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JP7418485B2 - ファブリー病の治療のための方法および組成物 - Google Patents

ファブリー病の治療のための方法および組成物 Download PDF

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JP7418485B2 JP2022039062A JP2022039062A JP7418485B2 JP 7418485 B2 JP7418485 B2 JP 7418485B2 JP 2022039062 A JP2022039062 A JP 2022039062A JP 2022039062 A JP2022039062 A JP 2022039062A JP 7418485 B2 JP7418485 B2 JP 7418485B2
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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月２０日に出願された米国仮出願第６２／４１０，５４３号、２０１７年１月９日に出願された米国仮出願第６２／４４４，０９３号、２０１７年２月１３日に出願された米国仮出願第６２／４５８，３２４号、２０１７年５月５日に出願された米国仮出願第６２／５０２，０５８号、２０１７年６月７日に出願された米国仮出願第６２／５１６，３７３号、および２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，７９２号の利益を主張し、これらの開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、ファブリー病の予防および／または治療ならびに遺伝子療法の分野にある。
遺伝子療法は、ヒト治療の新しい時代への莫大な潜在性を秘める。これらの方法は、標準の医療上の実施によってこれまで対処できなかった状態のための治療を可能にする。特に有望である１つの領域は、導入遺伝子を細胞に加えて、その細胞において以前に産生されていなかったまたは最適未満にしか産生されていなかった産物をその細胞に発現させる能力である。この技術の使用の例には、治療用タンパク質をコードする遺伝子の挿入、何らかの理由で細胞または個体において欠損しているタンパク質をコードするコード配列の挿入、およびマイクロＲＮＡなどの構造核酸をコードする配列の挿入が含まれる。
導入遺伝子が細胞自身のゲノムに組み込まれ、そこで維持されるように、様々な方法によって導入遺伝子を細胞に送達することができる。近年、選択されたゲノム遺伝子座への標的化挿入のために部位特異的ヌクレアーゼによる切断を使用する、導入遺伝子組み込みのための戦略が開発されている（例えば、共同所有された米国特許第７，８８８，１２１号を参照）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（操作されたガイドＲＮＡを利用する）などのヌクレアーゼ系は、標的化遺伝子に特異的であり、相同性誘導修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動プロセス中の末端捕捉によって導入遺伝子構築物が挿入されるように利用することができる。例えば、米国特許第９，３９４，５４５号；同第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１９６３７３号；同第２０１４０１２０６２２号；同第２０１５００５６７０５号；同第２０１５０３３５７０８号；同第２０１６００３０４７７号および同第２０１６００２４４７４号を参照、その開示は参照によりそれらの全体が組み込まれる。
導入遺伝子は、様々な方法で細胞に導入して、維持することができる。「ｃＤＮＡ」手法の後、導入遺伝子が細胞のクロマチンへの組み込みを通してではなく染色体外に維持されるように、導入遺伝子は細胞に導入される。導入遺伝子は環状ベクター（例えば、プラスミド、または非組み込み型のウイルスベクター、例えばＡＡＶもしくはレンチウイルス）で維持することができ、ここで、ベクターはプロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル配列、イントロンおよびスプライシングシグナルなどの転写調節配列を含むことができる（米国特許出願公開第２０１７０１１９９０６号）。代わりの手法は、アルブミン遺伝子などの高度に発現されるセーフハーバー位置への導入遺伝子の挿入を含む（米国特許第９，３９４，５４５を参照）。この手法は、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（登録商標）またはＩＶＰＲＰと呼ばれている。この手法の後、導入遺伝子はヌクレアーゼ媒介標的化挿入を通してセーフハーバー（例えば、アルブミン）遺伝子に挿入され、ここで、導入遺伝子の発現はアルブミンプロモーターによって駆動される。導入遺伝子は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の分泌／排出を助けるためのシグナル配列を含むように操作される。
「セーフハーバー」遺伝子座には、ヒト細胞中のＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミンおよびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞中のＲｏｓａ２６などの遺伝子座が含まれる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１４００１７２１２号を参照。導入遺伝子のランダムな組み込みに基づく古典的な組み込み手法と比較して、ヌクレアーゼ媒介組み込みは、向上した導入遺伝子発現、安全性の増加および発現持続性の見込みを提供する。なぜなら、それが、遺伝子サイレンシングまたは近くのオンコジーンの活性化の最小限のリスクのために正確な導入遺伝子配置を可能にするからである。
標的細胞への導入遺伝子の送達は、この技術を完全実施するために克服しなければならない課題の１つである一方、克服しなければならない別の課題は、導入遺伝子を細胞に挿入し、それが発現した後に、そのようにコードされている遺伝子産物が生物体の必要な位置に到達し、有効であるのに十分な局所濃度にすべきであることを確実にすることである。タンパク質の不足を特徴とする、または異常な非機能性タンパク質の存在を特徴とする疾患に対して、導入遺伝子がコードする野性型タンパク質の送達は非常に有用となり得る。
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、不用な脂質、糖タンパク質およびムコ多糖の分解に通常関与する機能的な個々のリソソームタンパク質の欠乏によって特徴付けられる、一群の稀な代謝性一遺伝子疾患である。特定の酵素の機能不全のためにそれらを処理して再利用することができないので、これらの疾患は細胞中のこれらの化合物の蓄積によって特徴付けられる。最も一般的な例は、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損－遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼＡ欠損－ＧＬＡ）、ハンター病（イズロネート－２－サルファターゼ欠損－ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ－Ｌイズロニダーゼ欠損－ＩＤＵＡ）、ポンぺ病（アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ））およびニーマン－ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損－ＳＭＰＤ１）である。すべて合わせると、ＬＳＤは、７０００の出産中約１の集団発生数を有する。米国特許出願公開第２０１４００１７２１２号；同第２０１４－０１１２８９６号；および同第２０１６００６０６５６号も参照。
例えば、ファブリー病は、α－ガラクトシダーゼＡ酵素（α－ＧａｌＡ）の欠損によって引き起こされるグリコスフィンゴリピド代謝のＸ連鎖障害である。それは、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ－３およびＧｂ３としても公知である）およびグロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ－Ｇｂ３）、ガラビオアシルセラミド、およびＢ群物質を含むグリコスフィンゴリピド（ｇｌｙｃｏｓｐｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）の進行性の沈着に関連している。疾患の症状は様々であり、灼熱痛、刺痛（肢端触覚異常）または強烈な疼痛のエピソードを含むことができ、これらは数分から数日持続することがある「ファブリークリーゼ」と呼ばれている。他の症状には、発汗障害、低い運動耐性、被角血管腫と呼ばれる赤紫の発疹、目異常、胃腸問題、心臓問題、例えば心臓肥大および心臓発作、腎不全につながる可能性のある腎臓問題、およびＣＮＳ問題が含まれ、一般に、ファブリー患者の平均余命はかなり短縮される。
ファブリー病のための現在の治療は、ヒトα－ＧａｌＡの２つの異なる調製物、アガルシダーゼベータまたはアガルシダーゼアルファによる酵素補充療法（ＥＲＴ）を含むことができ、それは患者のために２週ごとにコストおよび時間を要する注入（一般的に約０．２～１ｍｇ／ｋｇ）を必要とする。そのような治療は症状を治療するだけであり、治癒的でなく、したがって、患者は残りの寿命の間、これらのタンパク質の反復投与を受けなければならず、注射されるタンパク質に対する中和抗体を潜在的に発生させ得る。
さらに、α－ＧａｌＡ調製物で治療した被験体における抗α－ＧａｌＡ抗体の発生などの免疫反応を含む、有害反応が、ＥＲＴと関連する。実際、アガルシダーゼアルファで治療した男性の５０％およびアガルシダーゼベータで治療した男性の８８％が、α－ＧａｌＡ抗体を発生させた。重要なことに、それらの抗体のかなりの割合が中和抗体であり、したがって療法の治療効果を低減する（Ｍｅｇｈｄａｒｉら（２０１５年）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、１０巻（２号）：ｅ０１１８３４１頁、Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１８３４１）。さらに、ＥＲＴは、すべての患者において疾患の進行を停止させるとは限らない。
したがって、例えば発現される導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物を治療的に適切なレベルで送達するための、ファブリー病を治療するために使用することができる、ゲノム編集を通しての治療を含むＥＲＴ以外の方法および組成物の必要性がまだある。
米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第９，３９４，５４５号明細書 米国特許第９，２５５，２５０号明細書 米国特許第９，２００，２６６号明細書 米国特許第９，０４５，７６３号明細書 米国特許第９，００５，９７３号明細書 米国特許第９，１５０，８４７号明細書 米国特許第８，９５６，８２８号明細書 米国特許第８，９４５，８６８号明細書 米国特許第８，７０３，４８９号明細書 米国特許第８，５８６，５２６号明細書 米国特許第６，５３４，２６１号明細書 米国特許第６，５９９，６９２号明細書 米国特許第６，５０３，７１７号明細書 米国特許第６，６８９，５５８号明細書 米国特許第７，０６７，３１７号明細書 米国特許第７，２６２，０５４号明細書 米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書 米国特許第７，９５１，９２５号明細書 米国特許第８，１１０，３７９号明細書 米国特許第８，４０９，８６１号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書 米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書 米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０１２０６２２号明細書 米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号明細書 米国特許出願公開第２０１６／００３０４７７号明細書 米国特許出願公開第２０１６／００２４４７４号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０６号明細書
Ｍｅｇｈｄａｒｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１５年）１０巻（２号）：ｅ０１１８３４１頁
本明細書において、ファブリー病を治療および／または予防するための方法および組成物が開示される。本発明は、適する標的細胞（例えば、ファブリー病の被験体）への導入遺伝子配列の挿入のための方法であって、導入遺伝子は、疾患を治療する少なくとも１つのタンパク質（例えば、少なくとも１つのα－ＧａｌＡタンパク質）をコードする方法を記載する。本方法は、インビボ（生きている被験体の細胞への導入遺伝子配列の送達）であってもエクスビボ（生きている被験体への改変細胞の送達）であってもよい。本発明は、α－ＧａｌＡをコードする導入遺伝子が、疾患を治療する（例えば、それと関連する症状の１つまたは複数を軽減する）タンパク質を発現するような発現系による適する標的細胞のトランスフェクションおよび／または形質導入のための方法も記載する。α－ＧａｌＡタンパク質は、それが導入遺伝子を有しない他の細胞に影響することができるかまたは他の細胞がそれを取り込むことができるように、標的細胞から排出（分泌）させることができる（交差修正）。本発明は、高レベルのα－ＧａｌＡを産生する細胞（例えば、成熟したまたは未分化の細胞）の産生のための方法であって、これらの変更された細胞の集団の患者への導入は、疾患または状態を治療するための必要とされるタンパク質を供給する方法も提供する。さらに本発明は、高度活性型（治療型）のα－ＧａｌＡを産生する細胞（例えば、成熟したまたは未分化の細胞）の産生のための方法であって、患者におけるこれらの変更された細胞の集団の導入または形成は、ファブリー病を治療する（例えば、１つまたは複数の症状を低減または排除する）ための必要とされるタンパク質活性を供給する方法も提供する。本明細書に記載されるように産生される高度活性型のα－ＧａｌＡは、本明細書に記載される通りに細胞から単離することもでき、当業者に公知である標準の酵素補充手法を使用してそれを必要とする患者に投与することもできる。
本明細書で、少なくとも１つのαガラクトシダーゼＡ（α－Ｇａｌ Ａ）タンパク質を発現させるための方法および組成物が記載される。組成物および方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの使用のためであってよく、α－Ｇａｌ Ａタンパク質が細胞において発現されるように少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質をコードするＧＬＡ導入遺伝子（例えば、野生型のまたはコドン最適化ＧＬＡ配列を有するｃＤＮＡ）を細胞に投与することを含む。ある特定の実施形態では、細胞はファブリー病の被験体中にある。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、導入遺伝子は被験体の肝臓に投与することができる。任意選択で、本方法は、導入遺伝子がアルブミン遺伝子に組み込まれ、それから発現されるように、被験体の肝臓細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼを投与することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、導入遺伝子から発現されるα－Ｇａｌ Ａタンパク質は、被験体においてグリコスフィンゴリピドの量を２分の１以下に低下させることができる。ＧＬＡ導入遺伝子は、例えば、シグナルペプチドおよび／または１つまたは複数の制御エレメントを含むさらなるエレメントをさらに含むことができる。本明細書に記載される方法によって作製される細胞を含む、外因性ＧＬＡ導入遺伝子（組み込まれたか染色体外の）を含む遺伝子改変細胞（例えば、幹細胞、前駆体細胞、肝臓細胞、筋細胞等）も提供される。これらの細胞は、例えば、それを必要とする被験体に細胞（複数可）を投与することによって、あるいは、細胞によって産生されるα－Ｇａｌ Ａタンパク質を単離し、それを必要とする被験体にそのタンパク質を投与することによって（酵素補充療法）、α－ＧａｌＡタンパク質をファブリー病の被験体に提供するために使用することができる。ファブリー病の治療での使用を含む、本明細書に記載される方法のいずれかで使用するためのＧＬＡ導入遺伝子を含むベクター（例えば、ＡＡＶもしくはＡｄなどのウイルスベクターまたは脂質ナノ粒子）も提供される。
一態様では、本発明は、被験体の細胞において１つまたは複数の修正ＧＬＡ導入遺伝子をコードする導入遺伝子を発現させる方法を記載する。修正導入遺伝子によってコードされるα－ＧａｌＡ産物が細胞のゲノムに安定して組み込まれるように（「ＩＶＰＲＰ（登録商標）」手法とも呼ばれる）、あるいは、導入遺伝子を細胞の中で染色体外的に維持することができるように（「ｃＤＮＡ」手法とも呼ばれる）、導入遺伝子を適する標的細胞（例えば、血液細胞、肝臓細胞、脳細胞、幹細胞、前駆体細胞等）のゲノムに挿入することができる。一実施形態では、補充タンパク質のインビトロ産生のために修正ＧＬＡ導入遺伝子は細胞系の細胞に（安定して、または染色体外に）導入され、その（任意選択で精製および／または単離された）タンパク質は、ファブリー病の被験体を（例えば、ファブリー病に関連した１つまたは複数の症状を低減および／または排除することによって）治療するために被験体に次に投与することができる。ある特定の実施形態では、その修正導入遺伝子によってコードされるα－ＧａｌＡ産物は、未処置の被験体と比較して、任意の量だけ、例えば２～１０００倍またはそれより大きい倍数（または、その間の任意の値）、例えば、限定されずに、２～１００倍（または、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍を含むその間の任意の値）、１００～５００倍（または、その間の任意の値）または５００～１０００倍またはそれより大きい倍数だけ、被験体の組織においてα－ＧａｌＡ活性を増加させる。
別の態様では、本明細書において、ファブリー病の被験体を（例えば、ファブリー病に関連した１つまたは複数の症状を低減および／または排除することによって）治療するエクスビボまたはインビボ方法であって、タンパク質がファブリー病の被験体において産生されるように、本明細書に記載される通り（ｃＤＮＡおよび／またはＩＶＰＲＰ手法）細胞にＧＬＡ導入遺伝子を挿入することを含む方法が記載される。ある特定の実施形態では、ＧＬＡ導入遺伝子を含む単離細胞は、例えばファブリー病の被験体に細胞を投与することによって、それを必要とする患者を治療するために使用することができる。他の実施形態では、補充タンパク質がインビボで産生されるように、修正ＧＬＡ導入遺伝子は体の標的組織に挿入される。一部の好ましい実施形態では、修正導入遺伝子は、標的組織の細胞のゲノムに挿入されるが、他の好ましい実施形態では、修正導入遺伝子は標的組織の細胞に挿入され、細胞の中で染色体外に維持される。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、発現されるα－ＧａｌＡタンパク質は、細胞から排出されて二次標的に作用するか、またはＧＬＡ導入遺伝子を欠く他の組織の他の細胞（例えば、血液への移出を通して）を含む二次標的が取り込むことができる（交差修正）。一部の場合には、一次および／または二次の標的組織は肝臓である。他の場合には、一次および／または二次の標的組織は脳である。他の場合には、一次および／または二次の標的は血液（例えば、血管系）である。他の場合には、一次および／または二次の標的は骨格筋である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、ファブリー病に罹患した被験体の組織に沈着する、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ－３およびＧｂ３としても公知である）およびグロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ－Ｇｂ３）、ガラビオアシルセラミドを含むグリコスフィンゴリピドの量を低下させるために使用される。ある特定の実施形態では、その修正導入遺伝子によってコードされるα－ＧａｌＡ産物は、未処置の被験体と比較して、任意の量だけ、例えば２分の１～１００分の１またはそれより小さい値（または、その間の任意の値）、例えば、限定されずに、２分の１～１００分の１（または、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１を含むその間の任意の値）に、被験体の組織においてグリコスフィンゴリピドを低下させる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、修正ＧＬＡ導入遺伝子は、機能的ＧＬＡ遺伝子の野生型配列を含むが、他の実施形態では、修正ＧＬＡ導入遺伝子の配列は増強された生物活性を与える何らかの方法で変更される（例えば、生物活性を増加させる最適化されたコドンおよび／または遺伝子発現を向上させる転写および翻訳調節配列の変更）。一部の実施形態では、ＧＬＡ遺伝子は、発現特性を向上させるように改変される。そのような改変には、限定されずに、翻訳開始部位（例えばメチオニン）の挿入、最適化されたコザック配列の追加、シグナルペプチドの挿入および／またはコドン最適化を含めることができる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、アルブミンシグナルペプチド、Ｆ．ＩＸシグナルペプチド、ＩＤＳシグナルペプチドおよび／またはα－ＧａｌＡシグナルペプチドから選択することができる。本明細書に記載されるいかなる実施形態でも、ＧＬＡドナーは、図１Ｂ、図１Ｃ、図１０および／または図１３のいずれかに示すようなドナーを含むことができる。
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、ＧＬＡ導入遺伝子は、ヌクレアーゼを使用して標的細胞のゲノムに挿入することができる。適するヌクレアーゼの非限定的な例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様タンパク質ヌクレアーゼ）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が含まれ、それらは、細胞のゲノム中の目的の領域の中の標的部位（例えば、疾患関連遺伝子、高度発現遺伝子、アルブミン遺伝子または他のもしくはセーフハーバー遺伝子）に結合するＤＮＡ結合性分子、および１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、切断ドメインおよび／または切断ハーフドメイン）を含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓタンパク質および／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、赤血球前駆細胞（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）の中のアルブミン遺伝子またはグロビン遺伝子中の標的部位を認識する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４００１７２１号を参照。他の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、セーフハーバー遺伝子、例えばＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知である）遺伝子、アルブミン、ＨＰＲＴまたはＲｏｓａ遺伝子に結合し、および／またはそれを切断する。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１４００１７２１２号を参照。ヌクレアーゼ（またはその構成要素）は、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードするポリヌクレオチドとして提供することができる。ポリヌクレオチドは、例えばｍＲＮＡであってよい。一部の態様では、ｍＲＮＡは化学的に改変されてもよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら、（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９巻（２号）：１５４～１５７頁を参照）。他の態様では、ｍＲＮＡはＡＲＣＡキャップを含むことができる（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未改変のおよび改変されたヌクレオチドの混合物を含むことができる（米国特許出願公開第２０１２０１９５９３６号を参照）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、ＷＰＲＥエレメントを含むことができる（米国特許出願公開第２０１６０３２６５４８号を参照）。
別の態様では、本発明は、所望のＧＬＡ導入遺伝子（任意選択でヌクレアーゼを使用して組み込まれた）を有する遺伝子改変細胞（例えば、幹細胞、前駆体細胞、肝臓細胞、筋細胞等）を含む。一部の態様では、編集された幹細胞または前駆体細胞を次に増殖させ、成熟した編集された細胞にエクスビボで分化するように誘導することができ、次に、細胞は患者に与えられる。したがって、本明細書に記載される遺伝子編集（改変）ＧＬＡ産生幹細胞または前駆体細胞に由来する細胞は、本発明で使用するために選択することができる。他の態様では、編集された前駆体（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）が骨髄移植片に与えられ、それは、移植が成功した後、編集された産生細胞を増殖させ、それは次にインビボで分化、成熟し、ＧＬＡ導入遺伝子から発現される生物製剤を含有する。一部の実施形態では、編集された細胞が骨髄に移動し、分化、成熟してα－ＧａｌＡタンパク質を産生するように、編集されたＣＤ３４＋幹細胞は患者に静脈内に与えられる。他の態様では、編集された幹細胞は、筋肉組織にその後導入される筋肉幹細胞である。一部の態様では、操作されたヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（用語「ＺＦＮ」はＺＦＮの対を含む）であり、他の態様では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（用語「ＴＡＬＥＮ」はＴＡＬＥＮの対を含む）であり、他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子座、疾患に関連した遺伝子への、または細胞の中で高度に発現される遺伝子への特異性を有するように操作することができる。非限定的な例だけとして、セーフハーバー遺伝子座はＡＡＶＳ１部位、ＣＣＲ５遺伝子、アルブミンまたはＨＰＲＴ遺伝子であってよく、疾患関連の遺伝子はα－ガラクトシダーゼＡをコードするＧＬＡ遺伝子であってよい。
