CN107501370B - 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 - Google Patents
信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107501370B CN107501370B CN201710815709.0A CN201710815709A CN107501370B CN 107501370 B CN107501370 B CN 107501370B CN 201710815709 A CN201710815709 A CN 201710815709A CN 107501370 B CN107501370 B CN 107501370B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- diastereomer
- compound
- mrna
- rna
- rna molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 53
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title abstract description 156
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 78
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 47
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 36
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 136
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 92
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 85
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 52
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 48
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims description 33
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 29
- 101100223333 Caenorhabditis elegans dcap-2 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 18
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 16
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 125000004923 naphthylmethyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)C* 0.000 claims description 16
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 10
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 10
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 8
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 229930024421 Adenine Chemical group 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical group NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 201000003639 autosomal recessive cerebellar ataxia Diseases 0.000 abstract description 42
- 101001082110 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Eukaryotic translation initiation factor 4E homolog Proteins 0.000 abstract description 19
- 101001082109 Danio rerio Eukaryotic translation initiation factor 4E-1B Proteins 0.000 abstract description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 13
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical group C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 abstract description 11
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 abstract description 3
- 241000180579 Arca Species 0.000 abstract 2
- 108020005073 RNA Cap Analogs Proteins 0.000 abstract 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 151
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 50
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 48
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical class [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 26
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 25
- 101150087322 DCPS gene Proteins 0.000 description 24
- 101100386724 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) nhm1 gene Proteins 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 19
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 18
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 17
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical group 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 15
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 15
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 14
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 14
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 13
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 12
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 10
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- -1 ribonucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 8
- 101150100998 Ace gene Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 7
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H [oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 6
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 108010059585 mRNA decapping enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- NFOKCUQWYHRJGR-UHFFFAOYSA-N phosphonosulfanylphosphonic acid Chemical class OP(O)(=O)SP(O)(O)=O NFOKCUQWYHRJGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- PCKIYZZZOHQHIE-UHFFFAOYSA-N triethylazanium thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC PCKIYZZZOHQHIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 4
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091060294 Messenger RNP Proteins 0.000 description 3
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 3
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 3
- OZQGKWOGOZMTOM-UHFFFAOYSA-N [hydroxy(sulfanyl)phosphinothioyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(S)=S OZQGKWOGOZMTOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylguanosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 2'-O-methylguanosine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CJRPFMAFZQADLD-IOSLPCCCSA-O 2-amino-9-[(2r,3r,4r,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolan-2-yl]-7-methyl-3h-purin-9-ium-6-one Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1[N+]1=CN(C)C2=C1NC(N)=NC2=O CJRPFMAFZQADLD-IOSLPCCCSA-O 0.000 description 2
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010014863 Eukaryotic Initiation Factors Proteins 0.000 description 2
- 101710091919 Eukaryotic translation initiation factor 4G Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101001082056 Mus musculus Eukaryotic translation initiation factor 4E Proteins 0.000 description 2
- 101000819572 Mus musculus Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108091026838 U1 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 2
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M sodium propionate Chemical compound [Na+].CCC([O-])=O JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 2
- 229960003212 sodium propionate Drugs 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- HUEXNHSMABCRTH-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole Chemical class C1=CNC=N1.C1=CNC=N1 HUEXNHSMABCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QQODJOAVWUWVHJ-KQYNXXCUSA-N 7-methyl-7,8-dihydroguanosine-5'-diphosphate Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2N(C)CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QQODJOAVWUWVHJ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- ANQOOWZFPNPUAW-KQYNXXCUSA-N C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2O)O[C@H](COP([O-])(SP(O)(O)=O)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O Chemical compound C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2O)O[C@H](COP([O-])(SP(O)(O)=O)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O ANQOOWZFPNPUAW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WYMCIKNHISAQHP-IMPUYNKFSA-N C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2OC)O[C@H](COP(O)(OP([O-])(O)=O)=S)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O Chemical compound C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2OC)O[C@H](COP(O)(OP([O-])(O)=O)=S)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O WYMCIKNHISAQHP-IMPUYNKFSA-N 0.000 description 1
- OKHDJZYAKFAPLJ-IOSLPCCCSA-N C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2OC)O[C@H](COP([O-])(SP(O)(O)=O)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O Chemical compound C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2OC)O[C@H](COP([O-])(SP(O)(O)=O)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O OKHDJZYAKFAPLJ-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 101100494767 Drosophila melanogaster Dcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- QJXJXBXFIOTYHB-UUOKFMHZSA-N GDP-beta-S Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O QJXJXBXFIOTYHB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710149004 Nuclease P1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100268446 Pseudomonas putida (strain ATCC 47054 / DSM 6125 / CFBP 8728 / NCIMB 11950 / KT2440) proR gene Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- BMFDWNNPPWNUAM-PIORMBHWSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl] dihydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=S)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O BMFDWNNPPWNUAM-PIORMBHWSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000004673 fluoride salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical group [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000001394 phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000028499 poly(A) binding Human genes 0.000 description 1
- 108091023021 poly(A) binding Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
- C07H19/207—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
公开了新的RNA帽类似物，其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7‑甲基鸟苷的2’‑O位置处包含修饰，其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入，并因此是“抗‑反向帽类似物”(anti‑reverse cap analog，ARCA)。所述ARCA修饰确保，S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S‑ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S‑ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S‑ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地进行翻译。
Description
本申请是申请日为2008年6月19日、申请号为201410246751.1、发明名称为“信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途”的发明专利申请的分案申请。
Jacek Jemielity,Ewa M.Grudzien-Nogalska,Joanna Kowalska,EdwardDarzynkiewicz,和Robert E.Rhoads
文件编号：Jemielity 07S01W
在美国中根据35U.S.C.§119(e)，和在所有国家中根据适用的条约和公约，要求2007年6月19日提交的临时美国申请系列号60/944,842的提交日期的权益。
本发明的开发部分地在由国家综合医学研究所(National Institute ofGeneral Medical Sciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本发明中的某些权利。
本发明的开发部分地在由波兰科学和高等教育部(Polish Ministry of Scienceand Higher Education)给予的基金号2P04A 00628下得到波兰政府的资助。
技术领域
合成了新的信使RNA帽的抗-反向(anti-reverse)硫代磷酸类似物，并且显示在mRNA的翻译中是有用的。
技术背景
在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两个核苷部分之间的5'-5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。
能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。
最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸例如m7G(5')ppp(5')G(此后，m7GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录：m7GpppG的Guo部分的3'-OH对于下一个由模板所决定的核苷三磷酸上的α-磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m7GpppGpN。通过在转录反应混合物中将m7GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由GTP起始的产物pppGpN。
