[go: up one dir, main page]

JP2003180386A - 薬物の発見のための細胞 - Google Patents

薬物の発見のための細胞

Info

Publication number
JP2003180386A
JP2003180386A JP2002311841A JP2002311841A JP2003180386A JP 2003180386 A JP2003180386 A JP 2003180386A JP 2002311841 A JP2002311841 A JP 2002311841A JP 2002311841 A JP2002311841 A JP 2002311841A JP 2003180386 A JP2003180386 A JP 2003180386A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
expression
protein
zinc finger
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2002311841A
Other languages
English (en)
Inventor
Casey Case
ケース キャシー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sangamo Therapeutics Inc
Original Assignee
Sangamo Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Biosciences Inc filed Critical Sangamo Biosciences Inc
Publication of JP2003180386A publication Critical patent/JP2003180386A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特定の分子標的と相互作用する候補化合物の
能力について、候補化合物をスクリーニングするための
新規のアッセイを可能にすること。 【解決手段】 内因性分子標的の発現を直接的にかまた
は間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質
を含む細胞。１つの実施形態においては、この細胞が、
ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含む。１つの実施形態においては、この細胞が、
前記ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクト
されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本開示は、細胞の操作および
薬物の発見の分野にある。
【０００２】
【従来の技術】過去何年もの間の製薬会社のリサーチ活
動の多くは、既存の薬物の付加的な改良に焦点を当てて
いた。これらの努力は、反復ラウンドの化合物の改変お
よび生物学的試験を含み、そして類似の標的に指向され
る利用可能な薬物を大きな割合で得た。
【０００３】約１２年前、薬学的リサーチ活動の重点
が、新規の化学的クラスおよび新規の分子標的の意図的
な発見へとシフトし始めた。重点におけるこの変化、お
よびタイムリーな技術的躍進（例えば、分子生物学、実
験の自動化、コンビナトリアルケミストリー）は、高ス
ループットスクリーニング（すなわち、ＨＴＳ）を誕生
させた。この高スループットスクリーニングは、現在、
生物薬剤学的産業中に広まっている。
【０００４】高スループットスクリーニングは、以下の
いくつかの工程を包含する：特定の生理学的応答を予測
するアッセイを開発する工程；何回も再現可能に実施し
得るようにこのアッセイを自動化する工程；およびこの
アッセイで「ヒット」し得る化学構造（このような構造
が意図される生理学的応答を誘発し得ることを示唆す
る）を同定するために化学ライブラリーからサンプルを
順次試験する工程。高スループットスクリーニングによ
るヒットを種々の二次アッセイにおいて追跡して、人為
的な結果（特に、毒性化合物）を排除する。
【０００５】高スループットスクリーニングは、２０
０，０００個以上の化合物サンプルを試験する工程を含
み得、それ故、ラボロボットの使用を必要とする。この
ようなアッセイにおいて試験されるサンプルの例は、化
合物アーカイブ中に保存された純粋な化合物（例えば、
特定の製薬会社は、何十年もの医薬品化学の努力を通し
て生み出された化学ライブラリーを保有する）、学術源
から購入されるサンプル、天然産物の抽出物および高ス
ループットスクリーニングのために意図的に生成された
ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリ
ー）を含む。
【０００６】高スループットスクリーニングにおいて使
用されるアッセイは、特定の生物学的性質または生化学
的性質を有する化学サンプルの存在を検出することが意
図される。これらの性質を選んで、インビボで適用され
る場合に特定の生物学的応答を惹起する潜在能力を有す
る化合物を同定する。高スループットスクリーニング
は、代表的に、最終的に薬物として使用される因子より
もむしろ薬物候補を同定する。高スループットアッセイ
においていくらかのレベルの所望の生物学的性質を有す
ることが見出された特定の化学的クラスの化合物は、次
いで、医薬品化学者による誘導化合物の合成のための基
礎となり得る。
【０００７】これらのアッセイは、広範な２つのカテゴ
リに分類される：生化学的アッセイおよび細胞ベースの
アッセイ。生化学的アッセイは、細胞環境の外側の純粋
な成分または半純粋な成分を利用する。酵素アッセイお
よびレセプター結合アッセイは、生化学的アッセイの代
表的な例である。細胞ベースのアッセイは、培養中のイ
ンタクトな細胞を利用する。このようなアッセイの例と
しては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイおよ
びカルシウムフラックス（ｆｌｕｘ）アッセイが挙げら
れる。
【０００８】生化学的アッセイは、通常、実施するのが
より容易であり、そして一般的に、従来の細胞ベースの
アッセイよりも人為的結果への傾向がより少ない。生化
学的アッセイにおいて「活性」として同定された化合物
は、代表的に、所望のメカニズムに従って機能し、この
ことが、「ヒット」として化合物の状態を確証するため
に必要とされる追跡実験の回数を減少させる。しかし、
生化学的アッセイの主な不利点は、生物学的内容物の欠
如である。生化学的スクリーニングによる化合物の「ヒ
ット」は、標的タンパク質に到達しそして作用するため
に、形質膜または他の構造物を横切る必要がない。結果
的に、生化学的アッセイは、細胞ベースのアッセイより
も、動物における化合物の活性の予測性がはるかに少な
い傾向にある。
【０００９】細胞ベースのアッセイは、分子標的の多数
の生物学的内容物を保存する。形質膜を通じて通過し得
ない化合物または細胞に対して毒性のある化合物は、追
跡されない。しかし、この内容物が、アッセイに複雑性
を付加する。それ故、従来の細胞ベースのアッセイは、
生化学的アッセイよりも、人為的な結果または偽陽性の
結果に対するはるかに高い傾向がある。複雑な毒性反応
を誘発するかまたはアポトーシスを誘発する化合物は、
特に厄介である。従来の細胞ベースの高スループットス
クリーニングにあてられる多くの労力は、誤ったヒット
または望ましくないメカニズムで働くヒットを検出する
追跡アッセイに向けられる。
【００１０】偽陽性ヒットまたは人為的なヒットが迅速
に同定されそして除外され得る場合、生化学的アッセイ
の容易さおよび有効性が、生物学的内容物を保存しなが
ら、細胞ベースのアッセイにおいてアプローチされ得
る。この結果は、生物学的機能の最適なスループットお
よび最適な予測性を伴うアッセイである。要するに、新
たな医薬品の発見のためのより効率的なプロセスが、実
現される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、特定
の分子標的と相互作用する候補化合物の能力について、
候補化合物をスクリーニングするための新規のアッセイ
を可能にすることである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、分子標的との相互作用について化合物をスクリ
ーニングするための方法を提供し、この方法は、以下： （ａ）この化合物と第１細胞とを接触させる工程； （ｂ）この第１細胞の性質の第１値を決定する工程であ
って、この性質が、この化合物を接触させている細胞に
対して応答性である、工程； （ｃ）この化合物と第２細胞とを接触させる工程であっ
て、ここで、この第２細胞が、この分子標的の発現を直
接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンクフィンガ
ータンパク質を含む、工程； （ｄ）この第２細胞における性質の第２値を決定する工
程であって、ここで、この第１値とこの第２値との間の
差が、この化合物とこの分子標的との間の相互作用の指
標を提供する、工程、を包含する。
【００１３】１つの実施形態において、上記外因性ジン
クフィンガータンパク質は、上記分子標的の発現を直接
的に調節する。
【００１４】１つの実施形態において、上記外因性ジン
クフィンガータンパク質は、ポリペプチドとして提供さ
れる。
【００１５】１つの実施形態において、上記外因性ジン
クフィンガータンパク質は、このジンクフィンガータン
パク質をコードするポリヌクレオチドとして提供され
る。
【００１６】１つの実施形態において、上記外因性ジン
クフィンガータンパク質は、機能的ドメインをさらに含
む。
【００１７】１つの実施形態において、上記機能的ドメ
インは、活性化ドメインを含む。
【００１８】１つの実施形態において、上記活性化ドメ
インは、ＶＰ１６、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット、
ＶＰ６４およびリガンド結合甲状腺ホルモンレセプター
からなる群より選択される。
【００１９】１つの実施形態において、上記機能的ドメ
インは、抑制ドメインを含む。
【００２０】１つの実施形態において、上記抑制ドメイ
ンは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ
３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメ
ンバーからなる群より選択される。
【００２１】１つの実施形態において、上記分子標的
は、シグナル伝達経路に関連する。
【００２２】１つの実施形態において、上記化合物は、
上記分子標的を介するシグナルの伝達を阻害するその能
力についてスクリーニングされる。
【００２３】１つの実施形態において、上記第２細胞
は、第２外因性ジンクフィンガータンパク質を含む。
【００２４】１つの実施形態において、上記第１細胞お
よび第２細胞は、上記ジンクフィンガータンパク質をコ
ードする上記ポリヌクレオチド以外について実質的に同
一である。
【００２５】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドは、上記第２細胞に安定にトランスフェクトされ
る。
【００２６】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質をコードする上記ポリヌクレオチド
は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
【００２７】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質の発現は、上記第２細胞において誘導
される。
【００２８】１つの実施形態において、上記第１細胞お
よび第２細胞は、上記誘導性のジンクフィンガータンパ
ク質をコードする上記ポリヌクレオチドを含む。
【００２９】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質の発現は、上記第１細胞において誘導
されない。
【００３０】１つの実施形態において、上記分子標的
は、タンパク質である。
【００３１】１つの実施形態において、上記分子標的
は、細胞表面レセプターである。
【００３２】１つの実施形態において、上記第２細胞に
おける上記分子標的の発現のレベルは、上記第１細胞に
おける発現レベルの２５％よりも小さい。
【００３３】１つの実施形態において、上記第２細胞に
おける上記分子標的の発現レベルは、上記第１細胞にお
ける発現レベルの１２５％よりも大きい。
【００３４】１つの実施形態において、上記第２細胞に
おける上記分子標的の発現レベルは、上記第１細胞にお
ける発現レベルの５％よりも小さい。
【００３５】１つの実施形態において、上記性質は、増
殖、新生血管形成、レポーター発現および選択マーカー
発現からなる群より選択される。
【００３６】別の局面において、本発明は、分子標的と
の相互作用について化合物をスクリーニングする方法を
提供し、この方法は、以下：（ａ）この分子標的の発現
を調節する外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細
胞から膜を単離する工程および（ｂ）工程（ａ）の単離
された膜とこの化合物との相互作用をアッセイする工
程、を包含する。
【００３７】１つの実施形態において、上記分子標的
は、細胞表面分子および膜結合分子からなる群より選択
される。
【００３８】１つの実施形態において、上記相互作用
は、上記単離された膜への上記化合物の結合を測定する
ことによってアッセイされる。
【００３９】１つの実施形態において、上記化合物は、
放射標識される。
【００４０】別の局面において、本発明は、細胞プロセ
スに対するその効果について化合物をスクリーニングす
る方法を提供し、この方法は、以下： （ａ）第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチ
ドを含む細胞を提供する工程であって、この第１ポリヌ
クレオチドは、第１転写制御エレメントに作動可能に連
結された外因性ジンクフィンガータンパク質をコードす
る第１核酸分子を含み、ここで、この第１転写制御エレ
メントは、細胞プロセスに関連する分子に対して応答性
であり、そして、この第２ポリヌクレオチドは、レポー
ターまたは選択マーカーをコードする第２核酸分子を含
み、ここで、このレポーターまたは選択マーカーの発現
は、この外因性ジンクフィンガータンパク質によって調
節される、工程； （ｂ）工程（ａ）の細胞をこの化合物と接触させる工
程；および、 （ｃ）レポーターまたは選択マーカーの発現レベルをア
ッセイする工程であって、ここで、このレポーターまた
は選択マーカーの発現レベルにおける変化は、この化合
物が細胞プロセスに対する効果を有することを示す、工
程、を包含する。
【００４１】１つの実施形態において、上記細胞プロセ
スは、シグナル伝達経路を含む。
【００４２】１つの実施形態において、上記第１ポリヌ
クレオチドは、上記ジンクフィンガータンパク質に作動
可能に連結された機能的ドメインをコードする配列をさ
らに含む。
【００４３】１つの実施形態において、上記機能的ドメ
インは、抑制ドメインである。
【００４４】１つの実施形態において、上記抑制ドメイ
ンは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ
３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメ
ンバーからなる群より選択される。
【００４５】１つの実施形態において、上記レポーター
または選択マーカーは、直接レポーター、酵素的レポー
ター、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、およびそ
れらの組合わせからなる群より選択される。
【００４６】１つの実施形態において、上記直接レポー
ターは、蛍光タンパク質である。
【００４７】１つの実施形態において、上記直接レポー
ターは、緑色蛍光タンパク質である。
【００４８】１つの実施形態において、上記酵素的レポ
ーターは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β
−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）からなる群より選択される。
【００４９】１つの実施形態において、上記陽性選択マ
ーカーは、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、Ｚｅｏｃ
ｉｎ（登録商標）耐性、およびハイグロマイシン耐性か
らなる群より選択される。
【００５０】１つの実施形態において、上記陰性選択マ
ーカーは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ
−ＴＫ）である。
【００５１】別の局面において、本発明は、分子標的の
発現を直接的にかまたは間接的に調節する外因性ジンク
フィンガータンパク質を含む細胞を提供する。
【００５２】１つの実施形態において、上記細胞は、上
記ジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを用いてトランスフェクトされる。
【００５３】１つの実施形態において、上記細胞は、上
記ポリヌクレオチドを用いて安定にトランスフェクトさ
れている。
【００５４】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質は、上記分子標的の発現を直接的に調
節する。
【００５５】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質は、上記分子標的の発現を抑制する。
【００５６】１つの実施形態において、上記ジンクフィ
ンガータンパク質は、上記分子標的の発現を活性化す
る。
【００５７】別の局面において、本発明は、ＺＦＰをコ
ードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供し、この細
胞は、レポーターをコードするポリヌクレオチドをさら
に含み、ここで、このＺＦＰの発現は、細胞プロセスに
関連する分子に対して応答性である転写制御エレメント
によって調節され；そして、ここで、このレポーターの
発現は、ＺＦＰによって調節される。
【００５８】１つの実施形態において、上記細胞プロセ
スは、シグナル伝達経路を含む。
【００５９】１つの実施形態において、上記第１ポリヌ
クレオチドは、上記ジンクフィンガータンパク質に作動
可能に連結された機能的ドメインをコードする配列をさ
らに含む。
【００６０】１つの実施形態において、上記機能的ドメ
インは、抑制ドメインである。
【００６１】１つの実施形態において、上記抑制ドメイ
ンは、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ
３、非リガンド化ＴＲ、およびＤＮＭＴファミリーのメ
ンバーからなる群より選択される。
【００６２】１つの実施形態において、上記レポーター
または選択マーカーは、直接レポーター、酵素的レポー
ター、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、およびそ
れらの組合わせからなる群より選択される。
【００６３】１つの実施形態において、上記直接レポー
ターは、蛍光タンパク質である。
【００６４】１つの実施形態において、上記直接レポー
ターは、緑色蛍光タンパク質である。
【００６５】１つの実施形態において、上記酵素的レポ
ーターは、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β
−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）からなる群より選択される。
【００６６】１つの実施形態において、上記陽性選択マ
ーカーは、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、Ｚｅｏｃ
ｉｎ（登録商標）耐性、およびハイグロマイシン耐性か
らなる群より選択される。
【００６７】１つの実施形態において、上記陰性選択マ
ーカーは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ
−ＴＫ）である。
【００６８】別の局面において、本発明は、分子標的と
の相互作用について化合物をスクリーニングするための
キットを提供し、このキットは、（ａ）上記第１細胞；
（ｂ）上記外因性ジンクフィンガータンパク質を欠くこ
とを除いて、この第１細胞と実質的に同一である第２細
胞；（ｃ）補助試薬；（ｄ）指示書；および（ｅ）適切
な容器を備える。
【００６９】別の局面において、本発明は、分子標的と
の相互作用について化合物をスクリーニングするための
キットを提供し、このキットは、（ａ）上記細胞；
（ｂ）補助試薬；（ｃ）指示書；および（ｄ）適切な容
器を備える。
【００７０】１つの局面において、分子標的との相互作
用について化合物をスクリーニングするための方法が提
供される。特定の実施形態において、本方法は、以下の
工程を包含する：（ａ）この化合物と第１細胞とを接触
させる工程；（ｂ）この第１細胞の性質の第１値を決定
する工程であって、この性質が、この化合物を接触させ
ている細胞に対して応答性である、工程；（ｃ）この化
合物と第２細胞とを接触させる工程であって、ここで、
この第２細胞が、この分子標的の発現を直接的にかまた
は間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質
を含む、工程；（ｄ）この第２細胞におけるこの性質の
第２値を決定する工程。この第１細胞におけるこの細胞
の性質の値とこの第２細胞におけるこの細胞の性質の値
との間の差が、この化合物とこの分子標的との間の相互
作用の指標を提供する。このジンクフィンガータンパク
質は、好ましくは、この分子標的自体の発現を調節する
が、いくつかの実施形態において、このジンクフィンガ
ータンパク質は、例えば、次いで、この分子標的を調節
および／またはこの分子標的に作用するタンパク質の発
現を調節することによって、この分子標的の発現を間接
的に調節し得る。それ故、これらのスクリーニング方法
を用いて、当業者は、例えば、この分子標的を介するシ
グナルを伝達するその能力またはこの分子標的を介する
シグナルの伝達をブロックするその能力について化合物
を試験し得る。
【００７１】特定の実施形態において、第１細胞および
第２細胞は、第２の細胞が外因性ジンクフィンガータン
パク質および／または外因性ジンクフィンガータンパク
質コードする配列を含むことを除いて、実質的に同一で
ある。特定の実施形態において、さらに、第１細胞と第
２細胞との間に遺伝的差異（および／または表現型差
異）が存在し得る。
【００７２】本明細書において記載された方法のいずれ
かにおいて、ジンクフィンガータンパク質は、融合分子
（例えば、ジンクフィンガータンパク質と機能的ドメイ
ンとの融合体）の成分であり得る。この機能的ドメイン
は、例えば、抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＢＤ
−２Ｂ、ｖ−ＥｒｂＡ、ＭＢＤ３、非リガンド化ＴＲ、
およびＤＮＭＴファミリーのメンバー）；活性化ドメイ
ン（例えば、ＶＰ１６、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニッ
ト、リガンド結合ＴＲ、およびＶＰ６４）；インシュレ
ータ（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ドメイン；クロマチン再構
築タンパク質もしくはクロマチン再構築複合体の成分；
ならびに／またはメチル結合ドメインであり得る。本方
法に従って、ジンクフィンガータンパク質は、標的の発
現を活性化するかまたは阻害するかのいずれかである。
ジンクフィンガータンパク質（または融合体）は、発現
を活性化し得、例えば、その結果、第２細胞における発
現レベルが、第１細胞における発現レベルの１２５％ま
たは１７５％より大きい。ジンクフィンガータンパク質
は、発現を阻害し得、例えば、その結果、第２細胞にお
ける発現レベルが、第１細胞における発現レベルの９５
％、７５％、５０％、２５％、または５％より小さい。
【００７３】特定の実施形態において、この分子標的は
タンパク質である。しかし、分子標的は、その発現がジ
ンクフィンガータンパク質によって調節され得る任意の
分子（例えば、ＲＮＡ、炭水化物および／または脂質）
である。
【００７４】本明細書中に記載される任意の方法におい
て、このジンクフィンガータンパク質（または融合タン
パク質）は、タンパク質として、またはこのタンパク質
もしくは融合分子をコードするポリヌクレオチドとして
提供される。従って、この方法によって、このジンクフ
ィンガータンパク質は、第２細胞中で発現されるかまた
は第２細胞に付加されるかのいずれかである。このジン
クフィンガータンパク質がポリヌクレオチドとして提供
される特定の実施形態において、例えば、このジンクフ
ィンガータンパク質をコードする配列に作動可能に連結
された誘導性転写制御エレメント（例えば、プロモータ
ー）を使用して、このジンクフィンガータンパク質の発
現は誘導性であり得る。これらの実施形態において、第
１細胞および第２細胞は、両方共ジンクフィンガータン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含み得るが、し
かし発現は２つの一致する細胞のうち１つの細胞におい
てのみ誘導される。さらに、この第１細胞および／また
は第２細胞は、１つよりも多い外因性ジンクフィンガー
タンパク質または融合分子（あるいはこのジンクフィン
ガータンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含み
得る。
【００７５】他の局面において、このスクリーニング方
法において使用される第１細胞および／または第２細胞
はまた、レポーター（例えば、選択可能なマーカー）を
含み得る。例えば、特定の実施形態において、ジンクフ
ィンガータンパク質の発現が、公知の分子標的、好まし
くは生化学的経路またはシグナル伝達経路のような細胞
内プロセスの成分に応答性の転写制御エレメントに作動
可能に連結されたこのジンクフィンガータンパク質を、
細胞が含む方法が提供される。従って、シグナル伝達経
路が活性な条件下で、このジンクフィンガータンパク質
は発現される。この細胞はまた、好ましくはレポーター
（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク
質）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホ
スファターゼ、ＣＡＴなど）をコードするポリヌクレオ
チドを含む。レポーター分子のサブセットとしては、選
択マーカー（例えば、薬物耐性、チミジンキナーゼな
ど）が挙げられる。このレポーターまたは選択マーカー
は、ジンクフィンガータンパク質（またはジンクフィン
ガータンパク質を含む融合物）によって調節される転写
制御エレメントに作動可能に連結され得る。従って、試
験化合物がこの細胞に投与される場合、標的（例えば、
シグナル伝達経路の成分）と相互作用してＺＦＰの産生
を調節するこの化合物の能力は、産生されるレポーター
および／または選択マーカーの量に反映される。特定の
実施形態において、このジンクフィンガータンパク質
（または融合物）は、レポーターおよび／または選択マ
ーカーの発現を抑制する。これらの場合において、この
化合物が、シグナル伝達経路を遮断するような方法でこ
の化合物の標的と相互作用する場合、ＺＦＰによって発
現が制御されるレポーターの産生は上昇する。この細胞
はまた、１つより多くのレポーター／選択マーカーを含
み得る。
【００７６】さらなる実施形態において、分子標的を過
剰発現する細胞が提供され、ここでこの過剰発現は、外
因性ジンクフィンガータンパク質の作用によって仲介さ
れる。同様に、分子標的の発現が不足する細胞（ここで
この発現不足は、外因性ジンクフィンガータンパク質の
作用によって仲介される）が提供される。このような細
胞を作成および使用する方法が、また提供される。
【００７７】なおさらなる実施形態において、外因性ジ
ンクフィンガータンパク質を含む細胞から単離される１
つ以上の細胞成分の使用を包含する方法が提供される。
好ましい実施形態において、この細胞成分は、好ましく
は、ジンクフィンガータンパク質（またはジンクフィン
ガータンパク質を含む融合物）の活性によって分子標的
（例えば、レセプター）を過剰発現する細胞から単離さ
れる細胞膜である。この単離された膜は、例えば結合研
究（例えば、放射標識リガンドを使用して）のために使
用され得る。
【００７８】別の局面において、本明細書中に記載され
る任意のジンクフィンガータンパク質を含む細胞が提供
される。好ましい実施形態において、分子標的を発現す
る細胞が提供される。この種類の細胞は、分子標的と相
互作用する化合物と接触される細胞に対して応答性であ
るという特徴を示す。この細胞は、この細胞中のタンパ
ク質、好ましくは分子標的の産生を調節する外因性ジン
クフィンガータンパク質を含む。
【００７９】さらに別の局面において、本明細書中に記
載される任意の細胞、タンパク質、ポリヌクレオチドな
どを含む、目的の化合物をスクリーニングするためのキ
ットが提供される。好ましい実施形態において、このキ
ットはさらに、補助試薬、指示書、および本明細書中に
記載されるスクリーニング方法を実行するために設計さ
れた他の材料を含む。
【００８０】これらの実施形態および他の実施形態は、
本明細書中における開示から、当業者にとって容易に明
白である。
【００８１】
【発明の実施の形態】（概要）本明細書中に開示される
組成物および方法は、特定の分子標的と相互作用する候
補化合物の能力について、候補化合物をスクリーニング
するための新規のアッセイを含む。このアッセイは、細
胞ベースのアッセイおよび生化学的アッセイの両方を含
む。さらに、本明細書中に記載されるこのアッセイは、
目的の遺伝子の発現を調節し得るジンクフィンガータン
パク質を含む細胞を含むか、またはこの細胞から誘導さ
れる。
【００８２】１つの実施形態において、ジンクフィンガ
ータンパク質またはこれらのタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドは、細胞内に導入されて（例えば、安定
な形質転換または一過性のトランスフェクションを介し
て）、目的の分子標的を過剰発現する。ＺＦＰ含有細胞
におけるこの分子標的に対する候補化合物の効果は、Ｚ
ＦＰ非含有細胞におけるこの候補化合物の効果と比較さ
れ、この標的と相互作用する化合物の能力を決定し得
る。従って、このＺＦＰは、分子標的そのものの発現を
調節（例えば、活性化）し得る。あるいは、このＺＦＰ
は、異なる分子の発現を調節し得、これは次いで、分子
標的に対して直接的または間接的に作用し得、例えば、
このＺＦＰはこの分子標的を調節するシグナル伝達経路
において、上流の分子または下流の分子の発現を調節し
得る。
【００８３】他の実施形態において、ＺＦＰをコードす
る遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあり、そし
て第１細胞および第２細胞の両方は、この誘導性遺伝子
を含む。従って、この細胞は、実質的に同一であり、そ
してＺＦＰの発現は１つの細胞（試験細胞）中に誘導さ
れ得、そして他の細胞（コントロール細胞）には誘導さ
れず、候補化合物の分子標的との相互作用を決定する。
この細胞は、安定または一過性に誘導性ＺＦＰ構築物で
トランスフェクトされ得る。
【００８４】別の実施形態において、ジンクフィンガー
タンパク質は、細胞中に導入され、細胞表面分子または
膜結合分子（例えば、レセプター）を過剰発現する。次
いで、このレセプターが豊富な膜は単離され、そして生
化学的アッセイ（例えば、化合物の結合の測定によっ
て）に使用される。
【００８５】さらに他の実施形態において、化合物は、
分子標的（例えば、細胞プロセス（例えば、生化学的経
路またはシグナル伝達カスケード）に関する任意の標
的）と相互作用するその能力について試験される。例え
ば、試験化合物が、特定のシグナル伝達カスケードを開
始するレセプター発現することが公知である細胞に投与
される。さらに、この試験細胞はまた、（１）外因性ジ
ンクフィンガータンパク質および機能的ドメインを含む
融合分子をコードするポリヌクレオチド、および（２）
レポーター分子（例えば、緑色蛍光タンパク質、または
薬物耐性のような選択マーカー）をコードするポリヌク
レオチドを含む。この融合分子をコードするこのポリヌ
クレオチドは、目的の細胞プロセスに応答性の転写制御
エレメントに作動可能に連結される。例えば、融合分子
をコードするポリヌクレオチドは、発現がシグナル伝達
カスケードの結果として調節される遺伝子から誘導され
る、転写制御配列に作動可能に連結される。この融合分
子は、例えば、ジンクフィンガータンパク質および抑制
ドメイン（これは、発現される場合、レポーター分子の
発現を抑制する）を含み得る。従って、このレセプター
および関連プロセス（例えば、シグナル伝達カスケー
ド）が機能する場合、この融合分子は発現され、そして
次々に、この融合分子はレポーター分子の発現の抑制を
補助する。候補試験化合物が、シグナル伝達経路の成分
と、この経路を遮断するように相互作用する場合、この
抑制的な融合分子の発現は、減少または排除され、そし
てレポーターのレベルは上昇する。従って、任意の化合
物は、レポーターレベルをモニターすることによって、
シグナル伝達カスケード干渉するこの化合物の能力につ
いてスクリーニングされ得る。
【００８６】開示される方法の実行は、他に指示がなけ
れば、分子生物学、生化学、遺伝学、計算機化学、細胞
培養、組換えＤＮＡおよび当該分野の技術内にある関連
の分野における従来の技術を利用する。これらの技術
は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬ
ＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲ
ＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７および定期的な更
新；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯ
ＧＹのシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと。
【００８７】（定義） 用語「核酸」「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌク
レオチド」は、交換可能に使用され、そして一本鎖形状
もしくは二本鎖形状のいずれかの、デオキシリボヌクレ
オチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーをい
う。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの
長さについての限定として解釈されるべきではない。こ
の用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、なら
びに塩基、糖、および／またはリン酸部分において改変
されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌク
レオチドのアナログは、同じ塩基対特異性を有する；す
なわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成する。
【００８８】用語「ポリペプチド」「ペプチド」および
「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基
のポリマーをいう。この用語はまた、１つ以上のアミノ
酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナロ
グまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーに
も、適用される。
【００８９】「ジンクフィンガー」は、亜鉛原子の配位
によって安定化される構造を有するポリペプチド配列
（一般に約３０アミノ酸）を含む、配列特異的結合ドメ
インである。ジンクフィンガーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よび／またはアミノ酸配列に結合し得る。ＤＮＡ結合に
関して、単一のジンクフィンガーは、一般に、２〜４塩
基対、代表的には３または４塩基対を含む標的サブサイ
トに結合する。ジンクフィンガーの例示的なクラスは、
一般構造−Ｃｙｓ−Ｘ２〜４−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｈｉｓ
−Ｘ３〜５−Ｈｉｓ−（ここでＸは、任意のアミノ酸で
ある）を有し；これは亜鉛原子と配意する２つのシステ
イン残基および２つのヒスチジン残基を含む（いわゆる
ＣＣＨＨまたはＣ２Ｈ２ジンクフィンガー）。しかし、
さらなるジンクフィンガーの構造（例えば、ＣＣＨＣ、
ＣＣＣＨ、ＣＨＨＣ、ＣＨＣＨおよびＣＨＨＨ）もま
た、開示された方法および組成物において有用である。
【００９０】「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク
質」は、１つ以上のジンクフィンガーの結合活性を介し
て配列特異的な様式でＤＮＡと結合する、より大きなタ
ンパク質中の、タンパク質またはセグメントである。用
語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、しばしば
ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略され
る。ＺＦＰは、ジンクフィンガーに加えてポリペプチド
ドメインを含み得る；例えば、他のＤＮＡ結合ドメイン
および／または機能的ドメインである。
【００９１】「設計された」ジンクフィンガータンパク
質は、その設計／組成が主に合理的な判断基準から生じ
る、天然に存在しないタンパク質である。設計のための
合理的な判断基準には、置換法則の適用、および既存の
ＺＦＰ設計および結合データの情報を保存するデータベ
ースにおける、情報を処理するためのコンピューター化
されたアルゴリズムが挙げられる（例えば、共同所有さ
れたＰＣＴ ＷＯ００／４２２１９および共同所有され
た米国特許出願第０９／４４４，２４１号（１９９９年
１１月９日提出）に記載される）。
【００９２】「選択された」ジンクフィンガータンパク
質は、その産生が、ファージディスプレイのような経験
的なプロセスから主に生じる、天然に見出されないタン
パク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８
号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，
０１３，４５３号；ＷＯ ９５／１９４３１；ＷＯ９６
／０６１６６およびＷＯ ９８／５４３１１を参照のこ
と。
【００９３】「最適化された」ジンクフィンガータンパ
ク質は、上記に記載されたように設計または選択され、
次いで結合特異性について試験され、そして共同所有さ
れた米国特許出願第０９／７１６，６３７号（２０００
年１１月２０日提出、タイトル「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇ
ｎ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」）に
記載されるように、このジンクフィンガータンパク質の
結合特異性を改善するために配列において変更されたジ
ンクフィンガータンパク質をいう。
【００９４】用語「天然に存在する」は、ヒトによって
人工的に産生された物とは別の、天然に見出され得る対
象を記載するために使用される。
【００９５】核酸またはアミノ酸配列は、互いに機能的
な関係に配置された場合、「作動可能に連結される（ｏ
ｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または、「作動可
能的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋ
ｅｄ）」）。例えば、プロモーターまたはエンハンサー
は、このプロモーターもしくはエンハンサーがコード配
列の転写を制御するか、または調節に寄与する場合、こ
のコード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結
されたＤＮＡ配列は、代表的に連続し、そして作動可能
に連結されたアミノ酸配列は、代表的に連続しかつ同じ
リーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサー
が数ｋｂ以上プロモーターから離れ、そしてイントロン
配列が可変の長さであり得る場合、一般にこのエンハン
サーは機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレ
メントは作動可能に連結し得るが、連続し得ない。同様
に、一次ポリペプチド配列において非連続である特定の
アミノ酸配列が、例えばポリペプチド鎖の折り畳みに起
因して、それでも作動可能に連結し得る。
【００９６】融合ポリペプチドに関して、用語「作動可
能的に連結する」は、それぞれの成分が他の成分との連
鎖において、この成分がそのように連鎖していないかの
ように、同じ機能を実行するという事実をいい得る。例
えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化ドメイ
ン（またはそれらの機能的フラグメント）と融合される
融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ ＤＮＡ結合ド
メインおよびこの転写活性化ドメイン（またはそれらの
機能的フラグメント）は、融合ポリペプチドにおいてこ
のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位およ
び／またはその結合部位に結合し得、一方、転写活性化
ドメイン（またはそれらの機能的フラグメント）が転写
を活性化し得る場合に、作動可能的に連結される。
【００９７】例えば、ＺＦＰと特異的標的部位との間の
「特異的結合」は、少なくとも１×１０６Ｍの結合親和
性を意味する。
【００９８】「調節ドメイン」または「機能的ドメイ
