩基配列の３’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結することを含む。また、さらに、第一鎖および／または第二鎖が有するループを構成する塩基配列中に１または複数個の細胞膜透過性ペプチドを結合することを含む。
　ＤｂＲＮＡ中のステムを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的となる遺伝子を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。設計は、複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確認してもよいが、例えばｓｉＲＮＡ設計用アルゴリズムなどによる設計を利用してもよい（参照文献：Ｊ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１８３：２８１−３０６；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２８８：９１１−９４０）。設計時には、標的遺伝子と類似した配列を持つ、標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制すること（Ｏｆｆ　ｔａｒｇｅｔ効果）がないことが望ましい。
　標的遺伝子は特に限定されないが、例えば、ヒト疾患の原因遺伝子またはヒト感染性疾患の原因細菌もしくはウイルスに特異的な遺伝子、細胞増殖を調節する遺伝子（例えば、ＧＳＫ３β遺伝子）などが挙げられる。
　ＤｂＲＮＡ中のループを構成する配列は上記のとおり特に限定されないが、例えば上記配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、またはＵＧＵＧＣＵＧＵＣから選択することができる。
　また、ループを構成する配列には、細胞膜透過性ペプチドを結合する箇所に修飾塩基を導入する。修飾塩基は、結合する細胞膜透過性ペプチドの個数に応じて１または複数個を導入することができる。修飾塩基は核酸のインターナル修飾に有用であることが公知のものを利用することができる。例えば、核酸のインターナル修飾に有用であることが公知のビオチン修飾塩基および／またはアミノ修飾塩基（例えば、Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ，Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ２　ｄＴ，Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　ｄＴ，Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　ｄＡ，Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　ｄＣなど）を利用することができる。修飾塩基は、適当な長さのスペーサーを有することが好ましい。スペーサーは炭素数３~２０、好ましくは５~１２の炭化水素、好ましくは直鎖飽和炭化水素とすることができる。修飾塩基の導入は上記配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、またはＵＧＵＧＣＵＧＵＣの任意の箇所に挿入または置換により行うことができる。上記の通り、修飾塩基の導入位置および個数は、ループに付加された細胞膜透過性ペプチドが、所望されるＲＮＡ干渉作用や標的遺伝子の生物学的作用の制御作用を妨げない範囲で適宜決定・設計することができる。
　上記のステムおよびループの構成を有するように設計したＤｂＲＮＡの塩基配列を任意の箇所で２つに分けて第一鎖および第二鎖を設計し、それぞれ別に合成する。「任意の箇所」は特に限定されず、ステムおよび／またはループを構成する部位より選択することができる。例えば、「任意の箇所」がループを構成する塩基配列中に存在する場合、第一鎖および第二鎖を構成する塩基配列において、一つのループを構成する塩基配列が各鎖の５’末端および３’末端、または３’末端および５’末端にそれぞれ位置する。また、「任意の箇所」がステムを構成する塩基配列中に存在する場合、第一鎖または第二鎖の各塩基配列中に、ループを構成する塩基配列を挟んでセンス鎖およびアンチセンス鎖を構成する配列が存在する。第一鎖および第二鎖の合成に際しては、化学的リン酸化試薬を用いて５’末端のリン酸化を行うことが好ましい。
　核酸合成方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ合成方法、プラスミド、ウイルスベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法など種々の方法があり、特に限定されないが、純度の高さ、大量合成可能、ｉｎ　ｖｉｖｏでの使用安全性の高さ、化学修飾可能などの点から、化学合成方法が好ましい。化学合成方法は、Ｈ−ホスホネート法、ホスホロアミダイト法などがあり、特に限定されず、市販の自動核酸合成機を使用することができる。
　センス鎖およびアンチセンス鎖の両端にある相補鎖を形成しない塩基配列の末端をリガーゼ（例えばＴ４　ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼなど）で連結して、２つのループを同時に形成する。反応条件は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＢＳＡなどを含む緩衝液中で低温下２０時間インキュベーションすればよい。合成したＤｂＲＮＡは、常法で回収・精製（例えば高速液体クロマトグラフィー、ＰＡＧＥ法など）することができる。合成したＤｂＲＮＡの回収・精製に際しては、エキソヌクレアーゼ処理を行うことにより環化していないＲＮＡを分解することによって、回収・精製されるＤｂＲＮＡの純度を高めることができる。
　ＤｂＲＮＡへの細胞膜透過性ペプチドの結合は、ループを形成する配列中に導入された修飾塩基に対して、公知の手法に基づいて適宜行うことができる。例えば、導入された塩基残基がビオチン修飾塩基である場合には、細胞膜透過性ペプチドのＣ末端をストレプトアビジンで修飾することによって、ＤｂＲＮＡと細胞膜透過性ペプチドを結合することができる。また、導入された修飾塩基がアミノ修飾塩基である場合には、そのスペーサーの末端をマレイミド基またはヨードアセチル基あるいはチオール基で修飾することによって、Ｃ末端がチオール基で修飾されたあるいはＣ末端がマレイミド基またはヨードアセチル基で修飾された細胞膜透過性ペプチドと結合させることができる。