別の態様では、本明細書において、プロモーターに作動可能に連結されている、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮ対および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）発現ベクターが記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。さらなる態様では、本明細書において、プロモーターに作動可能に連結されている、本明細書に記載されるα－ＧａｌＡをコードするポリヌクレオチドを含むＧＬＡ発現ベクターが記載される。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮ対および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）発現ベクターおよび／またはα－ＧａｌＡ発現ベクターを含む宿主細胞が記載される。宿主細胞は、１つまたは複数のヌクレアーゼ発現ベクターによって安定して形質転換すること、または一時的にトランスフェクトすること、またはその組み合わせが可能である。一部の実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞である。
他の実施形態では、例えば本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮ対および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）（または前記ヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクター）、および、ヌクレアーゼによる標的化切断の後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列またはＧＬＡ導入遺伝子を使用して、本明細書に記載される治療用ＧＬＡ導入遺伝子によって任意の標的遺伝子中のゲノム配列を置き換えるための方法が提供される。ドナーＧＬＡ配列は、別個のベクター（例えば、Ａｄ、ＡＡＶまたはＬＶベクターまたはｍＲＮＡ）に存在するヌクレアーゼ（またはその構成要素）を含むベクターに存在することができるか、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することができる。標的遺伝子座（例えば、高度発現遺伝子、疾患関連遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子等）へのドナーヌクレオチド配列のそのような挿入は、標的遺伝子座（例えば、アルブミン、グロビン等）の内因性遺伝子制御エレメントの制御下でＧＬＡ導入遺伝子の発現をもたらす。一部の態様では、例えば標的遺伝子（例えば、アルブミン）へのＧＬＡ導入遺伝子の挿入は、インタクトなα－ＧａｌＡタンパク質配列の発現をもたらし、標的（例えば、アルブミン）によってコードされるいかなるアミノ酸も欠く。他の態様では、発現される外因性α－ＧａｌＡタンパク質は融合タンパク質であり、ＧＬＡ導入遺伝子によって、およびＧＬＡ導入遺伝子が挿入される内因性遺伝子座によってコードされるアミノ酸を含む（例えば、内因性の標的遺伝子座に由来する、あるいは標的遺伝子座の配列をコードする導入遺伝子上の配列に由来する）。標的は、任意の遺伝子、例えば、セーフハーバー遺伝子、例えばアルブミン遺伝子、ＡＡＶＳ１遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子；ＣＣＲ５遺伝子；または高度発現遺伝子、例えばＲＢＣ前駆細胞中のグロビン遺伝子（例えば、ベータグロビンまたはガンマグロビン）であってよい。一部の場合には、内因性配列は外因性α－ＧａｌＡタンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在するが、他の場合には、内因性配列は外因性α－ＧａｌＡタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する。他の場合には、内因性配列は、α－ＧａｌＡ外因性タンパク質のＮおよびＣ末端の両部分に存在する。一部の実施形態では、内因性配列は、α－ＧａｌＡタンパク質の分泌の過程で細胞から除去される分泌シグナルペプチドをコードする。内因性配列は完全長野生型または変異体内因性配列を含むことができるか、あるいは、部分的内因性アミノ酸配列を含むことができる。一部の実施形態では、内因性遺伝子－導入遺伝子融合物は、細胞の中の内因性遺伝子座に位置するが、他の実施形態では、内因性配列－導入遺伝子コード配列はゲノムの中の別の遺伝子座に挿入される（例えば、アルブミン、ＨＰＲＴまたはＣＣＲ５遺伝子座に挿入されるＧＬＡ－導入遺伝子配列）。一部の実施形態では、ＧＬＡ導入遺伝子は、治療用α－ＧａｌＡタンパク質産物が細胞（例えば、前駆体または成熟細胞）の中で保持されるように発現される。他の実施形態では、発現の際に、導入遺伝子α－ＧａｌＡ融合物が治療用タンパク質の表面局在化をもたらすように、ＧＬＡ導入遺伝子は膜タンパク質の細胞外ドメインに融合される。一部の態様では、細胞外ドメインは、表１に掲載されるタンパク質から選択される。一部の態様では、編集された細胞は、細胞を特定の組織型へ運ぶための膜貫通タンパク質をさらに含む。一態様では、膜貫通タンパク質は抗体を含み、他の態様では、膜貫通タンパク質は受容体を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、前駆体（例えば、ＣＤ３４＋または造血幹細胞）または成熟ＲＢＣ（本明細書に記載される遺伝子改変ＧＡＬ産生細胞に由来する）である。一部の態様では、導入遺伝子の上にコードされる治療用α－ＧａｌＡタンパク質産物は、細胞から移出し、導入遺伝子を欠く細胞に影響するかまたはそれによって取り込まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、治療用α－ＧａｌＡタンパク質を血流に放出して、遠位組織（例えば、腎臓、脾臓、心臓、脳等）に作用する肝臓細胞である。
本発明は、同種異系生成物としてすべての患者のために普遍的に使用することができる、ファブリー病の治療のためのα－ＧａｌＡ治療用タンパク質を有する細胞（例えば、ＲＢＣ）の産生のための方法および組成物も供給する。これは、例えば、ファブリー病の患者の治療のための単一の生成物の開発を可能にする。これらのキャリアは、細胞の輸送を支援するための膜貫通タンパク質を含むことができる。一態様では、膜貫通タンパク質は抗体を含むが、他の態様では、膜貫通タンパク質は受容体を含む。
一実施形態では、アルブミン遺伝子座への挿入の後に、ＧＬＡ導入遺伝子がアルブミンプロモーターから発現される。導入遺伝子がインビボで肝細胞に挿入されるならば、ＧＬＡ導入遺伝子によってコードされる生物製剤は血流に放出され得る。一部の態様では、ＧＬＡ導入遺伝子は、ウイルスベクターにおいて静脈内投与を通してインビボで肝臓に送達される。一部の実施形態では、発現される産物がアルブミンシグナルペプチドを欠くように、ドナーＧＬＡ導入遺伝子は、α－ＧａｌＡコード配列の前にコザックコンセンサス配列を含む（Ｋｏｚａｋ（１９８７年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、１５巻（２０号）：８１２５～４８頁）。一部の実施形態では、ドナーα－ＧａｌＡ導入遺伝子は、天然のＧＬＡシグナル配列の代わりに、アルブミン、ＩＤＳまたはＦ９遺伝子に由来するものなどの代替のシグナルペプチドを含有する。したがって、ドナーは、配列番号１～５のいずれかに示すようなシグナルペプチド、またはシグナルペプチドとして作用する、これらの配列に相同性を示す配列を含むことができる（例えば、図１Ｂ、図１０、図１３および図２５を参照）。
一部の実施形態では、ＧＬＡ導入遺伝子ドナーは、導入遺伝子のエピソームまたは染色体外での維持のために、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される。一部の態様では、導入遺伝子ドナーの発現を調節するために、ＧＬＡ導入遺伝子ドナーは調節ドメインを含むベクターの上で維持される。一部の場合には、導入遺伝子発現を調節する調節ドメインは、発現される導入遺伝子にとって内因性のドメインであり、他の場合には、調節ドメインは導入遺伝子にとって異種である。一部の実施形態では、ＧＬＡ導入遺伝子はウイルスベクターの上で維持され、他の実施形態では、それはプラスミドまたはミニサークル（ｍｉｎｉ ｃｉｒｃｌｅ）の上で維持される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、ＡｄまたはＬＶである。さらなる態様では、導入遺伝子ドナーを含むベクターは、インビボで適する標的細胞に送達され、そのため、導入遺伝子ドナーベクターが肝細胞に送達されるときに、導入遺伝子ドナーによってコードされるα－ＧａｌＡ治療用タンパク質は血流に放出される。
別の実施形態では、本発明は、それらの前駆体に由来する成熟細胞が、その導入遺伝子によってコードされる高レベルのα－ＧａｌＡ産物を含有するようにＧＬＡ導入遺伝子が挿入されている前駆体細胞（筋肉幹細胞、前駆体細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）またはＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＰＣ）細胞）を記載する。一部の実施形態では、これらの前駆体は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
一部の実施形態では、本発明の方法は、トランスジェニック動物系においてインビボで使用することができる。一部の態様では、トランスジェニック動物は、モデルの開発で使用することができ、そこでは、導入遺伝子はヒトのα－ＧａｌＡタンパク質をコードする。一部の場合には、トランスジェニック動物は、対応する内因性遺伝子座でノックアウトすることができ、ヒトタンパク質を単独で調査することができるインビボ系の開発を可能にする。そのようなトランスジェニックモデルは、目的のヒトタンパク質と相互作用するかまたは改変することができる小分子または大きな生体分子または他の実体を同定する、スクリーニング目的のために使用することができる。一部の態様では、ＧＬＡ導入遺伝子は、選択された遺伝子座（例えば、高度発現またはセーフハーバー）に、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝臓の幹細胞、神経幹細胞等）に、または本明細書に記載される方法および当分野で標準の方法のいずれかによって得られる非ヒト動物胚に組み込まれ、その後、生きた動物が生まれるように胚が移植される。動物は、次に性的成熟まで育てられて子孫を生まされ、ここで、子孫の少なくとも一部は組み込まれたＧＬＡ導入遺伝子を含む。
さらなる態様では、本明細書で、内因性遺伝子座（例えば、疾患関連、高度発現）、例えば肝臓細胞の中のアルブミン遺伝子座または染色体のＲＢＣ前駆体細胞の中のグロビン遺伝子座への、例えば非ヒト胚の染色体への、核酸配列の部位特異的組み込みのための方法が提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）非ヒト胚に、（ｉ）少なくとも１つのＤＮＡベクターであって、組み込むα－ＧａｌＡをコードする核酸配列に隣接している上流配列および下流配列を含むＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）標的遺伝子座の組み込み部位を認識する少なくとも１つのヌクレアーゼ（ジンクフィンガー、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ対またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を注射するステップと、（ｂ）ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）の発現を可能にするために胚を培養するステップであって、核酸配列を染色体に組み込むように、ヌクレアーゼによって組み込み部位に導入される二本鎖切断が、ＤＮＡベクターによる相同組換えを通して修復されるステップと、を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはＲＮＡである。
前の実施形態のいずれにおいても、本発明の方法および化合物は、ファブリー病の被験体の治療のための他の治療剤と組み合わせることができる。一部の実施形態では、方法および組成物は、ファブリータンパク質の正しいフォールディングを保証するために、分子シャペロンの使用を含む（Ｈａｒｔｌら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ、４６５巻：３２４～３３２頁）。一部の態様では、シャペロンはＡＴ１００１（Ｂｅｎｊａｍｉｎら（２０１２年）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２０巻（４号）：７１７～７２６頁）、ＡＴ２２２０（Ｋｈａｎｎａら（２０１４年）ＰＬｏＳ ＯＮＥ、９巻（７号）：ｅ１０２０９２頁、ｄｏｉ：１０．１３７１）、およびミガラスタト（Ｂｅｎｊａｍｉｎら（２０１６年）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｉｍ．２０１６．１２２）などの周知のシャペロンタンパク質から選択することができる。一部の態様では、方法および組成物は、血液脳関門を横切る通過を可能にする方法および組成物と併用して使用される。他の態様では、方法および組成物は、被験体の免疫応答を抑制することが公知である化合物と併用して使用される。
本明細書に記載されるヌクレアーゼ系および／またはＧＬＡドナーを含むキットも提供される。キットは、１つまたは複数のヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮ対および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする核酸、（例えば、適する発現ベクターに含有されるＲＮＡ分子またはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、ドナー分子、単一ガイドＲＮＡをコードする発現ベクター、適する宿主細胞系、本発明の方法を実行するための指示などを含むことができる。
これらおよび他の態様は、全体として開示に照らして当業者にとって容易に明らかになる。
図１Ａ～１Ｃは、野生型α－ＧａｌＡ酵素により実施される酵素反応、ならびに初期ドナーおよび導入遺伝子発現カセットを示す図である。図１Ａは、野生型哺乳動物においてＧｂ３基質が分解される、α－ＧａｌＡにより実施される反応を示す。ファブリー生物体では、Ｇｂ３基質が毒性レベルまで蓄積する。図１Ｂは、ｃＤＮＡからα－ＧａｌＡを発現させるために使用した初期ウイルスベクターを示し、一方、図１Ｃは、アルブミン遺伝子へのヌクレアーゼ媒介性挿入後にα－ＧａｌＡを発現させるために使用した初期ウイルスベクターを示す。
図２は、アルブミン特異的ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および図１Ｃに示すドナーが形質導入された細胞についての、７日の期間にわたってＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞培地で検出されたα－ＧａｌＡ活性を示すグラフである（「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（登録商標）」の頭字語である「ＩＶＰＲＰ」と標識された右側パネルに示す）。模擬形質導入手順を受けた細胞の培地における活性レベルを左側パネルに示す。バーは左から右に、３日目、５日目、７日目および細胞のみでの活性を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、ｃＤＮＡ手法を使用して検出されたα－ＧａｌＡ活性レベルを示すグラフである。図３Ａは、図１Ｂに示すｃＤＮＡ発現カセットを含む様々な用量のＡＡＶウイルスでの、６日の期間にわたって検出されたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞培地における活性を示す（バーは左から右に、模擬トランスフェクション、１０Ｋ、３０Ｋ、１００Ｋ、３００Ｋ、１０００Ｋ、３０００Ｋおよび９０００Ｋを示す）。図３Ｂは、実験の最後の時点で、図３Ａの細胞の細胞ペレットにおいて検出された活性を示すグラフである。
図４Ａおよび４Ｂは、ｃＤＮＡ含有ＡＡＶで処理したＧＬＡＫＯマウスにおけるインビボ活性を示すグラフである。図４Ａは、体重１キログラムあたりのベクターゲノム（ＶＧ／ｋｇ）２．０ｅ１２の、ｃＤＮＡ構築物を含むＡＡＶ２／６で処理した各個々のマウスについての結果を示し、一方、図４Ｂは、ＡＡＶ２／６－ｃＤＮＡ ２．０ｅ１３ＶＧ／ｋｇで処理した各マウスについての結果を示す。図４Ａでは、示した日に１匹のマウスを分子シャペロンＤＧＪでさらに処理した。野生型マウスで見られたα－ＧａｌＡ活性レベルも両図で点線により示す。示すように、処理したマウスは、治療上有効なレベルを示す、野生型を超えるレベルを示す。
図５Ａ～５Ｆは、ＧＬＡＫＯマウスおよびｃＤＮＡ構築物を含むＡＡＶ２／６で処理したマウスにおける、Ｇｂ３脂質基質レベルを示すグラフである。図５Ａは血漿で検出された基質レベルを示し、図５Ｂは心臓組織での基質を示す。図５Ｃは肝臓で検出された基質を示し、図５Ｄは腎臓組織で検出された基質を示す。示した組織すべてで、Ｇｂ３レベルは未処理ＧＬＡＫＯマウスでのレベルより低い。図５Ｄではこのアッセイについての定量下限（ｌｏｗｅｓｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）（ＬＬＯＱ）も示す。処理したマウスにおけるＧｂ３およびリゾ－Ｇｂ３レベルを、未処理マウスと比較して見られた基質量に関しても表した。図５Ｅは、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した、特定の組織において残存するＧｂ３のパーセントを示し、図５Ｆは、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した、特定の組織において残存するリゾ－Ｇｂ３のパーセントを示す。５Ｅおよび５Ｆの組織データセットは各処理群（未処理ＧＬＡＫＯ、低用量および高用量で処理したＧＬＡＫＯならびに野生型マウス）で示し、バーは（左から右に）血漿、肝臓、心臓および腎臓由来のデータを表す。 図５Ａ～５Ｆは、ＧＬＡＫＯマウスおよびｃＤＮＡ構築物を含むＡＡＶ２／６で処理したマウスにおける、Ｇｂ３脂質基質レベルを示すグラフである。図５Ａは血漿で検出された基質レベルを示し、図５Ｂは心臓組織での基質を示す。図５Ｃは肝臓で検出された基質を示し、図５Ｄは腎臓組織で検出された基質を示す。示した組織すべてで、Ｇｂ３レベルは未処理ＧＬＡＫＯマウスでのレベルより低い。図５Ｄではこのアッセイについての定量下限（ｌｏｗｅｓｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）（ＬＬＯＱ）も示す。処理したマウスにおけるＧｂ３およびリゾ－Ｇｂ３レベルを、未処理マウスと比較して見られた基質量に関しても表した。図５Ｅは、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した、特定の組織において残存するＧｂ３のパーセントを示し、図５Ｆは、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した、特定の組織において残存するリゾ－Ｇｂ３のパーセントを示す。５Ｅおよび５Ｆの組織データセットは各処理群（未処理ＧＬＡＫＯ、低用量および高用量で処理したＧＬＡＫＯならびに野生型マウス）で示し、バーは（左から右に）血漿、肝臓、心臓および腎臓由来のデータを表す。
図６Ａ～６Ｅは、インビボで試験したＩＶＰＲＰ手法についての結果を示すグラフである。図６Ａは、図１Ｃに示す導入遺伝子ドナーを含むＡＡＶ２／８ウイルスで処理したＧＬＡＫＯマウスの血漿において検出された経時的なα－Ｇａｌ Ａ活性を示し、一部のマウスには免疫抑制を受けた（実施例４を参照されたい）。野生型マウスで見られたレベルも示す。図６Ｂは、処理した動物の肝臓において９０日目に検出されたｉｎｄｅｌレベルを示すグラフである。ｉｎｄｅｌ（挿入および／または欠失）はヌクレアーゼ活性の指標である。図６Ｃ、６Ｄおよび６Ｅは、ほぼ３０日の期間にわたる、処理したマウスの血漿において検出された活性の時間経過である。図６Ｃは低量の免疫抑制でさらに処理した動物における活性を示し、一方、図６Ｄは中程度の免疫抑制で処理した動物における活性を示し、図６Ｅは、高レベルの免疫抑制で処理した動物を示す。図６Ｃ、６Ｄおよび６Ｅでは、比較のために野生型マウスで見られたレベルも示す（点線）。
図７Ａ～７Ｃは、免疫抑制（「ＩＳ」）およびＤＧＪシャペロンの両方で処理した動物において経時的に検出されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。図７Ａは、低レベルの免疫抑制で処理した動物についての結果を示し、矢印はシャペロン用量およびマウス処理のタイミングを示す。図７Ａではすべてのマウスをシャペロンで処理し、結果は、活性が増大したことを実証している。図７Ｂは、中程度の免疫抑制下の動物についての結果を示し、ここではマウス２匹をＤＧＪで処理した。このマウス２匹では、それらの血漿におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の増大が見られた。図７Ｃは、高用量の免疫抑制下のマウスについての結果を示し、ここでも、マウス３匹をＤＧＪで処理した時点を示す。これらの結果は、シャペロンにより、検出された活性の量が増大したことを実証している。点線は、比較のための、野生型マウスで見られた活性レベルを示す。
図８は、ｃＤＮＡまたはＩＶＰＲＰ手法のいずれかにより処理したマウスの組織におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の比較について示すグラフである。比較のため、野生型マウスおよび未処理ＧＬＡＫＯマウスにおけるレベルも示す。示した組織は肝臓、血漿、脾臓、心臓および腎臓である。Ｙ軸が分割されており、２．０ｅ１３ＶＧ／ｋｇ用量でのｃＤＮＡ手法によって野生型レベルのほぼ１００倍のα－ＧａｌＡ活性が生じること、および試験した組織すべてで活性が検出可能であることを示していることに留意されたい。
図９Ａ～９Ｃは、ｃＤＮＡおよびＩｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（登録商標）（ＩＶＰＲＰ）手法の両方についての結果として検出された、α－ＧａｌＡ活性およびＧｂ３脂質基質のレベルを示す図である。図９Ａは、異なる処理群で検出された平均活性値を示す。図９Ｂは、様々な群についての、血漿、肝臓および心臓組織において検出されたＧｂ３量を示し、ｃＤＮＡ手法によって野生型マウスに迫るＧｂ３減少がもたらされることを実証しており、導入遺伝子から発現されたタンパク質がその標的基質に対し作用するのに有効であることを示している。図９Ｃは、９Ａの表での個々のマウスにおけるα－ＧａｌＡ活性の量を示すグラフである（ＺＦＮ＋ドナー＋ＤＧＪ群は示さない）。ｃＤＮＡ高用量マウス（ｃＤＮＡドナーベクター２．０ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）は黒線上の黒丸で示す。ｃＤＮＡ低用量マウス（ｃＤＮＡドナーベクター２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）は破線上の網掛の三角で示す。野生型マウスは灰色線上の黒丸として示し、ＧＬＡＫＯマウスは黒線上の黒四角で示す。高用量ｃＤＮＡマウス４匹中３匹が、野生型マウスのレベルの１００倍を超えるレベルを有していた。 図９Ａ～９Ｃは、ｃＤＮＡおよびＩｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（登録商標）（ＩＶＰＲＰ）手法の両方についての結果として検出された、α－ＧａｌＡ活性およびＧｂ３脂質基質のレベルを示す図である。図９Ａは、異なる処理群で検出された平均活性値を示す。図９Ｂは、様々な群についての、血漿、肝臓および心臓組織において検出されたＧｂ３量を示し、ｃＤＮＡ手法によって野生型マウスに迫るＧｂ３減少がもたらされることを実証しており、導入遺伝子から発現されたタンパク質がその標的基質に対し作用するのに有効であることを示している。図９Ｃは、９Ａの表での個々のマウスにおけるα－ＧａｌＡ活性の量を示すグラフである（ＺＦＮ＋ドナー＋ＤＧＪ群は示さない）。ｃＤＮＡ高用量マウス（ｃＤＮＡドナーベクター２．０ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）は黒線上の黒丸で示す。ｃＤＮＡ低用量マウス（ｃＤＮＡドナーベクター２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）は破線上の網掛の三角で示す。野生型マウスは灰色線上の黒丸として示し、ＧＬＡＫＯマウスは黒線上の黒四角で示す。高用量ｃＤＮＡマウス４匹中３匹が、野生型マウスのレベルの１００倍を超えるレベルを有していた。
図１０は、ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法に使用した様々な例示的なドナー構築物（改変体＃Ａ～＃Ｌ、改変体Ａ～Ｌとも呼ばれる）を示す概略図である。概略図での略語は以下の通りである：「ＩＴＲ」はＡＡＶ逆位末端反復配列領域である。「ＨＡ－Ｒ」および「ＨＡ－Ｌ」は、ＺＦＮ切断部位に隣接するアルブミン配列に対し相同性を有する右（Ｒ）および左（Ｌ）相同アームである。「ＳＡ」はＦ９遺伝子由来のスプライス受容部位であり、一方、「ＨＢＢ－ＩＧＧ」はイントロン配列であり、「ＧＬＡｃｏ」はコドン最適化α－ＧａｌＡコード配列であり、一方、「ＧＬＡｃｏ ｖ．２」はα－ＧａｌＡコード配列の代替のコドン最適化である。「ｂＧＨｐＡ」はウシ成長ホルモン由来のポリＡ配列であり、「ＧＬＡシグナルペプチド」はＧＬＡ遺伝子由来のシグナルペプチドであり、「融合物」はスプライス受容部位とＧＬＡ導入遺伝子の間に挿入されるさらなるアミノ酸２～５個を有する構築物を指す。「Ｔ２Ａ」および「Ｆ２Ａ」は、それぞれＴ．ａｓｓｉｇｎａおよび口蹄疫ウイルス由来の自己切断配列である。「ＩＤＳシグナルペプチド」はＩＤＳ遺伝子用のシグナルペプチドであり、一方、「ＦＩＸシグナルペプチド」はＦＩＸ遺伝子由来のシグナルペプチドである。「ＴＩ」は導入遺伝子の３’末端に付加される５’ＮＧＳプライマー結合配列であり、その後に、野生型遺伝子座と同一の塩基組成を有する標的化組み込み（ＴＩ）特異的配列が続いており、ｉｎｄｅｌおよびＨＤＲ媒介性の導入遺伝子組み込みを同時に測定するための次世代シーケンシングが可能となる。より詳細には実施例を参照されたい。 図１０は、ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法に使用した様々な例示的なドナー構築物（改変体＃Ａ～＃Ｌ、改変体Ａ～Ｌとも呼ばれる）を示す概略図である。概略図での略語は以下の通りである：「ＩＴＲ」はＡＡＶ逆位末端反復配列領域である。「ＨＡ－Ｒ」および「ＨＡ－Ｌ」は、ＺＦＮ切断部位に隣接するアルブミン配列に対し相同性を有する右（Ｒ）および左（Ｌ）相同アームである。「ＳＡ」はＦ９遺伝子由来のスプライス受容部位であり、一方、「ＨＢＢ－ＩＧＧ」はイントロン配列であり、「ＧＬＡｃｏ」はコドン最適化α－ＧａｌＡコード配列であり、一方、「ＧＬＡｃｏ ｖ．２」はα－ＧａｌＡコード配列の代替のコドン最適化である。「ｂＧＨｐＡ」はウシ成長ホルモン由来のポリＡ配列であり、「ＧＬＡシグナルペプチド」はＧＬＡ遺伝子由来のシグナルペプチドであり、「融合物」はスプライス受容部位とＧＬＡ導入遺伝子の間に挿入されるさらなるアミノ酸２～５個を有する構築物を指す。「Ｔ２Ａ」および「Ｆ２Ａ」は、それぞれＴ．ａｓｓｉｇｎａおよび口蹄疫ウイルス由来の自己切断配列である。「ＩＤＳシグナルペプチド」はＩＤＳ遺伝子用のシグナルペプチドであり、一方、「ＦＩＸシグナルペプチド」はＦＩＸ遺伝子由来のシグナルペプチドである。「ＴＩ」は導入遺伝子の３’末端に付加される５’ＮＧＳプライマー結合配列であり、その後に、野生型遺伝子座と同一の塩基組成を有する標的化組み込み（ＴＩ）特異的配列が続いており、ｉｎｄｅｌおよびＨＤＲ媒介性の導入遺伝子組み込みを同時に測定するための次世代シーケンシングが可能となる。より詳細には実施例を参照されたい。