ン」は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）に結合
される場合、転写調節活性を有するポリペプチド、タン
パク質、またはタンパク質ドメインをいう。代表的に、
調節ドメインは、ＺＦＰに共有結合または非共有結合し
（例えば、融合分子を形成するために）、転写調節をも
たらす。調節ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ド
メインであり得る。活性化ドメインには、ＶＰ１６、Ｖ
Ｐ６４、リガンドに結合された野生型甲状腺ホルモンレ
セプター（ＴＲ）および特定のＴＲ変異体、ならびに核
因子κ−Ｂのｐ６５サブユニットが挙げられるが、これ
らに限定されない。抑制ドメインには、ＫＲＡＢ、ＭＢ
Ｄ２Ｂ、結合していない野生型ＴＲおよび特定のＴＲ変
異体、ならびにｖ−ＥｒｂＡが挙げられるが、これらに
限定されない。さらなる調節ドメインには、例えば転写
因子および補助因子（例えば、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩ
Ｄ、早期成長応答因子１（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ １）、および核ホル
モンレセプター）、エンドヌクレアーゼ、インテグラー
ゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒス
トンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラ
ーゼなどが挙げられる。活性化因子および抑制因子に
は、活性化補助因子および抑制補助因子が挙げられる
（例えば、Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４：４９
８〜５０２（１９９８）を参照のこと）。あるいは、Ｚ
ＦＰは、調節ドメインなしで単独に作用し、転写調節を
もたらし得る。
【００９９】「融合分子」は、２つ以上のサブユニット
分子が結合、好ましくは共有結合した分子である。この
サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、
または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合
分子の例としては、融合ポリペプチド（例えば、ＺＦＰ
ＤＮＡ結合ドメインとメチル結合ドメインとの間の融
合）および融合核酸（例えば、本明細書中に記載される
融合ポリペプチドをコードする核酸）が挙げられるがこ
れらに限定されない。第２の型の融合分子の例として
は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、およ
び副溝結合因子（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄ
ｅｒ）と核酸との間の融合が挙げられるがこれらに限定
されない。
【０１００】「外因性分子」は、細胞中に通常存在しな
いが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または
他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。細
胞における通常の存在は、その細胞の特定の発育段階お
よび環境条件に関して決定される。従って、例えば筋肉
の胚発達の間でのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関
して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘
導される分子は、熱ショックされていない細胞に関して
外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の
内因性分子の機能的な異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）、または
通常に機能する内因性分子の機能不全な異形を含み得
る。
【０１０１】外因性分子は、とりわけ、コンビナトリア
ル化学プロセスによって産生されるような小分子、また
は高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂
質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子
の任意の改変された誘導体、または上記分子の１つ以上
を含む任意の複合体）であり得る。核酸は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡを含み、一本鎖もしくは二本鎖であり得；直鎖
状、分枝状、もしくは環状であり得、そして任意の長さ
で有り得る。核酸は、二本鎖を形成し得る核酸、ならび
に三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７
６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照の
こと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因
子、クロマチン再構築因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅ
ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、メチル化ＤＮＡ結
合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラー
ゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスフ
ァターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガー
ゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼ
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】外因性分子は、内因性分子（例えば、タン
パク質または核酸）と同じ型の分子であり得る（すなわ
ち、外因性遺伝子）が、ただし、内因性分子とは異なる
配列を有する。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入さ
れるプラスミドまたはエピソーム、あるいは通常は細胞
中に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞中
に導入するための方法は、当該分野で公知であり、そし
て、脂質介在転移（すなわち、中性脂肪および陽イオン
性脂肪を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、
直接注射、細胞融合、微粒ボンバードメント、カルシウ
ムリン酸共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン介在転移およ
びウイルスベクター介在転移が挙げられるがこれらに限
定されない。
【０１０３】対照的に、「内因性分子」は、特定の環境
条件下で、特定の細胞中に特定の発育段階で通常存在す
る分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコ
ンドリアのゲノム、葉緑体のゲノムもしくは他の小器官
のゲノム、または天然に存在するエピソームの核酸を含
み得る。さらなる内因性分子としては、内因性遺伝子お
よび内因性タンパク質（例えば、転写因子およびクロマ
チン再構築複合体の成分）が挙げられ得る。
【０１０４】本開示の目的についての「遺伝子」とは、
遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領
域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ
領域（そのような調節配列がコード配列および／または
転写配列に隣接するかしないに関わらず）を含む。従っ
て、遺伝子は、限定される必要はないが、プロモーター
配列、ターミネーター、転写調節配列（例えば、リボゾ
ーム結合部位および内部リボゾーム流入部位、エンハン
サー、サイレンサー、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、
結合エレメント、複製起源、マトリックス結合部位およ
び遺伝子座制御領域が挙げられる。遺伝子は、正常また
は変異のいずれかの内因性細胞遺伝子、あるいは感染性
生物（例えば細菌またはウイルスなど）の外因性遺伝子
であり得る。
【０１０５】「内因性細胞遺伝子」は、細胞に対してネ
イティブな遺伝子をいい、これはその細胞の正常のゲノ
ム内容物（ｃｏｎｔｅｘｔ）および染色体内容物中にあ
り、そしてこれはこの細胞に対して異種ではない。この
ような細胞遺伝子には、例えば、動物遺伝子、植物遺伝
子、細菌遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコ
ンドリア遺伝子および葉緑体遺伝子が挙げられる。
【０１０６】「ネイティブなクロマチン内容物」とは、
天然に存在する、構造的な関係のゲノムＤＮＡ（例えば
細菌ゲノムＤＮＡ、動物ゲノムＤＮＡ、真菌ゲノムＤＮ
Ａ、植物ゲノムＤＮＡ、原生動物ゲノムＤＮＡ、ミトコ
ンドリアゲノムＤＮＡおよび葉緑体ゲノムＤＮＡ）、お
よびＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストン、非ヒス
トン染色体タンパク質および細菌ＤＮＡ結合タンパク質
ＩＩ）をいい、これは共に染色体を形成する。内因性細
胞遺伝子は、ネイティブなクロマチン内容物中で、転写
的に活性な状態または非活性な状態であり得る。
【０１０７】「遺伝子発現」は、遺伝子中に含まれる情
報の、遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、遺伝
子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセ
ンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意の他の
型のＲＮＡ）の直接的な転写産物、またはｍＲＮＡの翻
訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産
物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、
およびエディティングのようなプロセスによって改変さ
れるＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、
リン酸化、ユビキチン結合、ＡＤＰ−リボシル化、ミリ
スチル化、およびグリコシル化によって改変されるタン
パク質を含む。
【０１０８】「遺伝子の活性化」および「遺伝子発現の
増大」は、遺伝子産物の産生における増大を生じる任意
の方法をいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲ
ＮＡ、ｒＲＮＡ、および構造ＲＮＡを含むがこれらに限
定されない）またはタンパク質のいずれかであり得る。
従って、遺伝子の活性化は、遺伝子の転写および／また
はｍＲＮＡの翻訳を増大するプロセスを含む。転写を増
大する遺伝子の活性化プロセスの例は、転写開始複合体
の形成を促進するプロセス、転写開始率を増加するプロ
セス、転写の持続率を増加するプロセス、転写の進化性
を増加するプロセス、および転写抑制を取り除くプロセ
ス（例えば、転写抑制物の結合を遮断することによっ
て）が挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子の活
性化は、例えば、抑制の阻害ならびに、存在するレベル
以上の発現の刺激を構成し得る。翻訳を増大する遺伝子
の活性化プロセスの例は、翻訳開始を増大するプロセ
ス、翻訳の持続を増大するプロセス、およびｍＲＮＡの
安定性を増大するプロセスが挙げられる。一般に、遺伝
子の活性化は、遺伝子産物の産生における任意の検出可
能な増加、好ましくは遺伝子産物の産生における約２倍
の増加、より好ましくは約２〜約５倍もしくはその間の
任意の整数値、より好ましくは約５〜約１０倍の間もし
くはその間の任意の整数値、より好ましくは約１０〜約
２０倍の間もしくはその間の任意の整数値、さらにより
好ましくは約２０〜約５０倍の間もしくはその間の任意
の整数値、より好ましくは約５０〜約１００倍の間もし
くはその間の任意の整数値、より好ましくは１００倍以
上の増加を含む。
【０１０９】「遺伝子抑制」および「遺伝子発現の阻
害」は、遺伝子産物の生産において減少をもたらす任意
のプロセスをいう。遺伝子産物は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、
ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび構造ＲＮＡを含むが、これら
に限定されない）またはタンパク質のいずれかであり得
る。従って、遺伝子抑制は、遺伝子の転写および／また
はｍＲＮＡの翻訳を減少させるプロセスを含む。転写を
減少させる遺伝子抑制プロセスの例として以下のものが
挙げられるが、これらに限定されない：転写開始複合体
の形成を阻害するプロセス、転写開始率を減少させるプ
ロセス、転写延長率を減少させるプロセス、転写のプロ
セシング率（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を減少させる
方法および転写活性を拮抗するプロセス（例えば、転写
活性化因子の結合をブロックすることによる）。遺伝子
抑制は、例えば、活性化の防止および発現の存在レベル
を下まわる発現の阻害からなり得る。翻訳を減少させる
遺伝子抑制プロセスの例としては、翻訳開始を減少させ
る方法、翻訳延長を減少させる方法およびｍＲＮＡ安定
性を減少させる方法が挙げられる。翻訳抑制としては、
遺伝子転写の可逆的および不可逆的な不活性化の両方が
挙げられる。一般的には、遺伝子抑制は、遺伝子産物の
生産における任意の検出可能な減少を含み、好ましくは
約２倍だけの遺伝子産物の生産における減少、さらに好
ましくは約２〜約５倍またはそれらの間の任意の整数
値、さらに好ましくは、約５〜約１０倍の間またはそれ
らの間の任意の整数値、さらに好ましくは、約１０〜約
２０倍の間またはそれらの間の任意の整数値、なおさら
に好ましくは、約２０〜約５０倍の間またはそれらの間
の任意の整数値、さらに好ましくは、約５０〜約１００
倍の間またはそれらの間の任意の整数値、さらに好まし
くは、１００倍以上である。最も好ましくは、遺伝子抑
制が、遺伝子発現の完全な阻害をもたらし、それゆえ遺
伝子産物が検出されない。
【０１１０】用語「調節する」は、機能の抑制、促進ま
たは誘導をいう。例えば、ＺＦＰは、転写制御配列内の
モチーフに結合し、それによって転写制御配列に作動可
能に連結される遺伝子の転写を促進または抑制すること
によって、遺伝子発現を調節し得る。さらに、調節は、
遺伝子へのＺＦＰ結合の性質による遺伝子の転写阻害、
およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を最初
から最後まで読ことをブロックしてそれゆえ遺伝子の転
写を阻害することを含む。さらに、調節は、転写物の翻
訳の阻害を含む。従って、遺伝子発現の「調節」は、遺
伝子活性化および遺伝子抑制の両方を含む。
【０１１１】調節は、標的遺伝子の発現により間接的ま
たは直接的に影響を受ける任意のパラメーターを決定す
ることによって、アッセイされ得る。このようなパラメ
ーターとしては、例えば以下のものが挙げられる：ＲＮ
Ａまたはタンパク質のレベルにおける変化；タンパク質
活性における変化；産物レベルにおける変化；下流の遺
伝子発現における変化；レポーター遺伝子（例えば、ル
シフェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、ＧＦＰ（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉお
よびＳｐｅｃｔｏｒ、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４を参照
のこと）、または薬物耐性のような選択マーカー）の転
写または活性化における変化；シグナル伝達における変
化；リン酸化および脱リン酸化における変化；レセプタ
ー−リガンド相互作用における変化；セカンドメッセン
ジャー（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、および
Ｃａ２＋）の濃度における変化；細胞増殖における変
化；血管新生における変化；および／または遺伝子発現
の任意の機能的効果における変化。測定は、インビト
ロ、インビボ、および／またはエキソビボでなされ得
る。このような機能的効果は、従来の方法（例えば、Ｒ
ＮＡレベルまたはタンパク質レベルの測定、ＲＮＡ安定
性の測定、および／または下流遺伝子もしくはレポータ
ー遺伝子の発現の同定）によって測定され得る。読み出
しは、例えば、以下によりし得る：化学ルミネセンス、
蛍光発光、比色定量反応、抗体結合、誘導マーカー、リ
ガンド結合アッセイ；ｃＧＭＰおよびイノシトール三リ
ン酸（ＩＰ３）のような細胞内セカンドメッセンジャー
における変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；
サイトカイン放出など。
【０１１２】ジンクフィンガータンパク質（または融合
分子）が細胞内タンパク質の発現を阻害するために使用
される場合、細胞内タンパク質の発現レベル、および／
またはそれをコードするｍＲＮＡは、好ましくは発現し
ないかまたは調節に影響を及ぼすジンクフィンガータン
パク質を含む参照細胞中のものの７５％未満。好ましく
は、発現レベルは、参照細胞中のものの５０％未満；よ
り好ましくは参照細胞中のものの２５％未満；最も好ま
しくは参照細胞中のものの５％未満。ジンクフィンガー
タンパク質が細胞タンパク質の発現を活性化するために
使用される場合、この発現レベルは、ＺＦＰを発現しな
い参照細胞中のレベルの１１０％よりも多い。より好ま
しくは、この発現レベルは参照細胞中のレベルの１２５
％よりも多く；より好ましくは原始細胞（ｏｒｉｇｉｎ
ａｌ ｃｅｌｌ）中のレベルの１５０％よりも多く；最
も好ましくは参照細胞中のレベルの１７５％よりも多
い。
【０１１３】用語「転写制御エレメント」「転写調節エ
レメント」「転写制御配列」および「転写調節配列」
は、相互交換可能に使用され、転写の調節を媒介するＤ
ＮＡ配列をいう。これらのエレメントまたは配列の例と
して、以下のものが挙げられるが、これらに限定されな
い：プロモーター、オペレーター、エンハンサー、サイ
レンサー、スプライスドナー部位およびスプライスアク
セプター部位、転写終結部位およびポリアデニル化部
位。転写制御配列は、調節標的が制御エレメントによっ
て媒介される転写の調節に直接的または間接的に参加す
る場合、分子標的に応答する。
【０１１４】「真核生物細胞」は、以下のものを含む
が、これらに限定されない：真菌細胞（例えば、酵
母）、原生動物細胞、古細菌細胞、植物細胞、動物細
胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞。同様に、「原核生物
細胞」は、細菌を含むがこれに限定されない。
【０１１５】タンパク質、ポリペプチド、または核酸の
「機能的フラグメント」は、配列が全長タンパク質、ポ
リペプチドまたは核酸に同一ではないが、全長タンパク
質、ポリペプチドまたは核酸によって示される一つ以上
の機能をなお保持するタンパク質、ポリペプチドまたは
核酸である。機能的フラグメントは、対応するネイティ
ブ分子と比べてより多くの、より少ないまたは同数の残
基を有し得、および／または一つ以上のアミノ酸置換ま
たはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能を決定す
るための方法（例えば、コード機能、別の核酸にハイブ
リダイズする能力）は、当該分野で周知である。同様
に、タンパク質機能を決定するための方法が周知であ
る。例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、
または免疫沈降アッセイによって、例えば、ポリペプチ
ドのＤＮＡ結合機能が決定され得る。Ａｕｓｕｂｅｌら
（前出）を参照のこと。例えば、同時免疫沈降、ツーハ
イブリッドアッセイまたは相補性検定（遺伝子的相補性
検定および生化学的相補性検定の両方）によって、タン
パク質が別のタンパク質と相互作用する能力は決定され
得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，
２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照の
こと。
【０１１６】「標的部位」または「標的配列」は、結合
タンパク質（例えば、ＺＦＰのような）によって結合さ
れる配列である。標的配列は、ヌクレオチド配列（ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのいずれか）またはアミノ酸配列であり
得る。例として、３−フィンガーＺＦＰに対するＤＮＡ
標的配列は、一般的に、ＺＦＰと標的配列間の交差鎖相
互作用の存在および／または性質に依存して、９または
１０ヌクレオチド長のいずれかである。
【０１１７】「標的サブサイト」または「サブサイト」
は、単独のジンクフィンガーによって結合されるＤＮＡ
標的部位の部分である。従って、交差鎖相互作用の非存
在下において、サブサイトは、一般的に、３ヌクレオチ
ド長である。交差鎖相互作用（例えば、共同所有されて
いるＰＣＴ ＷＯ ００／４２２１９に記載される「Ｄ
−ａｂｌｅサブサイト（Ｄ−ａｂｌｅ ｓｕｂｓｉｔ
ｅ）」）が生じる場合において、サブサイトは４ヌクレ
オチド長であり、そして別の３または４ヌクレオチドサ
ブサイトと重なり合う。
【０１１８】「分子標的」は、候補化合物（例えば、薬
物）との相互作用について試験される任意の分子（例え
ば、細胞内の分子、または細胞膜と結合する分子）をい
う。分子標的の非限定の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびタンパク質（例えば、レセプター（例えば、細胞表
面レセプター、膜結合レセプターまたは核レセプタ
ー）、シグナル伝達経路の成分、転写因子またはそれら
の機能的フラグメント）が挙げられる。分子標的として
はまた、高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化
物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上
記分子の改変された任意の誘導体、または上記分子の１
つ以上を含む任意の複合体）を含み得る。化合物が分子
標的に直接的または間接的に作用する場合、その化合物
はその分子標的と「相互作用」する。その化合物は、そ
の分子標的に直接的に作用し得る。例えば、分子標的が
タンパク質である場合、その化合物は、そのタンパク質
に結合することによって直接的にそのタンパク質と相互
作用し得るか、または転写調節エレメントへの作用を介
してそのタンパク質の発現を直接的に調節し得る。同様
に、例えば、分子標的に代わりに作用する別の分子をブ
ロックするかまたは刺激することによって、その化合物
はまた、間接的に分子標的に作用し得る。例えば、標的
が非タンパク質分子であり、そしてその化合物が、非タ
ンパク質分子標的の産生、安定性、活性、維持および／
または修飾に関連するタンパク質と相互作用する場合、
化合物の分子標的への間接的な作用が起こり得る。
【０１１９】用語「有効量」は、所望される結果（例え
ば、既に活性化されている遺伝子の不活性化または不活
性な遺伝子の活性化）をもたらす量、あるいはジンクフ
ィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む遺伝子の不活
性化をもたらす量、もしくは構造遺伝子の転写またはＲ
ＮＡの翻訳をブロックする量を含む。
【０１２０】「Ｋｄ」は、化合物に関する解離定数（す
なわち、所定の条件下（すなわち、［標的］＜＜Ｋｄの
場合）での、化合物の標的への最大結合の２分の１（す
なわち、標的に結合される化合物分子の２分の１）を示
す化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の濃
度）をいい、所定のアッセイ系（米国特許第５，７８
９，５３８号）を使用して測定される。このＫｄを測定
するために使用されるアッセイ系が選択されるべきであ
り、そのためＺＦＰの実際のＫｄの最も厳密な測定が与
えられる。ＺＦＰの実際のＫｄの厳密な測定が与えられ
る限り、任意のアッセイ系が使用され得る。１つの実施
形態において、ＺＦＰのＫｄは、本明細書の実施例１に
記載されるような電気泳動移動度シフトアッセイ（「Ｅ
ＭＳＡ」）を使用して測定される。ＺＦＰの純度または
ＺＦＰ活性のための調整がなされない限り、実施例１を
使用してなされるＫｄの計算は、所定のＺＦＰの実際の
Ｋｄよりも小さい見積もりをもたらし得る。好ましく
は、内因性細胞遺伝子の転写を調節するために使用され
るＺＦＰのＫｄは、約１００ｎＭ未満であり、さらに好
ましくは約７５ｎＭ未満であり、さらに好ましくは約５
０ｎＭ未満であり、最も好ましくは約２５ｎＭ未満であ
る。
【０１２１】（スクリーニングアッセイ）好ましい実施
形態において、スクリーニングアッセイが、少なくとも
１つの外因性ジンクフィンガータンパク質を含む細胞を
用いてかまたは少なくとも１つの外因性ジンクフィンガ
ータンパク質を含む細胞由来の物質を用いて実施され
る。本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ
は、候補化合物の高スループットスクリーニングを可能
にし、これは、疑陽性の発生を減少しながら達成され得
る。
【０１２２】（Ａ．ジンクフィンガータンパク質）本明
細書中に開示される組成物および方法は、ＤＮＡ結合タ
ンパク質、特にジンクフィンガータンパク質の使用を含
む。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）ＥＭＢＯ
Ｊ．４：１６０９−１６１４；Ｒｈｏｄｅｓら（１９９
３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅ
ｂ．：５６−６５；およびＫｌｕｇ（１９９９）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：２１５−２１８を参照のこ
と。３つのフィンガーのＺｉｆ２６８マウス転写因子
が、詳細に十分に研究されている（Ｐａｖｌｅｔｉｃ
ｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５２：８０９−１７）。Ｚｉｆ２６８ ＺＦ
Ｐと二本鎖ＤＮＡとのＸ線共結晶構造によって、各フィ
ンガーがＤＮＡと独立して相互作用することが示される
（Ｎｏｌｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９５：２９３８−４３；Ｐａｖｌ
ｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．＆Ｐａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９
３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７０１−７）。３フィ
ンガーのドメインの機構は、各フィンガーによる３つ連
続する塩基対トリプレットの認識を可能にする。各フィ
ンガーは、約３０アミノ酸長であり、ββα折り畳みを
とる。この２つのβ鎖は、シートを形成し、ＤＮＡ結合
のための主溝中に認識αへリックスを位置づける。塩基
との特定の接触は、主に認識へリックスの直前およびこ
の認識ヘリックス内の４アミノ酸によって媒介される。
従来、これらの認識残基は、αへリックス内のその位置
に基づいて１、２、３、および６と番号付けられる。
【０１２３】ＺＦＰ ＤＮＡ−結合ドメインは、共同所
有されるＷＯ ００／４２２１９；ＷＯ ００／４１５
６６；および米国出願番号０９／４４４，２４１（１９
９９年１１月１９日出願）；同０９／５３５，０８８
（２０００年３月２３日出願）；ならびに米国特許第
５，７８９，５３８号；同第６，００７，４０８号；同
第６，０１３，４５３号；同第６，１４０，０８１号；
同第および；同第６，１４０，４６６；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９５／１９４３１、同ＷＯ ９８／５４３１
１、同ＷＯ ００／２３４６４および、同ＷＯ ００／
２７８７８に記載されるように設計および／または選択
されて、特定の標的部位を認識する。１つの実施形態に
おいて、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの標的部
位は、共同所有されるＷＯ ００／４２２１９に開示さ
れる部位選択規則に従って同定される。好ましい実施形
態において、ＺＦＰは、共同所有される米国出願番号０
９／７１６，６３７（２０００年１１月２０日出願）の
表題「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に記載されるように、設計および最
適化される。特定の好ましい実施形態において、ＤＮＡ
結合ドメインの結合特異性は、問題の配列中（例えば、
細胞性クロマチン中）の１つ以上の接近可能な領域を指
向する。接近可能な領域は、例えば、共同所有される米
国特許出願番号６０／２００，５９０（２０００年４月
２８日出願）の表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇａｎ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｔｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」、お
よび米国特許出願番号６０／２２８，５５６（２０００
年８月２８日出願）の表題「Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ
ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＳｅｑｕｅｎｃｅｓ；Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓ
ａｍｅ」に記載されるように決定される。ＤＮＡ結合ド
メインは、次いで、近接可能な領域内の標的部位に結合
するために、設計され、そして／または、選択され、そ
して／または、最適化される。
【０１２４】２つの代替方法が代表的に使用されて、新
規に設計されたＤＮＡ結合ペプチドを発現するために必
要とされるコード配列を作製する。１つのプロトコール
の例は、３フィンガーＺＦＰの構築のためのＰＣＲベー
スの組み立て手順であり、これは、６つの重複オリゴヌ
クレオチドを利用する（図１を参照のこと）。３つのオ
リゴヌクレオチドは、認識へリックス間のＤＮＡ結合ド
メインの一部をコードする「ユニバーサル」配列に対応
する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフ
ィンガー構築物に関して一定なままである。他の３つの
「特異的」オリゴヌクレオチドは、認識へリックスをコ
ードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチ
ドは、主に、認識へリックス上の１位、２位、３位、お
よび６位に置換を含み、その結果、各々は、異なるＤＮ
Ａ結合ドメインを特定する。
【０１２５】ＰＣＲ合成は、２工程で実行される。最初
に、二本鎖ＤＮＡ鋳型を、低い温度のアニーリング工程
を用いた４サイクルのＰＣＲ反応において６つのオリゴ
ヌクレオチド（３つはユニバーサル、３つは特異的）を
合わせ、これによってオリゴヌクレオチドをアニーリン
グしてＤＮＡ「足場」を形成することによって作製す
る。この足場の中のギャップは、高い忠実度（ｈｉｇｈ
−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の熱安定ポリメラーゼによって充
填され、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼの組合せもま
た、十分である。構築の第２段階において、ジンクフィ
ンガー鋳型は、増幅産物の両末端に制限部位を組み込む
ために設計された外部プライマーを用いて増幅され、こ
れがシャトルベクターまたは直接発現ベクターへクロー
ニングされることを容易にする。
【０１２６】設計されたＤＮＡ結合タンパク質をコード
するために配列を組み立てる代替の方法は、所望のジン
クフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補
オリゴヌクレオチドをアニーリングすることに依存す
る。この特定の適用は、オリゴヌクレオチドが最終連結
工程前にリン酸化されることを必要とする。これは通
常、アニーリング反応を始める前に実施されるが、リン
酸化（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼによる）はま
た、アニーリング後に生じてもよい。簡単に言うと、タ
ンパク質の定常領域をコードする「ユニバーサル」オリ
ゴヌクレオチドは、相補オリゴヌクレオチドにアニーリ
ングされる。さらに、フィンガー認識へリックスをコー
ドする「特異的」オリゴヌクレオチドは、そのそれぞれ
の相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングされる。こ
れらの相補的オリゴは、上記のプロトコールにおいてポ
リメラーゼによって以前に充填された領域を充填するよ
うに設計される。ユニバーサルオリゴ１および特異的オ
リゴ６（フィンガー３をコードする）に相補的なオリゴ
ヌクレオチドは、操作されて、選択ベクターへのクロー
ニングに使用される認識部位に特異的な突出配列を含
む。第２の組み立てプロトコールは、最初のプロトコー
ルと以下の面で異なる：新規に設計されたジンクフィン
ガータンパク質をコードする「足場」は、完全に合成Ｄ
ＮＡから構成され、これによってポリメラーゼ充填工程
を排除し、さらにベクターにクローニングされるフラグ
メントは、増幅を必要としない。最後に、配列特異的突
出を含むことは、ベクターへの挿入前の制限酵素消化の
必要性を排除する。
【０１２７】生じるフラグメント（新規に設計されたジ
ンクフィンガータンパク質をコードする）は、発現ベク
ターに連結される。一般的に利用される発現ベクターと
しては、改変ｐＭＡＬ−ｃ２細菌発現ベクター（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、「ＮＥＢ」、Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，ＭＡ）または真核生物発現ベクターのｐｃ
ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙
げられるが、これらに限定されない。従来の精製方法が
使用され得る（Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ（前出）を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主
（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細
胞など）が、使用され得る。
【０１２８】マルトース結合タンパク質に融合されたジ
ンクフィンガータンパク質（ＭＢＰ−ＺＦＰ）の細菌株
ＪＭ１０９における発現は、アミロースカラム（ＮＥ
Ｂ）を介した直接的な精製を可能にする。ジンクフィン
ガーキメラタンパク質の高い発現レベルは、ＩＰＴＧを
用いた誘導によって得ることができる。なぜなら、ｐＭ
ａｌ−ｃ２発現プラスミド中のＭＢＰ−ＺＦＰ融合物
は、ＩＰＴＧ誘導可能なｔａｃプロモーター（ＮＥＢ）
の制御下にあるからである。ＭＢＰ−ＺＦＰ融合プラス
ミドを含む細菌は、２×ＹＴ培地（１０μＭ ＺｎＣｌ
２、０．０２％ グルコース、および５０μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含む）に接種され、３７℃で振盪され
る。中間の指数関数的な増殖期に、ＩＰＴＧが０．３ｍ
Ｍまで添加され、そして培養物が振盪される。３時間
後、細菌が遠心分離によって回収され、超音波処理によ
って破壊され、次いで、不溶性物質が、遠心分離によっ
て除去される。ＭＢＰ−ＺＦＰタンパク質は、アミロー
ス結合樹脂上に捕獲され、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｄ
ＴＴおよび５０μＭ ＺｎＣｌ２を含む緩衝液で徹底的
に洗浄され、次いで、本質的に同じ緩衝液中でマルトー
スを用いて溶出される（精製は、ＮＥＢからの標準的な
プロトコールに基づく）。精製タンパク質は、定量さ
れ、そして生化学分析のために保存される。
【０１２９】精製タンパク質の生化学特性（例えば、Ｋ
ｄ）は、任意の適切なアッセイによって特徴付けられ得
る。Ｋｄは、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳ
Ａ」）を介して特徴付けられ得る（Ｂｕｒａｔｏｗｓｋ
ｉ＆Ｃｈｏｄｏｓｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１
２．２．１−１２．２．７頁（Ａｕｓｕｂｅｌ編、１９
９６）；米国特許第５，７８９，５３８号；ＰＣＴ Ｗ
Ｏ ００／４２２１９もまた参照のこと）。親和性は、
低目に固定された量の標識二本鎖オリゴヌクレオチド標
的に対して精製タンパク質を滴定することによって測定
される。この標的は、天然の配列中に見出される３ｂｐ
が隣接した天然の結合部位配列（９または１８ｂｐ）を
含む。結合部位および隣接配列の外部にあるのは、定常
配列である。アニーリングされたオリゴヌクレオチド標
的は、Ｔ４ファージポリヌクレオチドキナーゼを用いた
効率的な標的の標識を可能にする１ｂｐの５’突出を保
有する。このアッセイに関して、標的を、４０ｎＭ以下
の濃度で添加し（実際の濃度は、最も低いタンパク質希
釈よりも少なくとも１０分の１に維持される）、そして
反応物を、少なくとも４５分間平衡させる。さらに反応
混合物はまた、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１
００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ
ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％ グリセロール、
０．０２％ ＢＳＡも含む（ポリ（ｄＩｄＣ）または
（ｄＡｄＴ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がまた、１０〜１
００μｇ／μｌで添加され得る）。
【０１３０】平衡された反応物は、１０％ ポリアクリ
ルアミドゲル（これは、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液中で
４５分間、予備泳動された）に充填され、次いで、結合
または未結合の標識標的が、１５０Ｖの電気泳動で分離
される（あるいは、４％ポリアクリルアミドゲルスタッ
カーを含む１０〜２０％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルが
また、使用され得る）。乾燥させたゲルは、オートラジ
オグラフィーまたはホスホロイメージング（ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｏｉｍａｇｉｎｇ）によって可視化され、そして
見かけのＫｄが、最大半減の結合を与えるタンパク質濃
度を計算することによって決定される。
【０１３１】類似のアッセイがまた、タンパク質調製物
における活性な画分を決定することを含み得る。活性な
画分は、タンパク質が高い濃度の標的ＤＮＡに対して滴
定される化学量論的ゲルシフトによって決定される。滴
定は、１００、５０、および２５％の標的で実施される
（通常、マイクロモルのレベル）。
【０１３２】（Ｂ．融合分子）ジンクフィンガー含有タ
ンパク質の選択および／または設計はまた、遺伝子発現
の調節を容易にする融合分子の設計を可能にする。従っ
て、特定の実施形態において、本明細書中に開示される
組成物および方法は、ジンクフィンガータンパク質（ま
たはその機能フラグメント）と１つ以上の機能ドメイン
（またはその機能フラグメント）との間の融合物、また
はこのような融合物をコードするポリヌクレオチドを含
む。このような融合分子が細胞に存在する場合、機能ド
メインは、ジンクフィンガータンパク質が結合する遺伝
子中の配列の近位にもたらされる。次いで、この機能ド
メインの転写調節機能は、例えば、遺伝子発現を調節す
ることによって遺伝子上で作用し得る。
【０１３３】ジンクフィンガータンパク質は、１つ以上
の調節ドメインあるいは２つ以上の調節ドメイン（この
２つ以上のドメインは、同じドメインの２つのコピーで
あるか、または２つの異なるドメインである）と、共有
結合しても非共有結合してもよい。調節ドメインは、例
えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タンパク質の一
部としてジンクフィンガータンパク質に共有結合で連結
され得る。ジンクフィンガータンパク質はまた、非共有
結合二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー、Ｓ
ＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結
合タンパク質）を介して調節ドメインと結合され得る
（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：５３
９（１９９１）Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら，Ｃｕ
ｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５
９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；
Ｈｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８２２−８２６（１９
９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
３７：９６５（１９９８）を参照のこと）。調節ドメイ
ンは、任意の適切な位置（ジンクフィンガータンパク質
のＣ末端またはＮ末端を含む）でジンクフィンガータン
パク質と結合され得る。
【０１３４】ジンクフィンガータンパク質に加えるため
の通常の制御ドメインとしては、以下が挙げられる：例
えば、転写因子由来のエフェクタードメイン（アクチベ
ーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッ
サー）、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝
子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙ
ｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙ
ｂ、ｍｏｓおよび／またはｅｒｂファミリーメンバーな
ど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにこれらの関連因子および
修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにこれらの関連因子
および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびこれ
らの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよび
デアセチラーゼ）；およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メ
チルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカー
ゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラー
ゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにこれらの関連因子お
よび修飾因子。
【０１３５】制御ドメインを入手し得る転写因子ポリペ
プチドは、制御されかつ基礎的な転写に関連する転写因
子ポリペプチドを含む。このようなポリペプチドとして
は、例えば、転写因子、これらのエフェクタードメイ
ン、コアクチベーター、サイレンサーおよび核ホルモン
レセプターが挙げられる。転写に関するタンパク質およ
び核酸エレメントの概説については、例えば、Ｇｏｏｄ
ｒｉｃｈら，Ｃｅｌｌ８４：８２５−３０（１９９６）
を参照のこと；一般に転写因子は、Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｄ
ｒｏｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２５
Ｓｕｐｐｌ．２：４６−９（１９９５）およびＲｏｅｄ
ｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６
５−７１（１９９６）に概説される。転写因子の専用デ
ータベースは公知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６９：６３０（１９９５）を参照のこと）。核ホルモン
レセプター転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら，Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に
記載される。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Ｗｅ
ｄｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９３：１７
１−８５（１９９５）に概説される。核ホルモンレセプ
ターによって転写制御を媒介するコアクチベーターおよ
びコリプレッサーは、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９
（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；お
よびＵｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：４９８−５
０２（１９９８）に概説される。造血の制御に関連す
る、ＧＡＴＡ転写因子は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｎａ
ｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉ
ｓｓら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７
に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢ
Ｐ）およびその関連ＴＡＦポリペプチド（これは、ＴＡ
Ｆ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡ
Ｆ１５０およびＴＡＦ２５０を含む）は、Ｇｏｏｄｒｉ
ｃｈ＆Ｔｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）およびＨｕｒｌｅ
ｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．
６：６９−７５（１９９６）に記載される。ＳＴＡＴフ
ァミリーの転写因子は、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−
Ｐｏｕｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）に概
説される。疾患に関連する転写因子は、Ａｓｏら，Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９
６）に概説される。
【０１３６】ＺＦＰと融合するための例示的な機能的ド
メインは、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑
制ドメインである（例えば、Ｔｈｉｅｓｅｎら，Ｎｅｗ
Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２，３６３−３７４（１９９
０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，４５０９−４５１３（１
９９４）；Ｐａｎｇｕｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔ
ｚｇａｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９１，４５１４−４５１８（１９９４）を
参照のこと）。別の最適な抑制ドメインは、メチル結合
ドメインタンパク質２Ｂ（ＭＢＤ−２Ｂ）である（ＭＢ
Ｄタンパク質の記述に関してＨｅｎｄｒｉｃｈら，（１
９９９）Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ １０：９０６−９１
２も参照のこと）。別の有用な抑制ドメインは、ｖ−Ｅ
ｒｂＡタンパク質に関連する抑制ドメインである。例え
ば、Ｄａｍｍら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：
５９３−５９７；Ｅｖａｎｓ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．４：２６−２８；Ｐａｉｎ
ら、（１９９０）Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２：２８４−２９
４；Ｓａｐら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２
４２−２４４：Ｚｅｎｋｅら，（１９８８）Ｃｅｌｌ
５２：１０７−１１９；およびＺｅｎｋｅら，（１９９
０）Ｃｅｌｌ ６１：１０３５−１０４９を参照のこ
と。さらなる例示的な抑制ドメインとしては以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：非リガンド化（例え
ば、Ｔ３に結合しない）甲状腺ホルモンレセプター（Ｔ
Ｒ）および特定のＴＲ変異体、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢ
Ｄ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭ
Ｔ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭ
ｅＣＰ２。例えば、Ｚｈａｎｇら，（２０００）；Ａｎ
ｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６２：４３９−４６６；
Ｂｒｉｄら，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４
５４；Ｔｙｌｅｒら，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４
４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒら，（１９９９）Ｃ
ｅｌｌ ９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓ
ｏｎら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２
５：３３８−３４２を参照のこと。さらなる例示的な抑
制ドメインとしては、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙
げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｒｎ
ら，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ８：３０５−３
２１；およびＷｕら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２
２：１９−２７を参照のこと。
【０１３７】活性化を達成するための適切なドメインと
しては以下が挙げられる：ＨＳＶＶＰ１６活性化ドメイ
ン（例えば、Ｈａｇｍｅｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７
１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）、
核ホルモンレセプター（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら，Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３
−３８３（１９９８）を参照のこと）；リガンド結合Ｔ
Ｒおよび特定のＴＲ変異体；核因子κＢのｐ６５サブユ
ニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７
２：５６１０−５６１８（１９９８）ならびにＤｏｙｌ
ｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７
−２９４２（１９９７）；Ｌｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、また
はＶＰ６４のような人工キメラ機能的ドメイン（Ｓｅｉ
ｆｐａｌら，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８
（１９９２））。
【０１３８】さらなる例示的な活性化ドメインとしては
以下が含まれるがこれらに限定されない：ｐ３００、Ｃ
ＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２
Ａ、およびＥＲＦ−２。例えば、Ｒｏｂｙｒら，（２０
００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−
３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，（１９９９）Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７
５；Ｌｅｏら，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１
１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ
（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｏｌ．４
６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａら，（１９９９）Ｊ．
Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
６９：３−１２；Ｍａｌｉｋら，（２０００）Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８
３；およびＬｅｍｏｎら，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照
のこと。さらなる例示的な活性化ドメインとしては以下
が含まれるがこれらに限定されない：ＯｓＧＡＩ，ＨＡ
ＬＦ−１，Ｃ１，ＡＰ１，ＡＲＦ−５，−６，−７，お
よび−８，ＣＰＲＦ１，ＣＰＲＦ４，ＭＹＣ−ＲＰ／Ｇ
Ｐ，ならびにＴＲＡＢ１。例えば、Ｏｇａｗａら，（２
０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍ
ｉら，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７
−９９；Ｇｏｆｆら，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖ．５：２９８−３０９；Ｃｈｏら，（１９９９）Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９；Ｕ
ｌｍａｓｏｎら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９；
Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら，（２０００）
ＰｌａｎｔＪ．２２：１−８；Ｇｏｎｇら，（１９９
９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４
４；およびＨｏｂｏら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−
１５，３５３を参照のこと。
【０１３９】さらなる機能的ドメインは、例えば、共有
に係るＷＯ００／４１５６６に開示される。さらに、イ
ンシュレイタードメイン（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ ｄｏｍ
ａｉｎ）（融合分子における使用に適切なＩＳＷＩ含有
ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質
のようなクロマチン再構築タンパク質）は、例えば、共
有に係る米国特許出願番号６０／２３６，４０９号
（「Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｕ
ｓｉｎｇ ＩＳＷＩ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｈｒ
ｏｍａｔｉｎ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ＡＴＰａｓｅ
ｓ」と題される）；米国特許出願番号６０／２３６，８
８４号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ」と題される）；および米国特許出願番号６０／２５
３，６７８号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｎｓｕｌａ
ｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題され
る）に記載される。
【０１４０】機能的ドメインはまた、核ホルモンレセプ
ター由来であり得る。例えば、甲状腺ホルモンレセプタ
ー（ＴＲ）は、核ホルモンレセプターサブファミリーの
メンバーであり、そして一般的にその標的遺伝子に構成
的に結合される。ＴＲ結合の効果（すなわち、遺伝子発
現の抑制かまたは活性化のいずれか）は、通常、そのリ
ガンド（甲状腺ホルモン（Ｔ３））が存在するか、また
は存在しないかに依存する。Ｔ３の非存在下において、
レセプターは、一般に、基礎レベルより下のレベルに遺
伝子発現を抑制する。非リガンド化レセプターによって
補充され、そして抑制的な複合体を構成すると考えられ
る多数のタンパク質が同定された。このようなタンパク
質の例としては、レセプターと直接的に相互作用する、
ＳＭＲＴおよびＮＣｏＲ、ならびにＳＭＲＴ／ＮＣｏＲ
に相互作用する、Ｓｉｎ３が挙げられる。Ｓｉｎ３はま
た、多くのヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ
の１〜８（このうちのいくつかはまた、ＴＲと直接的に
相互作用し得る））と相互作用する。ＤＮＡ結合ＴＲに
よるヒストンデアセチラーゼの再補充は、抑制を与える
能力において主要な役割を担うと考えられるが；ＨＤＡ
Ｃ以外の抑制因子が、ＴＲによって補充されることもま
た可能である。
【０１４１】ＤＮＡ結合ＴＲへのリガンドの結合は、Ｔ
Ｒに関連する抑制性複合体の崩壊およびＤＮＡ結合、リ
ガンド結合ＴＲへの活性因子の再補充を生じる。このよ
うな活性因子としては以下が含まれるがそれらに限定さ
れない：ヒストンアセチルトランスフェラーゼＳＲＣ−
１、ＣＢＰ／ｐ３００、およびＰ／ＣＡＦ。オリゴマー
の活性化複合体はまた、リガンド結合ＴＲ（例えば、Ｄ
ＲＩＰおよびＡＲＣ）によって補充され得る。Ｒａｃｈ
ｅｚら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：８２４−
８２７；およびＮａａｒら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ
３９８：８２８−８３２。これらは、リガンド結合へ
の応答において、他の核ホルモンレセプターと相互作用
すること、そしてクロマチンの鋳型の前後において遺伝
子発現の活性化を容易にすることが示されている。核レ
セプターファミリー（糖質コルチコイドレセプター（Ｇ
Ｒ））の別のメンバーは、リガンド結合に応答してｈＢ
ＲＧ１／ＢＡＦクロマチン再構築複合体を補充する。Ｆ
ｒｙｅｒら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：８８
−９１。
【０１４２】ＴＲおよび関連する核レセプターは、（規
定されていない機能の）アミノ末端領域、中心的なＤＮ
Ａ結合ドメインおよびカルボキシ末端リガンド結合ドメ
イン（ＬＢＤ）を含むモジュラータンパク質である。Ｌ
ＢＤは、ホルモンを結合することに加えて、上記される
抑制因子と活性因子の両方との相互作用の原因である。
ＬＢＤが、異種ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４）に融合
される場合、Ｇａｌ４結合部位を含む標的プロモーター
の抑制を媒介する。Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、（１９
９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：４７６０−４７７０。さら
に、転写のＴ３依存活性化は、ＧＡｌ４ ＤＮＡ結合ド
メインとＴＲ ＬＢＤとの融合を使用して達成され得
る。Ｔｏｎｅら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６９：３１，１５７−３１，１６１。
【０１４３】ＴＲおよび関連する核レセプターのＬＢＤ
の構造の知見（突然変異誘発の研究の結果と共に）は、
ホルモン濃度に無感覚である抑制活性および活性化活性
を有する変異体レセプターを設計するために使用され得
る。例えば、生理学的なレベルのＴ３を結合し得ないＴ
Ｒの単一アミノ酸変異体（例えば、Ｇ３４４Ｅ、Δ４３
０Ｍ、およびΔ２７６Ｉ）は、これらの結合部位にコリ
プレッサーを補充する。Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，
（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１２
６２−１２７７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，（１９９
８）前出。逆に、ホルモン結合によって誘導される構造
変化を模倣するリガンド結合ドメインにおける構造変化
を起こす変異は、エストロゲンレセプター（例えば、Ｌ
５３６ＰおよびＹ５４１Ｄ／Ｅ／Ａ）において同定さ
れ、そしてレセプターの構成的活性形態を生じる。Ｅｎ
ｇら，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
７：４６４４−４６５３；Ｗｈｉｔｅら，（１９９７）
ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１４２７−１４３５。
【０１４４】従って、例えば、ＴＲまたはＧＲに由来す
る変異体核ホルモンレセプターＬＢＤは、細胞内のクロ
マチンにおける目的の領域に活性化タンパク質複合体ま
たは抑制タンパク質複合体を補充するために、ＺＦＰ
ＤＮＡ結合ドメインとの融合の成分として使用され得、
それによって標的分子の発現を制御する。特定の天然に
存在する変異体ＬＢＤは、利用可能であり；そして新し
い変異体は、当業者に周知の方法によって作製され得
る。このような複合体の作用部位は、ＤＮＡ結合ドメイ
ンの特異性によって決定されるが；これらの活性は、Ｌ
ＢＤに対する変異の性質によって決定され、そしてこれ
は、リガンド濃度に依存しない。例えば、ホルモンを結
合し得ないように変異されたＬＢＤを含む融合は、抑制
性の複合体の形成を容易にするが；リガンド結合ＬＢＤ
に似ているようにＬＢＤの構造を変化するＬＢＤ変異を
含む融合分子は、転写の活性化を容易にする複合体の形
成を刺激する。従って、本発明の開示の目的に関して、
変異体核ホルモンレセプターＬＢＤ（例えば、ＴＲ）
は、活性化ドメインまたは抑制ドメインとして使用され
得る。
【０１４５】さらなる実施形態において、「Ｔａｒｇｅ
ｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｃｈｒｏｍａ
ｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」と題される共有に係る米
国特許出願に開示されるように、クロマチンの標的再構
築は、機能的ドメイン融合分子／ＤＮＡ結合ドメイン融
合分子の結合にアクセス可能である細胞のクロマチンに
おいて１つ以上の部位を産生するために使用され得る。
【０１４６】キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子
制御に関連するポリペプチドを改変する他のタンパク質
はまた、ジンクフィンガータンパク質のための機能的ド
メインとして有用である。このような修飾因子は、しば
しば、例えば、ホルモンによって媒介される転写を作動
するかまたは停止するかに関連する。転写制御に関連す
るキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄ
ｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５），Ｊａｃｋｓｏ
ｎら，Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐ
ｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２８：２７９−
８６（１９９３），およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉ
ｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．ＧｅｎｅＥｘｐｒ．
５：１−７７（１９９５）に概説され、一方でホスファ
ターゼは、例えば、Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ＆Ｓｅｍｉｎ，
Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９
５）に概説される。核のチロシンキナーゼは、Ｗａｎ
ｇ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３
７３−６（１９９４）に記載される。
【０１４７】有用なドメインはまた、癌遺伝子（例え
ば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａ
ｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓおよび／
またはｅｒｂファミリーナンバー）ならびにこれらに関
連する因子および修飾因子の遺伝子産物から入手され得
る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ
ｔ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎＢｉｏｌｏｇｙ（第２版，１９
９５）に記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌ
ｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８
（１９９３）およびＣｒｅｐｉｅｕｘら，Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）に概
説される。Ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）
に概説される。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例え
ば、Ｆｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ （Ａ
ｎｇｅｌ＆Ｈｅｒｒｌｉｃｈ編，１９９４）に記載され
る。ｍａｘ癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎら，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．５９：１０９−１６に概説される。ｍｙｂ遺伝子フ
ァミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら，Ｃｕｒｒ．
Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１
１：８９−９８（１９９６）に概説される。ｍｏｓファ
ミリーは、Ｙｅｗら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）に概説され
る。
【０１４８】ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ修
復酵素ならびに関連因子および修飾因子から得られる機
能的ドメインを含み得る。ＤＮＡ修復系は、例えば、Ｖ
ｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：
３８５−９５（１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９−１０５（１９９５）；
Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１７：１−１９
（１９９５）；およびＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７（１９９６）に概説さ
れる。ＤＮＡ再構築酵素ならびにこれらの関連因子およ
び修飾因子はまた、制御ドメインとして使用され得る
（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆら，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉ
ａ ５０：２６１−９（１９９４）；Ｓａｄｏｗｓｋ
ｉ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：７６０−７（１９９３）を参
照のこと）。
【０１４９】同様に、制御ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素
（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソ
メラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ポスファ
ターゼ、ポリメラーゼ）ならびにこれらの関連因子およ
び修飾因子由来であり得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏ
ｎら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２（１９９
４）に概説され、そしてメチルトランスフェラーゼは、
Ｃｈｅｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉ
ｏｌ．５：４−１０（１９９５）に記載される。ヒスト
ンデアセチラーゼ（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７２：３７１−２（１９９６））のような、クロマチン
関連タンパク質およびこれらの修飾因子（例えば、キナ
ーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）はまた、選
択されたジンクフィンガータンパク質に加えるドメイン
として有用である。転写性のリプレッサーとして作用す
るＤＮＡメチルトランスフェラーゼはまた、制御ドメイ
ンであり得る（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｙｎｇａｅ
ｒｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２８９
（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２７９：１０１−１１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏら，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２５３６
−２５４０（１９９８）；およびＺａｒｄｏ＆Ｃａｉａ
ｆａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−
１６５２０（１９９８）を参照のこと）。Ｆｏｋ１のよ
うなエンドヌクレアーゼはまた、遺伝子切断を介して作
用する、転写性のリプレッサーとして使用され得る（例
えば、ＷＯ９５／０９２３３；およびＰＣＴ／ＵＳ９４
／０１２０１を参照のこと）。
【０１５０】クロマチンならびにＤＮＡ構造、移動およ
び局在ならびにこれらの関連因子および修飾因子を制御
する因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物および
ウイルス）に由来する因子、およびこれらと結合するか
またはこれらを修飾する因子はまた、融合タンパク質を
得るために使用され得る。リコンビナーゼおよびインテ
グラーゼは、機能的ドメインとして使用され得る。ヒス
トンアセチルトランスフェラーゼはまた、転写性のアク
チベーターとして使用され得る（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃ
ｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７
７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎ
ｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１
（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３５１９
−３５２４（１９９８）を参照のこと）。ヒストンデア
セチラーゼは、転写性のリプレッサーとして使用され得
る（例えば、Ｊｉｎ＆Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９
８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ＆Ｔｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９
（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄ
ｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；および
Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
３：２３７８１−２３７８５（１９９８）を参照のこ
と）。
【０１５１】ポリペプチドドメイン間（例えば、２つの
ジンクフィンガータンパク質間またはジンクフィンガー
タンパク質と機能的ドメインとの間）のリンカードメイ
ンは、含まれ得る。このようなリンカーは、典型的にポ
リペプチド配列である（例えば、約５〜２００アミノ酸
の間のポリｇｌｙ配列）。好ましいリンカーは、典型的
には組換え融合タンパク質の１部分として合成される可
撓性のアミノ酸配列である。例えば、リンカーＤＧＧＧ
Ｓ（配列番号：２８）は、２つのジンクフィンガータン
パク質を連結するために使用され得る。２つのジンクフ
ィンガータンパク質を連結する可動性のリンカーはま
た、配列ＴＧＥＫＰ（配列番号：２９）を含むアミノ酸
配列であり得る（例えば、Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５５２５−５５３
０（１９９７）を参照のこと）。リンカーＬＲＱＫＤＧ
ＥＲＰ（配列番号：３０）は２つのジンクフィンガータ
ンパク質を連結するために使用され得る。以下のリンカ
ーはまた、２つのジンクフィンガータンパク質を連結す
るために使用され得る：ＧＧＲＲ（配列番号：３１）
（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら．１９９５，前出），（Ｇ４
Ｓ）ｎ（配列番号：４５）（Ｋｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，１１５６
−１１６０（１９９６）；およびＧＧＲＲＧＧＧＳ（配
列番号：３２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号：３
３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号：３４）；
ＬＲＱＫｄ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号：３５）。あ
るいは、可動性のリンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチ
ドそれ自身の両方をモデル化し得るコンピュータープロ
グラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
９０：２２５６−２２６０（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１０
９９−１１１０３（１９９４））またはファージディス
プレイ方法によって（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９９／４５
１３２）合理的に設計され得る。
【０１５２】化学的リンカーは、合成的にかまたは組換
え的に産生されたドメイン配列を結合するために使用さ
れ得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカー
は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可
能である。いくつかのリンカーは、アミド結合、スルフ
ヒドリル結合またはヘテロ機能的結合を有する。制御ド
メインとジンクフィンガータンパク質との共有結合に加
えて、非共有結合性の方法は、制御ドメインと関連する
ジンクフィンガータンパク質を有する分子の産生に使用
され得る。
【０１５３】ＺＦＰ融合分子はまた、１つ以上の機能的
ドメインに加えて、または代わりに、精製、発現、モニ
タリングならびに／または細胞の局在および／もしくは
細胞下の局在の検出を容易にする１つ以上のドメインを
含み得る。例えば、これらとしては、マルトース結合タ
ンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、お
よびＦＬＡＧエピトープのようなポリペプチドが挙げら
れる。
【０１５４】融合分子は、当業者に周知であるクローニ
ングの方法および生化学的な組み合わせによって作製さ
れる。特定の実施形態において、融合分子は、ジンクフ
ィンガータンパク質および少なくとも２つの機能的ドメ
インを含む（例えば、インシュレイタードメインまたは
メチル結合タンパク質ドメイン、そして、さらに、転写
性活性化ドメインまたは転写性抑制ドメイン）。融合分
子はまた、核局在シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗
原由来のような）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬ
ＡＧおよび血球凝着素のような）を必要に応じて含む。
融合タンパク質（およびこれらをコードする核酸）は、
翻訳性リーディングフレームが、融合の成分間で保存さ
れるように設計される。
【０１５５】本明細書中で開示される融合分子は、標的
部位に結合し、そして分子標的の発現を媒介するジンク
フィンガー結合タンパク質を含む。特定の実施形態にお
いて、標的部位は、細胞のクロマチンのアクセス可能な
領域に存在する。アクセス可能な領域は、共有に係る米
国特許出願番号６０／２００，５９０号，米国特許出願
番号６０／２１４，６７４号および米国特許出願番号６
０／２２８，５５６号に記載されるように決定され得
る。標的部位が、細胞のクロマチンのアクセス可能な領
域に存在しない場合、１つ以上のアクセス可能な領域
は、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」と題
される共有に係る米国特許出願に記載されるように決定
される。さらなる実施形態において、融合分子のジンク
フィンガー成分は、その標的部位が、アクセス可能な領
域にあるかどうかに関係なく細胞のクロマチンに結合し
得る。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リン
カーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームのＤＮＡに結
合し得る。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型
の例は、特定のストロイドレセプターおよび肝細胞核因
子−３（ＨＮＦ３）において見出される。Ｃｏｒｄｉｎ
ｇｌｅｙら，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２
７０；Ｐｉｎａら，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１
９−７３１；およびＣｉｒｉｌｌｏら，（１９９８）Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１７：２４４−２５４。
【０１５６】融合化ＤＮＡ結合ドメインの長所によって
特定の配列に標的化された、１つ以上の機能的ドメイン
を使用する遺伝子制御の方法は、遺伝子発現のモジュレ
ーションを達成し得る。遺伝子発現のモジュレーション
は、低下した発現の形態であり得る（例えば、抑制）。
この場合において、分子標的の発現が、ＺＦＰによって
抑制されている細胞における細胞内の性質の価値は、し
ばしば、分子標的に指向される抑圧的なＺＦＰを発現し
ない細胞における性質の価値よりも低い。本明細書中に
記載されるように、特定の標的遺伝子の抑制は、ジンク
フィンガータンパク質および機能的ドメインを含む融合
分子を使用することによって達成され得る。
【０１５７】あるいは、分子標的をコードする遺伝子の
活性化が、分子標的と化合物との相互作用を試験するた
めに必要である場合、モジュレーションは、増大した遺
伝子発現、または活性化の形態であり得る。この機能的
ドメイン（例えば、インシュレイタードメイン、活性化
ドメインなど）は、標的遺伝子の発現を増大および／ま
たは維持することを可能にする。分子標的の発現が、Ｚ
ＦＰによって増大される細胞内における細胞内の性質の
価値は、しばしば、分子標的に指向される活性ＺＦＰを
発現しない細胞における細胞内の性質の価値よりも高
い。
【０１５８】いくつかの細胞は、誘導性プロモーターに
操作可能に連結されるジンクフィンガータンパク質をコ
ードする配列を発現するように設計される。種々の誘導
性プロモーターは、利用可能であり；誘導性プロモータ
ーの多くは、低分子または他の環境因子（例えば、温度
および栄養状態のような）によって制御され得る。誘導
性プロモーターとの操作可能な連結は、ＺＦＰの活性
化、そしてそれによってＺＦＰによる分子標的の発現の
モジュレーションが、適切な低分子を細胞に供給するこ