合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R.Contreras等人,“Simple,efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for direct expression ofcloned eukaryotic genes,”Nucl.Acids Res.,第10卷,第6353-6362页(1982)；J.Yisraeli等人,“Synthesis of long,capped transcripts in vitro by SP6and T7RNApolymerases,第42-50页,在J.Dahlberg等人(编辑),Meth.Enzymol.,第180卷,第42-50页(1989)中；和D.Melton等人,“Efficient in vitro synthesis of biologically activeRNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophageSP6promoter,”Nucl.Acids Res.,第12卷,第7035-7056页(1984)。
如此产生的加帽的RNA在体外进行的剪接反应中是有活性的。参见M.Konarska等人,“Recognition of cap structure in splicing in vitro of mRNAprecursors.Cell,第38卷,第731-736页(1984)；和I.Edery等人,“Cap-dependent RNAsplicing in a HeLa nuclear extract,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第82卷,第7590-7594页(1985)。
加帽的mRNA在无细胞翻译体系中比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见S.Muthukrishnan等人,“5'-Terminal 7-methylguanosine in eukaryotic mRNA isrequired for translation,”Nature,第255卷,第33-37页(1975)；L.Chu等人,“Paradoxical observations on the 5'terminus of ovalbumin messengerribonucleic acid,”J.Biol.Chem.,第253卷,第5228-5231页(1978)；E.Darzynkiewicz等人,“β-Globin mRNAs capped with m7G,m2 2.7G or m3 2.2.7G differ in intrinsictranslation efficiency,”Nucl.Acids Res.,第16卷,第8953-8962页(1988)；和E.Darzynkiewicz等人,“Inhibition of eukaryotic translation by nucleoside 5'-monophosphate analogues of mRNA 5'-cap:Changes in N7substituent affectanalogue activity,”Biochem.,第28卷,第4771-4778页(1989)。
5'-未甲基化的mRNA在翻译上的活性比5'-甲基化的mRNA低。参见G.Both等人,“Methylation-dependent translation of viral messenger RNAs in vitro,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第72卷,第1189-1193页(1975)。
通过电穿孔引入培养的哺乳动物细胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见E.Grudzien等人,“Differential inhibition of mRNA degradationpathways by novel cap analogs,”J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。
A.Pasquinelli等人,“Reverse 5'caps in RNAs made in vitro by phage RNApolymerases,”RNA,第1卷,第957-967页(1995)报道了，噬菌体聚合酶使用m7GpppG的7-甲基鸟嘌呤部分的3'-OH来起始转录，这证明用该帽类似物制备的RNA产物中的大约三分之一至一半实际上包含相反方向的帽，即Gpppm7GpN。此类反向帽化的RNA分子表现异常。相同的作者报道，当将反向帽化的pre-U1snRNA转录物注射入光滑爪蟾(Xenopus laevis)细胞核中时，它们比天然转录物更慢地被输出。类似地，细胞质中的胞质反向帽化的U1snRNA不被正确地输入到细胞核中。
mRNA上帽的存在强烈地刺激mRNA转录物翻译成蛋白质。E.Grudzien等人,“Novelcap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translationalefficiency,”RNA,第10卷,第1479-1487页(2004)证明，包含有专一地以相反方向掺入的帽的mRNA在无细胞体系中仅以包含有专一地以正常方向掺入的帽的mRNA的效率的4％进行翻译。
J.Stepinski等人,“Synthesis and properties of mRNAs containing thenovel‘anti-reverse’cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG,”RNA,第7卷,第1486-1495页(2001)报道了不能以相反方向掺入的两种新型帽类似物，m73'dGpppG和m2 7,3’-OGpppG，的合成和用途。用这些“抗-反向帽类似物”(anti-reverse cap analog，ARCA)帽化的mRNA在体外体系中比用常规类似物m7GpppG帽化的mRNA更有效地被翻译。还可参见，美国专利号7,074,596，和美国专利申请公开2003/0194759。
Z.Peng等人,“Synthesis and application of a chain-terminatingdinucleotide mRNA cap analog,”Org.Lett.,第4卷,第161-164页(2002)报道了m2 7,3’- OGpppG的合成以及其在均一地加帽的RNA的体外转录中的用途。
J.Jemielity等人，"Novel'anti-reverse'cap analogues with superiortranslational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)报道，用-OCH3或-H在2’位进行取代以分别产生m2 7,2’-OGpppG或m72’dGpppG，这产生了具有与在3’位取代的ARCA的性质相等或稍微更有利的性质的ARCA，如通过与翻译帽结合蛋白eIF4E的结合，在体外转录期间向mRNA中的正确掺入，以及在无细胞体系中所得的mRNA的翻译效率这样的标准所测量的。
从引入培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA所产生的蛋白质的量受限于通过天然周转过程的mRNA降解。mRNA降解的主要体内途径通过由特异的焦磷酸酶Dcp1/Dcp2(其在α和β磷酸之间进行切割)从完整的mRNA上去除帽来起始。E.Grudzien等人"Differentialinhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)设计并合成了其中亚甲基替代了α和β磷酸基团之间的O原子的帽类似物，m2 7,3’-OGppCH2pG，用该类似物帽化的mRNA在体外对于通过重组人Dcp2的水解具有抗性。当引入培养的细胞中时，用m2 7,3’-OGppCH2pG帽化的mRNA比用m2 7,3’-OGpppG帽化的mRNA更为稳定。
存在两种已知的脱帽酶：Dcp1/Dcp2，其作用于完整的mRNA以起始5’→3’降解；和DcpS，其作用于由于3’→5’降解而产生的短的加帽的寡核苷酸。因为Dcp1/Dcp2或单独的Dcp2从加帽的mRNA上释放m7GDP，所以切割可能发生在α-和β-磷酸之间。参见Z.Wang等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)。先前，显示了，核苷5’-单硫代磷酸以及三磷酸类似物例如ATPγS、GTPγS和GDPβS，对于磷酸酶是稳定的。参见F.Eckstein等人,"Guanosine 5'-O-(2-thiodiphosphate).An inhibitor of adenylatecyclase stimulation by guanine nucleotides and fluoride ions",J.Biol.Chem.,第254卷,第9829-9834页(1979)，和D.Cassel等人，"Activation of turkey erythrocyteadenylate cyclase and blocking of the catecholamine-stimulated GTPase byguanosine 5'-(gamma-thio)triphosphate",Biochem Biophys Res Commun,第77卷,第868-873页(1977)。此外，还发现包含硫代磷酸核苷酸间键合的多核苷酸比其天然对应物更缓慢地被降解。参见H.Matzura等人,"A polyribonucleotide containing alternation P＝O and P＝S linkages",Eur.J.Biochem.,第3卷,第448-452页(1968)。令人感兴趣的是，硫代磷酸的非对映异构体可以显示出不同的对于核酸酶的敏感性。核酸酶P1水解Sp非对映异构体比Rp更快。参见B.Potter等人,"Synthesis and configurational analysis of adinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus.Stereochemicalcourse of Penicillium citrum nuclease P1reaction.",Biochemistry,第22卷,第1369-1377页(1983)。相比于Sp，核糖核酸酶T1和蛇毒磷酸二酯酶优先切割Rp非对映异构体。参见F.Eckstein等人,"Stereochemistry of the transesterification step ofribonuclease T 1",Biochemistry,第11卷,第3507-3512页(1972)，和P.Burgers等人,"Absolute Configuration of the Diastereomers of Adenosine5'-O-(1-thiotriphosphate):Consequences for the stereochemistry of polymerization byDNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli",Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第75卷,第4798-4800页(1978)。
虽然用m2 7,3’-OGppCH2pG帽化的mRNA在培养的细胞中更为稳定，但是它具有较低的翻译效率，推测这是因为m2 7,3’-OGppCH2pG在体外以比m2 7,3’-OGpppG显著更低的亲和力与eIF4E结合。因此，即使它在培养的细胞中更为稳定，但这个优点却被较低的翻译效率给抵消了。
J.Kowalska等人"Synthesis and properties of mRNA cap analogscontaining phosphorothioate moiety in 5',5'-triphosphate chain,"Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,第24卷,第595-600页(2005)报道了其中用S替代α、β或γ磷酸部分中的O的三种帽类似物的合成，例如m7GpsppG、m7GpppsG和m7GppS-CH3pG。这些合成的硫代磷酸帽类似物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂，并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而，无论在体外还是在体内，这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率，因为它们可能在很大程度上以相反方向掺入。
存在对于这样的修饰的需要，所述修饰将可能达到更高的翻译效率和增加对于体内和体外降解的抗性。本文所报道的独特的化合物可以做到这两者。
发明内容
我们发现，在一个或多个磷酸处的S-取代连同2’-O甲基取代一起产生具有令人惊讶的性质的被称为S-ARCA的新型类似物。所述新的ARCA修饰确保，α、β和γ硫代磷酸基团在翻译和脱帽机器(machinery)中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。这些类似物中的至少一些对于Dcp1/Dcp2具有抗性。有些S-ARCA具有相比于缺乏硫代磷酸基团的相应类似物而言高得多的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度更有效地进行翻译。此外，用有些S-ARCA帽化的mRNA的半寿期长至用未修饰的帽合成的mRNA的半寿期的三倍。更有效地进行翻译的mRNA和更稳定的mRNA的组合导致在经转染的细胞中获得比使用常规的合成mRNA或者使用以早期ARCA帽化的mRNA更高的报道蛋白的总产量。S-ARCA增加了体内稳定性和令人惊讶地增加了翻译效率，这是由于与Dcp1/Dcp2抗性相组合的更高的对于eIF4E的亲和力。令人惊讶地，在生理条件下对于通过Dcp2的水解的抗性与三磷酸中的β-硫代磷酸基团相关，并且预期也与四磷酸中的γ-硫代磷酸基团相关。另一个相比于平常ARCA而言的优点是出现P-非对映异构现象，这归因于硫代磷酸部分。在当硫代磷酸部分准确地定位于α-、β-或γ-位置处时的每种情况下，仍然存在两种可能性来放置硫原子(proR和proS)，这导致获得具有可能不同的生物学活性的两种不同的非对映异构体。例如，在对应物D1和D2非对映异构体和还有用m2 7,2'-OGppSpG(D1)帽化的mRNA之间存在有对于eIF4E的结合亲和力的显著差异，并且该D1相比于其D2对应物而言对于Dcp2易感得多。因此，可以采用非对映异构体纯的S-ARCA作为P-手性探针，其可用于研究牵涉帽的酶促工艺步骤的立体化学过程。
附图简述
图1描绘了αS-ARCA m2 7,2’-OGpppSG(D1和D2)的合成。
图2描绘了γS-ARCA m2 7,2’-OGpSppG(D1和D2)的合成。
图3描绘了βS-ARCA m2 7,2’-OGppSpG(D1和D2)的合成。
图4描绘了四磷酸γS-ARCA，m2 7,2’-OGppSppG(D1和D2)的合成。
图5描绘了在三磷酸桥的α和β位置处具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA，m2 7,2’- OGppSpSG(D1、D2、D3和D4)的合成。
图6A-6H描绘了用hDcp2消化的体外合成的寡核苷酸的阴离子交换HPLC分析。
图7描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的衰变。
图8描绘了用S-ARCA帽化的mRNA在HC11细胞中的翻译效率。
图9A-9E描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HC11细胞中的多核糖体分布，显示为在蔗糖梯度中的沉降，通过监测260nm处的吸光度(A)，和通过使用实时PCR以显示萤光素酶mRNA(B、C和D)和GAPDH mRNA(E)的分布。
图10描绘了在用经S-ARCA帽化的mRNA对HC11细胞进行核穿孔(nucleoporation)后萤光素酶表达的时间过程。
本发明的实施方式
材料和方法
实施例1
一般的化学操作程序
使用在去离子水中的三乙基铵碳酸氢盐(TEAB)的线性梯度，在DEAD-Sephadex A-25(HCO3-形式)柱上通过离子交换色谱法来分离开中间体核苷酸，并且在通过添加乙醇在减压下进行蒸发后，将其分离为三乙基铵盐。通过分析型或半制备型RP HPLC来分离开终产物(帽类似物)，并且在反复的冷冻干燥后，将其分离为铵盐。分析型HPLC在装备有SupelcosilLC-18-T反相柱(4.6x 250mm，流速为1.3ml/分钟)的Spectra-Physics SP8800装置上进行，其中使用在pH 5.9的0.05M乙酸铵缓冲液中的0-25％甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。半制备型HPLC在装备有Waters HR-C-18反相柱(19x 300mm，流速为5.0m/分钟)的Waters 600E Multisolvent Delivery System上进行，其中使用在0.05M乙酸铵缓冲液(pH5.9)中的甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。
GMP和GDP购自Sigma-Aldrich，并且通过使用Dowex 50WX 8离子交换树脂而转化为三乙基铵盐。如先前在J.Jemielity等人"Novel'anti-reverse'cap analogues withsuperior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)中所报道的那样来制备其他核苷酸，即m7GMP、m2 7,2′-OGMP、m7GDP、m2 7,2′-OGDP。硫代磷酸三乙基铵盐通过下列方式而从Na3PSO3制备：在Dowex 50WX 8离子交换树脂上进行转化，并且(在蒸发至干后)用贮存于-20℃的99.8％乙醇进行再度蒸发。参见J Kowalska等人“A simple and rapidsynthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at theterminal position of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett.,第48卷,第5475-5479页(2007)。如先前所报道的那样来制备7-甲基鸟苷，除了使用DMF而非DMA之外(参见J.Jones等人,“Purine Nucleosides.111.Methylation Studies of Certain NaturallyOccurring Purine Nucleosides”,J.Am.Chem.Soc.,第85卷,第193-201页(1963))。通过类似的操作程序，从2’-O-甲基鸟苷来合成7,2’-O-二甲基鸟苷。根据J.Kusmierek等人,“Anew route to2'(3')-O-alkyl purine nucleosides”,Nucleic Acids Res.,第1卷,第73-77页,特别出版号4(1978)来制备2’-O-甲基鸟苷。
通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认最终化合物的结构和均一性。(结果显示在表1中)分别在399.94MHz和161.90MHz处在Varian UNITY-plus光谱仪上于25℃记录了1HNMR和31P NMR谱。报告了相对于在D2O中的3-三甲基甲硅烷基-[2,2,3,3-D4]-丙酸钠(TSP)(作为内标)的1H NMR化学位移。报告了相对于在D2O中的20％磷酸(作为外标)的31P NMR化学位移。使用负电喷雾电离(ESI-)，在Micromass QToF 1MS光谱仪上记录了质谱。
实施例2
用于核苷酸的N-酰化咪唑(imidazolide)衍生物(GMP-Im、m2 7,2’-OGMP-Im、GDP-Im和m2 7,2’-OGDP-Im)(7、8和12-15)的一般操作程序
参见T.Mukaiyama等人"Phosphorylation by oxidation-reductioncondensation.Preparation of active phosphorylating reagents",M.Bull.Chem.Soc.Jpn,第44卷,2284(1971)。在DMF(约2.5ml/100mg核苷酸)中混合合适的核苷酸(1当量的TEA盐)、咪唑(8当量)和2,2’-联硫基二吡啶(3当量)。添加三乙胺(2当量)和三苯膦(3当量)，并搅拌混合物6-8小时。用溶解在干燥的丙酮(约8ml/1ml DMF)中的无水高氯酸钠(1当量/一个负电荷)从反应混合物中沉淀出产物。在冷却至4℃后，过滤沉淀物，用冷的干燥的丙酮反复洗涤，并在真空中通过P4O10进行干燥。产率为80-100％。在m7GMP的情况下，由于其较低的在DMF中的溶解度，使用2倍过量的试剂，并且将反应时间延长至24小时。
实施例3
用于核苷5′-O-硫代磷酸(9-11)的一般操作程序
将合适的核苷(1当量，在真空中通过P4O10过夜干燥)在磷酸三甲酯(1.5ml/100mg核苷)中的悬浮液在冰/水浴上冷却至0℃。添加2,6-二甲基吡啶(3当量)和PSCl3(1.5当量)。反应在0℃下维持过夜，然后用0.35M TEAB猝灭并在室温下搅拌1小时。使用0-0.7MTEAB的线性梯度，通过DEAE Sephadex色谱法来分离开产物。产率：(9)380mg(0.67mmol)，从257mg(0.91mmol)鸟苷开始(74％)；(10)57mg(0.10mmol)，从120mg(0.42mmol)7-甲基鸟苷开始(24％)；(11)75mg(0.13mmol)，从70mg(0.23mmol)7,2′-O-二甲基鸟苷开始(53％)。
实施例4
核苷5′-(2-O-硫代二磷酸)的合成
7,2′-O-二甲基鸟苷5’-O-(2-硫代二磷酸)(17)。向14(100mg，0.21mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(220mg)在5ml DMF中的悬浮液之中添加无水ZnCl2(190mg，1.40mmol)。将所得的溶液在室温下搅拌20分钟。通过添加EDTA(520mg，1.40mmol)在50ml水中的溶液来猝灭反应，并用固体NaHCO3进行中和。使用0-1.0M的TEAB梯度，在DEAE Sephadex上分离产物。产率：106mg(0.15mmol)的(17)，作为TEA盐(71％)。
7-甲基鸟苷5′-O-(2-硫代二磷酸)(16)。如对于(17)所描述的那样，从(13)(40mg，0.089mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(100mg)开始来合成该化合物。产率：31mg(0.046mmol)的(16)，作为TEA盐(52％)。
实施例5
帽S-ARCA的合成
下面是对于各种帽S-ARCA的合成的描述。合成途径描绘在图1、2和3中。(数字)是指在图1、2和3中进行编号的化合物。
m7GpppsG D1和D2(1a，1b)。向(9)(10mg，0.018mmol)和7(15mg，0.027mmol)在DMF(0.8ml)中的悬浮液之中添加无水ZnCl2(30mg，0.22mmol)。反应在室温下维持2天。通过添加在10ml水中的90mg EDTA来猝灭反应，并用固体NaHCO3进行中和。通过分析型RP HPLC来分离开非对映异构体(1a)和(1b)。产率：0.8mg(1a)和1.0mg(1b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图1中。
m7GppspG D1和D2(2a，2b)。如对于1所描述的那样，从在2ml DMF中的16(20mg，0.030mmol)、15(23mg，0.053mmol)、ZnCl2(60mg，0.44mmol)开始来合成该化合物。产率：2.2mg(2a)和1.8mg(2b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图3中。
