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KR20180127319A - 신경 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

신경 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20180127319A
KR20180127319A KR1020187023424A KR20187023424A KR20180127319A KR 20180127319 A KR20180127319 A KR 20180127319A KR 1020187023424 A KR1020187023424 A KR 1020187023424A KR 20187023424 A KR20187023424 A KR 20187023424A KR 20180127319 A KR20180127319 A KR 20180127319A
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KR
South Korea
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cell
idua
protein
ids
mps
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Application number
KR1020187023424A
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English (en)
Inventor
러셀 데켈버
알. 스코트 맥아이버
리 오우
토마스 웩슬러
체스터 비. 휘틀리
Original Assignee
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드, 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 filed Critical 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20180127319A publication Critical patent/KR20180127319A/ko
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Abstract

치료적 IDUA 또는 IDS 단백질 가령 효소를 인코딩하는 서열을 세포에 삽입하고, 이를 통해 MPS I 또는 MPS II 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 단백질 또는 세포 치료제를 제공하는 뉴클레아제 및 이들 뉴클레아제를 사용하는 방법.

Description

신경 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
연관 출원의 상호-참조
본 출원은 2016년 1월 15일에 출원된 미국 가출원 특허 제62/279,394호; 2016년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/300,271호; 및 2016년 4월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/328,925호의 이익을 주장하며, 상기 개시들은 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.
기술 분야
본 개시는 신경 질환, 및 특별히 중추신경계와 연관된 리소좀 질환, 및 샤이에(Scheie) 증후군 (MPS IS) 및 헐러(Hurler)-샤이에 증후군 (MPS H-S)과 같은 "약화된 형태" 뿐만 아니라 더욱 빠르게 진행되는 형태의 헐러 증후군(MPS IH)에 해당하는 뮤코다당증 유형 I (MPS I) 및 헌터(Hunter) 증후군으로도 공지된 뮤코다당증 유형 II (MPS II)을 비롯한 질환, 및 유전자 치료의 분야에 속한다.
발명의 배경
유전자 치료는 인간 치료제의 새 시대를 위해 엄청난 가능성을 품고 있다. 이들 방법론은 이제까지 표준 의학 수준으로는 다룰 수 없었던 증상의 치료를 가능하게 할 것이다. 특히 유망한 한 분야는 세포에 전이유전자를 부가하여 그 세포가 이전에는 그 세포에서 생산되지 않았던 산물을 발현하게 하는 능력이다. 이러한 기술의 사용예는 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자의 삽입, 어떤 이유로든 세포 또는 개체에 결여된 단백질을 인코딩하는 암호화 서열의 삽입 및 마이크로RNA와 같은 구조적 핵산을 인코딩하는 서열의 삽입을 포함한다.
전이유전자는 이 전이유전자가 세포 자체의 유전체에 통합되고 그곳에 유지되도록 하는 다양한 방식으로 세포에 전달될 수 있다. 최근 수년간, 전이유전자 통합을 위해 선택된 유전체 좌위로의 표적 삽입을 위해 부위-특이적 뉴클레아제를 이용한 절단을 사용하는 전략이 개발되었다(예컨대, 공동-권리의 미국 특허 7,888,121호를 참조하라). 뉴클레아제, 가령 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 뉴클레아제 시스템 가령 CRISPR/Cas 시스템 (조작된 가이드 RNA를 이용)은 표적 유전자에 대해 특이적이며 전이유전자 구조체가 상동성 지정 수선 (HDR) 또는 비-상동성 말단 접합 (NHEJ) 유발 과정 도중의 말단 포획에 의해 삽입되도록 활용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제9,394,531호; 9,255,250호; 9,200,266호; 9,045,763호; 9,005,973호; 9,150,847호; 8,956,828호; 8,945,868호; 8,703,489호; 8,586,526호; 6,534,261호; 6,599,692호; 6,503,717호; 6,689,558호; 7,067,317호; 7,262,054호; 7,888,121호; 7,972,854호; 7,914,796호; 7,951,925호; 8,110,379호; 8,409,861호; 미국 특허 공보 20030232410호; 20050208489호; 20050026157호; 20050064474호; 20060063231호; 20080159996호; 201000218264호; 20120017290호; 20110265198호; 20130137104호; 20130122591호; 20130177983호; 20130196373호; 20150056705호 및 20150335708호를 참조하라, 상기 개시들은 그 전체가 참고로서 포함된다.
표적 좌위는 "피난항(safe harbor)" 좌위 가령 AAVS1, HPRT, 알부민 및 인간 세포 내 CCR5 유전자, 및 쥐의 세포 내 Rosa26를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제9,394,545호; 9,222,105호; 9,150,847호; 8,895,264호; 8,771,985호; 8,110,379호; 7,951,925호; 미국 공보 제20100218264호; 20110265198호; 20150056705호 및 20150159172호를 참조하라). 전이유전자의 무작위 통합에 의존하는 고전적인 통합 접근법과 비교할 때, 뉴클레아제-매개 통합은 향상된 전이유전자 발현, 증가된 안전성 및 발현 지속성의 전망을 제공하는데, 왜냐하면 이것이 유전자 침묵화 또는 근위 발암유전자의 활성화의 위험을 최소화하며 정확한 전이유전자 배치를 가능하게 하기 때문이며, 이는 다시 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 단백질의 제공을 가능하게 한다.
전이유전자를 표적 세포에 전달하는 것이 이 기술을 완벽히 실현하기 위해 반드시 극복해야 하는 한 장애물인 반면, 해결해야 하는 또다른 문제는 전이유전자가 세포에 삽입되고 발현된 이후, 그렇게 인코딩된 유전자 산물이 유기체의 필요한 장소에 도달하고, 효과적이기에 충분한 국부 농도로 생산되도록 보장하는 것이다. 단백질의 결핍 또는 비정상적인 비-기능적 단백질의 존재를 특징으로 하는 질환에 있어서, 전이유전자로 인코딩된 야생형 단백질의 송달은 정말 큰 도움이 될 수 있다.
리소좀 저장 질환 (LSD)은 폐 지질, 뮤코다당류 (즉 글리코사미노글리칸 (GAG))의 분해에 일반적으로 관여하는 기능적으로 개별적인 리소좀 단백질의 결여를 특징으로 하는 희귀 대사성 단일유전 질환의 한 군이다. 이들 질환은 세포 내 이들 화합물의 축적을 특징으로 하는데, 이는 특정 효소의 오작용으로 인해 이들을 재활용하는 공정이 불가능하기 때문이다. LSD의 병리생리학은 초기에는 단순한 GAG의 축적에 기인한 것으로 여겨졌으나, 현대 연구는 이들 질환의 복잡성을 이해하는 방향으로 진행되었다. GAG 저장은 세포, 조직 및 장기 항상성의 교란을 일으키는 것으로 보이며, 또한 염증 반응의 활성화를 유도하는 사이토킨 및 염증 조절제의 증가된 분비와 연관되어 있다(Muenzer (2014) Mol Gen Metabol 111:63-72).
가장 흔한 사례는 고세(Gaucher) 질환 (글루코세레브로시다아제 결핍증- 유전자 명칭: GBA), 파브리(Fabry) 질환 (α 갈락토시다아제 A 결핍증: GLA), 헌터 증후군 (MPS II로도 칭함, 이두로네이트 2-설파타제 결핍증: IDS), 헐러 증후군 (MPS IH로도 칭함, 알파-L 이두로니다아제 결핍증: IDUA), 폼페(Pompe) 질환 (알파-글루코시다아제: GAA) 및 니만-피크(Niemann-Pick) 질환 유형 A 및 유형 B (스핑고미엘린 포스포디에스테라제 1 결핍증- SMPD1) 질환이다. 모두 모아서 보면, LSD는 7000명 출생 중에 약 1명의 빈도로 발생한다. 치료 방법은 결여된 효소를 환자에게, 보통 정맥내 주사를 통해 고용량으로 투여하는 효소 보충 요법 (ERT)을 포함한다. 그러한 치료는 증상만 치료할 뿐 치유적이지 않으며, 따라서 환자는 일생 동안 이들 단백질을 반복해서 투여받아야 하며, 잠재적으로는 주입된 단백질에 대해 중화 항체가 생겨날 수 있다.
MPS I는 IDUA (알파-L 이두로니다아제) 결핍과 연관되며 대략 매 100,000명의 출생당 한 회 빈도로 발생한다. IDUA 효소 결핍증은 뇌를 비롯한 여러 장기의 리소좀 내에 GAG의 누적을 야기하며 이는 질환의 임상적 징후를 나타내게 한다. GAG는 뇨, 혈장, 및 조직에서 검출될 수 있고, 질환 진행에 대한 생체마커로서 기능할 수 있다. 이것은 상염색체 열성 장애이며, 하나의 정상 IDUA 유전자 및 하나의 돌연변이 유전자를 가진 이형접합체 개체는 감소된 양의 효소를 생산하나 야생형 유전자로부터 충분한 효소가 만들어지기 때문에 무증상일 수 있다. 환자에 있어서, 헐러 증후군의 증상은 가장 흔하게는 3세부터 8세 사이에 나타나고 척추의 뼈 이상, 갈퀴손, 각막혼탁, 난청, 성장중단, 심장 판막 문제, 경직을 비롯한 관절 질환, 시간이 지나면서 더 심해지는 지적 장애, 및 인중이 짧고 두껍고 거친 얼굴 특징을 포함할 수 있다. 더 중증인 헐러 증후군을 가진 신생아는 태어날 때 정상처럼 보이고 얼굴 징후는 생애 첫 2년 동안 훨씬 더 뚜렷해질 수 있다. 아동기에, 이들은 작은 키로 성장하며 (최대 대략 4피트) 대개 폐쇄성 기도 질환, 호흡기 감염, 또는 심장 합병증으로 10세가 되기 전에 사망한다.
임상적으로, MPS I는 증상을 처음 보고한 의사의 이름을 딴 세 가지 카테고리: 헐러 증후군, 헐러-샤이에 증후군, 및 샤이에 증후군으로 나뉜다. 헐러 증후군은 일반적으로 가장 심각하고 뇌가 영향을 받는 것으로 간주되고; 샤이에 증후군은 가장 '온화한' [또는 약한] 것으로 간주된다. 많은 사람들이 두 가지 사이의 경우에 해당되며 헐러-샤이에라고 지칭된다.
헌터 증후군 (뮤코다당증 유형 II, MPS II)은 기능적 이두로네이트 2-설파타제 효소 (IDS)의 결핍 및 발병 개체 내 글리코사미노글리칸 (GAG)의 연속된 누적에 의해 야기되는 희귀한 X-연관 리소좀 장애이다. 헌터 증후군은 대략 매 100,000 내지 150,000명의 남자 아기 중 한 명 빈도로 발생하며 여성에서는 매우 드물게 발생할 수 있다. MPS II는 가변성, 진행성, 다중장기 장애로, 대부분의 환자에서 증상이 심각하고 어린 연령대에 사망이 발생(10-20세 사이)하지만 더 약한 형태의 장애를 가진 환자에서, 50대 및 60대 생존자가 보고된 바 있다(Wraith 등 (2008) Eur J Pediatr 167:267-277).
임상적으로, 스펙트럼의 중증 극단에 있는 환자는 태어났을 때 정상처럼 보이지만 대개 출생후 18개월에서 36 개월 사이에 재발성 호흡시 감염, 발달 지연, 뻣뻣한 관절 및 고관절 이형성, 재발성 제대 및 서혜부 탈장, 및 MPS II와 연관된 전형적인 얼굴 특징(돌출된 이마, 납작한 콧등, 커진 혀 및 커진 머리)의 발달을 기초로 진단 받는다. 질환이 진행되면, 임상적 징후는 다중-장기화되어, 폐 및 심장 시스템 뿐만 아니라 근골격 시스템 및 CNS에 영향을 미친다. 중증 및 약한 형태의 차이는 주로 신경퇴행 및 정신 장애의 존재로 인해 생긴다.
MPS I 및 MPS II를 위한 표준적인 치료는 $100,000 내지 $500,000로 달라지는 효소 보충 요법 (ERT), 또는 단일 회차에 대략 $200,000의 비용이 드는 조혈모세포 이식 (HSCT), 또는 두 가지의 병행이다. 이들 치료 방법은 그러나 본질적인 단점을 가진다. ERT의 경우, 장기 치료의 일부 연구는 ERT 사용 경과와 삶의 질 저하 사이에 통계적으로 상당한 연관성을 보여주었다(Aronovich 및 Hackett (2015) Mol Gen Metabol 114: 83-93). 추가적으로, ERT는 체세포 질환의 개선을 위해 사용되며(CNS 개입이 없는 경우), 외생적으로 제공된 효소가 혈액 뇌 장벽을 통과하지 못하므로 신경 질환의 치료에는 효과적이지 않다(Muenzer 상기와 동일). HSCT의 경우, HSCT 과정으로 인한 높은 사망률(적어도 10%)이 존재한다(Aronovich 및 Hackett, 상기와 동일). 따라서, CNS 장애를 갖는 가장 심각한 MPS I 및 MPS II 환자는 현재 이용가능한 치료로는 불충분한 대응을 받는 것이다.
따라서, 유전체 편집을 통한 치료, 예를 들면, 전이유전자의 발현이 치료적으로 효과적인 수준이 되도록 유전자 산물을 인코딩하는 전이유전자를 전달하는 치료를 비롯한, MPS I 및 MPS II 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물에 대한 수요가 존재한다.
요약
헐러 (또는 MPS I) 질환을 치료 및/또는 예방 및 헌터 (MPS II) 증후군을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다. 본 발명은 전이유전자 서열을 적절한 표적 세포에 삽입하기 위한 방법을 기술하며 여기서 전이유전자는 질환을 치료하는 단백질 (예컨대, MPS I를 위한 전장 또는 말단이 잘린 IDUA 단백질; MPS II를 위한 전장 또는 말단이 잘린 IDS 단백질), 예를 들면 MPS I 또는 MPS II에서 부족 또는 결핍된 단백질로, IDUA 또는 IDS 전이유전자에 의해 공급되었을 때 MPS I 또는 MPS II를 각각 치료 및/또는 예방하는 단백질을 인코딩한다. 본 발명은 또한 IDUA 또는 IDS 인코딩 전이유전자가 질환을 치료하는(예컨대, 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 경감시키는) 단백질을 발현하도록 하는 발현 시스템을 이용하여 적절한 표적 세포의 형질감염 및/또는 형질도입을 위한 방법을 기술한다. IDUA 또는 IDS 단백질은 이것이 전이유전자를 가지지 않는 다른 세포에 효과를 주거나 흡수될 수 있도록 (방관자 효과 또는 교차 교정) 표적 세포로부터 분비될 수 있다. 본 발명은 또한 높은 수준의 IDUA 또는 IDS를 생산하는 세포 (예컨대, 성숙 또는 미분화 세포)를 생산하기 위한 방법을 제공하며 여기서 이들 변형된 세포의 집단을 환자에게 도입하는 것이 MPS I 또는 MPS II를 치료 및/또는 예방하는데 필요한 단백질을 공급할 것이다. 또한, 본 발명은 고도로 활성인 형태의(치료적인) IDUA 또는 IDS를 생산하는 세포 (예컨대 성숙 또는 미분화 세포)를 생산하기 위한 방법을 제공하며 여기서 환자 내 이들 변형된 세포 집단의 도입, 또는 생성이 MPS I 또는 MPS II 질환을 치료(예컨대, 하나 이상의 증상을 감소 또는 제거)하는데 필요한 단백질을 공급할 것이다.
한 양태에서, 본 명세서에 제공된 것은 뮤코다당증 유형 I (MPS I) 및/또는 뮤코다당증 유형 I (MPS II)를 가진 개체에서 중추신경계 (CNS) 장애를 감소 또는 예방하는 방법이고, 상기 방법은 개체에게 인간 α-L-이두로니다아제 (hIDUA) 및/또는 인간 이두로네이트-2-설파타제 (hIDS)를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 프로모터가 없는 공여 벡터를 투여하는 단계; 및 내생적 알부민 유전자를 표적화하는 한 쌍의 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN)를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 전이유전자는 인코딩된 hIDUA 및/또는 hIDS가 간으로부터 발현되고 분비되도록 알부민 유전자의 절단 후 간 세포 내 알부민 유전자로 통합되고 또한 여기서 간으로부터 분비되는 hIDUA 및/또는 hIDS는 CNS 장애가 감소 또는 예방되도록 개체의 중추신경계 (CNS) (예컨대, 혈액-뇌 장벽을 통과)에서 발견된다. 본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있어서, CNS 장애는 인지 결핍(예컨대, 학습 능력 상실이 미치료 개체에 비해 떨어짐)을 포함하고; 전이유전자(들)은 개체의 뇌에서 글리코사미노글리칸 수준을 조율하며; 및/또는 개체에서 신경세포 또는 교세포 공포형성이 CNS (뇌 및/또는 척수)에서 감소 또는 제거된다. 본 방법은 추가로 공여 벡터 및 발현 벡터의 투여 전 및 후에 개체에게 면역억제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있어서, ZFN의 쌍은 표 1에 나타난 바와 같은 아연 집게 단백질을 포함한다. ZFN 발현 벡터 및/또는 공여 벡터는 정맥내 주사를 비롯한 임의의 방법에 의해 투여될 수 있는 아데노-연관 벡터 (AAV)일 수 있다. 특정한 구체예에서, 개체에게 투여되는 ZFN:ZFN:공여체 비율은 1:1:8이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 세포에서 하나 이상의 교정성 IDUA 또는 IDS 전이유전자를 인코딩하는 전이유전자를 발현시키는 방법을 기술한다. 전이유전자는 교정성 전이유전자에 의해 인코딩된 IDUA 또는 IDS 산물이 세포의 유전체 내에 안정하게 통합되도록 또는, 대안적으로, 전이유전자가 세포 내에서 세포 염색체-바깥에 유지될 수 있도록, 적절한 표적 세포 (예컨대, 혈액 세포, 간세포, 뇌세포, 줄기 세포, 전구 세포, 등)의 유전체 내에 삽입될 수 있다. 한 구체예에서, 교정성 IDUA 또는 IDS 전이유전자는 IDUA 또는 IDS의 시험관 내 생산을 위해 세포주 내에 삽입되고(안정하게 또는 염색체-바깥에), 이러한 (임의로 정제된 및/또는 단리된) 단백질은 이후 MPS I 또는 MPS II 질환을 가지는 개체를 치료(예컨대, MPS I 또는 MPS II 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 제거)하기 위해 개체에게 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 것은 MPS I 또는 MPS II 질환을 가지는 개체를 치료(예컨대, MPS I 또는 MPS II 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 제거)하는 생체외 또는 생체 내 방법이며, 이 방법은 IDUA 또는 IDS 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 방법은 단백질이 MPS I 또는 MPS II 질환을 가진 개체에서 생산되도록, 예를 들면 IDUA 또는 IDS 전이유전자를 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포에 삽입하는 생체 내 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 활성화 발현된 IDUA 및/또는 발현된 IDS는 MPSI 또는 MPS II 질환을 가진 개체 내 내생적 수준의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 또는 그 이상의 백분율에 달한다. 일부 구체예에서, 발현된 활성 IDUA 또는 IDS 효소는 야생형 개체에서 발견되는 효소 수준의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 또는 그 이상의 백분율에 달한다. 다른 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자를 포함하는 단리된 세포는, 예를 들면, MPS I 또는 MPS II 질환을 가진 개체에게 세포를 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 교정성 IDUA 또는 IDS 전이유전자 및/또는 IDUA 또는 IDS를 발현하는 세포는 보충성 단백질이 생체 내에서 생산되도록 이를 필요로 하는 개체에게 삽입된다. 일부 바람직한 구체예에서, 교정성 전이유전자는 개체에서 세포의 유전체 내에 삽입되는 반면, 다른 바람직한 구체예에서, 교정성 전이유전자는 개체의 세포에 삽입되고 세포 내에서 염색체-바깥에 유지된다. 전이유전자는 간, 뇌, 근육, 심장, 폐, 등을 비롯한 다양한 표적 조직에 통합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 어느 한 방법에서, 발현된 IDUA 또는 IDS 단백질은 세포로부터 (예컨대 혈액 내로의 수송을 통해) 분비되어 IDUA 또는 IDS 전이유전자가 결여된 다른 세포에 작용하거나 또는 (예를 들면 만노스 수용체 또는 만노스-6-포스페이트 수용체를 통한 수용체-매개 엔도사이토시스에 의해) 흡수될 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자를 발현하는 세포(예컨대, 간, HSPC 또는 편집된 HSPC에서 유래된 세포)는 IDUA 또는 IDS 단백질을 분비하고 이는 이후 하나 이상의 이차 조직(예컨대, 뇌, 근육, 뼈, 심장, 폐, 비장, 등)에 작용한다. 일부 경우에, 표적 조직(IDUA 또는 IDS 전이유전자를 발현함)은 간이다. 다른 경우에, 표적 조직은 뇌이다. 다른 경우에, 표적은 혈액(예컨대, 맥관구조)이다. 다른 경우에, 표적은 골격근이다. 또다른 경우에, 표적 조직(들)은 질환의 병리생리학의 추가적인 양상을 나타내는 것들(예컨대 심장 판막, 뼈, 관절 조직, 기도 조직 등)이다.
본 명세서에 기술된 어느 한 방법에서, 교정성 IDUA 또는 IDS 유전자는 기능하는 IDUA 또는 IDS 유전자의 야생형 서열(야생형의 기능적 단편 포함)을 포함하는 반면, 다른 구체예에서, 교정성 IDUA 또는 IDS 전이유전자의 서열은 일부 방식으로, 예를 들면 강화된 생물학적 활성을 제공하도록 변형(예컨대, 생물학적 활성을 증가시키기 위해 코돈 최적화 및/또는 IDUA- 또는 IDS-인코딩 서열의 절단)된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 활성 IDUA 또는 IDS 효소를 이를 필요로 하는 MPSI 또는 MPS II 개체에서 생산한다. 발현된 IDUA 및/또는 IDS 효소는 글리코사미노글리칸 (GAG)를 분해할 수 있다. 일부 구체예에서, GAG는 간, 비장, 신, 폐, 심장, 근육 및 뇌를 비롯한 신체의 특정 조직에서 감소된다. 바람직한 구체예에서, 어느 한 조직 내 GAG 수준은 미치료 MPSI 또는 MPS II 개체와 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 또는 그 사이의 임의 수치까지 감소된다.
본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있어서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 뉴클레아제를 이용하여 표적 세포의 유전체 내로 삽입될 수 있다. 적절한 뉴클레아제의 비-제한적인 예시는 아연-집게 뉴클레아제 (ZFN), TALEN (전사 활성화제 유사 단백질 뉴클레아제) 및/또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 포함하며, 이들은 세포의 유전체 내 관심의 영역 (예컨대, 질환 연관 유전자, 고도로-발현된 유전자, 알부민 유전자 또는 다른 또는 피난항 유전자) 내 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 분자 및 하나 이상의 뉴클레아제 도메인 (예컨대, 절단 도메인 및/또는 절단 반쪽-도메인)을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 반쪽 도메인은, 예를 들면, 다양한 제한 엔도뉴클레아제, Cas 단백질 (클래스 1 또는 클래스 2) 및/또는 호밍 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 특정한 구체예에서, 아연 집게 도메인은 알부민 유전자 또는 적혈구 (RBC) 내 글로빈 유전자 내 표적 부위를 인식한다. 예컨대, 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된 미국 공보 제2014001721호를 참조하라. 다른 구체예에서, ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템은 피난-항 유전자, 예를 들면 CCR5 유전자, PPP1R12C (AAV S1로도 공지됨) 유전자, 알부민, HPRT 또는 Rosa 유전자에 결합 및/또는 절단시킨다. 예컨대, 미국 특허 제7,888,121호; 7,972,854호; 7,914,796호; 7,951,925호; 8,110,379호; 8,409,861호; 8,586,526호; 미국 특허 공보 20030232410호; 20050208489호; 20050026157호; 20060063231호; 20080159996호; 201000218264호; 20120017290호; 20110265198호; 20130137104호; 20130122591호; 20130177983호; 20130177960호 및 20140017212호를 참조하라. 뉴클레아제 (또는 이의 성분)는 본 명세서에 기술된하나 이상의 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다(예컨대 Kormann 등, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157를 참조하라). 다른 양태에서, mRNA는 ARCA 캡을 포함할 수 있다(미국 특허 7,074,596호 및 8,153,773호를 참조하라). 추가의 구체예에서, mRNA는 변형되지 않은 및 변형된 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다(미국 특허 공보 20120195936호를 참조하라). 또한 추가적인 구체예에서, mRNA는 WPRE 요소를 포함할 수 있다(미국 특허 출원 62/158,277호를 참조하라).
또 다른 양태에서, 본 발명은 요망되는 IDUA 또는 IDS 전이유전자의 도입을 위해 줄기 또는 전구 세포 (예컨대, 혈액 세포 전구체, 간 줄기 세포, 등)의 유전체를 절단(편집)할 수 있는 조작된 뉴클레아제 단백질을 제공한다. 일부 양태에서, 편집된 줄기 또는 전구 세포는 이후 증폭되고 생체외에서 성숙한 편집된 세포로 분화되도록 유도될 수 있으며, 이후 세포가 환자에게 제공된다. 다른 양태, 편집된 전구체 (예컨대, CD34+ 줄기 세포)는 골수 이식체에 제공되며 이는, 성공적인 이식 후에, 증식하여 편집된 세포를 생산하고 이는 이후 생체 내에서 분화하고 성숙하며 IDUA 또는 IDS 전이유전자로부터 발현된 생물학적 제제를 내포한다. 다른 양태에서, 편집된 줄기 세포는 이후 근육 조직 내로 도입되는 근육 줄기 세포이다. 일부 양태에서, 조작된 뉴클레아제는 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN)이고 다른 양태에서, 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제 (TALEN)이고, 다른 양태에서, CRISPR/Cas 시스템이 사용된다. 뉴클레아제는 질환과 연관된 유전자인 피난항 좌위, 또는 세포에서 고도로 발현되는 유전자에 대해 특이성을 가지도록 조작될 수 있다. 오로지 비-제한적인 예시의 방식으로, 피난항 좌위는 AAVS1 부위, CCR5 유전자, 알부민 또는 HPRT 유전자일 수 있는 반면 질환 연관 유전자는 IDUA 또는 IDS 유전자일 수 있다.