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞における、インビトロでのα－ＧａｌＡ活性を示すグラフである。図１１Ａでは、図１０に示す初期ドナーならびにドナー改変体＃Ａ、＃Ｂ、および＃Ｅを使用して、細胞および細胞上清において検出された活性を示す。「Ｚ＋Ｄ」は、ＺＦＮおよびドナーの投与を指す。データは、改変体＃Ａおよび＃Ｂが初期ドナーよりも大きい活性を有していたことを示している。図１１Ｂは、低（ＺＦＮ／ドナー３００，０００／６００，０００ＶＧ／細胞）または高（ＺＦＮ／ドナー６００，０００／１，２００，０００ＶＧ／細胞）用量のＺＦＮおよびＧＬＡドナーのいずれかの改変体＃Ａ、＃Ｋ、＃Ｊ、＃Ｈおよび＃Ｉ（改変体Ａ、Ｋ、Ｊ、ＨおよびＩ）を比較した、α－ＧａｌＡ活性を示すグラフである。「ドナーのみ」データセットは、ＺＦＮを有しないドナー構築物のみで処理した細胞を表す。バーは群平均を表し、標準偏差はエラーバーで示す。データは、このセットでは改変体＃Ｋが最大の活性をもたらすことを示した。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞における、インビトロでのα－ＧａｌＡ活性を示すグラフである。図１１Ａでは、図１０に示す初期ドナーならびにドナー改変体＃Ａ、＃Ｂ、および＃Ｅを使用して、細胞および細胞上清において検出された活性を示す。「Ｚ＋Ｄ」は、ＺＦＮおよびドナーの投与を指す。データは、改変体＃Ａおよび＃Ｂが初期ドナーよりも大きい活性を有していたことを示している。図１１Ｂは、低（ＺＦＮ／ドナー３００，０００／６００，０００ＶＧ／細胞）または高（ＺＦＮ／ドナー６００，０００／１，２００，０００ＶＧ／細胞）用量のＺＦＮおよびＧＬＡドナーのいずれかの改変体＃Ａ、＃Ｋ、＃Ｊ、＃Ｈおよび＃Ｉ（改変体Ａ、Ｋ、Ｊ、ＨおよびＩ）を比較した、α－ＧａｌＡ活性を示すグラフである。「ドナーのみ」データセットは、ＺＦＮを有しないドナー構築物のみで処理した細胞を表す。バーは群平均を表し、標準偏差はエラーバーで示す。データは、このセットでは改変体＃Ｋが最大の活性をもたらすことを示した。
図１２は、インビボでの改変体＃Ａ、＃Ｂおよび＃Ｅの活性を示すグラフである。ＧＬＡＫＯマウスを使用し、血漿試料を１週間あたり１回採取した。図１２は、注射後５６日目までの各群のデータを示し、比較のためにｃＤＮＡ手法でのデータも示す。２８日目に、「新しい」改変体ドナーで処理したマウスは初期ドナーよりもはるかに大きいα－ＧａｌＡ活性を有した。「初期」ドナーは、図１０を参照して、最適化する前に使用したドナーを指し、図１２では各群の左側に黒いバーとして示される。ｃＤＮＡの結果は、５６日目についてのみグラフの最も右側に提示する。点線は野生型マウスにおける活性レベルの５０倍を示し、すべての試料が２８日時点で野生型よりも少なくとも４０倍大きい活性を示したことを示している。
図１３Ａおよび１３Ｂは、例示的なｃＤＮＡ発現カセットの概略図である。図１３Ａは、以前に記載されたｃＤＮＡ発現系（米国公開第２０１７０１１９９０６号を参照されたい）のレイアウトを示し、ここで、ＧＬＡコード配列は異なるコドン最適化プロトコール（ＤＮＡ ２．０ ｖ１ 対 ＧｅｎｅＡｒｔ ｖ２、「ＧＬＡｃｏ ｖ．２」）を使用して挿入されている。図１３Ｂは、代替のコドン最適化プロトコールによる、この研究で使用されるｃＤＮＡ発現カセットを示し、２つの異なるプロトコールを使用して最適化されたＧＬＡコード配列と組み合わせた、ＩＤＳ、ＦＩＸまたはＡＬＢ遺伝子由来のシグナルペプチドを使用する改変体＃１～＃６（改変体１～６とも呼ばれる）を示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ｃＤＮＡ手法を使用してのα－ＧａｌＡ活性の発現を示すグラフである。この図では、示したｃＤＮＡ構築物を含むＡＡＶでＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を形質導入し、図１３Ｂに示すようにシグナルペプチドを変化させる効果を試験した。３日目および５日目に細胞上清においてα－Ｇａｌ Ａ活性を測定し、結果は、ＩＤＳおよびＦＩＸ（Ｆ９）リーダー配列によりＧＬＡまたはアルブミン（ＡＬＢ）リーダー配列よりも高いレベルの活性がもたらされることを示した。図１４Ｂは、改変体＃１、＃２、＃４、＃５および＃６についての、５日目のα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。これらの試験では、細胞に３．０ｅ５ ＶＧ／細胞のＡＡＶ２／６ ＧＬＡ ｃＤＮＡベクターを投与した。バーは群平均を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
図１５Ａ～１５Ｃは、血漿（図１５Ａ）または選択組織（図１５Ｂ）のいずれかにおけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。アルブミンイントロン１で二本鎖切断を引き起こすように設計されたＺＦＮ ３ｅ１１ＶＧ、および初期ＧＬＡドナー構築物または改変体Ａ、Ｂ、ＥもしくはＪ １．２ｅ１２ＶＧ（総ＡＡＶ用量／マウス＝６ｅ１３ＶＧ／ｋｇ）をＧＬＡＫＯマウスに注射した。図１５Ａは、毎週または隔週で評価しながら２ヶ月間追跡した、マウスにおけるプラスミドα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。左側パネルは、初期ドナー、改変体Ａ、改変体Ｅまたは改変体Ｂを受けた動物についての結果を示す。右側パネルは、野生型動物または改変体ＥもしくはＪを受けた動物についての結果を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示す動物を屠殺した後にアッセイされた肝臓、心臓、腎臓および脾臓において測定されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。図１５Ｂの左側のグラフは、初期ＧＬＡドナー構築物（各群の最も左のバーに示す「初期」）での処理から２ヶ月後、改変体Ａ（各群の左から２番目のバー）、改変体Ｂ（各群の中央のバー）、改変体Ｅ（各群の右から２番目のバー）での処理から２ヶ月後、および野生型動物（各群の最も右のバーに示す「野生型」）におけるデータを示す。図１５Ｂの右側のグラフは改変体ＥおよびＪについての活性を示し、各データセットでは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおける活性を最も左のバーで示し；野生型マウスにおけるものは各群の左から２番目のバー；改変体＃Ｅで処理したＧＬＡＫＯマウスにおける活性を左から３番目のバーで示し、一方、改変体Ｊでの活性を最も右のバーで示す。ＧＬＡドナー改変体Ａ、Ｂ、ＥおよびＪについては、血漿および測定した組織すべてで、α－Ｇａｌ Ａが野生型を何倍も上回った。図１５Ｃは血漿α－Ｇａｌ Ａ活性レベルを示し、ここでは、ＺＦＮ対および改変体Ａドナーで処理した各マウスについてのデータを示す。これは、図１５Ａでは群としてのマウスについてのデータを示すが、図１５Ｃでは処理した各マウスについてのデータを示すことを除いて、図１５Ａで示した、標識された改変体Ａと同一の実験であることに留意されたい。 図１５Ａ～１５Ｃは、血漿（図１５Ａ）または選択組織（図１５Ｂ）のいずれかにおけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。アルブミンイントロン１で二本鎖切断を引き起こすように設計されたＺＦＮ ３ｅ１１ＶＧ、および初期ＧＬＡドナー構築物または改変体Ａ、Ｂ、ＥもしくはＪ １．２ｅ１２ＶＧ（総ＡＡＶ用量／マウス＝６ｅ１３ＶＧ／ｋｇ）をＧＬＡＫＯマウスに注射した。図１５Ａは、毎週または隔週で評価しながら２ヶ月間追跡した、マウスにおけるプラスミドα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。左側パネルは、初期ドナー、改変体Ａ、改変体Ｅまたは改変体Ｂを受けた動物についての結果を示す。右側パネルは、野生型動物または改変体ＥもしくはＪを受けた動物についての結果を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示す動物を屠殺した後にアッセイされた肝臓、心臓、腎臓および脾臓において測定されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。図１５Ｂの左側のグラフは、初期ＧＬＡドナー構築物（各群の最も左のバーに示す「初期」）での処理から２ヶ月後、改変体Ａ（各群の左から２番目のバー）、改変体Ｂ（各群の中央のバー）、改変体Ｅ（各群の右から２番目のバー）での処理から２ヶ月後、および野生型動物（各群の最も右のバーに示す「野生型」）におけるデータを示す。図１５Ｂの右側のグラフは改変体ＥおよびＪについての活性を示し、各データセットでは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおける活性を最も左のバーで示し；野生型マウスにおけるものは各群の左から２番目のバー；改変体＃Ｅで処理したＧＬＡＫＯマウスにおける活性を左から３番目のバーで示し、一方、改変体Ｊでの活性を最も右のバーで示す。ＧＬＡドナー改変体Ａ、Ｂ、ＥおよびＪについては、血漿および測定した組織すべてで、α－Ｇａｌ Ａが野生型を何倍も上回った。図１５Ｃは血漿α－Ｇａｌ Ａ活性レベルを示し、ここでは、ＺＦＮ対および改変体Ａドナーで処理した各マウスについてのデータを示す。これは、図１５Ａでは群としてのマウスについてのデータを示すが、図１５Ｃでは処理した各マウスについてのデータを示すことを除いて、図１５Ａで示した、標識された改変体Ａと同一の実験であることに留意されたい。 図１５Ａ～１５Ｃは、血漿（図１５Ａ）または選択組織（図１５Ｂ）のいずれかにおけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。アルブミンイントロン１で二本鎖切断を引き起こすように設計されたＺＦＮ ３ｅ１１ＶＧ、および初期ＧＬＡドナー構築物または改変体Ａ、Ｂ、ＥもしくはＪ １．２ｅ１２ＶＧ（総ＡＡＶ用量／マウス＝６ｅ１３ＶＧ／ｋｇ）をＧＬＡＫＯマウスに注射した。図１５Ａは、毎週または隔週で評価しながら２ヶ月間追跡した、マウスにおけるプラスミドα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。左側パネルは、初期ドナー、改変体Ａ、改変体Ｅまたは改変体Ｂを受けた動物についての結果を示す。右側パネルは、野生型動物または改変体ＥもしくはＪを受けた動物についての結果を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示す動物を屠殺した後にアッセイされた肝臓、心臓、腎臓および脾臓において測定されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。図１５Ｂの左側のグラフは、初期ＧＬＡドナー構築物（各群の最も左のバーに示す「初期」）での処理から２ヶ月後、改変体Ａ（各群の左から２番目のバー）、改変体Ｂ（各群の中央のバー）、改変体Ｅ（各群の右から２番目のバー）での処理から２ヶ月後、および野生型動物（各群の最も右のバーに示す「野生型」）におけるデータを示す。図１５Ｂの右側のグラフは改変体ＥおよびＪについての活性を示し、各データセットでは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおける活性を最も左のバーで示し；野生型マウスにおけるものは各群の左から２番目のバー；改変体＃Ｅで処理したＧＬＡＫＯマウスにおける活性を左から３番目のバーで示し、一方、改変体Ｊでの活性を最も右のバーで示す。ＧＬＡドナー改変体Ａ、Ｂ、ＥおよびＪについては、血漿および測定した組織すべてで、α－Ｇａｌ Ａが野生型を何倍も上回った。図１５Ｃは血漿α－Ｇａｌ Ａ活性レベルを示し、ここでは、ＺＦＮ対および改変体Ａドナーで処理した各マウスについてのデータを示す。これは、図１５Ａでは群としてのマウスについてのデータを示すが、図１５Ｃでは処理した各マウスについてのデータを示すことを除いて、図１５Ａで示した、標識された改変体Ａと同一の実験であることに留意されたい。
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＺＦＮ＋異なるドナー改変体での処理後に残ったα－Ｇａｌ Ａ糖脂質基質（Ｇｂ３およびリゾ－Ｇｂ３）の量を示すグラフである。Ｇｂ３（図１６Ａ）およびリゾ－Ｇｂ３（図１６Ｂ）含量を、質量分光光度法により血漿、心臓、肝臓、腎臓および脾臓（脾臓データは示さない）において測定した。各データセットは４つの群で示され、（各群左から右に）血漿、肝臓、心臓および腎臓におけるレベルを示す。基質量は、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した残りの割合として表す。ＧＬＡドナー改変体Ａ、ＢまたはＥで処理したマウスの組織において、Ｇｂ３およびリゾ－Ｇｂ３の量がともに著しく減少した。
図１７Ａ～１７Ｃは、脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏ Ｈでα－Ｇａｌ Ａタンパク質を処理する効果を示す図である。図１７Ａは、ＩＶＰＲＰ手法により処理した動物のマウス肝臓由来のホモジェネートから作製されたウェスタンブロットを示す。上側パネル（「ＧＬＡドナー改変体Ａ」と標識）では、マウス３匹の試料、および野生型マウス（「ＷＴ」）、未処理ＧＬＡＫＯマウス（「ＧＬＡＫＯ」）由来の試料、および組換えヒトＧａｌ Ａ（「ｒｅｃ．ｈＧａｌ Ａ」）の試料について示す。「ＧＬＡドナー改変体Ｊ」と標識された下側パネルでは、マウス２匹の試料について、野生型マウス試料および未処理ＧＬＡＫＯマウス試料、および組換えヒトＧａｌ Ａの試料とともに示す。両ブロットの（＋）および（－）は、ＰＮＧａｓｅ ＦまたはＥｎｄｏ Ｈでの処理を示す。図１７Ｂは、ｃＤＮＡ手法（「初期」構築物）を使用してマウスを処理したことを除き、図１７Ａに記載されるように作製されたウェスタンブロットを示す。図１７Ｃは、複雑なグリコシル化構造のＰＮＧａｓｅＦ切断を示す概略図である。データは、ＩＶＰＲＰ（登録商標）またはｃＤＮＡ手法のいずれかの後に、処理したＧＬＡＫＯ動物において発現されたＧａｌ Ａ酵素が、ＰＮＧａｓｅＦ処理後の脱グリコシル化ヒト組換えタンパク質と同様の脱グリコシル化を示すことを実証している。 図１７Ａ～１７Ｃは、脱グリコシル化酵素ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏ Ｈでα－Ｇａｌ Ａタンパク質を処理する効果を示す図である。図１７Ａは、ＩＶＰＲＰ手法により処理した動物のマウス肝臓由来のホモジェネートから作製されたウェスタンブロットを示す。上側パネル（「ＧＬＡドナー改変体Ａ」と標識）では、マウス３匹の試料、および野生型マウス（「ＷＴ」）、未処理ＧＬＡＫＯマウス（「ＧＬＡＫＯ」）由来の試料、および組換えヒトＧａｌ Ａ（「ｒｅｃ．ｈＧａｌ Ａ」）の試料について示す。「ＧＬＡドナー改変体Ｊ」と標識された下側パネルでは、マウス２匹の試料について、野生型マウス試料および未処理ＧＬＡＫＯマウス試料、および組換えヒトＧａｌ Ａの試料とともに示す。両ブロットの（＋）および（－）は、ＰＮＧａｓｅ ＦまたはＥｎｄｏ Ｈでの処理を示す。図１７Ｂは、ｃＤＮＡ手法（「初期」構築物）を使用してマウスを処理したことを除き、図１７Ａに記載されるように作製されたウェスタンブロットを示す。図１７Ｃは、複雑なグリコシル化構造のＰＮＧａｓｅＦ切断を示す概略図である。データは、ＩＶＰＲＰ（登録商標）またはｃＤＮＡ手法のいずれかの後に、処理したＧＬＡＫＯ動物において発現されたＧａｌ Ａ酵素が、ＰＮＧａｓｅＦ処理後の脱グリコシル化ヒト組換えタンパク質と同様の脱グリコシル化を示すことを実証している。
図１８Ａ～１８Ｃは、初期ｃＤＮＡ構築物を使用して、改変体＃４（上記の１３Ｂに示す）と比較して測定された活性を示すグラフである。図１８Ａは、示したＧＬＡ ｃＤＮＡを含むＡＡＶ２／６ ２ｅ１２ＶＧ／ｋｇで処理したＧＬＡＫＯマウスにおける血漿α－ＧａｌＡ活性を示す。注射後最大６０日間活性を測定した。図１８Ｂは、図１８Ａのマウスの、示した組織におけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。データセットは、左から右に、ＧＬＡＫＯ未処理マウス（最も左のバー）；野生型マウス（最も左のバーから２番目）；初期ｃＤＮＡ改変体で処理したＧＬＡＫＯマウス（左のバーから３番目）；およびｃＤＮＡ改変体Ｄで処理したＧＬＡＫＯマウスにおけるα－ＧａｌＡ活性を示す。水平方向の点線は、参照のための、野生型レベルの１０×に相当する活性を示す。図１８Ｃは、ｃＤＮＡ改変体＃４で処理したＧＬＡＫＯマウス３匹の肝臓におけるヒトα－ＧａｌＡを検出したウェスタンブロットを示す。比較のため、野生型マウス（「ＷＴ」）および未処理ＧＬＡＫＯマウスの活性を示す。比較のため、組換えｈＧａｌＡについても示す。試料は、図１７に記載されるようにＰＮＧａｓｄＦまたはＥｎｄｏＨで処理した。
図１９は、初期ｃＤＮＡ構築物（図１３に示す）で処理したマウスの血漿におけるα－Ｇａｌ Ａ活性レベルを示すグラフである。１．２５ｅ１１～５．０ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、示した用量の構築物を含むＡＡＶで各群を処理した（実線、群平均をエラーバーで示す）。野生型および未処理ＧＬＡＫＯマウスも含め、図に示す。
図２０Ａおよび２０Ｂは、改変体ＥおよびＪのインビボでの発現後に検出されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。図２０Ａは、アルブミン特異的なＺＦＮ、および改変体Ｅまたは改変体Ｊドナー（図１０を参照されたい）のいずれかによるＧＬＡＫＯマウス処理後に、血漿において検出されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。図２０Ｂは、目的の様々な組織（肝臓、心臓、腎臓および脾臓）において検出されたα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。図２０Ｂの各データセットでは、左から右に、バーはＧＬＡＫＯマウス、野生型（ＷＴ）マウス、改変体Ｅドナーまたは改変体Ｊドナーについての結果を示す。
図２１Ａおよび２１Ｂは、目的の様々な組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）において検出されたα－Ｇａｌ Ａ基質量を示すグラフである。図２１Ａは、ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたＧＢ３量を示す。図２１Ｂは、ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたリゾ－Ｇｂ３量を示す。図２１Ａおよび２１Ｂではともに、各データセットは、左から右に、血漿、肝臓、心臓および腎臓において検出された結果を示す。
図２２は、ＧＬＡ導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み後の、ファブリー病のＧＬＡＫＯマウスモデルにおける肝細胞の恒久的な改変を示すグラフであり、示した条件下で処理した肝臓細胞におけるｉｎｄｅｌのパーセンテージを示す。
図２３Ａおよび２３Ｂは、組み込まれた導入遺伝子から発現され、血流に分泌され、二次的な組織に取り込まれたα－Ｇａｌ Ａを示すグラフである。ＧＬＡＫＯマウスを、ＺＦＮ、および２つのｈＧＬＡドナー構築物のうち１つで処理した。図２３Ａは、示した構築物で処理した動物または未処理動物由来の血漿におけるＧａｌＡ活性を示す。図２３Ｂは、示した条件下での、示した組織（肝臓、脾臓、心臓および腎臓）におけるＧａｌＡ活性を示す。最も左のバーは未処理動物における活性を示し；左から２番目のバーはドナー改変体Ｅのみで処理した動物における活性を示し；中央のバーは野生型動物における活性を示し；右から２番目のバーはＺＦＮおよびドナー改変体Ａで処理した動物における活性を示し；最も右のバーはＺＦＮおよびドナー改変体Ｅで処理した動物における活性を示す。未処理ＧＬＡＫＯマウス、未処理野生型マウス、およびドナーで処理したがＺＦＮでは処理しなかったＧＬＡＫＯマウスは対照として含めた。安定な血漿活性が野生型の最大８０倍に到達した。グラフは経時的な血漿α－Ｇａｌ Ａ活性および試験終結時（５６日目）の組織活性を示す。
図２４Ａおよび２４Ｂは、示した組織におけるファブリー基質含量を示すグラフである。図２４ＡはＧｂ３含量を、図２４Ｂはリゾ－Ｇｂ３含量を、示した条件での、未処理ＧＬＡＫＯマウスからの％減少として示す。各条件下のバーは、左から右に、血漿、肝臓、心臓および腎臓におけるレベルを示す。ＺＦＮ、およびｈＧＬＡドナーのいずれかの改変体で処理したマウスでは、基質含量が著しく減少している。
図２５Ａおよび２５Ｂは、改変体Ｌおよび改変体Ｍ、ならびに野生型アルブミン遺伝子座への標的化組み込みについての概略図である。図２５Ａは改変体ＬおよびＭについて示し、改変体Ｍが、ＧＬＡシグナルペプチドではなくＩＤＳシグナルペプチドを含むという点において改変体Ｌと異なることを示す。略語は図１０に記載されている通りである。図２５Ｂは、アルブミン遺伝子座へのＧＬＡ導入遺伝子の組み込みを示す。「ＴＩ」は導入遺伝子の３’末端に付加される５’次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プライマー結合配列であり、その後に、野生型遺伝子座と同一の塩基組成を有する標的化組み込み（ＴＩ）特異的配列が続き、ｉｎｄｅｌおよびＨＤＲ媒介性の導入遺伝子組み込みを同時に測定するための次世代シーケンシングが可能となる。
図２６Ａおよび２６Ｂは、ヒト肝細胞癌（ｈｅｍａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２に対して、示した投与量の示したドナーを使用しての改変（ｉｎｄｅｌパーセントまたはＴＩパーセント）を示すグラフである。図２６Ａは改変体Ｌドナーを使用しての結果を示し、図２６Ｂは改変体Ｍドナーを使用しての結果を示す。
図２７Ａおよび２７Ｂは、肝臓で産生されたα－Ｇａｌ Ａがどのように血流に分泌されて二次的な組織に取り込まれるかを示すグラフである。ＩＤＳシグナルペプチドおよび標的化組み込み（ＴＩ）の分析のための３’配列を含有するＧＬＡドナー構築物を使用してＧＬＡＫＯマウスを処理した。図２７Ａは示した構築物で処理した動物または未処理動物由来の血漿におけるＧａｌＡ活性を示す。図２７Ｂは、示した条件下での、示した組織（肝臓、脾臓、心臓および腎臓）におけるＧａｌＡ活性を示す。最も左のバーは未処理動物における活性を示し；左から２番目のバーはドナー改変体Ｍのみで処理した動物における活性を示し；中央のバーは野生型動物における活性を示し；右から２番目のバーはＺＦＮおよび低用量のドナー改変体Ｍで処理した動物における活性を示し；最も右のバーはＺＦＮおよび高用量のドナー改変体Ｍで処理した動物における活性を示す。示したように、野生型の最大２５０倍の安定な血漿活性が観察され、心臓および腎臓ではα－Ｇａｌ Ａ活性がそれぞれ野生型の２０倍および野生型の４倍を超えた。
図２８Ａおよび２８Ｂは、ＧＬＡ構築物を含む肝臓特異的な構築物で処理した細胞におけるα－ＧＡＬ Ａ活性を示すグラフである。図２８ＡはＨｅｐＧ２細胞上清における活性を示し、図２８Ｂは、図２８Ａに示す処理したまたは未処理のＨｅｐＧ２細胞由来の上清の存在下で培養されたＫ５６２細胞ペレットにおける活性を示す。
図２９は、初期ｃＤＮＡ構築物１．２５ｅ１１～５．０ｅ１２ＶＧ／ＫＧ（実線、群平均、１群あたりｎ＝４～７）を投与され、６ヶ月間追跡されたＧＬＡＸＯマウスの血漿におけるα－ＧＡＬ Ａ活性を示すグラフである。野生型（灰色点線、矢印で示す）および未処理ＧＬＡＫＯマウス（黒色点線、矢印で示す）についても示す。
図３０は、示した投与量による処理後６ヶ月時点での、示した組織（肝臓、脾臓、心臓および腎臓）におけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示すグラフである。野生型および未処理動物についても示す。
図３１は、初期ｃＤＮＡ構築物１．２５ｅ１１～５．０ｅ１２ＶＧ／ＫＧによる、ＧＬＡＫＯマウスの示した組織（肝臓、脾臓、心臓および腎臓）におけるファブリー基質Ｇｂ３含量の用量依存性減少を、未処理ＧＬＡＫＯマウスからの％減少として示すグラフである（群平均、１群あたりｎ＝４～７）。マウスは測定されたすべての組織でＧｂ３含量の用量依存性減少を示した。
図３２Ａおよび３２Ｂは、示した処理プロトコール後の、目的の様々な組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）において残存するＧｂ３基質のパーセントを示すグラフである（図１８も参照されたい）。図３２Ａは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたＧＢ３量を示す。図３２Ｂは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたリゾ－Ｇｂ３量を示す。図３２Ａおよび３２Ｂではともに、各データセットは、左から右に、血漿、肝臓、心臓および腎臓において検出された結果を示す。
図３３Ａおよび３３Ｂは、示した処理プロトコール後の、目的の様々な組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）において残存するＧｂ３基質のパーセントを示すグラフである（図２７も参照されたい）。図３３Ａは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたＧＢ３量を示す。図３３Ｂは、未処理ＧＬＡＫＯマウスにおいて検出された量（１００％に設定）に対するパーセントとして検出されたリゾ－Ｇｂ３量を示す。図３３Ａおよび３３Ｂではともに、各データセットは、左から右に、血漿、肝臓、心臓および腎臓において検出された結果を示す。
本明細書において、ファブリー病を治療または予防するための方法および組成物が開示される。本発明は、遺伝子が肝臓で発現され、治療用（補充）タンパク質が発現されるように、ファブリー病の被験体において欠けているかまたは十分に発現されないタンパク質をコードするＧＬＡ導入遺伝子の挿入のための方法および組成物を提供する。本発明は、それが高レベルの治療薬を生成し、それらの変更された細胞の集団の患者への導入がその必要とされるタンパク質を供給するような、細胞（例えば、前駆体または成熟したＲＢＣ、ｉＰＳＣまたは肝臓細胞）の変更も記載する。導入遺伝子は、それを必要とする患者において治療的に有益である所望のタンパク質または構造的ＲＮＡをコードすることができる。