m7GpsppG D1和D2(3a，3b)。如对于(1)所描述的那样，从在3.5ml DMF中的(10)(58mg，0.090mmol)、(12)(120mg，0.22mmol)、ZnCl2(249mg，1.8mmol)开始来合成该化合物。产率：14.7mg(3a)和10.1mg(3b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图2中。
m2 7,2′-OGpppsG D1和D2(4a，4b)。将化合物(9)(48mg，0.084mmol)和(8)(57mg，0.10mmol)悬浮在2ml DMF中。随后，添加无水ZnCl2(115mg，0.84mmol)。将所得的溶液在室温下维持2天。通过添加在30ml水中的350mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。在45分钟内，使用在0.05M乙酸胺(pH＝5.9)中的0-50％的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：5.2mg(4a)和7.4mg(4b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图1中。
m2 7,2′-OGppspG D1和D2(5a，5b)。如对于(4)所描述的那样，从在5ml DMF中的(17)(106mg，0.16mmol)、(15)(103mg，0.24mmol)和ZnCl2(260mg，1.9mmol)开始来合成该化合物。用在100ml水中的800mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用等度的0.05M乙酸铵(pH＝5.9)，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：10.0mg(5a)和12.1mg(5b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图3中。
m2 7,2′-OGpsppG D1和D2(6a，6b)。如对于(4)所描述的那样，从在3ml DMF中的(11)(70mg，0.15mmol)、(12)(107mg，0.20mmol)和无水ZnCl2(220mg，1.6mmol)开始来合成该化合物。用在70ml水中的650mg EDTA来猝灭反应。在45分钟内，使用在0.05M乙酸铵(pH＝5.9)中的0-50％的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率：15mg(6a)和20mg(6b)，作为NH4 +盐。合成的流程图显示在图2中。
通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ESI-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认上述最终化合物的结构和均一性。结果显示在下表1中。
表1
相对于内标3-三甲基甲硅烷基-[2,2,3,3-2H4]-丙酸钠的
以百万分率表示的1H NMR化学位移(±0.01)
以及相对于外标H3PO4的
以百万分率表示的31P NMR化学位移(±0.01)
实施例6
四磷酸S-ARCA的合成
通过m2 7,2'-OGppSppG的合成显示了用于合成含有5',5'-四磷酸桥的S-ARCA的所开发出的策略的效用(图4)。通过类似的方法可得到三种其他四磷酸S-ARCA(即，m2 7,2'- OGpSpppG、m2 7,2'-OGpppSpG、m2 7,2'-OGppppSG)的合成。
m2 7,2′-OGppsppG(D1和D2)
将7,2’-O-二甲基鸟苷5’-(硫代二磷酸)(20mg，0.029mmol)和鸟苷5’-二磷酸N-酰化咪唑(30mg，0.056mmol)悬浮在2ml DMF中。随后，添加无水ZnCl2(61mg，0.45mmol)。在室温下搅拌所得的溶液3天。通过添加在20ml水中的EDTA(166mg，0.45mmol)来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用0-1.2M的TEAB梯度，通过离子交换DEAE Sephadex色谱法来分离开产物。收集包含m2 7,2’-OGppSppG的非对映异构体混合物的级分，倒在一起，并在减压下通过反复添加乙醇来进行蒸发。在60分钟内，使用在0.05M乙酸铵(pH＝5.9)中的0-25％甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来达到最后的纯化。产率：7mg m2 7,2′-OGppsppG(非对映异构体混合物)，作为NH4 +盐。
MS ESI(-):关于C22H30N10O17P3S的计算值:897.02；测定值:879.09
D1:1H NMR:δ(ppm)9.14(1H,s)8.08(1H,s),5.99(1H,d),5.813(1H,d)；4.70(1H；t),4.64(1H,t),4.54(1H,t),4.45(1H,m),4.35(2H,m),4.29(3H,m),4.07(3H,s),3.60(3H,s)；31P NMR:δ30.2(1P,t,Pγ),-11.1(1P,dd,Pδ),-11.9(1P,dd,Pα),-23.8(1P,d,Pβ)
D2:1H NMR:δ(ppm)9.16(1H,s)8.08(1H,s),6.03(1H,d),5.83(1H,d)；4.70(1H；t),4.60(1H,t),4.54(1H,t),4.45(1H,m),4.35(2H,m),4.29(3H,m),4.07(3H,s),3.58(3H,s)；31P NMR:δ30.2(1P,t,Pγ),-11.1(1P,dd,Pδ),-11.9(1P,dd,Pα),-23.8(1P,d,Pβ)
实施例7
具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA的合成
所开发出的策略还提供了用于合成在5',5'-多磷酸桥中含有多个硫代磷酸部分(这可以通过图5中所建议的合成路线来达到)的化合物(例如，化合物m2 7,2'-OGppSpSG)的方法。将与先前对于腺苷5′-O-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物所报道的操作程序[M.Shimazu等人,"Regio-and stereocontrolled synthesis of 2'-5'-linked phosphorothioateoligoadenylates by uranyl ion catalyst in aqueous solution",J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,2002,1778-1785]相类似地来制备鸟苷5′-O-硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物，并用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子水中的0至0.5M TEAB)在DEAE SephadexA-25上进行纯化。关于该合成的描绘显示在图5中。
鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)。将鸟苷5'-O-单硫代磷酸的N-酰化咪唑衍生物(三乙基铵盐，53mg，0.1mmol)与硫代磷酸三乙基铵盐(320mg，约1.2mmol)相混合，并将所得的混合物悬浮在3.5mL DMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0.4mmol)和氯化锰(50mg，0.4mmol)。通过添加EDTA溶液(270mg，0.8mmol，在35mL水中)来猝灭反应，并用碳酸氢钠调至pH 7。用三乙基铵碳酸氢盐的线性梯度(在去离子水中的0至0.9M TEAB)，在DEAE-Sephadex A-25柱上进行色谱法分离。收集包含鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)的级分并通过添加乙醇在减压下进行蒸发，并且将所得的固体在真空中通过P4O10进行干燥。
m2 7,2'-OGppSpSG。将7,2'-O-二甲基鸟苷5′-O-单磷酸的N-酰化咪唑衍生物(钠盐，23mg，0.05mmol)与鸟苷5'-O-(1,2-二硫代二磷酸)(三乙基铵盐，39mg，0.05mmol)相混合，并将所得的混合物悬浮在1.5mL DMF中。随后，添加无水氯化锌(55mg，0.4mmol)。通过添加EDTA溶液(135mg，0.4mmol，在20mL水中)来猝灭反应，并用碳酸氢钠调至pH 7。m2 7,2'- OGppSpSG非对映异构体(D1、D2、D3、D4)的色谱法分离和分开通过半制备型RP HPLC来进行。
实施例8
细胞培养
HC11乳腺上皮细胞以克隆方式衍生自COMMA-1D小鼠乳腺细胞系。参见，K.Danielson等人,"Epithelial mouse mammary cell line exhibiting normalmorphogenesis in vivo and functional differentiation in vitro,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第81卷,第3756-3760页(1984)。细胞在含有10％牛生长血清(HyClone)、5μg/ml牛胰岛素(Sigma)、10ng/ml重组EGF(BD Biosciences)的RPMI1640培养基中进行生长。
实施例9
mRNA的体外合成
在所有四种核苷三磷酸和不同的帽二核苷酸存在下，用T7聚合酶在编码萤光素酶的质粒(pluc-A60)存在下通过体外转录来合成加帽的RNA。参见J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)。典型的转录反应包含40mM Tris-HCl(pH 7.9)、6mM MgCl2、2mM亚精胺、10mM DTT、0.1mg/ml BSA、1U/μl的RNasin(Promega)、0.5mM ATP、0.5mM CTP、0.5mMUTP、0.1mM GTP、1mM帽类似物、15μg/ml DNA和1U/μl的T7聚合酶(Promega)。pluc-A60(其包含有在pGEM4(Promega)中的整个萤火虫萤光素酶编码序列和3’-末端的60-nt poly(A)束(tract)(参见E.Grudzien等人,"Differential inhibition of mRNA degradationpathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006))用HpaI进行消化以合成萤光素酶mRNA，并且用NcoI进行消化以合成加帽的寡核苷酸。
在10μCi/μl的[α-32P]GTP(ICN)存在下，在于37℃温育45分钟的50-μl反应混合物中合成短RNA(约48nt的加帽的寡核苷酸)。用苯酚和氯仿对反应混合物进行提取，然后根据制造商的实验方案，使用旋转柱(spin column)(Ambion)将RNA与未掺入的核苷酸分离开。通过契仑科夫(Cerenkov)计数法来测定mRNA的浓度，其中将最终转录反应混合物中[α-32P]GTP的比放射性活度用于使cpm转换为pmol。
在于37℃温育45分钟的200-μl反应混合物中合成mRNA。温育后，将200-μl反应混合物在37℃下用3个单位的DNA酶RQ1(Promega)处理20分钟，并使用制造商的实验方案，用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)来纯化RNA。采用分光光度测定法来测定RNA的浓度。
实施例10
体外RNA脱帽测定法
使用加帽的48-nt寡核苷酸(萤光素酶mRNA的截短形式(48个核苷酸))作为底物来测量Dcp2活性。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达GST-hDcp2并进行纯化，如Z.Wang等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)所描述的。首先使加帽的寡核苷酸在37℃下在脱帽缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁、0.5mMMnCl2、2mM二硫苏糖醇和0.1mM精胺)中经历使用GST-hDcp2来进行的消化2小时。参见C.Piccirillo等人,"Functional characterization of the mammalian mRNA decappingenzyme hDcp2,"RNA,第9卷,第1138-1147页(2003)。然后，将反应混合物用等体积的苯酚提取一次和用氯仿提取两次，并且用乙醇来沉淀出RNA。将脱帽反应的产物进一步用核糖核酸酶的混合物(RiboShredder；Epicentre)在37℃下消化1小时。产物在4.6×250-mmPartisil 10SAX/25柱(Whatman)上通过阴离子交换HPLC进行解析。梯度的组成如下：水，1分钟；至112mM KH2PO4的线性梯度(pH 4.5)，20分钟；112-450mM KH2PO4的线性梯度，15分钟；450mM至1.5M KH2PO4的线性梯度，15分钟；和以1.5M KH2PO4的等度洗脱，9分钟；全部以1ml/分钟的流速。
实施例11
在HC11细胞中的翻译效率和mRNA衰变的测量
使用两种方法(电穿孔和核穿孔)来将RNA递送入细胞中。在电穿孔的情况下，用Bio-Rad GenepulserTM设备，以0.22kV和960μF，在Gene pulser杯池(cuvette)(4mm间隙)中，在总体积400μl的血清减少的RPMI 1640培养基中，将5μg RNA引入107个HC11细胞中。在放电后，细胞用PBS洗涤两次，在室温下以300×g离心2分钟，重悬浮在预热的完全培养基中，并放置于37℃。根据制造商的建议，用Amaxa Nucleofector II(Amaxa Biosystems)来进行核穿孔。使用Nucleofector溶液V和一套所建议的方案(程序T-024)，将1微克的RNA引入106个HC11细胞中。
为了测量翻译效率，将细胞划分入几个Eppendorf管中，放置在37℃的水浴中，并摇动。为了测量mRNA稳定性，将细胞分配入35-mm细胞培养皿中，并且放置于37℃和在5％CO2潮湿气氛中。在各个不同的时间处收获细胞，并用PBS洗涤两次。
为了细胞质RNA的提取，在175μl裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、140mMNaCl、1.5mM MgCl2、0.5％(v/v)Igepal(Sigma)和1mM二硫苏糖醇)中裂解2×105个细胞。RNA用RNeasy小型试剂盒来进一步进行纯化。为了蛋白质的提取，在200μl萤光素酶细胞培养物裂解试剂(Promega)中裂解2×105个细胞。根据制造商的实验方案(Promega)，测量细胞提取物的萤光素酶活性。
实施例12
多核糖体的制备
为了分离开核糖体亚基和起始复合物，用包含0.1mg/ml放线菌酮的冰冷的PBS处理4×106个HC11细胞2分钟，用相同的培养基洗涤两次，并且在600μl的0.3M NaCl、15mMTris-HCl(pH 7.6)、15mM MgCl2、1％Triton X-100、1mg/ml肝素和0.1mg/ml放线菌酮中进行裂解。在以14,000×g离心10分钟后，将上清液铺层在15-45％蔗糖梯度(在相同的但缺少Triton X-100的缓冲液中)上，并且在Beckman SW41Ti转子中于4℃以38,000rpm离心2小时。通过连续监测在260nm处的吸光度来使梯度分级分离。从每个级分(1ml)中分离出RNA，并通过实时PCR来进行分析。
实施例13
实时PCR
为了测量mRNA稳定性，将从HC11细胞中分离并用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化的约2μg每种总RNA样品在37℃下用3个单位的DNA酶RQ1(Promega)处理20分钟。在包含5.5mM MgCl2、500μM每种dNTP、2.5μM随机六聚体、0.2个单位的RNA酶抑制剂和0.8个单位的MultiScribe反转录酶(Applied Biosystems)的20-μl反应混合物中对400ng RNA进行反转录。将反应混合物于25℃温育10分钟，于48℃温育30分钟，和于95℃温育5分钟。使用以Beacon Designer工具(Bio-Rad)对于每种mRNA而设计的特异引物来进行定量实时PCR。关于检测萤光素酶mRNA的5’-末端的序列，引物为5’-CGTTCGGTTGGCAGAAGCTA-3’(SEQ ID NO:1)和5’-ACTGTTGAGCAATTCACGTTCATT-3’(SEQ ID NO:2)。从帽结构至3’-末端同聚物束的开始处，萤光素酶mRNA由1714个核苷酸组成。这些引物扩增出核苷酸226-398。使用引物5’-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3’(SEQ ID NO:3)和5’-GAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGA-3’(SEQ IDNO:4)，通过相同的方法和在相同的RNA样品中测量小鼠GAPDH mRNA水平。
用iCycler IQ实时PCR检测系统，在包含5μl转录反应混合物(50ng cDNA)、12.5μlIQ SYBRgreen Supermix和0.3mM引物(Bio-Rad)的25-μl反应混合物中进行扩增和检测。温育条件是在95℃下3分钟以用于聚合酶活化，以及在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。
使用如在关于ABI Prism 7700Sequence Detection System的第2号用户公报中所描述的绝对标准曲线方法来计算萤光素酶mRNA水平。在从标准曲线计算出萤光素酶mRNA的量后，将其对于每个样品中小鼠GAPDH mRNA的量进行标准化。将在每个时间点处存留的萤光素酶mRNA的量转换为在零时存在的RNA的百分比，并将结果以“log10([RNA])对时间”的形式进行作图以测定半寿期。为了分析来自多核糖体梯度的RNA，在RNA分离之前，向每个级分中添加体外合成的GFP mRNA作为内标以检验RNA产量的变化。使用GFP mRNA水平来使萤光素酶和GAPDH mRNA的水平标准化。
实施例14
对于eIF4E的结合亲和力
通过荧光猝灭来测定S类似物对于鼠类eIF4E的结合亲和力。在LS-50B分光荧光计(Perkin Elmer Co.)上，于20.0±0.2℃，在50mM HEPES/KOH(pH 7.2)、100mM KCl、0.5mMEDTA、1mM DTT中进行荧光滴定测量。向1.4ml的0.1蛋白质溶液中添加1μl浓度递增的帽类似物溶液的等份试样。考虑到样品稀释和内滤效应，对荧光强度(用2.5nm带宽在280nm处进行激发，和用4nm带宽和290nm截止滤光片在337nm处进行检测)进行修正。通过将荧光强度对于帽类似物总浓度的理论依赖性(theoretical dependence)与根据先前所描述的方程(参见A.Niedzwiecka等人,“Biophysical studies of eIF4E cap-binding protein:recognition of mRNA 5'cap structure and synthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1proteins,”J.Mol.Biol.,第319卷,第615-635页(2002))的实验数据点相拟合，来测定平衡缔合常数(KAS)。将蛋白质浓度作为显示“活性”蛋白质的量的平衡方程的自由参数进行拟合。将最终的KAS计算为3至10次独立滴定的加权平均值，其中将所述权重作为数值标准差平方的倒数。使用ORGIN 6.0(Microcal Software Inc.,USA)来进行数值非线性最小二乘回归分析。根据标准方程ΔG°＝-RTlnKAS，从KAS值来计算结合的吉布斯自由能。
实施例15
通过人和秀丽隐杆线虫(C.elegans)DcpS来进行的酶促水解
根据先前所描述的操作程序(L.S.Cohen等人,“Nematode m7GpppG and m3(2,2,7)GpppG decapping:activities in Ascaris embryos and characterization ofC.elegans scavenger DcpS,”RNA,第10卷,第1609-1624页(2004))，在大肠杆菌中表达人和线虫DcpS。这两种蛋白质都于-80℃在含有50mM KCl、0.2mM EDTA、1mM DTT、0.5mM PMSF和20％甘油的20mM Tris缓冲液(pH 7.5)中进行贮存。在37℃下，用5.0或7.0μl的在500μl含有20mM MgCl2和60mM(NH4)2SO4的50mM TRIS缓冲液(pH＝7.9)中的DcpS(分别来自人或秀丽隐杆线虫)处理浓度为1mM的合适的帽类似物60-90分钟。每15-20分钟从反应混合物中收集100μl样品，并通过在90℃下温育3分钟来使其失活。不经进一步处理，通过分析型RPHPLC来分析所收集的样品，其中在15分钟内使用在0.1M KH2PO4(pH＝6.0)中的0-50％甲醇线性梯度，并在260nm处进行UV-检测。
实施例16
帽依赖性翻译的抑制
将经微球菌核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物用于体外翻译(A.Cai等人,“Quantitative assessment of mRNA cap analogues as inhibitors of in vitrotranslation,”Biochemistry,第38卷,第8538-8547页(1999))。在100mM乙酸钾和1.4mM氯化镁时，取得最佳的帽依赖性翻译。为了测定由各种帽类似物引起的翻译的抑制，以5μg/ml的浓度向裂解物中添加天然的兔珠蛋白mRNA，并通过[3H]Leu的掺入来测量蛋白质合成。如先前所描述的(Cai等人，1999)，进行KI数据的标准化。使用λ＝255nm和εM＝22.6×10-3M，在pH 7.0下通过UV吸收来测量二核苷酸帽类似物溶液的浓度。
结果
实施例17
帽类似物的合成
导致获得在三磷酸链的α、γ和β位置处拥有硫代磷酸基团的类似物的合成途径分别描绘在图1、2和3中。
我们合成了一系列的6种帽类似物，其在5’,5’-三磷酸链的α、β或γ位置处携带有单个硫代磷酸部分。(参见下文)。由于致立体性(stereogenic)P-中心的存在，每种S-类似物以两种非对映异构体(根据它们在RP HPLC期间的洗脱顺序而命名为D1和D2)的混合物形式而获得。通过RP HPLC成功地对每种S-类似物进行了拆分，从而提供了12种化合物，随后对这12种化合物在生物物理学和生物化学方面进行了表征。这些S-类似物中的6种包含ARCA修饰，即在m7Guo部分中的2′-O-甲基，并因此称为S-ARCA。在β位置处引入硫代磷酸基团产生了对于Dcp2的抗性，增加了半寿期，和改善了翻译效率。
n.a.-未指定