본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있이서, 뉴클레아제 (예컨대, ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)는 프로모터에 임의로 작동가능하도록 연결된 폴리뉴클레오티드 형태, 예를 들면 하나 이상의 뉴클레아제 (또는 이의 성분)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 제공될 수 있다. 한 구체예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 추가의 양태에서, 본 명세서에 기술된 것은 프로모터에 임의로 작동가능하도록 연결된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 IDUA 또는 IDS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 IDUA 또는 IDS 발현 벡터이다. 한 구체예에서, 발현은 바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 것은 하나 이상의 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 IDUA 또는 IDS 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 숙주 세포는 하나 이상의 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 발현 벡터로 안정하게 형질전환되거나 또는 일시적으로 형질주입되거나 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 간 세포이다. 따라서, 본 명세서에 제공된 것은 알부민 유전자의 인트론 1에 통합된 hIUDA 및/또는 hIDS를 인코딩하는 프로모터가 없는 공여 벡터를 포함하는 Hep2G 세포이며, 여기서 hIUDA 및/또는 hIDS는 Hep2G 세포로부터 발현되고 분비된다. 배양 배지가 hIUDA 또는 hIDS를 포함하는 제11항의 Hep2G 세포를 포함하는 세포 배양물이 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 세포로부터 분비 및/또는 세포의 배양 배지로부터 단리된 hIUDA 및/또는 hIDS를 포함하는 약제학적 조성물로서 제공된다.
다른 구체예에서, 임의의 표적 유전자에서 유전체 서열을, 예를 들면 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제 (예컨대, ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 (또는 상기 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 인코딩하는 벡터) 및 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 표적 절단 후 유전자에 삽입되는 "공여체" 서열 또는 IDUA 또는 IDS 전이유전자를 이용하여 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료적 IDUA 또는 IDS 전이유전자로치환하기 위한 방법이 제공된다. 공여체 IDUA 또는 IDS 서열은 뉴클레아제 (또는 이의 성분)를 내포하는 벡터 내에 존재하거나, 별도의 벡터 (예컨대, Ad, AAV 또는 LV 벡터 또는 mRNA)에 존재할 수 있거나 또는, 대안적으로, 상이한 핵산 송달 메커니즘을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 그러한 공여체 뉴클레오티드 서열의 표적 좌위 (예컨대, 고도로 발현되는 유전자, 질환 연관 유전자, 다른 피난-항 유전자, 등)로의 삽입은 표적 좌위(예컨대, 알부민, 글로빈, 등)의 내생적 유전자 제어 요소의 제어 하에 IDUA 또는 IDS 전이유전자의 발현을 야기한다. 일부 양태에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자의, 예를 들면 표적 유전자 (예컨대, 알부민)로의 삽입은, 온전한 IDUA 또는 IDS 단백질 서열의 발현을 야기하고 표적에 의해 인코딩되는 임의의 아미노산(예컨대, 알부민)을 결여시킨다. 다른 양태에서, 발현된 외생적 IDUA 또는 IDS 단백질은 융합 단백질이고 IDUA 또는 IDS 전이유전자에 의해 및 (예컨대, 내생적 표적 좌위로부터 또는, 대안적으로 표적 좌위의 서열을 인코딩하는 전이유전자 상의 서열로부터의) IDUA 또는 IDS 전이유전자가 삽입되는 내생적 좌위에 의해 인코딩되는 아미노산을 포함한다. 표적은 임의의 유전자, 예를 들면, 피난항 유전자 가령 알부민 유전자, AAVS1 유전자, HPRT 유전자; CCR5 유전자; 또는 고도로-발현되는 유전자 가령 RBC 내 글로빈 유전자(예컨대, 베타 글로빈 또는 감마 글로빈)일 수 있다. 일부 경우에, 내생적 서열은 외생적 IDUA 단백질의 아미노 (N)-말단 부분 상에 존재할 것인 반면, 다른 경우에, 내생적 서열은 외생적 IDUA 또는 IDS 단백질의 카르복시 (C)- 말단 부분 상에 존재할 것이다. 다른 경우에, 내생적 서열은 IDUA 외생적 단백질의 N- 및 C-말단 부분 모두에 존재할 것이다. 내생적 서열은 전장 야생형 또는 돌연변이 내생적 서열을 포함할 수 있거나, 대안적으로, 부분적인 내생적 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 내생적 유전자-전이유전자 융합은 세포 내 내생적 좌위에 위치하는 반면 다른 구체예에서, 내생적 서열-전이유전자 암호화 서열은 유전체 내의 또다른 좌위에 삽입된다(예컨대, 알부민, HPRT 또는 CCR5 좌위에 삽입된 IDUA 또는 IDS -전이유전자 서열). 일부 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 치료적 IDUA 또는 IDS 단백질 산물이 세포 (예컨대, 전구 또는 성숙 세포) 내에 보유되도록 발현된다. 다른 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 발현시, 전이유전자 IDUA 또는 IDS 융합이 치료적 단백질의 표면 국재화를 야기하게 되도록 막 단백질의 세포외 도메인에 융합된다. 예컨대, 미국 특허 공보 제20140017212호를 참조하라. 일부 양태에서, 편집된 세포는 추가로 막-관통 단백질을 포함하여 특정한 조직 유형에 세포를 이동시킨다. 한 양태에서, 막-관통 단백질은 항체인 반면, 다른 양태에서, 막-관통 단백질은 수용체이다. 특정한 구체예에서, 세포는 전구세포 (예컨대, CD34+ 또는 조혈모세포) 또는 성숙 RBC이다. 일부 양태에서, 전이유전자 상에서 인코딩되는 치료적 IDUA 또는 IDS 단백질 산물은 세포 밖으로 배출되어 전이유전자가 결여된 세포에 영향을 주거나 흡수된다. 특정한 구체예에서, 세포는 간 세포이며 이는 치료적 IDUA 또는 IDS 단백질을 혈류로 방출하여 원위 조직 (예컨대, 뇌, 심장, 근육, 등)에 작용하게 한다.
본 발명은 또한 모든 환자에게 동종이형 산물로서 보편적으로 사용될 수 있는 MPS I 질환의 치료를 위한 IDUA 또는 IDS 치료적 단백질을 담고 있는 세포(예컨대, RBC)의 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 RBC 담체는 막-관통 단백질을 포함하여 세포의 이동을 도울 수 있다. 한 양태에서, 막-관통 단백질은 항체인 반면, 다른 양태에서, 막-관통 단백질은 수용체이다.
한 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 알부민 좌위로의 삽입 후 알부민 프로모터로부터 발현된다. IDUA 또는 IDS 전이유전자에 의해 인코딩된 생물학적 제제는 전이유전자가 생체 내 간세포로 삽입된 경우 이후 혈류로 방출될 수 있다. 일부 양태에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 정맥내 또는 다른 주사를 통해 바이러스 벡터에서 생체 내 간으로 전달된다.
일부 구체예에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자 공여체는 전이유전자의 에피좀으로 또는 염색체-바깥으로의 유지를 위해 세포 내로 형질주입 또는 형질도입된다. 일부 양태에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자 공여체는 조절 도메인을 포함하는 벡터에 유지되어 전이유전자 공여체의 발현을 조절한다. 추가의 양태에서, 전이유전자 공여체를 포함하는 벡터는 적절한 생체 내 표적 세포로 이동되고, 따라서 전이유전자 공여체에 의해 인코딩되는 IDUA 또는 IDS 치료적 단백질은 전이유전자 공여 벡터가 간세포에 전달된 경우 혈류로 방출된다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 이들 전구세포로부터 유래한 성숙 세포가 전이유전자에 의해 인코딩되는 IDUA 또는 IDS 산물을 높은 수준으로 내포하도록 IDUA 또는 IDS 전이유전자가 삽입된 전구 세포 (조혈모세포, 근육 줄기 세포 또는 CD34+ 조혈모세포 (HSC) 세포)를 기술한다. 일부 구체예에서, 이들 전구세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 형질전환 동물 시스템의 생체 내에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 형질전환 동물은 전이유전자가 인간 IDUA 또는 IDS 단백질을 인코딩하는 모델 개발에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 형질전환 동물은 상응하는 내생적 좌위가 녹아웃될 수 있어, 인간 단백질이 단리되어 연구될 수 있는 생체 내 시스템의 개발을 가능하게 한다. 그러한 형질전환 모델은 소형 분자, 또는 대형 생체분자 또는 관심의 인간 단백질과 상호작용하거나 이를 변형시킬 수 있는 다른 독립체를 확인하는 선별 목적으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, IDUA 또는 IDS 전이유전자는 선택된 좌위(예컨대, 고도로 발현되거나 또는 피난-항)로 줄기 세포(예컨대, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 간 줄기 세포, 중립 줄기 세포 등)로 또는 본 명세서에 기술된 어느 한 방법으로 수득된 인간이-아닌 동물 배아에 통합되고, 이후 배아는 생존 동물이 태어나도록 이식된다. 동물은 이후 성적 성숙 정도까지 성장하고 후손을 생산하게 되며 여기서 후손의 적어도 일부는 통합된 IDUA 또는 IDS 전이유전자를 포함한다.
더욱 추가적인 양태에서, 본 명세서에 제공된 것은 핵산 서열을 염색체, 예를 들면 인간이-아닌 배아의 염색체의의 내생적 좌위 (예컨대, 질환-연관, 고도로 발현되는 가령 간 세포 내 알부민 좌위 또는 RBC 내 글로빈 좌위로 부위 특이적 통합시키기 위한 방법이다. 특정한 구체예에서, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) (i) 적어도 하나의 DNA 벡터, 여기서 DNA 벡터는 통합될 IDUA 또는 IDS를 인코딩하는 핵산 서열의 측면에 위치한 상위 서열 및 하위 서열을 포함함, 및 (ii) 표적 좌위 내 통합 부위를 인식하는 아연 집게, TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 시스템을 인코딩하는 적어도 하나의 RNA 분자를 가지는 인간이-아닌 배아를 주입하는 단계, 및 (b) 배아를 배양하여 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템이 발현되게 하는 단계, 여기서 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 통합 부위로 도입되는 이중 가닥 단절은 상동성 재조합을 통해 DNA 벡터로 수선되어, 핵산 서열을 염색체 내로 통합시킴.
앞선 어느 한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 화합물은 MPS I 또는 MPS II 질환을 가진 개체의 치료를 위한 다른 치료제와 조합될 수 있다. 일부 양태에서, 방법 및 조성물은 혈액 뇌 장벽을 통한 통과를 가능하게 하는 방법 및 조성물과 함께 사용된다. 다른 양태에서, 방법 및 조성물은 개체의 면역 반응을 억제하는 것으로 공지된 화합물과 함께 사용된다.
뉴클레아제 시스템 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 IDUA 또는 IDS 공여체를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트는 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 인코딩하는 핵산, (예컨대 적절한 발현 벡터에 내포된 RNA 분자 또는 ZFN, TALEN, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 인코딩 유전자), 공여체 분자, 단일-가이드 RNA를 인코딩하는 발현 벡터 적절한 숙주 세포주, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서, 등을 포함할 수 있다.
이들 및 다른 양태는 본 개시 전체에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 쉽게 이해될 것이다.
도 1A 및 1B는 표시된 마우스의 군을 마우스 알부민-특이적 ZFN 및 IDUA 공여체로 처리한 후의 결과를 도시한다. 도 1A에서 그래프는 rAAV2/8 마우스 대용체 ZFN 및 hIDUA 공여체로 처리된 마우스의 간에서 투여-후 1 달(왼쪽 패널) 및 4달 (오른쪽 패널) 시점의 ZFN 활성 수준(% 삽입-결실)을 나타낸다. 유전체 DNA를 개별적인 마우스의 간으로부터 단리하였고 ZFN 활성을 ZFN 표적 부위의 마우스 알부민 좌위를 심층서열분석하여 측정하였다. 연구 군 번호가 나열되고, 각각의 개별적인 기호는 언급 시점(부검 시점)의 개별적인 마우스로부터의 데이터를 나타낸다. 수평선은 각각의 군의 중간 ± 표준 편차를 나타낸다. 도 1B에서, IDUA 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체를 rAAV2/8로서 봉입하고 IV를 마우스에 주입하였다. 마우스를 투여-후 1 달(패널 i) 또는 4 달(패널 ii) 시점에 안락사시키고 단백질을 간으로부터 추출하였다. 마우스 간에서의 hIDUA의 발현을 인간-특이적 IDUA 항체를 이용하여 측정하였다. GAPDH는 로딩 대조로서 나타난다.
도 2A 내지 2C는 검출가능한 IDUA 효소 활성을 도시한다. 도 2A는 혈장 내 효소 활성을 도시하는 그래프이다. 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체를 rAAV2/8로서 봉입하고 IV를 마우스에 주입하였다. 혈장을 표시된 날짜에 수확하고 IDUA 효소 활성을 형광분석 어세이로 측정하였다. 데이터는 시점에 따라, 4-8마리 동물/군의 중간 ± SD를 나타낸다. 두-방식 반복-측정 ANOVA 이후에 이어진 Dunnett 다중 비교 시험은 MPS I ZFN+공여체 군이 수컷 동물에 있어서 제14-120일부터, 암컷 동물에 있어서 제28-120일부터 야생형과 상당히 상이했음을 나타내었다. 도 2B는 간 (왼쪽 패널), 혈장 (중간 패널), 비장 (오른쪽 패널), 신 (오른쪽 패널) 및 폐 (오른쪽 패널)에서 제60일까지 측정된 IDUA 활성을 나타낸다. 간, 비장, 신 및 폐 데이터를 도시하는 그래프에서, 가장 왼쪽 막대 (1)는 MPS I 이형접합 마우스를 나타내고, 그 다음 오른쪽 막대 (2)는 미처리 MPS I 동형접합 마우스를 나타내고, 그 다음 오른쪽 막대 (3)는 IDUA 공여체 AAV로만 처리된 MPS I 마우스를 나타내고, 및 가장 오른쪽에 있는 막대 (4)는 공여체 AAV 및 알부민 특이적 ZFN을 포함하는 AAV로 처리된 MPS I 마우스로부터의 데이터를 나타낸다. 도 2C는 1달 (패널 (i)) 또는 4 달 (패널 (ii))시점에 희생된 마우스의 다양한 조직에서 IDUA 활성의 양을 도시하는 두 개의 막대그래프를 가진다. 나타난 군은 다음과 같다: (1 - 가장-왼쪽 막대) 야생형 마우스, 제형화 완충액으로 투여; (2 - 왼쪽에서 두 번째 막대) MPS I 수컷, 제형화 완충액; (3 - 왼쪽에서 세 번째 막대) MPS I 암컷, 제형화 완충액; (4 - 오른쪽에서 세 번째 막대) MPS I 수컷, ZFN + 공여체; (5 - 오른쪽에서 두 번째 막대) MPS I 암컷, ZFN + 공여체; (6 - 가장 오른쪽 막대) MPS I, 공여체 단독.
도 3A 내지 3C는 처리 후 처리된 마우스 내 GAG 수준의 상당한 감소를 도시하는 그래프이다. 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체를 rAAV2/8로서 봉입하고 IV를 마우스에 주입하였다. 표시된 날짜에 뇨를 수집하고 GAG 수준을 Blyscan GAG 어세이에 의해 측정하였다. 도 3A는 처리 후 뇨의 GAG 결과를 나타낸다. 각각의 군에서 가장 왼쪽 막대는 미처리된 MPS I 수컷을 나타내고; 왼쪽에서 두 번째 막대는 미처리된 MPS I 암컷을 나타내고; 오른쪽에서 두 번째 막대는 처리된 MPS I 수컷을 나타내고 가장 오른쪽 막대는 처리된 MPS I 암컷을 나타낸다. 데이터는 시점에 따라, 1-8마리 동물/군의 중간 ± SD를 나타낸다. 도 3B는 처리 1 달 후 (도 3B(i)) 또는 처리 4 달 후 (도 3B(ii)) 시점에 다양한 장기에서 검출된 GAG의 양을 나타낸다. 나타난 군은 상기 도 2B 및 2C에 나타난 것과 동일하다. 도 3C는 처리 후 120일 동안 다양한 군의 뇨에서 검출된 GAG의 양을 나타내는 그래프이다. 처리 군은 도 3B에 나타난 군과 동일하다.
도 4A 내지 4F는 처리된 마우스로부터의 상이한 조직에서 검출된 IDUA 효소 활성의 양을 도시하는 일련의 그래프를 나타낸다. 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체를 rAAV2/8로서 봉입하고 IV를 마우스에 주입하였다. 마우스를 투여-후 4달 시점에 안락사시키고 단백질을 간 및 다른 조직으로부터 추출하였다. IDUA 효소 활성을 형광분석 어세이로 측정하였다. 데이터는 8마리 동물/군의 중간 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. 각각의 대조군 (제형완충액-처리된 MPS I 마우스) (Mann-Whitney 검증). 도 4A는 표시된 군의 간 내 IDUA 활성을 나타낸다. 도 4B는 표시된 군의 비장 내 IDUA 활성을 나타낸다. 도 4C는 표시된 군의 폐 내 IDUA 활성을 나타낸다. 도 4D는 근육 내 IDUA 활성을 나타낸다. 도 4E는 표시된 군의 뇌 내 IDUA 활성을 나타내고 도 4F는 표시된 군의 심장 내 IDUA 활성을 나타낸다.
도 5A 내지 5F는 처리 후 처리된 마우스 내 GAG 수준의 상당한 감소를 도시하는 그래프이다. 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체를 rAAV2/8로서 봉입하고 IV를 마우스에 주입하였다. 마우스를 투여-후 1 및 4달 시점에 안락사시키고 단백질을 간 및 다른 조직으로부터 추출하였다. IDUA 효소 활성을 형광분석 어세이로 측정하였다. 데이터는 8마리 동물/군 중간 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. 각각의 대조군 (제형완충액-처리된 MPS I 마우스) (Mann-Whitney 검증). 도 5A는 표시된 군의 간 내 GAG 수준을 나타낸다. 도 5B는 표시된 군의 비장 내 GAG 수준을 나타낸다. 도 5C는 표시된 군의 폐 내 GAG 수준을 나타낸다. 도 5D는 근육 내 GAG 수준을 나타낸다. 도 5E는 표시된 군의 뇌 내 GAG 수준을 나타내고 도 5F는 표시된 군의 심장 내 GAG 수준을 나타낸다.
도 6A 내지 6D는 투여-후 4달 시점의 인지 능력을 측정한 반즈 미로(Barnes Maze)를 보여주는 일련의 사진들을 나타낸다. 반즈 미로는 40개 구멍을 가진 틀을 포함한다(도 6A). 마우스를 틀에 배치하고 밝은 조명과 함께 위에서 촬영하였다(도 6B). 모든 구멍은 하나를 제외하고 막았으며(도 6C), 이 구멍은 마우스가 빛을 피해 찾게 되는 탈출 구멍이다(도 6D).
도 7A 및 7B는 투여-후 ~4 달까지 반즈 미로 시험을 이용한 인지 능력 검사결과를 도시하는 그래프이다. 데이터는 시험하는 6일 동안 표적 탈출 구멍 (하루 평균 4회 시도)을 동물이 찾는데 걸린 시간의 중간 ± SEM을 나타낸다. 도 7A는 MPS I 수컷, 미처리, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. 야생형; #p<0.05, ###p<0.001 vs. MPS I 수컷, ZFN+ 공여체에 대한 결과를 나타내고; 및 도 7B는 MPS I 암컷, ZFN+공여체 *p<0.05 vs. 야생형; #p<0.05 vs MPS I, 공여체 단독에 대한 결과를 나타낸다(두-방식 반복-측정 ANOVA 이후 Tukey의 다중 비교 시험).
도 8A 내지 8C는 MPS II의 마우스 모델에서 IDS의 발현을 도시한다. 도 8A는 처리-후 1 달 (상단 패널) 또는 4 달 (하단 패널) 시점에 마우스 간에서 인간 IDS의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯이다. IDS에 대응하는 항체를 인간 단백질 (R&D Systems사의 AF2449)에 대응하도록 생성하였고, 로딩 대조는 마우스 GAPDH(Genscript사의 A00191)를 검출하는 대조였다. 도 8B는 처리 후 120일까지 검출된 혈장 내 IDS 효소 활성을 나타내는 그래프이고, 도 8C는 처리 후 4 달에 다양한 조직 내 IDS 효소 활성을 나타내는 막대그래프이다. 도 8C는 다음과 같이 각각의 조직에 대한 처리 군을 나눈 것을 보여주는 그래프이다: (1 - 가장 왼쪽 막대) 야생형, 미처리 마우스; (2 - 왼쪽에서 두 번째 막대) MPS II 마우스, 미처리; (3 - 왼쪽에서 세 번째 막대) MPS II 마우스, ZFN + 공여체 처리, 저용량; (4 - 오른쪽에서 세 번째 막대) MPS II 마우스, ZFN + 공여체 처리, 중간 용량; (5 - 오른쪽에서 두 번째 막대) MPS II 마우스, ZFN + 공여체 처리, 고용량; (6 - 가장 오른쪽 막대) MPS II 마우스, 공여체 처리 단독. 군 내 샘플의 순서는 왼쪽부터 오른쪽으로, 1-6이다. 데이터 유의성이 표시된다.
도 9A 및 9B는 처리 후 4 달에 MPS II 마우스의 표시된 장기 내 GAG 수준을 나타내는 막대그래프이다. 도 9A는 간, 비장, 신 및 폐 내 수준을 도시하는 반면 도 9B는 심장, 근육 및 뇌 내 수준을 도시한다. 별표는 MPS II 미처리 마우스와 비교한 데이터 유의성을 나타낸다. 시험된 군 및 나타난 순서는 도 8C과 동일하다.
도 10은 처리-후 4달에 반즈 미로 시험을 이용한 인지 능력 검사결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 시험하는 6일 동안 표적 탈출 구멍 (하루 평균 4회 시도)을 동물이 찾는데 걸린 시간의 중간 ± SEM을 나타낸다. 별표는 MPS II 미처리 마우스 및 ZFN + 공여체 마우스를 비교한 데이터 유의성을 나타내고, 샵표는 MPS II 미처리 마우스 및 야생형 미처리 마우스를 비교한 유의성을 나타낸다.
도 11A 내지 11D는 알부민-특이적 ZFN 및 IDS 또는 IDUA 공여체로 형질도입된 HepG2 세포 내 IDS 또는 IDUA 활성을 도시하는 그래프이다. SBS#47171, SBS#47931 및 SB-IDS 공여체(IDS), 또는 SBS#47171 및 SBS#47931 단독 (ZFN 단독)으로 형질도입된 HepG2 세포로부터 유래된 네 가지 서브클론을 72시간 상청액 침강 후 hIDS ELISA (도 11A에 나타남) 및 IDS 효소 활성 (도 11B에 나타남) 어세이에 의해 분석하였다. SBS#47171, SBS#47931 및 SB-IDUA 공여체(IDUA), 또는 SBS#47171 및 SBS#47931 단독 (ZFN 단독)으로 형질도입된 HepG2 세포로부터 유래된 세 가지 서브클론을 72시간 상청액 침강 후 hIDUA ELISA (도 11C에 나타남) 및 IDUA 효소 활성 (도 11D에 나타남) 어세이에 의해 분석하였다. 데이터는 세 가지 독립적인 상청액의 중간 ± SD를 나타낸다.
도 12A 내지 도 12I는 알부민 좌위에서 일어날 수 있는 IDS 공여체 ("SB-IDS") 또는 IDUA ("SB-IDUA")의 통합 유형 및 네 가지 IDS 및 세 가지 IDUA 서브클론에서 관찰된 결과를 나타낸다. NHEJ (도 12A) 또는 HDR (도 12B)에 의한 인간 알부민 좌위에서의 SB-IDS 통합 현상이 각각의 특이적 시약 (프라이머 및 탐침) 및 결합 부위와 함께 나타난다. 도 12C는 모든 서브클론에 대한 Taqman® 데이터를 요약한 표이다. 괄호 안의 숫자는 총 3 차례의 어세이 반복 중 Taqman® 어세이에서의 표시된 통합 방식에 대해 클론이 양성 또는 음성으로 점수매겨진 횟수를 나타낸다. 도 12D는 주된 통합 방식을 나타내는, 모든 서브클론에 대한 생어(Sanger) 서열분석 데이터를 요약한 표이다. N.A. = 해당없음. NHEJ (도 12E 및 12H) 또는 HDR (도 12F)에 의한 인간 알부민 좌위에서의 SB-IDUA 통합 현상은 또한 예상된 밴드 크기를 나타낸다. 도 12G는 표시된 서브클론에 대한 Taqman® 데이터를 요약한 표이다. 도 12I는 클론 21에 대한 IDUA, 클론 25에 대한 NHEJ 및 클론 30에 대한 NHEJ의 젤 확인 HDR 통합을 나타낸다.
도 13은 IDS가 형질도입된 간에서 생산되고 이후 흡수되어 나중에 최종 성숙 단백질 내로 처리되는 과정을 보여주는 도식이다.
도 14A 및 14B는 초기 간세포 내 HepG2 서브클론으로부터 분비된 IDS가 흡수되는 것을 나타낸다. 도 14A는 IDS 단백질이 성숙되는 동안의 상이한 단백질 형태를 나타내고 초기 간세포 배양물에 HepG2 상청액을 부가하기 위한 과정을 나타낸다. 도 14B는 성숙 형태 (45 kDa)의 생성 도중 전장 폴리펩티드 (90 kDa)의 처리를 설명하는, HepG2 클론 ("혼합물" 및 55) 상청액 및 펠렛에서 검출되는 IDS의 형태, 및 초기 간세포 펠렛에서 검출되는 형태를 도시하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 또한 항존(housekeeping) 단백질 (α-GAPDH)의 로딩 대조 뿐만 아니라 상청액으로부터의 IDS 업데이트 후 초기 간세포 펠렛 내 IDS 활성이 나타난다.