したがって、本発明の方法および組成物は、ファブリー病において欠損しているおよび／または欠けている酵素を置き換えるために、任意の遺伝子座（例えば、高度発現されるアルブミン遺伝子座）からの１つまたは複数の治療的に有益なα－ＧａｌＡタンパク質を導入遺伝子から発現させるために使用することができる。さらに、本発明は、肝臓細胞などの細胞中の高度発現遺伝子座への導入遺伝子配列の挿入による、ファブリー病の治療（１つまたは複数の症状の軽減を含む）のための方法および組成物を提供する。本発明には、それを必要とする被験体の肝臓へのウイルスベクターを経たα－ＧａｌＡコード導入遺伝子の送達のための方法および組成物が含まれ、ここで、ウイルスは末梢静脈系への注入を通して、または肝臓方向の血管（例えば、門脈）への直接的注入を通して導入することができる。方法および組成物は、セーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミン）への導入遺伝子の挿入を誘導するために使用することができるか、または肝臓細胞におけるウイルスｃＤＮＡ構築物の染色体外の維持を引き起こすために使用することができる。いずれの場合にも、導入遺伝子は高度に発現され、必要とするファブリー患者に治療的有益性を提供する。
さらに、最終的な移植で使用するために、患者由来の細胞に、例えば患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または他のタイプの幹細胞（胚性または造血性）に導入遺伝子を導入することができる。それを必要とする患者への移植のために、造血幹細胞への治療的導入遺伝子の挿入が特に有益である。幹細胞が成熟細胞に分化するにしたがって、それらは組織への送達のために高レベルの治療用タンパク質を含有する。
概要
方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ
ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的最新版；ＭＥＴＨＯＤＳ
ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒら）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋｄの低下と相関性がある。
「結合性ドメイン」は、別の分子に非共有結合することができる分子である。結合性分子は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質、例えばジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬ－エフェクタードメインタンパク質または単一ガイドＲＮＡ）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合性分子の場合、それはそれ自体に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマー等を形成する）、および／またはそれは異なるタンパク質（複数可）の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性分子は、１つより多いタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。したがって、人工ヌクレアーゼおよび転写因子のＤＮＡ結合性構成要素を含むＤＮＡ結合性分子には、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡが限定されずに含まれる。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または、結合性ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定する結合性ドメインの中のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質の中のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとしてしばしば略される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインおよび機能的ドメイン（ＺＦＮの場合はヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ－ＴＦの場合は転写調節ドメイン）を含むことができる。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、１つのＺＦＮならびに標的遺伝子を切断するために二量体化するＺＦＮの対を含む。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復配列」とも呼ばれる）は、長さが一般的に３３～３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくとも多少の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよび機能的ドメイン（ＴＡＬＥＮの場合はヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥＮ－ＴＦの場合は転写調節ドメイン）を含むことができる。用語「ＴＡＬＥＮ」は、１つのＴＡＬＥＮならびに標的遺伝子を切断するために二量体化するＴＡＬＥＮの対を含む。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合性ドメインは、例えば天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたは複数のアミノ酸を変更する）を通して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合性タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合性タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合性タンパク質は、その設計／組成が合理的な基準から主に生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な基準には、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合性データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５６８，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照；国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号および同第ＷＯ０３／０１６４９６号も参照。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験プロセスから主に生じる、天然に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号；同第ＷＯ０２／０９９０８４号を参照。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復機構を介して細胞における二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすことから、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的（ｂｒｏｋｅｎ ｔａｒｇｅｔ）とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅａｉｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的化されたヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）の所定の部位で二本鎖切断を生じ、この切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、またはあるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復用の鋳型として使用され、その結果、ドナーにおいて見られるようなヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を改変することができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える（ｒｅｐｌａｃｅ）」または「置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」という用語の使用が、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置き換え（すなわち、情報の意味において、配列の置き換え）を表し、かつあるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置き換えは必ずしも必要としないことが理解され得る。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）のために使用され得る。
細胞クロマチンにおける目的とする領域内の配列の標的組換えおよび／または置き換えおよび／または改変のための方法のある実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって改変される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組換えは、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって促進される。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的とする領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それによって、相同組換えを促進して目的とする領域内に非同一配列を挿入する。したがって、ある実施形態において、目的とする領域内の配列と相同であるドナー配列の一部は、置き換えられるゲノム配列に約８０～９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１００を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの例において、非相同配列は、概して、５０～１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列が隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
本明細書に記載の方法のいずれかは、目的とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的化組み込みによる細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系も提供される。
さらに、本明細書に記載の標的化組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および－切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と絶対的ヘテロダイマーを形成するように改変されている切断ハーフドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，８２３，６１８号を参照。
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００～５００ヌクレオチド長であってもよい。
「疾患関連遺伝子」は、一遺伝子疾患において何らかの形で欠損しているものである。一遺伝子疾患の非限定的な例には、重症複合免疫不全、嚢胞性線維症、血友病、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ハーラー病、ハンター病、ファブリー病、ニーマン－ピック病、テイ－サックス病等）、鎌状赤血球貧血およびサラセミアが含まれる。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて多様な長さの）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に広がって存在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列であるが、但し、結合に十分な条件が存在することを条件とする。
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「細胞における通常の存在」については、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能バージョン、または正常機能型内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される小分子等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体）、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入され得る。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学的種類の分子であり得るか、または異なる化学的種類の分子であり得る。第１の種類の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例として、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ここで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の個所で示される。
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制を限定されずに含めることができる。発現をモジュレートするために、ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較したときの、遺伝子発現のあらゆる低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的であっても、または完全であってもよい。
「目的とする領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列等であり、そこで外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さであるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
「真核」細胞には、幹細胞（多能性および多分化能）を含む、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、肝臓細胞、筋細胞、ＲＢＣ、Ｔ細胞等）が限定されずに含まれる。
「赤血球」（ＲＢＣ）または赤血球は、造血幹細胞に由来する最終分化細胞である。それらは、ヌクレアーゼおよびほとんどの細胞小器官を欠いている。ＲＢＣは、周辺組織に肺から酸素を運ぶためのヘモグロビンを含有する。実際、個々のＲＢＣの３３％は、ヘモグロビンである。それらは、代謝の間に細胞によって産生されるＣＯ２を組織外に運び、および呼気の間の放出のために肺に戻す。ＲＢＣは血液低酸素に応答して骨髄において産生され、それは腎臓によるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の放出によって媒介される。ＥＰＯは前赤芽球の数の増加を引き起こし、完全なＲＢＣ成熟のために必要とされる時間を短縮する。概ね１２０日後、ＲＢＣは核またはいかなる他の再生能力を含有しないので、この細胞は肝臓、脾臓およびリンパ節の中のマクロファージの食細胞活性によって（約９０％）、または血漿中の溶血によって（約１０％）循環から除去される。マクロファージ貪食の後、ＲＢＣの化学構成要素は、リソソーム酵素の作用のためにマクロファージの液胞の中で分解される。ＲＢＣは、インビトロまたはインビボにおいて、本明細書に記載される遺伝子改変幹細胞またはＲＢＣ前駆体細胞から導くことができる。
「分泌組織」は、典型的には上皮に由来するいくつかのタイプのルーメンに個別の細胞から産物を分泌する、動物内の組織である。胃腸管に局在している分泌組織の例としては、腸、膵臓および胆嚢を覆っている細胞が挙げられる。他の分泌組織としては、肝臓、眼に関連する組織ならびに粘膜、例えば、唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体および内分泌系の他のメンバーが挙げられる。さらに、分泌組織としては、分泌可能な組織タイプの個々の細胞が挙げられる。
「作用的連結」および「作用的に連結した」（または「作動可能に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並列に関して交換可能に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼす機能を媒介し得ることを可能にするように配置される。例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作用的に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスに作用的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作用的に連結される転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作用的に連結した」は、構成要素の各々が、そのように連結していない場合にそれが実行するだろうものと同じ機能を、他の構成要素と連結して実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合性ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、一方で活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよび活性化ドメインは、作用的連結にある。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドのときは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができるならば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインおよび切断ドメインは、作用的連結にある。
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同一の数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指示することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、日常的なアッセイにおいて必ずしも測定されないが、好ましくは容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグは、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。「発現タグ」は、目的とする遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
「被験体」および「患者」という用語は交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに、実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。したがって、本明細書で使用する場合の用語「被験体」または「患者」とは、本発明の改変された細胞および／または本発明の改変された細胞によって産生されるタンパク質が投与され得る、任意の哺乳動物の患者または被験体を意味する。本発明の被験体としては、ＬＳＤの被験体が挙げられる。
ヌクレアーゼ
導入遺伝子が標的化された形式でゲノムに組み込まれるように、細胞のゲノムの切断のための導入遺伝子およびヌクレアーゼを有するドナー分子のインビボ切断のために有益である、少なくとも１つのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングエンドヌクレアーゼならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡを含む系を限定されずに含む、任意のヌクレアーゼを本発明の実施において使用することができる。したがって、本明細書において、選択された遺伝子を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼを含む組成物が記載され、その切断は、遺伝子のゲノム改変をもたらす（例えば、切断される遺伝子に対する挿入および／または欠失）。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの１つまたは複数は、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼの１つまたは複数は天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合性分子（ＤＮＡ結合性ドメインとも呼ばれる）および／または切断ドメインにおいて操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、選択された標的部位に結合するように操作されるＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのｓｇＲＮＡ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合性ドメインおよび切断ドメインを含む（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬ－エフェクタードメインＤＮＡ結合性タンパク質；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメイン）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏ系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどの系を含む。
Ａ．ＤＮＡ結合性ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム中の目的領域への結合のために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合性ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは１５～４０塩基対の切断部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに一般的に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５巻：３３７９～３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ、８２巻：１１５～１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２巻、１１２５～１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：２２４～２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２６３巻：１６３～１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２８０巻：３４５～３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ、１０巻：８９５～９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：２９５２～２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ、４４１巻：６５６～６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７巻：４９～６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合性ドメインは、ヌクレアーゼ全体との関連で変更することができ（すなわち、ヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合することができる。
他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物で使用されるヌクレアーゼの１つまたは複数のＤＮＡ結合性ドメインは、天然に存在するかまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合性ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。植物転写活性化因子を模倣して植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、これらの注入されるタンパク質の１つである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻：６４８～６５１頁を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も良く特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．ＶｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ
Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ、２１８巻：１２７～１３６頁および国際公開ＷＯ第２０１００７９４３０号を参照）。ＴＡＬエフェクターはタンデムリピートの集中化ドメインを含有し、各反復配列は概ね３４アミノ酸を含有し、それらはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵である。さらに、それらは核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（レビューについては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓら（２００６年）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１６３巻（３号）：２５６～２７２頁を参照）。さらに、植物病原細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および次亜種４菌株ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同である、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と呼ばれる２つの遺伝子が見出された（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ、７３巻（１３号）：４３７９～４３８４頁を参照）。これらの遺伝子はヌクレオチド配列がお互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復配列ドメインの中の１，５７５ｂｐが欠失している点で異なる。しかし、両遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照。