とまたは刺激を誘導することによって制御されることを
可能にする。誘導性プロモーターによるＺＦＰの発現の
制御は、細胞に対して致死性を生じる持続性の過剰発現
または過少発現下を有する分子標的の発現の一過性のモ
ジュレーションを達成するのに有用である。誘導性発現
はまた、分子標的のモジュレーションに帰する二次的な
効果を軽減する利点がある。例えば、１つの細胞のタン
パク質の発現のモジュレーションは、細胞内の多くの他
のタンパク質（および他の分子）の相対的な量の変化を
直接的にかまたは間接的に生じ得る。アッセイを実施す
る直前にジンクフィンガータンパク質の発現を誘導する
ことによって、このような二次的な変化は最小化され
る。従って、制御された分子標的を含む試験細胞とコン
トロール細胞との間での応答の差異は、標的の制御によ
って起きる二次的な効果よりも化合物と分子標的との間
の相互作用に全面的にかまたは実質的に全面的に帰す
る。
【０１５９】（Ｃ．細胞に基づくアッセイ）１つの局面
において、他の従来的な方法に共通した偽陽性の発生率
を減少する、細胞に基づく薬物スクリーニングアッセイ
を行う方法が記載される。偽陽性は、例えば、化合物
が、内因性の標的と相互作用しないが、代替のメカニズ
ムによって同一または類似の効果を達成する場合に起こ
る。
【０１６０】本方法において、好ましくは、少なくとも
１つの分子標的（例えば、タンパク質標的または分子標
的の発現を調節するタンパク質）の発現レベルのみが異
なる一致した細胞集団でアッセイを行うことによって、
偽陽性は、減少または排除される。代表的には、コント
ロール細胞集団は、特定の細胞型および環境（例えば、
培養）条件について正常なレベルで分子標的を発現す
る。試験細胞集団は、コントロール集団と比較して変化
したレベル（より高いか、またはより低いかのいずれ
か）で、分子標的を発現する。分子標的の変化した発現
レベルは、標的分子の発現を調節するように作用するＺ
ＦＰ分子またはＺＦＰ融合分子によって達成される。標
的分子の発現は、例えば、ＺＦＰ分子またはＺＦＰ融合
分子が、分子標的をコードする遺伝子の転写を調節する
場合のように、直接的に調節され得る。あるいは、標的
分子の発現の間接的な調節は、ＺＦＰ分子またはＺＦＰ
融合分子が、標的分子の合成、安定性または調節に関連
する遺伝子の発現を調節する場合に生じる。間接的な調
節は、分子標的がタンパク質ではない場合に生じ得る
が、タンパク質分子標的の間接的な調節もまた可能であ
る。
【０１６１】１つの実施形態において、分子標的は、試
験細胞で過剰発現される。化合物は、試験細胞集団にお
いて、例えば、分子標的との相互作用を測定（定量的に
または定性的に）する１以上のアッセイを使用して、過
剰発現された分子標的と相互作用する能力についてスク
リーニングされる。同一の化合物がまた、コントロール
集団においてもスクリーニングされ、そして分子標的と
相互作用するその能力がまた、試験細胞集団で使用され
たアッセイを使用して決定される。化合物が、これらの
２つの細胞集団において同様な応答を惹起する場合、そ
の化合物は、分子標的との相互作用を介してその効果を
発揮しないようである。逆に、化合物が、これらの２つ
の細胞集団において異なる応答を惹起する場合、その化
合物は、分子標的と相互作用（例えば、直接的にまたは
間接的に）するようである。一般的に、分子標的が、試
験細胞で過剰発現される場合、応答の程度は、コントロ
ール細胞においてよりも試験細胞において大きい。従っ
て、標的と相互作用することが予期される化合物が、コ
ントロール細胞よりも試験細胞に対してより大きな効果
を発揮する場合、この化合物は、意図された標的を介し
てその効果を発揮しているようである。しかし、特定の
場合において、例えば、分子標的が、応答に関連する細
胞成分を抑制する場合、応答の程度は、分子標的を過剰
発現している試験細胞においてより小さくあり得る。
【０１６２】特定の実施形態において、試験細胞および
コントロール細胞は、この試験細胞が、コントロール細
胞において発現される薬物スクリーニングのための分子
標的を発現しないかまたは減少したレベルで発現すると
いう点で異なる。標的と相互作用することが予期される
化合物が、コントロール細胞および試験細胞に同様の効
果を発揮する場合、この化合物は、意図された分子標的
相互作用を介してその効果を発揮しない。コントロール
細胞で発現されるよりも低いレベルで分子標的を発現す
る試験細胞について、分子標的と相互作用する化合物
は、一般的に、コントロール細胞においてよりも試験細
胞においてより小さな効果を有する。
【０１６３】他の実施形態において、試験細胞およびコ
ントロール細胞は、コントロール細胞が、構造的に分子
標的と類似でありかつ分子標的を介する誘導により生じ
る細胞応答と同様の細胞応答を誘導し得るタンパク質を
発現しないかまたは減少したレベルで発現するという点
で異なる。標的と相互作用することが予期される化合物
が、コントロール細胞および試験細胞に異なる効果を発
揮する場合、その化合物は、意図された分子標的相互作
用を介してその効果を発揮しない。
【０１６４】試験細胞は、好ましくは、ジンクフィンガ
ータンパク質または本明細書中で記載される融合分子で
細胞遺伝子を調節することにより生成される。いくつか
の方法において、試験細胞は、内因性分子標的の発現を
抑制するように設計された外因性ジンクフィンガータン
パク質（または融合分子）を発現するように細胞を操作
することによって生成される。代替的な方法において、
試験細胞は、内因性分子標的の発現を活性化または増加
するように設計された外因性ジンクフィンガータンパク
質（または融合分子）を発現するように細胞を操作する
ことによって生成される。生じる試験細胞は、好ましく
は、外因性ジンクフィンガー含有タンパク質をコードす
る外因性核酸（そして、おそらく、環境因子に起因する
ランダム変異の低い発生率）を除いて、対応するコント
ロール細胞と実質的に同一である。従って、特定の実施
形態において、試験細胞集団およびコントロール細胞集
団の表現型は、外因性ジンクフィンガー含有分子による
調節（および、このタンパク質の調節に起因する他の二
次的変化）に供されるタンパク質のレベルに関してのみ
異なる。他の実施形態において、試験細胞およびコント
ロール細胞は、実質的に同一でなくともよいが、これら
の場合において、遺伝的相違（任意の外因性ＺＦＰコー
ドポリヌクレオチドに加えて）が、代表的に既知であ
る。
【０１６５】本願方法において使用されるコントロール
細胞および試験細胞は、個々の細胞または細胞集団であ
り得、後者がより一般的である。細胞型は、細胞株また
は天然の（例えば、単離された）細胞（例えば、一次細
胞）であり得る。細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）から入手可能であるか、または例えば、Ｆ
ｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａ
ｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）、およびこ
の中に列挙された参考文献に記載されるように当該分野
で公知の方法によって、生成され得る。類似の細胞は、
当該分野で公知の方法によって単離され得る。細胞型の
他の非限定的な例として、病理を有するか、または病理
に供された細胞（例えば、癌性細胞および形質転換細
胞）、病原体で感染させた細胞、幹細胞、完全分化細
胞、部分的分化細胞、不死化細胞などが挙げられる。原
核生物（例えば、細菌）および真核生物（例えば、酵
母、植物、真菌、魚類および哺乳動物細胞（例えば、ネ
コ、イヌ、マウス、ウシ、ブタおよびヒト）の両方の細
胞が使用され得、真核細胞が好ましい。哺乳動物（ヒト
および非ヒト）細胞型が、特に好ましい。古細菌細胞も
また使用され得る。細胞型の選択は、試験される薬物の
意図されたレシピエントに一部依存する。例えば、ヒト
細胞型は、ヒトでの使用を意図された薬物をスクリーニ
ングするために有利であり、そしてネコ細胞型は、ネコ
での使用を意図された薬物をスクリーニングするために
有利である。
【０１６６】適切な哺乳動物細胞株として、ＣＨＯ（チ
ャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ−Ｇ２細胞、
ＢａＦ−３細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）
細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するサル腎
臓細胞）、ＣＶ−１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲ
Ａ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞およびＨｅＬａ
細胞、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７
７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９を参照のこ
と）、ならびにＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞
（例えば、ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９
８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３〜４
６を参照のこと）が挙げられる。他の真核生物細胞とし
て、例えば、昆虫（例えば、ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）、真菌細胞（酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌ
ａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含む）、お
よび植物細胞（Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ３：４８６〜４９６を参照のこと）が挙げられ
る。細菌細胞型として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられ
る。
【０１６７】細胞は、ＺＦＰまたは融合分子（またはＺ
ＦＰまたは融合分子をコードするポリヌクレオチド）で
一過的にかまたは安定にトランスフェクトまたは形質転
換され得る。細胞をトランスフェクトする方法は、当該
分野で公知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら
（前出）に記載される。実施例１１は、２９３細胞を、
エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を活性化するＺＦＰを
コードする核酸分子で安定にトランスフェクトし得る方
法を示す。
【０１６８】さらに、上記のように、ジンクフィンガー
タンパク質は、実質的に任意の細胞遺伝子の発現を抑制
または活性化するように設計され得る。従って、ＺＦＰ
およびＺＦＰ融合体は、意図された分子標的に構造的に
関連するタンパク質の発現を抑制するか、または細胞に
基くＨＴＳアッセイに適切な細胞を生成するために分子
標的を過剰発現するように設計され得る。
【０１６９】薬物発見のための細胞に基くアッセイにつ
いて、ジンクフィンガー含有細胞を適用する際に、多く
の方法を使用し得る。試験細胞集団およびコントロール
細胞集団を、例えば、２つの異なる容器に入れ得る。候
補化合物の溶液を連続して両容器に添加し得、そして各
細胞集団について細胞の特性を定量および／または観察
し得る。それぞれの細胞集団についての細胞特性の値の
間に有意差（すなわち、実験誤差の範囲外）が存在する
場合、この候補化合物をこのアッセイにおける「ヒッ
ト」であると決定する。
【０１７０】別の方法は、最初にコントロール細胞集団
と候補化合物を接触する工程、および特定の細胞応答を
測定する工程を包含する。この応答の値は、アッセイに
ついてのベースライン尺度として役立つ。次いで、試験
細胞集団を候補化合物と接触させ、そして同一の細胞応
答を測定する。２つの応答について統計学的に異なる値
は、この化合物が「ヒット」であること；これが、実質
的に分子標的と相互作用することを示す。この方法は、
順序が逆であっても行われ得、その場合、最初に試験細
胞集団をアッセイする。
【０１７１】他の方法において、ジンクフィンガータン
パク質を使用して、試験細胞における分子標的の発現を
増強する。このような試験細胞は、必要に応じて、コン
トロール細胞（ここで、この標的は、正常なレベルで発
現される）か、または他の試験細胞（ここで、この標的
は正常以下のレベルで発現される）と組み合わせて使用
され得る。あるいは、分子標的の発現が、増強されてい
る試験細胞を、コントロール細胞との比較なしで使用し
得る。例えば、化合物の存在下および非存在下で、細胞
応答を測定する分析を行い得る。
【０１７２】いくつかの方法において、試験細胞および
コントロール細胞における細胞応答の分析は、並行して
行われる。他の方法において、試験細胞における細胞応
答の分析は、ヒストリカル（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コ
ントロールと比較される。いくつかの方法において、化
合物の存在下での試験細胞またはコントロール細胞のい
ずれかにおける細胞応答が、化合物の非存在下での同様
の細胞応答と比較される。
【０１７３】細胞の実質的に任意の成分が、薬物スクリ
ーニングのための分子標的として役立ち得る。代表的に
は、分子標的はポリペプチドである。目的の分子標的の
非限定的な例として、増殖因子レセプター（例えば、Ｆ
ＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ，ＥＦＧ、ＮＧＦＲ，およびＶＥＧ
Ｆ）が挙げられる。他の標的は、Ｇタンパク質レセプタ
ーであり、Ｋ物質レセプター、アンギオテンシンレセプ
ター、αおよびβアドレナリン作用性レセプター、セロ
トニンレセプター、およびＰＡＦレセプターが挙げられ
る。例えば、Ｇｉｌｍａｎ、Ａｎｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５６：６２５〜６４９（１９８７）を参照のこと。他の
標的として、イオンチャネル（例えば、カルシウムチャ
ネル、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル）、ムス
カリン性レセプター、アセチルコリンレセプター、ＧＡ
ＢＡレセプター、グルタミン酸レセプター、およびドー
パミンレセプター（Ｈａｒｐｏｌｄ、５，４０１，６２
９号、および米国特許第５，４３６，１２８号を参照の
こと）が挙げられる。他の標的は、接着タンパク質（例
えば、インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリ
ンスーパーファミリーのメンバー）である（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５〜４３３（１９
９０）；Ｏｓｂｏｒｎ、Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９
０）；Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２）
を参照のこと）。他の標的は、サイトカイン（例えば、
インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ１３）、腫瘍壊死因子
αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、トラン
スフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺
激因子（ＣＳＦ）および顆粒球／マクロファージコロニ
ー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。Ｈｕｍａｎ Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉ
ｃ ＆ ＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒ
ａｗａｌら編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１を参照のこと。
他の標的は、ホルモン、酵素、ならびに細胞内メッセン
ジャーおよび細胞間メッセンジャー（例えば、アデニル
シクラーゼ、グアニルシクラーゼ）、ならびにホスホリ
パーゼＣ、核内レセプター（例えば、ＦＸＲ（ファルネ
ソールＸレセプター（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ））、ならびにＲＺＲ（レチノイドＺレセプ
ター（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｚ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｐ
ＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター
（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒＡ
ｃｔｉｖａｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、ならびにオ
ルガネラレセプターである。標的分子は、ヒト、哺乳動
物、ウイルス、植物、真菌、または細菌であり得る。他
の標的は、抗原（例えば、微生物病原体（ウイルスおよ
び細菌の両方）由来ならびに腫瘍体由来のタンパク質、
糖タンパク質、および炭水化物、）である。なお他の標
的が、米国特許第４，３６６，２４１号に記載される。
標的との相互作用についてスクリーニングされるいくつ
かの化合物は、ほとんど標的と結合しない。他の化合物
は、標的をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズす
る。
【０１７４】いくつかの方法において、化合物は、個々
にスクリーニングされる。他の方法において、多くの化
合物は、並行してスクリーニングされる。マイクロタイ
タープレートおよびロボット利用は、多くの化合物の並
行的なスクリーニングに特に有用である。光学的検出が
また、迅速性および自動化について好ましい。数百、数
千または数百万もの化合物が、１週間でスクリーニング
され得る。
【０１７５】本発明の方法を使用して、一旦「ヒット」
が同定されると、その化合物の誘導体が、作製され、そ
の分子標的と相互作用する能力を最大化され得る。誘導
体は、従来技術（例えば、自己一致領域（ＳＣＦ）分析
（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｆｉｅｌｄ（ＳＣ
Ｆ） ａｎａｌｙｓｉｓ）、立体配置相互作用（ＣＩ）
分析、および正規モード動力学分析）を使用して作製さ
れ得る。これらの技術を実行するためのコンピュータプ
ログラムが、容易に入手可能である。例えば、Ｒｅｉｎ
ら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌ
ｉｎｇ ｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１９８９）を参照のこと。化合物誘導体を、細
胞に基づくアッセイにおけるスクリーニングに供し、分
子標的と最良の相互作用プロフィールを示す化合物を選
択する。
【０１７６】他の実施形態において、細胞が操作され、
その結果、レセプター系が、分子標的を介してシグナル
伝達に作動可能に関連付けられる。レセプター発現が、
転写産物または翻訳産物の形成を検出することによって
直接的に検出され得る。例えば、転写産物は、ＲＮＡ
（ノーザン）ブロットを使用して検出され得、特定のタ
ンパク質の形成は、特徴的な株を用いるか、またはタン
パク質固有の特徴を検出することによって検出され得
る。しかし、より代表的には、レセプターの発現は、レ
セプター活性の結果として形成される産物を検出するこ
とによって決定される。
【０１７７】従って、細胞に基づくスクリーニングアッ
セイが実施され得る。ここでは、ＺＦＰが、陰性シグナ
ル（例えば、シグナル伝達カスケードにおける事象の遮
断の結果としてのＺＦＰ制御抑制からのリポーターまた
は選択可能なマーカーの放出）に対する陽性応答（例え
ば、リポーターおよび／または選択可能なマーカーの活
性化）を媒介する。例えば、化合物の既知のシグナル伝
達カスケードへの影響について化合物をスクリーニング
するために、この化合物は、特定のシグナル伝達カスケ
ードに関連する標的を発現することが既知の細胞に投与
される。特定の実施形態において、標的は、細胞表面ま
たは膜に結合したレセプターであり、その結果、この化
合物は、細胞膜または細胞壁を横切る必要はない。他の
実施形態において、この標的は、シグナル伝達カスケー
ドの細胞内成分であり、従って、この化合物はまた、当
該分野で公知であり、そして本明細書中で記載された方
法を用いて細胞に直接投与され得る。
【０１７８】代表的には、これらの陽性応答アッセイに
おいて、試験細胞は（１）外因性ジンクフィンガータン
パク質および機能的ドメイン（例えば、抑制ドメイン）
を含む融合分子をコードするポリヌクレオチドならびに
（２）リポーターおよび／または選択可能な分子（例え
ば、緑色蛍光タンパク質、薬物耐性など）をコードする
ポリヌクレオチドを含む。融合分子をコードするポリヌ
クレオチドは、目的のシグナル伝達カスケードに応答性
の転写制御エレメントに作動可能に連結される。機能的
ドメインが、抑制ドメインである実施形態において、融
合分子は、発現される場合に、リポーター分子の発現を
抑制するように設計される。従って、シグナル伝達カス
ケードが機能している場合、融合分子が発現され、次い
でこれは、リポーター分子の発現を抑制するのに役立
つ。試験化合物が、例えば、融合分子の転写を調節する
制御エレメントに直接的または間接的に作用するシグナ
ル伝達経路の成分をブロックすることによって、抑制性
融合分子の発現を阻害する場合、リポーター分子発現の
抑制が減少し、そして増加したレベルのリポーター発現
が観察される。従って、任意の化合物は、リポーターレ
ベルをモニタリングするか、またはＺＦＰによってリポ
ーター（例えば、選択可能マーカー）分子の調節をモニ
ターするための陽性および／または陰性選択を使用する
ことによって、シグナル伝達カスケードを阻害する能力
についてスクリーニングされ得る。
【０１７９】本明細書中に記載された任意の方法が、任
意のリポーターおよび／または選択可能マーカーと共に
使用され得る。直接検出され得るリポーターとして、蛍
光分子（例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が挙げ
られる。蛍光は、市販の種々の蛍光検出システム（例え
ば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）システムを含
む）を使用して検出される。他のリポーターは、検出可
能な産物の形成を触媒する酵素である。適切な酵素とし
て、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファ
ターゼ、糖加水分解酵素、およびエステラーゼが挙げら
れる。酵素をコードする適切なリポーター遺伝子の例と
して、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ；ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ
（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４〜８６
９）、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルク
ロニダーゼ、βラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼおよびアルカリホスファターゼ（例えば、Ｔｏｈら
（１９８０）Ｄｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２
３１〜２３８；およびＨａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）が挙げられる。
【０１８０】選択可能マーカーはまたサブセットまたは
リポーター分子を形成し、そしてまた上記の直接検出可
能なリポーターの代わりに、またはそれに加えて使用さ
れ得る。陽性選択マーカーは、この遺伝子を保有し、そ
して発現する細胞のみが特定の条件下で生存および／ま
たは増殖するのを可能にする産物をコードするポリヌク
レオチドである。例えば、ネオマイシン耐性（Ｎｅ
ｏｒ）遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に耐性
であるが、Ｎｅｏｒを発現しない細胞は、Ｇ４１８によ
って死滅（ｓｋｉｌｌｅｄ）させられる。陽性選択マー
カーの他の例として、ハイグロマイシン耐性、Ｚｅｏｃ
ｉｎ（登録商標）耐性などが挙げられ、これらは、当業
者に公知である。陰性選択マーカーは、この遺伝子を保
有し、そして発現する細胞のみが、特定の条件下で死滅
させられるのを可能にする産物をコードするポリヌクレ
オチドである。例えば、チミジンキナーゼ（例えば、単
純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ＨＳＶ−ＴＫ）
を発現する細胞は、ガンシクロビルが添加される場合に
死滅する。他の陰性選択マーカーが、当業者に公知であ
る。選択マーカーは導入遺伝子である必要はなく、そし
てさらにリポーターと選択可能マーカーは、種々の組み
合わせで使用され得る。
【０１８１】（Ｄ．生化学的アッセイ）生化学的薬物ス
クリーニングアッセイを行う方法もまた本明細書中で記
載される。特定のレセプターに影響する薬物を試験する
ための重要な生化学的アッセイは、目的のレセプターを
含む細胞膜の単離および候補化合物の結合についての試
験を含む。従って、細胞膜に結合する特定のタンパク質
（例えば、レセプター）を過剰発現する細胞は、これら
のタンパク質の発現を活性化するジンクフィンガータン
パク質を使用して容易に生成され得る。引き続いて、目
的のタンパク質を過剰発現する細胞の膜は、アッセイ
（例えば、結合アッセイ）における使用のために容易に
単離され得る。
【０１８２】（Ｅ．化合物および細胞特性）本明細書中
で記載された方法は、広範で多様な化合物のスクリーニ
ングにおいて有用である。例えば、本方法でスクリーニ
ングされる化合物は、ペプチドまたは低分子、ホルモ
ン、増殖因子、およびサイトカインのコンビナトリアル
ライブラリー由来であり得るか、天然に生じる分子であ
り得るか、または製薬産業で合成される化合物の既存の
レパートリー由来であり得る。コンビナトリアルライブ
ラリーは、ステップバイステップ様式で合成され得る多
くの型の化合物について作製され得る。このような化合
物として、例えば、ポリペプチド、βターン模倣物、多
糖類、核酸、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジ
ン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベン
ゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシンおよびオリゴ
カルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコ
ンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ
９５／１２６０８、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ９３／０６１
２１、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＷＯ
９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ＷＯ９
５／３５５０３、およびＳｃｒｉｐｐｓ、ＷＯ９５／３
０６４２に記載されるコードされた合成ライブラリー
（ＥＳＬ）法によって構築され得る。ペプチドライブラ
リーもまた、ファージディスプレイ法によって作製され
得る。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ９１／１８９８０を
参照のこと。スクリーニングされる化合物はまた、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ
Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏ
ｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手し得る。既知の
効果を有する既存の化合物または薬物をまたスクリーニ
ングして、副作用および／またはさらなる指標を評価し
得る。
【０１８３】さらに、種々の細胞および／または生化学
的応答（細胞特性とも呼ばれる）が、測定され得、そし
て本明細書中で記載される方法において比較され得る。
いくつかの方法において、細胞特性の値は、細胞増殖、
新生血管形成、ホルモン放出、ｐＨ変化、細胞内セカン
ドメッセンジャー（例えば、ＧＭＰ）の変化、レセプタ
ーとの結合などの関数として測定される。
【０１８４】別の実施形態において、化合物の投与に対
する細胞の応答が、細胞特性の値として正常に定量され
る。値の単位は、特性に依存する。例えば、この単位
は、吸光度、光子計数、放射活性粒子計数または光学密
度であり得る。
【０１８５】（分子の送達）分子標的が細胞内に存在す
る場合、分子と相互作用する化合物は、細胞膜を横断し
なければならない。細胞と接触する化合物は、多くの手
段で細胞膜を通過し得る。化合物が適切なサイズおよび
適切な電荷特性を有する場合、化合物は、受動的に膜を
横切って輸送され得る。膜通過の他のプロセスとして、
能動輸送（例えば、レセプター媒介輸送）、エンドサイ
トーシスおよびピノサイトーシスが挙げられる。化合物
が前述の任意の方法によって効率的に輸送され得ない場
合、微量注入、微粒子銃、または他の方法を使用して細
胞内部に化合物を送達し得る。あるいは、スクリーニン
グされる化合物がタンパク質である場合、タンパク質を
コードする核酸が細胞内に導入され、そして細胞内で発
現され得る。
【０１８６】同様に、細胞内の調節をもたらす外因性ジ
ンクフィンガータンパク質は、細胞内に導入されなけれ
ばならない。代表的には、このことは、ＺＦＰ分子また
はＺＦＰをコードする核酸のいずれかを、細胞内におい
てジンクフィンガータンパク質の発現をもたらす細胞に
導入することによって達成される。核酸は、ウイルスに
基づく方法、化学的方法、リポフェクションおよび微量
注入を含む従来の手段によって導入され得る。導入され
た核酸は、宿主染色体に組み込まれ得るか、エピソーム
形態で存続し得るか、または細胞質中で一過的に存在し
得る。同様に、外因性タンパク質は、タンパク質の形態
で細胞に導入され得る。例えば、ジンクフィンガータン
パク質は、リポフェクション、微粒子銃、もしくは微量
注入によってか、または膜トランスロケーションドメイ
ンへの融合を介して導入され得る。
【０１８７】従って、本明細書中で記載される組成物
は、インビトロまたはインビボで標的細胞に提供され得
る。さらに、この組成物は、ポリペプチド、ポリヌクレ
オチドまたはこれらの組み合わせとして提供され得る。
【０１８８】（Ａ．ポリヌクレオチドの送達）特定の実
施形態において、この組成物は、１つ以上のポリヌクレ
オチドとして提供される。さらに、上記のように、ジン
クフィンガータンパク質含有組成物は、ポリペプチドの
ジンクフィンガーと機能的ドメイン（これは、融合核酸
によってコードされる）との間の融合体として設計され
得る。融合体および非融合体の両方の場合において、こ
の核酸は、複製および／または発現のための原核生物細
胞または真核生物細胞への形質転換のための中間ベクタ
ーにクローニングされ得る。核酸の貯蔵もしくは操作ま
たはタンパク質の産生のための中間ベクターは、例え
ば、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）、シャト
ルベクター、昆虫ベクター、またはウイルスベクターで
あり得る。ジンクフィンガータンパク質をコードする核
酸はまた、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞、植物細
胞、または魚細胞または哺乳動物細胞（好ましくは、ヒ
ト細胞）のような動物細胞への投与のための、発現ベク
ターにクローニングされ得る。
【０１８９】クローニングされた核酸の発現を得るため
に、代表的に、核酸は、転写を指向するプロモーターを
含む発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細
菌および真核生物プロモーターは、当該分野で周知であ
り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅ
ｌら、前出；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９９０）において
記載されている。細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら（１９８３）
Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５）。このような発現系
のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵
母細胞、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当
該分野で周知であり、そしてまた、例えば、Ｉｎｖｉｔ
ｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡおよびＣｌｏｎ
ｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから市販されて
いる。
【０１９０】選択した核酸の発現を指向するために使用
されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例え
ば、強力な構成性プロモーターは、代表的に、発現およ
び精製のために使用される。対照的に、タンパク質が、
インビボで使用される場合、構成性または誘導性プロモ
ーターのいずれかが使用され、これは、タンパク質の特
定の用途に依存する。さらに、ＨＳＶ ＴＫまたは同様
の活性を有するプロモーターのような弱いプロモーター
が使用され得る。代表的に、これらのプロモーターはま
た、トランス活性化に応答性であるエレメント（例え
ば、低酸素応答性エレメント、Ｇａｌ４応答性エレメン
ト、ｌａｃリプレッサー応答性エレメント、ならびにｔ
ｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系のような低分子制御
系）を含み得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ ８９：
５５４７−５５５１；Ｏｌｉｇｉｎｏら（１９９８）Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒ．５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら（１
９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１；Ｎ
ｅｅｒｉｎｇら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４
７−１１５５；およびＲｅｎｄａｈｌら（１９９８）Ｎ
ａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１を
参照のこと）。
【０１９１】プロモーターに加えて、発現ベクターは、
代表的に、宿主細胞（原核生物または真核生物のいずれ
か）における核酸の発現のために必要なさらなるエレメ
ントを含む転写単位、または発現カセットを含む。従っ
て、代表的な発現カセットは、例えば、核酸配列に作動
可能に連結されたプロモーター、および、例えば、転写
産物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム
結合、および／または翻訳終結に必要なシグナルを含
む。このカセットのさらなるエレメントは、例えば、エ
ンハンサー、および異種のスプライスされるイントロン
シグナルを含み得る。
【０１９２】遺伝情報を細胞に輸送するために使用され
る特定の発現ベクターは、得られたＺＦＰポリペプチド
の意図される用途（例えば、植物、動物、細菌、真菌、
原生動物類などにおける発現）に関して選択される。標
準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ
のようなプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺの
ような市販の融合発現系が挙げられる。エピトープタグ
はまた、組換えタンパク質に付加され、発現のモニタリ
ングならびに細胞および細胞以下の局在化のモニタリン
グのための、単離の慣例的な方法（例えば、ｃ−ｍｙｃ
またはＦＬＡＧ）を提供する。
【０１９３】真核生物ウイルス由来の調節エレメント
は、しばしば真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０
ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、およびエプスタイ
ン−バーウイルス由来のベクター）において使用され
る。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳ
Ｇ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡ
Ｍｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳ
Ｖ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、
メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス
プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリ
へドリンプロモーター、または真核生物細胞における発
現に効果的であると示される他のプロモーターの指向下
で、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクター
が挙げられる。
【０１９４】いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、および
ジヒドロ葉酸レダクターゼのような、安定してトランス
フェクトされた細胞株の選択のためのマーカーを有す
る。昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターのよう
な高収率発現系はまた、ポリへドリンプロモーターまた
は任意の他の強力なバキュロウイルスプロモーターの転
写制御下で、本明細書中に記載されるように、ＺＦＰを
コードする核酸配列に適している。
【０１９５】代表的に発現ベクターに含まれるエレメン
トはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ（または、原核生物宿主、Ｅ．
ｃｏｌｉ以外の場合）において機能するレプリコン、組
換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする選択
マーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝
子）、および組換え配列の挿入を可能にするベクターの
非必須な領域における特殊な制限部位を含む。
【０１９６】標準的なトランスフェクション方法を使用
して、所望であれば標準的な技術を使用して精製され得
る大量のジンクフィンガータンパク質を発現する、細菌
細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株、昆虫細胞株、ま
たは他の細胞株を作製し得る（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら
（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６
１９−１７６２２；およびＧｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅｒ編）１９９０年を参照のこと）。真核生
物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術
に従って行なわれる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９
７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５
１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８３）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４
７−３６２（Ｗｕら編）を参照のこと）。
【０１９７】外来のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入
するための任意の手順が使用され得る。これらとして
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレ
ン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、脂
質媒介性送達（例えば、リポソーム）、微小注入、微粒
子銃、裸のＤＮＡの導入、プラスミドベクター、ウイル
スベクター（エピソームおよび組込みの両方）およびク
ローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ
または他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入するための
周知の他の方法のいずれかの使用が挙げられるが、これ
らに限定されない（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出
を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順は、
選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞に少なくとも
１つの遺伝子を首尾良く導入し得ることのみが必要であ
る。
【０１９８】慣習的なウイルスおよび非ウイルスベース
の核酸送達方法を使用して、核酸を宿主細胞または標識
組織に導入し得る。このような方法を使用して、核酸を
インビトロで細胞に投与し得る。さらに、核酸は、イン
ビボまたはエキソビボで投与される。非ウイルス送達系
としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソ
ームのような送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げら
れる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達
後、エピソームまたは組込みゲノムのいずれかを有する
ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。核酸送達手
順の総説としては、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９
２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３；Ｎａｂ
ｅｌら（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉら（１９９
３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１６
２−１６６；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１６７−１７５；Ｍｉｌ
ｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４
６０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４；Ｖｉ
ｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：
３５−３６；Ｋｒｅｍｅｒら（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓ
ｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：
３１−４４；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈ
ｍ（編）、１９９５年；ならびにＹｕら（１９９４）Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６を参照のこ
と。
【０１９９】核酸の非ウイルス送達の方法としては、リ
ポフェクション、微小注入、バリスティックス（ｂａｌ
ｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロゾーム、リポソーム、イムノリ
ポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸の
ＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増強性のＤＮＡの取
り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米
国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８
７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されてお
り、そして、リポフェクション試薬が市販されている
（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭおよびＬｉｐｏ
ｆｅｃｔｉｎＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセ
プター認識リポフェクションに適切な陽イオン性および
中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４
２４およびＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
核酸は、細胞（インビトロもしくはエキソビボ投与）ま
たは標的組織（インビボ投与）に送達され得る。
【０２００】脂質：核酸複合体（免疫脂質複合体のよう
な標的化されたリポソームを含む）の調製は、当業者に
周知である。例えば、Ｃｒｙａｔａｌ（１９９５）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０；Ｂｌａｅｓｅら
（１９９５）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２
９１−２９７；Ｂｅｈｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９；Ｒｅｍｙ
ら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．
５：６４７−６５４；Ｇａｏら（１９９５）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２；Ａｈｍａｄら
（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−
４８２０；ならびに米国特許第４，１８６，１８３号；
同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１
号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５
４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０
８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９
４６，７８７号を参照のこと。
【０２０１】核酸の送達のためのＲＮＡウイルスまたは
ＤＮＡウイルスベースの系の使用は、身体中の特定の細
胞にウイルスを標的化するため、そしてウイルス荷重
（ｐａｙｌｏａｄ）を核に輸送するための高度に進化し
たプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接被験
体に投与され得るか（インビトロ）またはそれらを使用
して、インビトロもしくはエキソビボで細胞を処置し得
る。ＺＦＰの送達のための慣例的なウイルスベースの系
としては、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックス
ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、水疱
性口内炎ウイルスおよびヘルペスウイルスベクターの系
が挙げられる。宿主ゲノムにおける組込みは、特定のウ
イルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、お
よびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を含む）で可能
であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現を
生じる。さらに、高い形質転換効率が、多数の異なった
細胞型および標的組織において観察される。
【０２０２】レトロウイルスの向性は、外来のエンベロ
ープタンパク質を取り込むことによって変更され得、潜
在的な標的細胞集団の変更および／または増殖を可能に
する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導
入または感染し得るレトロウイルスベクターであり、そ
して、代表的に高いウイルス力価を生成する。従って、
レトロウイルス核酸送達系の選択は、標的細胞および／
または組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６
〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有
し、そして、シス作用性の長い末端配列（ＬＴＲ）から
構成される。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複
製およびパッケージングに十分であり、次いで、これら
を使用して、外因性遺伝子を標的細胞に組込み、永続的
な導入遺伝子発現を提供する。広範に使用されるレトロ
ウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（Ｍ
ｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シ
ミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づいた
ベクターが挙げられる（Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９
２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏ
ｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３
５−１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖ
ｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９
８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍ
ｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２
２０−２２２４；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７０
０）。ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験におい
て使用されるレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕ
ｎｂａｒら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−
３０５；Ｋｏｈｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅ
ｄ．１：１０１７−１０２；Ｍａｌｅｃｈら（１９９
７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９４；１２１３３−１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡ
ＳＮは、遺伝子治療試験において使用された最初の治療
ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０）。５０％以上の形
質転換効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージ化ベクターについ
て観察された（Ｅｌｌｅｍら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０；
Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒ．１：１１１−２）。
【０２０３】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを
また使用して、例えば、核酸およびペプチドのインビト
ロ産生において、そして、インビボおよびエキソビボ適
用のために、標的核酸で細胞を形質導入する。例えば、
Ｗｅｓｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３
８−４７；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３
／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒ．５：７９３−８０１；およびＭｕｚｙｃ
ｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９
４：１３５１を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構
築は、多数の刊行物において記載され、米国特許第５，
１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６
０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｈｅｒｍｏｎ
ａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；およびＳａ
ｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３
８２２−３８２８が挙げられる。
【０２０４】欠損性および非病原性パルボウイルス属２
型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−２）に基づいた組換え
アデノ随伴ウイルスベクターは、有望な核酸送達系であ
る。例示的なＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現カセッ
トに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復を含む
プラスミドに由来する。核酸の効率的な移入および形質
導入された細胞のゲノムへの組込みに起因する安定した
導入遺伝子送達は、このベクター系についての重要な特
徴である（Ｗａｇｎｅｒら（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ
３５１（９１１７）：１７０２−３；およびＫｅａｒｎ
ら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−７５
５）。
【０２０５】一過的な発現が好ましい適用において、ア
デノウイルスベースの系が有用である。アデノウイルス
ベースのベクターは、多数の細胞型において非常に高い
効率で形質導入し得、そして、感染し得、従って、分裂
細胞および非分裂細胞の両方に核酸を送達する。このよ
うなベクターを用いて、高い力価および高い発現レベル
が得られた。アデノウイルスベクターは、比較的単純な
系で大量に生成され得る。
【０２０６】複製欠損組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベ
クターは、高い力価で生成され得、そして、それらは、
容易に多数の異なった細胞型に感染する。大部分のアデ
ノウイルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、
Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操
作され；複製欠損ベクターは、トランスで必要なＥ１機
能を提供するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベ
クターは、インビボで多数の型の組織（肝臓、腎臓およ
び筋肉において見出されるような非分裂の分化した細胞
を含む）を形質導入し得る。慣例的なＡｄベクターは、
挿入されたＤＮＡについて大規模な保有能力を有する。
臨床試験におけるＡｄベクターの用途の例としては、筋
肉内注射を用いる抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド
治療が挙げられる（Ｓｔｅｒｍａｎら（１９９８）Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９）。
核酸送達のためのアデノウイルスベクターの使用のさら
なる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら（１９９６）
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：５−１０；Ｓｔｅｒｍａｎ
ら、前出；Ｗｅｌｓｈら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２：２０５−２１８；Ａｌｖａｒｅｚら
（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７
−６１３；およびＴｏｐｆら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．５：５０７−５１３が挙げられる。
【０２０７】パッケージング細胞を使用して、宿主細胞
を感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞
としては、２９３細胞（これは、アデノウイルスをパッ
ケージ化する）、およびΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞
（これは、レトロウイルスをパッケージ化する）が挙げ
られる。核酸送達において使用されるウイルスベクター
は、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージ化
する産生細胞株によって、産生される。これらのベクタ
ーは、代表的に、パッケージングおよび引き続く宿主細
胞への組込みに必要な最小限のウイルス配列、発現され
るタンパク質の発現カセットによって置換される他のウ
イルス配列を含む。ウイルス機能を失うことは、必要な
場合、細胞株をパッケージングすることによって、トラ
ンスで提供される。例えば、核酸送達において使用され
るＡＡＶベクターは、代表的に、ＡＡＶゲノム由来のＩ
ＴＲ配列のみを保有し、これは、パッケージングおよび
宿主ゲノムへの組込みに必要である。ウイルスＤＮＡ
は、細胞株にパッケージ化され、この細胞株は、他のＡ
ＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードす
るがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む。この
細胞株はまた、ヘルパーとして、アデノウイルスで感染
される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製お
よびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促
進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起
因して、有意な量でパッケージ化されない。アデノウイ
ルスの混入は、例えば、アデノウイルスを優先的に不活
化する熱処理によって減少され得る。
【０２０８】多数の核酸送達適用において、ベクター
は、特定の組織型に対して高度の特異性を有して送達さ
れることが望ましい。ウイルスベクターは、ウイルスの
外表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク
質として、リガンドを発現することによって、所定の細
胞について特異性を有するように改変され得る。このリ
ガンドは、目的の細胞型に存在することが知られている
レセプターに親和性を有するように選択される。例え
ば、Ｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１は、モ
ロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合された
ヒトヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）を発現するよう
に改変され得、そして、組換えウイルスは、ヒト上皮増
殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染
することを報告した。この原理は、リガンド融合タンパ
ク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現する標
的細胞の他の組み合わせに広げられ得る。例えば、繊維
状ファージは、事実上任意の選択された細胞レセプター
について特異的結合親和性を有する抗体フラグメント
（例えば、ＦａｂまたはＦｖ）を提示するように操作さ
れ得る。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用す
るが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用され得る。
このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込み
を助けると考えられている特定の取り込み配列を含むよ
うに操作され得る。
【０２０９】ベクターは、以下に記載のように、被験体
への投与によって、代表的には、全身投与（例えば、静
脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または
頭蓋内注射）または局所適用によって、インビボで送達
され得る。あるいは、ベクターは、インビトロまたはエ
キソビボで細胞（例えば、被験体から外植された細胞
（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検））に送達
され得る。
【０２１０】１つの実施形態において、造血幹細胞は、
細胞トランスフェクションおよび核酸送達のためのイン
ビトロ手順において使用される。幹細胞を使用すること
に対する利点は、それらが、インビトロで他の細胞型に
分化し得ることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよ
びＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用する、インビ
トロでＣＤ３４＋幹細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に
分化させるための方法は、公知である（Ｉｎａｂａら
（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−
１７０２）。
【０２１１】幹細胞は、公知の方法を使用して、形質転
換および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、
不必要な細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細
胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒
球）、ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞））に結
合する抗体を用いて、骨髄細胞をパニングすることによ
って、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、前出、
を参照のこと）。
【０２１２】（Ｂ．ポリペプチドの送達）他の実施形態
において、ＺＦＰまたはＺＦＰ融合タンパク質は、直接
標的細胞に投与される。特定のインビトロ内容物におい
て、標的細胞は、１つ以上のＺＦＰに融合された機能的
ドメインを含む１つ以上の融合タンパク質を含む培地中
で培養される。
【０２１３】ポリペプチド化合物の投与における重要な
要因は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核のよ
うな細胞内区画の膜を横断する能力を有することを保証
することである。細胞膜は、小さい非イオン性の親油性
化合物に対して自由に浸透可能であり、そして、極性化
合物、マクロ分子、および治療薬剤または診断薬剤に対
して固有に非浸透性である、脂質−タンパク質の２層か
ら構成される。しかし、細胞膜を横切るポリペプチドを
転位する能力を有する、タンパク質、脂質および他の化
合物が記載される。
【０２１４】例えば、「膜転位ポリペプチド」は、膜転
移キャリアとして作用する能力を有する両親媒性または
疎水性のアミノ酸のサブ配列を有する。１つの実施形態
において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切
って転移する能力を有する。ホメオドメインタンパク質
（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）の最も短い内部移行可能
なペプチドは、タンパク質の第３のヘリックス（アミノ
酸４３〜５８位に由来する）であることが見出された
（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９−６３４）。別の
サブ配列（シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメイン）
が、同様の細胞膜転移特徴を有することが見出された
（Ｌｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：１４２５５−１４２５８）。
【０２１５】細胞へのその取り込みを促進するためのジ
ンクフィンガーポリペプチド（またはこれを含む融合
体）に連結され得るペプチド配列の例としては、以下を
含むがこれらに限定されない：ＨＩＶのｔａｔタンパク
質の１１アミノ酸ペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ
酸８４〜１０３に対応する２０残基ペプチド配列（Ｆａ
ｈｒａｅｕｓら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：
８４）；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａの長さ６０アミノ酸
のホメオドメインの第３のヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉ
ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０
４４４）；シグナルペプチドのｈ領域（例えば、カポー
ジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域（Ｌｉｎ
ら、前出））；およびＨＳＶ由来のＶＰ２２転移ドメイ
ン（Ｅｌｌｉｏｔら（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２２
３−２３３）。強化された細胞性取り込みを提供する他
の適切な化学部位はまた、ＺＦＰに共有結合または非共
有結合のいずれかで結合され得る。
【０２１６】毒素分子はまた、細胞膜を横切ってポリペ
プチドを輸送する能力を有する。しばしば、このような
分子（「バイナリー毒素」と呼ばれる）は、少なくとも
２つの部分から構成される：転移または結合ドメインお
よび別々の毒素ドメイン。代表的に、転移ドメイン（こ
れは、必要に応じて、ポリペプチドであり得る）は、細
胞レセプターに結合し、細胞への毒素の輸送を容易にす
る。いくつかの細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐ
ｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ微小毒素、ジフテリア毒素（Ｄ
Ｔ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）、百日
咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓ毒素、および百日咳アデニルシクラーゼ（ＣＹＡ）を
含む）を使用して、内部融合体またはアミノ末端融合体
として、細胞細胞質へペプチドを送達する（Ａｒｏｒａ
ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３
３４−３３４１；Ｐｅｒｅｌｌｅら（１９９３）Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５１４７−５１５６；Ｓｔ
ｅｎｍａｒｋら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１１３：１０２５−１０３２；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１
９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：３５３０−３５３４；Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ
ら（１９９５）Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５；Ｓｅ
ｂｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：
３８５１−３８５７；Ｋｌｉｍｐｅｌ（１９９２）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１
０２７７−１０２８１；およびＮｏｖａｋら（１９９
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６−１
７１９３）。
【０２１７】このようなサブ配列を使用して、細胞膜を
横切って、ポリペプチド（本明細書中に記載されるよう
なポリペプチドを含む）を転移する。これは、例えば、
これらの転移配列の１つで、融合ポリペプチドを誘導す
ることによって、または、融合ポリペプチドと転移配列
のさらなる融合を形成することによって、達成される。
必要に応じて、リンカーを使用して、融合ポリペプチド
および転移配列に連結し得る。任意の適切なリンカー
（例えば、ペプチドリンカー）が使用され得る。
【０２１８】適切なポリペプチドがまた、リポソームお
よび免疫リポソームのようなリポソーム誘導体を介し
て、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞に導入され得
る。用語「リポソーム」は、水相をカプセル化する、１
つ以上の同心性の向きの脂質の２層から構成される小胞
をいう。代表的に、この水相は、細胞に送達される分子
を含む。
【０２１９】リポソームは原形質膜と融合し、それによ
り、分子を細胞質中に放出する。あるいは、リポソーム
は貧食されるか、または、輸送小胞体中の細胞に取り込
まれる。一旦エンドソームまたは食胞中に入ると、リポ
ソームは、分解されるかまたは輸送小胞体の膜と融合
し、そしてその含有物を放出する。
【０２２０】現在のリポソームを介した薬物送達方法に
おいて、リポソームは最終的に透過性になり、そして標
的組織または標的細胞でカプセル化された分子を放出す
る。全身的送達または組織特異的送達にとって、このこ
とは、例えば、リポソームの二重層が、体内の種々の因
子の作用を通じて経時的に分解されるような受動的な様
式で達成され得る。あるいは、活性な薬物の放出は、リ
ポソームビヒクルにおける透過性の変化を誘導する因子
の使用を伴う。リポソーム膜は、リポソーム膜付近の環
境が酸性になる場合、不安定になるように構築され得
る。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ２８：９０８（１９８９）を参照のこと。
例えば、リポソームが標的細胞によってエンドサイトー
シスを受ける場合、これらは不安定になり、そして内容
物を放出する。この不安定化は、フソジェネシス（ｆｕ
ｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれる。ジオレイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、多くの「フソ
ジェニック」システムの基本である。
【０２２１】本明細書中で開示される方法および組成物
を用いる使用のために、リポソームは代表的に、本明細
書中で開示されるような融合ポリペプチド、脂質構成成
分（例えば、中性脂質および／またはカチオン性脂質）
を含み、そして必要に応じて、限定の細胞表面レセプタ
ーまたはリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体のよ
うな、レセプター認識分子を含む。例えば、以下の文献
に記載されるような、リポソームを調製するための、種
々の方法が利用可能である：米国特許第４，１８６，１
８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，
８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８
５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７
７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；同第４，
２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第
４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同
第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；
同第４，９４６，７８７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１
７４２４号；Ｓｚｏｋａら（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；Ｄｅ
ａｍｅｒら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９−６３４；Ｆｒａｌｅｙ
ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８−３３５２；Ｈｏｐｅら
（１９８５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ ８１２：５５−６５；Ｍａｙｅｒら（１９８６）Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１
６１−１６８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４２
−２４６；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｏｓｔｒｏ編，１９８
３，Ｃｈａｐｔｅｒ １）；Ｈｏｐｅら（１９８６）Ｃ
ｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９；Ｇｒｅｇｏｒ
ｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
（１９８４）およびＬａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：
ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ （１９９３）。例えば、適切な方法として、超音
波破砕、押し出し、高圧／ホモジェナイゼーション、ミ
クロ流体化、界面活性剤透析、小リポソームベシクルの
カルシウム誘導性融合およびエーテル融合方法が挙げら
れ、これらの全ては当該分野で周知である。
【０２２２】特定の実施形態において、特定の細胞型、
組織などに特異的な標的化部分を用いてリポソームを標
的化することが、望ましくあり得る。種々の標的化部分
（例えば、リガンド、レセプター、およびモノクローナ
ル抗体）を用いたリポソームの標的化は、これまでに記
載されている。例えば、米国特許第４，９５７，７７３
号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと。
【０２２３】標的化部分の例として、新生物に関連する
抗原（例えば、前立腺癌特異的抗原およびＭＡＧＥ）に
特異的なモノクローナル抗体が挙げられる。腫瘍細胞も
また、癌遺伝子（例えば、ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ
２）の活性化または過剰発現に起因する遺伝子産物を検
出することによって標的化され得る。さらに、多くの腫
瘍が、胎児組織によって通常は発現される抗原（例え
ば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児抗原
（ＣＥＡ））を発現する。ウイルス感染細胞は、種々の
ウイルス抗原（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原およびＢ型肝
炎表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エ
プスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス
１型（ＨＩＶ−１）ならびにパピローマウイルス抗原）
を用いて標的化され得る。炎症細胞は、炎症部位で発現
される表面分子（例えば、インテグリン（例えば、ＶＣ
ＡＭ−１）、セレクチンレセプター（例えば、ＥＬＡＭ
−１）など）によって特異的に認識される分子を用いて
標的化され得る。
【０２２４】リポソームに標的化因子をカップリングさ
せるための標準的な方法が、用いられる。これらの方法
は一般に、リポソーム中への脂質成分（例えば、標的化
因子の付着のために活性化され得るホスファチジルエタ
ノールアミン）の組込みか、または誘導体化された親油
性化合物（例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）の組
込みを含む。抗体を標的化したリポソームは、例えば、
プロテインＡを組み込んだリポソームを用いて構築され
得る。Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３３７−１６３４２および
Ｌｅｏｎｅｔｔｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２４４８−２４５１
を参照のこと。
【０２２５】（キット）上記の方法のいずれかを実施す
るためのキットもまた、提供される。このキットは代表
的に、上記の方法において使用するための細胞またはこ
のような細胞を作製するための構成成分を含む。例え
ば、いくつかのキットは、１つの細胞集団が、試験細胞
内の分子標的（例えば、タンパク質）の発現を調節する
ために設計されたジンクフィンガータンパク質をコード
する外来核酸を用いて形質転換されている点で相違す
る、試験細胞およびコントロール細胞の対を含む。いく
つかのキットは、１つの細胞型、およびこの細胞型から
試験細胞を生成することを可能にする他の構成成分を含
む。このような構成成分は、ジンクフィンガータンパク
質をコードするベクターかまたはジンクフィンガータン
パク質自体を含み得る。このキットはまた、必要な容
器、細胞の形質転換のための緩衝液、細胞のための培養
培地、および／またはアッセイを実施するための緩衝液
を含み得る。代表的に、このキットはまた、この細胞
が、化合物をスクリーニングするために用いられるべき
ことを示す標識を含み得る。標識は、備え付けである
か、そうでなければこのキットの他の構成成分を伴う包
装用印刷物または広告用印刷物のような、任意の物質を
含む。
【０２２６】
【実施例】以下の実施例は、例示するために提供される
のであって、いかなる手段においても限定することを意
図しない。
【０２２７】（実施例１）この第１の実施例は、ヒト血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子のプロモーター内に
含まれたＤＮＡ配列を認識するよう設計されたＺＦＰの
構築を実証する。ＶＥＧＦは、低酸素症により誘導され
る内皮細胞特異的マイトジェンであるおよそ４６ｋＤａ
の糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、癌、種々の網膜
症、および他の重篤な疾患に関連する、脈管形成に関連
するとみなされてきた。選択したＤＮＡ標的部位は、こ
の遺伝子の転写開始部位の周囲の領域であった。選択し
た２つの９塩基対（ｂｐ）の部位は、配列
【０２２８】
【化１】 （配列番号１）（ここで、大文字は、実際の９塩基標的
をあらわす）中に存在することが見出された。上流の９
ｂｐ標的を標的化したタンパク質を、ＶＥＧＦ１と命名
し、そして下流の９ｂｐ標的を標的化したタンパク質を
ＶＥＧＦ３ａと命名した。ＶＥＧＦの主要な転写開始部
位は、第１の９ｂｐ標的の３’末端におけるＴであり、
上記の配列において下線を引いてある。
【０２２９】ヒトＳＰ−１転写因子を、設計されたＺＦ
Ｐの構築のための前駆体分子として使用した。ＳＰ−１
は、十分に研究されているマウスＺｉｆ２６８に関連す
る３フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する（Ｃｈｒｉ
ｓｔｙら、ＰＮＡＳ ８５：７８５７−７８６１（１９
８８））。このドメインを用いた部位特異的変異誘発実
験は、Ｚｉｆ２６８において作動している提唱された
「認識ルール」が、他の標的ＤＮＡ配列にＳＰ−１を適
合するために用いられ得ることを示した（Ｄｅｓｊａｒ
ｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ、ＰＮＡＳ ９１：１１０９９
−１１１０３（１９９４））。ジンクフィンガークロー
ンの構築のために用いられたＳＰ−１配列は、ＳＰ−１
転写因子のアミノ酸５３３〜６２４に対応する。
【０２３０】２つの設計されたＺＦＰであるＶＥＧＦ１
およびＶＥＧＦ３ａの認識ヘリックスにおけるアミノ酸
の選択を、表１に要約する。
【０２３１】（表１：ＶＥＧＦ−認識ＺＦＰの認識ヘリ
ックスとして選択されたアミノ酸）
【０２３２】
【表１】 ６つの重複オリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲベース
の構築手順を用いて、これらのペプチドを発現させるた
めに、コード配列を構築した。これらのオリゴヌクレオ
チドは、認識ヘリックス間のＤＮＡ結合ドメインの一部
をコードする「ユニバーサル」配列に対応する。これら
のオリゴヌクレオチドは、どのジンクフィンガー構築物
についても一定のままである。３つの「特異的な」オリ
ゴヌクレオチドを、認識ヘリックスをコードするように
設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、異なるＤＮ
Ａ結合ドメインそれぞれに対して特異的になるように、
認識ヘリックスにおける１、２、３および６位での置換
を含んだ。哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉの両方にお
いて発現を可能にするよう、コドンのバイアスを選択し
た。
【０２３３】ＰＣＲ合成を、２工程で実施した。第１
に、二本鎖ＤＮＡテンプレートを、上記の６つのオリゴ
ヌクレオチド（ユニバーサルな３つ、特異的な３つ）を
組み合わせること、そして低温（２５℃）のアニーリン
グ工程を含む４サイクルＰＣＲ反応を用いることによっ
て作製した。この温度では、この６つのオリゴヌクレオ
チドは、ＤＮＡ「骨格」を形成するよう結び付く。骨格
中の間隙をＴａｑポリメラーゼとＰｆｕポリメラーゼと
の組合せにより満たした。構築の第２段階において、ジ
ンクフィンガーのテンプレートを、クローニングのため
にｐＵＣ１９に制限部位を組み込むよう設計された外部
プライマーによって、３０サイクルにて増幅した。ＶＥ
ＧＦ ＺＦＰに対するクローンの正確さを、ＤＮＡ配列
決定によって確認した。この２つの構築物のそれぞれの
ＤＮＡ配列を、以下に列挙する。ＶＥＧＦ１：
【０２３４】
【化２】 ＶＥＧＦ１翻訳物：
【０２３５】
【化３】 ＶＥＧＦ３ａ：
【０２３６】
【化４】 ＶＥＧＦ３ａ翻訳物：
【０２３７】
【化５】 設計されたＺＦＰがそれらの標的部位に結合する能力
を、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質を発現および精
製し、そして電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳ
Ａ）を実施することによって確認した。ＺＦＰの発現
を、２つの異なる系において実行した。第１の系におい
て、ＤＮＡ結合ペプチドを、それらを市販のｐＥＴ１５
ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することにより、
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。このベクターは、組
換えタンパク質の発現を駆動するためのＴ７プロモータ
ー配列を含む。この構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１
／ＤＥ３（ｌａｑＩｑ）細胞に導入した。この細胞は、
ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ポリメラーゼを含む。培養物に５０
μＭ ＺｎＣｌ２を補充し、６００ｎｍのＯＤが０．５
〜０．６になるまで３７℃で培養し、そしてタンパク質
産生を、ＩＰＴＧを用いて２時間誘導した。ＺＦＰ発現
が、非常に高いレベル（総細胞タンパク質のおよそ３０
％）で見られた。これらのタンパク質を、「非融合」Ｚ
ＦＰと呼ぶ。
【０２３８】部分的に純粋な非融合ＺＦＰを、以下のよ
うに生成した（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：１０１−１０４
（１９９２）から適合させた）。凍結細胞ペレットを、
１／５０容量の１Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００μＭ ＺｎＣｌ２、５ｍ
Ｍ ＤＴＴに再懸濁した。このサンプルを、１０分間沸
騰させ、そして約３，０００×ｇにて１０分間遠心分離
した。この時点での上清中のＺＦＰタンパク質は、クマ
シーブルーを用いてＳＤＳポリアクリルアミドを染色す
ることにより概算すると、５０％を超える精製度であ
り、そして生成物は、１１ｋＤａあたりの推定分子量に
移動した。
【０２３９】ＺＦＰを生成する第２の方法は、それらを
Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との
融合物として発現させることであった。ＺＦＰとのＮ末
端ＭＢＰ融合物を、ｐＥＴ１５ｂクローンのＰＣＲ増幅
およびＴａｑプロモーターの制御下でのベクターｐＭａ
ｌ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
への挿入によって構築した。この融合物は、組換えタン
パク質の容易な精製および検出を可能にする。ジンクフ
ィンガーＤＮＡ結合タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉにおい
て可溶化形態で高レベルにこのベクターから発現され得
ること、および再フォールディングすることなく適切な
ＤＮＡ標的に効果的に結合し得ることが、これまでに報
告されている（Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ９４：５５２５−
５５３０（１９９７））。ＭＢＰ融合タンパク質の生成
は、製造元（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）によって記載されている通りであった。形質転換体
を、グルコースおよびアンピシリンを補充したＬＢ培地
で増殖させ、そしてＩＰＴＧを用いて３７℃にて３時間
誘導した。この細胞を、フレンチプレスによって溶解さ
せ、次いでＭＢＰ部分に特異的に結合する（従って、こ
のタンパク質に対するアフィニティー樹脂として作用す
る）アガロースベースのアミロース樹脂に曝した。ＭＢ
Ｐ融合タンパク質を、１０ｍＭマルトースを用いて溶出
し、５０％を超える精製度のＺＦＰを遊離させた。いく
つかの場合、このタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
３０フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてさら
に濃縮した。
【０２４０】部分的に精製した非融合ＺＦＰおよびＭＢ
Ｐ融合ＺＦＰを、ＥＭＳＡによって試験し、それらの標
的ＤＮＡ配列との結合を評価した。調製物中のタンパク
質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）
によって測定した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルが、
いずれの精製方法によっても５０％を超える均質性を示
したので、この算出におけるＺＦＰ精製度に対して調整
は行わなかった。さらに、この調製物中に有意な量の不
活性タンパク質が存在し得た。従って、以下のＥＭＳＡ
によって生じたデータは、タンパク質のそれらの標的に
対する真の親和性の過小評価（すなわち、Ｋｄの過大評
価）を示している。２つの別々の調製物を、それぞれの
タンパク質に対して作製し、ＺＦＰ活性における相違の
制御を手助けした。
【０２４１】ＥＭＳＡ実験のためのＶＥＧＦ ＤＮＡ標
的部位を、２９ｂｐの二重鎖オリゴヌクレオチド中に９
ｂｐの結合部位を組み込むことによって作製した。この
アッセイにおいて用いられる認識（「上方」）鎖の配列
およびそれらの相補鎖（「下方」）の配列を以下に示
す：
【０２４２】
【化６】 ＶＥＧＦ ＤＮＡ標的部位は、下線を引かれている。９
ｂｐの結合部位のそれぞれの端の３ｂｐもまた、実際の
ＶＥＧＦ ＤＮＡ配列に由来した。それぞれの標的部位
の上方の鎖を、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−
３２Ｐ ＡＴＰを用いて標識した。上方および下方の鎖
を、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび５０ｍＭ ＮａＣｌにて、各オリゴヌクレオチドを
含む反応においてアニールさせた。この混合物を９５℃
で５分間加熱し、そして６０分間にわたって３７℃まで
ゆっくり冷却した。二重鎖形成を、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって確認した。標的調製物中に残存す
る遊離の標識ＤＮＡおよびｓｓＤＮＡは、この結合反応
を妨害するようではなかった。
【０２４３】標的オリゴヌクレオチドへのＺＦＰの結合
を、固定量の二重鎖基質に対してタンパク質を滴定する
ことにより行った。２０マイクロリットルの結合反応物
は、１０フェムトモル（０．５ｎＭ）５’３２Ｐ標識二
本鎖標的ＤＮＡ、３５ｍＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、１０％グリセロール、２０μ
ｇ／ｍｌ ポリｄＩ−ｄＣ（必要に応じて）、２００μ
ｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、および２５μＭ Ｚｎ
Ｃｌ２を含んだ。タンパク質を、２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ
中に作製された連続希釈からの１／５容量として加え
た。結合を、室温にて３０分間進行させた。ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を、プレキャストされた１０％ま
たは１０〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａ
ｄ）および０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２を含む標準的なＴｒ
ｉｓ−グリシン泳動緩衝液を用いて実行した。
【０２４４】ＭＢＰ融合ＺＦＰを用いた代表的なＥＭＳ
Ａを実施した。この場合、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１タンパク
質の３倍連続希釈を用いた。シフトされた生成物をホス
ホールイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍ
ｉｃｓ）で定量し、そして相対的なシグナル（プラトー
値の％）対ｎＭタンパク質濃度のｌｏｇ１０をプロット
した。見かけのＫｄを、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１のその標的
部位への最大結合の半値を与えるタンパク質濃度を決定
することによって見出した。そしてこの実験においてこ
れは、およそ２ｎＭであった。
【０２４５】ＶＥＧＦタンパク質に対する決定された結
合親和性は、以下のように要約され得る。ＶＥＧＦ１
は、より強いＤＮＡ結合親和性を示した；複数のＥＭＳ
Ａ分析において、平均の見かけ上のＫｄを、ＶＥＧＦ部
位１に結合する場合、およそ１０ｎＭであると決定し
た。ＶＥＧＦ３ａは、その標的部位に十分結合したが、
ＶＥＧＦ１よりも高い見かけ上のＫｄを有した；ＶＥＧ
Ｆ３ａについての平均Ｋｄは、約２００ｎＭであった。
両方の場合において、このタンパク質のＭＢＰ融合バー
ジョンおよび非融合バージョンは、同様の親和性で結合
した。またＫｄを、野生型Ｚｉｆ２６８とＳＰ−１ Ｚ
ＦＰとのＭＢＰ融合物について、これらの条件下で決定
した（それぞれ、Ｋｄ６０ｎＭおよび６５ｎＭを生じ
た）。これらの結果は、およそ２〜３０ｎＭのＺｉｆ２
６８について文献において報告された結合定数と同様で
ある（例えば、Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ３３：５６８９−５６９５（１９９４）を参照
のこと）。従って、合成ＶＥＧＦ ＺＦＰについてのＫ
ｄは、これらの天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質に
ついて決定されたＫｄと非常に好都合に比較される。
【０２４６】要約すると、この実施例は、ＶＥＧＦ遺伝
子の転写開始付近の特定の標的に関する２つの新規のＤ
ＮＡ結合タンパク質の生成を示す。これらのタンパク質
は、天然に存在する転写因子のそれらの標的への結合の
親和性と同様の親和性で結合する。
【０２４７】（実施例２）９ｂｐ標的部位を認識するジ
ンクフィンガードメインが、細胞内で発現された場合に
必要な親和性または特異性を欠く場合、１８塩基対の標
的部位を認識するために、リンカー配列を用いて別々の
３−フィンガードメインを結び付け、６−フィンガード
メインを形成することによって、より大きなドメインを
構築し得る。このことは、ＺＦＰに融合された機能的ド
メイン（例えば、アクチベーターまたはリプレッサー）
が、特に少量のＺＦＰ融合タンパク質のみが生成される
ような条件下で、適切な配列を特異的に標的化すること
を保証するはずである。ＶＥＧＦにおける９ｂｐ標的部
位を、相互に隣接するよう選択し、その結果、ジンクフ
ィンガーが、１８ｂｐ配列を認識するよう連結し得た。
リンカーＤＧＧＧＳを、１つのヌクレオチドギャップに
よって分離された２つの９ｂｐ部位へのＺＦＰの結合を
可能にすることが理由で選択した。ＶＥＤＦ１およびＶ
ＥＧＦ３ａ部位についての場合も同様である（Ｌｉｕ
ら、ＰＮＡＳ ５５２５−５５３０（１９９７）もまた
参照のこと）。
【０２４８】６−フィンガーＶＥＧＦ３ａ／１タンパク
質をコードする配列を、以下のように生成した。ＶＥＧ
Ｆ３ａを、プライマーＳＰＥ７（
【０２４９】
【化７】 （配列番号１０））およびＳＰＥａｍｐ１２（
【０２５０】
【化８】 （配列番号１１））を用いてＰＣＲ増幅し、その末端に
ＥｃｏＲＩ制限部位およびＸｂａＩ制限部位を生成した
（制限部位に下線を引く）。ＶＥＧＦ１をプライマーＳ
ＰＥａｍｐ１３（
【０２５１】
【化９】 （配列番号１２））およびＳＰＥａｍｐ１１（
【０２５２】
【化１０】 （配列番号１３））を用いてＰＣＲ増幅し、その末端に
ＳｔｙＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成
した（制限部位に下線を引く）。合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて、以下の配列を、ＸｂａＩ部位とＳｔｙＩ部
位との間に連結した（ＸｂａＩ部位およびＳｔｙＩ部位
に下線を引く）：
【０２５３】
【化１１】 （配列番号１４）。これは、２つのＳＰ−１ドメイン間
にリンカー配列ＤＧＧＧＳを導入した。この連結産物を
プライマーＳＰＥ７およびＳＰＥａｍｐ１１を用いて再
増幅し、そしてＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部
位を用いてｐＵＣ１９中にクローン化した。次いでこの
連結ＺＦＰ配列を、以下のプライマーを用いて増幅し、
上述したように、改変されたｐＭＡＬ−ｃ２発現ベクタ
ー中に、クローニングのためのＫｐｎＩ部位およびＢａ
ｍＨＩ部位を導入した：（１）ＧＢ１９
【０２５４】
【化１２】 （配列番号１５） （２）ＧＢ１０
【０２５５】
【化１３】 （配列番号１６）。
【０２５６】ＫｐｎＩからＢａｍＨＩまでの設計された
６−フィンガーＺＦＰ ＶＥＧＦ３ａ／１のヌクレオチ
ド配列は、以下のようなものである：
【０２５７】
【化１４】 （配列番号１７）。
【０２５８】ＶＥＧＦ３ａ／１アミノ酸翻訳物は、以下
のようなものである（１文字コードを用いる）：
【０２５９】
【化１５】 （配列番号１８）。
【０２６０】１８ｂｐの結合タンパク質ＶＥＧＦ３ａ／
１を、ＭＢＰ融合物としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ
て、アフィニティークロマトグラフィーによって精製
し、そして実施例１に記載されるようなＥＭＳＡ実験に
おいて試験した。この標的オリゴヌクレオチドを、記載
されたように調製した。そしてこれは以下の相補配列を
含んだ： （１）ＪＶＦ９
【０２６１】
【化１６】 （配列番号１９）、および（２）ＪＶＦ１０
【０２６２】
【化１７】 （配列番号２０）。
【０２６３】ＥＭＳＡ研究のために、２０μｌの結合反
応物は、１０ｆｍｏｌ（０．５ｎＭ）の５’３２Ｐ−標
識された二重鎖の標的ＤＮＡ、３５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭ
ｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール、１０％のグル
コース、２０μｇ／ｍｌのポリｄＩ−ｄＣ、２００μｇ
／ｍｌのウシ血清アルブミン、および２５μＭのＺｎＣ
ｌ２を含んだ。タンパク質を、３倍に希釈したシリーズ
から１／５体積として添加した。結合を、室温または３
７℃のいずれかで６０分間進行させた。ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を、成形済みの１０％または１０〜２
０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）および標
準的Ｔｒｉｓ−グリシン泳動用緩衝液を使用して、室温
または３７℃で実行した。この室温アッセイは、約１．
５ｎＭのＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質についての見かけ
のＫｄを得た。従って、この１８−ｂｐの結合ＺＦＰ
は、その標的部位に高い親和性で結合した。平行する実
験において、ＶＥＧＦ１タンパク質を、その標的に対し
て実施例１に記載されたオリゴヌクレオチドを使用して
試験し、約２．５ｎＭの見かけのＫｄを得た。結合およ
び電気泳動が３７℃で実施された場合、１８−ｂｐの標
的に対して試験された場合には、その標的に対して試験
されたＶＥＧＦ１についての４０ｎＭのＫｄと比較し
て、ＶＥＧＦ３ａ／１の見かけのＫｄは、約９ｎＭであ
った。これは、結合の親和性における差異が、より高い
温度で強調されることを示す。
【０２６４】見かけのＫｄは、そのＤＮＡ標的に対する
タンパク質の親和性の有用な尺度である。しかし、イン
ビトロまたはインビボのいずれかのＤＮＡ結合部位につ
いて、その占有率は、ＤＮＡ結合タンパク質の乖離率
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）によって大部分、決定される。こ
のパラメーターを、競合実験によって測定し得る。ＥＭ
ＳＡのための条件は、上記のとおりである；結合および
電気泳動を、３７℃で実施した。これらのデータは、タ
ンパク質−ＤＮＡ複合体の半減期が、ＶＥＧＦ１に関し
てより、ＶＥＧＦ３ａ／１に関して、１０倍より長いこ
とを示す。従って、これらのインビボ条件下では、標的
部位の占有率は、９−ｂｐのタンパク質に関してより、
１８−ｂｐのタンパク質に関して、より高い。
【０２６５】（実施例３：）この実施例は、哺乳動物細
胞内でＺＦＰを産生するための発現ベクターの構築、発
現ベクターの核への転移、およびＺＦＰによって標的Ｄ
ＮＡに局在化される機能的ドメインの提供を記載する。
採用された機能的ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ−Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄ Ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）抑制ドメインおよ
び単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）ＶＰ１６活性化ド
メインである。
【０２６６】特定のＤＮＡ結合タンパク質は、転写リプ
レッサーとして機能する分離可能なドメインを含む。約
２０％のＺＦＰは、転写リプレッサーとして機能する約
９０アミノ酸の非ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｔｈｉｅ
ｓｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：３
６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮ
ＡＳ ９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎ
ｇｕｅら、（１９９４）、上記；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、
（１９９４）、上記）。ＫＲＡＢドメインと命名された
このドメインは、モジュラーであり、そして他のＤＮＡ
結合タンパク質に連結されて、標的のＤＮＡ配列を有す
る遺伝子の発現をブロックし得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎ
ら、（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、（１９９４）；Ｗ
ｉｔｚｇａｌｌら、（１９９４）、上記）。このＫＲＡ
Ｂドメインは、それ自体では効果を有さない；リプレッ
サーとして機能するためには、ＤＮＡ結合ドメインを通
じて、ＤＮＡ配列に連結されることが必要である。この
ＫＲＡＢドメインは、転写の開始をブロックすることが
示されており、そして転写開始部位から少なくとも３ｋ
ｂまで上流の距離で機能し得る。ヒトＫＯＸ−１タンパ
ク質由来のＫＲＡＢドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｔｈｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ２：３６３−３７（１
９９０）を、本明細書に記載される研究のために使用し
た。この６４アミノ酸のドメインは、ＺＦＰに融合され
得、細胞培養物において抑制を与えることが示された
（Ｌｉｕら、上記）。
【０２６７】ＨＳＶ−１のＶＰ１６タンパク質は、広く
研究されており、そしてＣ末端の７８アミノ酸が、ＤＮ
Ａ結合ドメインと融合した場合、トランス活性化ドメイ
ンとして働き得ることが示された（Ｈａｇｍａｎｎら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：５９５２−５９６２（１
９９７））。ＶＰ１６はまた、離れて、そして方向非依
存的な様式で機能することが示された。これらの研究の
ために、ＶＰ１６タンパク質配列のアミノ酸４１３〜４
９０を使用した。このドメインをコードするＤＮＡを、
以下の配列を有するプライマーを使用して、プラスミド
ｐＭＳＶＰ１６Ｃ＋１１９からＰＣＲ増幅した： （１）ＪＶＦ２４
【０２６８】
【化１８】 （配列番号２１）；および（２）ＪＶＦ２５
【０２６９】
【化１９】 （配列番号２２）下流のプライマー、ＪＶＦ２５を、下
流のＦＬＡＧエピトープをコードする配列を含むように
設計した。
【０２７０】３つの発現ベクターを、これらの研究のた
めに構築した。これらのベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１
（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来であり、そしてサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に
ＺＦＰ構築物を配する。このベクターは、それぞれ細菌
および哺乳動物細胞培養物での選択のためのアンピシリ
ンマーカーおよびネオマイシンマーカーを有する。適切
な転写開始のためのＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０
（１９９１））を、取り込んだ。この産物の核への局在
を達成するために、ＳＶ４０大（ｌａｒｇｅ）Ｔ抗原由
来の核局在配列（ＮＬＳ）（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ、配列番号４０）（Ｋ
ａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ ３９：４９９−５０９
（１９８４）を付加した。ＺＦＰコード配列のためのこ
の挿入部位には、機能的ドメイン配列が続く。このベク
ターの３つの変形型は、その機能的ドメインにおいて異
なる；「ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ」は、ＫＲＡＢ抑制ドメイ
ン配列を有し、「ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ」は、ＶＰ１６活
性化ドメインを有し、そして「ＮＦ−コントロール」
は、機能的ドメインを有さない。以下の機能的ドメイン
は、ＺＦＰの特異的な検出を可能にするためのＦＬＡＧ
エピトープ配列（Ｋｏｄａｋ）である。
【０２７１】これらのベクターを、以下のように構築し
た。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＢは、プラスミドｐｃＤ
ＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ、ＣＡ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで
切断し、付着末端をクレノウによって埋め、再連結させ
ることによって構築した。このことにより、ポリリンカ
ー中のＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位
を除外した。このベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログに記載される。プラス
ミドｐｃＤＮＡ−ＮＫＦを、ｐｃＤＮＡ−ＨＢのＥｃｏ
ＲＩ／ＸｈｏＩ部位中にフラグメントを挿入することに
よって生成した。ｐｃＤＮＡ−ＨＢは、以下を含む：
１）開始コドンおよびＳＶ４０ＮＬＳ配列を含むＫｏｚ
ａｋ配列を含む、全体でＤＮＡ配列
【０２７２】
【化２０】 （配列番号２３）を構成するＥｃｏＲＩ〜ＫｐｎＩ断
片、ここでＥｃｏＲＩ部位およびＫｐｎＩ部位を下線で
示す；ならびに２）ＢａｍＨＩ部位、ＫＯＸ−１由来の
ＫＲＡＢ−Ａボックス（上記のＴｈｉｅｓｅｎ、１９９
０におけるアミノ酸１１〜５３に相当する）、ＦＬＡＧ
エピトープ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩカタログから）、およ
びＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、全体で配列
【０２７３】
【化２１】 （配列番号２４）を構成するＫｐｎＩからＸｈｏＩの断
片、ここでＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位
を、下線で示す。
【０２７４】ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクター
プラスミドを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐ
ｃＤＮＡ−ＮＫＦ中に、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−Ｂ
ａｍＨＩカセットを挿入することによって生成した。Ｖ
ＥＧＦ１−ＫＲＡＢおよびＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢエフ
ェクタープラスミドを、同様の方法で構築した（プラス
ミドｐＬｉｔｍｕｓ ２８（ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）の場合に、ＺＦＰ配列を最初にＮＬＳ
−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧ配列中にクローン化し、そしてＢ
ｇｌＩＩ−ＸｈｏＩカセットとしてｐｃＤＮＡ３．１
（＋）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に続いて移動させる
ことを除く）。ここで、このＢｇｌＩＩ部位を、Ｅｃｏ
ＲＩ部位の直ぐ上流に設置した（これらのベクターの発
現については、実施例４を参照のこと）。
【０２７５】実施例５に使用したエフェクタープラスミ
ドを、以下のように構築した。プラスミドｐｃＤＮＡ−
ＮＶＦを、上記のように、ＶＰ１６トランス活性化ドメ
インをＰＣＲ増幅し、そしてこの産物をｐｃＤＮＡ−Ｎ
ＫＦのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＫＲ
ＡＢ配列を置換することによって構築した。ＢａｍＨＩ
からＨｉｎｄＩＩＩのこの挿入フラグメントの配列は：
【０２７６】
【化２２】 （配列番号２５）であった。
【０２７７】ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３ａ
／１−ＶＰ１６ベクターを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ
で切断したｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ中に、ＺＦＰ配列を含む
ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットを挿入することによって
構築した。
【０２７８】実施例６に使用したエフェクタープラスミ
ドを、以下のように構築した。プラスミドＮＦ−コント
ロールを、ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ
部位中に配列
【０２７９】
【化２３】 （配列番号２６）を挿入することによって生成し、それ
によってＮＬＡ−ＦＬＡＧのみでＮＬＳ−ＫＲＡＢ−Ｆ
ＬＡＧ配列を置換した。
【０２８０】ＶＥＧＦ１−ＮＦおよびＶＥＧＦ３ａ／１
−ＮＦは、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセ
ットを、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで切断したＮＦ−コ
ントロール中に挿入することによって構築した。ＣＣＲ
５−ＫＲＡＢを、ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢベクターと同じ方
法によって構築した（ＺＦＰ配列が、ＶＥＧＦ標的に関
連しないＤＮＡ標的部位に対して特異的であるように設
計された点を除く）。
【０２８１】最後に、ＫＲＡＢ発現プラスミドおよびＶ
Ｐ１６発現プラスミドの両方のコントロールの変形型
を、構築した。プラスミドＮＫＦ−コントロールを、ジ
ンクフィンガータンパク質配列なしのＮＬＳ−ＫＲＡＢ
−ＦＬＡＧを発現するように設計した；プラスミドＮＶ
Ｆ−コントロールを、ＺＦＰ配列なしのＮＬＳ−ＶＰ１
６−ＦＬＡＧを発現するように設計した。これらのプラ
スミドは、適切なリーディングフレーム中に下流のドメ
インを設置するために、ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦおよびｐｃ
ＤＮＡ−ＮＶＦをそれぞれ、ＢａｍＨＩで切断し、クレ
ノウで末端を埋め、そして再連結することによって作製
した。これらのプラスミドは、細胞培養物研究のための
厳密なコントロールとして働く。
【０２８２】ＺＦＰを操作したＶＥＧＦの哺乳動物細胞
の発現および核への局在を、免疫蛍光研究で実証した。
２９３（ヒト胚性腎臓）細胞を、ＮＬＳ−ＶＥＧＦ１−
ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧキメラをコードする発現プラスミド
でトランスフェクトした。リポフェクトアミン（ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を、以下に記載のように使用し
た。２４〜４８時間後、細胞を固定し、そしてＦＬＡＧ
エピトープに対する一次抗体に曝露した。Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄで標識した二次抗体を用い、そしてこれらの細胞
を、ＤＡＰＩで対比染色した。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ染色
は、ＤＡＰＩ染色と一致して共局在することが観察され
た。これは、このプラスミドから発現されるＺＦＰが核
に局在したことを示す。
【０２８３】（実施例４：）この実施例は、細胞内での
ＺＦＰ抑制タンパク質の活性を測定するための一過性の
共トランスフェクションの使用を実証する。このような
実験は、ＶＥＧＦ標的部位を有するレポータープラスミ
ドを伴う、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ発現（「エフェクター」）
プラスミドの共トランスフェクションを含む。効力を、
空のベクターコントロールと比較した、エフェクタープ
ラスミドの存在下でのレポーター遺伝子の発現の抑制に
よって、評価した。
【０２８４】このレポータープラスミドシステムは、ｐ
ＧＬ３ホタルルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）に基づいた。ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを、
ｐＶＦＲ１−４ｘを創出するために、プラスミドｐＧＬ
３−コントロール中の、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を
駆動するＳＶ４０プロモーターの上流に挿入した。この
プラスミドは、ＳＶ４０エンハンサーを含み、そして多
くの細胞型においてホタルルシフェラーゼを高レベルで
発現する。挿入を、実施例２に記載された２つの相補的
な４２−ｂｐのオリゴヌクレオチド、ＪＶＦ９およびＪ
ＶＦ１０の縦列コピーを共に連結させることによって作
製した。アダプター配列を連結し、そしてこの組立を、
ｐＧＬ３−コントロールのＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ部位中
に挿入した。これは、これらの部位間の以下の配列の挿
入を生じた：
【０２８５】
【化２４】 （配列番号２７）示された最初の６ヌクレオチドおよび
最後の６ヌクレオチドは、ＭｌｕＩ部位およびＢｇｌＩ
Ｉ部位であり；小文字はＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す。Ｖ
ＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａの結合部位を、下線で示
す。
【０２８６】エフェクタープラスミド構築物を、上に記
した。ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ、ＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ
およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ発現ベクターを、Ｃ
ＭＶプロモーターの制御下にあるＳＶ４０核局在配列、
ＶＥＧＦ ＺＦＰ、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、およびＦＬ
ＡＧエピトープマーカー全ての融合を生成するように設
計した。空のｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを、コント
ロール（ｐｃＤＮＡ）として使用した。
【０２８７】全てのベクターを、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ
精製キットを使用して、調製した。約４０，０００細胞
を、２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、１０％のウ
シ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−Ｍ
ＥＭ）培地中で、５％のＣＯ ２と共に３７℃で一晩増殖
させた。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして血清なしのＤ
−ＭＥＭの２００μｌを被せた。プラスミドを、リポフ
ェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して導入し
た。各ウェルを、６μｌのリポフェクトアミンと２５μ
ｌのＤ−ＭＥＭで３０分間３７℃で複合化した約０．３
μｇのエフェクタープラスミド、０．３μｇのレポータ
ープラスミド、および０．０１μｇのプラスミドｐＲＬ
−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、トランスフェクトし
た。トランスフェクションを、３連で行った。３時間
後、１０％の血清を含む１ｍｌの培地を、各ウェルに添
加した。細胞を、トランスフェクション後４０〜４８時
間で回収した。ルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕａｌ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を使用して行った。トランスフェクトされた第三の
プラスミド、ｐＲＬ−ＳＶ４０は、Ｒｅｎｉｌｌａルシ
フェラーゼ遺伝子を有し、そしてトランスフェクション
効率についての基準として共トランスフェクトした。
【０２８８】コントロールレポータープラスミドｐＧＬ
３−コントロール（ｐＧＬ３−Ｃ）に関して、ＺＦＰ−
ＫＲＡＢ発現プラスミドの存在または不在は、ルシフェ
ラーゼ発現レベルに影響しない。しかし、ｐＶＦＲ１−
４ｘ、ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを含むレポータ
ーに関しては、ＶＥＧＦ１（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）ま
たはＶＥＧＦ３ａ／１（１８−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現
プラスミドの存在が、空のｐｃＤＮＡベクターコントロ
ールに対して、２〜３倍ルシフェラーゼの発現を減少さ
せる。このＶＥＧＦ３ａ（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現
プラスミドは、ほとんど影響を示さないかまたは影響を
示さないようである。これらの実験は明らかに、設計さ
れたＺＦＰが、その標的部位が存在する場合、細胞内で
機能して遺伝子の転写を抑制し得ることを実証する。さ
らに、親和性の特定のレベルが、機能のために必要であ
るように思われる；すなわち、１０ｎＭ以下のＫｄを有
するＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１は機能的である
が、一方２００ｎＭのＫｄを有するＶＥＧＦ３ａは機能
的でない。
【０２８９】第二のレポータープラスミド、ｐＶＦＲ２
−４ｘを、ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーをＨｉｎｄ
ＩＩＩを使用して取り除き、そしてそれをｐＧＬ３−コ
ントロールのＨｉｎｄＩＩＩ部位中に（順方向に）挿入
することによって構築した。これは、ＳＶ４０プロモー
ターについての転写の開始部位とルシフェラーゼ遺伝子
の翻訳開始コドンとの間の標的部位に位置する。記載さ
れたものに類似の共トランスフェクション実験におい
て、ｐｃＤＮＡコントロールと比較して、ルシフェラー
ゼシグナルの約３〜４倍の抑制が、ＶＥＧＦ１−ＫＲＡ
ＢリプレッサーまたはＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢリプ
レッサーで観察された。これは、このリプレッサーが、
転写の開始の上流または下流のいずれかに結合した場合
に、活性であることを示す。
【０２９０】（実施例５：）この実施例は、細胞におけ
るＺＦＰ転写活性化因子の活性を測定するための一過性
の共トランスフェクション研究の使用を実証する。実験
的な設定は、異なったトランスフェクション方法、異な
った細胞株、ならびに異なったレポーターおよびエフェ
クタープラスミドの組を使用した点を除いて、実施例４
のものと類似である。
【０２９１】活性化実験に関して、レポーターは、構築
された標識化されたｐＶＦＲ３−４ｘであった。このレ
ポーターは、プラスミドｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）のＭｕｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位で、上に示し
た配列と共にＶＥＧＦ標的の４つのコピーを含む。この
ベクターは、ＳＶ４０のエンハンサー配列について欠失
されており、従ってより低い基準レベルのホタルルシフ
ェラーゼ発現を有する。ｐＶＦＲ３−４ｘは、ｐＶＦＲ
１−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントを、ｐＧＬ
３−プロモーターのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ部位中に交換す
ることによって構築した。
【０２９２】このエフェクタープラスミド構築物は、上
に記載した。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６、ＶＥＧＦ３ａ−Ｖ
Ｐ１６およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６発現ベクター
を、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＳＶ４０核局在
配列、ＶＥＧＦ ＺＦＰ、ＶＰ１６トランス活性化ドメ
インおよびＦＬＡＧエピトープタグ全ての融合を生成す
るように設計した。空のｐｃＤＮＡ３発現ベクターを、
コントロールとして使用した。
【０２９３】全てのベクターを、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ
精製キットを使用して調製した。約４０，０００個の細
胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに撒き、そして１
０％のウシ胎仔血清を含むＤ−ＭＥＭ培地中で、５％の
ＣＯ２と共に３７℃で一晩増殖させた。細胞を、血清な
しのＤ−ＭＥＭ培地で洗浄し、血清なしのＤ−ＭＥＭ培
地の２００μｌを被せた。プラスミドを、製造業者の取