도 15A 내지 15D는 HepG2 서브클론에서 생산된 IDS 또는 IDUA 상의 당화 패턴을 조사한 것을 설명한다. 도 15A는 상이한 종류의 당화 패턴 및 탈당화에 사용되는 글리코시다아제의 기질 특이성을 나타낸다(Lee 등 (2009) Nat Protoc. 4(4):592-604으로부터 변형됨). 도 15B 및 15C는 HepG2 클론에서 생산된 IDS 단백질을 조사하는 항-IDS 항체를 이용한 웨스턴 블롯이고 여기서 도 15B는 세포 상청액에서 발견되는 단백질을 나타내는 반면 도 15C는 글리코시다아제 PNGaseF 및 Endo H로 처리한 후 세포 펠렛 내 단백질을 나타낸다. PNGase F로의 처리는 모든 올리고다당류 사슬을 제거하며, 이는 설명된 것처럼 "비-당화 hIDS"를 생성하였다. HepG2 펠렛 웨스턴 블롯에 있어서, HSP90는 로딩 대조 '혼합물' = 2가지 상이한 IDS 서브클론으로 이루어진 혼합된 HepG2 IDS 집단으로 나타난다. '클론 55' = HepG2 IDS 서브클론 #55. '대조' = IDS 대신 IDUA를 갖는 HepG2 서브클론, 음성 대조로서 알부민 좌위에 통합된 것. 'kDa' = 킬로달톤 (분자량 마커). 도 15D는 시판되는 hIDUA (Alsurazyme® 및 R&D Systems IDUA)에 비해 생산된 hIDUA의 당화 패턴을 조사하기 위해 항-IDUA 항체를 이용한 웨스턴 블롯 (상단 패널은 암노출을 나타내고 하단 패널은 광노출을 나타냄)을 보여준다. 전과 같이, 효소는 PNGase F, Endo H로 처리하거나 처리 없이 두었다.
도 16A 내지 16D는 HepG2 세포 (도 16A) 또는 K562 세포 (도 16B)에 의한 IDS의 흡수에 대해 부가된 만노스-6-포스파아제 (M6P)의 효과 및 K562 세포에 의해 생산된 IDUA의 흡수의 그래프(도 16C)를 나타낸다. 도 16D는 만노스-6-포스페이트를 이용한 표적 세포의 처리의 흡수에 대한 효과를 보여주는 도식이다. 도시된 데이터는 M6P로 처리되거나 처리 없이 둔 세포를 나타낸다. 도 16A 및 16B에서, 각각의 3-원 군, 샘플은 왼쪽부터 오른쪽으로 다음과 같이 나타난다: 가장 왼쪽 막대 - 미처리된 HepG2 세포로부터의 조건화 배지로의 처리를 포함하는 대조; 중간 막대 - HepG2-IDS 클론 8로부터의 조건화 배지로 처리된 세포; 오른쪽 막대 - HepG2-IDS 클론 15로부터의 조건화 배지로 처리된 세포. 각각의 시점에서, M6P로 처리된 세포가 표시된다. 표시된 기간 후에, 세포의 펠렛을 수확하고 이후 IDS 활성에 대해 분석하였다. 두 조건의 비교는 M6P가 당화된 IDS 단백질의 흡수를 저해하였음을 설명한다. 도 16C는 미처리된 HepG2 세포 또는 IDUA 공여체를 가지는 HepG2 세포 (IDUA 클론 번호 25)로부터 수득된 조건화 배지 내에 배양된 K562 세포에 의한 IDUA 흡수를 도시한 것이다. 도 16D는 만노스-6-포스페이트 (M6P)를 이용한 세포 처리의 효과를 나타내는 도식으로, 도 16A-16C에서 M6P 처리가 어떻게 효소 흡수를 차단하고, 세포에서 검출가능한 IDUA의 양을 감소시켰는지 설명한다.
도 17A 및 17B는 처리된 및 미처리된 야생형 및 MPS I & II 마우스의 뇌에서의 데르마탄 설페이트 (왼쪽 패널) 및 헤파란 설페이트 (오른쪽 패널) 수준의 분석을 도시한다. 도 17A는 도 3B(ii), 컬럼의 가장 왼쪽 세트에서 분석된 마우스에 해당한다. 도 17B는 도 9B, 컬럼의 가장 오른쪽 세트에서 분석된 마우스에 해당한다.
상세한 설명
MPS I 또는 MPS II 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다. 본 발명은 유전자가 개체의 하나 이상의 세포 및/또는 조직의 생체 내에서 발현되게 하도록, MPS I 또는 MPS II 질환을 가진 개체에서 결핍되거나 불충분하게 발현되는 단백질을 인코딩하는 유전자의 삽입하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 유전자는 표적 조직 (예컨대, 간)에서 발현될 뿐만 아니라 표적 조직으로부터 분비될 수 있고 이것은 이차 세포 및 조직 (예컨대, 비장, 폐, 심장, 근육, 뇌, 등)에서 기능한다. 본 발명은 또한 세포가 높은 수준의 치료제를 생산하도록 하고 이들 변형된 세포 집단의 환자로의 도입이 필요한 단백질을 공급하게 하는 세포 (예컨대, 전구체 또는 성숙 RBC, iPSC 또는 간 세포)의 개조를 기술한다. 전이유전자는 이를 필요로 하는 환자에서 치료적으로 유익한 요망되는 단백질 또는 구조적 RNA를 인코딩할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 MPS I 또는 MPS II 질환에서 결핍된 효소를 대체하도록 전이유전자로부터 치료적으로 유익한 MPS I 및/또는 MPS II 단백질을 임의의 좌위 (예컨대, 고도로 발현되는 알부민 좌위)로부터 발현시키도록 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 간 세포와 같은 세포 내 고도로-발현되는 좌위 내로 전이유전자 서열을 삽입함으로써 MPS I 및/또는 MPS II 질환을 치료(가령 하나 이상의 증상을 경감)하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
또한, 전이유전자는 환자 유래 세포, 예컨대 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 또는 필요시 이식에 사용하기 위한 다른 유형의 줄기 세포 (배아 또는 조혈세포) 내에 도입될 수 있다. 특히 유용한 것은 이를 필요로 하는 환자에게 이식하기 위한 조혈모세포 내에 치료적 전이유전자를 삽입하는 것이다. 줄기 세포가 성숙 세포로 분화하면서, 이들은 조직으로 송달할 높은 수준의 치료적 단백질을 내포하게 된다.
일반
본 명세서에 개시된 방법의 실시, 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 달리 지시되지 않는 한, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당해 분야의 기술이 속하는 바와 같은 연관 분야의 통상적일 기술을 이용한다. 이들 기술은 문헌에 충실히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook 등 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 3판, 2001; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 개편본; 시리즈 METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 3판, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, 304권, "Chromatin" (P.M. Wassarman 및 A. P. Wolffe, 발행), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 119권, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, 발행) Humana Press, Totowa, 1999를 참조하라.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며 선형 또는 환형 형태, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 가리킨다. 본 개시의 목적에 있어서, 이들 용어는 중합체의 길이에 관해 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 이들 용어는 자연적인 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예컨대, 포스포로티오에이트 백본)이 변형된 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 형성 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기-쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 중합체를 가리킨다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 화학적 유사체이거나 또는 상응하는 자연-발생적 아미노산의 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이(예컨대, 단백질 및 핵산 사이)의 서열-특이적, 비-공유적 상호작용을 가리킨다. 상호작용이 전체적으로 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 구성성분이 서열-특이적(예컨대, DNA 백본 내 포스페이트 잔기와 접촉)일 필요는 없다. 그러한 상호작용은 일반적으로 10-6 M-1 또는 그 미만의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화성"은 결합의 강도를 가리키며: 증가된 결합 친화성은 더 낮은 Kd와 연관된다.
"결합 단백질"은 또다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들면, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 그 자체에 결합(하여 동종이합체, 동종삼합체, 등을 형성)할 수 있고 및/또는 이것은 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 초과의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, 아연 집게 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가질 수 있다.
"아연 집게 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 아연 집게를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 집게 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 집게 단백질 또는 ZFP로 축약된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 이 반복 도메인은 TALE의 이의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" (또한 "반복체"로도 지칭됨)는 전형적으로 33-35개 아미노산 길이이고 자연발생적 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 부분적인 서열 상동성을 나타낸다. 예컨대, 미국 특허 제8,586,526호를 참조하라.
아연 집게 및 TALE 결합 도메인은 예를 들면 자연발생적 아연 집게 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산의 개조)을 통해 "조작되어" 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있다. 그러므로, 조작된 DNA 결합 단백질 (아연 집게 또는 TALE)은 비-자연발생적 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하기 위한 방법의 비-제한적인 예시는 설계 및 선별이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 이들의 설계/조성이 합리적 기준으로부터 원리적으로 생성된 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적 기준은 치환 법칙 및 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보에서 정보를 처리하기 위한 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제 8,568,526호; 6,140,081호; 6,453,242호; 및 6,534,261호를 참조하라; 또한 WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496호를 참조하라.
"선택된" 아연 집게 단백질 또는 TALE은 이들의 생산이 주로 실험적 과정 가령 파지 전시, 상호작용 덫(trap) 또는 하이브리드 선별로부터 생성된, 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예컨대 미국 특허 제8,586,526호; 5,789,538호; 5,925,523호; 6,007,988호; 6,013,453호; 6,200,759호; 및 WO 95/19431호; WO 96/06166호; WO 98/53057호; WO 98/54311호; WO 00/27878호; WO 01/60970호; WO 01/88197호 및 WO 02/099084호를 참조하라.
"재조합"은 두 폴리뉴클레오티드 사이에 유전적 정보가 교환되는 과정을 가리킨다. 본 개시의 목적에 있어서, "상동성 재조합 (HR)"은, 예를 들면, 상동성-지정 수선 메커니즘을 통해 세포에서 이중-가닥 단절을 수선하는 도중 일어나는 그러한 교환의 특화된 형태를 가리킨다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 단절이 발생한 분자)의 주형 수선을 위해 "공여체" 분자를 이용하고, 및 이것이 표적에게 공여체로부터의 유전적 정보의 전달을 야기하기 때문에 "비-교차 유전자 전환" 또는 "짧은 회로 유전자 전환"으로서 다양하게 공지되어 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 그러한 전이는 손상된 표적 및 공여체 사이에 형성되는 이형이중가닥 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 공여체가 표적의 일부가 될 유전적 정보를 재-합성하기 위해 사용되는 "합성-의존성 가닥 어닐링", 및/또는 연관 과정을 포함할 수 있다. 그러한 특화된 HR은 흔히 공여체 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 모든 서열이 표적 폴리뉴클레오티드 내에 포함되도록 표적 분자의 서열의 개조를 일으킨다.
본 개시의 방법에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적화 뉴클레아제는 표적 서열 (예컨대, 세포 염색질)에서 소정의 부위에 이중-가닥 단절을 만들고, 단절된 영역 내 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성을 가지는 "공여체" 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입될 수 있다. 이중-가닥 단절의 존재는 공여체 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 공여체 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나 또는, 대안적으로, 공여체 폴리뉴클레오티드는 상동성 재조합을 통해 단절의 수선을 위한 주형으로서 사용되며, 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 공여체 내에서처럼 세포 염색질 내로 도입시킨다. 따라서, 세포 염색질 내 제1 서열은 변형될 수 있고, 특정 구체예에서, 공여체 폴리뉴클레오티드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "대체" 또는 "교체"의 사용은 한 뉴클레오티드 서열의 또다른 서열로의 교체(즉, 정보적 의미에서의 서열 교체)를 나타내는 것으로 이해될 수 있고 한 뉴클레오티드 서열의 또다른 서열로의 물리적 또는 화학적 치환을 반드시 필요로 하지 않는다.
본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있어서, 아연-집게 또는 TALEN 단백질의 추가적인 쌍은 세포 내의 추가적인 표적 부위의 추가적인 이중-가닥 절단을 위해 사용될 수 있다.
세포 염색질의 관심의 영역 내 서열의 표적화 재조합 및/또는 교체 및/또는 개조를 위한 방법의 특정한 구체예에서, 염색체 서열은 외생적 "공여체" 뉴클레오티드 서열을 이용한 상동성 재조합에 의해 변형된다. 그러한 상동성 재조합은 단절 영역에 대해 상동적인 서열이 존재하는 경우, 세포 염색질 내 이중-가닥 단절의 존재에 의해 촉진된다
본 명세서에 기술된 어느 한 방법에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열 ("공여체 서열")은 관심의 영역 내 유전체 서열에 대해 동일하진 않지만 상동적인 서열을 내포하여, 이를 통해 관심의 영역 내 비-동일한 서열을 삽입하는 상동성 재조합을 촉진할 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 관심의 영역 내 서열에 상동적인 공여체 서열의 비율은 교체되는 유전체 서열에 대해 약 80 내지 99% (또는 그 사이의 임의의 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 구체예에서, 공여체 및 유전체 서열 사이의 상동성은, 예를 들면 100개가 넘는 연접한 염기 쌍의 공여체 및 유전체 서열 사이에 단 1개의 뉴클레오티드만 상이한 경우 99%를 초과한다. 특정한 경우에, 공여체 서열의 비-상동성 부분은 신규한 서열이 관심의 영역 내로 도입되도록, 관심의 영역 내에 존재하지 않는 서열을 내포할 수 있다. 이들 경우에, 비-상동성 서열은 일반적으로 관심의 영역 내 서열에 상동성이거나 동일한 50-1,000 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 중간 수치) 또는 1,000을 초과하는 임의 수의 염기 쌍의 서열의 측면에 위치한다. 다른 구체예에서, 공여체 서열은 제1 서열에 대해 비-상동성이고, 비-상동성 재조합 메커니즘에 의해 유전체에 삽입된다.
본 명세서에 기술된 어느 한 방법은 관심의 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여체 서열의 표적화 통합에 의해 세포 내 하나 이상의 표적 서열을 부분적 또는 완전하게 비활성화하기 위해 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 유전자를 가지는 세포주가 또한 제공된다.
게다가, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적화 통합 방법은 또한 하나 이상의 외생적 서열을 통합시키기 위해 사용될 수 있다. 외생적 핵산 서열은, 예를 들면, 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 임의 유형의 암호화 또는 비-암호화 서열, 뿐만 아니라 하나 이상의 제어 요소(예컨대, 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외생적 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자 (예컨대, 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 저해 RNA (RNAi), 마이크로RNA (miRNA), 등)를 생산할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유적 백본이 깨지는 것을 가리킨다. 절단은 이에 제한되지 않지만, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 비롯한 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단이 모두 가능하며, 이중-가닥 절단은 두 가지 별개의 단일-가닥 절단 현상의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 접착성 말단의 생성을 야기할 수 있다. 특정한 구체예에서, 융합 폴리펩티드가 표적화 이중-가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.
"절단 반쪽-도메인"은 제2 폴리펩티드 (동일하거나 상이한)와 함께 절단 활성 (바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 반쪽-도메인", "+ 및 - 절단 반쪽-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 반쪽-도메인"은 상호교환적으로 사용되며 이량체를 이루는 절단 반쪽-도메인의 쌍을 가리킨다.
"조작된 절단 반쪽-도메인"은 또다른 절단 반쪽-도메인 (예컨대, 또다른 조작된 절단 반쪽-도메인)과 편성(obligate) 이종이합체를 형성하도록 변형된 절단 반쪽-도메인이다. 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함되는, 미국 특허 제7,888,121호; 7,914,796호; 8,034,598호 및 8,823,618호를 참조하라.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 가리키며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 환형 또는 분지형일 수 있고 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여체 서열"은 유전체 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들면 2 내지 10,000 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이 또는 그 이상의 임의의 정수 수치), 바람직하게는 약 100 내지 1,000 뉴클레오티드 길이 (또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 약 200 내지 500 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
"질환 연관 유전자"는 단일유전 질환에서 어떤 방식으로든 결함이 있는 유전자이다. 단일유전 질환의 비-제한적인 예시는 중증 복합 면역결핍증, 낭성 섬유증, 리소좀 저장 질환 (예컨대 고세, 헐러 헌터, 파브리, 니만-피크(Neimann-Pick), 테이-삭스(Tay-Sach) 등), 겸상적혈구 빈혈, 및 지중해성 빈혈을 포함한다.
"혈액 뇌 장벽"은 순환하는 혈액을 중추신경계의 뇌로부터 분리하는 고도로 선택적인 투과성 장벽이다. 혈액 뇌 장벽은 혈액 용질의 통과를 제한하는 CNS 혈관에서 밀착 연접에 의해 연결된 뇌 내피 세포에 의해 형성된다. 혈액 뇌 장벽은 오랫동안 대형 분자 치료제의 흡수를 막고 대부분의 소형 분자 치료제의 흡수를 막는 것으로 생각되어 왔다 (Pardridge (2005) NeuroRx 2(1): 3-14).
"염색질"은 세포의 유전체를 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 비롯한 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵세포 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 핵심은 각각 두 개씩의 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 포함하는 옥타머와 연관된 대략 150 염기 쌍의 DNA를 포함하고; 및 링커 DNA (유기체에 따라 길이 달라짐)가 뉴클레오솜 핵심 사이를 연장한다. 히스톤 H1 분자가 일반적으로 링커 DNA와 연관된다. 본 개시의 목적에 있어서, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질, 원핵세포성 및 진핵세포성 둘다를 포괄하는 것으로 의도된다. 세포 염색질은 염색체 및 부체의 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"는 세포 유전체의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 유전체는 흔히 이의 핵형에 의해 특징지어지며, 이는 세포의 유전체를 포함하는 모든 염색체의 집합이다. 세포의 유전체는 하나 이상의 염색체를 포함한다.
"부체"는 복제하는 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 기타 구조이다. 부체의 예시는 플라스미드 및 특정 바이러스 유전체를 포함한다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다는 전제하에 결합 분자가 결합하게 될 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열이다.
"외생적" 분자는 일반적으로는 세포에 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포에 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내에 일반적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경적인 조건을 감안하여 결정된다. 따라서, 예를 들면, 태아의 근육 발달 동안만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 있어서 외생적 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도되는 분자는 열-충격을 받지 않은 세포에 있어서 외생적 분자이다. 외생적 분자는, 예를 들면, 제대로 기능하지 못하는 내생적 분자의 정상기능 버전 또는 정상적으로-기능하는 내생적 분자의 불량 버전을 포함할 수 있다.
외생적 분자는 무엇보다도, 가령 조합적 화학 과정에 의해 생성된 소형 분자, 또는 거대분자 가령 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 리포단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체 일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 환형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 이중복합체를 형성할 수 있는 핵산, 뿐만 아니라 삼중복합체-형성 핵산을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제5,176,996호 및 5,422,251호를 참조하라. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 개조 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸화효소, 탈메틸효소, 아세틸화효소, 탈아세틸효소, 키나아제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가아제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
외생적 분자는 내생적 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있고, 예컨대, 외생적 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들면, 외생적 핵산은 감염성 바이러스 유전체, 세포에 도입된 플라스미드 또는 부체, 또는 세포에 일반적으로는 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포로 외생적 분자를 도입하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 지질-매개 전이 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 비롯한 리포좀), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 유전자총, 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 전이 및 바이러스 벡터-매개 전이를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 외생적 분자는 또한 내생적 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 세포가 유래된 종과 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 인간 핵산 서열은 본래 마우스 또는 햄스터에서 유래한 세포주로부터 도입될 수 있다.
대조적으로, "내생적" 분자는 특정한 환경적인 조건 하에 특정한 발달 단계에 있는 특정한 세포에 일반적으로 존재하는 분자이다 예를 들면, 내생적 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 기관의 유전체, 또는 자연-발생적 부체의 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내생적 분자는 단백질, 예를 들면, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 둘 이상의 소단위 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 소단위 분자는 동일한 화학 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학 유형의 분자일 수 있다. 융합 분자의 예시는 융합 단백질 (예를 들면, 단백질 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 사이의 융합), 절단 도메인과 작동가능하게 연관된 폴리뉴클레오티드 DNA-결합 도메인 (예컨대, sgRNA) 사이의 융합, 및 융합 핵산 (예를 들면, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 세포로의 융합 단백질의 송달 또는 세포로의 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 송달에 의해 야기될 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 전사되고, 전사물은 번역되어, 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 결찰이 또한 세포에서 단백질의 발현에 관여될 수 있다. 세포로 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 송달하기 위한 방법은 본 개시의 다른 부분에 제시된다.
본 개시의 목적에 있어서, "유전자"는 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역(하기 참조), 뿐만 아니라 그러한 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접했느냐와 상관없이 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열 가령 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 침입 부위, 인핸서, 사일랜서, 절연체(insulator), 경계 요소, 복제 개시점, 기질 부착 부위 및 좌위 제어 영역을 포함하지만, 반드시 이에 제한되지 않는다.
"유전자 발현"은 유전자에 내포된 정보가, 유전자 산물로 전환되는 것을 가리킨다. 유전자 산물은 유전자(예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA)의 직접 전사 산물 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들면, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 당화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조율"은 유전자 활성의 변화를 가리킨다. 발현의 조율은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 유전체 편집 (예컨대, 절단, 개조, 비활성화, 무작위 돌연변이)은 발현을 조율하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 비활성화는 본 명세서에 기술된 바와 같은 ZFP 또는 TALEN을 포함하지 않는 세포에 비해 유전자 발현이 임의로 감소되는 것을 가리킨다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"관심의 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 가령, 예를 들면, 유전자 또는 유전자 내부 또는 이에 인접한 비-암호화 서열이며, 여기서 이것이 외생적 분자에 결합하는 것이 요망된다. 결합은 표적화 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은 예를 들면 염색체, 부체, 기관의 유전체 (예컨대, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 유전체 내에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 암호화 영역 내부, 전사되는 비-암호화 영역 가령, 예를 들면, 선도 서열, 비번역(trailer) 서열 또는 인트론 내부, 또는 암호화 영역 상류 또는 하류의 비-전사 영역 내부에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작거나 또는 최대 2,000 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 임의의 중간 수치의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포 (가령 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포 (예컨대, T-세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"적혈구"(RBC) 또는 적혈구(erythrocyte)는 조혈모세포에서 유래하여 최종적으로 분화된 세포이다. 이들은 뉴클레아제 및 대부분의 세포 기관이 없다. RBC는 폐부터 말초 조직까지 산소를 운반하는 헤모글로빈을 내포한다 실제로, 개별적인 RBC의 33%는 헤모글로빈이다. 이들은 또한 조직 바깥의 대사 도중 세포에 의해 발생된 CO2를 운반하여 숨을 내쉬는 동안 배출하기 위해 폐로 돌려보낸다. RBC는 신장에 의한 에리트로포이에틴 (EPO)의 방출에 의해 매개되는 혈액 저산소증에 대한 대응으로 골수에서 생성된다. EPO는 전기 적혈구모세포의 수 증가를 야기하고 완전한 RBC 성숙을 위해 필요한 시간을 단축시킨다. 대략 120일 후, RBC가 핵 또는 임의의 다른 재생 능력을 보유하지 않기 때문에, 세포는 간, 비장 및 림프절 내 대식 세포의 식세포 활성 (~90%) 또는 혈장 내 용혈 (~10%)에 의해 순환계로부터 제거된다. 대식 세포 포획 후, RBC의 화학 성분은 대식 세포의 공포 내에서 리소좀 효소의 작용으로 인해 분해된다.
"분비 조직"은 개별적인 세포로부터 전형적으로 상피에서 유래하는 일부 유형의 내강으로 산물을 분비하는 동물의 조직이다. 위장관에 위치하는 분비 조직의 예시는 소화관, 췌장, 및 쓸개를 연결하는 세포를 포함한다. 다른 분비 조직은 간, 눈과 연관된 조직 및 점막 가령 침샘, 유선, 전립선, 뇌하수체 및 내분비 시스템의 다른 구성원을 포함한다. 추가적으로, 분비 조직은 분비할 수 있는 조직 유형의 개별적인 세포를 포함한다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하도록 연결된")은 상호교환적으로 사용되며 둘 이상의 성분 (가령 서열 요소)의 병렬을 가리키고, 여기서 성분들은 모든 성분이 정상적으로 기능하고 적어도 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 영향을 주는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예시의 방식으로, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어하는 경우 전사 조절 서열, 가령 프로모터는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 cis로 작동적으로 연결되지만, 반드시 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들면, 인핸서는 비록 연접해있지 않지만 암호화 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드에 있어서, 용어 "작동적으로 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분과 연결되어 마치 그렇게 연결되지 않은 것처럼 동일한 기능을 수행하는 사실을 가리킬 수 있다. 예를 들면, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드에 있어서, 만일 이 융합 폴리펩티드에서, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 활성화 도메인은 유전자 발현을 상향-조절할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 작동적으로 연결된 것이다. ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드의 경우, 만일 이 융합 폴리펩티드에서, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 절단 도메인은 표적 부위의 근위에서 DNA를 절단할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동적으로 연결된 것이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 이의 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지 않지만, 여전히 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 상응하는 자연적인 분자보다 많거나, 적거나, 또는 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고, 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 내포할 수 있다. 핵산의 기능을 확인하기 위한 방법(예컨대, 암호화 기능, 또다른 핵산에 대한 혼성화 능력)은 당해 분야에 널리-공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 확인하기 위한 방법이 널리-공지되어 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은 예를 들면, 필터-결합, 전기영동 이동성-변화, 또는 면역침강 어세이에 의해 확인될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동으로 분석될 수 있다. Ausubel 등, 상기와 동일을 참조하라. 또다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예를 들면, 동시-면역침강, 유전적 및 생화학적인 두 가지-하이브리드 어세이 또는 상보성에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, Fields 등 (1989) Nature 340:245-246; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/44350호를 참조하라.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포에 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구조체", "발현 벡터", 및 "유전자 전이 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝, 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 필수적이진 않지만 통상적 어세이로 쉽게 측정되는 단백질 산물을 생산하는 임의의 서열을 가리킨다. 적절한 리포터 유전자는 항생제 저항성 (예컨대, 암피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 퓨로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 인코딩하는 서열, 발색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라아제)을 인코딩하는 서열, 및 세포 성장 강화 및/또는 유전자 증폭 (예컨대, 디하이드로폴레이트 환원효소)을 매개하는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에피토프 태그는, 예를 들면, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 복제물을 포함한다. "발현 태그"는 관심의 유전자의 발현을 관찰하기 위해 요망되는 유전자 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있는 리포터를 인코딩하는 서열을 포함한다.