S-ARCA的该化学合成是最初对于具有未修饰的5’,5’-多磷酸桥的帽类似物所开发的化学合成的修改形式。参见M.Kadokura等人,"Efficient synthesis ofγ-methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6RNAvia a new triphosphate bond formation involving activation of methylphosphorimidazolidate using ZnCl2as a catalyst in DMF under anhydrousconditions,"Tetrahedron Lett.,第38卷,第8359-8362页(1997)；J.Stepinski等人,"Synthesis and properties of mRNAs containing the novel"anti-reverse"capanalogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG,"RNA,第7卷,第1486-1495页(2001)；和J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues withsuperior translational properties,"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)。将两个单核苷酸种类(其中之一首先转化为反应性N-酰化咪唑衍生物)在DMF中进行偶联。通过8倍过量的ZnCl2来促进反应，所述8倍过量的ZnCl2显著地改善反应物在有机介质中的溶解度，防止N-酰化咪唑衍生物的水解，和加速反应速率。在该合成中的重要步骤是在DMF中在ZnCl2存在下合适的N-酰化咪唑衍生物与核苷5’-硫代磷酸或核苷5’-(2-硫代二磷酸)的偶联。在类似的、最近开发出的反应(其采用硫代磷酸阴离子(PSO3 3-)作为亲核体)中有效地获得中间体核苷5’-(2-硫代二磷酸)。参见J.Kowalska等人,“A simple and rapid synthesis ofnucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at the terminalposition of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett,第48卷,2007,5475-5479。我们所开发出的反应策略使得能够在多磷酸链的所选位置处引入硫代磷酸部分，以及产生中间体核苷5’-(2-硫代二磷酸)。
如上文所显示的和如在权利要求书中所使用的，称为“α”的磷酸部分是对于7-甲基鸟苷部分来说最远端的磷酸部分。称为“β”的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移动的方向上的下一个磷酸，和称为“γ”的位置是在朝向7-甲基鸟苷部分移动的方向上的下一个磷酸。在三磷酸ARCA中，如上文所显示的，“γ”是最靠近7-甲基鸟苷部分的磷酸。在四磷酸ARCA中，“δ”磷酸将“γ”与7-甲基鸟苷相隔开。(在没有7-甲基鸟苷部分的ARCA中，将会理解，应当修改前面的定义以换而涉及具有这样的位置的部分，即该位置类似于在本文所给出的实施例中的7-甲基鸟苷的位置)。
导致获得在5′,5′-三磷酸桥的α-位置处经修饰的类似物1和4(即，m7GpppSG和m2 7 ,2′-OGpppSG)的合成途径描绘在图1中。在这两个最后的偶联反应中，都使用了1.5至2倍过量的磷酸N-酰化咪唑(phosphorimidazolide)以确保核苷5′-硫代磷酸的完全消耗。偶联稳步地进行，这导致在1-2天内几乎完全消耗掉底物。在γ位置处经修饰的类似物3和6(即，m7GpSppG和m2 7,2′-OGpSppG)的合成(描绘在图2中)与上文所描述的相似。在每种情况下，如图2中所显示的那样，通过RP HPLC来指示两种非对映异构体的形成。中间体核苷5′-硫代磷酸9、10和11经过合适的核苷的硫代磷酸化来合成，所述硫代磷酸化于0℃在2,6-二甲基吡啶存在下在磷酸三甲酯中通过PSCl3来进行，类似于先前报道的操作程序(J.R.Moran等人,“Apractical enzymatic synthesis of(S[P])-adenosine 5'-O-(1-thiotriphosphate)((S[P])-ATP-á-S),”J.Org.Chem.,第49卷,第704-706页(1984))。在化合物10和11的情况下，N7位处的甲基化必须在硫代磷酸化步骤之前在核苷阶段进行，这是因为否则甲基碘优先使硫原子烷基化(未发表的发现)。通过采用2,2′-联硫基二吡啶/三苯膦活化体系，经过与咪唑的反应而容易地达到将核苷5′-二磷酸转化为其N-酰化咪唑衍生物(7、8和12-15)(T.Mukaiyama等人,“Phosphorylation by oxidation-reductioncondensation.Preparation of active phosphorylating reagents,”Bull.Chem.Soc.Jpn.,第44卷,第2284页(1971))。如图3中所描绘的那样，合成在β-位置处经修饰的类似物，即m7GppSpG(2)和m2 7,2′-OGppSpG(5)。最终的偶联的HPLC分析揭示了两种P-非对映异构体的形成。但是，它们的保留时间非常相似。为了获得中间体核苷5′-O-(2-硫代二磷酸)16和17，我们采用了最近开发出的在核苷5′-单磷酸N-酰化咪唑和作为亲核体的硫代磷酸(PSO3 3-)三乙基铵盐之间的偶联反应(J.Kowalska等人,“A simple and rapidsynthesis of nucleotide analogues containing a phosphorothioate moiety at theterminal position of the phosphate chain”,Tetrahedron Lett,第48卷,2007,5475-5479)。
在所有导致获得帽类似物1-6的反应中，HLPC分析都揭示，作为主要产物形成了所希望的化合物，只有适度量的副产物。尽管如此，制备性的产量令人惊讶地低于由HPLC所指示的那些，在总体10-20％的范围内。这可能是由于在长时间的通过RP HPLC来分离开非对映异构体的过程中材料的大量损失所致，RP HPLC在许多情况下重复进行以便获得非对映异构体纯的样品。
实施例18
体外脱帽反应
我们就通过重组hDcp2的水解而测试了用任一种S-ARCA帽化的寡核苷酸，以测试用m2 7,2’-OGpppSG和m2 7,2’-OGppSpG的各种非对映异构体帽化的mRNA在它们对于通过Dcp1/Dcp2的切割的敏感性方面是否不同。一般地，参见，Z.Wang等人,"The hDcp2protein is amammalian mRNA decapping enzyme,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第99卷,第12663-12668页(2002)；和Z.Wang等人,"An mRNA Stability Complex Functions with Poly(A)-Binding Protein To Stabilize mRNA In Vitro",Mol.Cell.Biol.,第19卷,第4552-4560页(1999)。所使用的帽类似物在最初是未标记的，因此为了追踪消化反应的产物，我们在[α-32P]GTP和DNA模板(其中G是在启动子之后指定的第一个核糖核苷酸)存在下合成了加帽的寡核苷酸。用所述S-ARCA中的任一种帽化的寡核苷酸经历体外Dcp2消化，之后用核糖核酸酶混合物(来自Epicenter的RiboShredder)进一步消化所述产物。通过最近邻转移(nearest-neighbor transfer)，在核糖核酸酶消化后，在G残基的5’-侧处的任意核苷酸获得32P-标记的3’-磷酸基团。然后，使用阴离子交换色谱法将在RNA中的内部位置处的经标记的3’-核苷单磷酸(3’-NMP*)与经标记的5’-末端产物解析开(图6)。后者分别包括源自未帽化的转录物的p3Gp*和m2 7,2’-OGp3Gp*(当使用m2 7,2’-OGp3G时)，或者由对于酶促切割具有抗性或不具有抗性的帽化的RNA而产生的pGp*。所使用的所有帽类似物是ARCA，其确保它们仅以正确的方向掺入RNA中。这进一步保证了，在核糖核酸酶处理后只观察到一种5’-末端产物(m2 7,2’-OGp3Gp*)。未帽化的RNA不是Dcp2的底物，这解释了为什么在Dcp2消化后观察到p3Gp*产物。
为了确定哪些帽类似物保护mRNA免于hDcp2切割，我们用重组hDcp2消化加帽的、32P-标记的短RNA，其中采用这样的条件，即在所述条件下(i)用m2 7,2’-OGp3G帽化的寡核苷酸完全被hDcp2消化(图6A)，和(ii)用m2 7,3’-OGppCH2pG帽化的寡核苷酸具有抗性(图6B)。先前显示，m2 7,3’-OGppCH2pG保护mRNA免于hDcp2降解。参见E.Grudzien等人,"Differentialinhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。我们发现，只有m2 7,2’-OGppSpG的D2异构体使RNA对于hDcp2水解保持稳定(图6F)。用m2 7,2’-OGpppSG和m2 7,2’-OGpSppG的异构体帽化的寡核苷酸不显示在对于hDcp2的稳定性方面的增加(图6C、6D、6G和6H)。
实施例19
用硫代磷酸帽类似物帽化的mRNA的5’降解
由于用m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的短RNA对于hDcp2水解具有抗性，我们预测，该帽类似物的存在会影响细胞中mRNA的稳定性。我们使用核穿孔或电穿孔来将合成的萤光素酶mRNA引入HC11小鼠乳腺上皮细胞中。这些方法允许几乎紧接在放电后，就测量细胞中的萤光素酶合成和萤光素酶mRNA水平。对于电穿孔，我们使用先前优化的条件。参见E.Grudzien等人，"Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel capanalogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。对于核穿孔，我们遵循由AmaxaBiosystems建议的条件(参见“材料和方法”)。由于Amaxa实验方案给出了最高的转染效率以及还有最高的细胞生存力，因而其被用于本文所描述的大多数实验。
在体外合成了包含各种5’-末端帽和3’-末端60-nt poly(A)束的萤光素酶mRNA(Luc-A60)。在核穿孔后，以直至90分钟的间隔取出细胞以便测量翻译效率，其中使用萤光素酶活性增加的速率；或者以直至8小时的间隔取出细胞以通过实时PCR来测量萤光素酶mRNA稳定性。如果从包含经翻译的和未翻译的mRNA两者的细胞中回收mRNA，那么翻译效率和mRNA稳定性的测定可能会是错误的。为了解决这个问题，我们测定了总胞质mRNA的降解速率，相比于多核糖体mRNA。将用m2 7,2’-OGp3G帽化的萤光素酶mRNA核穿孔入HC11细胞中，然后在各个不同时间处裂解所述细胞并且铺层在蔗糖梯度上以将多核糖体与起始复合物分离开。合并多核糖体级分，并纯化RNA。为了追踪胞质mRNA降解，我们使用从总细胞提取物中分离出的mRNA。在这两种情况下，均使用针对荧光素酶mRNA的5’-末端的引物对，通过实时PCR来定量萤光素酶mRNA。
与多核糖体相联合的转录物以大约与总胞质mRNA相同的速率被降解(数据未显示)。这暗示，即使在任何给定时间处存在经翻译的和未翻译的荧光素酶mRNA池(pool)，但mRNA在它们之间自由交换。该观察结果验证了翻译效率和降解速率的测量结果。
在核穿孔入HC11细胞中后，测定了用各种S-ARCA帽化的Luc-A60的稳定性。通过实时PCR测定了在各个不同时间处存留在细胞中的mRNA。用m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的Luc-A60(t1/2＝257分钟)比用天然帽m7Gp3G(t1/2＝86分钟)或亲本化合物m2 7,2’-OGp3G(t1/2＝155分钟)帽化的mRNA更为稳定(图7和表2)。这暗示，mRNA稳定性的增加是由于对于通过Dcp1/Dcp2的水解的抗性而引起的。m2 7,2’-OGpppSG(D1)(t1/2＝169分钟)和m2 7,2’-OGppSpG(D1)(t1/2＝185分钟)都没有赋予比m2 7,2’-OGp3G(t1/2＝155分钟)显著更大的稳定性(表2)。值得注意的是，m2 7,2’-OGpppSG(D1)和m2 7,2’-OGppSpG(D1)对于eIF4E的亲和力都为m2 7,2’-OGp3G的3倍。人们可能预期，用这些类似物帽化的mRNA将会更稳定，如果关于eIF4E和Dcp1/Dcp2之间的竞争的假说是正确的话。参见E.Grudzien等人,"Differential inhibition of mRNAdegradation pathways by novel cap analogs,"J.Biol.Chem.,第281卷,第1857-1867页(2006)。对于用这些类似物帽化的mRNA，我们没有观察到稳定性或翻译效率的增加(参见下文)。这可以表明，虽然m2 7,2’-OGpppSG(D1)和m2 7,2’-OGppSpG(D1)更强地结合eIF4E，但存在有上限，超过了该上限，对于eIF4E的高亲和力不加速总体翻译。根据这个解释，当帽结合的速率变得足够高时，蛋白质合成起始中的一些其他步骤就成为是限速的。
实施例20
在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA的翻译效率
对于用S-ARCA帽化萤光素酶mRNA，我们还测定了在培养的细胞中的翻译效率。这涉及在核穿孔后的各个不同时间处进行的两个测量：在经澄清的细胞裂解物中通过发光测定法而测量的萤光素酶活性，和通过实时PCR而测量的Luc-A60水平。通过已被递送入细胞中的萤光素酶mRNA的量来使萤光素酶活性标准化。为了测定在紧接于核穿孔后的时间处(即在出现任何衰变之前)在细胞中存在的RNA的量，在核穿孔后2至8小时的各个不同时间处收获细胞，并且提取胞质RNA。使用扩增5’-末端附近序列的引物，通过实时PCR来测量萤光素酶mRNA的量。将在每个时间点处存留的萤光素酶mRNA以“log10([RNA])对时间”的形式进行作图以测定t1/2。将曲线外推至0小时，并计算出递送入细胞中的RNA的量。我们定义了这样的条件，在所述条件下，在～30分钟的最初的延滞期后，萤光素酶的积累随着时间是线性的，所述延滞期用于将mRNA募集至核糖体，完成第一条多肽链，和将萤光素酶释放到细胞溶胶中。
用m2 7,2’-OGppSpG(D1)和m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的Luc-A60mRNA以分别为用m7Gp3G帽化的mRNA的2.8倍和5.1倍的程度更有效地进行翻译(图8和表2)。对于在兔网织红细胞裂解物体系中的无细胞翻译，用m2 7,2’-OGppSpG(D1)和m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的Luc-A60mRNA仅以为用m7Gp3G帽化的Luc-A60mRNA的2.3倍的程度更有效地进行翻译(数据未显示)。该差异暗示，在培养的细胞中翻译效率的增加与更高的mRNA稳定性(其不是无细胞翻译体系的因素)相关，这是因为只有用对于hDcp2具有抗性的类似物帽化的mRNA被更有效地翻译。
表2
在HC11细胞中具有硫代磷酸帽类似物的萤光素酶mRNA的翻译效率和稳定性
a在20℃下小鼠eIF4E(氨基酸28-217)与各种帽类似物的相互作用的平衡缔合常数。在大肠杆菌中表达小鼠eIF4E(残基28-217)，并且进行荧光时间同步滴定(fluorescence time-synchronized titration)，如在J.Zuberek等人,"Phosphorylationof eIF4E attenuates its interaction with mRNA cap analogs by electrostaticrepusion:Intein-mediated protein ligation strategy to obtain phosphorylatedprotein,"RNA,第9卷,第52-61页(2003)；和A.Niedzwiecka等人,"Biophysical studiesof eIF4E cap-binding protein:recognition of mRNA 5'cap structure andsynthetic fragments of eIF4G and 4E-BP1proteins,"J.Mol.Biol.,第319卷,第615-635页(2002)中所描述的。
b使用图4的数据来估计用各种类似物帽化的寡核苷酸对于hDcp2水解的易感性。将在44分钟处(未消化的帽)和在38分钟处(pGp*)洗脱出的峰中的放射性活度对于背景放射性活度进行修正，并相加以代表帽中的总放射性活度。通过作为总放射性活度的百分比来表示的在pGp*中的放射性活度来给出Dcp2易感性。(ND)未测定。
c通过实时PCR(其使用针对萤光素酶mRNA的5’-末端的引物)来测定用所示的类似物帽化的Luc-A60mRNA中5’-末端序列的降解。
d显示了在HC11细胞中用所示的帽类似物帽化的Luc-A60mRNA的翻译效率。通过细胞中萤光素酶RNA的量来对萤光素酶活性进行标准化。如由J.Jemielity等人,"Novel'anti-reverse'cap analogues with superior translational properties"RNA,第9卷,第1108-1122页(2003)所描述的，计算出相对翻译效率。
*指明了与用m2 7,2’-OGp3G帽化的mRNA显著不同(p<0.05)的半寿期。
实施例21
在HC11细胞中用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA更有效地被募集至多核糖体
我们采用了独立的方法来验证这样的观察结果：用m2 7,2’-OGppSpG帽化的mRNA更有效地被翻译，即它们的多核糖体分布(图9A-9E)。相对于延伸或终止而言起始的速率的增加导致mRNA从较轻的多核糖体移动至较重的多核糖体。参见H.Lodish,"Model for theregulation of mRNA translation applied to haemoglobin synthesis,"Nature,第251卷,第385-388页(1974)。未预期帽结构的类型会影响延伸的速率。因此，移动至更高的多核糖体表明了更快的起始。
将用m7Gp3G、m2 7,2’-OGp3G或m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的Luc A60mRNA电穿孔入HC11细胞中。在电穿孔后4小时，裂解这些细胞，并将经澄清的上清液铺层在蔗糖梯度上以将多核糖体与起始复合物分离开。萤光素酶mRNA主要地存在于多核糖体中(图9A和9B，级分6-11)，尽管有些也存在于起始复合物的区域中(级分3-5)。小的萤光素酶mRNA存在于未翻译的信使核糖核蛋白复合物(mRNP)池中(图9A和9B，级分1-2)。用标准ARCA即m2 7,2’-OGp3G帽化的mRNA移动至更高的多核糖体(图9C)。然而，用m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的mRNA移动至更加高的多核糖体，并且同时从mRNP区域中丢失(图9D)。在相同的实验条件下，内源的GAPDH mRNA被有效地翻译(图9E)，尽管有些也沉积在起始复合物的区域中。总之，这些结果暗示，萤光素酶转录物的5’-末端处m2 7,2’-OGppSpG(D2)的存在增加它们的起始速率，从而确认了基于萤光素酶活性的积累的结果。
实施例22
S-ARCA萤光素酶mRNA的更大的稳定性和更大的翻译效率的组合在HC11细胞中产生更多的总体蛋白质表达
我们还测定了通过其酶促活性来测量的总的萤光素酶积累，作为关于用m2 7,2’- OGp3G、m2 7,2’-OGppSpG(D1)和m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的mRNA的时间的函数。对HC11细胞进行核穿孔，然后在直至10小时的各个不同时间处进行裂解。将在上清液中测量得到的萤光素酶活性对于递送入细胞中的Luc-A60的量进行标准化。如图10中所显示的，HC11细胞中的萤光素酶活性在3小时处达到最大，然后在经过10小时下降至1/10。表达的动力学与荧光素酶蛋白质的半寿期(其为约180分钟)(参见J.Thompson等人,"Modulation of fireflyluciferase stability and impact on studies of gene regulation,"Gene,第103卷,第171-177页(1991))和各种萤光素酶mRNA的半寿期(其分别为155、185和257分钟)相一致。对于用m2 7,2’-OGppSpG(D2)帽化的Luc-A60(其具有最高的翻译效率和最大的稳定性)来说，大多数萤光素酶发生积累。预测对于具有更长半寿期的蛋白质来说，来自用该类似物帽化的mRNA的总体蛋白质表达的增加是更加大的。
实施例23
对于eIF4E的结合亲和力
所述S-类似物的KAS值和结合自由能(ΔG°)，以及关于它们的未修饰的亲本化合物的同样的数据显示在表3中。令人惊讶地，不但硫代磷酸部分的存在没有降低对于eIF4E的结合亲和力，而且在有些情况下，亲和力还显著增加了。KAS值强烈地依赖于硫代磷酸修饰的位置和在不对称P-中心周围的绝对构型。有趣的是，在每对非对映异构体中，D1成员以D2成员或亲本类似物的2.3至4.5倍的亲和力与eIF4E结合。例如，m2 7,2'-OGpSppG的D1异构体的KAS为D2或m2 7,2'-OGpppG的3倍。类似地，m2 7,2'-OGppSpG的D1异构体的KAS为D2的2倍和为m2 7,2'- OGpppG的4.5倍。对于γ-修饰的类似物，观察到最大的在D1/D2非对映异构体之间的结合亲和力的差异。在另一个方面，对于β-取代的类似物，观察到最大的在经修饰的和未修饰的对之间的差异。
表3
鼠类eIF4E(28-217)与硫代磷酸帽类似物的结合的平衡缔合常数(KAS)和结合自由能(ΔG°)，其通过荧光猝灭来测定。
**对于非对映异构体混合物所测定的
实施例24
对于通过人和秀丽隐杆线虫DcpS的酶促水解的易感性
使新系列的S-类似物经历由来自人和秀丽隐杆线虫来源的DcpS所催化的体外酶促水解。在所有实验中，将相应的未修饰的帽类似物用作阳性对照，即对于非ARCA S-类似物来说为m7GpppG，和对于S-ARCA来说为m2 7,2′-OGpppG。优化DcpS酶的量以提供在40-90分钟内对照底物的完全降解。通过RP HPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收集的样品(如在“材料和方法”中所描述的)。
在表4中，在导致于40-90分钟内未修饰的亲本化合物(即，对于非ARCA S-类似物来说为m7GpppG，和对于ARCA来说为m2 7,2′-OGpppG)完全降解的条件下，使4μM浓度的帽类似物经历通过DcpS的酶促消化。如在“材料和方法”中所描述的，采用在260nm处的UV检测通过RPHPLC来分析以各个不同时间间隔从反应混合物中收集的样品。在表4中，被指定为“具有抗性”的类似物在所应用的条件下保持完全未被消化，而被指定为“被水解”的类似物以与各自未修饰的亲本化合物相当的效率被DcpS水解。发现在γ-位置处经修饰的S-类似物对于水解具有抗性，这不依赖于P-中心绝对构型(表4)。即使将反应时间延长至24小时，使用各种不同的酶量，和修改反应缓冲液的组成，结果也不变。所有其他S-类似物以与未修饰的亲本类似物相当的效率被hDcpS水解。对于通过来自人和秀丽隐杆线虫来源的DcpS来进行的S-类似物水解，没有观察到显著的差异。
对在α-位置处经修饰的类似物的DcpS降解产物的分析使得我们能够确定它们在不对称P-中心周围的绝对构型。我们发现，通过DcpS来进行的m7GpppSG(D1)或m7GpppSG(D2)的水解导致获得m7GMP和鸟苷5′-O-(1-硫代二磷酸)(GDPαS)的D1或D2异构体，而m2 7,2′- OGpppSG(D1)或m2 7,2′-OGpppSG(D2)的水解导致获得m2 7,2′-OGMP和GDPαS的D1或D2异构体(数据未显示)。
表4
S-类似物在体外对于通过DcpS(来自人和秀丽隐杆线虫)的酶促水解的易感性
实施例25
作为帽依赖性翻译的抑制剂的帽类似物