扱説明書に従って、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョンキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して導入し
た。各ウェル中の細胞を、１．５μｇのレポータープラ
スミド、１．５μｇのエフェクタープラスミド、および
０．５μｇのアクチン／β−ｇａｌプラスミドでトラン
スフェクトした。プラスミドを、１５μｌのＣａＣｌ２
と合わせ、ｄＨ２Ｏで１００μｌにした。１００μｌの
ＨＥＰＥＳ溶液を、ボルテックスで混合しながら滴下し
て添加した。この混合物を、室温で３０分間インキュベ
ートした。次いで、リン酸カルシウム処理したＤＮＡの
２００μｌを、各ウェル中の培地に添加した。トランス
フェクションを３連で行った。５時間後、この培地を除
去し、１０％の血清を含む１ｍｌの培地を添加した。細
胞を、トランスフェクション後４０〜４８時間で回収し
た。ルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して行った。ト
ランスフェクトされた第三のプラスミド、アクチンβ−
ｇａｌは、アクチンプロモーターの制御下にあるβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を有し、トランスフェクション効
率についての基準として共トランスフェクトした。この
β−ガラクトシダーゼアッセイをまた、製造業者のプロ
トコル（Ｔｒｏｐｉｘ）に従って行った。
【０２９４】コントロールレポータープラスミド、ｐＧ
Ｌ３−プロモーター（ｐＧＬ３−Ｐ）に関して、ＺＦＰ
−ＶＰ１６発現プラスミドの存在または不在は、ルシフ
ェラーゼ発現レベルに有意に影響しない。ＶＥＧＦ標的
部位の４つのコピーを含むレポーター、ｐＶＦＲ３−４
ｘに関しては、ＶＥＧＦ１（９−ｂｐ−結合ＺＦＰ）の
存在が、空のｐｃＤＮＡベクターコントロールと比較し
て非常に僅かな活性化を示す。ＶＥＧＦ３ａ／１（１８
−ｂｐ−結合ＺＦＰ）発現プラスミドは、ルシフェラー
ゼ発現をまさに実質的に活性化し、ｐｃＤＮＡと比較し
て約１４倍の増大を示す。これらの実験は明らかに、設
計されたＺＦＰが、ＶＰ１６の活性化ドメインと融合し
た場合、その標的部位が存在する場合に、細胞において
機能して遺伝子の転写を活性化し得ることを実証する。
さらに、これらの結果は明らかに、このアッセイにおい
て、１８−ｂｐの結合タンパク質、ＶＥＧＦ３ａ／１
が、９−ｂｐの結合ＶＥＧＦ１タンパク質よりも、かな
りよい活性化因子であることを実証する。これは、親和
性の改善またはＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質の乖離率の
減少の結果であり得る。
【０２９５】第四のＶＥＧＦレポータープラスミドを、
プラスミドｐＶＦＲ４−４ｘを創出するためにｐＶＦＲ
２−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントをｐＧ３−
プロモーター中にクローニングすることによって構築し
た。活性化は、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３
ａ／１−ＶＰ１６融合物を発現するエフェクタープラス
ミドと組み合わせてこのレポーターを使用した共トラン
スフェクションにおいて観察された。これは、これらの
人工のトランス活性化因子が、転写開始の上流または下
流のいずれかに結合した場合、機能的であることを示
す。
【０２９６】これらの共トランスフェクションデータ
は、ＺＦＰがレポーター遺伝子の発現を調節するために
使用され得ることを実証する。このような実験は、内因
性分子の標的の発現の調節因子としてのさらなる使用の
ために、ＺＦＰを同定するための有用なツールとして働
き得る。
【０２９７】（実施例６：）この実施例は、設計された
ＺＦＰが、通常のゲノム状態およびクロマチン状態であ
る内因性の細胞の遺伝子の発現を抑制し得ることを実証
する。詳細には、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合したＶＥ
ＧＦ ＺＦＰを発現するエフェクタープラスミドを、細
胞中に導入し、これがＶＥＧＦ遺伝子をダウンレギュレ
ートすることを示した。
【０２９８】真核生物の発現ベクターを、実施例３で上
に記したように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１
ＺＦＰを、ＳＶ４０ ＮＬＳおよびＫＲＡＢに融合する
ように構築した。トランスフェクションを、ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬから市販されるリポソーム調製物のリポフェク
トアミンを使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡ
を、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製システムを使
用して調製した。総体積１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ中で、１０μｌのエフェクタープラスミドを、１００
μｇのリポフェクトアミン（５０μｌ）と混合した。ｐ
ＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）をま
た、トランスフェクション効率についての内部コントロ
ールとして、このＤＮＡ混合物中に含んだ。３０分間の
インキュベーション後に、６．４ｍｌのＤＭＥＭを添加
し、そしてこの混合物を３×１０６個の２９３細胞上に
重ねた。５時間後、このＤＮＡ−リポフェクトアミン混
合物を除去し、そして１０％のウシ胎仔血清を含む新鮮
な培養培地を、これらの細胞上に重ねた。
【０２９９】トランスフェクション後１８時間で、これ
らの２９３細胞を、１００μＭのＤＦＸ（デスフェリオ
キサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ））での処
理によって誘導し、ＶＥＧＦ遺伝子の迅速かつ持続する
転写活性化を生じ、かつまたＶＥＧＦ ｍＲＮＡの安定
性における段階的な増大を生じた（Ｉｋｅｄａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９７６１−１９７６６
（１９９５））。慣用的な培養条件下で、２９３細胞
は、培養培地中に低レベルのＶＨＧＦを分泌する。これ
らの細胞を、ＥＬＩＳＡアッセイによるＶＥＧＦレベル
の決定のために上清を収集する前に、さらに２４時間イ
ンキュベートさせた。
【０３００】類似のレベルの抑制が実証された平行する
実験において、細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌ
ｌｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎ
ｅＳｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を使用してモニターした。１８時間のＤｆｘ処理
後、元の２ｍｌの培地のうち５００μｌを除去し、上記
のようにＶＥＧＦ発現について分析した。細胞の生存率
を評価するために、３００μｌのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｅ
ｌｌｔｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏ
ｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを、残りの
１．５ｍｌに添加した。次いで、これらの細胞を３７℃
で約２時間インキュベートした。各ウェルからの１００
μｌを、９６ウェルプレートに移し、そしてＯＤ ４９
０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレート読み取り機上で読み取っ
た。空のベクターコントロールでトランスフェクトされ
た細胞と比較して、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ構築物
を発現する細胞の生存率における有意な減少は存在しな
かった。これは、観察されたＶＥＧＦ抑制が、一般化し
た細胞死に起因しないことを示す。
【０３０１】ＶＥＧＦ発現の４０〜５０倍の減少を、Ｖ
ＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ（１８ｂｐの結合ＶＥＧＦ高
親和性ＺＦＰをコードする発現するベクター）でトラン
スフェクトされたＤＦＸ処理細胞において示した。細胞
をＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ（９ｂｐの結合ＶＥＧＦ高親和
性ＺＦＰをコードする発現するベクター）でトランスフ
ェクトした場合に、発現の２倍の減少を観察した。ＶＥ
ＧＦ発現の有意な減少は、非ＶＥＧＦ ＺＦＰ（ＣＣＲ
５−ＫＲＡＢ）またはＮＫＦコントロールでトランスフ
ェクトした細胞において観察されなかった。同様の結果
を、３つの独立したトランスフェクション実験において
得た。
【０３０２】別途の実験において、以下の結果を得た
（データは示さない）。ＶＥＧＦ１−ＮＦ（機能的なド
メインなしに９ｂｐの結合ＶＥＧＦ１ ＺＦＰを発現す
るする）は、ＶＥＧＦ遺伝子発現するに効果を示さなか
った。ＶＥＧＦ発現するにおける有意な減少を、ＶＥＧ
Ｆ３ａ／１−ＮＦ（機能的なドメインなしに１８ｂｐの
結合タンパク質を発現するする）で観察した。この結果
は、転写の開始部位への結合が、抑制ドメインなしでさ
え、転写を妨げることを示唆する。ＫＲＡＢドメインに
融合された場合でさえ、ＶＥＧＦ３ａ ＺＦＰは、発現
レベル（プラスミドＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ）に影響を
及ぼし得ない。しかし、ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ
１（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）は、発現における劇的な減
少を生じる。ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ３ａ／１
（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）は、全体的にＶＥＧＦ
の発現を妨げる。
【０３０３】これらのデータは、設計されたＺＦＰが、
染色体上のその標的部位へ位置し得、そして結合し得、
そして内因性の細胞標的遺伝子発現を防ぎ得ことを示
す。特に、結果は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦ
Ｐ（例えば、ＶＥＧＦ１が約１０ｎＭの平均的な見かけ
のＫｄを有する）が発現における劇的な減少を提供する
ことを示す。さらに、データは、ＫＲＡＢ機能性ドメイ
ンが遺伝子サイレンシングを高めることを示す。この発
現におけるリプレッサーの誘導は、ＶＥＧＦのインデュ
ーサー（ＤＦＸ）が添加される前に起こるため、このデ
ータは、設計されたリプレッサーがすでに休止の遺伝子
の活性化を妨げる能力を示す。さらに、これらの結果
は、転写開始部位と重なる標的を結合する場合、その標
的に対するナノモルの親和性でシックスフィンガー（ｓ
ｉｘ−ｆｉｎｇｅｒ）の操作したＺＦＰ（ＶＥＧＦ３ａ
／１）がＶＥＧＦ遺伝子の低酸素性応答を阻害し得るこ
とを示す。
【０３０４】（実施例７：）本実施例は、設計したＺＦ
Ｐが正常なゲノムおよびクロマチン内容物にある内因性
の細胞性遺伝子の発現を活性化し得ることを示す。特
に、ＶＰ１６活性化ドメインに融合されたＶＥＧＦ Ｚ
ＦＰを発現するエフェクタープラスミドを、細胞に導入
し、そしてＶＥＧＦ遺伝子を上方制御することを示し
た。
【０３０５】真核生物発現ベクターを、実施例３に記載
されるように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１ Ｚ
ＦＰをＳＶ４０ ＮＬＳおよびＶＰ１６に融合させて構
築した。トランスフェクションをリポフェクトアミン
（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されるリポソーム調製
物）を使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑ
ｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製システムを使用して
調製した。１０μｇのエフェクタープラスミド（操作し
たＺＦＰを含む）を、１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ
の総容積中１００μｇのリポフェクトアミン（５０μ
ｌ）と共に混合した。ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド
（Ｐｒｏｍｅｇａ）をまた、トランスフェクション効率
に関する内部コントロールとして、ＤＮＡ混合物中に含
有した。インキュベート３０分後、６．４ｍｌのＤＭＥ
Ｍを添加し、そして混合物を３×１０６の２９３細胞上
に積層した。５時間後、ＤＮＡ−リポフェクトアミン混
合物を除去して、そして１０％のウシ胎仔血清を含有す
る新鮮な培養培地を細胞上に積層した。１日後、新鮮な
培地を添加して、そして市販されるＥＬＩＳＡキット
（Ｒａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＶＥＧＦ
レベルの測定のために、上澄みを２４時間後に収集し
た。
【０３０６】スリーフィンガーのＶＥＧＦ１−特異的Ｚ
ＦＰ（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）について、コントロール
プラスミド（ＮＶＦ−コントロール）および擬トランス
フェクトした細胞と比較した場合に、ＶＥＧＦ発現の７
〜１０倍の増加が観察された。同様の結果を、５つの独
立した実験において観察している。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１
６トランスフェクト細胞におけるＶＥＧＦ分泌のレベル
がＤＦＸで処理されている細胞におけるレベルと等価で
あるかまたは、それより大きいことを示すことが重要で
ある。ＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６の導入は、より緩や
かな導入を刺激した。この結果は、実施例６における知
見と矛盾しない。この知見において、機能的なドメイン
なしでの１８ｂｐの結合タンパク質の発現は一定の程度
まで活性化を妨げた。この結果は、転写の開始部位への
このタンパク質の密接な結合が活性化を妨げることを示
唆した。
【０３０７】これらのデータは、設計したＺＦＰが、染
色体上の標的部位に位置し得、そしてこの部位に結合し
得、転写活性化ドメインを提示し得、そして劇的に内因
性遺伝子の発現レベルを高め得ること示す。特に、この
結果は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦＰ（例え
ば、ＶＥＧＦ１が約１０ｎＭの平均的な見かけのＫｄを
有する）が、発現における劇的な増加を提供することを
示す。
【０３０８】（実施例８：）さらに実施例６および７に
おける結果を実体化するため、リボヌクレオチド保護ア
ッセイ（ＲＰＡ）を実施して、増加したレベルのＶＥＧ
Ｆタンパク質とＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルにおける増加
とを相関させ（実施例７）、そして減少したレベルのＶ
ＥＧＦタンパク質とＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルの減少と
を相関させた（実施例６）。
【０３０９】ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした細胞から
単離した。放射標識された複数のテンプレートプローブ
（ＶＥＧＦ特異的プローブを含む）を、インビトロの転
写によって調製し、そして５６℃で一晩、実験細胞およ
びコントロールトランスフェクトした細胞由来の５μｇ
の各ＲＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー
ション混合物を、ＲＮａｓｅで処理し、そして保護され
たプローブを精製し、そして５％の変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、そして放射能をオートラジオ
グラフィによって評価した。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６でト
ランスフェクトした２９３細胞は、ＮＶＦ−コントロー
ルでトランスフェクトした細胞と比較した場合、ＶＥＧ
Ｆ ｍＲＮＡのレベルにおける２〜４倍の増加を有した
（実験の詳細については実施例７を参照のこと）。保護
されたプローブのサイズは、ＲＮＡの完全性のためのコ
ントロールトランスフェクトして提供したコントロール
ヒトＲＮＡから生成されるプローブのサイズと同一であ
った。
【０３１０】別途の実験において、ＶＥＧＦ特異的ｍＲ
ＮＡのレベルをまた、ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢエフェクター
プラスミドでトランスフェクトされている細胞において
定量した（実験の詳細については実施例６を参照のこ
と）。トランスフェクションの詳細を実施例６に記載す
る。細胞をＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクタープ
ラスミドでトランスフェクトした場合、ＶＥＧＦ ｍＲ
ＮＡのレベルの劇的な減少を観察した。細胞をＮＫＦ−
コントロールまたは非ＶＥＧＦ特異的ＺＦＰ（異なるＣ
ＣＲ５標的部位を認識する、ＣＣＲ５−５−ＫＲＡＢお
よびＣＣＲ５−３−ＫＲＡＢ）でトランスフェクトした
場合、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにおける有意な減少を観察し
なかった。
【０３１１】この実験は、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６キメラ
転写因子でのトランスフェクションの際に観察されるＶ
ＥＧＦタンパク質の増加は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベ
ルの増加によって媒介されることを示す。同様に、ＶＥ
ＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢキメラ転写因子でのトランスフ
ェクションの際に観察されるＶＥＧＦタンパク質の減少
は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルの減少によって媒介さ
れることを示す。
【０３１２】（実施例９：ＶＥＧＦ２媒介マイトジェン
シグナルのインヒビターの同定） （工程１：細胞株の産生）ＶＥＧＦ−Ｒ２を過剰発現
し、そしてＶＥＧＦ−Ｒ１を発現しないＥＣＶ３０４由
来細胞株を以下のように産生する。ＶＥＧＦ−Ｒ１に対
して設計したＺＦＰリプレッサーを上記のように産生し
た。ＶＥＧＦ−Ｒ２を高めるように設計したＺＦＰアク
チベーターをまた、上記のように産生した。ＥＣＶ３０
４細胞を、２つのＺＦＰ構築物で同時トランスフェクト
する；クローンを薬物選択に続いてＦＡＣＳ分析（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＦＶＥ０）のために選んだ。Ｆ
ＡＣＳ分析を介してＶＥＧＦ−Ｒ１の欠失および膜表面
上でのＶＥＧＦ−Ｒ２の増加を示すクローンを増殖さ
せ、そして細胞株に高スループット（ＨＴＰ）スクリー
ニングを実行する。細胞株を、ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２
＋＋と再命名する。
【０３１３】ＶＥＧＦ−Ｒ１を本質的に抑制し、そして
条件付でＶＥＧＦ−Ｒ２を産生するコントロール細胞株
を以下のように産生する。ＶＥＧＦ−Ｒ２に対して設計
したＺＦＰリプレッサーを、Ｔ−Ｒｅｘ（登録商標）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへクローニングす
る。これおよびＶＥＧＦ−Ｒ１ ＺＦＰリプレッサー
を、ＥＣＶ３０４細胞中へと同時トランスフェクトす
る。再度、安定なクローンを選択し、ＶＥＧＦ−Ｒ１の
欠失およびＶＥＧＦ−Ｒ２の存在についてＦＡＣＳ分析
を介して分析する。次いで、細胞をドキシサイクリンで
処理し、そして、ＶＥＧＦ−Ｒ２の欠失についてＦＡＣ
Ｓ分析を介して試験する。ＶＥＧＦ−Ｒ１を発現せず、
そしてドキシサイクリン処理後にＶＥＧＦ−Ｒ２の欠失
を示す細胞株に、ＨＴＰスクリーニングを繰り返す。こ
の細胞株を、ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２ｉｎｄと再命名す
る。
【０３１４】２．ＶＥＧＦ−Ｒ１−／Ｒ２＋＋を用いて
開始し、９６ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり
１０，０００細胞をプレートする。アッセイの最終容量
が１００μｌであるので、細胞を５０μｌの培地中にプ
レートする。
【０３１５】３．化合物ライブラリー由来の試験化合物
を、３０ｎＭの最終濃度まで（２５μｌ）添加し、そし
てプレートを１時間インキュベートする。２５μｌの培
地を１ウェルに対して化合物なしで添加して、＋ＶＥＧ
Ｆコントロールとして利用する。別のウェルに対して、
１ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで、ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，１００−Ｂ−００１）（２５μｌ中に０．
０７５ｎｇ）を添加して、ＶＥＧＦインヒビターコント
ロールとして利用する。
【０３１６】４．各ウェルに対して、３０ｎｇ／ｍｌの
最終濃度までＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２９
８−ｖｓ−００５）（２５μｌ中に３ｎｇ）を添加す
る。３０分間インキュベートする。
【０３１７】５．膜を透過することによって細胞内のリ
ン酸化チロシンについてアッセイする。タンパク質チロ
シンキナーゼ活性を測定する代替のアッセイもまた、利
用可能であり、工程１７へ飛ぶ。
【０３１８】６．培地を吸引する。細胞を３０分間１％
ホルムアルデヒドで固定する。
【０３１９】７．ＰＢＳで細胞を洗浄する。
【０３２０】８．抗リン酸チロシン抗体（Ｐｉｅｒｃ
ｅ，＃２９９２６）を５μｇ／ｍｌの最終濃度になるよ
うに添加する。１時間インキュベートする。
【０３２１】９．１％ＢＳＡおよび０．０５％ＮＰ−４
０を含有するＰＢＳで細胞を洗浄する。
【０３２２】１０．ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体
（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３１４３０）、１：２００希釈液を
添加する。１時間インキュベートする。
【０３２３】１１．上記のように細胞を洗浄する。
【０３２４】１２．記載通りにＨＲＰ ＥＬＩＳＡアッ
セイ（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３２０５２）を実施する。ＶＥ
ＧＦ−刺激リン酸チロシン産生を低下させる化合物を同
定する。
【０３２５】１３．工程２のようにＶＥＧＦ−Ｒ１−／
Ｒ２ｉｎｄ細胞をプレートすることで２次スクリーニン
グのための準備をし、同時に複製プレートを調製する。
【０３２６】１４．１つのプレートに対して、ドキシサ
イクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。一晩
インキュベートする。
【０３２７】１５．両方のプレートに対して、工程３〜
１１を繰り返す。
【０３２８】１６．陽性ヒット（ｈｉｔ）は、ドキシサ
イクリンで未処理の細胞において減少したＶＥＧＦ刺激
リン酸チロシン産生を示した。理想的な化合物は、ドキ
シサイクリン処理細胞と同様にふるまい、従ってＶＥＧ
Ｆ−Ｒ２誘導経路以外の任意の系では作用しないことを
示す。
【０３２９】１７．工程５から再開する。培地を吸引す
る。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する２００
μｌのＰＴＫ抽出緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｖ６４８
０）を添加することによって細胞を可溶化し、そして１
０分間氷上でインキュベートする。
【０３３０】１８．任意の残留細胞を分離し、そして数
回ピペットで上げ下げすることで、細胞懸濁液を混合す
る。深いウェルブロックに懸濁液を移し、そして４℃で
１５分間振動させる。
【０３３１】１９．懸濁液を４℃で１００，０００×ｇ
で１時間遠心分離し、そして上澄みを保存する。
【０３３２】２０．Ｐｒｏｍｅｇａ（技術広報ＴＢ２１
１）に記載されるようなＰＴＫアッセイプロトコールの
工程ＩＩＩ．Ａ．１を続ける。
【０３３３】（実施例１０：Ｔ細胞の活性化を生じない
Ｔ細胞増殖の刺激因子の同定）カリウムチャンネルは、
Ｔリンパ球のカルシウムシグナル伝達の調節において重
大な役割を果たす。ヒトＴリンパ球において発現される
２つの際立ったカリウムチャンネルは、Ｋｖ１．３（膜
電位の変化に応答して開くチャンネル）およびＫＣａ４
（細胞内のカルシウムレベルにおける上昇によって活性
化されるチャンネル）である。Ｋｖ１．３が、Ｔ細胞増
殖の制御においてきわめて重大な役割を果たし、一方Ｋ
Ｃａ４はＴ細胞活性化において機能することを示してい
る。次いで、Ｔ細胞の活性化は、ＩＦＮ−γの放出およ
び免疫応答を導く。この経路に対する注意は、ＫＣａ４
が公知のマイトジェン刺激および抗原性刺激に応答して
上方制御されることである、従って、選択的にＴリンパ
球の増殖を可能にし得るが、Ｔ細胞の活性化を生じない
化合物を同定することは困難であった。いくつかのＫＣ
ａ４インヒビターは同定されているが、これらのインヒ
ビターは、完全には選択されていない；これらはまた、
他のタンパク質（例えば、Ｔ細胞にまた存し得るカルシ
ウム関連活性化Ｃａ２＋（ＣＲＡＣ）チャンネル）を阻
害し得る。
【０３３４】ヒトｈＫＣａ４遺伝子のＺＦＰベースのイ
ンヒビターを、上記のＺＦＰ設計の方法を使用して作製
した。その標的配列を、ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ
登録番号ＡＥ０２２７９７）の塩基対２１７に位置さ
せる。標的配列は、５’−ＧＧＧＧＡＧＧＧＣ−３’
（配列番号４１）である。認識へリックス（−１〜＋
６）のアミノ酸配列（一文字コード）は以下である：Ｆ
１＝ＲＳＤＨＬＡＲ（配列番号４２）。Ｆ２＝ＲＳＤＮ
ＬＡＲ（配列番号４３）。Ｆ３＝ＲＳＤＨＬＳＲ（配列
番号４４）。
【０３３５】得られる３フィンガーＺＦＰ（ＺＦＰ３Ａ
と呼ばれる）は、ゲル移動度シフトアッセイによって測
定されるように、その標的に対して０．３ｎＭの解離定
数を有する。ＺＦＰ３Ａ ＤＮＡ結合ドメインに対する
ＶＰ１６融合物は、同時トランスフェクトされたレポー
ター遺伝子を５倍よりも大きく活性化する。
【０３３６】ｈＫＣａ４遺伝子発現のインヒビターに影
響するＫＲＡＢ−ＺＦＰ３Ａキメラ構築物を、緑蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現ベクターと共にヒ
ト赤白血球細胞に同時トランスフェクトした。トランス
フェクトした細胞を、蛍光顕微鏡を使用して同定した。
次いで、トランスフェクトした細胞を、パッチクランプ
方法によってｈＫＣａ４機能について試験した。イオン
チャンネル機能を、勾配伝導度（ｎＳ）を決定すること
によって決定した。トランスフェクトしていないコント
ロールは、１２．５（ｎ＝１）の値を有する。空のベク
ターでトランスフェクトされた細胞は、１０．０±２．
５（ｎ＝４）の値を有する。ＺＦＰ３Ａでトランスフェ
クトされた細胞は、１．０±０．１の値を有する。これ
は、機能のほとんどの総損失を示す。
【０３３７】ＺＰＦ３Ａトランスフェクトされた細胞を
さらに、Ｋｖ１．３発現を活性化するように設計された
第２ＺＦＰでトランスフェクトする。アクチベーターを
コードする配列を、Ｔ−ＲｅｘＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）プラスミドにクローニングする。安定なクローン
を、ＦＡＣＳ分析を使用して選択して、Ｋｖ１．３の増
加した発現を有するこれらのクローンを同定する。クロ
ーンを、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）有りまたは
無しで処理した場合、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｉ蛍光画
像化プレートリーダーシステム（Ｆｌｏｕｒｏｍｅｔｒ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃ
ｓ）を使用して、細胞内のカルシウム変動における変化
について試験する。ドキシサイクリンの存在下では、細
胞内のカルシウム変動において最小の変化があり、一
方、ドキシサイクリン未処理細胞は、野生型Ｊｕｒｋａ
ｔと同様の変動を示す。Ｋｖ１．３の増加した発現を有
し、そしてドキシサイクリン処理後のＫＣａ４の損失を
示す細胞株を、ＨＴＰスクリーニングについて繰り返
す。これを、Ｋｖ１．３＋／ＫＣａ４＋／−と再命名す
る。
【０３３８】Ｋｖ１．３＋／ＫＣａ４＋／−細胞を、９
６ウェルディッシュにおいて１０，０００細胞／ウェル
にて二重でプレートする。ドキシサイクリンを１プレー
トに１μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、そして両方の
プレートを一晩インキュベートする。
【０３３９】化合物ライブラリー由来の試験化合物を、
３０ｎＭの最終濃度まで添加し、そして両方のプレート
を２４時間インキュベートする。各プレートについて、
コントロールウェルは、１０μｇ／ｍＬのコンカナバリ
ンＡ（Ｃｏｎ Ａ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を有して、マイトジェン活性およびＴ細胞活性
化に対する陽性コントロールとなる。第２コントロール
ウェルは、何も添加されず、バックグランドコントロー
ルとしてなる。
【０３４０】収集４時間前、［３Ｈ］チミジン（１μＣ
ｉ／ウェル）を各ウェルに添加する。
【０３４１】プレートを回して、細胞をペレット化す
る。上清をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａのプロトコールおよび試薬）を使
用して収集する。
【０３４２】細胞をＰＢＳ中に再懸濁して、そしてグラ
スファイバーフィルター上で収集する。［３Ｈ］チミジ
ン組み込みを、シンチレーションカウンターで測定す
る。
【０３４３】マイトジェン性化合物に曝していない細胞
は［３Ｈ］チミジン摂取およびＩＦＮ−γ分泌について
のベースラインとなる。ＣｏｎＡコントロールは、ドキ
シサイクリン処理細胞および未処理細胞の両方において
増加した［３Ｈ］チミジン摂取を示す；さらに、未処置
細胞における分泌ＩＦＮ−γの増加があるが、ドキシサ
イクリン処理細胞における増加はない。陽性ヒットは、
ドキシサイクリン処理細胞または未処理細胞のいずれか
において［３Ｈ］チミジン組み込みの増加を刺激するが
ＩＦＮ−γ分泌の増加を刺激しない化合物である。
【０３４４】（実施例１１：ヒトエリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）遺伝子のＺＦＰ調節）この実施例において、ヒト
エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を、発現がＺＦＰに
よって調節され得る分子標的の例として使用した。従っ
て、誘導性ＺＦＰを含む安定な細胞株を、Ｚｈａｎｇら
（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：３３８
５０〜３３８６０に記載されるように確立した。この細
胞株は、ＶＰ１６活性化ドメインに融合したヒトＥＰＯ
遺伝子の上流の標的部位８６２ヌクレオチドを結合する
ように設計したＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（ＥＰＯＺ
ＦＰ−８６２）をコードする安定に統合された融合遺伝
子を含んでいた。この融合遺伝子の発現は、ｔｅｔ転写
制御配列の制御下にあり；従ってドキシサイクリンによ
って誘導可能であった。
【０３４５】ＥＰＯＺＦＰ−８６２タンパク質に対する
標的部位は、ＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣ（配列番号３６）で
あった。その認識へリックス（−１位と＋６位の間）の
アミノ酸配列は、Ｆ１：ＱＳＳＤＬＴＲ（配列番号：３
７）；Ｆ２：ＲＳＤＡＬＳＲ（配列番号：３８）；およ
びＦ３：ＲＳＤＥＲＫＲ（配列番号：３９）であった。
ＥＰＯＺＦＰ−８６２ジンクフィンガータンパク質をＳ
Ｐ−１骨格（この遺伝子をＰＣＲによって組み立てる）
に設計し、マルトース結合タンパク質との融合体として
精製し、そして上に記載されるように、標的部位に対す
るその親和性について試験した。
【０３４６】一過性かつ安定にトランスフェクトしたヒ
ト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞を、Ｚｈａｎｇら（２０
００）（上述）に記載されるように産生した。簡単に
は、細胞を、１０％の胎仔子ウシ血清を補充したＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変イーグル培地中で増殖させた。安定なＴ
ｅｔ誘導性ＥＰＯＺＦＰ細胞株を産生するため、ｐＥＰ
ＯＺＦＰ８６２ ＤＮＡ由来のコード領域を、ＡｆｌＩ
ＩＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用して
ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブク
ローニングした。生じたｐＴＯ−ＥＰＯＺＦＰ８６２構
築物を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＴ−Ｒｅ
ｘ−２９３ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞株にトラ
ンスフェクトした。ＺｅｏｃｉｎＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を含む培地における選択の２週間後、安定なク
ローンを、単離し、そしてＺＦＰ発現のドキシサイクリ
ン（Ｄｏｘ）−依存活性化について分析した。
【０３４７】一過性のトランスフェクションを、Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥを使用して実施した。細胞溶解物
をトランスフェクションの４０時間後に収穫し、そして
ルシフェラーゼ活性をデュアルライト（Ｄｕａｌ−Ｌｉ
ｇｈｔ）ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼレポ
ーターアッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ）によって測定
した。内因性染色体ＥＰＯ遺伝子活性化をアッセイする
ために、ＥＰＯ ｍＲＮＡのノーザン分析およびＴａｑ
ｍａｎ分析を、Ｚｈａｎｇら（上記）に詳細に記載され
るように実施した。
【０３４８】図２に示されるように、内因性ＥＰＯ遺伝
子を、ＥＰＯＺＦＰ８６２の合成に対応して誘導的に発
現した。図２Ａは、ＥＰＯ発現およびＴｅｔ応答性全長
ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＰＯＺＦＰ８６２遺伝
子のコピーを含む安定にトランスフェクトした２９３細
胞に対するＤｏｘ用量応答曲線を示す。この実験につい
て、順化培地を、Ｄｏｘの添加（図に示す濃度で）の４
８時間後に収穫し、そしてＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットに
よって分析した。図２Ｂは、示されるＤｏｘ濃度で処理
したＥＰＯＺＦＰ８６２細胞からのタンパク質抽出物の
免疫ブロットを、抗Ｆｌａｇ抗体を使用して示す。抽出
物を、導入４８時間後の細胞から調製した。図２Ｃは、
ＥＰＯＺＦＰ８６２で誘導したＥＰＯ ｍＲＮＡのＲＮ
Ａ（ノーザン）ブロット分析を示す。ＥＰＯ ｍＲＮＡ
シグナルを、トランスフェクトしていない２９３細胞お
よびＥＰＯＺＦＰ８６２ｃでトランスフェクトした２９
３細胞について（それぞれ、レーン１およびレーン
２）、ならびに誘導していないＥＰＯＺＦＰ８６２細胞
およびＤｏｘ誘導したＥＰＯＺＦＰ８６２細胞について
（それぞれ、レーン３およびレーン４）示す。ＥＰＯプ
ローブ化された膜を、はがし、そしてＺＦＰ ｍＲＮＡ
ならびに負荷コントロールとなるヒトβアクチン遺伝子
にハイブリダイズするアンチセンスフラグメントを含む
３２Ｐ標識化リボプローブで再ハイブリダイズさせた。
【０３４９】従って、内因性のヒトＥＰＯを、ＥＰＯ遺
伝子に対して標的化されるＺＦＰの一過性の発散、また
は安定な発現のいずれかに応答して活性化し得る。
【０３５０】本明細書中に記載される実施例および実施
形態は、例示的な目的としてのみであり、それらを考慮
した種々の改変または変更は、当業者に示唆され、そし
て本願の趣旨および範囲内ならびに添付の特許請求の範
囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０３５１】
【発明の効果】本発明によれば、特定の分子標的と相互
作用する候補化合物の能力について、候補化合物をスク
リーニングするための新規のアッセイが可能となる。
【０３５２】
【配列表】
【０３５３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、設計されたＺＦＰをコードする核酸分
子を構築するプロセスを示す。
【図２Ａ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応
答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィン
ガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対す
る応答において、安定に形質転換された２９３細胞中
の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ａ
は、ＥＬＩＳＡによって決定された、ＥＰＯ発現につい
てのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）用量応答性を示す。
【図２Ｂ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応
答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィン
ガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対す
る応答において、安定に形質転換された２９３細胞中
の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ｂ
は、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した、示された濃度のドキシ
サイクリンで処理された細胞におけるＥＰＯＺＦＰ−８
６２発現のイムノブロット分析を示す。
【図２Ｃ】図２のパネルＡ〜Ｃは、テトラサイクリン応
答性全長ＣＭＶプロモーターの制御下で、ジンクフィン
ガータンパク質（ＥＰＯＺＦＰ−８６２）の合成に対す
る応答において、安定に形質転換された２９３細胞中
の、内因生ＥＰＯ遺伝子の誘導性発現を示す。図２Ｃ
は、ＥＰＯＺＦＰ−８６２によって誘導されるＥＰＯｍ
ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。レーン１は、ト
ランスフェクトされない細胞を示すコントロールであ
り；レーン２は、ＥＰＯＺＦＰ−８６２で一過性にトラ
ンスフェクトした細胞を示し；レーン３およびレーン４
は、Ｄｏｘの非存在（レーン３）および存在（レーン
４）において、ＥＰＯＺＦＰ−８６２で安定にトランス
フェクトした細胞を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA20 DA03 DA06 EA04 GA11 4B065 AA26X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 内因性分子標的の発現を直接的にかまた
    は間接的に調節する外因性ジンクフィンガータンパク質
    を含む細胞。
  2. 【請求項２】 前記細胞が、前記ジンクフィンガータン
    パク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１
    に記載の細胞。
  3. 【請求項３】 前記細胞が、前記ポリヌクレオチドを用
    いて安定にトランスフェクトされている、請求項２に記
    載の細胞。
  4. 【請求項４】 前記ジンクフィンガータンパク質が、前
    記分子標的の発現を直接的に調節する、請求項１〜３の
    いずれか１項に記載の細胞。
  5. 【請求項５】 前記ジンクフィンガータンパク質が、前
    記分子標的の発現を抑制する、請求項４に記載の細胞。
  6. 【請求項６】 前記ジンクフィンガータンパク質が、前
    記分子標的の発現を活性化する、請求項４に記載の細
    胞。
JP2002311841A 2000-02-08 2002-10-25 薬物の発見のための細胞 Withdrawn JP2003180386A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18111700P 2000-02-08 2000-02-08
US60/181,117 2000-02-08