용어 "개체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 포유동물 가령 인간 환자 및 인간이-아닌 영장류, 뿐만 아니라 실험 동물 가령 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스, 및 다른 동물을 가리킨다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 용어 "개체" 또는 "환자"는 본 발명의 변형된 세포 및/또는 본 발명의 변형된 세포에 의해 생산된 단백질이 투여될 수 있는 임의의 포유류 환자 또는 개체를 의미한다. 본 발명의 개체는 LSD (MPS I) 및/또는 MPSII 장애를 가진 부류를 포함한다.
뉴클레아제
본 명세서에 기술된 방법은 IDUA 또는 IDS 전이유전자의 표적화 도입을 위한 하나 이상의 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 뉴클레아제의 비-제한적인 예시는 전이유전자를 담은 공여체 분자의 생체 내 절단을 위해 유용한 ZFN, TALEN, 호밍 엔도뉴클레아제, CRISPR/Cas 및/또는 Ttago 가이드 RNA, 및 전이유전자가 표적화 방식으로 유전체 내로 통합되도록 세포의 유전체를 절단하기 위한 뉴클레아제를 포함한다. 특정한 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 자연발생적이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 비-자연발생적, 즉, DNA-결합 분자 (또한 DNA-결합 도메인으로 지칭됨) 및/또는 절단 도메인에서 조작된 것이다. 예를 들면, 자연-발생적 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위에 결합하도록 변형될 수 있다(예컨대, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된 ZFP, TALE 및/또는 CRISPR/Cas의 sgRNA). 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인 (예컨대, 아연 집게 뉴클레아제; TAL-이펙터 도메인 DNA 결합 단백질; 이종 절단 도메인을 가지는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다. 다른 구체예에서, 뉴클레아제는 Ttago 시스템의 CRISPR/Cas와 같은 시스템을 포함한다.
A. DNA-결합 도메인
특정한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 공여체 분자에 대한 결합 및/또는 세포의 유전체 내 관심의 영역에 대한 결합을 위한 메가뉴클레아제 (호밍 엔도뉴클레아제) DNA-결합 도메인을 이용한다. 자연-발생적 메가뉴클레아제는 15-40 염기-쌍 절단 부위를 인식하며 보통 네 개의 패밀리: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리로 나뉜다. 예시적인 호밍 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; Belfort 등 (1997) Nucleic AcidsRes.25:3379-3388; Dujon 등 (1989) Gene 82:115-118; Perler 등 (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조하라.
특정한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 조작된 (비-자연발생적인) 호밍 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제)를 포함하는 뉴클레아제를 이용한다. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제 가령 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujon 등 (1989) Gene 82:115-118; Perler 등 (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조하라. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-자연적인 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, Chevalier 등 (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth 등 (2006) Nature 441:656-659; Paques 등 (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공보 제20070117128호를 참조하라. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 뉴클레아제의 맥락에서 전체로서(즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 변형될 수 있거나 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에서 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연발생적 또는 조작된 (비-자연발생적) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예컨대, 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된 미국 특허 제8,586,526호를 참조하라. 산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 식용 식물에 많은 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 산토모나스의 병원성은 25가지가 넘는 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포에 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 의존적이다. 이들 주입된 단백질 중에서 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조종한다(Kay 등 (2007) Science 318:648-651을 참조하라). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 내포한다. 가장 잘 특징분석된 TAL-이펙터 중 하나는 고추 데뎅이 병균(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다(Bonas 등 (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430호를 참조하라). TAL-이펙터는 직렬 반복체의 중심화 도메인을 내포하며, 각각의 반복체는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 보유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 내포한다 (검토는 Schornack S, 등 (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272를 참조하라). 또한, 식물병원성 박테리아 담배 마름병균(Ralstonia solanacearum)에서 brg11 및 hpx17로 지칭되는 두 개의 유전자가 담배 마름병균(R. solanacearum) 생물형 1 균주 GMI1000 및 생물형 4 균주 RS1000에서 산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 것으로 밝혀졌다 (Heuer 등 (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384를 참조하라). 이들 유전자는 뉴클레오티드 서열에서 각각 서로 98.9% 동일하지만 hpx17의 반복 도메인에서 1,575 bp가 결실되어 상이하다. 그러나, 두 유전자 산물은 모두 산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예컨대, 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된 미국 특허 제8,586,526호를 참조하라.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 직렬 반복체에서 발견되는 서열에 의존적이다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하며 반복체는 전형적으로 각각 서로 91-100% 상동성을 가진다(Bonas 등, 상기와 동일). 반복체의 다형성은 일반적으로 위치 12 및 13에 위치하고 TAL-이펙터의 표적 서열 내 연접한 뉴클레오티드의 동일성과 위치 12 및 13의 초가변 이중잔기(RVD)의 동일성 사이의 일-대-일 대응이 존재하는 것으로 보인다(Moscou 및 Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch 등 (2009) Science 326:1509-1512를 참조하라). 실험적으로, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 자연적인 암호가 확인된 바 있고 따라서 위치 12 및 13의 HD 서열은 시토신 (C)에 대한 결합을 야기하고, NG는 T에 결합하고, NI는 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하고, 및 ING는 T에 결합한다. 이들 DNA 결합 반복체는 신규한 조합 및 수의 반복체를 가지는 단백질 내에 조립되어, 신규한 서열과 상호작용할 수 있고 식물 세포에서 비-내생적 리포터 유전자의 발현을 활성화하는 인공적인 전사 인자가 만들어졌다(Boch 등, 상기와 동일). 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 반쪽 도메인에 연결되어 효모 리포터 어세이 (플라스미드계 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합 (TALEN)을 얻었다. 예컨대, 미국 특허 제8,586,526호; Christian 등 ((2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)를 참조하라.
특정한 구체예에서, 세포 유전체의 생체 내 절단 및/또는 표적화 절단을 위해 사용된 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 아연 집게 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 집게 단백질은 이것이 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된 점에서 비-자연발생적이다. 예를 들면, 예를 들면, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; 미국 특허 제6,453,242호; 6,534,261호; 6,599,692호; 6,503,717호; 6,689,558호; 7,030,215호; 6,794,136호; 7,067,317호; 7,262,054호; 7,070,934호; 7,361,635호; 7,253,273호; 및 미국 특허 공보 제2005/0064474호; 2007/0218528호; 2005/0267061호를 참조하라, 참조하라, 이들 문헌은 모두 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.
조작된 아연 집게 결합 도메인은 자연-발생적 아연 집게 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선별을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합리적 설계는, 예를 들면, 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 아연 집게 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 집게의 하나 이상의 아미노산 서열에 연관된다. 예를 들면, 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된, 공동-권리의 미국 특허 6,453,242호 및 6,534,261호를 참조하라.
파지 전시 및 두-하이브리드 시스템을 비롯한 예시적인 선별 방법이 미국 특허 5,789,538호; 5,925,523호; 6,007,988호; 6,013,453호; 6,410,248호; 6,140,466호; 6,200,759호; 및 6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186호; WO 98/53057호; WO 00/27878호; 및 WO 01/88197호에 개시되어 있다. 또한, 아연 집게 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상이, 예를 들면, 공동-권리의 WO 02/077227호에 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 문헌에 개시된 바와 같이, 아연 집게 도메인 및/또는 다중-집게 아연 집게 단백질은 예를 들면, 5 또는 그 이상의 아미노산 길이의 링커를 비롯한 임의의 적절한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 예시적인 링커 서열-에 관해서는 미국 특허 제8,772,453호; 6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호를 참조하라. 본 명세서에 기술된 단백질은 단백질의 개별적인 아연 집게 사이의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선별; 융합 단백질 (및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레이티드)의 설계 및 구성을 위한 ZFP 및 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지이며 미국 특허 제6,140,081호; 5,789,538호; 6,453,242호; 6,534,261호; 5,925,523호; 6,007,988호; 6,013,453호; 6,200,759호; WO 95/19431호; WO 96/06166호; WO 98/53057호; WO 98/54311호; WO 00/27878호; WO 01/60970호; WO 01/88197호; WO 02/099084호; WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496호에 자세히 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 문헌에 개시된 바와 같이, 아연 집게 도메인 및/또는 다중-집게 아연 집게 단백질은 예를 들면, 5 또는 그 이상의 아미노산 길이의 링커를 비롯한 임의의 적절한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6 또는 그 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 제6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호를 참조하라. 본 명세서에 기술된 단백질은 단백질의 개별적인 아연 집게 사이의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 예를 들면 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 비롯한 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 일부이다. 예컨대, 미국 특허 제8,697,359호 및 미국 특허 공보 제20150056705호를 참조하라. 시스템의 RNA 성분을 인코딩하는 CRISPR (일정 간격으로 운집 분포된 짧은 회문 반복체) 좌위, 및 단백질을 인코딩하는 Cas (CRISPR-연관) 좌위 (Jansen 등, 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova 등, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft 등, 2005. PLoSComput. Biol. 1: e60)가 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주 내 CRISPR 좌위는 CRISPR-연관 (Cas) 유전자 뿐만 아니라 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그램화할 수 있는 비-암호화 RNA 요소의 조합을 내포한다.
유형 II CRISPR는 가장 잘 특징분석된 시스템 중 하나이며 네 가지 연속적인 단계로 표적화 DNA 이중-가닥 단절을 수행한다. 첫째, 두 가지 비-암호화 RNA인, 전구-crRNA 어레이 및 tracrRNA는 CRISPR 좌위로부터 전사된다. 둘째, tracrRNA는 전구-crRNA의 반복 영역과 혼성화되고 개별적인 스페이서 서열을 내포하는 성숙 crRNA 내로의 전구-crRNA의 프로세싱을 매개한다. 셋째, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 Cas9로 하여금 crRNA 상의 스페이서 및 표적 인식을 위한 추가적인 요건인 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 옆의 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭 염기-쌍 형성을 통해 DNA를 표적화하도록 지시한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내부에 이중-가닥 단절을 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 세 단계를 포함한다: (i) '적응'이라 부르는 과정으로, 미래의 공격을 방지하기 위해 CRISPR 어레이 내로 이질적인 DNA 서열을 삽입하는 단계, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이를 발현 및 프로세싱하는 단계, 이어서 (iii) 이질적인 핵산과 RNA-매개 간섭하는 단계. 따라서, 박테리아 세포에서, 몇몇 이른바 'Cas' 단백질들이 CRISPR/Cas 시스템의 자연적인 기능에 관여하고 이질적 DNA의 삽입 등과 같은 기능에서 역할을 수행한다.
특정한 구체예에서, Cas 단백질은 자연발생적 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 자연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 자연 서열 폴리펩티드와 공통된 질적 생물학적 특성을 가지는 화합물이다. "기능적 유도체"는 이들이 상응하는 자연 서열 폴리펩티드와 공통된 생물학적 활성을 가진다는 전제 하에, 자연 서열의 단편 및 자연 서열 폴리펩티드의 유도체 및 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형, 및 이들의 융합을 모두 포괄한다. Cas 폴리펩티드 또는 이의 단편의 적절한 유도체는 Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이, 융합, 공유 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질 또는 이의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질 또는 이의 단편의 유도체를 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻거나 화학적으로 합성되거나 또는 이들 두 가지 절차의 조합에 의해 수득할 수 있다. 세포는 자연적으로 Cas 단백질을 생산하는 세포, 또는 자연적으로 Cas 단백질을 생산하는 세포이되 내생적 Cas 단백질을 더 높은 발현 수준으로 생산하도록 또는 외생적으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 세포일 수 있고, 상기 핵산은 내생적 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 인코딩한다. 일부 경우에, 세포는 자연적으로 Cas 단백질을 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된다. Cas 단백질에 더해 및/또는 이것 대신에 사용될 수 있는 RNA 유도 뉴클레아제의 추가적인 비-제한적인 예시는 클래스 2 CRISPR 단백질 가령 Cpf1을 포함한다. 예컨대, Zetsche 등 (2015) Cell 163:1-13을 참조하라.
일부 구체예에서, DNA 결합 도메인은 TtAgo 시스템의 일부다(Swarts 등, 상기와 동일; Sheng 등, 상기와 동일을 참조하라). 진핵세포에서, 유전자 침묵화는 단백질의 아르고너트 (Ago) 패밀리에 의해 매개된다. 이러한 체계에서, Ago는 소형 (19-31 nt) RNA에 결합된다. 이러한 단백질-RNA 침묵화 복합체는 소형 RNA 및 표적 사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 형성을 통해 표적 RNA를 인식하고 핵산내부분해 방식으로 표적 RNA를 절단한다(Vogel (2014) Science 344:972-973). 대조적으로, 원핵세포의 Ago 단백질은 소형 단일-가닥 DNA 단편에 결합하며 외부 (대개 바이러스) DNA를 탐지하고 제거하는 기능을 할 것으로 보인다 (Yuan 등, (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, 등 (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts 등, 상기와 동일). 예시적인 원핵세포 Ago 단백질은 초호열세균(Aquifex aeolicus), 광합성균(Rhodobacter sphaeroides) 및 호열세균(Thermus thermophilus)으로부터의 단백질을 포함한다.
가장 잘-특징분석된 원핵세포 Ago 단백질 중 하나는 호열세균(T. thermophilus)으로부터의 단백질이다 (TtAgo; Swarts 등 상기와 동일). TtAgo는 5' 포스페이트 기를 가지는 15 nt 또는 13-25 nt 단일-가닥 DNA 단편과 연관된다. 이렇게 TtAgo에 의해 결합된 "가이드 DNA"는 단백질-DNA 복합체로 하여금 DNA의 제3자 분자 내 왓슨-크릭 상보성 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 기능을 한다. 일단 이들 가이드 DNA 내 서열 정보가 표적 DNA의 식별을 허용한 경우, TtAgo-가이드 DNA 복합체가 표적 DNA를 절단한다. 그러한 메커니즘은 또한 표적 DNA에 결합되어 있는 동안의 TtAgo-가이드 DNA 복합체의 구조에 의해 지원된다 (G. Sheng 등, 상기와 동일). 광합성균(Rhodobacter sphaeroides)으로부터의 Ago (RsAgo)는 유사한 특성을 지닌다 (Olivnikov 등 상기와 동일).
임의의 DNA 서열의 외생적 가이드 DNA는 TtAgo 단백질 상에 로딩될 수 있다 (Swarts 등 상기와 동일). TtAgo 절단의 특이성이 가이드 DNA에 의해 지정되기 때문에, 외생적인, 연구자-특화 가이드 DNA로 형성된 TtAgo-DNA 복합체는 그러므로 TtAgo 표적 DNA 절단이 상보적인 연구자-특화 DNA에 일어나도록 지시할 것이다. 이러한 방식으로, DNA 내에 표적화 이중-가닥 단절이 생성될 수 있다. TtAgo-가이드 DNA 시스템 (또는 다른 유기체로부터의 이종상동성 Ago-가이드 DNA 시스템)의 사용은 세포 내부 유전체 DNA의 표적화 절단을 가능하게 한다. 그러한 절단은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 포유류 유전체 DNA의 절단에 있어서, 포유류 세포에서 발현하기 위해 최적화된 버전의 TtAgo 코돈 사용이 바람직할 수 있다. 추가로, 세포를 시험관 내 형성된 TtAgo-DNA 복합체로 처리하는 것이 바람직할 수 있고 여기서 TtAgo 단백질은 세포-침투성 펩티드에 융합된다. 추가로, 섭씨 37도에서 향상된 활성을 가지도록 하는 돌연변이유발을 통해 변형된 버전의 TtAgo 단백질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. TtAgo-RNA-매개 DNA 절단은 DNA 절단의 이용을 위한 당해 분야의 표준 기술을 이용하는 유전자 넉-아웃, 표적화 유전자 부가, 유전자 교정, 표적화 유전자 결실을 비롯한 수많은 결과에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 뉴클레아제는 공여체(전이유전자)를 삽입하는 것이 요망되는 어떠한 유전자에서든 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다.
B. 절단 도메인
임의의 적절한 절단 도메인이 DNA-결합 도메인과 연관(예컨대, 작동적으로 연결)되어 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 예를 들면, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인과 융합되어 ZFN을 생성하였고-, 이는 이의 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 이의 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있고 뉴클레아제 활성을 통해 DNA의 ZFP 결합 부위 근처가 절단되게 하는 기능적 독립체이다. 예컨대, Kim 등 (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160를 참조하라. 더욱 최근에는, ZFN은 다양한 유기체에서 유전체 변형을 위해 사용되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 공보 20030232410호; 20050208489호; 20050026157호; 20050064474호; 20060188987호; 20060063231호; 및 국제 공보 WO 07/014275호를 참조하라. 유사하게, TALE DNA-결합 도메인이 뉴클레아제 도메인과 융합되어 TALEN을 형성하였다. 예컨대, 미국 특허 제8,586,526호를 참조하라. DNA에 결합하고 절단 도메인 (예컨대, Cas 도메인)과 연관되어 표적화 절단을 유도하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템이 또한 기술되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제8,697,359호 및 8,932,814호 및 미국 특허 공보 제20150056705호를 참조하라.
위에서 언급된 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인에 대해 이종(heterologous), 예를 들면 뉴클레아제로부터의 아연 집게 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 또는 뉴클레아제로부터의 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인; 뉴클레아제 (CRISPR/Cas)로부터의 sgRNA DNA-결합 도메인 및 절단 도메인; 및/또는 상이한 뉴클레아제로부터의 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인일 수 있다. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 2002-2003 카탈로그, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388를 참조하라. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(예컨대, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNA 가수분해효소 I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 Linn 등 (발행) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993을 참조하라). 하나 이상의 이들 효소 (또는 이의 기능적 단편)는 절단 도메인 및 절단 반쪽-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반쪽-도메인은 앞서 제시된 바와 같이 절단 활성을 위해 이합체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 이의 부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반쪽-도메인을 포함하는 경우 절단을 위해 두 가지 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 두 절단 반쪽-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 두 개의 절단 반쪽-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 반쪽-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 두 융합 단백질을 위한 표적 부위는 바람직하게는, 각각 서로에 대해, 두 융합 단백질의 이들의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 절단 반쪽-도메인을 서로, 절단 반쪽-도메인들이 예컨대, 이합체화에 의해 하나의 기능적 절단 도메인을 형성하는 공간적 배향으로 배치하도록 제시된다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 부위의 가까운 모서리는 5-8 뉴클레오티드 또는 15-18 뉴클레오티드만큼 떨어져 있다. 그러나, 임의의 중간 수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 두 표적 부위 사이에 끼어들 수 있다(예컨대, 2 내지 50 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종류로 존재하며 DNA에 (인식 부위에) 서열-특이적 결합을 할 수 있고, 및 결합 부위 또는 그 근처에서 DNA를 절단한다. 특정 제한 효소 (예컨대, 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거되는 부위에서 DNA를 절단하고 분리될 수 있는 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들면, 유형 IIS 효소 Fok I은 한 가닥 상의 이의 인식부위로부터 9 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상의 이의 인식부위로부터 13 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들면, 미국 특허 5,356,802호; 5,436,150호 및 5,487,994호; 뿐만 아니라 Li 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등 (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등 (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982를 참조하라. 따라서, 한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소 및 하나 이상의 아연 집게 결합 도메인으로부터의 절단 도메인 (또는 절단 반쪽-도메인)을 포함하며, 이는 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 이렇게 특정한 효소는 이량체로서 활성을 가진다. Bitinaite 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시의 목적에 있어서, 개시된 융합 단백질에서 사용되는 Fok I 효소의 부분은 절단 반쪽-도메인으로 고려된다. 따라서, 아연 집게-Fok I 융합체를 이용하는 세포 서열의 표적화 이중-가닥 절단 및/또는 표적화 교체에 있어서, 각각 Fok I 절단 반쪽-도메인을 포함하는 두 개의 융합 단백질은 활성 절단 도메인을 촉매적으로 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 집게 결합 도메인 및 두 개의 Fok I 절단 반쪽-도메인을 내포하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 집게-Fok I 융합체를 이용하는 표적화 절단 및 표적화 서열 개조에 대한 척도는 본 개시의 다른 부분에 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 반쪽-도메인은 절단 활성을 보유하거나, 또는 다량체 (예컨대, 이량체)를 형성하는 능력을 가져 기능적 절단 도메인을 형성하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소가 본 명세서에 그 전체가 포함되는 미국 특허 7,888,121호에 기술된다. 추가적인 제한 효소가 또한 분리될 수 있는 결합 및 절단 도메인을 내포하며, 이들은 본 개시에 의해 고려된다. 예를 들면, Roberts 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참조하라.
특정한 구체예에서, 절단 도메인은 예를 들면, 미국 특허 제8,772,453호; 8,623,618호; 8,409,861호; 8,034,598호; 7,914,796호; 및 7,888,121호에 기술된 바와 같이 동종이합체를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반쪽-도메인 (또한 이합체화 도메인 돌연변이로도 지칭됨)을 포함하고, 이들 개시는 모두 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 반쪽-도메인의 이합체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
편성 이종이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 반쪽-도메인은 제1 절단 반쪽-도메인이 FokI의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고 제2 절단 반쪽-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 교체하고; 538의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하고; 486의 돌연변이는 Gln (Q)을 Glu (E)로 교체하고; 및 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체한다. 특히, 본 명세서에 기술된 조작된 절단 반쪽-도메인은 하나의 절단 반쪽-도메인 내 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)를 변이시켜 "E490K:I538K"로 지칭되는 조작된 절단 반쪽-도메인을 생성하고 또다른 절단 반쪽-도메인 내 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 변이시켜 "Q486E:I499L"로 지칭되는 조작된 절단 반쪽-도메인을 생성함으로써 제조하였다. 본 명세서에 기술된 조작된 절단 반쪽-도메인은 비정상적인 절단이 최소화 또는 제거된 편성 이종이합체 돌연변이다. 미국 특허 제7,914,796호 및 8,034,598호, 상기 개시는 그 전체가 참고로서 포함된다. 특정한 구체예에서, 조작된 절단 반쪽-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 비교한 번호)에 돌연변이를 포함하고, 예를 들면 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로 및 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 (또한 각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 지칭됨) 교체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 조작된 절단 반쪽-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 비교한 번호)에 돌연변이를 포함하고, 예를 들면 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 및 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 (또한 각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 지칭됨) 교체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 조작된 절단 반쪽-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 비교한 번호)에 돌연변이를 포함하고, 예를 들면 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로 및 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 (또한 각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 지칭됨) 교체하는 돌연변이를 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제8,772,453호를 참조하라. 다른 구체예에서, 조작된 절단 반쪽 도메인은 "샤키(Sharkey)" 및/또는 "샤키" 돌연변이를 포함한다 (Guo 등, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107을 참조하라).
본 명세서에 기술된 조작된 절단 반쪽-도메인은 미국 특허 제7,888,121호; 7,914,796호; 8,034,598호; 및 8,623,618호에 기술된 바와 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여, 예를 들면, 야생형 절단 반쪽-도메인 (Fok I)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분열(split)-효소" 기술 (예컨대, 미국 특허 공보 제20090068164호를 참조하라)을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내에서 조립될 수 있다. 그러한 분열 효소의 성분은 서로 다른 발현 구조체 상에 발현될 수 있거나, 또는 각각의 성분이, 예를 들면, 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 개방 판독 프레임 내에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 집게 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인 일 수 있다.
뉴클레아제는 사용 전에, 예를 들면 미국 특허 제8,563,314호에 기술된 바와 같은 효모-계 염색체 시스템에서 활성에 대해 선별될 수 있다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들면 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재에서 활성화(탈-억제)되고 글루코스의 존재에서 억제되는 갈락토키나아제 프로모터의 제어 하에 이루어질 수 있다.
Cas9 연관 CRISPR/Cas 시스템은 동일한 직열 반복체 (DR)에 의한 간격을 갖는 뉴클레아제 가이드 서열 (스페이서)을 내포하는 두 가지 RNA 비-암호화 성분: tracrRNA 및 전구-crRNA 어레이를 포함한다. 유전체 조작을 달성하기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 이용하려면, 이들 RNA의 두 기능이 모두 존재해야 한다 (Cong 등, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143을 참조하라). 일부 구체예에서, tracrRNA 및 전구-crRNA는 개별 발현 구조체를 통해 또는 개별 RNA로서 공급된다. 다른 구체예에서, 키메라 RNA는 조작된 성숙 crRNA (표적 특이성을 부여)가 tracrRNA (Cas9와의 상호작용을 제공)에 융합되어 키메라 cr-RNA-tracrRNA 하이브리드 (또한 단일 가이드 RNA로도 지칭됨)를 생성한 구조체이다. (Jinek 상기와 동일 및 Cong, 상기와 동일을 참조하라).
본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레아제(들)은 표적 부위에 하나 이상의 이중-가닥 및/또는 단일-가닥 절단을 만들 수 있다. 특정한 구체예에서, 뉴클레아제는 촉매적으로 비활성인 절단 도메인 (예컨대, FokI 및/또는 Cas 단백질)을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제9,200,266호; 8,703,489호 및 Guillinger 등 (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582를 참조하라. 촉매적으로 비활성인 절단 도메인은, 촉매적으로 활성인 도메인과 함께 틈내기효소로서 작용하여 단일-가닥 절단을 만들 수 있다. 그러므로, 두 가지 틈내기효소가 함께 사용되어 특정한 영역에 이중-가닥 절단을 만들 수 있다. 추가적인 틈내기효소가 또한 당해 분야에, 예를 들면, McCaffery 등 (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19에 공지되어 있다.