在用天然兔珠蛋白mRNA进行规划的兔网织红细胞裂解物体系中检验了所述新的S-类似物抑制帽依赖性翻译的能力。在所述12种S-类似物中，选择出在γ-位置处经修饰的两种，即m7GpSppG(D1)和m7GpSppG(D2)，这是因为发现它们对于DcpS具有抗性和因为它们在体内可能更稳定。将关于翻译抑制的数据与理论曲线相拟合，所述理论曲线描述了作为mRNA结合的竞争性抑制剂的函数的帽依赖性翻译(Cai等人,1999)。这使得我们能够测定KI，即在帽依赖性翻译被抑制50％时的帽类似物浓度(表5)。发现这两种S-类似物都是比m7GpppG更好的帽依赖性翻译的抑制剂，这构成了关于硫代磷酸部分通常使帽-eIF4E相互作用稳定化的额外的证据。此外，m7GpSppG(D1)比其D2对应物显著地更具有抑制性(KI＝4.1±0.2μM对KI＝12.1±3.2μM)，这与其更高的对于eIF4E的结合亲和力(KAS＝30.8±0.5对KAS＝10.0±0.2)相一致。
表5
在兔网织红细胞切割液翻译体系中通过γ-修饰的S-类似物的帽依赖翻译的抑制的抑制常数(KI)
实施例26
作为帽依赖性翻译的体内抑制剂的用S-ARCA帽化的mRNA片段
S-ARCA，尤其是其中硫代磷酸修饰出现在γ位置处的三磷酸，例如在实施例17下的化合物6a和6b的未来应用可能是作为帽依赖性翻译的抑制剂。已充分证明，在癌细胞中帽依赖性翻译被上调，并且eIF4E的下调逆转恶性表型。在可能出现完全降解成核苷酸之前，当它们达到小于25nt的长度时，由于加帽的mRNA的3’→5’降解而产生的片段必须进行脱帽。预期用在γ位置处包含硫代磷酸修饰的三磷酸S-ARCA帽化的此类片段对于DcpS具有抗性，类似于对于帽二核苷酸自身所显示的(表4，见上)。因此，预期他们在细胞中积累并且与正常mRNA竞争募集至翻译机器。我们将用在γ位置处进行取代的三磷酸S-ARCA(在实施例17下的化合物6a和6b)帽化的mRNA或mRNA片段引入培养的细胞中。然后，我们使用报道构建体来测量帽依赖性翻译对帽非依赖性翻译。我们预期前者优先被抑制。应当注意的是，ARCA修饰是在掺入mRNA中后这些S-ARCA的正确方向所必需的，这是因为否则硫代磷酸部分可能不处于使得mRNA片段对于DcpS具有抗性的正确位置。
类似地，我们分析作为帽依赖性翻译的潜在抑制剂的四磷酸S-ARCA。我们预期，四磷酸S-ARCA，尤其是包含δ-硫代磷酸基团的那些，将不会在生理条件下被DcpS水解，并且将会抑制帽依赖性翻译。
实施例27
权利要求书详细说明了三磷酸和四磷酸帽类似物二核苷酸的硫代磷酸修饰的所有组合，类似于下面所列出的那些。m7Guo的核糖部分的修饰是2’-脱氧、3’-脱氧、阿拉伯糖、2’-O-乙基和3’-O-乙基。G的7-取代基的修饰是甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基和其他经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。鸟嘌呤部分的修饰是使用腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶或m7G。可以合成这些各种修饰物，如本申请中所公开的和另外从本领域(例如美国专利申请公开2003/0194759)已知的方法改编的。
本说明书中所引用的所有参考文献的全部公开内容通过提及而合并入本文。还通过提及而合并入了关于本发明者自己工作的下列出版物的全部公开内容，其不是本申请的现有技术：J.Kowalska等人,“Synthesis and characterization of mRNA cap analogscontaining phosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and areresistant to the decapping pyrophosphatase DcpS,”RNA,第14卷,第1119-1131页(2008)；E.Grudzien-Nogalska等人,“Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNAand increase translational efficiency in mammalian cells,”RNA,第13卷,第1745-1755页(2007)；和E.Darzynkiewicz等人,“Methylene and phosphorothioate capdinucleotides:useful tools to study decapping and translantion”,提交给RNAMeeting,Seattle,Washington,June 20-25,2006的摘要和海报。但是，在另外出现相矛盾的冲突的情形下，应当以本说明书为准。
本发明的一些实施方案如下：
1.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
n是3或4；和
如果R1是OH，那么R2不是OH。
2.实施方案1中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
3.实施方案1中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
4.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案1的组合物。
5.用于在体外合成实施方案4中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
6.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
7.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案4中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
8.实施方案1中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
9.实施方案1中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
10.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案8中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
11.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
n是3或4；和
如果R1是OH，那么R2不是OH；
和B选自
12.实施方案11中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
13.实施方案11中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
14.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案11的组合物。
15.用于在体外合成实施方案14中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
16.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
17.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案14中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
18.实施方案11中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
19.实施方案11中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
20.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案17中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
21.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
n是3或4；和
如果R1是OH，那么R2不是OH；和
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。
22.实施方案21中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
23.实施方案21中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
24.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案21的组合物。
25.用于在体外合成实施方案24中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
26.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
27.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案24中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
28.实施方案21中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
29.实施方案21中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
30.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案28中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
31.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；
n是3或4；
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团。
32.实施方案31中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
33.实施方案31中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
34.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案31的组合物。
35.用于在体外合成实施方案34中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
36.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案34中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
37.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案34中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
38.实施方案31中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
39.实施方案31中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
40.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案38中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
41.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；和
n是3或4；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。
42.实施方案41中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
43.实施方案41中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
44.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案41的组合物。
45.用于在体外合成实施方案44中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
46.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案44中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
47.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案44中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
48.实施方案41中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
49.实施方案41中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
50.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案48中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
51.组合物，其包含
其中：
每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；和
n是3或4。
52.实施方案51中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
53.实施方案51中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
54.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案51的组合物。
55.用于在体外合成实施方案54中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
56.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案54中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
57.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案54中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
58.实施方案51中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
59.实施方案51中所描述的组合物；其中n是3并且所述组合物包含γ-硫代磷酸基团，或者其中n是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
60.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5'末端掺入有实施方案58中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
61.组合物，其包含一种或多种选自下列的化合物：m2 7,2′-OGppspG；m2 7,3′-OGppspG；m2 7,2′-OGpppspG；m2 7,3′-OGpppspG；m2 7,2′-OGppsppG；m2 7,3′-OGppsppG；m2 7,2′-OGpspspG；m2 7,3′- OGpspspG；m2 7,2′-OGppspsG；m2 7,3′-OGppspsG；bn7m2′-OGppspG；bn7m3′-OGppspG；bn7m2′-OGpppspG；bn7m3′-OGpppspG；bn7m2′-OGppsppG；bn7m3′-OGppsppG；bn7m2′-OGpspspG；bn7m3′-OGpspspG；bn7m2′- OGppspsG；和bn7m3′-OGppspsG。
62.实施方案61中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由所述化合物之一的单种立体异构体组成。
63.实施方案61中所描述的组合物，其中所述组合物包含所述化合物之一的至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
64.RNA分子，其5'末端掺入有实施方案61的组合物。
65.用于在体外合成实施方案64中所描述的RNA分子的方法，所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
66.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译实施方案64中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
67.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将实施方案64中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
序列表
<110> Board of Supervisors of Louisiana State University and
Agricultural and Mechanical College
Jemielity, Jacek
Grudzien-Nogalska, Ewa M.
Kowalska, Joanna
Darzynkiewicz, Edward
Rhoads, Robert E.
<120> 信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途
<130> Jemielity 07S01W
<140> PCT/US2008/______
<141> 2008-06-19
<150> 60/944,842
<151> 2007-06-19
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
cgttcggttg gcagaagcta 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
actgttgagc aattcacgtt catt 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
caatgtgtcc gtcgtggatc t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 4
gaagagtggg agttgctgtt ga 22
Claims (35)
1.具有下列结构之一的化合物用于制造通过掺入RNA的5'末端来增加所述RNA的翻译效率的试剂的用途：
其中：
n是3，且
α位置的Y是O，
β位置的Y是S，且
γ位置的Y是O；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
如果R1是OH，那么R2不是OH；
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。
2.权利要求1的用途，其中所述化合物具有下述结构：
3.权利要求1的用途，其中所述化合物具有下述结构：
其中B选自：
4.权利要求1的用途，其中所述化合物是m2 7,2′-OGppspG。
5.权利要求1至4中任何一项的用途，其中所述化合物基本上由单种立体异构体组成。
6.权利要求5的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第一非对映异构体D1的立体化学构型。
7.权利要求5的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第二非对映异构体D2的立体化学构型。
8.权利要求1至4中任何一项的用途，
其中所述化合物为至少两种非对映异构体，第一非对映异构体D1和第二非对映异构体D2的混合物；
其中除了所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在其他方面是相同的；
其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
9.权利要求1至4中任何一项的用途，其中所述化合物在生理条件下不被Dcp2水解。
10.具有下列结构之一的化合物用于制造具有增加的翻译效率的在5'末端掺入有所述化合物的RNA分子的用途：
其中：
n是3，且
α位置的Y是O，
β位置的Y是S，且
γ位置的Y是O；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
如果R1是OH，那么R2不是OH；
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。
11.权利要求10的用途，其中所述化合物具有下述结构：
12.权利要求10的用途，其中所述化合物具有下述结构：
其中B选自：
13.权利要求10的用途，其中所述化合物是m2 7,2′-OGppspG。
14.权利要求10至13中任何一项的用途，其中所述化合物基本上由单种立体异构体组成。
15.权利要求14的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第一非对映异构体D1的立体化学构型。
16.权利要求14的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第二非对映异构体D2的立体化学构型。
17.权利要求10至13中任何一项的用途，
其中所述化合物为至少两种非对映异构体，第一非对映异构体D1和第二非对映异构体D2的混合物；
其中除了所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在其他方面是相同的；
其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
18.权利要求10至13中任何一项的用途，其中所述化合物在生理条件下不被Dcp2水解。
19.用于以增加的翻译效率在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在无细胞蛋白质合成体系中翻译在5'末端掺入有具有下列结构之一的化合物的RNA分子：
其中：
n是3，且
α位置的Y是O，
β位置的Y是S，且
γ位置的Y是O；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
如果R1是OH，那么R2不是OH；
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的，
其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述翻译在有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽的条件下进行。
20.权利要求19的方法，其中所述化合物具有下述结构：
其中B选自：
21.权利要求19的方法，其中所述化合物是m2 7,2′-OGppspG。
22.权利要求19至21中任何一项的方法，其中所述化合物基本上由单种立体异构体组成。
23.权利要求22的方法，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第一非对映异构体D1的立体化学构型。