　更に、一本鎖環状ＲＮＡをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などで化学修飾してもよく、化学修飾はループ部分に行うことが好ましい。結合のために、ＰＥＧの両末端を改変して、たとえばホルミル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの、塩基のアミノ基と反応性の官能基を導入する。
　細胞膜透過性ペプチドを結合したＤｂＲＮＡは、たとえば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などとの沈殿または熱変性、それに続く遠心分離；クロマトグラフィー工程、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー工程、ゲル濾過クロマトグラフィー工程、逆相クロマトグラフィー工程、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー工程、およびアフィニティークロマトグラフィー工程；等電点フォーカシング；ゲル電気泳動；ならびにこれらの組合せ、さらには他の公知の技術を用いて適宜回収・精製することができる。
　以下、上記方法で製造した細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡを用いた、ＲＮＡ干渉法について説明する。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、ＲＮＡ干渉法に用いることができる。
　ＲＮＡ干渉とは、ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ともいい、標的ＲＮＡと相補的な配列を持つ小ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡに結合し、それを分解するか又は翻訳を抑制する現象である。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、対照細胞（ＤｂＲＮＡが導入されていない）における標的ＲＮＡの発現を１とした場合に、該ＤｂＲＮＡを導入した細胞における細胞導入後２４時間での標的ＲＮＡの発現が０．４以下を示すことが好ましい。
　標的ＲＮＡの発現は、例えばレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）を細胞に形質転換し、レポーター遺伝子のｍＲＮＡを標的ＲＮＡとして、該標的ＲＮＡの発現が細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡによってどのくらい阻害されているかを、レポーター遺伝子由来のタンパク質の発色、蛍光を測定することにより確認することができる。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて従来的に核酸の細胞導入の際に用いられてきた細胞内デリバリーシステム、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、特にウイルスベクターやカチオン性リポソームなどを用いることなく細胞に導入することができ、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することができる。前記細胞は、ヒト細胞または非ヒト細胞を用いることができる。
　ｉｎ　ｖｉｖｏにてＲＮＡ干渉法を行う場合には、まず細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡを含む試料を透析、ｐＨ調節などを行って、生体に適合するように調製する。動物又は植物への導入方法は特に限定されず、例えば局所投与、静脈内投与、遺伝子銃を用いる方法などが挙げられ、ヒトに適用する場合、安全性の点から微生物等を用いない方法が好ましい。
　細胞内に導入された細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、細胞膜透過性ペプチドの働きにより細胞膜を通過して細胞内に入ると、細胞内ダイサーによりループ部の切断を受けＲＮＡ干渉作用のあるＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）を生じる。ｓｉＲＮＡの末端は、平滑末端または突出末端であり得る。ｓｉＲＮＡが一本鎖となり、ＲＮＡ−ヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ））を形成し、ｓｉＲＮＡと相補的な配列の標的ｍＲＮＡを認識して、ｍＲＮＡを分解し、標的遺伝子の発現が抑制される。
　本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、植物、動物（例えばヒト、ペット、家畜を含む哺乳動物など）、それらの細胞のいずれでも使用可能であり、特に医学、農学分野での広範な応用が期待される。例えば、植物又は動物レベルあるいは植物又は動物細胞レベルでの特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、例えばノックアウト法による機能の解明など、種々の目的のために本発明の細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡを使用することができる。
　また、本発明は、細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物を含有する。
　細胞膜透過性ペプチド修飾ＤｂＲＮＡの医薬組成物への配合量は、組成物の種類や目的等によって調整することができ、組成物の全量に対して、例えば０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、１００重量％であるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の剤形として、例えば液体製剤（溶液剤、懸濁剤、乳濁剤など）、固体製剤（用時調製の凍結乾燥剤など）封入製剤などが挙げられ、また投与経路として、非経口投与が好ましく、例えば患部に直接投与する局所投与、経肺投与、経鼻投与等の経粘膜投与、静脈内投与などが含まれる。