표적 부위
위에서 자세히 기술한 바와 같이, DNA 도메인은 좌위 내 선택된 임의의 서열, 예를 들면 알부민 또는 다른 피난-항 유전자에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA-결합 도메인은 자연-발생적 DNA-결합 도메인에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선별을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합리적 설계는, 예를 들면, 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 (예컨대, 아연 집게) 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열에 연관된다. 예를 들면, 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된, 공동-권리의 미국 특허 6,453,242호 및 6,534,261호를 참조하라. TAL-이펙터 도메인의 합리적인 설계가 또한 수행될 수 있다. 예컨대, 미국 공보 제20110301073호를 참조하라.
파지 전시 및 두-하이브리드 시스템을 비롯한, DNA-결합 도메인에 적용가능한 예시적인 선별 방법이 미국 특허 5,789,538호; 5,925,523호; 6,007,988호; 6,013,453호; 6,410,248호; 6,140,466호; 6,200,759호; 및 6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186호; WO 98/53057호; WO 00/27878호; WO 01/88197호 및 GB 2,338,237호에 개시되어 있다.
표적 부위의 선별; 융합 단백질 (및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레이티드)의 설계 및 구성을 위한 뉴클레아제 및 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지이며 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된, 미국 특허 출원 공보 제20050064474호 및 20060188987호에 자세히 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인 (예컨대, 다중-집게 아연 집게 단백질)은 예를 들면, 5 또는 그 이상의 아미노산의 링커를 비롯한 임의의 적절한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 예컨대, 6 또는 그 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 관해서는 미국 특허 제6,479,626호; 6,903,185호; 및 7,153,949호를 참조하라. 본 명세서에 기술된 단백질은 단백질의 개별적인 DNA-결합 도메인 사이의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 제8,586,526호를 참조하라.
공여체
위에서 언급한 바와 같이, 예를 들면 돌연변이 유전자의 교정 또는 MPS I 및/또는 MPS II 질환(예컨대, IDUA 또는 IDS)에서 결여되거나 결핍된 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 증대를 위한 외생적 서열 (또한 "공여체 서열" 또는 "공여체"로도 지칭됨)의 삽입이 제공된다. 공여체 서열이 전형적으로 이것이 배치되는 유전체 서열과 동일하지 않음은 매우 명백할 것이다. 공여체 서열은 관심의 위치에서의 효율적인 HDR을 가능하게 하기 위해 상동성인 두 영역의 측면에 위치한 비-상동성 서열을 내포할 수 있다. 추가적으로, 공여체 서열은 세포 염색질 내 관심의 영역에 비상동성인 서열을 내포하는 벡터 분자를 포함할 수 있다 공여체 분자는 세포 염색질에 상동성인 몇 가지, 불연속 영역을 내포할 수 있다. 예를 들면, 관심의 영역에 일반적으로는 존재하지 않는 서열의 표적화 삽입에 있어서, 상기 서열은 공여체 핵산 분자 내에 존재하고 관심의 영역 내 서열에 상동성인 영역의 측면에 위치할 수 있다.
본 명세서에 기술된 것은 삽입하기 위한 IDUA 또는 IDS 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 선택된 위치 내로 표적화 삽입하는 방법이다. 삽입을 위한 폴리뉴클레오티드는 또한 "외생적" 폴리뉴클레오티드, "공여체" 폴리뉴클레오티드 또는 분자 또는 "전이유전자"로 지칭될 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고 선형 또는 환형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제8,703,489호 및 9,005,973호를 참조하라. 공여체 서열(들)은 또한 DNA MC 내에 내포될 수 있고, 이는 환형 또는 선형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 공보 제20140335063호를 참조하라. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 보호될 수 있다(예컨대, 엑소뉴클레아제 분해로부터). 예를 들면, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고 및/또는 자체-상보성 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들면, Chang 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등 (1996) Science 272:886-889을 참조하라. 외생적 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노 기(들)의 부가 및 변형된 뉴클레오티드간 연결 가령, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드는 추가적인 서열 가령, 예를 들면, 복제 개시점, 프로모터 및 항생제 저항성을 인코딩하는 유전자를 가지는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 게다가, 공여체 폴리뉴클레오티드는 노출된 핵산으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 물질을 갖는 핵산 복합체로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결핍 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체는 일반적으로 이의 발현이 통합 부위의 내생적 프로모터, 즉 공여체가 삽입되는 내생적 유전자(예컨대, 고도로 발현되는, 알부민, AAVS1, HPRT, 등)의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 유도되도록 삽입된다. 그러나, 공여체가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들면 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 일부 구체예에서, 공여체는 세포에서 유전자가 염색체-바깥에 발현되도록 발현 플라스미드 내에 유지된다.
공여체 분자는 내생적 유전자가 전부, 일부 발현되거나 발현되지 않도록 내생적 유전자 내에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 전이유전자는 알부민 또는 다른 좌위에 삽입될 수 있고 그래서, 예를 들면 IDUA 또는 IDS 단백질(들)을 인코딩하는 전이유전자와의 융합으로서 내생적 알부민 서열의 일부 (리소좀 효소를 인코딩하는 전이유전자에 대한 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되거나 발현되지 않는다. 다른 구체예에서, 전이유전자 (예컨대, 가령 알부민에 대한 추가적인 암호화 서열이 있거나 없는)는 임의의 내생적 좌위, 예를 들면 피난-항 좌위에 통합된다.
내생적 서열 (내생적 또는 전이유전자의 일부)이 전이유전자와 함께 발현되는 경우, 내생적 서열 (예컨대, 알부민, 등)은 전장 서열 (야생형 또는 돌연변이) 또는 부분 서열일 수 있다. 바람직하게는 내생적 서열은 기능적이다. 이들 전장 또는 부분 서열 (예컨대, 알부민)의 기능의 비-제한적인 예시는 전이유전자 (예컨대, 치료적 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩티드의 혈청 반-감기를 증가시키는 것 및/또는 담체로서 작용하는 것을 포함한다.
게다가, 발현에 필요하지 않더라도, 외생적 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 침입 부위, 2A 펩티드 인코딩 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
특정한 구체예에서, 외생적 서열 (공여체)은 관심의 단백질 및, 이의 융합 상대로서, 융합 단백질을 세포 표면 상에 위치하게 하는 막 단백질의 세포외 도메인의 융합을 포함한다. 이는 전이유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 혈청에서 강하게 작용할 수 있게 한다. MPS I 또는 MPS II 질환에 대한 치료의 경우에, 전이유전자 융합에 의해 각각 인코딩되는 IDUA 또는 IDS 효소는 세포 (예컨대, RBC)의 표면 상의 이의 위치로부터 혈청 내에 축적되는 대사 산물에 작용한다. 또한, RBC가 분해의 정상적인 과정 대로 비장 대식 세포에 의해 포획되는 경우, 대식 세포가 세포를 포획할 때 형성되는 리소좀은 막에 결합된 융합 단백질을 효소에게 자연적으로 더 유리한 pH에서 리소좀 내 고농도의 대사 산물에 노출하게 된다.
일부 경우에, 공여체는 변형된 내생적 유전자 (IDUA 또는 IDS)일 수 있다. 예를 들면, 코돈 최적화가 내생적 유전자에 수행되어 공여체를 생성할 수 있다. 게다가, 비록 효소 교체 요법에 대한 항체 반응은 문제의 특정한 치료적 효소 및 개별적인 환자에 따라 다르지만, 야생형 IDUA 또는 IDS로의 효소 교체로 처리된 많은 MPS I 또는 MPS II 질환 환자에서 상당한 면역 반응이 나타났다. 또한, 치료의 효과성에 대한 이들 항체의 적합성이 또한 가변적이다 (Katherine Ponder, (2008) J Clin Invest 118(8):2686를 참조하라). 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 야생형 IDUA 또는 IDS에 비해 변형된 서열을 가진 공여체의 생성을 포함할 수 있고, 이는 내생적 면역 반응에 대해 프라이머 에피토프인 것으로 공지된 부위에서 기능적으로 조용한 아미노산 변화를 생성하는 변형, 및/또는 그러한 공여체에 의해 생성된 폴리펩티드가 덜 면역원성이게 하는 절단을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
MPS I 및 MPS II 질환 환자는 대개 뇌에서 사라진 IDUA 또는 IDS 효소 결여로 인한 신경학적 후유증을 가진다. 안타깝지만, 혈액 뇌 장벽의 비투과성으로 인해 혈액을 통해 뇌로 치료제를 송달하는 것은 어렵다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 뇌에 치료제의 송달을 증가시키기 위한 방법과 함께 사용될 수 있고, 이는 고장성 만니톨 용액의 경동맥내 투여의 사용, 집속 초음파의 사용 및 브래디키닌 유사체의 투여를 통한 일시적인 삼투성 파괴와 같은 뇌 모세혈관의 세포 사이의 밀착 연접을 일시적으로 개방하게 만드는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 치료제는 뇌로의 특화 수송을 위한 수용체 또는 수송 메커니즘을 이용하도록 고안될 수 있다. 사용될 수 있는 특화 수용체의 예시는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체 또는 저-밀도 리포단백질 수용체 연관 단백질 1 및 2 (LRP-1 및 LRP-2)를 포함한다. LRP는 광범위한 분비 단백질 가령 apoE, tPA, PAI-1 등과 상호작용한다고 공지되어 있으며, 따라서 이들 단백질 중 하나의 인식 서열을 LRP에 대해 융합하는 것은 간에서의 치료적 단백질의 발현 및 혈류로의 분비 후에 뇌로의 효소 수송을 용이하게 할 수 있다 (Gabathuler, (2010) 상기와 동일을 참조하라).
세포
또한 본 명세서에 제공된 것은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 생산된 세포를 비롯한, IDUA 및/또는 IDS 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 예를 들면, 간 세포 또는 줄기 세포이다. IDUA 및/또는 IDS 전이유전자는 염색체-바깥에 발현될 수 있거나 또는 하나 이상의 뉴클레아제를 이용하여 표적화 방식으로 세포의 유전체 내로 통합될 수 있다 무작위 통합과 달리, 뉴클레아제-매개 표적화 통합은 전이유전자가 특정한 유전자에 통합되는 것을 보장한다. 전이유전자는 표적 유전자 내 어느 곳에나 통합될 수 있다. 특정한 구체예에서, 전이유전자는 뉴클레아제 결합 및/또는 절단 부위에 또는 부근에, 예를 들면, 절단 부위 및/또는 결합 부위의 상류 또는 하류의 1-300 (또는 그 사이의 임의의 수의 염기 쌍) 염기 쌍 이내, 더 바람직하게는 절단 및/또는 결합 부위의 어느 한쪽의 1-100 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 수의 염기 쌍) 이내, 더욱 더 바람직하게는 절단 및/또는 결합 부위의 어느 한쪽의 1 내지 50 염기 쌍 (또는 그 사이의 임의의 수의 염기 쌍)이내에 통합된다. 특정한 구체예에서, 통합된 서열은 어떠한 벡터 서열 (예컨대, 바이러스 벡터 서열)도 포함하지 않는다.
세포 또는 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 세포 유형이 본 명세서에 기술된 바와 같이 전이유전자를 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포의 다른 비-제한적인 예시는 T-세포 (예컨대, CD4+, CD3+, CD8+, 등); 수지상 세포; B-세포; 자가세포 (예컨대, 환자-유래)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 세포는 간 세포이고 생체 내에서 변형된다. 특정한 구체예에서, 세포는 이종 만능성, 전능성 또는 다능성 줄기 세포 (예컨대, CD34+ 세포, 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC), 배아 줄기 세포 등)를 비옷한 줄기 세포이다. 특정한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포 는 환자 유래 줄기 세포이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 세포는 장애를 가진 개체에서, 예를 들면, 생체 내 요법에 의해 MPS I 또는 MPS II 질환을 치료 및/또는 예방하기에 유용하다. 예를 들면 뉴클레아제-변형된 세포가 증폭되고 이후 표준 기술을 이용하여 환자에게 재도입될 수 있는 경우, 생체외 요법이 또한 제공된다. 예컨대, Tebas 등 (2014) New Eng J Med 370(10):901을 참조하라. 줄기 세포의 경우, 개체에 주입된 후에, 기능적 단백질을 (삽입된 공여체로부터) 발현하는 세포로의 이들 전구체의 생체 내 분화가 또한 일어난다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 또한, 세포는 환자에게 투여되기 전에 저온 보존될 수 있다.
송달
뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 공여체 폴리뉴클레오티드 및 본 명세서에 기술된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 생체 내 또는 생체외에서 임의의 적절한 수단에 의해 송달될 수 있다
본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레아제를 송달하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제6,453,242호; 6,503,717호; 6,534,261호; 6,599,692호; 6,607,882호; 6,689,558호; 6,824,978호; 6,933,113호; 6,979,539호; 7,013,219호; 및 7,163,824호에 기술되며, 상기 개시는 모두 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체는 또한 하나 이상의 아연 집게, TALEN 및/또는 Cas 단백질(들)을 인코딩하는 서열을 내포하는 벡터를 이용하여 송달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된 미국 특허 제6,534,261호; 6,607,882호; 6,824,978호; 6,933,113호; 6,979,539호; 7,013,219호; 및 7,163,824호를 참조하라. 게다가, 임의의 이들 벡터가 치료를 위해 필요한 하나 이상의 서열을 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 공여체 구조체가 세포에 도입되는 경우, 뉴클레아제 및/또는 공여체 폴리뉴클레오티드는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 복수의 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 하나 또는 복수의 뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전이 방법이 뉴클레아제 및 공여체 구조체를 인코딩하는 핵산을 세포 (예컨대, 포유류 세포) 및 표적 조직으로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 송달 시스템은 DNA 플라스미드, 노출된 핵산, 및 송달 비히클 가령 리포좀 또는 폴록사머와 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 송달 시스템은 세포에 송달된 후 부체 또는 통합된 유전체를 가지는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해서는, Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada 등, Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler 및 Boehm (발행) (1995); 및 Yu 등, Gene Therapy 1:13-26 (1994)을 참조하라.
핵산의 비-바이러스 송달 방법은 전기천공, 리포펙션, 미세주입, 유전자총, 비로좀, 리포좀, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 노출된 DNA, 인공적인 바이러스입자, 및 DNA의 물질-강화된 흡수를 포함한다. 예컨대, Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)을 이용한 초음파천공이 또한 핵산의 송달을 위해 사용될 수 있다.
추가적인 예시적 핵산 송달 시스템은 Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc, (예를 들면 US6008336호를 참조하라)에 의해 제공되는 것들을 포함한다. 리포펙션은 예컨대, 미국 특허 제5,049,386호; 4,946,787호; 및 4,897,355호)에 기술되어 있고 리포펙션 시약이 시판되고 있다(예컨대, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션을 위해 적절한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424호, WO 91/16024호의 것들을 포함한다.
면역지질 복합체와 같은 표적화 리포좀을 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다 (예컨대, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao 등, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 등, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 제4,186,183호, 4,217,344호, 4,235,871호, 4,261,975호, 4,485,054호, 4,501,728호, 4,774,085호, 4,837,028호, 및 4,946,787호를 참조하라).
추가적인 송달 방법은 송달될 핵산을 EnGeneIC 송달 비히클 (EDV) 내에 봉입하는 것의 사용을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 한 팔이 표적 조직에 대한 특이성을 가지고 다른 팔이 EDV에 대한 특이성을 가지는 이중특이적 항체를 이용하여 표적 조직으로 정확히 송달된다. 이 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 이끌고 이후 EDV는 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 들어간다. 일단 세포에 들어가면, 내용물이 방출된다(MacDiarmid 등 (2009) Nature Biotechnology 27(7):643을 참조하라).
조작된 ZFP를 인코딩하는 핵산의 송달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 체내 특정 세포에 표적화하고 바이러스 탑재물을 핵에 수송하기 위한 고도로 발달된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 개체로 직접 투여될 수 있거나(생체 내) 또는 이들은 시험관 내에서 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고 변형된 세포가 개체에 투여된다(생체외). ZFP의 송달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전이를 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관, 백시니아 및 단순포진 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전이 방법을 이용하면 숙주 유전체 내 통합이 가능하며, 대개 삽입된 전이유전자의 장기 발현이 야기된다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 도입함으로써 변형될 수 있어, 표적 세포의 가능한 표적 집단이 확장된다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형집도입 및 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터이고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성한다. 레트로바이러스 유전자 전이 시스템의 선택은 표적 조직에 의존적이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열을 봉입할 능력을 가진 cis-작용성 긴 말단 반복체로 이루어진다. 최소의 cis-작용성 LTR이 벡터의 복제 및 봉입을 위해 충분하고, 이는 이후 치료적 유전자를 표적 세포에 통합시키기 위해 사용되어 지속적인 전이유전자 발현을 제공한다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐의 백혈병 바이러스 (MuLV), 기본(gibbon) 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합을 기초로 하는 것들을 포함한다 (예컨대, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt 등, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700호를 참조하라).
일시적인 발현이 선호되는 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 그러한 벡터를 이용하여, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 수득되었다. 이러한 벡터는 비교적 단순한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 ("AAV") 벡터가 또한 예컨대, 핵산 및 펩티드의 시험관 내 생산에서, 및 생체 내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는데 사용된다 (예컨대, West 등, Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 제4,797,368호; WO 93/24641호; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)를 참조하라. 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국 특허 제5,173,414호; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 비롯한 수많은 간행물에 기술되어 있다.
적어도 여섯 가지의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 시험에서의 유전자 전이를 위해 이용가능하며, 이는 형질도입제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주 내에 삽입된 유전자에 의해 결핍 벡터를 보완하는 것을 포함하는 접근법을 사용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 바 있는 레트로바이러스 벡터의 예시이다 (Dunbar 등, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn 등, Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech 등, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에서 사용된 최초의 치료적 벡터였다. (Blaese 등, Science 270:475-480 (1995)). 50% 또는 그 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 봉입된 벡터에 대해 관찰되었다. (Ellem 등, Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff 등, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)는 결함이 있고 비병원성인 파보바이러스 아데노-연관 유형 2 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대안적인 유전자 송달 시스템이다. 모든 벡터는 전이유전자 발현 카세트의 측면에 위치하는 AAV 145 bp 반전 말단 반복체만을 보유하는 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 유전체 내로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전이 및 안정한 전이유전자 송달은 이러한 벡터 시스템에 있어서 핵심 특징이다. (Wagner 등, Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns 등, GeneTher. 9:748-55 (1996)). 비-제한적인 예시로서 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9 및 AAV rh10 및 위형 AAV 가령 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6를 비롯한 다른 AAV 혈청형이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 높은 역가로 생산되며 수많은 상이한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 전이유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되고; 이후 이 복제 결핍 벡터는 trans로 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 증식한다. Ad 벡터는 생체 내에서 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것과 같은 비-분열, 분화 세포를 비롯한 복수 유형의 조직을 형질도입시킬 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 대량의 내포 능력를 지닌다. 임상 시험에서 Ad 벡터를 사용하는 예시는 근육내 주사를 이용한 항-종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 포함하였다(Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전이를 위해 아데노바이러스 벡터를 사용한 추가적인 예시는 Rosenecker 등, Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh 등, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez 등, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf 등, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)을 포함한다.
봉입(packaging) 세포가 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 그러한 세포는 아데노바이러스를 봉입하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 봉입하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자 내에 봉입하는 생산체 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 봉입 및 이후의 숙주로의 통합(적용시)을 위해 필요한 최소의 바이러스 서열을 내포하며, 나머지 바이러스 서열은 발현될 단백질을 인코딩하는 발현 카세트에 의해 교체된다. 없는 바이러스 기능은 봉입 세포주에 의해 trans로 공급된다. 예를 들면, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 오로지 AAV 유전체로부터의 반전 말단 반복 (ITR) 서열만 보유하며 이는 봉입 및 숙주 유전체로의 통합을 위해 필요하다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드를 보유하지만, ITR 서열은 결여된 세포주에 봉입된다. 세포주는 또한 헬퍼로서의 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 봉입되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은 예컨대, AAV보다 아데노바이러스가 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 요법 적용에서, 유전자 요법 벡터가 특정 조직 유형에 대한 높은 정도의 특이성으로 송달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면 상에 바이러스 외피 단백질을 가지는 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 소정의 세포 유형에 대한 특이성을 가지도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심의 세포 유형에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대한 친화성을 가지도록 선택된다. 예를 들면, Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)은, 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있고, 이 재조합 바이러스가 인간 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킴을 보고하였다. 이러한 원리는 표적 세포가 수용체를 발현하고 바이러스가 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에도 연장될 수 있다. 예를 들면, 사상 파지는 사실상 어떠한 선택된 세포 수용체에 대해서도 특이적 결합 친화성을 가지는 항체 단편 (예컨대, FAB 또는 Fv)을 전시하도록 조작될 수 있다. 비록 상기 설명이 주로 바이러스 벡터에 적용되긴 하지만, 동일한 원리가 비바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 그러한 벡터는 특정한 표적 세포에 의해 잘 흡수되는 특정 흡수 서열을 내포하도록 조작될 수 있다.
유전자 요법 벡터는 개별적인 환자에의 투여에 의해, 전형적으로 전신성 투여 (예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 하기 기술된 바와 같은 국소 도포에 의해 생체 내로 송달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체외 세포, 가령 개별적인 환자로부터 (예컨대, 림프구, 골수 흡인, 조직 생검) 또는 보편 공여체 조혈모세포로부터 외식된 세포로 송달될 수 있고, 이후 세포는 보통 벡터가 포함된 세포 선별 후에 환자에게 재이식된다.
벡터 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀, 등) 함유 뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체는 또한 생체 내 세포의 형질도입을 위한 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 노출된 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 분자를 도입하여 결국 혈액 또는 조직 세포와 접촉하게 하기 위해 일반적으로 사용되는, 주사, 주입, 국소 도포 및 전기천공을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 그러한 핵산을 투여하는 적절한 방법이 이용가능하며 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있고, 및, 비록 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있지만, 흔히 특정 경로가 또다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 도입을 위해 적절한 벡터는 비-통합성 렌티바이러스 벡터 (IDLV)를 포함한다. 예를 들면, Ory 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull 등 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery 등 (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi 등 (2000) Nature Genetics 25:217-222; 미국 특허 공보 제2009/054985호를 참조하라.
약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기 기술된 바와 같이 이용가능한 약제학적 조성물의 다양한 적절한 제형이 존재한다(예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17판, 1989를 참조하라).
뉴클레아제-인코딩 서열 및 공여체 구조체가 동일하거나 상이한 시스템을 이용하여 송달될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 공여체 폴리뉴클레오티드는 플라스미드에 의해 이동될 수 있는 반면, 하나 이상의 뉴클레아제는 AAV 벡터에 의해 운송될 수 있다. 게다가, 상이한 벡터가 동일하거나 상이한 경로 (근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 벡터는 동시에 또는 임의의 순차적인 순서로 송달될 수 있다.
생체외 및 생체 내 투여 모두를 위한 제형은 액체 내 현탁액 또는 에멀젼화 액체를 포함한다. 활성 성분은 흔히 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 양립가능한 부형제와 혼합된다. 적절한 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 조성물은 미량의 보조 물질, 가령, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약제학적 조성물의 효과를 증진시키는 다른 시약을 함유할 수 있다.
적용
본 발명의 방법은 MPS I 질환 (예컨대 리소좀 저장 질환) 및/또는 MPS I 질환의 치료 및/또는 예방을 고려한다. 치료는 필요한 효소(들)의 발현 및 혈류로의 방출을 위한 하나 이상의 교정성 질환-연관 유전자 (예컨대, IDUA, IDS, 등)의 세포 내 피난항 좌위 (예컨대 알부민)로의 삽입을 포함할 수 있다. 전이유전자는 코돈 최적화 전이유전자 (예컨대, IDUA 또는 IDS); 및/또는 에피토프가 단백질을 기능적으로 개조하지 않고 제거될 수 있는 전이유전자를 포함하는 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 경우에, 본 방법은 필요한 효소의 발현 및 혈류로의 방출을 위한 교정성 효소-인코딩 전이유전자를 발현하는 부체의 세포로의 삽입을 포함한다. 혈류로 산물을 방출하기 위한 분비 세포, 가령 간 세포로의 삽입이 특히 유용하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 이들 세포로부터 유래한 성숙 세포 (예컨대, RBC)가 치료제를 내포하도록 조혈 줄기 세포 내에 하나 이상의 치료제를 인코딩하는 IDUA 또는 IDS 전이유전자를 공급하는 것이 요망되는 임의의 환경에서 사용될 수 있다. 이들 줄기 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 분화될 수 있고 모든 환자를 위해 사용될 수 있는 보편 공여체 유형의 세포로부터 유래될 수 있다. 추가적으로, 세포는 신체에서 세포를 운송하기 위해 막관통 단백질을 내포할 수 있다. 치료는 또한 치료적 전이유전자를 내포하는 환자 세포의 사용을 포함할 수 있고 여기서 이 세포는 생체외에서 발달하고 이후 환자에게 다시 도입된다. 예를 들면, 적절한 IDUA 또는 IDS 인코딩 전이유전자를 내포하는 HSC는 골수 이식을 통해 환자에게 삽입될 수 있다. 대안적으로, IDUA 또는 IDS 인코딩 전이유전자를 이용하여 편집되어온 줄기 세포 가령 근육 줄기 세포 또는 iPSC가 또한 근육 조직에 주입될 수 있다.
따라서, 이러한 기술은 환자에게 문제(예컨대, 발현 수준의 문제 또는 하위- 또는 비-기능으로서 발현된 단백질의 문제)로 인해 일부 단백질이 결핍된 조건에 유용할 수 있다. 본 발명으로 특히 유용한 것은 MPS I 질환을 가진 개체에서 기능성을 교정 또는 회복하는 전이유전자의 발현이다.