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001558729A Division JP5047437B2 (ja) 2000-02-08 2001-02-08 薬物の発見のための細胞

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011040748A Division JP2011147448A (ja) 2000-02-08 2011-02-25 薬物の発見のための細胞

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003180386A true JP2003180386A (ja) 2003-07-02

Family

ID=22662967

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001558729A Expired - Fee Related JP5047437B2 (ja) 2000-02-08 2001-02-08 薬物の発見のための細胞
JP2002311841A Withdrawn JP2003180386A (ja) 2000-02-08 2002-10-25 薬物の発見のための細胞
JP2011040748A Pending JP2011147448A (ja) 2000-02-08 2011-02-25 薬物の発見のための細胞

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001558729A Expired - Fee Related JP5047437B2 (ja) 2000-02-08 2001-02-08 薬物の発見のための細胞

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011040748A Pending JP2011147448A (ja) 2000-02-08 2011-02-25 薬物の発見のための細胞

Country Status (9)

Country Link
US (3) US6689558B2 (ja)
EP (2) EP1254369B1 (ja)
JP (3) JP5047437B2 (ja)
KR (1) KR20020086508A (ja)
AT (1) ATE483970T1 (ja)
AU (2) AU2001250774B2 (ja)
CA (1) CA2398590C (ja)
DE (1) DE60143192D1 (ja)
WO (1) WO2001059450A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015509957A (ja) * 2012-02-28 2015-04-02 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ ヒストンアセチル化の標的化

Families Citing this family (249)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7070934B2 (en) * 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US20020061512A1 (en) * 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US6610489B2 (en) * 2000-04-28 2003-08-26 Sangamo Biosciences, Inc. Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions
CA2407460C (en) * 2000-04-28 2013-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted modification of chromatin structure
US6919204B2 (en) * 2000-09-29 2005-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of gene expression using localization domains
CN100463962C (zh) * 2001-12-07 2009-02-25 图尔金株式会社 嵌合蛋白质的表型筛选
US7154002B1 (en) 2002-10-08 2006-12-26 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
EP1570058A1 (en) * 2002-12-09 2005-09-07 Toolgen, Inc. Regulatory zinc finger proteins
US7381825B2 (en) * 2003-03-17 2008-06-03 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
US20050137234A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Syrrx, Inc. Histone deacetylase inhibitors
US20050159470A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Syrrx, Inc. Histone deacetylase inhibitors
US20050249772A1 (en) * 2004-05-04 2005-11-10 Prasanna Malaviya Hybrid biologic-synthetic bioabsorbable scaffolds
US7642275B2 (en) * 2004-12-16 2010-01-05 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
EP1896436A2 (en) * 2005-05-11 2008-03-12 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
WO2006125012A2 (en) 2005-05-18 2006-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and kits for real-time nucleic acid analysis in live cells
US7732475B2 (en) * 2005-07-14 2010-06-08 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
WO2007084390A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
AU2007254251A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase
DE602007005634D1 (de) 2006-05-25 2010-05-12 Sangamo Biosciences Inc Variante foki-spaltungshälften-domänen
AU2007267874B2 (en) * 2006-05-25 2012-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
US7919313B2 (en) 2007-07-12 2011-04-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (FUT8) gene expression
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
HUE029916T2 (en) * 2007-09-27 2017-04-28 Dow Agrosciences Llc Genetically Modified Zinc Fusion Proteins Targeting 5-Enolpyruvyl Cyclamate-3-Phosphate Synthetic Genes
JP2011500082A (ja) 2007-10-25 2011-01-06 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的組込みのための方法および組成物
JP5763530B2 (ja) * 2008-06-10 2015-08-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｂａｘ−およびＢａｋ−欠損細胞株の生成のための方法および組成物
JP5908725B2 (ja) 2008-08-22 2016-04-26 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的一本鎖開裂および標的組込みのための方法、並びに組成物
KR101673566B1 (ko) 2008-10-29 2016-11-07 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 글루타민 신테타제 유전자 발현을 불활성화시키기 위한 방법 및 조성물
JP5681114B2 (ja) 2008-12-04 2015-03-04 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したラットのゲノム編集
EP2393506B1 (en) 2009-02-04 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating neuropathies
WO2010107493A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
CA2769262C (en) 2009-07-28 2019-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
DE102009045484A1 (de) * 2009-10-08 2011-04-14 Hilti Aktiengesellschaft Leitungsabhängeeinrichtung
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US8994666B2 (en) * 2009-12-23 2015-03-31 Colin J. Karpfinger Tactile touch-sensing interface system
EP2526112B1 (en) * 2010-01-22 2018-10-17 Dow AgroSciences LLC Targeted genomic alteration
WO2011097036A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
EP2660318A1 (en) 2010-02-09 2013-11-06 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US9567573B2 (en) 2010-04-26 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using nucleases
DK2566972T3 (da) 2010-05-03 2020-02-17 Sangamo Therapeutics Inc Sammensætninger til at forbinde zinkfinger-moduler
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
CA2993567C (en) 2010-07-21 2022-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a t-cell receptor gene
EP3511420B1 (en) 2010-09-27 2021-04-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for inhibiting viral entry into cells
JP6018069B2 (ja) 2010-10-12 2016-11-02 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ 血友病ｂを治療する方法及び組成物
WO2012094132A1 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene correction
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9161995B2 (en) 2011-07-25 2015-10-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene
US9394545B2 (en) 2011-09-21 2016-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
CA2852955C (en) 2011-10-27 2021-02-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
US9458205B2 (en) 2011-11-16 2016-10-04 Sangamo Biosciences, Inc. Modified DNA-binding proteins and uses thereof
NZ629427A (en) 2012-02-29 2016-04-29 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treating huntington’s disease
KR102116153B1 (ko) 2012-05-07 2020-05-27 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 도입유전자의 뉴클레아제-매개 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2013192278A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
WO2014011237A1 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
EP2872154B1 (en) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
UA118957C2 (uk) 2012-08-29 2019-04-10 Сангамо Біосайєнсиз, Інк. Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
AU2013312538B2 (en) 2012-09-07 2019-01-24 Corteva Agriscience Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
WO2014059173A2 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
CA2892448A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
WO2014089541A2 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Haplomics, Inc. Factor viii mutation repair and tolerance induction
US9375048B2 (en) 2012-12-28 2016-06-28 Nike, Inc. Article of footwear having adjustable sole structure
WO2014130955A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
JP6346266B2 (ja) 2013-03-21 2018-06-20 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊
JP2016518142A (ja) 2013-05-10 2016-06-23 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法および組成物
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CN105531372A (zh) * 2013-06-14 2016-04-27 塞尔克蒂斯股份有限公司 植物中非转基因基因组编辑方法
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
JP6588438B2 (ja) 2013-08-28 2019-10-09 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
EP3058072B1 (en) 2013-10-17 2021-05-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2015057976A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
UY35812A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?loci de maíz óptimos?.
WO2015066643A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
CA2928855A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
CN105980395A (zh) 2013-11-04 2016-09-28 美国陶氏益农公司 最优大豆座位
US10369201B2 (en) 2013-11-11 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating Huntington's disease
PT3492593T (pt) 2013-11-13 2021-10-18 Childrens Medical Center Regulação da expressão de genes mediada por nucleases
AU2014364051B2 (en) 2013-12-09 2018-12-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
LT3102673T (lt) 2014-02-03 2020-08-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Beta talasemijos gydymo būdai ir kompozicijos
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
AU2015255877B2 (en) 2014-05-08 2020-03-26 Chdi Foundation, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
EP3152319A4 (en) 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
JP2017521079A (ja) 2014-07-14 2017-08-03 ワシントン ステイト ユニバーシティ 生殖系列細胞を切除するｎａｎｏｓノックアウト
AU2015289644A1 (en) 2014-07-15 2017-02-02 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
WO2016014794A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
EP4079847A1 (en) 2014-07-30 2022-10-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
SI3194570T1 (sl) 2014-09-16 2022-01-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Postopki in sestavki za genomski inženiring s posredovanjem nukleaze in korekcijo krvotvornih matičnih celic
WO2016076948A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nike Innovate C.V. Article of footwear with a sole assembly having a bladder element and a guide component and method of manufacturing the article of footwear
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
WO2016118726A2 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
AU2016243052C1 (en) 2015-04-03 2022-11-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of B-cells
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
JP6873917B2 (ja) 2015-05-12 2021-05-19 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
CN108024544B (zh) 2015-07-13 2022-04-29 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程化的递送方法及组合物
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
US10091975B2 (en) 2015-08-06 2018-10-09 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes
WO2017053753A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Htt repressors and uses thereof
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
AU2016343887B2 (en) 2015-10-28 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor VIII expression cassettes and methods of use thereof
AU2016361350B2 (en) 2015-11-23 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
WO2017106528A2 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
EA201891212A1 (ru) 2015-12-18 2019-01-31 Сангамо Терапьютикс, Инк. Адресная дезорганизация клеточного рецептора гкгс
KR20180127319A (ko) 2016-01-15 2018-11-28 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 신경 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
CN109069568B (zh) 2016-02-02 2023-07-07 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于连接dna结合结构域和切割结构域的组合物
CN109689677B (zh) 2016-05-27 2023-11-10 阿迪根有限公司 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
ES2938210T3 (es) 2016-07-13 2023-04-05 Vertex Pharma Métodos, composiciones y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma
JP7231935B2 (ja) 2016-08-03 2023-03-08 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CA3034884A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
BR112019003100A2 (pt) 2016-08-24 2019-07-09 Sangamo Therapeutics Inc regulação da expressão gênica usando nucleases manipuladas
JP7256739B2 (ja) 2016-09-07 2023-04-12 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 肝臓遺伝子のモジュレーション
AU2017340634B2 (en) 2016-10-05 2022-06-02 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption
CN110381963A (zh) 2016-10-13 2019-10-25 朱诺治疗学股份有限公司 涉及色氨酸代谢途径调节剂的免疫治疗方法和组合物
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
JP7042263B2 (ja) 2016-10-20 2022-03-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ファブリー病の治療のための方法および組成物
WO2018081775A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
IL266862B2 (en) 2016-12-01 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Tau modulators and methods and preparations for their administration
MA46959A (fr) 2016-12-02 2019-10-09 Juno Therapeutics Inc Cellules b modifiées et compositions et méthodes associées
US20200040345A1 (en) 2016-12-08 2020-02-06 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
GB2575930A (en) 2017-03-23 2020-01-29 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018200635A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods of treating rheumatoid arthritis using rna-guided genome editing of hla gene
CA3061612A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2018204469A2 (en) 2017-05-03 2018-11-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
AU2018302098A1 (en) 2017-07-18 2020-02-20 Csl Behring Gene Therapy, Inc. Compositions and methods for treating beta-hemoglobinopathies
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592B2 (en) 2017-10-16 2025-03-27 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019094725A2 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene
WO2019109051A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Encoded Therapeutics, Inc. Engineered dna binding proteins
WO2019143678A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
AU2019209290B2 (en) 2018-01-17 2024-03-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated DNA-PK inhibitors
US12269804B2 (en) 2018-01-17 2025-04-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
WO2019157324A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
CN112585277A (zh) 2018-04-05 2021-03-30 朱诺治疗学股份有限公司 表达重组受体的t细胞、相关多核苷酸和方法
MA52656A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Editas Medicine Inc Procédés de production de cellules exprimant un récepteur recombinant et compositions associées
CN112313246B (zh) 2018-04-18 2025-05-13 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于调节亨廷顿蛋白(htt)的锌指蛋白组合物
US20230159956A1 (en) 2018-05-11 2023-05-25 Beam Therapeutics Inc. Methods of editing single nucleotide polymorphism using programmable base editor systems
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
EP3830263A4 (en) 2018-08-03 2022-05-04 Beam Therapeutics, Inc. Multi-effector nucleobase editors and methods of using same to modify a nucleic acid target sequence
EP3841204A4 (en) 2018-08-23 2022-05-18 Sangamo Therapeutics, Inc. CHANGED TARGET SPECIFIC BASE EDITORS
US20210348177A1 (en) 2018-09-05 2021-11-11 The Regents Of The University Of California Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
WO2020061161A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases
WO2020061426A2 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
CN113226333A (zh) 2018-10-02 2021-08-06 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于调控Tau蛋白的方法和组合物
US12281338B2 (en) 2018-10-29 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising GeoCas9 and uses thereof
US20220282275A1 (en) 2018-11-15 2022-09-08 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
CN113166727A (zh) 2018-11-28 2021-07-23 四十七公司 对消融方案耐受的基因修饰的hspc
GB201820863D0 (en) 2018-12-20 2019-02-06 Univ Bath Screening assay
PT3908568T (pt) 2019-01-11 2024-09-30 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos para a administração de agentes ativos por nanopartículas lipídicas
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
CA3106693A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type i
US11866469B2 (en) 2019-02-06 2024-01-09 Klogenix Llc DNA binding proteins and uses thereof
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
WO2020181180A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to c:g base editors and uses thereof
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
US20220170013A1 (en) 2019-03-06 2022-06-02 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
JP7669281B2 (ja) 2019-03-19 2025-04-28 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
SG11202110776TA (en) 2019-04-02 2021-10-28 Sangamo Therapeutics Inc Methods for the treatment of beta-thalassemia
US20230165976A1 (en) 2019-04-10 2023-06-01 University Of Utah Research Foundation Htra1 modulation for treatment of amd
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2020219726A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulators of chromosome 9 open reading frame 72 gene expression and uses thereof
AU2020265741A1 (en) 2019-05-01 2021-11-25 Editas Medicine, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods
AU2020265749A1 (en) 2019-05-01 2022-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified CD247 locus, related polynucleotides and methods
JP2022543112A (ja) 2019-08-01 2022-10-07 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド Ｄｕｘ４発現細胞およびそれらの使用
WO2021030666A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 The Broad Institute, Inc. Base editing by transglycosylation
CA3148370A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof
JP2022553828A (ja) 2019-11-01 2022-12-26 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ゲノム操作のための組成物および方法
TW202132565A (zh) 2019-11-01 2021-09-01 美商聖加莫治療股份有限公司 Ｇｉｎ重組酶變異體
WO2021108717A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 The Broad Institute, Inc Systems and methods for evaluating cas9-independent off-target editing of nucleic acids
US20230235309A1 (en) 2020-02-05 2023-07-27 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
CA3174486A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for modulating a genome
BR112022019060A2 (pt) 2020-03-25 2022-11-29 Sana Biotechnology Inc Células neurais hipoimunogênicas para o tratamento de distúrbios e condições neurológicas
EP4143315A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 The Broad Institute Inc. <smallcaps/>? ? ?ush2a? ? ? ? ?targeted base editing of thegene
WO2021224395A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Cellectis S.A. Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes
EP4146284A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Cellectis S.A. Methods to genetically modify cells for delivery of therapeutic proteins
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
EP4150057A2 (en) 2020-05-13 2023-03-22 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
WO2021236852A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Sana Biotechnology, Inc. Methods and compositions for treatment of viral infections
JP2023531531A (ja) 2020-06-26 2023-07-24 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
KR20230051172A (ko) 2020-07-16 2023-04-17 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노 입자에 사용하기 위한 양이온성 지질
US20230293581A1 (en) 2020-08-13 2023-09-21 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions
EP4501951A3 (en) 2020-08-25 2025-04-30 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
MX2023005665A (es) 2020-11-16 2023-08-01 Pig Improvement Co Uk Ltd Animales resistentes a la influenza a que tienen genes de anp32 editados.
IL303473A (en) 2020-12-31 2023-08-01 Sana Biotechnology Inc Methods and compositions for modulating car-t activity
CN116981697A (zh) 2021-01-14 2023-10-31 森迪生物科学公司 可分泌有效载荷调节
CA3208612A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Beam Therapeutics Inc. Recombinant rabies viruses for gene therapy
CA3213080A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Krit RITTHIPICHAI Cish gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
BR112023024434A2 (pt) 2021-05-27 2024-02-20 Sana Biotechnology Inc Células hipoimunogênicas que compreendem hla-e ou hla-g geneticamente modificadas
AU2022309875A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
TW202321435A (zh) 2021-08-11 2023-06-01 美商薩那生物科技公司 用於改變低免疫原性細胞中之基因表現之可誘導系統
AU2022325232A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
US20240425820A1 (en) 2021-08-11 2024-12-26 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
JP2024535677A (ja) 2021-08-11 2024-10-02 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 即時血液媒介性炎症反応を減少させるための同種細胞療法を目的とした遺伝子改変細胞
WO2023035011A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 North Carolina State University Compositions and methods for conferring resistance to geminivirus
WO2023039424A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for modulating a genome
US20230270840A1 (en) 2021-09-08 2023-08-31 Beam Therapeutics Inc. Viral guide rna delivery
WO2023069790A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
EP4426832A1 (en) 2021-11-03 2024-09-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
CA3242402A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP4452285A1 (en) 2021-12-23 2024-10-30 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
US20250101382A1 (en) 2022-03-11 2025-03-27 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells and compositions and uses thereof
EP4522201A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
EP4522203A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
EP4573191A1 (en) 2022-08-16 2025-06-25 The Broad Institute, Inc. Evolved cytosine deaminases and methods of editing dna using same
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
WO2024155745A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 The Broad Institute, Inc. Base editing-mediated readthrough of premature termination codons (bert)
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024187174A2 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Aadigen, Llc Compositions for treating cancer with kras mutations and uses thereof
WO2024229302A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Sana Biotechnology, Inc. Methods of dosing and administration of engineered islet cells
WO2024238723A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Omega Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating pcsk9 expression
WO2024238726A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 Omega Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating methylation of a target gene
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods
WO2025004001A1 (en) 2023-06-30 2025-01-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Htt repressors and uses thereof
WO2025019742A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Omega Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating ctnnb1 expression
WO2025049959A2 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025064469A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Omega Therapeutics, Inc. Methods for assessing dosage for epigenetic modifying agents

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040939A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cadus Pharmaceutical Corporation Expression of functional vertebrate phospholipases in yeast
JPH09176048A (ja) * 1995-12-28 1997-07-08 Takeda Chem Ind Ltd ヒトＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体タンパク質の製造法および用途
JPH09238686A (ja) * 1996-03-07 1997-09-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その製造法および用途
JPH10504461A (ja) * 1994-08-20 1998-05-06 メディカル・リサーチ・カウンシル Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
WO1998054311A1 (en) * 1997-05-27 1998-12-03 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
JPH11152300A (ja) * 1997-04-25 1999-06-08 Takeda Chem Ind Ltd 新規レセプター蛋白質およびその用途
WO1999047656A2 (en) * 1998-03-17 1999-09-23 Gendaq Limited Nucleic acid binding proteins
JP2001231583A (ja) * 1999-01-12 2001-08-28 Sanagamo Biosciences Inc ジンクフィンガータンパク質を用いた、細胞における、内因性遺伝子発現の調節
JP2002527097A (ja) * 1998-10-16 2002-08-27 ノヴァルティス アクチェンゲゼルシャフト Ｇｎｎのためのジンクフィンガー結合ドメイン
JP2003509078A (ja) * 1999-09-22 2003-03-11 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 細胞に基づくアッセイ

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5071773A (en) 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5266464A (en) 1988-02-10 1993-11-30 Ict Pharmaceuticals, Inc. Method of screening for protein inhibitors and activators
US5688655A (en) 1988-02-10 1997-11-18 Ict Pharmaceuticals, Inc. Method of screening for protein inhibitors and activators
US4980281A (en) 1988-02-10 1990-12-25 Housey Gerard M Method of screening for protein inhibitors and activators
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5580722A (en) 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
ES2109945T3 (es) 1990-06-01 1998-02-01 Chiron Corp Composiciones y procedimientos para identificar moleculas biologicamente activas.
US5401629A (en) 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
CZ49693A3 (en) 1990-09-24 1994-02-16 Gen Hospital Corp Method for testing of a compound capability to inhibit onco-protein activity
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE148889T1 (de) 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
IL107166A (en) 1992-10-01 2000-10-31 Univ Columbia Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5582995A (en) * 1993-06-11 1996-12-10 The General Hospital Corporation Methods of screening for compounds which inhibit the direct binding of Ras to Raf
EP0726906A4 (en) 1993-11-02 1998-10-07 Affymax Tech Nv THE SYNTHESIS AND EXAMINATION OF MOLECULAR DIVERSITY
AU704601B2 (en) 1994-01-18 1999-04-29 Scripps Research Institute, The Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
AU691296B2 (en) 1994-05-06 1998-05-14 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
AU2053197A (en) 1996-02-23 1997-09-10 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Cell-based assay
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
US6007408A (en) 1997-08-21 1999-12-28 Micron Technology, Inc. Method and apparatus for endpointing mechanical and chemical-mechanical polishing of substrates
US6639051B2 (en) * 1997-10-20 2003-10-28 Curis, Inc. Regulation of epithelial tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
DE69942334D1 (de) 1998-03-02 2010-06-17 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
US6410245B1 (en) * 1998-04-01 2002-06-25 Affymax, Inc. Compositions and methods for detecting ligand-dependent nuclear receptor and coactivator interactions
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
US9401201B1 (en) 2015-05-22 2016-07-26 Qualcomm Incorporated Write driver for memory

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10504461A (ja) * 1994-08-20 1998-05-06 メディカル・リサーチ・カウンシル Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
WO1996040939A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cadus Pharmaceutical Corporation Expression of functional vertebrate phospholipases in yeast
JPH09176048A (ja) * 1995-12-28 1997-07-08 Takeda Chem Ind Ltd ヒトＭＩＰ−１α／ＲＡＮＴＥＳ受容体タンパク質の製造法および用途
JPH09238686A (ja) * 1996-03-07 1997-09-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その製造法および用途
JPH11152300A (ja) * 1997-04-25 1999-06-08 Takeda Chem Ind Ltd 新規レセプター蛋白質およびその用途
WO1998054311A1 (en) * 1997-05-27 1998-12-03 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO1999047656A2 (en) * 1998-03-17 1999-09-23 Gendaq Limited Nucleic acid binding proteins
JP2002527097A (ja) * 1998-10-16 2002-08-27 ノヴァルティス アクチェンゲゼルシャフト Ｇｎｎのためのジンクフィンガー結合ドメイン
JP2001231583A (ja) * 1999-01-12 2001-08-28 Sanagamo Biosciences Inc ジンクフィンガータンパク質を用いた、細胞における、内因性遺伝子発現の調節
JP2003509078A (ja) * 1999-09-22 2003-03-11 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 細胞に基づくアッセイ

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015509957A (ja) * 2012-02-28 2015-04-02 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ ヒストンアセチル化の標的化

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001059450A3 (en) 2002-05-02
WO2001059450A8 (en) 2001-10-18
AU5077401A (en) 2001-08-20
EP2207032A1 (en) 2010-07-14
JP2003522536A (ja) 2003-07-29
EP1254369B1 (en) 2010-10-06
US20030180713A1 (en) 2003-09-25
EP1254369A2 (en) 2002-11-06
US20030175790A1 (en) 2003-09-18
DE60143192D1 (de) 2010-11-18
AU2001250774B2 (en) 2005-01-27
CA2398590C (en) 2012-08-28
JP5047437B2 (ja) 2012-10-10
US7045304B2 (en) 2006-05-16
HK1051067A1 (en) 2003-07-18
KR20020086508A (ko) 2002-11-18
US20020045158A1 (en) 2002-04-18
JP2011147448A (ja) 2011-08-04
ATE483970T1 (de) 2010-10-15
US6689558B2 (en) 2004-02-10
CA2398590A1 (en) 2001-08-16
US6989269B2 (en) 2006-01-24
WO2001059450A2 (en) 2001-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5047437B2 (ja) 薬物の発見のための細胞
AU2001250774A1 (en) Cells expressing zinc finger proteins for drug discovery
US6933113B2 (en) Modulation of endogenous gene expression in cells
US7013219B2 (en) Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20060014286A1 (en) Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
CA2435394A1 (en) Modified zinc finger binding proteins
AU2004274957A1 (en) Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
WO2002026960A2 (en) Modulation of gene expression using localization domains
HK1051067B (en) Cells for drug discovery
WO2004018632A2 (en) High-throughput screen for modulators of chromatin modifying activity

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20050225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050519

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071221

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080520

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080819

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080826

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080905

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090512

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090812

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090819

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090914

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101026

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110428

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20110511