24.权利要求22的方法，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第二非对映异构体D2的立体化学构型。
25.权利要求19至21中任何一项的方法，
其中所述化合物为至少两种非对映异构体，第一非对映异构体D1和第二非对映异构体D2的混合物；
其中除了所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在其他方面是相同的；
其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
26.权利要求19至21中任何一项的方法，其中所述化合物在生理条件下不被Dcp2水解。
27.在5'末端掺入有具有下列结构之一的化合物的RNA分子在制备试剂中的用途：
其中：
n是3，且
α位置的Y是O，
β位置的Y是S，且
γ位置的Y是O；
R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；
如果R1是OH，那么R2不是OH；
B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶；和
X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的C1至C10脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的，
所述试剂用于在以增加的翻译效率体内合成蛋白质或肽的方法中使用，
所述方法包括将所述RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述引入在有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽的条件下进行。
28.权利要求27的用途，其中所述化合物具有下述结构：
其中B选自：
29.权利要求27的用途，其中所述化合物是m2 7,2′-OGppspG。
30.权利要求27至29中任何一项的用途，其中所述化合物基本上由单种立体异构体组成。
31.权利要求30的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第一非对映异构体D1的立体化学构型。
32.权利要求30的用途，其中所述单种立体异构体在硫代磷酸基团上具有对应于m2 7,2′- OGppspG的第二非对映异构体D2的立体化学构型。
33.权利要求27至29中任何一项的用途，
其中所述化合物为至少两种非对映异构体，第一非对映异构体D1和第二非对映异构体D2的混合物；
其中除了所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一非对映异构体D1和所述第二非对映异构体D2在其他方面是相同的；
其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
34.权利要求27至29中任何一项的用途，其中所述化合物在生理条件下不被Dcp2水解。
35.权利要求27至29中任何一项的用途，其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94484207P | 2007-06-19 | 2007-06-19 | |
| US60/944,842 | 2007-06-19 | ||
| CN200880102959.9A CN101855231B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880102959.9A Division CN101855231B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107501370A CN107501370A (zh) | 2017-12-22 |
| CN107501370B true CN107501370B (zh) | 2021-06-18 |
Family
ID=40156965
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410246751.1A Active CN104072561B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
| CN200880102959.9A Active CN101855231B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
| CN201710815709.0A Active CN107501370B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410246751.1A Active CN104072561B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
| CN200880102959.9A Active CN101855231B (zh) | 2007-06-19 | 2008-06-19 | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8153773B2 (zh) |
| EP (1) | EP2167523B1 (zh) |
| CN (3) | CN104072561B (zh) |
| AU (1) | AU2008265683B2 (zh) |
| CA (1) | CA2692906C (zh) |
| CY (1) | CY1115525T1 (zh) |
| DK (1) | DK2167523T3 (zh) |
| EA (1) | EA017740B1 (zh) |
| ES (1) | ES2500515T3 (zh) |
| HK (1) | HK1200461A1 (zh) |
| HR (1) | HRP20140771T1 (zh) |
| PL (1) | PL2167523T3 (zh) |
| PT (1) | PT2167523E (zh) |
| SI (1) | SI2167523T1 (zh) |
| WO (1) | WO2008157688A2 (zh) |
Families Citing this family (166)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8304529B2 (en) * | 2006-07-28 | 2012-11-06 | Life Technologies Corporation | Dinucleotide MRNA cap analogs |
| WO2009058911A2 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Applied Biosystems Inc. | Preparation and isolation of 5' capped mrna |
| EP2281579A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-09 | BioNTech AG | Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA |
| CN101671669B (zh) * | 2009-08-27 | 2012-05-02 | 浙江大学 | 一种肝癌靶向性基因表达元件ae及其应用 |
| US8822663B2 (en) | 2010-08-06 | 2014-09-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CN104531671A (zh) | 2010-10-01 | 2015-04-22 | 现代治疗公司 | 设计核酸及其使用方法 |
| CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| BR112014007852B1 (pt) | 2011-10-03 | 2021-11-03 | Moderna Therapeutics, Inc | Polinucleotídeo isolado modificado e composição farmacêutica |
| AU2012352180A1 (en) | 2011-12-16 | 2014-07-31 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
| RU2639277C2 (ru) | 2012-02-29 | 2017-12-20 | Сангамо Байосайенсиз, Инк. | Способы и составы лечения болезни хантингтона |
| US9254311B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| WO2013151672A2 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| RS63237B1 (sr) | 2012-11-26 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Terminalno modifikovana rnk |
| WO2014130955A1 (en) | 2013-02-25 | 2014-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| US10023626B2 (en) | 2013-09-30 | 2018-07-17 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| JP2016538829A (ja) | 2013-10-03 | 2016-12-15 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド |
| AU2014346424B2 (en) | 2013-11-11 | 2020-09-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treating Huntington's Disease |
| SI3492593T1 (sl) | 2013-11-13 | 2022-03-31 | Children's Medical Center Corporation | Reguliranje izražanja genov s posredovanjem nukleaze |
| DK3080274T3 (da) | 2013-12-09 | 2020-08-31 | Sangamo Therapeutics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til genom-manipulation |
| EP3540060A1 (en) | 2013-12-30 | 2019-09-18 | CureVac AG | Methods for rna analysis |
| WO2015101416A1 (en) | 2013-12-30 | 2015-07-09 | Curevac Gmbh | Methods for rna analysis |
| WO2015117081A2 (en) | 2014-02-03 | 2015-08-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia |
| EP3119878B1 (en) | 2014-03-18 | 2021-05-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression |
| US9522936B2 (en) | 2014-04-24 | 2016-12-20 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered transcription activator like effector (TALE) proteins |
| JP2017515819A (ja) | 2014-05-08 | 2017-06-15 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | ハンチントン病を処置するための方法および組成物 |
| CA2947622A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing methods and compositions for prevention or treatment of a disease |
| WO2015188056A1 (en) | 2014-06-05 | 2015-12-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease design |
| ES2727776T3 (es) | 2014-06-10 | 2019-10-18 | Curevac Ag | Método para mejorar la producción de ARN |
| WO2016014837A1 (en) | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene editing for hiv gene therapy |
| WO2016019144A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
| US10889834B2 (en) | 2014-12-15 | 2021-01-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration |
| US20180112213A1 (en) | 2015-03-25 | 2018-04-26 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods, compositions and components |
| ES2959608T3 (es) | 2015-04-03 | 2024-02-27 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Composición y métodos de edición del genoma de células B |
| SG11201707832RA (en) | 2015-04-22 | 2017-11-29 | Curevac Ag | Rna containing composition for treatment of tumor diseases |
| US11390884B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-07-19 | Editas Medicine, Inc. | Optimized CRISPR/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
| AU2016262521A1 (en) | 2015-05-11 | 2017-12-14 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS |
| US10808020B2 (en) | 2015-05-12 | 2020-10-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
| DE202016009003U1 (de) | 2015-05-29 | 2021-05-28 | Curevac Real Estate Gmbh | Zusammensetzung umfassend in vitro transkribierte RNA erhältlich durch ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von RNA mit mindestens einem Schritt mit einer tangentialen Flussfiltration |
| AU2016276702B2 (en) | 2015-06-09 | 2022-07-28 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation |
| US9957501B2 (en) | 2015-06-18 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
| EP3317424B1 (en) | 2015-07-01 | 2023-09-06 | CureVac Manufacturing GmbH | Method for analysis of an rna molecule |
| DK4104687T5 (da) | 2015-09-21 | 2024-07-22 | Trilink Biotechnologies Llc | Sammensætninger og fremgangsmåder til syntetisering af RNA'er med 5-kappe |
| US10435441B2 (en) | 2015-09-23 | 2019-10-08 | Sangamo Therapeutics, Inc. | HTT repressors and uses thereof |
| US11866754B2 (en) | 2015-10-16 | 2024-01-09 | Modernatx, Inc. | Trinucleotide mRNA cap analogs |
| SI3362461T1 (sl) | 2015-10-16 | 2022-05-31 | Modernatx, Inc. | Analogi kape MRNA z modificirano fosfatno povezavo |
| WO2017070284A1 (en) | 2015-10-21 | 2017-04-27 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hepatitis b virus |
| EP3368670A1 (en) | 2015-10-30 | 2018-09-05 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus |
| EP3380622A4 (en) | 2015-11-23 | 2019-08-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING IMMUNITY |
| EP3389677B1 (en) | 2015-12-18 | 2024-06-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of the t cell receptor |
| NZ743429A (en) | 2015-12-18 | 2022-02-25 | Sangamo Therapeutics Inc | Targeted disruption of the mhc cell receptor |
| EP3394280A1 (en) | 2015-12-23 | 2018-10-31 | CureVac AG | Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof |
| PL415967A1 (pl) * | 2016-01-29 | 2017-07-31 | Univ Warszawski | 5'-tiofosforanowe analogi końca 5' mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie |
| EP3417069A1 (en) | 2016-02-15 | 2018-12-26 | CureVac AG | Method for analyzing by-products of rna in vitro transcription |
| WO2017149139A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Curevac Ag | Rna analysis by total hydrolysis |
| WO2017162266A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna replicon for versatile and efficient gene expression |
| WO2017162265A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Trans-replicating rna |
| RU2021134269A (ru) | 2016-04-22 | 2022-03-16 | Бионтэк Рна Фармасьютикалз Гмбх | Способы получения одноцепочечной рнк |
| US20210162037A1 (en) | 2016-05-04 | 2021-06-03 | Curevac Ag | Influenza mrna vaccines |
| US20180126003A1 (en) * | 2016-05-04 | 2018-05-10 | Curevac Ag | New targets for rna therapeutics |
| EP3452493B1 (en) | 2016-05-04 | 2025-01-15 | CureVac SE | Nucleic acid molecules and uses thereof |
| US20190136230A1 (en) | 2016-05-06 | 2019-05-09 | Juno Therapeutics, Inc. | Genetically engineered cells and methods of making the same |
| MA45670A (fr) | 2016-07-13 | 2019-05-22 | Vertex Pharma | Procédés, compositions et kits pour augmenter l'efficacité d'édition du génome |
| AU2017314067A1 (en) | 2016-08-19 | 2018-12-20 | CureVac SE | RNA for cancer therapy |
| US10975393B2 (en) | 2016-08-24 | 2021-04-13 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Engineered target specific nucleases |
| TN2019000048A1 (en) | 2016-08-24 | 2020-07-15 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulation of gene expression using engineered nucleases. |
| CA3039673A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
| SG11201903460QA (en) | 2016-10-26 | 2019-05-30 | Curevac Ag | Lipid nanoparticle mrna vaccines |
| US11020492B2 (en) | 2016-10-31 | 2021-06-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