비-제한적인 예시의 방식으로, 결핍된 또는 없는 단백질의 생산이 달성되었고 MPS I 및/또는 MPS II 질환을 치료하기 위해 사용되었다. 단백질을 인코딩하는 핵산 공여체는 피난항 좌위 (예컨대 알부민 또는 HPRT)에 삽입되어 외생적 프로모터를 이용하여 또는 피난항에 존재하는 프로모터를 이용하여 발현될 수 있다. 대안적으로, 공여체는 결핍 유전자를 인시추로 교정하기 위해 사용될 수 있다. 요망되는 IDUA 또는 IDS 인코딩 전이유전자는 CD34+ 줄기 세포에 삽입되고 골수 이식 도중 환자에게 돌려보내질 수 있다. 마지막으로, 핵산 공여체는 베타 글로빈 좌위의 CD34+ 줄기 세포에 삽입되어 이러한 세포로부터 유래한 성숙 적혈구가 핵산 공여체에 의해 인코딩된 고농도의 생물학적 제제를 가지게 할 수 있다. 생물학적 제제-내포 RBC는 이후 막관통 단백질 (예컨대 수용체 또는 항체)을 통해 조직을 교정하도록 표적화될 수 있다. 추가적으로, RBC는 에너지 공급원에의 노출 후에 파괴에 더 취약하게 만드는 전기감작을 통해 생체외에서 감작될 수 있다(WO2002007752호를 참조하라).
일부 적용에서, 내생적 유전자가 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 녹아웃될 수 있다. 이러한 양태의 예시는 비정상적인 유전자 조절제 또는 비정상적인 질환 연관 유전자의 녹아웃을 포함한다. 일부 적용에서, 비정상적인 내생적 유전자가 기능적으로 또는 인시추로, 야생형 버전의 유전자로 교체될 수 있다. 삽입된 유전자는 또한 치료적 IDUA 또는 IDS 단백질의 발현을 향상하도록 또는 이의 면역원성을 낮추도록 변형될 수 있다. 일부 적용에서, 삽입된 IDUA 또는 IDS 인코딩 전이유전자는 선택된 조직 가령 뇌로의 수송을 증가시키는 융합 단백질이다.
하기 실시예는 뉴클레아제가 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN) 또는 TALEN을 포함하는 본 개시의 예시적인 구체예에 관한 것이다. 이는 단지 예시의 목적을 위함이며 다른 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 시스템, 예를 들면 조작된 DNA-결합 도메인을 갖는 호밍 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제) 및/또는 조작된 호밍 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인 및 이종 절단 도메인의 자연발생적 융합 및/또는 조작된 단일 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 마우스 ZFN 시약 및 IDUA 공여체 주형의 설계 및 구성
임상 후보 ZFN 및 인간 알부민 공여체 상동성 팔에 대한 표적 서열이 마우스 알부민 좌위에 보존되지 않기 때문에, 이들 마우스 연구에서 사용하기 위해 마우스 대용체 시약을 개발하였다. 마우스 대용체 시약은 마우스 알부민 유전자의 인트론 1 내 상동성 부위를 표적화하는 한 쌍의 ZFN rAAV 벡터 (SB-48641, SB-31523, 하기 표 I 및 표 II에 나타남, 미국 특허 출원 14/872,537호를 참조) 뿐만 아니라 마우스 좌위 (SB-mu-IDUA)에 상동성을 갖는 팔에 의해 측면 부착된 프로모터 없는 인간 IDUA 전이유전자 (hIDUA)를 인코딩하는 공여체를 포함한다 이 연구에서 사용된 ZFN:ZFN:공여체의 비율은 1:1:8이었다. 이 마우스 연구에서, 대용체 시약은 혈청형 rAAV2/8을 이용하여 봉입되고 송달되었고, 이는 이것이 마우스 생체 내에서 rAAV2/6 벡터보다 우월한 형질도입 및 더 빠른 전이유전자 발현을 부여하기 때문이다 rAAV2/8 벡터를 제형화 완충액인, 35 mM NaCl 및 5% 글리세롤로 보충된, pH 7.1 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 희석하였다.
표 1: 마우스 알부민 설계
SBS # 설계
F1 F2 F3 F4 F5
31523 RSDNLSE (서열 번호:1) QSGNLAR (서열 번호:2) DRSNLSR (서열 번호:3) WRSSLRA (서열 번호:4) DSSDRKK (서열 번호:5)
48641 TSGSLTR (서열 번호:6) RSDALST (서열 번호:(7) QSATRTK (서열 번호:8) LRHHLTR (서열 번호:9) QAGQRRV (서열 번호:10)
표 2: 마우스 알부민-특이적 아연 집게의 표적 부위
SBS # 표적 부위
31523 ttTCCTGTAACGATCGGgaactggcatc (서열 번호:11)
48641 ctGAAGGTgGCAATGGTTcctctctgct (서열 번호:12)
마우스 알부민-특이적 ZFN 쌍은 완전히 활성이었다.
실시예 2: 마우스 모델에서 MPS I (IDUA 녹아웃 또는 Idua -/- )의 치료
A. 재료 및 방법
이 연구에서 사용된 MPS I (IDUA 녹아웃 또는 Idua -/-) 마우스 모델은 엘리자베스 노이펠드(Elizabeth Neufeld) (UCLA, Los Angeles, CA) 박사에 의해 네오마이신 저항성 카세트가 엑손 6에 삽입된 IDUA 유전자의 파괴를 통해 생성되었다 (Ohmi 등 (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):1902 -1907). 마우스는 이후 C57BL/6 유전 바탕으로 번식되었고, 이형접합체가 선택되어 Idua -/- 마우스를 생산하였다. 이러한 동형접합 돌연변이는 동물의 수명 주기에 따라 상당한 형태학적, 생화학적 및 신경학적 변화를 일으켰고, 리소좀 병리생리학을 연구하기 위한 적절한 모델인 것으로 입증되었다. 특히, 이들 MPS I 마우스는 MPS I의 전형적인 표현형 특징, 가령 두개 및 안면의 이상, 신경학적 결핍, 및 조직 및 뇨 내 증가된 GAG 수준을 보이는 것으로 나타났다 (Hartung 등 (2004). Mol Ther. 9(6):866-75; Ou 등 (2014). Mol Genet Metab. 111(2):116-22). Idua-/- 마우스는 약 3-5주 이후 이들 증상을 보이기 시작하며 12-16주령에서 GAG의 폭넓은 리소좀 누적이 간 및 중추신경계 (CNS, 즉 뇌, 척수 및 뇌척수막)에서 명백해진다. 또한, 이들 MPS I 마우스는 인지 결핍/장애를 보인다 (Hartung 등 상기와 동일; Ou 등 상기와 동일).
마우스 코호트는 무작위로 정했고 번식이 가능해지는 4-10주령에 투여하였다. 군마다 적어도 2마리의 마우스가 동일 날짜에 투여를 받았다.
동물에 hIDUA 단백질에 대한 가능한 면역원성 반응을 억제하기 위해 사이클로포스파미드를 투여하였다. 모든 마우스가 투여 전날 및 그 후 12주 동안 매주 사이클로포스파미드 (120 mg/kg)의 200 μL 복강내 (IP) 주사를 맞았다. 12주 후에, 마우스는 부검 전까지 두 주에 한 차례 120 mg/kg를 투여받았다. 12주 후에 사이클로포스파미드 투여 빈도를 변화시킨 이유는 사이클로포스파미드의 부작용으로 공지된, 주사 부위 부근의 약한 탈모 및 약한 급성 운동완만 증세가 몇몇 마우스에서 관찰되었기 때문이다. 이전 연구는 매 두 달마다 (Aronovich 등 (2007). J. Gene Med. 9:403-15), 또는 필요시 (Ou 등 (2014) Mol Genet Metabol 111(2):116을 참조하라) 주사하는 스케줄을 이용하여 MPS I 마우스에서 인간 IDUA 활성의 손실을 약화시키는 효율적인 면역억제를 입증하였다.
동물을 성별대로 각각 주령 및 체중에 따라 무작위로 나누었다. 시험 제품 또는 비히클의 단회 투여량을 제1일에 투여하였다. 각각의 군으로부터 세 마리 마우스를 AAV 주사 후 1달 시점에 안락사시켰다. 각각의 군으로부터 나머지 다섯 마리 마우스를 AAV 주사 후 4달 시점에 안락사시켰다. ZFN+공여체 군에 대한 총 rAAV2/8 투여 수준은 1.5e 12 vg/마우스였고, 공여체 단독 군에 대해서는 1.2e 12 vg/마우스였다. 군 및 투여량은 하기 표 3에 나타난다.
표 3: 군 명칭 및 투여 수준
군 군
명칭 		유전자형 동물의 수 각각의 ZFN 투여 수준
(vg/마우스) 		공여체 투여 수준 (vg/마우스) 총 AAV 용량 (vg/마우스) 총 AAV 용량 (vg/kg) 1
수컷 암컷
1 제형화 완충액 대조 C57BL/6 8 0 0 0 0 0
2 제형화 완충액 대조 MPS I 8 0 0 0 0 0
3 제형화 완충액 대조 MPS I 0 8 0 0 0 0
4 ZFN + 공여체 MPS I 8 0 1.5e11 1.2e12 1.5e12 7.5e13
5 ZFN + 공여체 MPS I 0 8 1.5e11 1.2e12 1.5e12 7.5e13
6 공여체 단독 MPS I 4 4 0 1.2e12 1.2e12 6e13
수집 및 측정: 혈액학 및 임상 화학 분석을 위한 혈액 샘플을 모든 동물로부터 동물 부검 (제120일) 전에 악하(submandibular) 출혈을 통해 수집하였다. 동물은 혈청 화학 수집 전 적어도 8 시간 동안 금식시켰다. 혈액학 분석을 위한 혈액 샘플(표적 부피 100-150 μL)을 항응고제로서 칼륨 (K3) EDTA를 함유하는 튜브에 수집하였다. 임상 화학 분석을 위한 혈액 샘플(표적 부피 100-150 μL)을 항응고제가 없는 튜브에 수집하고 혈청으로 처리하였다.
IDUA 활성 평가를 위해, 혈액 샘플 (표적 부피 200 μL)을 모든 마우스로부터 제7, 14, 28, 60, 90, 104 및 120일에 악하 출혈을 통해 항응고제로서 헤파린을 함유하는 튜브에 수집하고 혈장으로 처리하였다.
뇨의 글리코사미노글리칸 (GAG) 수준을 평가하기 위해, 뇨 샘플 (대략 10-100 μL)을 제7, 14, 21, 28, 42, 60, 74, 90, 104 및 120일에 방광에 압력을 부드럽게 가하여 모든 마우스로부터 수집하였다.
마우스 조직으로부터의 유전체 DNA 단리: 대략 5 mg의 동결된 조직을 용해 매트릭스 D 튜브 (MP Biomedicals, Burlingame, CA)에 담고 400 μL의 조직 및 세포 용해 용액 (Epicentre, Madison, WI)을 부가하였다. FastPrep®-24 장비 (MP Biomedicals)에서 파쇄를 세 차례, 40초/4 m/s의 펄스로 수행하였다. 미정제 용해물을 짧게 원심분리하고 이후 65℃에서 30분간 항온처리한 후 용해물이 맑아지도록 짧게 원심분리하였다. 부분적으로 투명해진 용해물을 얼음 상에 5분간 배치하고 미세원심분리 튜브로 옮기고, 이후 400 μL의 MPC 단백질 침전 시약 (Epicentre)을 부가하였다. 혼합물을 짧게 와류 교반하고, 이후 4℃에서 10분간 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후, 투명해진 용해물을 새로운 미세원심분리 튜브로 옮기고 1 mL의 매우-차가운 이소프로판올을 부가하고, 30-50차례 뒤집어서 혼합하고, -20℃에서 20분간 항온처리하였다. 혼합물을 4℃에서 10분간 14,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 생성된 펠렛을 75% 에탄올로 두 차례 세척하고 공기 건조되게 하였다. DNA 펠렛을 100 μL TE 완충액 내에 재-현탁시키고 DNA 농도 (ng/μL)를 NanoDrop 분광광도계 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 측정하였다.
유전자 변형 분석: MiSeq 심층 서열분석: 표적 간세포에서 마우스 대용체 ZFN 구조체의 활성을 평가하기 위해, 유전체 DNA를 각각의 마우스의 간으로부터 단리하였다. ZFN 표적 부위를 MiSeq 시스템 (Illumina, San Diego CA)을 이용하여 서열 분석 처리하였다. 마우스 알부민 좌위 (표 4) 내 ZFN 표적 부위에 걸친 169-염기 쌍 (bp) 단편의 증폭을 위해 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고 두 번째 증폭 회차를 위해 결합 서열을 도입하였다 (볼드 표시). 이러한 중합효소 사슬 반응 (PCR) 증폭의 산물을 정제하고 증폭절-특이적 식별자 서열 ("바코드")에 도입하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드, 뿐만 아니라 결합 서열분석 올리고뉴클레오티드 프라이머 결합을 위해 설계된 말단 영역과 함께 두 차례의 PCR로 처리하였다. 혼합된 바코드-증폭절 집단은 이후 단일 어세이 칩 상에서 수천가지 샘플의 병렬 분석을 허용하는 고체-상 서열분석 절차인, MiSeq 분석으로 처리된다. MiSeq 프로토콜은 각각의 유입 올리고뉴클레오티드에 대한 순방향 및 역방향 서열분석 반응을 둘다 연속적으로 수행한다. 쌍을 이룬 서열이 정렬되고 합쳐지고 삽입 및/또는 결실 ("삽입-결실")을 맵핑하기 위해 야생형 서열과 비교된다. ZFN 활성은 삽입 또는 결실에 의해 야생형과 상이한 서열분석된 증폭절의 비율인 "% 삽입-결실"로 보고된다.
표 4. MiSeq 삽입/결실 (삽입-결실) 분석을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드
PCR#1: 알부민 (인트론 1) 특이적 프라이머
순방향 ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAAATCTTGAGTTTGAATGCACAGAT (서열 번호:13)
역방향 GACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCACTGACCTAAGCTACTCCC (서열 번호:14)
hIDUA 웨스턴 블롯: 마우스 간세포에서 hIDUA의 발현을 검사하기 위해, 웨스턴 블롯을 간 단백질 추출물에 대해 수행하였다. 대략 50 mg의 동결된 조직을 용해 매트릭스 D 튜브 (MP Biomedicals, Burlingame, CA)에 담고 HALT 프로테아제 저해제 (Thermo Fisher Scientific)로 보충된 500 μL의 RIPA 완충액을 부가하였다. FastPrep®-24 장비 (MP Biomedicals)에서 파쇄를 다섯 차례, 45초/4.5 m/s의 펄스로 수행하였다. 파쇄 회차 사이에 튜브를 얼음에 배치하였다. 미정제 용해물을 이후 4℃에서 10분간 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후, 투명해진 용해물을 미리-차게 식힌 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 단백질 농도를 이후 PierceTM 바이신코닌산 (BCA) 단백질 어세이 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 통해 측정하였다. 변성 조건 하에서, 35 μg의 총 단백질을 4-12% NuPAGE Novex 비스-트리스 겔 (Life Technologies; Grand Island, NY)에서 분리하였고 니트로셀룰로스 막 상에 고정하였다. 막을 Odyssey 차단 완충액 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였고, 이후 Odyssey 차단 완충액에 희석된 일차 항체로 밤새 4℃에서 탐침 처리하였다. 막을 트리스-완충 식염수 + 0.05% 트윈-20 (TBST) 용액에서 각각 5분간 5차례 세척하고 이후 Odyssey 차단 완충액 내 이차 항체로 1시간 동안 실온에서 탐침 처리하였다. 이차 표지 후, 막을 TBST에서 5분간 5차례 세척하였다. 마지막으로, 균일한 단백질 로딩을 측정하기 위해, 막을 GAPDH-800 표지된 항체로 1시간 동안 실온에서 탐침 처리하였다. 세척을 상기에서처럼 반복하고 LI-COR Odyssey 스캐너를 이용하여 막을 촬영하였다.
IDUA 효소 활성 어세이: 혈장 및 조직 단백질 추출물 내 IDUA 효소 활성을 합성 기질 4-메틸움벨리페릴 알파-L-이두로나이드 (4-MU-이두로나이드; Glycosynth, Warrington, Cheshire, England)를 이용한 형광 어세이로 평가하였다. 조직 단백질 추출물을 마우스 조직 샘플과 1 mL의 PBS (pH 7.4)를 혼합시켜 제조하였다. 샘플을 얼음에 보관하고, Polytron® 파쇄기 (Kinematica, Lucerne, Switzerland)를 이용하여 5의 속도 수준으로 5초간 파쇄하였다. 파쇄를 3차례 반복하거나, 또는 고체 조직 입자가 눈에 보이지 않을 때까지 반복하였다. 파쇄 이후, 11 μL의 10% Triton X-100을 각각의 샘플에 부가하였다. 파쇄액을 이후 얼음에서 10분간 항온 처리하고, 그 후에 미정제 파쇄액을 3,000 rpm로 10분간 원심분리하여 용해물을 분석 전에 투명하게 만들었다. 조직 추출물 내 단백질 농도를 PierceTM 660 nm 단백질 어세이 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여, 제조사의 설명에 따라 측정하였다.
IDUA 효소 활성 어세이에서, 25 μL의 마우스 조직 단백질 추출물 또는 마우스 혈장 샘플을 포르메이트 완충액 (0.4 M 나트륨 포르메이트, pH 3.5, 0.2% Triton X-100)에 용해된 25 μL의 360 μM 합성 기질 (4-MU-이두로나이드)과 혼합하였다. 반응물을 37℃에서 30분간 항온처리하고 200 μL의 글리신 카르보네이트 완충액 (84 mM 글리신, 85 mM 무수 탄산나트륨)을 부가하여 종결시켰다. 4-MU의 방출은 BioTek 마이크로플레이트 판독기 (BioTek, Winooski, VT)를 이용한 형광 (Ex365/Em450) 측정에 의해 측정하였다. 표준 곡선을 4-MU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 희석을 이용하여 생성하였다. 생성된 데이터를 선형 곡선과 정합시키고 시험 샘플 내 4-MU의 농도를 이러한 최-정합 곡선을 이용하여 산출하였다. 효소 활성은 어세이 배양 시간의 시간당, 혈장의 mL당 또는 조직 추출물의 mg당 방출된 nmol 4-MU로서 표현된다(nmol/hr/mL 또는 nmol/hr/mg).
뇨 및 마우스 조직 내 GAG 수준의 평가: 조직 및 뇨 내 GAG 수준을 BlyscanTM 글리코사미노글리칸 어세이 키트 (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, United Kingdom)를 이용하여, 제조사의 설명에 따라 측정하였다. GAG 어세이 전에, 상기 기술된 바와 같이 제조된 마우스 조직 파쇄액을 프로테이나제 K (20 mg/mL)와 1:3의 비율로 혼합하고 55℃에서 24시간 동안 분해시키고, 이어서 10분간 가열함으로써 프로테이나제 K를 열 비활성화시켰다. 조직 파쇄액을 그후 교반하면서 24시간 동안 실온에서 200 단위의 DNA 가수분해효소 및 2 μg의 리보뉴클레아제로 분해시켰다. DNA 가수분해효소 및 리보뉴클레아제를 이후 10분간 가열함으로써 열 비활성화시키고, 생성된 조직 파쇄액을 GAG 어세이를 위해 사용하였다.
병리조직학 분석: 종말점 체중 및 장기 (부신, 뇌, 심장, 신, 간, 비장, 고환 또는 난소) 중량을 수컷 (군 1 [n=5], 군 2 [n=4], 군 4 [n=4], 및 군 6 [n=2]) 및 암컷 (군 3 [n=4], 군 5 [n=5], 및 군 6 [n=2])에 대한 제120일의 부검시 수집하였고, 군의 중간 및 표준 편차를 엑셀에서 통상적으로 산출하였다.
군 1 내지 6으로부터의 동물을 부검하였고 수집된 조직을 고정하기 휘애 10% 중성 완충된 포르말린 (NBF)에 배치하였다. 다음의 조직을 절제하여 조직학적 단면을 생성하였다: 부신, 대동맥, 뇌, 맹장, 자궁경부, 결장, 십이지장, 부고환, 식도, 눈, 대퇴부-경골 관절, 쓸개, 하르더샘, 심장, 회장, 주사 부위, 공장, 신장, 후두, 간, 폐와 기관지, 림프절 (장간막), 시신경, 난소, 췌장, 부갑상샘, 뇌하수체, 전립선, 직장, 침샘, 궁둥신경, 정낭, 골격근 (대퇴 사두근), 피부, 척수 (경추, 요추, 흉추), 비장, 흉골과 골수, 위장, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 기관, 방광, 자궁, 및 질. 모든 투여군의 동물로부터, 상기 나열된 조직은 통상적으로 처리되고, 파라핀 블록에 포매되었다. 블록을 자르고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 슬라이드를 면허가 있는 수의학 병리학자가 현미경으로 평가하였다.
B. 결과
유전자 변형 분석: 알부민 좌위에서의 삽입-결실 백분율: 생체 내 표적 간세포에서 ZFN 구조체의 활성을 평가하기 위해, 유전체 DNA를 부검시 모든 마우스의 간으로부터 단리하였다. 마우스 알부민 인트론 1 좌위에서의 ZFN 표적 부위를 MiSeq 시스템 (Illumina, San Diego CA)을 이용하여 서열 분석 처리하였다. ZFN 활성을 이후 ZFN 활성의 특징인 소형 삽입 및/또는 결실 (삽입-결실)의 존재에 의해 측정하였다. ZFN 활성은 대용체 마우스 ZFN + SB-mu-IDUA (군 4 및 5)를 수용한 마우스의 모든 군에서 검출되었다. 1달 시점의 간 조직에서 알부민 유전자 변형의 수준 (% 삽입-결실)은 수컷 및 암컷 동물에 있어서, 각각 46.67 ± 5.74% 및 34.05 ± 2.06% (중간 ± SD)이었다. 4달 시점의 유전자 변형 수준은 수컷 및 암컷 동물에 있어서, 각각 55.65 ± 4.08% 및 45.69 ± 2.26%이었다. 두 시점 모두의 제형화 완충액 대조군 또는 공여체 단독군에서 배경을 넘어서는 ZFN 수준은 존재하지 않았다.
간-특이적 프로모터의 특이성을 확인하기 위해, MiSeq 분석을 또한 비장, 심장, 및 근육으로부터의 유전체 DNA 에 수행하였다. 이들 장기는 이들이 ZFN+공여체-처리 마우스의 간 외부에서 가장 높은 수준의 IDUA 활성을 보였기 때문에 선택되었다 (도 1A 참조). 이들 분석을 군 4 및 군 5의 마우스에 수행하였고, 이는 이들이 표적-적중 조직에서 가장 높은 수준의 ZFN 활성을 보였기 때문이다. 상응하는 미처리된 수컷 마우스 (군 2)는 음성 대조로서 포함되었다. 4 달 시점에서 군 2 및 4의 비장 및 심장 (비-표적 조직)에서는 어떠한 유전자 변형도 관찰되지 않았으므로, 이는 간-특이적 프로모터의 특이성을 확인시켜주고 이들 조직에서 관찰되는 IDUA 활성 및 GAG 감소가 간 외부에서 ZFN 활성 및 공여체 통합으로부터 유래하지 않았음을 입증해준다.
hIDUA 웨스턴 블롯. 간세포에서 마우스 알부민 좌위의 적절한 유전자 변형을 확인한 후에, 간으로부터 추출된 단백질을 다음으로 알부민 좌위로부터의 hIDUA 발현에 대해 검사하였다. 내생적 마우스 IDUA로부터의 가능한 바탕 신호를 방지하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 인간 IDUA에 대응하도록 만들어진 검출 항체를 이용하여 수행하였다.
도 1B에 나타난 바와 같이, hIDUA는 1 및 4 달 시점에 마우스 대용체 ZFN + hIDUA 공여체를 수용한 모든 수컷 및 암컷 마우스의 간에서 검출가능하였다. 발현은 4 달 시점에 증가한 것으로 보였다. 제형화 완충액만 단독으로 주입한 야생형 대조 마우스는 hIDUA 신호를 보이지 않았고, 이는 사용된 항체의 종-특이성을 나타낸다. ZFN의 부재(공여체 단독 군)에서는 hIDUA 신호가 관찰되지 않았기 때문에, hIDUA의 발현은 ZFN 및 hIDUA 공여체 둘다의 존재에 의존적이었다.
IDUA 효소 활성. 간 알부민 좌위로부터 발현된 hIDUA 전이유전자가 기능적으로 활성인 단백질을 생산하는지 여부를 확인하기 위해, 형광-기반 효소 활성 어세이를 IDUA에 대해 수행하였다. 이러한 어세이를 1) 간으로부터의 단백질 추출물(발현된 효소가 활성이었음을 보장하기 위함); 2) 혈장 (발현된 효소가 간세포로부터 분비된 것이었는지를 확인하기 위함); 및 3) 뇌, 심장, 폐, 근육, 및 비장으로부터의 단백질 추출물 (효소가 이차 조직에 의해 흡수될 수 있는 형태로 발현되는지를 확인하기 위함)에 대해 수행하였다.
1달 시점에, ZFN+공여체-처리된 마우스의 간에서 IDUA 활성 (수컷 및 암컷 동물, 각각에 있어서 65.26 ± 24.68 및 40.54 ± 14.54 nmol/hr/mg)은 야생형 마우스에서 측정되는 활성의 수준 (4.09 ± 0.99 nmol/hr/mg)보다 9 내지 10배 더 높았다. ZFN+공여체-처리된 마우스에서의 IDUA 활성은 또한 대조 (0.11 ± 0.02 [수컷] 및 0.16 ± 0.04 [암컷] nmol/hr/mg) 및 공여체 단독 (0.18 ± 0.05 nmol/hr/mg) MPS I 마우스 둘다에서의 활성에 비해 현저하게 증가하였다. ZFN의 부재 (공여체 단독)에서 SB-mu-IDUA 공여체를 수용한 MPS I 마우스에서 관찰되는 낮은 수준의 활성은 ZFN 및 SB-mu-IDUA 공여체가 둘다 마우스 간세포에서 hIDUA의 통합 및 발현을 위해 필요하다는 것을 보여준다.