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。反復配列は概ね１０２ｂｐを含み、反復配列はお互いと一般的に９１～１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。反復配列の多型は、通常１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（ＲＶＤ）の同一性とＴＡＬエフェクターの標的配列の中の連続したヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応があるようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０１頁およびＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６巻：１５０９～１５１２頁を参照）。実験的に、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合につながり、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬ－エフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードが決定されている。新しい配列と相互作用して、植物細胞中の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製するために、これらのＤＮＡ結合性反復配列は、新しい組み合わせおよび数の反復配列を有するタンパク質に組み立てられた（Ｂｏｃｈら、同書）。酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）で活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を与えるために、操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結した。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照。
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのインビボ切断および／または標的化切断のために使用されるヌクレアーゼの１つまたは複数のＤＮＡ結合性ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、それが選択された標的部位に結合するように操作されている点で、天然に存在しない。例えば、すべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５～１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３～３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６～６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２～６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１～４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照。
操作されたジンクフィンガー結合性ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、合理的な設計および各種の選択が限定されずに含まれる。合理的な設計には、例えば、三つ組（ｔｒｉｐｌｅｔ）（または、四つ組（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、共同所有される米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法が、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ００／２７８７８号；および同第ＷＯ０１／８８１９７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合性ドメインへの結合特異性の増強が、例えば、共同所有される国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。例示的なリンカー配列については、米国特許第８，７７２，４５３号；同第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。
標的部位の選択；ＺＦＰおよび融合タンパク質（および、それをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号；同第ＷＯ０２／０９９０８４号；同第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号および同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳述されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照する。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、例えば単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照。系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３巻：１５６５～１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０巻：４８２～４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ、１巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、１巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。先ず、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレｃｒＲＮＡの反復配列領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟したｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟したｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要件である、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡの上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対合を通して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。最後に、プロトスペーサーの中で二本鎖切断を生成するために、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップを含む：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイへの外来（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）外来核酸に対するＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入などの機能における役割を果たす。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってよい。天然配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列のポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、天然配列の断片、天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が限定されずに含まれるが、但し、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有することを条件とする。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体、共有結合性改変およびその融合を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適する誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合、共有結合性改変が限定されずに含まれる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から入手できるか、または化学的に合成することができるか、またはこれらの２つの手順の組み合わせによって入手できる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、または、Ｃａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝子操作されているか、もしくは、内因性Ｃａｓと同じであるか異なるＣａｓをコードする、外因的に導入される核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってよい。一部の場合には、細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。Ｃａｓタンパク質に加えておよび／またはその代わりに使用することができるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのさらなる非限定的な例には、Ｃｐｆ１などのクラス２ＣＲＩＳＰＲタンパク質が含まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５年）Ｃｅｌｌ、１６３巻：１～１３頁を参照。
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐにおいて同定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞における頑強なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの側面で異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄら、（２０１５年）Ｇｅｎｏｍ
Ｂｉｏ、１６巻：２５１頁を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との間の主な差は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがってｃｒＲＮＡだけを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは長さが４２～４４ヌクレオチド（１９ヌクレオチド反復配列および２３～２５ヌクレオチドスペーサー）であり、単一のステム－ループを含有し、それは二次構造を保持する配列変化を許容する。さらに、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりかなり短く、ＦｎＣｐｆｌのＰＡＭ要件は置換された鎖の上の５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を形成するが、Ｃａｓ９はガイドＲＮＡのシード配列の中で平滑末端切断を形成するためにそのＲｕｖＣ－およびＨＮＨ様ドメインを使用し、一方Ｃｐｆ１は、シードの外で互い違いの切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）を形成するためにＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１は重要なシード領域から離れて互い違いの切断を形成するので、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがって、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで、Ｃｐｆ１が同じ部位を切断し続けることができることを確実にする。したがって、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むものと理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指す。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書、を参照）。真核生物では、遺伝子サイレンシングはアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏはスモール（１９～３１ｎｔ）ＲＮＡに結合される。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、スモールＲＮＡと標的との間のワトソン－クリック型塩基対合を通して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをヌクレオチド鎖分解的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：９７２～９７３頁）。対照的に、原核生物のＡｇｏタンパク質は小さい一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来の（しばしばウイルスの）ＤＮＡを検出し、除去する機能をおそらく果たす（Ｙｕａｎら、（２００５年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ、１９巻、４０５頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら、（２０１３年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ、５１巻、５９４頁；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質には、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものが含まれる。
最も良く特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体がＤＮＡの第三者分子中のワトソン－クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように誘導する役目をする。これらのガイドＤＮＡ中の配列情報が標的ＤＮＡの同定を可能にしたならば、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを切断する。そのような機構は、その標的ＤＮＡに結合する間のＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても裏付けられる（Ｇ． Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからのＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質に負荷することができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって誘導されるので、外因性のインベスティゲーター（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ）によって指定されたガイドＤＮＡで形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を相補的なインベスティゲーターによって指定された標的ＤＮＡに誘導する。この方法で、ＤＮＡにおいて標的化二本鎖切断を生成することができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系（または、他の生物体からのオルソログのＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞の中でゲノムＤＮＡの標的化切断を可能にする。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であってよい。哺乳動物のゲノムＤＮＡの切断のために、哺乳動物細胞での発現のために最適化されるバージョンのＴｔＡｇｏコドンを使用するのが好ましいであろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞貫通性ペプチドに融合される、インビトロで形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましい可能性がある。さらに、摂氏３７度で改善された活性を有するように変異誘発を通して変更された、ＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい可能性がある。ＴｔＡｇｏ－ＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断の活用のための当技術分野で標準の技術を使用した、遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子補正、標的化遺伝子欠失を含む結果の一式を実行するために使用される可能性がある。
したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが所望される任意の遺伝子の中の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合性ドメインを含む。
Ｂ．切断ドメイン
任意の適する切断ドメインは、ＤＮＡ結合性ドメインに作用的に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメインはヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮ－その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合性ドメインを通してその意図した核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性によりＺＦＰ結合部位の近くでＤＮＡを切断させることができる機能的実体－を形成した。例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３巻（３号）：１１５６～１１６０頁を参照。用語「ＺＦＮ」は、標的遺伝子を切断するために二量体化するＺＦＮの対を含む。より近年、ＺＦＮは様々な生物体におけるゲノム改変のために使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインは、ＴＡＬＥＮを形成するために、ヌクレアーゼドメインに融合された。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照。ＤＮＡに結合し、切断ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）に会合して標的化切断を誘導する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系も、記載されている。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，９３２，８１４号および米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号を参照。
上記したように、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン；ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合性ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）；および／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合性ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインなど、切断ドメインはＤＮＡ結合性ドメインにとって異種であってよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを導くことができる例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが限定されずに含まれる。例えば、２００２～２００３年のカタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９～３３８８頁を参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓のＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、も参照）。これらの酵素の１つまたは複数（または、その機能的断片）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、互いに空間的定位でこれらの切断ハーフドメインを配置して、例えば二量体化によって切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５～８個のヌクレオチドまたは１５～１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２～５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間に存在する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上でその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４、ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。
その切断ドメインは結合性ドメインと分離できる例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：１０，５７０～１０，５７５頁。したがって、本開示のために、開示される融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した、細胞配列の標的化二本鎖切断および／または標的化交換のために、各々ＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合性ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更のためのパラメータは、この開示の他の場所で提供される。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってよい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号に記載される。さらなる制限酵素も分離可能な結合性および切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１巻：４１８～４２０頁を参照。
ある特定の実施形態では、例えば、そのすべての開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７７２，４５３号；同第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載される通り、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小にするかまたは阻止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、すべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響するための標的である。
絶対的ヘテロダイマーを形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基の変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９の変異を含む対を含む。
したがって、一実施形態では、４９０での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６での変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位での変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」（「ＫＫ」）と呼ばれる操作された切断ハーフドメインを生成することによって、ならびに、別の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」（「ＥＬ」）と呼ばれる操作された切断ハーフドメインを生成することによって調製された。本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小にされるかまたは消滅させられる絶対的ヘテロダイマー変異体である。その開示は参照により全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位（野生型ＦｏｋＩと比較して番号付けされる）における変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、を含む（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比較して番号付けされる）における変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異を含む（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩと比較して番号付けされる）における変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異を含む（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号を参照。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Ｇｕｏら、（２０１０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４００巻（１号）：９６～１０７頁を参照）。
本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号に記載される通り、任意の適する方法を使用して、例えば野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって調製することができる。
標的外部位（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）として公知である他の意図しない切断部位と比較して、その意図した標的へのヌクレアーゼ対の特異性を増加させるための方法および組成物も使用される（米国特許出願公開第２０１７－０２１８３４９－Ａ１号を参照）。したがって、本明細書に記載されるヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ結合性ドメイン主鎖領域の１つまたは複数における変異および／またはそれらのヌクレアーゼ切断ドメインにおける１つまたは複数の変異を含むことができる。これらのヌクレアーゼは、ＤＮＡ主鎖の上のホスフェートと非特異的に相互作用することができる、ＺＦＰ ＤＮＡ結合性ドメイン（「ＺＦＰ主鎖」）の中のアミノ酸への変異を含むことができるが、それらはＤＮＡ認識ヘリックスにおける変化を含まない。したがって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性のために必要とされない、ＺＦＰ主鎖におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性のアミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ主鎖におけるこれらの変異は、極性のアミノ酸残基を中性または無極性のアミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合性ヘリックスに対して（－５）位、（－９）位および／または（－１４）位で形成される。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）において１つまたは複数の変異を含むことができる。さらなる実施形態では、多フィンガージンクフィンガータンパク質の１つまたは複数のジンクフィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）において変異を含むことができる。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に変異される。
ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに由来し、野生型完全長ＦｏｋＩと比較して番号付けされるアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５の１つまたは複数において変異を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５における変異は、上記の通りＦｏｋＩの「ＥＬＤ」、「ＥＬＥ」、「ＫＫＫ」、「ＫＫＲ」、「ＫＫ」、「ＥＬ」、「ＫＩＫ」、「ＫＩＲ」および／またはＳｈａｒｋｅｙに導入される。
さらに、本明細書において、ヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインパートナーの独立した滴定を通して切断活性の特異性を増加させる方法が記載される。一部の実施形態では、２つのパートナー（ハーフ切断ドメイン）の比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０または１：２０の比、またはその間の任意の値で与えられる。他の実施形態では、２つのパートナーの比は、１：３０を超える。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１と異なるように選択される比で配置される。個々に、または組み合わせで使用されるとき、本発明の方法および組成物は、標的外切断活性の低減を通して標的化特異性の驚くべき予想外の増加を提供する。これらの実施形態で使用されるヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＺＦＮの対、ＴＡＬＥＮ、ＴＡＬＥＮの対、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓおよびＴｔＡｇｏ、またはその任意の組み合わせを含むことができる。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物のいずれかで発現され得るか、または個々の構成要素が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結され得る。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ヌクレアーゼは、使用前に、例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載される酵母をベースとした染色体系において、活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化され（脱抑制され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあることができる。
Ｃａｓ９に関連したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成要素を含む：同一の直列反復配列（ＤＲ）が間に入るヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ。ゲノム操作を達成するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら、（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ、１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ１２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を通して、または別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、ここでは、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合して、キメラｃｒ－ＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ばれる）を形成する。（Ｊｉｎｅｋ、同書およびＣｏｎｇ、同書を参照）。
標的部位
上で詳細に記載されるように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えば、アルブミンまたはセーフハーバー遺伝子における任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重鎖（または四重鎖）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実行され得る。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含むＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示の選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。
標的部位の選択；融合タンパク質（および、それをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は当業者に公知であり、参照により全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８９１号に詳述されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
ドナー
上記のように、例えば、変異遺伝子の補正のための、またはファブリー病において欠いているかまたは欠損しているタンパク質（例えば、α－ＧａｌＡ）をコードする遺伝子の発現増加のための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入が提供される。ドナー配列はそれが置かれるゲノム配列と一般的に同一でないことは、容易に明らかになる。ドナー配列は、目的の位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同領域（「相同アーム」）が隣接した非相同配列を含有することができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチンにおいて目的領域に相同性でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同性のいくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、通常は目的領域に存在しない配列の標的化挿入のために、前記配列はドナーの核酸分子に存在することができ、目的領域の配列に相同性の領域が隣接することができる。
本明細書において、選択された位置への挿入のためにα－ＧａｌＡタンパク質をコードする導入遺伝子の標的化挿入の方法が記載される。ＧＬＡ導入遺伝子は完全長α－ＧａｌＡタンパク質をコードすることができるか、トランケーションされたα－ＧａｌＡタンパク質をコードすることができる。挿入のためのポリヌクレオチドは、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子、または「導入遺伝子」と呼ぶこともできる。非限定的な例示的なＧＬＡドナーは、図１Ｂ、図１Ｃ、図１０、図１３および図２５に示す。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖および／または二本鎖であってよく、線状または環状の形で細胞に導入することができる。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および同第９，２５５，２５９号を参照。ドナー配列（複数可）はＤＮＡ ＭＣの中に含有されてもよく、それは環状または線状の形で細胞に導入することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１４０３３５０６３号を参照。線状形で導入される場合は、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ的分解から）保護することができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に加えられ、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが片方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８４巻：４９５９～４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６～８８９頁を参照。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法には、末端アミノ基（複数可）の付加および改変されたヌクレオチド間連結、例えばホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が限定されずに含まれる。
さらなる配列、例えば複製起源、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子を有するウイルスまたは非ウイルスベクター分子の一部として、ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入することができるか、または、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達することができる。
一般的に、ドナーは、その発現が組み込み部位で内因性プロモーターによって、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子（例えば、高度発現されるアルブミン、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ等）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかし、ドナーはプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることが明らかになる。一部の実施形態では、遺伝子が染色体外で発現されるように、ドナーは細胞において発現プラスミドの中で維持される。
内因性遺伝子のすべてか一部が発現されるかまたはそのいずれも発現されないように、ドナー分子を内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、内因性アルブミン配列の一部（リソソーム酵素をコードする導入遺伝子のＮ末端および／またはＣ末端側）が、例えばα－ＧａｌＡタンパク質（複数可）をコードする導入遺伝子との融合物として発現されるか、またはいずれも発現されないように、本明細書に記載される導入遺伝子をアルブミンまたは他の遺伝子座に挿入することができる。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、アルブミンなどのためのさらなるコード配列の有る無しで）は、任意の内因性遺伝子座、例えばセーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。
内因性配列（内因性、または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子と共に発現される場合、内因性配列（例えば、アルブミン等）は完全長の配列（野生型または変異体）または部分配列であり得る。好ましくは、内因性配列は機能性である。これらの完全長配列または部分配列（例えば、アルブミン）の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清半減期の延長および／またはキャリアとしての作用が挙げられる。
さらに、発現に必要ではないが、外因性配列は転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を挙げることもできる。
導入遺伝子に連結される外因性配列は、コードされるタンパク質のプロセシングおよび／または分泌を支援するシグナルペプチドを含むこともできる。これらのシグナルペプチドの非限定的な例には、アルブミン、ＩＤＳおよび第ＩＸ因子に由来するものが含まれる（例えば、図１３を参照）。
ある特定の実施形態では、外因性配列（ドナー）は、目的のタンパク質と、その融合パートナーとして膜タンパク質の細胞外ドメインとの融合物を含み、融合タンパク質を細胞の表面に位置させる。これは、導入遺伝子によってコードされるタンパク質が血清中で潜在的に作用することを可能にする。ファブリー病の場合、導入遺伝子融合物によってコードされるα－ＧａｌＡ酵素は、細胞（例えば、ＲＢＣ）の表面のその位置から血清中に蓄積する代謝産物に作用する。さらに、正常な分解過程である通りＲＢＣが脾臓のマクロファージによって貪食される場合、マクロファージが細胞を貪食するときに形成されるリソソームは、その酵素にとって本来より好ましいｐＨで、膜結合融合タンパク質をリソソーム中の高濃度の代謝産物に曝露させるだろう。潜在的な融合パートナーの非限定的な例は、下の表１に示す。
一部の場合には、ドナーは、改変された内因性遺伝子（ＧＬＡ）であってよい。例えば、内因性遺伝子の上でコドン最適化を実行して、ドナーを生成することができる。さらに、酵素補充療法への抗体応答は、問題の具体的治療用酵素および個々の患者に関して異なるが、野生型α－ＧａｌＡによる酵素補充で治療される多くのファブリー病患者においてかなりの免疫応答が見られている。導入遺伝子は、導入遺伝子のない被験体と比較してタンパク質の量（および／またはその活性）を増加させる場合、治療用タンパク質を提供すると考えられる。さらに、治療の有効性に対するこれらの抗体の関連性も変動し得る（Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｐｏｎｄｅｒ、（２００８年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１８巻（８号）：２６８６頁）。したがって、本発明の方法および組成物は、内因性免疫応答のための初回刺激エピトープであることが公知である部位で機能的にサイレントなアミノ酸変化を生成する改変、および／またはそのようなドナーによって生成されるポリペプチドがより免疫原性でないようなトランケーションを限定されずに含む、野生型ＧＬＡと比較して改変された配列を有するドナーの生成を含むことができる。
ファブリー病患者は、脳内の欠落しているα－ＧａｌＡ酵素の欠乏による神経学的後遺症をしばしば有する。残念なことに、血液脳関門の不透過性のために、血液を通して脳に治療薬を送達することはしばしば困難である。したがって、本発明の方法および組成物は、脳毛細管の細胞の間の密着帯の一時的な開口、例えば、高張性マンニトール溶液の頚動脈内投与の使用、集中的超音波の使用およびブラジキニン類似体の投与を通しての一時的な浸透圧性破壊を引き起こす方法を限定されずに含む、脳への治療薬の送達を増加させる方法と併用することができる（Ｍａｔｓｕｋａｄｏら（１９９６年）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、３９巻：１２５頁）。あるいは、治療薬は、脳内への特異的輸送のための受容体または輸送機構を利用するように設計することができる。使用することができる特異的受容体の例には、トランスフェリン受容体、インスリン受容体または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１および２（ＬＲＰ－１およびＬＲＰ－２）が含まれる。ＬＲＰは、ａｐｏＥ、ｔＰＡ、ＰＡＩ－１等などの様々な分泌タンパク質と相互作用することが公知であり、そのため、ＬＲＰのためにこれらのタンパク質の１つに由来する認識配列を融合させることは、治療用タンパク質の肝臓における発現および血流中への分泌の後に脳への酵素の輸送を促進することができる（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ、（２０１０年）、同書を参照）。
細胞
本明細書において、遺伝子改変細胞、例えば、本明細書に記載される方法によって産生される細胞を含む、α－ＧａｌＡタンパク質をコードする導入遺伝子を含む肝臓細胞または幹細胞も提供される。ＧＬＡ導入遺伝子は、完全長であるか改変されてもよく、染色体外に発現させることができ、または１つまたは複数のヌクレアーゼを使用して細胞のゲノムの中に標的化された形式で組み込むことができる。ランダム組み込みと異なって、ヌクレアーゼ媒介標的化組み込みは、導入遺伝子が指定された遺伝子に組み込まれることを確実にする。導入遺伝子は、標的遺伝子の中の任意の場所に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子はヌクレアーゼ結合性および／または切断部位にまたはその近くに、例えば、切断部位および／または結合部位から１～３００塩基対（または、その間の任意の数の塩基対）上流または下流の範囲内に、より好ましくは切断および／または結合部位のいずれの側から１～１００塩基対（または、その間の任意の数の塩基対）の範囲内に、さらにより好ましくは切断および／または結合部位のいずれの側から１～５０塩基対（または、その間の任意の数の塩基対）の範囲内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。
導入遺伝子を含むように、細胞または細胞系を非限定的に含む任意の細胞型を本明細書に記載される通りに遺伝子改変することができる。本明細書に記載される遺伝子改変細胞の他の非限定的な例には、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋等）；樹状細胞；Ｂ細胞；自己の（例えば、患者由来の）筋細胞、脳細胞などが含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は肝臓細胞であり、インビボで改変される。ある特定の実施形態では、細胞は、異種の多能性、全能性または多分化能の幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞など）を含む幹細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるような細胞は、患者に由来する幹細胞である。
本明細書に記載されるような細胞は、障害を有する被験体におけるファブリー病を、例えばインビボ療法によって治療および／または予防するのに有益である。例えば、標準の技術を使用してヌクレアーゼ改変細胞を増殖し、次に患者に再導入することができる、エクスビボ療法も提供される。例えば、Ｔｅｂａｓら（２０１４年）Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３７０巻（１０号）：９０１頁を参照。幹細胞の場合、被験体への注入の後、機能性タンパク質を（挿入されたドナーから）発現する細胞へのこれらの前駆体のインビボ分化も起こる。
本明細書に記載される細胞を含む医薬組成物も、提供される。さらに、患者への投与の前に、細胞を低温保存することができる。
送達
本明細書に記載されるヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドおよび／または組成物（例えば、細胞、タンパク質、ポリヌクレオチド等）は、任意の適する手段によってインビボまたはエクスビボで送達することができる。
本明細書に記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、そのすべての開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載される。
本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣａｓタンパク質（複数可）の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等を限定されずに含む、任意のベクター系を使用することができる。参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照。さらに、これらのベクターのいずれも、治療のために必要とされる配列の１つまたは複数を含むことができることが明らかになる。したがって、１つまたは複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞に導入するとき、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは同じベクターで、または異なるベクターで運ぶことができる。複数のベクターを使用するとき、各ベクターは１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含むことができる。
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルとの複合型の核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子療法手順の概説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａら，ｉｎ
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（編）（１９９５）、およびＹｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。
さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。
免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
本明細書に記載される組成物（ｃＤＮＡおよび／またはヌクレアーゼ）は、ナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して送達することもできる。例えば、Ｌｅｅら（２０１６年）Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６巻（５号）：１１１８～１１３４頁；米国特許出願公開第２０１７０１１９９０４号；および米国特許仮出願第６２／５５９，１８６号を参照。
さらなる送達方法は、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。一旦細胞内に運び込まれると、その内容物は放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照のこと）。
操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡウイルスベースのまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を処置するために使用され得、修飾細胞が被験体に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
レトロウイルスの向性を、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復配列からなる。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これはその後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために用いられる。一般に用いられているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）を参照のこと）。
一過性の発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、細胞を標的核酸で形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、かつインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に現在利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完に関与するアプローチを利用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎら，Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈら，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３－１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ－Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０－２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２（１９９７）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５（１９９６））。他のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにシュードタイプＡＡＶ（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６）の例が挙げられるが、これらに限定されない）も本発明に従って使用することができる。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３－１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９（１９９８）が挙げられる。
宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子療法に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（適切な場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞系内にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性の高い熱処理によって減少させることができる。
多くの遺伝子療法の用途において、特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子療法ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的とする細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７－９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつ、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルスと標的細胞とのペアにまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理が非ウイルスベクターにも適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの造血幹細胞等にエクスビボで送達することもでき、その後、該細胞が、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者に再移植される。
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡは投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むが、これらに限定されない、通常、血液または組織細胞との最終的な接触へと分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能であって、かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられてもよいが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に好適なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３－８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３－９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７－２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
薬学的に許容されるキャリアは、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によっても部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、多種多様な薬学的組成物の好適な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７版，１９８９を参照のこと）。
ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物が同一または異なる系を用いて送達され得ることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって運ばれてもよく、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって運ばれてもよい。さらに、同一または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。ベクターは、同時にまたは任意の逐次的順序で送達されてもよい。
エクスビボ投与用の製剤およびインビボ投与用の製剤は両方ともに、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、かつ有効成分と相溶性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の少量の補助物質を含有してもよい。
適用
本発明の方法は、ファブリー病（例えばリソソーム蓄積症）の治療および／または予防を企図する。治療は、必要とされる酵素の発現および血流への放出のための、細胞中のセーフハーバー遺伝子座（例えばアルブミン）における修正疾患関連ＧＬＡ導入遺伝子の挿入を含むことができる。修正α－ＧａｌＡをコードする導入遺伝子は、野生型または改変されたタンパク質をコードすることができ；および／または、コドン最適化ＧＬＡ導入遺伝子；および／またはタンパク質を機能的に変更することなくエピトープを除去することができる導入遺伝子を含むことができる。一部の場合、本方法は、必要とされる酵素の発現および血流への放出のために、細胞へのα－ＧａｌＡをコードする導入遺伝子を発現するエピソームの挿入を含む。血流への産物の放出のための肝臓細胞などの分泌細胞への挿入は、特に有益である。本発明の方法および組成物は、それらの細胞に由来する（それから発生した）成熟した細胞（例えば、ＲＢＣ）が治療的なα－ＧａｌＡタンパク質を含有するように、造血幹細胞に１つまたは複数の治療薬をコードするＧＬＡ導入遺伝子を供給することが所望される任意の状況において使用することもできる。これらの幹細胞はインビトロまたはインビボで分化させることができ、すべての患者のために使用することができる汎用性のドナー細胞型に由来することができる。さらに、細胞は、体内に細胞を運ぶために膜貫通タンパク質を含有することができる。治療は治療用導入遺伝子を含有する患者細胞の使用を含むこともでき、ここで、細胞はエクスビボで成長させられ、その後患者に導入して戻される。例えば、適するα－ＧａｌＡコード導入遺伝子を含有するＨＳＣは、骨髄移植を通して患者に挿入することができる。あるいは、α－ＧａｌＡコード導入遺伝子を使用して編集された筋肉幹細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞を、筋肉組織に注入することもできる。
したがって、この技術は、問題（例えば、発現レベルの問題または十分ではない機能性（ｓｕｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）もしくは非機能性として発現されるタンパク質の問題）のために、患者が一部のタンパク質を欠損している状態において有益である可能性がある。ファブリー病の被験体において機能を補正または回復するための導入遺伝子の発現が、本発明で特に有益である。
非限定的な例として、欠損または欠落しているα－ＧａｌＡタンパク質を補充するための、機能的α－ＧａｌＡタンパク質の産生の異なる方法が達成され、ファブリー病を治療するために使用される。タンパク質をコードする核酸ドナーをセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミンまたはＨＰＲＴ）に挿入することができ、および外因性プロモーターを使用して、またはセーフハーバーに存在するプロモーターを使用して発現させることができる。肝臓細胞のアルブミン遺伝子座へのＧＬＡ導入遺伝子の挿入が特に有益であり、ここで、ＧＬＡ導入遺伝子は肝臓細胞から血流への発現されるα－ＧａｌＡタンパク質の分泌を媒介するシグナルペプチドをコードする配列をさらに含む。あるいは、インサイチュで欠損している遺伝子を補正するために、ドナーを使用することができる。所望のα－ＧａｌＡコード導入遺伝子をＣＤ３４＋幹細胞に挿入し、骨髄移植の間に患者に戻すことができる。最後に、この細胞に由来する成熟した赤血球が核酸ドナーによってコードされる高濃度の生物製剤を有するように、ベータグロビン遺伝子座で、核酸ドナーをＣＤ３４＋幹細胞に挿入することができる。生物製剤含有ＲＢＣは、膜貫通タンパク質（例えば、受容体または抗体）を通して、次に正しい組織を標的にさせることができる。さらに、エネルギー源への曝露の後にそれらを破壊に対してより感受性にするために、電気感作（ｅｌｅｃｔｒｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を通してエクスビボでＲＢＣを感作させることができる（国際公開ＷＯ第２００２００７７５２号を参照）。
一部の適用では、内因性遺伝子は、本発明の方法および組成物の使用によってノックアウトすることができる。この態様の例には、異常な遺伝子調節因子または異常な疾患関連遺伝子をノックアウトすることが含まれる。一部の適用では、異常な内因性遺伝子は、その遺伝子の野生型バージョンによって機能的に、またはインサイチュで置き換えることができる。挿入される遺伝子は、治療用α－ＧａｌＡタンパク質の発現を向上させるために、またはその免疫原性を低減するために変更することもできる。一部の適用では、挿入されるα－ＧａｌＡコード導入遺伝子は、脳などの選択された組織へのその輸送を増加させる融合タンパク質である。
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（またはＺＦＮの対）またはＴＡＬＥＮ（またはＴＡＬＥＮの対）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは例示だけが目的であること、ならびに他のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）と操作されたＤＮＡ結合性ドメイン、および／または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合性ドメインと非相同切断ドメインの融合物および／または操作された単一ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができることが理解される。同様に、適するＧＬＡドナーは下に例示されるものに限定されずに、任意のＧＬＡ導入遺伝子を含むことが理解される。
（実施例１：α－ＧａｌＡをコードする導入遺伝子の設計および構築）
ＧＬＡ導入遺伝子の発現のため、２つの手法を採用した。１つの手法はＩｎ Ｖｉｖｏ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（登録商標）（「ＩＶＰＲＰ」）と呼ばれ、発現がアルブミンプロモーターによって駆動されるように、導入遺伝子をアルブミン遺伝子座に挿入するように操作されたヌクレアーゼを利用する（米国特許第９，３９４，５４５号および第９，１５０，８４７号を参照されたい）。第２の手法は、導入遺伝子のｃＤＮＡコピーを含むＡＡＶによる細胞の形質導入を伴い、ここで、ｃＤＮＡはプロモーターおよびその他の調節配列をさらに含む。これら２つの手法のためのＧＬＡ導入遺伝子発現カセットの設計を図１に示す。
（実施例２：方法）
ＨｅｐＧ２／Ｃ３ａおよびＫ５６２細胞の形質導入
ｃＤＮＡおよびＩＶＰＲＰ（登録商標）系の両方で、標準的な技術を使用してＨｅｐＧ２細胞を形質導入した。
Ａ．ｃＤＮＡ
ｃＤＮＡ手法は、ｈＡＡＴプロモーター（Ｏｋｕｙａｍａら（１９９６年）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７巻（５号）：６３７～４５頁）、ＨＢＢ－ＩＧＧイントロン（ヒトベータ－グロビン遺伝子の第１のイントロン由来の５’－ドナー部位、および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分岐部および３’－受容部位から構成されるキメライントロン）、シグナルペプチド、コード配列（コード配列は任意選択でコドン最適化されている）およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナル配列に連結したＡＰＯＥエンハンサーを含む、ＡＡＶにより送達される発現構築物の使用を含み得る。
ｃＤＮＡ系では、本明細書に記載されるＡＡＶ ＧＬＡ ｃＤＮＡベクターでＨｅｐＧ２細胞を形質導入し、上清を収集してα－Ｇａｌ Ａ活性について試験した。さらに、細胞表面のＭ６Ｐ受容体を飽和させてα－Ｇａｌ Ａの取り込みを遮断する過剰量のマンノース－６リン酸（Ｍ６Ｐ、５ｍＭ）の非存在下および存在下で、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞から収集された上清中でＫ５６２細胞を培養した。細胞ペレットを収集し、α－Ｇａｌ Ａ活性について試験した。
Ｂ．ＩＶＰＲＰ（登録商標）
ファブリーＩＶＰＲＰ（登録商標）には３つの成分がある：ヒトアルブミンイントロン１の特定の遺伝子座を切断するように設計されたＺＦＮ ＳＢＳ４７１７１およびＳＢＳ４７８９８をコードする２つのｒＡＡＶ２／６ベクター、ならびにｈＧＬＡドナー鋳型をコードする１つのｒＡＡＶ２／６ベクター。ドナーｈＧＬＡ鋳型は、ヒトアルブミンへのドナーの相同性誘導修復（ＨＤＲ）組み込みを促進するための相同アームに隣接した、ｈＧＬＡ ｃＤＮＡのコドン最適化バージョンである。
ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞（「ＨｅｐＧ２」細胞とも呼ばれる）（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１０７４１）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１×ペニシリンストレプトマイシングルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する、Ｅａｒｌｅ塩およびＬグルタミン含有最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で維持し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞は３～４日ごとに継代した。
ＩＶＰＲＰ（登録商標）形質導入では、細胞をすすぎ、０．２５％トリプシン／２．２１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でトリプシン処理し、増殖培地で再懸濁した。少量のアリコートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）中トリパンブルー溶液０．４％（ｗ／ｖ）と１：１で混合し、ＴＣ２０ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）で計数した。細胞を増殖培地で１ｍＬあたり密度２ｅ５で再懸濁し、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１ウェルあたり培地０．５ｍＬ中１ｅ５で播種した。組換えＡＡＶ２／６粒子を、適切な感染多重度（ＭＯＩ）で増殖培地と混合し、細胞に添加した。
ＨｅｐＧ２細胞を、ｈＧＬＡドナーのみ（２連；対照）、または２つのｈＡＬＢ ＺＦＮ ＳＢ４７１７１およびＳＢ４７９３１プラスＳＢ ＩＤＳドナー（３連）のいずれかで形質導入した。ドナーのみでの形質導入におけるＭＯＩは６ｅ５ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞であった。ＺＦＮ＋ドナー形質導入におけるＭＯＩは、各ＺＦＮについては３ｅ５ｖｇ／細胞、ｈＧＬＡドナーについては６ｅ５ｖｇ／細胞であった。これはＺＦＮ１：ＺＦＮ２：ドナー比１：１：２となり、インビトロ実験に最適な比であることがこれまでに決定されている。インビトロでの形質導入効率を最大にするため、ｈＧＬＡドナーはＺＦＮベクターの２４時間後に添加した。
形質導入後、細胞を６～１０日間培養物中に静置した。上清を３、５、７および１０日目に収集し（適切な場合）、新しい培地で置き換えた。最終の上清収集ステップの後、細胞を上述のようにトリプシン処理および再懸濁し、次いで遠心分離して細胞ペレットを作製し、ＰＢＳで洗浄し、－８０℃で保存した。
同様の方法を使用して、ＨｅｐＧ２細胞をＧＬＡ ｃＤＮＡ構築物で形質導入した。ＧＬＡ ｃＤＮＡ構築物におけるＭＯＩは、３ｅ４、１ｅ５、３ｅ５または１ｅ６ｖｇ／細胞のいずれかであった。
α－ＧａｌＡ活性アッセイ
合成基質４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵ－α－Ｇａｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、蛍光定量アッセイでα－ＧａｌＡ活性を評価した。
簡単に説明すると、ＨｅｐＧ２細胞培養物上清１０マイクロリットルを、リン酸緩衝液（０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４．６、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に溶解させた５ｍＭ ４ＭＵ－α－Ｇａｌ ４０μＬと混合した。反応を３７℃でインキュベートし、０．５Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ１０．３ １００μＬの添加により終了させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ 蛍光リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を使用する蛍光測定（Ｅｘ３６５／Ｅｍ４５０）により、４メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の放出を決定した。
４ＭＵの２倍段階希釈を使用して標準曲線を作成した。得られたデータを両対数曲線（ｌｏｇ ｌｏｇ ｃｕｒｖｅ）とフィットさせた；このベストフィット曲線を使用して試験試料中の４ＭＵ濃度を算出した。酵素活性は、アッセイインキュベーション時間の１時間あたり、細胞培養物上清１ｍＬあたりの、放出された４ＭＵのｎｍｏｌとして表す（ｎｍｏｌ／時間／ｍＬ）。
Ｇｂ３の検出
Ｇｂ３およびリゾ－Ｇｂ３基質定量および分析：
質量分析により、選択されたマウス血漿および組織においてファブリー基質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）を測定した。簡単に説明すると、組織を秤量し、組織破壊液（５％ＭｅＯＨ、９５％水および０．１％酢酸（ａｓｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））で、組織１ｍｇあたり液５ｍｌの比で機械的に破壊した。次いで血漿または組織スラリー１０μｌを、シリコン処理したチューブ中の沈殿溶媒（溶液に添加された内部標準Ｎ－トリコサノイルセラミドトリヘキソシド（Ｃ２３：０、Ｍａｔｒｅｙａ）含有ＭｅＯＨ）９０μｌに添加し、ボルテックスし、振盪プレートに室温で３０分間配置した。次いで試料を遠心分離し、試料１０μｌをガラスＬＣ－ＭＳバイアル中の単一のブランクマトリックス（ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨ１：１＋０．１％ＦＡ）９０μｌに添加した。ＧＬＡＫＯマウスに存在する主要なＧｂ３種であるＧｂ３鎖長２４：０について試料を分析し、セラミドトリヘキソシド（Ｇｂ３、Ｍａｔｒｅｙａ）から構成される標準曲線に対して測定した。
同様の方式で、内部標準としてグルコシルスフィンゴシン（Ｍａｔｒｅｙａ）、および標準曲線を作成するためのリゾ－セラミドトリヘキソシド（リゾ－Ｇｂ３、Ｍａｔｒｅｙａ）を使用してグロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ－Ｇｂ３）を測定した。
遺伝子改変（ｉｎｄｅｌ％）の評価
ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して、ＺＦＮ標的部位を配列分析に供した。ヒトアルブミン遺伝子座またはマウスアルブミン遺伝子座のＺＦＮ標的部位をまたぐ１９４ｂｐ断片の増幅のため、および２回目の増幅用の結合配列を導入するための一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このＰＣＲ増幅の産物を精製し、アンプリコンに特異的な識別子配列（「バーコード」）、およびシーケンシングオリゴヌクレオチドプライマーを結合させるために設計された末端領域を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて２回目のＰＣＲに供した。次いで、バーコード化アンプリコンの混合集団を、単一のアッセイチップで数千の試料の平行分析が可能な固相シーケンシング手順であるＭｉＳｅｑ分析に供した。
ＧＬＡＫＯマウスモデルにおける、ファブリーＩＶＰＲＰ（登録商標）およびｃＤＮＡベクターのインビボ試験
ファブリー病の動物モデルにおけるこれらの治療薬の効果を実証するため、ＨｅｐＧ２細胞に使用したものと同一のＡＡＶ２／６ ＧＬＡ ｃＤＮＡ構築物でＧＬＡＫＯマウスを形質導入した。その他のＧＬＡＫＯマウスを、マウスアルブミンを切断するように設計されたＺＦＮ ＳＢ－４８６４１およびＳＢ－３１５２３をコードする２つのｒＡＡＶ２／８ベクター、ならびにマウス相同アームとともにｈＧＬＡ ｃＤＮＡドナー鋳型をコードする１つのｒＡＡＶ２／８ベクターからなるファブリーＩＶＰＲＰのマウスバージョンで形質導入した。対照として、さらなるＧＬＡＫＯマウスおよび野生型マウスに、ベクター粒子を含有しないＡＡＶベクター製剤緩衝液（ＰＢＳ、３５ｎＭ ＮａＣｌ、１％スクロース、０．０５％プルロニックＦ－６８、ｐＨ７．１）を注射した。動物には、ＡＡＶ注射の前日から開始して２週間ごとにシクロホスファミド５０ｍｇ／ｋｇを投与した。マウスはすべて注射時点で４～１２週齢であった。血漿α－ＧａｌＡ活性を測定するため毎週または隔週で顎下穿刺により血漿を採取しながら、２～３ヶ月間マウスをモニタリングした。実験終了時にマウスを安楽死させ、上述のように血漿、肝臓、腎臓、心臓および脾臓においてα－ＧａｌＡ活性を測定した。質量分析により、血漿、肝臓、腎臓、心臓および脾臓においてＧｂ３およびリゾ－Ｇｂ３基質レベルを測定した。ファブリーＩＶＰＲＰで処理したマウスについては、上述のようにＭｉＳｅｑによって、肝臓組織におけるｉｎｄｅｌを測定した。
ウェスタンブロットおよび脱グリコシル化手順：
マウス肝臓を０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４．６中でホモジェナイズした。肝臓ホモジェネートを１０分間煮沸し、次いで各試料のアリコートを、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）で、ＮＥＢプロトコールに従って１時間処理することにより脱グリコシル化した。
総タンパク質１ｕｇを、ＮｕＰａｇｅ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングした。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理前後にローディングされた組換えヒトＧＬＡ ０．５ｎｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をサイズ参照として含めた。
ウェスタンブロットに使用した抗体は：一次抗体：α－ＧＬＡ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌウサギモノクローナル抗体、１：１０００；二次抗体：ヤギα－ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：１０，０００であった。
（実施例３：インビトロでのＧＬＡ導入遺伝子発現）
ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法：方法は実施例２で先に記載している。簡単に説明すると、各ＺＦＮについては１００ｋ ｖｇ／細胞およびＧＬＡドナーについては２００ｋ ｖｇ／細胞の用量、またはＺＦＮおよびドナーについて３００ｋ／６００ｋの用量のＡＡＶ２／６ＺＦＮおよびｈＧＬＡドナーベクターで、それぞれＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞を形質導入した。
図２に示すように、形質導入された細胞では上清および細胞ペレットにおけるα－ＧａｌＡ活性が増大し、ＺＦＮ＋ドナー群で活性が模擬形質導入されたＨｅｐＧ２レベルの３×に到達した。ＺＦＮ活性の尺度であるアルブミン遺伝子座でのＩｎｄｅｌを、ＧＬＡドナー構築物ＡおよびＢについて各ベクター用量で測定した。ドナーＡおよびＢにおけるＩｎｄｅｌは、３００／６００ベクター用量で４３．４６％および３９．８１％、１００／２００ベクター用量で８．８１％および９．６９％であった。
ｃＤＮＡ手法：図１Ｂに示すｃＤＮＡ構築物についても、上述のようにＨｅｐＧ２／Ｇ３細胞で試験した。図３に示すように、ＡＡＶ２／６ ＧＬＡ ｃＤＮＡベクターが形質導入されたＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞では、上清および細胞ペレットにおけるα－ＧａｌＡ活性が用量依存的に増大した。各用量は図３で標識され、１細胞あたりの千（Ｋ）のウイルスベクターコピーを示す。上清α－ＧａｌＡ活性は、高ｃＤＮＡ用量では模擬レベルの２００×に到達した。
タンパク質を単離し、酵素補充療法で被験体に投与することができる。
（実施例４：２つの手法のインビボ試験）
次に、２種類の手法（ｃＤＮＡおよびＩＶＰＲＰ（登録商標））をインビボで試験した。構築物をＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／８にパッケージングし、次いでＧＬＡノックアウト（ＧＬＡＫＯ）マウスに静脈内注射した。これはファブリー病のマウスモデルである（Ｂａｎｇａｒｉら（２０１５年）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １８５巻（３号）：６５１～６５頁）。投与レジメン（表３）とともに、試験物品を以下（表２）に示す。
ｃＤＮＡ手法：
図４に示すように、ｃＤＮＡ処理した群のＧＬＡＫＯマウスは、早くもＡＡＶ投与後７日目には血漿において超生理学的なα－ＧａｌＡ活性を示した。個々のマウスの結果を図に示す。血漿α－ＧａｌＡ活性を毎週測定し、高い、用量依存性の活性レベルが試験期間を通して持続した。血漿活性は、低用量（２．０ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）群では野生型の最大６×、高用量（２．０ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）群では野生型の２８０×に到達した。２ヶ月後にマウスを安楽死させ、肝臓および二次的な遠位組織でのα－ＧａｌＡ活性およびＧｂ３蓄積について分析した。
図５に示すように、対応するＧｂ３基質含量の減少とともに、α－ＧａｌＡ活性の用量依存性増大が肝臓、心臓および腎臓で見られた。高ＡＡＶ２／６ｃＤＮＡ用量を投与された一部のＧＬＡＫＯマウスの組織では、Ｇｂ３が検出不能であった。データは、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較した基質クリアランス量に関しても分析され（図５Ｅおよび図５Ｆ）、高ｃＤＮＡ用量で処理したマウスが、平均すると未処理ＧＬＡＫＯマウスで見られた基質の１０％未満を有していたことを実証した。
ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法：
９０日の期間にわたって、ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法で投与されたＧＡＬＫＯマウスについて血漿レベルを計測した。データ（図６Ａ）は、α－Ｇｌａタンパク質活性が、野生型マウスで見られた活性の約２５～３０％のレベルで血清において検出されたことを示している。この実験では、細胞の１群に軽度の免疫抑制レジメン（２週間ごとにシクロホスファミド５０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。肝臓におけるＺＦＮ活性（Ｉｎｄｅｌ）の測定により、軽度の免疫抑制で処理した動物はわずかに高いレベルのｉｎｄｅｌを有していた（図６Ｂ）が、両群が予期された範囲の存在するｉｎｄｅｌを有していたことが判明した。
漸増する厳しい免疫抑制（以下の表４に示す投与）を使用して第２の実験を実施し、データ（図６Ｃ、６Ｄ、および６Ｅ）は、免疫抑制がα－Ｇａｌ Ａタンパク質活性を有意には増大させなかったことを実証した。
α－Ｇａｌ Ａは、タンパク質の活性部位から遠位のいくつかの変異でファブリー病につながることから（ＧａｒｍａｎおよびＧａｒｂｏｃｚｉ（２００４年） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７巻（２号）：３１９～３５頁）、ミスフォールディングによる不活性化に感受性であると考えられ、いくつかのＧＬＡ変異体による使用のため、デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）を含む分子シャペロンの使用が提案されている（Ｍｏｉｓｅら（２０１６年） Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７巻（６号）：１０７１～８頁）。したがって、上述の試験では、だいたい３０～３５日目にＤＧＪを添加した。具体的には、水２００ｕｌで希釈した３ｍｇ／ｋｇを経口胃管栄養により毎日与えた。ＤＧＪで処理した動物ではα－Ｇａｌ Ａ活性の迅速な上昇が検出された（図７）。
この試験の動物由来の組織でも、上述のようにα－ＧＬＡ活性について検査した。結果（図８）は、組織において、特に肝臓および脾臓において活性が検出可能であったことを実証した。すべての組織で、高用量ｃＤＮＡ手法について検出された活性は、野生型マウスより高かった。
α－Ｇａｌ Ａ一次基質のレベルも、上述のように血漿、肝臓および心臓組織において測定した。データ（図９）は、ＩＶＰＲＰ（登録商標）試料については血漿における検出可能なＧｂ３の減少を示し、ｃＤＮＡ試料については検出可能なＧｂ３を示さなかった（野生型マウスと同等）。肝臓および心臓組織でもＩＶＰＲＰ（登録商標）試料は検出可能なＧｂ３の減少を示し、これは低用量ｃＤＮＡ試料でも当てはまった。高用量ｃＤＮＡ試料では、レベルは野生型試料とほぼ同じであった。
これらの結果は、本明細書に記載されるｃＤＮＡまたはＩＶＰＲＰ（登録商標）手法のいずれかによるＧＬＡ導入遺伝子の提供により、インビボでの治療上の利益がもたらされることを示している。
（実施例５：ＩＶＰＲＰ（登録商標）ドナー設計の最適化）
また、ＧＬＡコード領域の設計を最適化し、シグナルペプチドを最適化するためのＩＶＰＲＰ（登録商標）手法についてドナー設計を検討した。始めに、ＧＬＡコード配列の前にα－Ｇａｌ Ａ（ＧＬＡ）シグナルペプチド（配列：ＭＱＬＲＮＰＥＬＨＬＧＣＡＬＡＬＲＦＬＡＬＶＳＷＤＩＰＧＡＲＡ、配列番号１）を導入するようにドナー設計を変化させ、アルブミンシグナルペプチドとは別に新しい翻訳事象を引き起こすように、α－Ｇａｌ Ａシグナルペプチドの前にＫｏｚａｋ配列（配列：ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ、配列番号２）を挿入した（図１０を参照されたい、例は改変体＃Ａ、改変体＃Ｂ）。さらに、代替のＩＤＳシグナルペプチド（配列：ＭＰＰＰＲＴＧＲＧＬＬＷＬＧＬＶＬＳＳＶＣＶＡＬＧ、配列番号３）の使用について分析し（図１０、改変体＃Ｈ）、翻訳中にシグナルペプチドの５’側配列を除去するための、Ｔ．ａｓｉｇｎａ由来の２Ａ様配列（「Ｔ２Ａ」）（Ｌｕｋｅら（２００８年） Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ８９巻（第４部）：１０３６～１０４２頁）の使用についても分析した。新しい構築物を、これまでに記載されたようにＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞で試験した。
結果は、インビトロでは改変体＃Ａおよび改変体＃Ｂが、初期ドナーよりもはるかに高いレベルのα－ＧａｌＡ活性を有していたことを示した（図１１Ａ）。さらに、改変体Ｋは、改変体Ａまたは初期ドナーと比較してさらに高いレベルのα－ＧａｌＡ活性を示した（図１１Ｂ）。
次いで、以下の表５に列挙する投与プロトコールを使用して、構築物をＧＬＡＫＯマウスにおいてインビボで試験した。
１週間あたり１回血漿を採取し、上述のようにα－Ｇａｌ Ａ活性を測定した。各マウスの試料すべてで活性が見られ、新しい設計は初期ドナーを超える改善を示し（図１２）、レベルは２８日時点で野生型より少なくとも４０倍高かった（点線で示す）。試料は経時的に増大を示し、群２（ドナー＃Ａ）では野生型レベルの約８０×、群４（ドナー＃Ｅ）ではＷＴの５０×の活性が測定された。組織試料がマウスから採取され、Ｇｂ３レベルが測定され、未処理ＧＬＡＫＯマウスと比較して低下することが判明している。
上記の実験を５６日間実施し、５６日目に動物を屠殺し、肝臓、心臓、腎臓および脾臓におけるα－Ｇａｌ Ａ活性について分析した。延長したデータ（図１５）は、この手法により、野生型動物の血漿と比較しての、処理した動物の血漿におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の１００倍の増大、野生型（未処理）動物の心臓と比較しての、処理した動物の心臓におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の９倍の増大、および未処理（野生型）動物と比較しての、処理した動物の腎臓におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の８０％の増大を含む、試験した組織におけるα－Ｇａｌ Ａ活性の増大が生じたことを示している。
次いで、組織分析を行って、処理後の様々な組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）におけるα－Ｇａｌ Ａ糖脂質基質（Ｇｂ３（図１６Ａ）およびリゾ－Ｇｂ３（図１６Ｂ））レベルを決定した。図１６に示すように、本明細書に記載される処理により、処理前（初期）および未処理（野生型）動物と比較して、Ａ、ＢまたはＥ改変体で処理した動物では、試験したすべての組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）において両基質（Ｇｂ３およびリゾ－Ｇｂ３）レベルの低下が生じ、本明細書に記載される組成物および方法により、インビボで治療上有益なレベルのタンパク質がもたらされることが示された。
上述のように実験を繰り返して、アルブミンを標的とするＺＦＮとともに改変体Ｅおよび改変体Ｊ（図１０を参照されたい）を投与した後の、血漿および様々な組織（肝臓、心臓（ｈｅａｒ）、腎臓および脾臓）におけるα－Ｇａｌ Ａ活性をアッセイした。図２０および２１に示すように、改変体Ｊドナーを受けた動物の血漿（図２０Ａ）ならびに肝臓、心臓、腎臓および脾臓（図２０Ｂ）におけるα－Ｇａｌ Ａ活性が、野生型の活性のほぼ３００×の血漿α－Ｇａｌ Ａ活性、ならびに肝臓、心臓および脾臓では野生型の活性の１０～１００×またはそれを超える組織α－Ｇａｌ Ａ活性を生じた。
処理後の様々な組織（血漿、肝臓、心臓および腎臓）におけるα－Ｇａｌ Ａ糖脂質基質（Ｇｂ３（図２１Ａ）およびリゾ－Ｇｂ３（図２１Ｂ））濃度を、本明細書に記載されるように測定した。図２１に示すように、改変体Ｊの発現により基質レベルが著しく低下した。
（実施例６：ｃＤＮＡ手法用のＧＬＡ導入遺伝子カセット設計の最適化）
ｃＤＮＡ手法用のＧＬＡ導入遺伝子カセットも最適化した。α－Ｇａｌ Ａペプチド、ＩＤＳ遺伝子（イズロン酸２－スルファターゼ）用シグナルペプチド、ＦＩＸ遺伝子（第ＩＸ因子、（配列：ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣ、配列番号４））およびアルブミン（配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号５）シグナルペプチドを含む様々なシグナルペプチドをコードする配列に導入遺伝子を連結させた（図１３Ｂ）。さらに、ＧＬＡ導入遺伝子を、代替の最適化されたｃＤＮＡ発現ベクター（図１３Ａ、米国公開第２０１７０１１９９０６号も）に挿入した。すべての構築物が、上述のようにインビトロでＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞において、１細胞あたりウイルスベクターコピー３０～６００千（Ｋ）の範囲の用量で試験され、ＩＤＳおよびＦＩＸ（Ｆ９）リーダー配列が、ＧＬＡまたはＡＬＢ（アルブミン）リーダー配列の使用よりも高いα－ＧａｌＡ活性をもたらすことを示した（図１４Ａ）。ｃＤＮＡ改変体＃４、＃５および＃６（図１３）についてのデータを図１４Ｂに示す。
構築物は上述のようにＧＬＡＫＯマウスでも試験され、インビボで活性である。
（実施例７：ウェスタンブロットおよび脱グリコシル化によるα－Ｇａｌ Ａタンパク質の分析）
ＩＶＰＲＰ（登録商標）手法またはｃＤＮＡ手法のいずれかで処理したマウス由来の血漿を、実施例２に記載されるようにα－ＧａｌＡタンパク質の存在について分析した。さらに、試料をＰＮＧａｓｅＦでも処理して、脱グリコシル化を引き起こした。
図１７に示すように、ＩＶＰＲＰ（登録商標）（図１７Ａは改変体Ａおよび改変体Ｊの結果を示す）または初期ｃＤＮＡ構築物（構築物は図１３Ｂに示し、データは図１７Ｂに示す）処理のいずれかの後に、ＧＬＡＫＯマウスにおいてインビボで産生されたα－ＧａｌＡタンパク質は、組換えｈＧａｌＡタンパク質と同様に振る舞い、本明細書に記載される組成物および方法により、臨床的に妥当なレベル、すなわち酵素補充療法において現在使用されている組換え治療用タンパク質でのレベルと同様の治療レベルのタンパク質がもたらされることを示した。
（実施例８：ｃＤＮＡ投与後のインビトロでのタンパク質産生）
Ｈｅｐ２Ｇ細胞をＡＡＶ ＧＬＡ ｃＤＮＡ改変体＃４で形質導入し、５日後に上清を収集し、α－Ｇａｌ Ａ活性について試験し、実施例２に記載されるように上清をＫ５６２細胞の培養に使用した。
図２８Ａに示すように、ＡＡＶ ＧＬＡ ｃＤＮＡ改変体＃４によるＨｅｐＧ２細胞の形質導入から５日後に収集された上清は、多量のα－Ｇａｌ Ａ活性を示した。図２８Ｂは、ＨｅｐＧ２上清由来のα－Ｇａｌ Ａが２４時間以内にＫ５６２に取り込まれ、取り込みがＭ６Ｐにより遮断されたことを示している。
したがって、本明細書に記載される細胞はα－Ｇａｌ Ａを多量に産生および分泌し、次いで、分泌されたα－Ｇａｌ Ａは他の細胞に取り込まれる。したがって、本明細書に記載される系を、例えば酵素補充療法において、それを必要とする被験体に投与するためのα－Ｇａｌ Ａの産生に使用することができる。
（実施例９：ｃＤＮＡ改変体＃４で処理したマウスのインビボ活性）
ｃＤＮＡ改変体＃４（図１３を参照されたい）または初期ｃＤＮＡ構築物（図１３Ｂ）を含むＡＡＶ５．０ｅ１０ＶＧ（２．０ｅ１２ＶＧ／ｋｇ）を含有する製剤緩衝液２００μＬでＧＬＡＫＯマウスを静脈内処理し、２ヶ月の期間にわたり血漿α－ＧａｌＡ活性を分析した。改変体＃４で処理したＧＬＡＫＯマウスの血漿におけるα－ＧａｌＡ活性は、初期ｃＤＮＡ構築物で観察された活性の約１０×であった（図１８Ａ）。上述のように、２つの処理群について肝臓、心臓、腎臓および脾臓でも活性を測定し、図１８Ｂに示す。さらに、処理したマウスの肝臓においてα－Ｇａｌ Ａタンパク質を分析し、上記で論じたようにＰＮＧａｓｅ ＦまたはＥｎｄｏ Ｈによる処理後の分子量の変化を観察した（図１８Ｃ）。さらに、図３２に示すように、初期および改変体＃４ｃＤＮＡで処理したＧＬＡＫＯマウスはともに、試験した組織すべてにおいてファブリー基質濃度の低下を示した。
これらのデータは、ｃＤＮＡ手法も、インビボでの、治療上有益なレベルのα－ＧａｌＡタンパク質の産生のためのロバストなプラットフォームであることを実証している。
（実施例１０：初期ｃＤＮＡ構築物で処理したマウスにおけるインビボ滴定）
１．２５ｅ１１ＶＧ／ｋｇ～５．０ｅ１２ＶＧ／ｋｇの範囲の用量の、初期ｃＤＮＡ構築物（図１３Ｂ）を含むＡＡＶでＧＬＡＫＯマウスを静脈内処理し、実施例４および５に記載されるように、６ヶ月の期間にわたり血漿α－ＧａｌＡ活性を分析した。
初期ｃＤＮＡで処理したＧＬＡＫＯマウスは、血漿において、野生型の１×～野生型の最大４０×の範囲の用量依存性α－ＧａｌＡ活性を有した（図１９）。さらに、図２９に示すように、α－Ｇａｌ Ａ活性は形質導入後６ヶ月間（用量依存的に）治療レベルを維持し、長期的な治療上の利益が示された。図３０は、１８０日（処理後６ヶ月）時点での肝臓、脾臓、心臓および腎臓におけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示し、これらの組織における治療レベルも示す。α－Ｇａｌ Ａ活性の用量依存性増大は、Ｇｂ３基質含量の減少にも対応する。評価した組織すべてにおけるＧｂ３含量の用量依存性減少を示す図３１および３２を参照されたい。
データは、本明細書に記載されるｃＤＮＡ手法で処理した被験体において、治療レベルのα－Ｇａｌ Ａタンパク質が生成されることを実証している。
（実施例１１：さらなるインビボＩＶＰＲＰ（登録商標）試験）
ＺＦＮおよび様々な例示的なｈＧＬＡドナー構築物でＧＬＡＫＯマウスを処理し、ゲノム改変、インビボでのＧＬＡ活性、およびインビボでのファブリー基質の減少について上述のように評価した。実施例５を参照されたい。
図２２に示すように、ヌクレアーゼ媒介性のＧＬＡドナー組み込みにより、ファブリー病のＧＬＡＫＯマウスモデルにおいて肝細胞の恒久的な改変がもたらされた。図２３は、動物へのヌクレアーゼおよびＧＬＡドナー投与後の経時的な（図２３Ａ）および２ヶ月時点（図２３Ｂ）での、示した組織におけるα－Ｇａｌ Ａ活性を示す。示したように、安定な血漿活性が野生型の最大８０倍に到達したことを含めて、肝臓で産生されたα－Ｇａｌ Ａが血流に分泌され、二次的な組織に取り込まれる。図２４は、ヌクレアーゼおよびドナーで処理した動物が、未処理動物、野生型動物およびドナーのみで処理した動物と比較して、試験した組織すべてにおいて著しく低下した基質濃度を示したことを示している。
改変体Ｌ、および改変体ＬのＧＬＡシグナルペプチドの代わりにＩＤＳシグナルペプチドを含む、改変体Ｍという名称の改変ドナー（図２５）を使用して、ＨｅｐＧ２およびＧＬＡＫＯマウスにおける実験を実施した。
ＬおよびＭドナー組み込みの検出のため、組み込み事象を欠く野生型遺伝子について生成された産物に対して、ドナーが組み込まれていると異なる産物を生成する、バイアスのないＰＣＲスキームに基づくＮＧＳ手法を使用した。簡単に説明すると、５－ＮＧＳプライマー配列（図２５Ｂのプライマー１と同一）を、導入遺伝子の３’末端に付加した（図２５Ａを参照されたい）。ＮＧＳプライマー配列のすぐ下流に、標的化組み込み（ＴＩ）配列を付加した。ＴＩ配列はアルブミン遺伝子座における対応する配列と同一の塩基組成および長さを有するが、導入遺伝子組み込みを含む遺伝子座と比較して、組み込みを有しない野生型遺伝子座に関連するＰＣＲ産物の増幅においてＰＣＲバイアスが導入されないように、塩基配列がスクランブルされている。したがって、２種のＰＣＲ産物は同一のプライマーを利用し、同一のサイズおよび組成のＰＣＲ産物を産生するが、異なる配列を有し、ＮＧＳによるＴＩ事象の容易な特定、ならびにＮＧＳによるｉｎｄｅｌおよびＴＩ事象の同時分析が可能となる。
ヒト細胞における組み込み事象の分析のために使用したプライマーは以下である：
ヒト細胞に使用したＴＩ配列を以下に示し、ここで、スクランブルされた配列はイタリック体で示し、プライマー１結合部位の位置は下線で示す：
２つのプライマーを使用する増幅により、以下に示す２２２ｂｐアンプリコンが産生される：
野生型アンプリコン（挿入なし）：
ＴＩアンプリコン（イタリック体はスクランブルされた配列を示す）：
同様に、マウス細胞に使用したＴＩ配列およびプライマーを以下に示す。組み込み事象の分析のために使用したプライマーは以下の通りである：
マウス細胞に使用したＴＩ配列を以下に示し、ここで、スクランブルされた配列はイタリック体で示し、プライマー１結合部位の位置は下線で示す：
２つのプライマーを使用する増幅により、以下に示す２４７ｂｐアンプリコンが産生される：
野生型アンプリコン（挿入なし）：
ＴＩアンプリコン（イタリック体はスクランブルされた配列を示す）：
さらに、この技術を、以下に示すプライマーおよび挿入されるＴＩ配列を利用して、非ヒト霊長類（アカゲザル、ＮＨＰ）に使用することができる：
ＮＨＰ細胞に使用したＴＩ配列を以下に示し、ここで、スクランブルされた配列はイタリック体で示し、プライマー１結合部位の位置は下線で示す：
２つのプライマーを使用する増幅により、以下に示す１７３ｂｐアンプリコンが産生される：
野生型アンプリコン（挿入なし）：
ＴＩアンプリコン（イタリック体はスクランブルされた配列を示す）：
したがって、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃａｒｉｎｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２由来のヒト細胞を、ＺＦＮ、およびＨＤＲの分析のためのＴＩ配列を含むＧＬＡドナー改変体＃Ｌで処理した。形質導入から７日後に、形質導入された細胞からＤＮＡを精製し、ＮＧＳにより分析した。
図２６に示すように、インビトロでのｉｎｄｅｌおよびＴＩ（ＨＤＲ）は、固定比のＺＦＮおよびＴＩドナーに対し用量依存性応答を示した。さらに、ＧＬＡＫＯマウスで示されるように、改変体Ｍのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み（ＴＩ）により、野生型の最大２５０倍の安定な血漿活性が生じ、心臓および腎臓ではα－Ｇａｌ Ａ活性がそれぞれ野生型の２０倍および野生型の４倍を超えた。
ＧＬＡドナー構築物のヌクレアーゼ媒介性ＴＩ後にα－Ｇａｌ Ａが二次的な組織に取り込まれるか否かをさらに評価するためのアッセイも実施した。簡単に説明すると、上述のように、ＩＤＳシグナルペプチドおよび標的化組み込み（ＴＩ）の分析のための３’配列を含むＧＬＡドナー構築物（ドナー改変体Ｍ）を使用してＧＬＡＫＯマウスを処理し、血漿および組織試料（例えば、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳など）を、α－Ｇａｌ Ａ活性および基質濃度の両方についてアッセイした。
図２７に示すように、α－Ｇａｌ Ａの安定な血漿活性は野生型の最大２５０倍であり、心臓および腎臓ではα－Ｇａｌ Ａ活性がそれぞれ野生型の２０倍および野生型の４倍を超えた。
データは、本明細書に記載されるＩＶＰＲＰ手法で処理した被験体（二次的な組織を含む）において、治療レベルのα－Ｇａｌ Ａタンパク質が生成されることを実証している。
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
理解の明瞭化ために図解および例を用いてある程度詳しく開示を提供しているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、上記の記載および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞において少なくとも１つのαガラクトシダーゼＡ（α－Ｇａｌ Ａ）タンパク質を発現させる方法であって、前記α－Ｇａｌ Ａタンパク質が前記細胞において発現されるように少なくとも１つの前記α－Ｇａｌ Ａタンパク質をコードするＧＬＡ導入遺伝子を前記細胞に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記細胞がファブリー病の被験体中にある、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記導入遺伝子がｃＤＮＡを含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記導入遺伝子が前記被験体の肝臓に投与される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記導入遺伝子がアルブミン遺伝子に組み込まれ、それから発現されるように、被験体の肝臓細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断する１つまたは複数のヌクレアーゼを投与することをさらに含む、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記導入遺伝子から発現される前記α－Ｇａｌ Ａタンパク質が前記被験体においてグリコスフィンゴリピドの量を２分の１以下に低下させる、項目１から５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記導入遺伝子が野生型ＧＬＡ配列またはコドン最適化ＧＬＡ配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子がシグナルペプチドをさらにコードする、項目１から７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
項目１から８のいずれかに記載の方法によって作製される、外因性ＧＬＡ導入遺伝子を含む遺伝子改変細胞。
（項目１０）
幹細胞または前駆細胞である、項目９に記載の遺伝子改変細胞。
（項目１１）
前記細胞が肝臓細胞または筋細胞である、項目９または項目１０に記載の遺伝子改変細胞。
（項目１２）
前記ＧＬＡ導入遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれている、項目９から１１のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
（項目１３）
前記ＧＬＡ導入遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれていない、項目９から１１のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
（項目１４）
ファブリー病の治療のための、少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質をコードするＧＬＡ導入遺伝子の使用。
（項目１５）
ファブリー病の治療のための、少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質をコードするＧＬＡ導入遺伝子を含む薬学的に許容される組成物。
（項目１６）
ファブリー病の治療のためのα－Ｇａｌ Ａタンパク質を産生する方法であって、項目１から８のいずれかに記載の方法に従って単離細胞において前記α－Ｇａｌ Ａタンパク質を発現させること、および前記細胞によって産生される前記α－Ｇａｌ Ａタンパク質を単離することを含む、方法。
（項目１７）
項目１から８のいずれかに記載の方法で使用するための、ＧＬＡ導入遺伝子を含むベクター。
（項目１８）
ウイルスベクターまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、項目１７に記載のベクター。

Claims (12)

  1. アルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターに連結したアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）エンハンサー、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）－ＩＧＧイントロン、シグナルペプチドをコードする配列、少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡ導入遺伝子、及びポリＡシグナル配列を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現構築物。
  2. 前記シグナルペプチドが、α－Ｇａｌ Ａシグナルペプチドである、請求項１に記載のＡＡＶ発現構築物。
  3. 前記ポリＡシグナル配列が、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル配列である、請求項１又は２に記載のＡＡＶ発現構築物。
  4. 前記導入遺伝子が、野生型α－Ｇａｌ Ａ配列又はコドン最適化α－Ｇａｌ Ａ配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物。
  5. 前記ＡＡＶ発現構築物が、それを必要とする被験体において前記導入遺伝子から、少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質を発現することができる、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物。
  6. 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を少なくとも２分の１に減少させる、請求項５に記載のＡＡＶ発現構築物。
  7. 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を、１／２から１／１００に、１／１００から１／５００に、又は１／５００から１／１０００に減少させる、請求項５に記載のＡＡＶ発現構築物。
  8. 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも１つのα－Ｇａｌ Ａタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、又は１／１００に減少させる、請求項５に記載のＡＡＶ発現構築物。
  9. 前記被験体が、ファブリー病を有する、請求項５から８のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物。
  10. 前記ＡＡＶ発現構築物が、非経口的に投与される、請求項５から９のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物。
  11. 前記ＡＡＶ発現構築物が、静脈内に投与される、請求項５から１０のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物。
  12. それを必要とする被験体において少なくとも１つのαガラクトシダーゼＡ（α－Ｇａｌ Ａ）タンパク質を発現するための組成物であって、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＡＡＶ発現構築物を含む、組成物。
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