　本発明の医薬組成物は、製剤化、剤形等に応じて、賦形剤（生理食塩水、滅菌水、リンゲル液など）、緩衝剤、等張化剤、安定化剤などを含めてもよい。
　また、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の性別、体重、年齢、重篤度、症状などに応じて変更し得る。
　本発明の医薬組成物の適用は、特に限定されないが、例えば、癌などの疾患の治療、例えば癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能の抑制、感染性疾患の原因細菌もしくはウイルスで特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能の抑制、細胞増殖の促進または阻害などが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
ＴＡＴペプチドの合成
　本実施例で用いた細胞膜透過性ペプチドであるＴＡＴペプチドの配列を下記に示す。（Ｎ末端）４７　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ５７−Ｃｙｓ（Ｃ末端）（配列番号２）
　これは、野生型ＨＩＶ−１　ＴＡＴプロテインの４７−５７残基のアミノ酸配列のＣ末端にシステインを導入したものである。
　当該ペプチドの合成はＰＨ　Ｊａｐａｎに依頼した。
マレイミド修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成
　マレイミド修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成の流れを図１に示す。
　ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡとマレイミド基を反応させ、更にマレイミド基とＴＡＴペプチドのシステインに含まれるチオール基を反応させて合成を行う。
　ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの構造および配列を図２（ａ）および（ｂ）に示す。
　図２（ｂ）に示す配列のうち、下線の配列がループ部を形成する配列であり、太字で示した部位がアミノ修飾部位を示す。
　ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡの合成は特開２００８−２７８７８４号公報などに記載の方法に基づいて行うことができる。ＤｂＲＮＡの原料となる５’リン酸化ＲＮＡは、全てホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ　Ｈ８−ＳＥ）により合成した。ＲＮＡアミダイトはＴＢＤＭＳ保護体（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、５’　リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。ループ部のアミノ修飾部位には、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６−ｄＴを導入した。脱保護は定法に従い、ＰＡＧＥ精製した。
　次に、酵素反応を、２μＭ　ＲＮＡ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄ、２．０ｕｎｉｔｓ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ、０．００６％ＢＳＡ、２５％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰの組成で、反応スケール２５μｌで行った。
　具体的には、まず、５’リン酸化ＲＮＡ二本鎖が４μＭとなるよう、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＡＴＰ緩衝液中（２ｘ緩衝液）１２．５μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱後、室温まで徐冷した。その後、ＢＳＡ水溶液、ＰＥＧ６０００水溶液、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ）を上記の組成と反応スケールになるように加え、１１℃で２０時間インキュベートした。エタノール沈殿により、ＲＮＡを回収した。
　次に、ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡのアミノ基とマレイミド化合物を反応させ、マレイミド修飾ＤｂＲＮＡを合成する。マレイミド化合物としては、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏ−Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　４−（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）を用いた。
　具体的には、まず、ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡが５μＭとなるよう、５ｍＭ　Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、７５ｍＭ　ＮａＢ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）に溶解し、室温にて３時間、振とうした。その後ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濃縮して未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを取り除き、イソプロパノール沈殿を行い、ループ部をマレイミド修飾したＤｂＲＮＡを回収した。反応の進行は逆相ＨＰＬＣで確認を行った（図３）。