4달 시점의 ZFN+공여체-처리된 마우스에서 간 IDUA 활성(수컷 및 암컷 동물, 각각에 있어서 147.32 ± 65.86 및 63.59 ± 43.42 nmol/hr/mg)은 야생형 동물에서의 활성 (8.05 ± 1.55 nmol/hr/mg)에 비해 더욱 증가하였다.
도 2A에 나타난 바와 같이, ZFN+공여체 처리된 마우스에서의 혈장 IDUA 효소 활성이 또한 시작 제14일 및 연구 전반에 걸쳐 대조 및 공여체 단독 마우스에서 관찰된 수준에 비해 증가하였다. 평균 IDUA 활성은 제14일부터 연구가 끝날 때까지 야생형 대조 마우스에서 관찰되는 내생적, 생리학적 수준을 넘어 상승된 ~1.5-10 배로 유지되었다. IDUA 활성을 1달 및 4달 시점에 뇌, 심장, 간, 폐, 근육 및 비장에서 비교하였고 (도 2C) ZFN+공여체 군에서 4달 시점의 IDUA 활성은 심장, 간, 폐, 및 비장 (수컷 및 암컷) 및 근육 (수컷만)에서 성별-대응된, 미처리된 MPS I 마우스에 비해 상당히 더 높은 활성을 나타내었다.
대용체 마우스 ZFN + hIDUA 공여체 둘다를 수용한 MPS I 마우스에서, 1달 시점의 뇌를 제외한 모든 비-표적 조직에서 IDUA 활성은, 야생형 마우스에서의 활성 수준에 도달하였고, 이는 간세포 내 알부민 좌위에서 생산된 IDUA가 혈장으로 분비되어, 이로부터 활성 형태로 이차 조직에 흡수되었음을 나타낸다(도 4를 참조). 뇌에서는 IDUA 활성 증가가 검출되었고, 이는 야생형 마우스의 뇌에서 측정되는 IDUA 활성의 대략 5%에 상응한다 (도 4E를 참조).
뇨 및 마우스 조직 내 GAG 수준의 평가: ZFN+공여체-처리된 MPS I 마우스에서 IDUA 효소 결핍증의 관찰된 교정이 질환 생체마커인 글리코사미노글리칸 (GAG)의 시간에 따른 증가된 수준 또는 감소의 예방과 연관되었는지 확인하기 위해, GAG 수준을 모든 동물의 뇨 및 조직 추출물에서 측정하였다.
결과는 제형 완충액을 수용한 MPS I 마우스에서 뇨의 GAG 수준이 연구 전반에 걸쳐 질환이 진행됨에 따라, 야생형 마우스의 수준보다 증가되었음을 나타내었다. 도 3C에 나타난 바와 같이, 수컷 및 암컷 MPS I 마우스에서 대용체 마우스 ZFN 및 hIDUA 공여체 둘다로의 처리가 투여-후 제14일에 미처리된 MPS I 마우스에서 보이는 뇨의 GAG 수준 증가를 방지하였다. GAG 수준은 또한 제형화 완충액-처리된 수컷 및 암컷 MPS I 마우스의 모든 조직(뇌 제외)에서 야생형 마우스에 비해 현저하게 증가하였다 (도 5를 참조). 이들 수준은 ZFN+공여체-처리된 MPS I 동물에서는 완전히 정상화되었다. 정상화는 간(IDUA가 알부민 좌위로부터 생산되는 장소) 및 이차 조직(혈장으로부터 IDUA를 흡수했을 장소) 모두에서 발생하였다. 뇌에서 GAG 수준은 처리된 동물에서 처리 안된 동물에 비해 더 낮았다 (도 5E를 참조).
이러한 데이터는 간-생산된 hIDUA가 순환계 (혈장)로 들어가고 비장, 심장, 간, 폐, 및 골격근에 의해 흡수되어, ZFN+공여체-처리된 MPS I 마우스에서 이차 조직의 GAG 수준의 감소를 야기하였음을 나타내었다
병리조직학 평가
중간 및 종말점 부검, 연구 제28일 및 120일
조직의 하위집합 (뇌, 폐, 심장, 간, 골격 근육 및 비장)을 제28일 부검으로부터 평가하였다.
야생형 C57BL/6 대조 동물은 시험 제품-연관 병리적 결과를 보이지 않았다. 수컷 및 암컷 MPS I 대조 마우스는 신체 전체에 다양한 세포 유형의 공포형성을 일으켰고, 이는 글리코사미노글리칸 (GAG)의 리소좀 누적으로 해석되었다. 공포형성은 글리코사미노글리칸으로 부풀어오른 리소좀의 특징적인 현미경 모습이다 (Ohmi 등 (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(4):1902-1906). 제28일의 수컷 및 암컷 MPS I 대조 마우스와 비교할 때, 제120일의 동물은 GAG의 리소좀 누적으로 간주되는 신체 전반에 걸친 다양한 세포 유형의 전형적인 공포형성의 증가된 발생 및/또는 중증도를 가졌다. 야생형 C57BL/6 대조 동물은 제28일 또는 120일에 시험 제품-연관 병리적 결과를 보이지 않았다.
CNS 조직 평가. MPS I 대조와 비교할 때, ZFN+hIDUA 공여체 또는 hIDUA 공여체-단독 처리된 동물은 뇌 내 거대 뉴런 또는 교세포 공포형성의 유사한 발생 및/또는 중증도를 가졌다. 그러나, 척수에서, ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 수컷은 신경세포 또는 교세포 공포형성의 감소된 발생 및/또는 중증도를 가졌다. 유사하게, ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 암컷은 암컷의 요추부 척수 내 교세포 공포형성을 제외하고는, 신경세포 또는 교세포 공포형성의 감소된 발생 및/또는 중증도를 가졌다.
비-CNS 조직 평가. 대동맥 공포형성 (혈관 중간막)의 중증도는 MPS I 또는 hIDUA-단독 대조 (각각 최소-내지-약함 및 중간)와 비교할 때 ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 동물에서 감소하였다. MPS I 대조와 비교할 때, 폐, 심장 판막 또는 간질, 대동맥 혈관 중간막, 신장 관상 상피, 방광 (요로상피 및 간질), 골격근 간질성 세포, 비장 대식 세포/ 조직구, 장간막 림프절 대식 세포/조직구, 흉선 간질성 세포, 쿠퍼 세포, 궁둥 신경, 부갑상샘 세포, 각막 기질/내피 세포 (데스메 막), 위장관 (근육층 및 간질 [암컷에는 사실상 부재]), 뇌하수체 전엽, 및 ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 동물의 주사 부위 (군 4 및 5)에서 공포형성의 감소된 발생 및/또는 중증도가 존재하였다. ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 암컷에서 (군 5), 흉골 또는 대퇴경골 관절 연골세포/골세포/골막 세포, 대퇴경골 관절 활막의 공포 형성의 감소된 발생, 및 난소, 자궁, 자궁경부, 및 질 내 공포형성이 존재하였다. ZFN+hIDUA 공여체를 수용한 수컷에서, 부고환 상피 또는 간질 세포 공포형성의 감소된 발생이 존재하였다.
신경행동 평가: 반즈 미로. 마우스의 인지 성능을 부검 전 마지막 일주일간 반즈 미로 시험을 이용하여 시험하였다. MPS I 마우스는 반즈 미로 (Belur 등(2015). Presented at American Society of Gene and Cell Therapy ASGCT May 13-16; New Orleans, LA) 및 다른 인지 능력 평가시험, 가령 물 T-미로 (Ou 등. 상기와 동일) 둘다에서 학습능력 결핍이 이미 나타난 바 있다.
반즈 미로 시험은 플랫폼의 중심 주변으로 둥글게 자리한 사십 개의 구멍이 있는 둥근 플랫폼에서 이루어진다. 도 6을 참조하라. 모든 구멍은 마우스가 구멍으로 접근할 수 있는 "탈출 박스"가 달린 하나의 구멍을 제외하면 막혀 있다. 밝은 머리위 광원이 회피 자극을 만들어, 동물로 하여금 표적 탈출 구멍을 찾게 하고 빛을 피하도록 유인한다. 잘 보이는 곳에 시각적 신호가 미로 주변 벽에 배치되며 마우스의 방향을 지시하는 공간적 신호로 기능한다(도 6을 참조). 마우스를 반즈 미로에서 6일간, 매일 4 시도씩, 시험당 3분의 최대 시간 제한을 두어 훈련하였다. 시간 간격은 각각의 동물에 있어서 연속적인 시도 사이에 12-15분이었다.
수컷 및 암컷 동물, 각각에 있어서 도 7A 및 7B에 나타난 바와 같이, 야생형 수컷 마우스는 시험하는 6일에 걸쳐 표적 탈출 구멍을 찾는 경과 시간의 감소로 표시된 바와 같이 시간이 지나면서 향상된 반면, 미처리된 MPS I 수컷 마우스에서는 시간이 지나도 탈출 경과 시간이 향상되지 않았다 (제4-6일에 p<0.05 vs. 야생형). 반면, 대용체 마우스 ZFN + hIDUA 공여체를 수용한 수컷 MPS I 마우스는 제형화 완충액-처리된 MPS I 군에 비해 시간이 지나면서 탈출 능력의 향상을 보였고 (제4-6일에 p<0.05), 야생형 동물과 완전히 동일하게 행동하였다. 시험 제4일에, ZFN+공여체-처리된 수컷 MPS I 마우스는 표적 구멍을 찾는데 제6일의 53 ± 26 (중간 ± SEM) 초 평균과 학습 거동에 있어서 통계학적으로 상당한 차이를 나타낸 반면, 미처리된 수컷 MPS I 마우스는 표적을 찾는데 149 ± 17 초를 소요하였다. 야생형 수컷 마우스는 제6일에 51 ± 15 초에 표적에 도달하였다.
제형화 완충액을 수용한 암컷 MPS I 마우스는 시험하는 6일에 걸쳐, 야생형 마우스에 비해 상당한 능력 차이를 보이지 않았다. 그러나, ZFN + 공여체로 처리된 암컷 MPS I 마우스는 연구의 경과 동안 계속 더 나은 탈출 능력으로 향하는 경향을 나타내었다. 제6일에, 처리된 암컷 MPS I 마우스는 표적 구멍을 찾는데 38 ± 23 초를 소요했고, 제형화 완충액-처리된 암컷 MPS I 마우스는 표적을 찾는데 96 ± 33 초를 소요하였다. 이들 결과는 hIDUA가 MPS I 마우스에서 CNS에 접근할 수 있고 hIDUA 단백질을 혈액-뇌 장벽의 통과가 용이하도록 변형시키지 않고도 긍정적인 신경행동 효과를 만들었음을 시사한다. (예컨대, Ou 등 상기와 동일을 참조하라). 그러므로, 본 명세서에서 달성된 IDUA의 꾸준하게 높은 혈장 수준(간으로부터의 지속적인 분비로 인함)은 변형되지 않은 IDUA가 혈액-뇌 장벽을 통과하게 하였다.
중요하게는, GAG 데이터는 ZFN+공여체-처리된 MPS I 마우스에서 발현된 IDUA 활성이 뇨 GAG 수준의 정상화, 뿐만 아니라 간 및 이차 조직에서 GAG 수준의 감소와 연관되어 있음을 나타내었다. 게다가, 처리는 CNS 및 다른 표적 조직 내 공포형성 감소 경향 뿐만 아니라 반즈 미로 시험에서 인지 능력 향상 (향상된 공간 기억)과 연관되었다.
요약하면, 본 명세서에서 제시되는 데이터는 MPS I 개체에 있어서 알부민 좌위의 ZFN-매개 유전자 교체가 질환을 치료함을 증명한다. 이러한 4-달 약리/독성 연구는 다음을 입증한다: 간-향성 rAAV2/8 벡터를 통한 대용체 마우스 ZFN과 hIDUA 전이유전자 공여체의 동시-송달은 1) 생체 내 MPS I 마우스 간세포에서 알부민 좌위의 효율적인 변형; 2) 간에서 높은 수준의 hIDUA 효소 발현 및 활성; 3) 혈장으로 기능적 효소의 분비; 및 4) 비장, 폐, 심장, 근육 및 뇌를 비롯한 이차 조직에 의한 혈장으로부터의 IDUA의 흡수를 야기한다. 게다가, 이 결과는 또한 달성된 IDUA 활성 수준이 비-표적 조직 내 대사 결함 (GAG 누적)의 적어도 부분적인 교정을 위해 충분하며, 이것이 향상된 거동 기능을 야기함을 입증한다.
실시예 3: 마우스 모델에서 MPS II (IDS 녹아웃 또는 Ids Y/-)의 치료
IDUA 전이유전자를 이용한 MPS I의 치료를 위해 위에서 시행된 작업과 유사하게, 교정성 인간 IDS 전이유전자를 이용한 실험을 MPS II 마우스 모델 시스템에서 반복하였다. AAV2/8 바이러스는 IDS 전이유전자를 포함하여 제작하였고 마우스 알부민 유전자의 인트론 1 내 상동성 부위를 표적화하는 마우스 ZFN rAAV 벡터 (SB-48641, SB-31523, 미국 특허 출원 14/872,537호에 나타남) 뿐만 아니라 마우스 좌위 (SB-mu-IDS)에 상동성을 가진 팔에 측면 부착된 프로모터가 없는 인간 IDS 전이유전자 (hIDS)를 인코딩하는 공여체를 이용하여 MPS II 마우스를 치료하기 위해 사용하였다. 이 연구에서 사용된 ZFN:ZFN:공여체의 비율은 1:1:8이었다. 이 마우스 연구에서, 대용체 시약은 혈청형 rAAV2/8을 이용하여 봉입되고 송달되었고, 이는 이것이 마우스 생체 내에서 rAAV2/6 벡터보다 우월한 형질도입 및 더 빠른 전이유전자 발현을 부여하기 때문이다 rAAV2/8 벡터를 제형화 완충액인, 35 mM NaCl 및 5% 글리세롤로 보충된, pH 7.1 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 희석하였다.
연구 설계가 6군의 마우스 및 사용된 각각의 유형의 AAV2/8 바이러스의 양을 나열하는 하기 표 5에 나타난다.
표 5: MPS II 연구 설계
군 성별 유전자형 처리 ZFN (각각) 공여체
1 수컷 야생형 제형화 대조 N/A N/A
2 수컷 MPS II 제형화 대조 N/A N/A
3 수컷 MPS II ZFN+공여체
저용량 		2.50E+10 2.00E+11
4 수컷 MPS II ZFN+공여체
중간 용량 		5.00E+10 4.00E+11
5 수컷 MPS II ZFN+공여체
고용량 		1.50E+11 1.20E+12
6 수컷 MPS II 공여체 단독
중간 용량 		N/A 4.00E+11
본 연구는 본질적으로 MPS I 치료에 대해 위에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 웨스턴 블롯을 상기 기술된 바와 같이 진행하고 발현된 인간 IDS 단백질을 마우스 단백질의 검출을 방지하기 위해 인간 IDS 단백질에 대응하도록 만들어진 항체를 이용하여 검출하였다 (R&D Systems사의 AF2449). 결과는 인간 IDS 단백질이 1달 및 4달 시점에 ZFN 및 공여체 (상기 군 3, 4, 및 5)를 둘다 수용한 처리군에서 검출가능하였음을 나타내었다.
IDS 활성을 분석할 조직을 용해하고 이어서 IDS 활성의 검출함으로써 검출하였다. 따른 방법은 하기와 같다:
조직 용해: 조직 단백질 추출물을 마우스 조직 샘플과 염수(0.9% 염화나트륨)를 혼합시켜 제조하였다. 샘플을 얼음에 저장하고, Bullet Blender® 파쇄기 (Next Advance, Averill Park, NY)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄를 고체 조직 입자가 눈에 보이지 않을 때까지 수행하였다. 파쇄 후, 미정제 파쇄액을 4°C에서 최대 속도로 15분간 원심분리하여 용해물을 분석 전에 투명하게 만들었다. 조직 추출물 내 단백질 농도를 PierceTM 660 nm 단백질 어세이 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여, 제조사의 설명에 따라 측정하였다.
IDS 활성 어세이: IDS 효소 활성을 합성 기질 4 메틸움벨리페릴 α L 아이도피라노스이두론산 2 설페이트 (4 MU IDS; Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 형광 어세이로 평가하였다.
이는 Voznyi 등 ((2001), J. Inherit Metab Dis 24(6): 675-80)에 기술된 두-단계 어세이다. 제1 단계에서, 4 MU IDS는 시험 샘플과 항온처리되고; IDS가 존재하는 경우, 이것이 기질로부터 설페이트 기의 제거를 촉매한다. 생성된 화합물, 4 메틸 움벨리페릴 α L 이두로나이드 (4 MU 이두로나이드)는 제2 효소, α L 이두로니다아제 (IDUA)에 대한 기질이다. 제1 단계를 고정된 시간 동안 항온처리한 후에, IDS 활성을 퀀칭하고 과량의 재조합 IDUA를 부가하여, 4 MU 이두로나이드의 절단을 일으켜서, 형광 화합물 4 메틸움벨리페론 (4 MU)을 얻었다. 간략하게, 10 μL의 희석된 샘플을 기질 완충액 (0.1 M Na 아세테이트, pH 5.0, 10 mM Pb(II) 아세테이트)에 용해된 20 μL의 1.25 mM 4 MU IDS와 혼합하였다. 반응물을 이후 37℃에서 항온처리하였다.
IDS 활성을 중지시키고 임의의 탈설페이트된 기질을 4 MU로 전환시키기 위해, 20 μL의 2x 농축된 맥일베인 완충액 (0.2 M 시트레이트, 0.4 M 포스페이트, pH 4.5)을 각각의 샘플에 부가한 뒤에, 10 μL의 1 μg/mL 재조합 IDUA를 부가하였다. IDUA 반응물을 밤새 37℃에서 항온처리하고, 이후 200 μL 중지 용액 (0.5 M NaHCO3 / Na2CO3, pH 10.7, 0.2% Triton X 100)을 부가하여 종결시켰다. 4 MU의 방출은 SynergyTM MX 마이크로플레이트 판독기 (BioTek, Winooski, VT)에서 형광 (Ex365/Em450) 측정에 의해 측정하였다.
표준 곡선을 4 MU (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 이용하여 생성하였다. 생성된 데이터를 도표화하고, 로그 로그 곡선을 데이터와 정합시키고, 시험 샘플 내 4 MU의 농도를 이러한 최정합 곡선을 이용하여 산출하였다. 효소 활성은 어세이 배양 시간의 시간당(첫 반응 단계만), 혈장의 mL당 또는 단백질 용해물의 mg당 방출된 nmol 4 MU로서 표현하였다(nmol/hr/mL 또는 nmol/hr/mg).
IDS 단백질을 처리-후 1달 및 4달 시점의 동물의 간에서 측정하였다(도 8A). 데이터는 단백질이 공여체 및 ZFN을 둘다 수용한 모든 군에서 검출가능했음을 나타내었다. 또한, 활성을 시간이 지남에 따라 처리 군의 혈장에서 측정하였고, 활성을 ZFN 및 공여체를 수용한 군의 모든 샘플에서 검출하였다. 가장 높은 활성은 고용량 군에서 검출하였다 (도 8B). 4달 후 희생 시점에, IDS 활성을 또한 ZFN 및 공여체를 수용한 동물의 모든 조직에서 검출하였다. 활성을 또한 연구 내 동물의 수많은 장기에서 측정하였고(도 8C), 고용량 처리군은 뇌를 비롯한 시험된 모든 조직에서 미처리된 MPS II 마우스에 비해 현저하게 더 높은 IDS 활성을 보인다.
조직 GAG 수준을 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정하였고 결과는 뇌를 제외한 고용량 동물로부터 분석된 모든 조직에서 GAG의 상당한 감소를 보였다(도 9A 및 9B).
처리군의 인지능력을 처리-후 4달에 반즈 미로 시험을 이용하여 시험하였다(도 10). 데이터는 시험하는 6일 동안 표적(하루 평균 4회 시도)을 동물이 찾는데 걸린 시간의 중간 ± SEM을 나타낸다. 각각의 개별적인 마우스에 대한 데이터가 하기 표 6에 제시된다 (각각의 시험 일의 각각의 마우스에 대한 구멍에 도달하기까지의 시간을 초로 표시). 개별적인 마우스에 대한 데이터가 표의 수평 방향을 가로질러 나타나고 (여기서 각각의 마우스는 1 내지 10번으로 표시되고, 각각의 데이터 점수는 시험일 하루에 네 번 시도한 것의 평균임) 각각의 자취(시험 제1-6일)는 수직 방향에 나타난다. 높은 처리 용량에서, 처리받은 동물 및 미처리된 MPS II 동물 사이에 현저한 차이가 존재하였다.
표 6: 반즈 미로에서 MPS II 처리군의 인지 능력(초)
시도 마우스 수 →
↓ 야생형, 미처리 (n=10)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 180 180 156.75 180 180 180 138 145.25 97.25 180
2 157.25 180 135.25 120.25 136.5 121.5 103.75 83.75 47 151.5
3 36 150 123.75 64 140 68.75 29.75 31.75 15.75 107.25
4 102 88 98.75 38.75 87.5 20 10.25 22.75 13 56
5 11.5 96.5 23.5 28 28 8.25 14.5 12.75 17 37.75
6 14.25 30 55 9 14.25 10.75 32.25 17.25 13.25 33.25
MPS II, 미처리 (n=10)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 168 79.75 126 180 180 180 180 148.5 174.25 180
2 167.5 49.25 76.75 81.25 79.75 122.5 55.25 46.25 37.25 103.25
3 101 90.5 34 12.75 35.25 59.25 33 40.75 81.25 121.75
4 137.75 30.5 83.75 97.25 89.75 65.5 50 38.25 63.75 107
5 99.25 23.25 30.5 66 114.25 56 29.25 14.5 34.75 79
6 106.75 15 63 16.75 74.25 127.75 42 55.25 62.5 106.75
MPS II, ZFN+공여체 고용량 (n=10)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 180 180 82.75 180 85.75 158.25 94.25 144.75 180 116.5
2 54.5 180 51.75 73.5 31.5 68.5 50.5 59.25 67.25 44.5
3 109.25 152.75 49 53.25 23.5 25.5 25.5 34.5 47.75 12.5
4 31 117.25 22.25 69.5 26.75 14.75 11.75 27.25 30.75 16.75
5 34 30 24.75 94.5 17 17.5 14 15 29 21.5
6 17 29.5 21 113.5 25.25 28.25 17.75 10.75 13.5 30.75
나타난 바와 같이, 높은 처리 용량에서, 처리받은 동물 및 MPS II 동물 사이에 현저한 차이가 존재하였다.
실시예 4: 인간 세포에서 생산된 IDS 및 IDUA 단백질의 특징
A. HepG2 세포 (풀(pool)) 및 HepG2 서브클론의 생성 및 특징
본질적으로 WO 2015/089077 및 IDS 또는 IDUA 공여체의 통합에 기술된 바와 같이 hALB ZFN SBS# 47171 및 SBS# 47931로 형질도입된 HepG2 세포를 형질도입 후 제3일에 MiSeq 분석으로 평가하였고 알부민 좌위에서의 59.27% 삽입-결실 (hIDS) 및 62.27% 삽입-결실 (hIDUA)을 나타내었다. 이러한 높은 수준의 변형을 기반으로, 이들 세포를 서브클로닝을 위해 선택하였고 네 가지 hIDS 서브클론 (번호 4, 8, 15 및 55) 및 세 가지 hIDUA 서브클론 (번호 21, 25 및 30)을 이후 24 웰 플레이트에 시딩하고 상청액을 hIDS 또는 hIDUA 분비에 대해 IDS 또는 IDUA 효소 활성 어세이 및 ELISA 두 가지로 분석하였다 (도 11). SB 47171 및 SB 47931 ZFN 벡터 단독으로 형질도입된 HepG2 세포를 음성 대조로서 사용하였다 (도 11 내 "ZFN 단독").
네 가지 IDS 서브클론은 기능적 IDS의 분비를 나타내었고, 이들 서브클론의 상청액 내 활성 수준은 408 내지 1,855 nmol/hr/mL 범위였다. 모든 서브클론이 원래의 HepG2 풀(도 11A 및 11B의 'IDS-풀')보다 몇 배 더 높은 hIDS 활성을 나타내었다.
세 가지 IDUA 서브클론은 기능적 IDUA의 분비를 나타내었고, 이들 서브클론의 상청액 내 활성 수준은 92-475 nmol/hr/mL 범위였다 (도 11C 및 11D).
이들 결과는 hIDS 또는 hIDUA ELISA에 의해 입증되었다. hIDS에 있어서, 모든 네 가지 서브클론이 또한 원래의 HepG2 풀보다 몇 배 더 높은, 156 내지 438 ng/mL 범위의 수준으로 세포 배양 상청액으로의 hIDS 분비를 나타내었다. 두 어세이 모두에서, ZFN 단독으로 형질도입된 HepG2 풀에서 어떤 바탕 수준도 나타나지 않았고, 이는 HepG2 세포가 이들 어세이에 의해 검출가능한 수준의 내생적 hIDS를 분비하지 않았음을 알려준다. 유사하게, hIDUA에 있어서, 모든 세 가지 서브클론이 또한 40.6-209.8 ng/mL 범위의 수준으로 세포 배양 상청액으로의 hIDUA 분비를 나타내었다. 두 어세이 모두에서, 미처리 HepG2 세포 또는 ZFN 단독으로 형질도입된 HepG2 서브클론에서 어떤 바탕 수준도 나타나지 않았고, 이는 HepG2 세포가 이들 어세이에 의해 검출가능한 수준의 내생적 hIDUA를 분비하지 않았음을 알려준다.
B. Taqman®에 의한 HepG2 서브클론 내 알부민 좌위에서의 SB IDS 통합의 특징분석
HepG2 서브클론 4, 8 15 및 55를 유전체 알부민 좌위에서의 변형에 관해 추가로 특징분석하였다. 먼저, NHEJ 또는 HDR 중 어느 하나에 의한 IDS ("SB-IDS") 공여의 통합 방식을 확인하기 위해, Taqman® 어세이를 전이유전자의 5' 말단에서의 통합의 각각의 방법에 대해 특이적인 프라이머 및 탐침을 이용하여 진행하였다 (도 12). NHEJ에 의한 통합 후에, AAV ITR (및 상동성 팔)은 여전히 존재하며 NHEJ 특이적 탐침에 의해 인식되고, 이는 Taqman® 어세이에서 긍정적인 신호를 야기한다(도 12A). 대조적으로, SB-IDS 공여체가 HDR에 의해 통합되는 경우, ITR은 사라지며 이는 이들 시약으로의 부정적인 신호를 야기한다. HDR에 의해 통합된 SB-IDS 공여체를 탐지하는 시약은 429 bp 산물에 최적화된 PCR 프라이머 및 알부민의 엑손 1에 결합하는 탐침으로 이루어진다 (도 12 B). 이들 HDR 시약이 NHEJ에 의해 통합된 SB-IDS 공여체에 사용된 경우, 생성된 979 bp PCR 산물은 부가된 크기로 인해 비효율적으로 증폭될 것이며, 부정적인 신호를 야기하게 된다.
결과는 모든 네 가지 분석된 ZFN+공여체 처리된 서브클론이 NHEJ 또는 HDR 특이적 시약에 의한 신호를 나타냈음을 보여주었고, 이는 이들 서브클론 내 알부민 좌위에서의 SB-IDS 전이유전자의 5' 통합 현상을 확인시켜준다. 서브클론 15 및 55에 대한 결과는 HDR을 SB-IDS 통합을 위한 메커니즘으로서 명확히 나타낸다 (도 12C). 서브클론 4 및 8은 모든 세 가지 Taqman® 어세이에서 NHEJ 통합 현상에 대해 지속적으로 긍정적인 점수를 나타내었다. 그러나, 서브클론 4 및 8은 또한 3가지 Taqman® 어세이 반복 중 하나에서 HDR에 의한 통합에 대해 긍정적인 점수를 나타내었다. 다른 두 반복체에서, 이들 서브클론은 HDR 통합에 대해 부정적이거나 어세이 내 복제물 중에서 다량의 변형이 존재하여, 통합 방법을 확인하기 어렵게 하였다. 따라서, 이들 샘플은 HDR에 대해 부정적인 것으로 간주되었다. 제2 알부민 알릴의 삽입-결실 분석을 기반으로, 우리는 서브클론 4 및 8이 각각 88% 및 83% 클로닝되었다고 결론내렸고, 이는 낮고 불안정한 HDR 신호가 이들 서브클론 내 SB-IDS의 HDR 기반 통합을 갖는 미미한 HepG2 집단의 존재로부터 야기될 수 있음을 시사한다.
C. Taqman®에 의한 HepG2 서브클론 내 알부민 좌위에서의 SB-IDUA 통합의 특징분석
HepG2 IDUA 서브클론 21, 25 및 30을 유전체 알부민 좌위에서의 변형에 관해 추가로 특징분석하였다. 먼저, NHEJ 또는 HDR 중 어느 하나에 의한 IDUA ("SB-IDUA") 공여의 통합 방식을 확인하기 위해, Taqman® 어세이를 전이유전자의 5' 말단에서의 통합의 각각의 방법에 대해 특이적인 프라이머 및 탐침을 이용하여 진행하였다 (도 12). NHEJ에 의한 통합 후에, AAV ITR (및 상동성 팔)은 여전히 존재하며 NHEJ 특이적 탐침에 의해 인식되고, 이는 Taqman 어세이에서 긍정적인 신호를 야기한다(도 12E). 대조적으로, SB-IDUA 공여체가 HDR에 의해 통합되는 경우, ITR은 사라지며 이는 이들 시약으로의 부정적인 신호를 야기한다. HDR에 의해 통합된 SB-IDUA 공여체를 탐지하는 시약은 429 bp 산물에 최적화된 PCR 프라이머 및 알부민의 엑손 1에 결합하는 탐침으로 이루어진다 (도 12F). 이들 HDR 시약이 NHEJ에 의해 통합된 SB-IDUA 공여체에 사용된 경우, 생성된 979 bp PCR 산물은 부가된 크기로 인해 비효율적으로 증폭될 것이며, 부정적인 신호를 야기하게 된다.
결과는 모든 세 가지 분석된 ZFN+공여체 처리된 서브클론이 NHEJ 또는 HDR 특이적 시약에 의한 신호를 나타냈음을 보여주었고, 이는 이들 서브클론 내 알부민 좌위에서의 SB-IDUA 전이유전자의 5' 통합 현상을 확인시켜준다. 서브클론 21에 대한 결과가 HDR에 의한 hIDUA 통합임을 명백하게 나타내는 반면, 서브클론 25 및 30에 대한 통합 메커니즘은 분명하지 않았다. 그러므로, 대안적인 유전형검증 방법을 모든 세 가지 서브클론에 대해 수행하였다. 이러한 유전형검증에 있어서, 서브클론 21, 25 및 30으로부터의 유전체 DNA를 방사성표지 PCR 어세이로 처리하여 알부민 좌위 내부의 ZFN 표적 부위에서 5' 전이유전자 통합 현상의 존재를 평가하였다(도 12H). 생성된 겔은 클론 21에 대해서는 HDR 통합, 클론 25에 있어서는 NHEJ 및 클론 30에 대해서는 NHEJ를 확인하였다 (도 12I). 화살표가 NHEJ (상단 화살표) 또는 HDR (하단 화살표)를 통한 삽입의 특징적인 밴드 영역을 가리킨다.
D. HepG2 IDS 서브클론에서 알부민 좌위로부터 생산된 hIDS 폴리펩티드의 특징분석
간에서 IDS의 생체 내 발현 및 이후 이어지는 표적 조직에 의한 흡수는 IDS 단백질 상의 당화 패턴에 의존적이다 (도 13). 알부민 좌위로부터 생산된 hIDS 단백질을 추가로 특징분석하기 위해, 웨스턴 블롯을 HepG2 IDS 및 대조 HepG2 클론으로부터 생성된 상청액에 수행하였다. 두 세트의 hIDS-발현 HepG2 세포를 이러한 분석을 위해 사용하였다. 첫 번째는 상기 분석된 HepG2 IDS 클론과 동일한 방식으로 생성된 높은 IDS 발현 혼합 클론이다. 알부민 좌위의 MiSeq 분석은 이러한 '혼합 클론'이 69.9%의 변형되지 않은 HepG2 세포, 21.4%의 비-IDS 삽입체 알부민 알릴 내에 5bp 결실을 내포하는 HepG2 IDS 서브클론, 및 총 집단의 6.8%을 나타내는 작은 결실을 내포하는 세 가지의 다른 서브클론 (도 14에서 "혼합물"로 표지됨)으로 이루어졌음을 나타내었다.
두 번째로 사용된 HepG2 IDS 클론은 클론 #55으로, 위에서 특징분석된 더 적은 발현 IDS 클론이었다. HepG2 IDUA 클론을 음성 대조로서 사용하였고, 이는 이것이 이들 HepG2 IDS 클론과 동일한 방식으로 생성되었지만, 알부민에서 IDS보다 IDUA (MPS I에서 결핍된 유전자)와 통합되기 때문이었다(도 14에서 'Ctrl').
인간 IDS는 내생적으로 처음에는 550 아미노산 미성숙 전구체 형태로서 발현되며, 신호 펩티드 및 프로펩티드를 모두 내포한다. 25 아미노산 신호 펩티드 및 8 아미노산 프로펩티드는 모두 hIDS 단백질의 번역후 변형 및 성숙 도중 절단된다 (Wilson 등, (1990) Proc Natl Acad Sci USA. 87(21) 8531 5). 생성된 73- 78 kDa 폴리펩티드는 골지체에서 포스포릴화 및 당화되어 90 kDa 전구체가 되고, 이는 나중에 리소좀에서 55 kDa 중간체로 절단되며, 18 kDa 폴리펩티드의 방출과 함께 마지막으로 45 kDa 성숙 hIDS 단백질이 된다 (Froissart 등, (1995) Biochem. J. 309(Pt 2): 425-30).
이들 형태의 hIDS 중 어느 것이 hIDS 통합 후 알부민 좌위로부터 생성되는지 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 HepG2 세포 펠렛, HepG2 세포 배양 상청액 (세포로부터의 hIDS 분비후), 및 이러한 HepG2 세포 배양 상청액과의 배양(이차 조직에 의한 흡수를 모방) 후 변형되지 않은 초기 간세포 펠렛에 수행하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 전장 IDS 및 모든 중간체 및 성숙 폴리펩티드 형태가 알부민으로부터 hIDS를 생산하는 HepG2 펠렛('HepG2 펠렛')에서 발견되었다. 전장 형태의 IDS는 뚜렷하지 않은 밴드로 나타나며, 이는 이들 생산 세포에서 새로 합성된 IDS의 진행중인 번역후 변형(당화)로 인한 것으로 보인다. 이는 간암 HepG2 세포 내 알부민 좌위로부터 생산된 hIDS 단백질이 자연발생적 폴리펩티드와 유사하게 번역-후 변형되고 분비되었음을 증명하였다. 약 90 kDa의 생산된 효소의 이동은 섬유아세포 (Froissart 등, 상기와 동일) 및 CHO 세포 (Elaprase® 및 GREEN CROSS 재조합 IDS; 미국 특허 공개 제20130236442호를 참조하라)에서 생산된 재조합 IDS의 그것과 일치하였다.
둘째, 이들 HepG2 서브클론으로부터의 조건화 상청액의 분석은 전장 hIDS가 세포로부터 분비되는 초기 형태의 IDS였음을 나타내며, 다만 18 kDa 밴드에 대한 매우 약한 밴드가 또한 검출되었다('HepG2 상청액'). 이러한 조건화 세포 배양 상청액을 미숙한, 변형되지 않은 초기 간세포와 함께 배양한 경우, 이들 간세포는 상청액으로부터의 hIDS ('초기 간세포 펠렛')를 효율적으로 흡수한다. 비록 전장 hIDS가 이들 펠렛에서 검출가능했던 반면, hIDS가 쉽게 성숙 형태의 단백질로 처리될 뿐만 아니라 55, 45, 및 18 kDa 폴리펩티드가 모두 이들 펠렛 내에 존재함이 분명하였다. 마지막으로, 상청액으로부터 흡수된 hIDS는 활성이었고, 이는 hIDS 분비 HepG2 세포로부터의 상청액과 항온처리된 초기 간세포에서 hIDS 활성의 6.5 10.3배 증가가 존재했기 때문이었다.
종합하면, 이들 데이터는 알부민으로부터 생산된 hIDS가 원래의 세포에서 일반적으로 이의 성숙 형태로 처리되고, 전장 형태는 세포로부터 분비되어, 이러한 전장 hIDS가 이차 세포에 의해 흡수되고 효율적으로 이의 성숙 및 활성 형태로 처리됨을 입증한다.
E. HepG2 IDS 서브클론에서 알부민 좌위로부터 생산된 hIDS 및 hIDUA의 당화 특징분석
IDS 또는 IDUA 효소에 대한 만노스 6 포스페이트 변형이 간세포, 신경세포 및 교세포와 같은 몇몇 세포 유형에서 효율적인 세포 흡수 및 적절한 리소좀 표적화를 위해 필요함이 시사/증명된 바 있다(Daniele 등, (2002) Biochim Biophys Acta. 1588(3):203-9). 그러므로, 알부민 좌위로부터 생산되고 분비된 hIDS 및 hIDUA의 당화 패턴을 특징분석하기 위해, 웨스턴 블롯을 HepG2 IDS 또는 IDUA 서브클론 상청액에 수행하였다. IDS는 8 가능한 N 당화 부위를 내포하는데, 이는 고수준 만노스, 하이브리드, 및 복합체 올리고다당류 사슬의 조합으로 채워져 있다 (Froissart 등, 상기와 동일). 이들 당화 유형은 특이적 글리코시다아제를 이용하여 구분될 수 있다: 펩티드-N-글리코시다아제 F (PNGase F)는 모든 3 유형의 올리고다당류를 당단백질로부터 절단할 수 있는 반면, 엔도글리코시다제 H (Endo H)는 고수준 만노스 및 복합 올리고다당류가 아닌 일부 하이브리드 올리고다당류만을 N-연결된 당단백질로부터 절단할 수 있다 (도 15A).
어떤 종류의 당화가 알부민 좌위로부터 생산되고 분비된 hIDS에 존재하는지 확인하기 위해, 세포 배양 상청액을 두 가지 상이한 HepG2 IDS 집단 (혼합물 및 클론 55; 상기 기술됨)으로부터 수확하고 대조 상청액을 알부민에 통합된 IDUA를 갖는 HepG2 서브클론으로부터 수확하였다 (대조). 상청액을 분해하지 않거나(U) PNGase F (P) 또는 Endo H (E)로 분해 처리하였다. 도 15B는 HepG2 IDS 집단으로부터의 상청액의 PNGase F 분해 (P)가 대략 60 kDa의 단일 밴드로의 완전한 이동을 야기함을 보여주며, 이는 단백질(= 비-당화 hIDS)로부터의 모든 올리고다당류 사슬의 제거를 나타낸다. 대조적으로, Endo H 분해 (E)는 중간 이동성의 불분명한 밴드를 생성하였다. 대조 상청액은 어떠한 hIDS 발현도 야기하지 않았고, 이는 미처리된 세포로부터 hIDS가 거의 내지 전혀 분비되지 않았음을 나타낸다.
유사하게, 동일한 세트의 글리코시다아제 분해가 HepG2 펠렛으로부터의 단백질 용해물에 수행되었을 때 (도 15C), 세 가지 주요 대형 IDS 형태가 보이고(전장 ~73- 78 kDa; 중간체 ~55 kDa; 및 성숙 ~45 kDa) 모두 명백한 분자량에서 동일한 이동을 나타내었다. 전장 및 중간체 밴드는 둘다 PNGase F 분해 (P)로는 완전한 이동 및 Endo H 분해 (E)로는 부분적 이동을 나타내었다. 성숙 45 kDa 밴드는 이러한 동일한 세트의 이동을 나타내었으나, PNGase F 분해 후 이중으로서 더 분명하게 보였으며, 이는 간행된 문헌과 일치하였다 (Froissart 등, 상기와 동일).
HepG2-IDUA 클론을 생선된 IDUA의 당화 패턴을 분석하기 위해 유사하게 사용하였다. 도 15D는 PNGase F 및 EndoH가 HepG2-IDUA 세포 상청액에서 시판되는 IDUA 효소 Aldurazyme® 및 R&D Systems사의 rIDUA와 유사한 패턴을 생성함을 보여준다.
종합하면, 이들 데이터는 알부민 좌위로부터 생산되고 분비된 hIDS 및 IDUA 단백질이 고수준 만노스/하이브리드 당화 (Endo-H 민감성) 및 복합 당화 (Endo-H 비민감성/PNGase F-민감성)의 혼합물을 내포함을 증명한다.
F. 만노스-6 포스페이트에 의한 세포 IDS 흡수의 경쟁
조건화 배지를 대조 HepG2/C3A (ATCC, CRL-10741; 'HepG2') 세포 또는 HepG2-IDS 클론 #8 또는 #15를 10% FBS 및 1X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (Thermo Fisher Scientific)으로 보충된 이글 최소 필수 배지 (MEM) (Corning)에서 배양함으로써 제조하였다. 세포를 72시간 배양하여 IDS가 세포 배양 상청액에 누적되게 하고, 이후 상청액을 수집하고, 0.2 μm 여과하고, 사용할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
100,000개의 변형되지 않은 HepG2 또는 K562 세포를 24 웰 플레이트에 웰마다 시딩하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 성장시켰다. 배지를 이후 5 mM 만노스-6-포스페이트 (M6P; Sigma-Aldrich)의 존재 또는 부재에서 HepG2 또는 HepG2-IDS 조건화 배지 (상기 기술된 바와 같이 생성됨)로 교체하였다. 세포를 조건화 배지 ± 5 mM M6P에서 6 또는 24시간 동안 배양하였다. 조건화 배지에서 6시간 배양된 세포를 일반 세포 성장 배지로 되돌려 다시 18시간 배양하고, 모든 조건의 세포 펠렛을 24시간 기간 마지막에 수집하였다. 세포 배양 상청액을 제거한 후, 세포 펠렛을 1 mL의 PBS로 한 차례 세척하여 IDS 활성에 대한 어세이 전에 임의의 잔여 조건화 배지를 제거하였다. 세포 펠렛을 150 μL TBS + 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 및 1x Halt 프로테아제 저해제 (Thermo Fisher Scientific)에서 초음파분해로 용해시키고 IDS 활성에 대해 분석하였다.
결과 (도 16A 및 16B)는 5mM M6P의 존재에서, IDS 흡수가 HepG2 및 K562 세포 둘다에서 감소하였음을 나타낸다.
G. 시험관 내 에서 알부민 좌위로부터 생산된 IDUA는 만노스-6-포스페이트 의존성 방식으로 이차 세포에 의해 흡수되었다. 도 16D는 만노스-6-포스페이트(M6P)를 이용한 K562 세포의 처리가 어떻게 IDUA 효소의 흡수를 차단하는지 보여주는 모식도이다.
배지를 대조 HepG2/C3A (ATCC, CRL-10741; 'HepG2') 세포 또는 HepG2-IDUA 클론 #25를 10% FBS 및 1X 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (Thermo Fisher Scientific)으로 보충된 이글 최소 필수 배지 (MEM) (Corning)에서 배양함으로써 제조하였다. 세포를 72시간 배양하여 IDUA가 세포 배양 상청액에 누적되게 하고, 이후 상청액을 수집하고, 0.2 μm 여과하고, 사용할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
IDUA 흡수를 하기와 같이 측정하였다. 100,000 변형되지 않은 K562 세포를 5 mM 만노스-6-포스페이트 (M6P; Sigma-Aldrich)의 존재 또는 부재에서 HepG2 조건화 배지 (상기 기술된 바와 같이 생성됨)에서 24 웰 플레이트의 웰마다 시딩하였다. 세포를 조건화 배지 ± 5 mM M6P에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상청액을 제거한 후, 세포 펠렛을 1 mL의 PBS로 두 차례 세척하여 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로나이드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하는 IDUA 활성에 대한 어세이 전에 임의의 잔여 조건화 배지를 제거하였다.
도 16C에 나타난 바와 같이, 시험관 내에서 알부민 좌위로부터 생산된 것은 만노스-6-포스페이트 의존성 방식으로 이차 세포에 의해 흡수되었다.
실시예 5: 뇌로의 공여체 흡수
IDUA 및 IDS 효소의 기질인 글리코사미노글리칸인 데르마탄 및 헤파란 설페이트의 수준에 대한 뇌 조직 파쇄액의 질량 분석을 Pacific BioLabs (Hercules, CA)에서 수행하였다. 간략하게, 실시예 2에 기술된 바와 같은 MPSI 마우스의 조직(미처리 및 ZFN 및 IDUA 공여체로 처리된 것)을 200 mM 암모늄 아세테이트, 20 mM 칼슘 아세테이트, 4 mM DTT, pH 7.0에서 파쇄하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트 (Thermo Fisher Scientific)로 측정하고 샘플을 1 mg/mL로 정상화하였다. 헤파란 설페이트 샘플을 헤파리나아제 I 및 III으로 분해하여, 두 가지 주요한 이당류 (Δ-UA-GlcNAc [IV-A] 및 Δ-UA-GlcNS [IV-S])를 얻었다. 데르마탄 설페이트 샘플을 콘드로이티나제 B로 분해하여, 3가지 주요한 이당류 (ΔUA-GalNAc (4S) [디-4S], ΔUA-GalNAc (6S) [Δ디-6S] 및 ΔUA-GalNAc (4S, 6S) [Δ디-4S,6S])를 얻었다. 분해 후, 내부 표준을 증폭(spike-in)하고, 대형 분자를 10,000 NMWL 회전 여과기 또는 여과 플레이트를 통해 원심분리하여 제거하고, 샘플을 역상 HPLC 처리하였다. 피분석물 및 내부 표준을 음성 방식으로 특이적 다중-반응-관찰 방법을 사용하는 ESI-MS/MS를 통해 검출하였다. 각각의 피분석물 및 IS의 피크 영역을 이들의 각각의 MS-크로마토그램에 통합하고 피크 영역의 비율을 정량화를 위해 사용하였다. 공지의 샘플 내 각각의 이당류의 농도를 공지 농도의 표준의 보정 곡선으로부터 따서 보충하고 각각의 이당류에 대해 0.005 μg/mL의 최소 정량 한계(LLOQ)로, μg/mL로 기록하였다. 이당류 농도를 각각의 샘플에 대해 합하고 파쇄액 대입량에 대해 도표화하였다.
도 17A에 나타난 바와 같이, MPS I 마우스로부터의 뇌 조직 파쇄액이 질량 분석법에 의해 데르마탄 및 헤파란 설페이트 수준에 대해 특정하게 측정되는 경우, 주사-후 4달 시점의 이들의 성별-대응 대조와 비교할 때 수컷 ZFN+공여체 처리된 마우스에서 데르마탄 설페이트 수준의 현저한 감소가 존재하였다. 암컷 처리된 마우스 또한 데르마탄 설페이트 수준이 감소하는 경향을 나타내었다. 유사하게, ZFN+공여체 처리된 MPS II 마우스 또한 가장 높은 ZFN+공여체 용량에서 통계적인 유의성에 도달했던 뇌 데르마탄 설페이트 수준이 감소하는 경향을 나타내었다 (도 17B). 그러나, 어느 MPS I 또는 MPS II 마우스 모델에서도 헤파란 설페이트의 감소는 관찰되지 않았다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 명세서에 그 전체가 참고로서 포함된다.
비록 개시가 예시의 방식으로 및 명확한 이해의 목적을 위한 예시로서 일부 자세히 제공되었지만, 당해 분야의 숙련가에겐 다양한 변화 및 변형이 본 개시의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않고 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 전술된 상세한 설명 및 실시예는 제한으로 간주되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGIC DISEASE <130> 8325-0149.40 <140> PCT/US2017/013189 <141> 2017-01-12 <150> 62/328,925 <151> 2016-04-28 <150> 62/300,271 <151> 2016-02-26 <150> 62/279,394 <151> 2016-01-15 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Trp Arg Ser Ser Leu Arg Ala 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Asp Ser Ser Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Thr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gln Ser Ala Thr Arg Thr Lys 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Leu Arg His His Leu Thr Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gln Ala Gly Gln Arg Arg Val 1 5 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 11 tttcctgtaa cgatcgggaa ctggcatc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 12 ctgaaggtgg caatggttcc tctctgct 28 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <221> modified_base <222> (21)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 13 acacgacgct cttccgatct nnnnaaatct tgagtttgaa tgcacagat 49 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 gacgtgtgct cttccgatct ttcactgacc taagctactc cc 42 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: "LAGLIDADG" family homing endonuclease peptide <400> 15 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5

Claims (15)

  1. 뮤코다당증 유형 I (MPS I) 또는 뮤코다당증 유형 I (MPS II)를 가지는 개체에서 중추신경계 (CNS) 장애를 감소 또는 예방하는 방법이되, 상기 방법은
    개체에게 인간 α-L-이두로니다아제 (hIDUA) 또는 인간 이두로네이트-2-설파타제 (hIDS)를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 프로모터가 없는 공여 벡터를 투여하는 단계; 및
    내생적 알부민 유전자를 표적하는 한 쌍의 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN)를 인코딩하는 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 전이유전자는 인코딩된 hIDUA 및/또는 hIDS가 간으로부터 발현되고 분비되도록 알부민 유전자의 절단 후 간 세포 내 알부민 유전자로 통합되고 또한 여기서 간으로부터 분비된 hIDUA 및/또는 hIDS는 CNS 장애가 감소 또는 예방되도록 개체의 중추신경계 (CNS)에서 발견되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, CNS 장애는 인지 결핍을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공여 벡터 및 발현 벡터의 투여 전 및 후에 개체에게 면역억제제를 투여하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자의 발현이 개체의 뇌 내 글리코사미노글리칸 수준을 조율하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 신경세포 또는 교세포 공포형성이 감소 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 개체에서 신경세포 또는 교세포 공포형성은 개체의 척수에서 감소 또는 제거된 세포 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 학습 능력의 상실이 미처리 개체와 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ZFN의 쌍은 표 1에 나타난 바와 같은 아연 집게 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ZFN 발현 벡터 및 공여 벡터는 아데노-연관 벡터 (AAV)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, ZFN 발현 벡터 및 공여 벡터 AAV는 정맥내 주사를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 투여되는 ZFN:ZFN:공여체 비율은 1:1:8인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 알부민 유전자의 인트론 1에 통합된 hIUDA 또는 hIDS를 인코딩하는 프로모터가 없는 공여 벡터를 포함하는 Hep2G 세포이되, 여기서 hIUDA 또는 hIDS는 Hep2G 세포로부터 발현되고 분비되는 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제12항의 Hep2G 세포를 포함하는 세포 배양물이되, 여기서 배양 배지가 hIUDA 또는 hIDS를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
  14. 제12항에 따른 세포로부터 분비되는 hIUDA 및/또는 hIDS 또는 제13항에 따른 세포 배양물을 포함하는 약제학적 조성물.
  15. hIUDA 또는 hIDS 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 방법이되, 상기 방법은 제14항에 따른 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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