| WO2018102665A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Tau modulators and methods and compositions for delivery thereof |
| WO2018115507A2 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Curevac Ag | Henipavirus vaccine |
| EP3558356A2 (en) | 2016-12-23 | 2019-10-30 | CureVac AG | Mers coronavirus vaccine |
| US11920148B2 (en) | 2017-02-22 | 2024-03-05 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for gene editing |
| ES2981244T3 (es) | 2017-04-28 | 2024-10-07 | Acuitas Therapeutics Inc | Novedosas formulaciones de nanopartículas de lípidos de carbonilo y lípidos para la administración de ácidos nucleicos |
| EP3619322A4 (en) | 2017-05-03 | 2021-06-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFICATION OF A TRANSMEMBRANARY CONDUCTANCE REGULATORY GENE IN MUCOVISCIDOSIS (CFTR) |
| US11512287B2 (en) | 2017-06-16 | 2022-11-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors |
| SG11201911430PA (en) | 2017-07-04 | 2020-01-30 | Curevac Ag | Novel nucleic acid molecules |
| US11602557B2 (en) | 2017-08-22 | 2023-03-14 | Cure Vac SE | Bunyavirales vaccine |
| EP3681904A1 (en) | 2017-09-13 | 2020-07-22 | Biontech Cell&Gene Therapies GmbH | Rna replicon for expressing a t cell receptor or an artificial t cell receptor |
| KR102762959B1 (ko) | 2017-09-13 | 2025-02-06 | 트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하 | 세포에서 rna 발현을 향상시키는 방법 |
| CN111094549B (zh) | 2017-09-13 | 2024-11-01 | 生物技术公司 | 用于将体细胞重编程的rna复制子 |
| RU2020117848A (ru) | 2017-11-08 | 2021-12-08 | Куревак Аг | Адаптиция последовательности phk |
| BR112020008568A2 (pt) | 2017-11-09 | 2020-10-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | modificação genética de gene de proteína contendo sh2 indutível por citoquina (cish) |
| US11931406B2 (en) | 2017-12-13 | 2024-03-19 | CureVac SE | Flavivirus vaccine |
| SG11202005760PA (en) | 2017-12-21 | 2020-07-29 | Curevac Ag | Linear double stranded dna coupled to a single support or a tag and methods for producing said linear double stranded dna |
| MA51619A (fr) | 2018-01-17 | 2021-04-14 | Vertex Pharma | Inhibiteurs de la protéine kinase dépendante de l'adn |
| EA202091707A1 (ru) | 2018-01-17 | 2020-12-02 | Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед | Хиноксалиноновые соединения, композиции, способы и наборы для повышения эффективности редактирования генома |
| EP3740479B1 (en) | 2018-01-17 | 2024-11-20 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Dna-pk inhibitors |
| BR112020026125A8 (pt) * | 2018-03-15 | 2022-10-18 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Compostos oligonucleotídeos superiores ou 5'-cap- trinucleotídeo e seus usos na estabilização de rna, expressão de proteínas e em terapia |
| WO2019193183A2 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Curevac Ag | Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination |
| CA3091558A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Curevac Ag | Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination |
| US11690921B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-07-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery of target specific nucleases |
| WO2020002525A1 (en) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Curevac Ag | Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination |
| EP4234570A3 (en) | 2018-09-18 | 2023-12-13 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases |
| CA3122645A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
| CN113453707A (zh) | 2018-12-21 | 2021-09-28 | 库瑞瓦格股份公司 | 用于疟疾疫苗的rna |
| PT3908568T (pt) | 2019-01-11 | 2024-09-30 | Acuitas Therapeutics Inc | Lípidos para a administração de agentes ativos por nanopartículas lipídicas |
| WO2020150152A1 (en) | 2019-01-14 | 2020-07-23 | Genentech, Inc. | Methods of treating cancer with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine |
| EP4491229A2 (en) | 2019-02-08 | 2025-01-15 | CureVac SE | Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases |
| WO2020219726A1 (en) | 2019-04-23 | 2020-10-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modulators of chromosome 9 open reading frame 72 gene expression and uses thereof |
| WO2020254535A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Curevac Ag | Rotavirus mrna vaccine |
| JP2022544412A (ja) | 2019-08-14 | 2022-10-18 | キュアバック アーゲー | 免疫賦活特性が減少したｒｎａ組み合わせおよび組成物 |
| CA3162019A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Gemma NAVARRO | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids |
| BR112022015077A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-10-04 | Genentech Inc | Métodos para induzir células t cd8+ específicas de neoepítopos em um indivíduo com um tumor e para induzir o tráfico de células t cd8+, vacinas de rna, vacina de rna para uso e antagonistas de ligação |
| IL293571B2 (en) | 2020-02-04 | 2025-01-01 | Curevac Ag | Coronavirus vaccine |
| US12194089B2 (en) | 2020-02-04 | 2025-01-14 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
| JP2021185136A (ja) | 2020-04-22 | 2021-12-09 | ビオエンテッヒ・アールエヌエイ・ファーマシューティカルズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | コロナウイルスワクチン |
| IL298084A (en) | 2020-05-29 | 2023-01-01 | CureVac SE | Nucleic acid based combination vaccines |
| CA3181193A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Mario Perkovic | Rna replicon for versatile and efficient gene expression |
| CN116096702A (zh) | 2020-07-16 | 2023-05-09 | 爱康泰生治疗公司 | 用于脂质纳米颗粒的阳离子脂质 |
| CA3170741A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-03 | Curevac Ag | Nucleic acid encoded antibody mixtures |
| CN113308503A (zh) * | 2020-08-20 | 2021-08-27 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 一种Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用 |
| US12152251B2 (en) | 2020-08-25 | 2024-11-26 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
| US20240066114A1 (en) | 2020-08-31 | 2024-02-29 | CureVac SE | Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines |
| KR20230066395A (ko) | 2020-09-08 | 2023-05-15 | 제넨테크, 인크. | 연동 펌프 및 댐프너를 사용하여 약학적 조성물을 생성하기 위한 시스템 및 방법 |
| KR20230129432A (ko) | 2020-12-09 | 2023-09-08 | 비온테크 에스이 | Rna 제조 |
| WO2022137133A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Curevac Ag | Rna vaccine against sars-cov-2 variants |
| MX2023007574A (es) | 2020-12-22 | 2023-09-29 | CureVac SE | "vacuna de arn contra variantes de sars-cov-2. |
| US20240299309A1 (en) | 2020-12-22 | 2024-09-12 | CureVac SE | Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration |
| US20240102065A1 (en) | 2021-01-27 | 2024-03-28 | CureVac SE | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
| CN117377491A (zh) | 2021-03-26 | 2024-01-09 | 葛兰素史克生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
| CA3171429A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-09-30 | Alexander SCHWENGER | Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna |
| WO2022233880A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Curevac Ag | Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression |
| EP4334943A1 (en) | 2021-05-04 | 2024-03-13 | BioNTech SE | Technologies for early detection of variants of interest |
| KR20240042414A (ko) | 2021-07-29 | 2024-04-02 | 비온테크 에스이 | 흑색종의 치료용 조성물 및 방법 |
| EP4377331A2 (en) | 2021-07-30 | 2024-06-05 | CureVac SE | Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases |
| IL309502A (en) | 2021-09-03 | 2024-02-01 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine |
| WO2023031394A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids |
| CN113957108B (zh) * | 2021-09-09 | 2025-01-10 | 上海兆维科技发展有限公司 | 一种加帽rna的合成方法以及加帽rna转录反应液 |
| WO2023066875A1 (en) | 2021-10-18 | 2023-04-27 | BioNTech SE | Modified replicable rna and related compositions and their use |
| WO2023066874A1 (en) | 2021-10-18 | 2023-04-27 | BioNTech SE | Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use |
| US12186387B2 (en) | 2021-11-29 | 2025-01-07 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| JP2024546952A (ja) | 2021-12-16 | 2024-12-26 | アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子製剤に用いるための脂質 |
| WO2023138786A1 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | BioNTech SE | Analysis of rna molecules using catalytic nucleic acids |
| EP4469091A1 (en) | 2022-01-28 | 2024-12-04 | CureVac SE | Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors |
| AU2023227443A1 (en) | 2022-03-01 | 2024-10-10 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions |
| EP4496891A1 (en) | 2022-03-21 | 2025-01-29 | CRISPR Therapeutics AG | Methods and compositions for treating lipoprotein-related diseases |
| WO2023213378A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | BioNTech SE | Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases |
| WO2023227608A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide |
| WO2023237726A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Pantarhei Oncology B.V. | An intracellular tumor-specific variant of human zona pellucida glycoprotein 3 and nucleic acids coding therefor for use in the treatment of cancer |
| WO2024002985A1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-04 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| CN114941018B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-09-22 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | cap1帽类似物的合成方法 |
| WO2024017479A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | BioNTech SE | Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production |
| WO2024056856A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | BioNTech SE | Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna |
| AU2023353931A1 (en) | 2022-09-26 | 2025-03-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
| US12186389B2 (en) | 2022-10-28 | 2025-01-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants |
| WO2024137589A2 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-27 | Genentech, Inc. | Methods of treating pancreatic cancer with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine |
| WO2024160936A1 (en) | 2023-02-03 | 2024-08-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Rna formulation |
| WO2024165146A1 (en) | 2023-02-07 | 2024-08-15 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Immune effector cells stably and transiently expressing nucleic acids |
| GB202302092D0 (en) | 2023-02-14 | 2023-03-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Analytical method |
| WO2024184500A1 (en) | 2023-03-08 | 2024-09-12 | CureVac SE | Novel lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