　次に、ループ部をマレイミド修飾したＤｂＲＮＡのマレイミド基とＴＡＴペプチドのチオール基（Ｃ末端にシステインに含まれている）を反応させて、ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを合成した。具体的には、まず、ループ部をマレイミド修飾したＤｂＲＮＡが３．６９μＭとなるよう、１ｍＭ　ＴＡＴペプチド、０．０１Ｍ　ＮａＢ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）に溶解し、室温にて１２時間、振とうした。反応後、１０％変性ＰＡＧＥに反応液をそのままアプライし、反応の進行を確認した（図４）。以下、本明細書および図面中、ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを「ＴＡＴ−Ｄｂ２３」と記載する。
　なお、本実験においては対照として、ｓｉＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾されていないＤｂＲＮＡ（以下、「Ｄｂ２３」と記載）を利用した。ｓｉＲＮＡおよびＤｂ２３の構造および配列は図５に示す。ｓｉＲＮＡおよびＤｂ２３は公知の手法（特開２００８−２７８７８４号公報）に基づいてそれぞれ配列番号５および６、ならびに配列番号７および８に示す配列からなるＲＮＡを用いて作製することができる。
ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの細胞膜透過能の評価
　合成したＴＡＴ−Ｄｂ２３をトランスフェクション試薬なしで、細胞内に導入させ、ＲＮＡ干渉作用を調べることによって当該ＲＮＡの細胞膜透過能を評価した。
　細胞としては、ベクターのトランスフェクションの過程をなくすために、ルシフェラーゼを安定発現したＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ（北海道大学大学院薬学研究院原島研究室畠山裕人助教より御分与頂いた）を用いた。
　ルシフェラーゼを安定発現したＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓを血清および抗生物質を含有しないＤＭＥＭ培地中に２０ｘ１０４細胞／ｍｌとなるよう調製した。
　各種ＲＮＡ＋Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（および必要に応じてトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００））をＴｏｔａｌ　５０μＬ／ｗｅｌｌになるようにＲＮＡ　ｍｉｘを調整した。
　ＲＮＡ　ｍｉｘと細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ混合し１０分間静置し、その後９６ウェルプレートに播種した。
　その後、３７℃、５％ＣＯ２下２．５時間インキュベートし、２０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地をそれぞれのウェルに加えた。３７℃でさらにインキュベート後、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、添付のプロトコールに従い細胞を可溶化してルシフェラーゼ発現量を定量した（条件−試薬量：３０μｌ；ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ：２秒；ｒｅａｄ　ｔｉｍｅ：１０秒；機器：Ｗａｌｌａｃ　ＡＲＶＯ　ＳＸ　１４２０　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）。
　比較として、バッファーのみ（コントロール）；トランスフェクション試薬と混合させたｓｉＲＮＡまたはＤｂ２３（ポジティブコントロール）；ｓｉＲＮＡまたはＤｂ２３のみ；ＴＡＴペプチドと混合させたｓｉＲＮＡまたはＤｂ２３、の条件も同様に評価した。蛍ルシフェラーゼの発光強度は、内部標準であるレニラルシフェラーゼの発光強度により補正した。
　結果を図６に示す。
　バッファーのみ（コントロール）を添加した場合の、ルシフェラーゼの発現量を１として各サンプルを添加した際のルシフェラーゼの発現量を相対的に示す。この結果より、トランスフェクション試薬を用いずに単独で導入したｓｉＲＮＡまたはＤｂ２３はＲＮＡ干渉作用を示さないことから、ＲＮＡのみでは細胞内導入が起こっていないことが示された。
　また、ＴＡＴペプチドと混合しただけのｓｉＲＮＡまたはＤｂ２３もＲＮＡ干渉作用は示さないことから、ＴＡＴペプチドとＲＮＡを混合させるだけではＲＮＡは細胞内に取り込まれないことが示された。
　一方、ＴＡＴ−Ｄｂ２３は２５ｎＭではＲＮＡ干渉作用を示さないが、１００ｎＭおよび２００ｎＭにおいてはＲＮＡ干渉作用を示した。
　したがって、ＴＡＴペプチドをＤｂＲＮＡのループ部に修飾することで、当該ＲＮＡはトランスフェクション試薬なしで細胞内に導入できることが明らかとなった。
　２００ｎＭのＴＡＴ−Ｄｂ２３については、ポジティブコントロールのＤｂ２３とほぼ同程度の作用を示していると言える。
　以上より、ＴＡＴペプチド付加することによってＤｂＲＮＡに細胞膜透過能を付与することに成功した。
ヨードアセチル修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成
　ヨードアセチル修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成の流れを図７に示す。
　ヨードアセチル修飾を介したＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡは、ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡをヨードアセチル化した後、更にヨードアセチル基とＴＡＴペプチドのシステインに含まれるチオール基を反応させて合成を行う。
　具体的には、ループ部をアミノ修飾したＤｂＲＮＡ（上記実施例１と同様に作製）が５０μＭとなるように０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液２０μＬ中に溶解し、５０ｍＭヨードアセチルＮＨＳエステルを２μＬを加え、室温で３時間静置した。その後、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）４μＬ，２−プロパノール８０μＬを加え混合し、−３０℃にて１時間インキュベーションし、遠心（２０，０００ｇ，４℃，３０分）して、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡを回収した（収率７９％）。
　次に、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡのＴＡＴペプチド修飾を行った。具体的には、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡが１μＭとなるように、２Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液２５μＬ中に溶解し、３５０μＬのホルムアミドと０．５μＬの５ｍＭ　ＴＡＴペプチドを加えて、室温で一晩攪拌した。その後、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）４μＬ，２−プロパノール８０μＬを加え混合し、−３０℃にて１時間インキュベーションし、遠心（２０，０００ｇ，４℃，３０分）して、ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを回収した。得られたＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを、イオン交換カラム（ＴＯＳＯＨ　ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＤＥＡＥ−２ＳＷ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｎｏ．Ｍ０００９，Ｐａｒｔ　Ｎｏ．０７１６８）を用いて、ＨＰＬＣ精製した（０−８０％１Ｍ過塩素酸ナトリウム，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８），５０％ホルミアミド／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８），５０％ホルミアミド）（収率８８％）。
　上記アミノ修飾したＤｂＲＮＡ、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡをそれぞれ、イオン交換カラム（ＴＯＳＯＨ　ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＤＥＡＥ−２ＳＷ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｎｏ．Ｍ０００９，Ｐａｒｔ　Ｎｏ．０７１６８）を用いて、ＨＰＬＣにて分析した（０−８０％１Ｍ過塩素酸ナトリウム，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８），５０％ホルミアミド／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８），５０％ホルミアミド，ＴＯＳＯＨ　ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＤＥＡＥ−２ＳＷ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｎｏ．Ｍ０００９，Ｐａｒｔ　Ｎｏ．０７１６８）。
　結果を図８に示す。原料となるアミノ修飾したＤｂＲＮＡと比較して、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡのリテンションタイムが変化していることから、これらＤｂＲＮＡにおけるヨードアセチル化およびＴＡＴペプチド修飾が確認できた。
　さらに、上記アミノ修飾したＤｂＲＮＡ、ヨードアセチル化ＤｂＲＮＡおよびＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを１０％変性ＰＡＧＥ（１０％ＰＡＧＥ，７．５Ｍ尿素，２５％ホルミアミ，１×ＴＢＥ，１ｍｍ厚）を用いて分析した（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩで染色後、ＢｉｏＲａｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　ＦＸで画像化した）。ＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡ（レーン３）は、アミノ修飾したＤｂＲＮＡ（レーン１）およびヨードアセチル化ＤｂＲＮＡ（レーン２）と比較してバンドが高分子側にシフトしていることから、ＴＡＴペプチド修飾されていることが確認できた。
ＧＳＫ３β遺伝子を標的とするＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成
　ＧＳＫ３β遺伝子を標的とするＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの原料となる、５’リン酸化ＲＮＡは、公知の手法に基づいて合成した（特開２００８−２７８７８４号公報）。ＧＳＫ３β遺伝子を標的とするＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの構造および配列を図１０（ａ）および（ｂ）に示す。図１０（ｂ）に示す配列のうち、下線の配列がループ部を形成する配列であり、太字で示した部位がアミノ修飾部位を示す。
　具体的には、図１０（ｂ）に示す２本のＲＮＡ配列（配列番号９および１０）を、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ　Ｈ８−ＳＥ）により合成した。ＲＮＡアミダイトはＴＢＤＭＳ保護体（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、５’リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。ループ部のアミノ修飾部位には、Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６−ｄＴを導入した。脱保護は定法に従い、ＰＡＧＥ精製した。
　当該ＲＮＡ配列を用いたＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡの合成は上記実施例２と同様に、ヨードアセチル修飾を介して行った。得られたＧＳＫ３β遺伝子を標的とするＴＡＴペプチド修飾ＤｂＲＮＡを、以下、本明細書および図面中、「ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫ」と記載する。
ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫによるＧＳＫ３β遺伝子発現阻害実験
　網膜細胞において、ＧＳＫ３β遺伝子の発現を阻害するとＷｎｔ／β−カテニン経路の活性化により細胞増殖が促進され、その結果、網膜組織の再生を生じることが明らかとなっている（Ｏｓａｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）２７（１５）：４２１０−４２１９）。本実験においては、網膜組織培養系にＴＡＴ−ｄｂＧＳＫ添加の有無による、網膜細胞の細胞増殖を指標にして、ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫのＧＳＫ３β遺伝子発現阻害効果を評価した。
　具体的には以下のとおりである。
　麻酔下で屠殺した６週齢ＤＡラットの眼球を取り出し、神経性網膜のみを他の組織（角膜、強膜、水晶体、虹彩、毛様体、網膜色素上皮細胞）から分離した。１ｍｌの培養液（５０％　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ／ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ），２５％　ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２５％　ｈｅａｔ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｈｏｒｓｅ　ｓｅｒｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２００μＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，５．７５ｍｇ／ｍｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ）を入れた細胞培養用６穴ディッシュ（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ）上に組織培養用セルカルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ，ＰＩＣＭ３０５０）を置き、このインサート上に分離した神経性網膜を神経節細胞が上になるように載せ、５％　ＣＯ２、３５．５度にて４日間培養した。培養１日目及び３日目に神経性網膜が載ったインサートを空の６穴ディッシュに移し、ＨＢＳＳで希釈したＴＡＴ−ｄｂ２３又はＴＡＴ−ｄｂＧＳＫ溶液１０μＬを３０分毎に２回神経性網膜上に載せた。インサートを再び培養液の入ったディッシュに戻し、培養４日目にＳｕｐｅｒｆｉｘ（ＫＵＲＡＢＯ）を用いて４℃にて３日間固定後、パラフィンにて組織を包埋し切片を作成した。抗体染色には１次抗体としてｒａｔ　ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ（ｓｅｒｏｔｅｃ，ＯＢＴ００３０）、ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｔ　ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（ｈｉｇｈｌｙ　ｃｒｏｓｓ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）を用いた。
　結果を、図１１に示す。
　ＴＡＴ−ｄｂ２３（コントロール）を添加した場合と比較して、ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫを添加した網膜組織においてＢｒｄＵ標識（赤）された細胞が多く観察された（図中、矢印）。この結果は、ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫのＲＮＡ干渉作用により、ＧＳＫ３β遺伝子の発現が阻害され、網膜細胞の増殖が促進されたことを示唆する。
　以上より、ＴＡＴ−ｄｂＧＳＫは他の細胞膜透過能を付与する化合物を用いることなく、標的細胞において有効にＲＮＡ干渉作用を生じることが明らかになった。
　本発明により、ウイルスベクターやカチオン性リポソームを用いることなく、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなど機能性二本鎖ＲＮＡを生じるＤｂＲＮＡを細胞内に導入することができ、安全かつ効率的に細胞においてＲＮＡ制御を引き起こすことができる。したがって、本発明は癌などの疾患の新たな治療薬として期待される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (6)

  1. 　センス鎖配列と、該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列と、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じか又は異なる２つのループ配列とを含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が対合してステムを形成し、該ループ配列の１つ又は２つが１又は複数の細胞膜透過性ペプチドによって修飾されていることを特徴とし、ならびに細胞膜透過能を有し、かつ細胞内で該２つのループ配列が切除されて機能性二本鎖ＲＮＡを生じさせる、細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
  2. 　細胞膜透過性ペプチドが、ＨＩＶ−１　ＴＡＴタンパク質に由来するペプチドを含む、請求項１に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
  3. 　いずれかのループの、ステムより最も遠位の一箇所が細胞膜透過性ペプチドによって修飾されている、請求項１または２に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡ。
  4. 　以下の（ａ）~（ｃ）の工程を含む、請求項１~３のいずれか１項に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡの製造方法：
    　（ａ）請求項１~３のいずれか１項に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡを構成する塩基配列を任意の箇所で２つに分けてなる塩基配列をそれぞれ有する、第一鎖および第二鎖をそれぞれ合成する工程であって、第一鎖および／または第二鎖が有するループ配列を構成する塩基配列中に１又は複数の修飾塩基を導入することを含む、上記工程；
    　（ｂ）第一鎖の塩基配列の５’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の３’末端の塩基、および第一鎖の塩基配列の３’末端の塩基と第二鎖の塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結する工程であって、その際、第一鎖および第二鎖が有するループ配列を構成する塩基配列はそれぞれまたは一緒になってループを形成し、ならびに第一鎖内もしくは第二鎖内または第一鎖と第二鎖との間で、互いに相補的関係にある塩基配列が対合してステムを形成する、上記工程；
    ならびに
    　（ｃ）修飾塩基に対して細胞膜透過性ペプチドを結合する工程。
  5. 　請求項１~３のいずれか１項に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡをヒト由来の細胞に添加して、該ＲＮＡをその他の細胞内デリバリーシステムを用いることなく該細胞内に導入し、それによって該細胞内の標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をｉｎ　ｖｉｔｒｏで抑制する方法。
  6. 　請求項１~３のいずれか１項に記載の細胞膜透過性ペプチド修飾ダンベル型一本鎖環状ＲＮＡを非ヒト動物、植物又はそれらの細胞に添加して、該ＲＮＡをその他の細胞内デリバリーシステムを用いることなく該細胞内に導入し、それによって該細胞内の標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016100401A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
EP4095248A1 (en) * 2021-05-25 2022-11-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Circrnas for gene silencing
JP2023055874A (ja) * 2015-12-21 2023-04-18 スツラ セラポーティクス エルティーディー ステープルまたはステッチペプチドに複合された生物活性化合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEADE, B.R. ET AL.: "Exogenous siRNA delivery using peptide transduction domains/cell penetrating peptides", ADV.DRUG DELIV.REV., vol. 59, no. 2-3, 2007, pages 134 - 140 *
MIWAKO UDA ET AL.: "Maku Tokano o Yusuru Shushoku Dumbbell-gata RNA ni yoru RNA Kanshoho no Kaihatsu", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN KOEN YOKOSHU, vol. 90, no. 3, 12 March 2010 (2010-03-12), pages 785 *
MIWAKO UDA ET AL.: "Synthsis of dumbbell-shaped nanocircular RNAs for improvement of permeability and stability", CSJ: THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN KOEN YOKOSHU, vol. 89, no. 2, 2009, pages 1521, XP008174518 *
STETSENKO, D.A. ET AL.: "Peptide conjugates of oligonucleotides as enhanced antisense agents", MOL.BIOL., vol. 34, no. 6, 2000, pages 852 - 859 *
YEH, H.Y. ET AL.: "Visualizing the dynamics of viral replication in living cells via Tat peptide delivery of nuclease-resistant molecular beacons", PROC.NATL.ACAD.SCI.USA, vol. 105, no. 45, 2008, pages 17522 - 17525 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016100401A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
EP3569711A1 (en) * 2014-12-15 2019-11-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
JP2023055874A (ja) * 2015-12-21 2023-04-18 スツラ セラポーティクス エルティーディー ステープルまたはステッチペプチドに複合された生物活性化合物
US11944688B2 (en) 2015-12-21 2024-04-02 Sutura Therapeutics Ltd Biologically active compounds
EP4095248A1 (en) * 2021-05-25 2022-11-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Circrnas for gene silencing
WO2022248572A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Circrnas for gene silencing

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