| WO2024193827A1 (en) | 2023-03-23 | 2024-09-26 | BioNTech SE | Stabilized nucleic acid compositions and methods for preparing, storing and using the same |
| WO2024216217A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-17 | BioNTech SE | Hiv vaccine |
| WO2024223724A1 (en) | 2023-04-27 | 2024-10-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
| WO2024223728A1 (en) | 2023-04-27 | 2024-10-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza virus vaccines |
| WO2024230934A1 (en) | 2023-05-11 | 2024-11-14 | CureVac SE | Therapeutic nucleic acid for the treatment of ophthalmic diseases |
| EP4464713A1 (en) | 2023-05-18 | 2024-11-20 | Siec Badawcza Lukasiewicz - PORT Polski Osrodek Rozwoju Technologii | Circular rna analogs, preparation and application thereof |
| WO2025004001A1 (en) | 2023-06-30 | 2025-01-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Htt repressors and uses thereof |
| WO2025022290A1 (en) | 2023-07-21 | 2025-01-30 | Crispr Therapeutics Ag | Modulating expression of alas1 (5'-aminolevulinate synthase 1) gene |
| WO2025051381A1 (en) | 2023-09-08 | 2025-03-13 | BioNTech SE | Methods and compositions for localized expression of administered rna |
| GB202404607D0 (en) | 2024-03-29 | 2024-05-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | RNA formulation |
| CN119241624A (zh) * | 2024-12-06 | 2025-01-03 | 上海科泽永欣生物科技有限公司 | 一种含hna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 |
| CN119306779A (zh) * | 2024-12-13 | 2025-01-14 | 上海科泽永欣生物科技有限公司 | 一种含r构型的起始加帽寡核苷酸引物及其合成方法 |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4854610A (en) * | 1988-02-10 | 1989-08-08 | Bertek, Inc. | Method of making laminated articles and articles made therefrom |
| US5470967A (en) * | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
| US5643780A (en) * | 1992-04-03 | 1997-07-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating RNA activity through modification of the 5' cap structure of RNA |
| US5653472A (en) * | 1995-07-25 | 1997-08-05 | The Standard Register Company | Form having detachable wristband and labels |
| EP2251347A3 (en) * | 1997-04-22 | 2011-02-23 | Life Technologies Corporation | Methods for the production of ASLV reverse transcriptases composed of multiple subunits |
| US6000160A (en) * | 1997-10-14 | 1999-12-14 | Riley; James M. | Computer generated moisture proof identification bracelet |
| US6510634B1 (en) * | 1997-10-14 | 2003-01-28 | Laser Band, Llc | Multiple computer generated multi-web moisture proof identification bracelets on a single form with window |
| US7017294B2 (en) * | 2002-09-27 | 2006-03-28 | Laser Band, Llc | Wristband/cinch with inboard label assembly business form and method |
| US7386949B2 (en) * | 1997-10-14 | 2008-06-17 | Laser Band, Llc | Special precautions self-laminating wristband business form and method |
| US7047682B2 (en) * | 2002-09-27 | 2006-05-23 | Laser Band, Llc | Wristband/label assembly business form and method |
| US7017293B2 (en) * | 2002-09-27 | 2006-03-28 | Laser Band, Llc | Wristband/cinch with label assembly business form and method |
| US6016618A (en) * | 1997-11-17 | 2000-01-25 | Avery Dennison Corporation | Laminated article |
| AU1087301A (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-30 | Yale University | Conjoined polynucleotide catalysts |
| US20040261644A1 (en) * | 2001-09-14 | 2004-12-30 | Stewart Thomas R. | Medical patient labeling system and method |
| US6788687B2 (en) * | 2001-10-30 | 2004-09-07 | Qualcomm Incorporated | Method and apparatus for scheduling packet data transmissions in a wireless communication system |
| US6836215B1 (en) * | 2002-01-22 | 2004-12-28 | The Standard Register Company | Printable identification band with top strip for RFID chip attachment |
| US7316358B2 (en) * | 2002-03-18 | 2008-01-08 | Precision Dynamics Corporation | Identification band with adhesively attached coupling elements |
| US7074596B2 (en) | 2002-03-25 | 2006-07-11 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues |
| US6971200B2 (en) * | 2002-09-13 | 2005-12-06 | Chicago Tag & Label | Form having a removable wristband and labels |
| US7000951B2 (en) * | 2002-09-13 | 2006-02-21 | Chicago Tag And Label, Inc. | Form having a removable wristband and labels |
| US7520077B2 (en) * | 2004-06-17 | 2009-04-21 | Laser Band, Llc | Cushioned wristband with self-laminating identity tag |
| US20050181165A1 (en) * | 2002-11-13 | 2005-08-18 | Franko Joseph D.Sr. | Glue-applied resealable expanded content label |
| US7322613B2 (en) * | 2002-12-17 | 2008-01-29 | Precision Dynamic, Corporation | Multi-part form having detachable wristband, labels and cards or the like |
| US7222748B2 (en) * | 2003-09-26 | 2007-05-29 | Royal Vendors, Inc. | Clear door vending machine |
| US20050091896A1 (en) * | 2003-10-30 | 2005-05-05 | Kotik Mark M. | Identification band with detachable machine-readable lables |
| US7320194B2 (en) * | 2004-06-01 | 2008-01-22 | Precision Dynamics Corporation | Adhesive wristband without removable release liner |
| US7658026B2 (en) * | 2006-10-27 | 2010-02-09 | Laser Band, Llc | Wristband with snap closure and patent id label |
| US20050285385A1 (en) * | 2004-06-28 | 2005-12-29 | Bova Antonio V | Emergency medical analysis form with detachable patient identification piece and method of using same |
| US7417541B2 (en) * | 2004-10-08 | 2008-08-26 | Bartronics America, Inc. | Identification band with regions having electro-magnetically detectable regions |
| US20060113788A1 (en) * | 2004-11-30 | 2006-06-01 | Laser Band, Llc. | Laser printable business form having a self laminating wristband and a self laminating strip label |
| US7810267B2 (en) * | 2005-04-21 | 2010-10-12 | Avery Dennison Corporation | Patient identification products |
| US20070120358A1 (en) * | 2005-11-30 | 2007-05-31 | Waggoner Bryce C | Patient wristband form |
| US20070283607A1 (en) * | 2006-06-13 | 2007-12-13 | Printmark Industries, Inc. | Printed identification band and method of manufacturing same |
| US20080067802A1 (en) * | 2006-08-24 | 2008-03-20 | Tri-State Hospital Supply Corporation | Self-laminating label for a wristband |
| US8424115B2 (en) * | 2006-10-27 | 2013-04-23 | Laser Band, Llc | Wristband with contoured comfort sides |
| ES2423729T3 (es) * | 2007-06-14 | 2013-09-24 | Precision Dynamics Corporation | Un mecanismo de cierre para un medio de identificación apto para recibir material formador de un índice y medios de doble cierre |
-
2008
- 2008-06-19 CN CN201410246751.1A patent/CN104072561B/zh active Active
- 2008-06-19 ES ES08771474.7T patent/ES2500515T3/es active Active
- 2008-06-19 AU AU2008265683A patent/AU2008265683B2/en active Active
- 2008-06-19 WO PCT/US2008/067494 patent/WO2008157688A2/en active Application Filing
- 2008-06-19 SI SI200831256T patent/SI2167523T1/sl unknown
- 2008-06-19 CA CA2692906A patent/CA2692906C/en active Active
- 2008-06-19 US US12/280,282 patent/US8153773B2/en active Active - Reinstated
- 2008-06-19 CN CN200880102959.9A patent/CN101855231B/zh active Active
- 2008-06-19 PT PT87714747T patent/PT2167523E/pt unknown
- 2008-06-19 EP EP08771474.7A patent/EP2167523B1/en active Active
- 2008-06-19 DK DK08771474.7T patent/DK2167523T3/da active
- 2008-06-19 EA EA201070030A patent/EA017740B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-06-19 CN CN201710815709.0A patent/CN107501370B/zh active Active
- 2008-06-19 PL PL08771474T patent/PL2167523T3/pl unknown
-
2014
- 2014-08-18 HR HRP20140771AT patent/HRP20140771T1/hr unknown
- 2014-09-08 CY CY20141100718T patent/CY1115525T1/el unknown
-
2015
- 2015-01-27 HK HK15100888.8A patent/HK1200461A1/zh unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to eIF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS;JOANNA KOWALSKA et al.;《RNA》;20080422;第14卷(第6期);第1119-1131页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8153773B2 (en) | 2012-04-10 |
| CN104072561B (zh) | 2017-12-22 |
| DK2167523T3 (da) | 2014-09-08 |
| CN101855231B (zh) | 2014-06-11 |
| EA017740B1 (ru) | 2013-02-28 |
| ES2500515T3 (es) | 2014-09-30 |
| EP2167523B1 (en) | 2014-07-23 |
| CN101855231A (zh) | 2010-10-06 |
| PL2167523T3 (pl) | 2014-12-31 |
| US20100233757A1 (en) | 2010-09-16 |
| CY1115525T1 (el) | 2017-01-04 |
| WO2008157688A3 (en) | 2009-02-26 |
| EP2167523A2 (en) | 2010-03-31 |
| PT2167523E (pt) | 2014-09-22 |
| HK1200461A1 (zh) | 2015-08-07 |
| CN107501370A (zh) | 2017-12-22 |
| CA2692906A1 (en) | 2008-12-24 |
| AU2008265683A1 (en) | 2008-12-24 |
| SI2167523T1 (sl) | 2014-09-30 |
| HRP20140771T1 (hr) | 2014-11-07 |
| EP2167523A4 (en) | 2011-06-15 |
| CN104072561A (zh) | 2014-10-01 |
| EA201070030A1 (ru) | 2010-06-30 |
| AU2008265683B2 (en) | 2013-08-29 |
| WO2008157688A2 (en) | 2008-12-24 |
| CA2692906C (en) | 2016-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107501370B (zh) | 信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途 | |
| EP2297175B1 (en) | Mrna cap analogs | |
| Grudzien‐Nogalska et al. | Synthesis of anti‐reverse cap analogs (ARCAs) and their applications in mRNA translation and stability | |
| Jemielity et al. | Synthetic mRNA cap analogs with a modified triphosphate bridge–synthesis, applications and prospects | |
| US20030194759A1 (en) | Synthesis and use of anti-reverse mRBA cap analogues | |
| EP3484907B1 (en) | Novel phosphotriazole mrna 5'-end cap analogs, composition comprising the same, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule, protein or peptide | |
| JP2009544754A (ja) | ジヌクレオチドｍｒｎａキャップアナログ | |
| EP3146068A1 (en) | Nucleic acid processing of a nucleic acid fragment with a triazole linkage | |
| JPH11503306A (ja) | Ｃ−ヌクレオシド誘導体および核酸検出におけるその使用 | |
| Strenkowska et al. | Towards mRNA with superior translational activity: synthesis and properties of ARCA tetraphosphates with single phosphorothioate modifications | |
| PL214850B1 (pl) | Cząsteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub białka | |
| WO2023199261A1 (en) | Rna molecule containing modified cap analogs at the 5 ' end, use of rna molecule in in vitro protein or peptide synthesis, rna molecule for use in medicine, and use of modified cap analogs for rna capping | |
| EP4116313A1 (en) | Cap analog for the 5'-end of eukaryotic messenger rnas | |
| WO2025053766A2 (en) | Dinucleotide monophosphate derivative, the nucleic acid derivative containing it, and the method of obtaining it | |
| Chakrapani | Bioorthogonal reactions on DNA for regulation of transcription | |
| Feldman | Chemical Optimization of a Semi-Synthetic Organism | |
| TW202436624A (zh) | 試管內轉錄方法以及其使用之化合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1242326 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |