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TW202436624A - 試管內轉錄方法以及其使用之化合物 - Google Patents

試管內轉錄方法以及其使用之化合物 Download PDF

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TW202436624A
TW202436624A TW113103993A TW113103993A TW202436624A TW 202436624 A TW202436624 A TW 202436624A TW 113103993 A TW113103993 A TW 113103993A TW 113103993 A TW113103993 A TW 113103993A TW 202436624 A TW202436624 A TW 202436624A
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TW
Taiwan
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ome
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pppa
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Application number
TW113103993A
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English (en)
Inventor
羅伯特 登普希
丹 劉
皮鳳梅
政憲 吳
Original Assignee
美商金斯瑞美國公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
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Abstract

一種用於將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法包括提供含有緩衝物質、核糖核苷三磷酸(NTP)、約2 mM至約60 mM之濃度的一或多種鎂鹽、DNA模板、重組RNA聚合酶、及包含式(I)、(II)、或(III)之結構的帽類似物的混合物，及將反應混合物在約15℃至約35℃，視情況約18℃至約31℃下孵育約1小時至約12小時，由此產生RNA。

Description

試管內轉錄方法以及其使用之化合物
相關申請案之交叉引用
本申請案為主張2023年2月1日提交之美國臨時專利申請案第63/482,688號之優先權的國際(PCT)申請案，該申請案之整個內容出於所有目的以引用方式併入本文。 作為相容XML檔案(.xml)提交之序列表之參考
按照EFS-Web法律框架及37 C.F.R. § 1.821-825 (參見M.P.E.P.§ 2442.03(a))，呈相容XML檔案(題為「3000076-010900 Seq Listing ST26.xml」，2024年1月31日產生，並且大小為36,097個位元組)形式之序列表與本申請案同時提交，並且序列表之整個內容以引用方式併入本文。
本揭示案通常係關於合成mRNA加帽類似物之方法及 試管內轉錄之方法及組成物。
mRNA為具有5’帽、5’末端未轉譯區域(UTR)、編碼所關注基因之開放閱讀框序列、及3’末端UTR、及聚A尾之結構的明確界定分子。經由 試管內合成來製備加帽mRNA可對於基礎科學研究及新治療劑開發而言具有顯著重要性。產生可具有高表現水準、穩定性、及功能之mRNA需要考慮多個因素。
mRNA分子可側接有5’末端及3’末端未轉譯區域(untranslated region，UTR)。5’-UTR充當啟動轉譯之核糖體之進入位點，並且3’UTR在轉譯終止及轉錄後修飾方面發揮重要作用，從而可影響mRNA之表現及半衰期。mRNA之聚A尾可使得RNA分子更穩定並且防止mRNA降解。另外，聚A尾可允許成熟信使RNA從細胞核輸出並且藉由細胞質中之核糖體來轉譯至蛋白。 參見例如Sachs A及Wahle E, 「Poly(A) tail metabolism and function in eucaryotes」, J Biol Chem, (1993 Nov 5); 268(31):22955-8，該文獻以全文引用方式併入本文。
mRNA帽為mRNA之5’末端處之高度甲基化修飾，該修飾可保護mRNA免於降解、募集涉及mRNA處理之複合物，並且標記細胞mRNA以避免被免疫系統識別。在哺乳動物中，主要5’帽結構為藉由5’-5’三磷酸鍵來連接至第一轉錄核苷酸的反向7-甲基鳥苷核苷酸。7-甲基鳥苷在其7氮位置處經甲基化，並且可被稱為 m7G或 7mG。此帽結構可表現為5’ m7GpppN 1(pN) x，其中N為任何核苷酸並且x為0或任何數目。在帽-0結構中，第一核苷酸在其核糖處具有2’羥基，而在帽-1結構中，第一核苷酸在核糖中具有2’-o-甲基修飾，並且此結構可從5’末端至3’末端包含 m7G 5’pppN 1 2’-OMe(pN) x，其中N為任何核苷酸並且x可為任何整數。此外，在帽-2結構中，相對於 m7G之第一及第二核糖之2’羥基經甲基化。此結構可從5’末端至3’末端包含 m7G 5’pppN 1 2’-OMepN 2 2’-OMe(pN) x，其中N為任何核苷酸並且x可為任何整數。 參見例如Perry RP, 「RNA processing comes of age」, J Cell Biol.(1981 Dec);91(3 Pt 2):28s-38s，該文獻以全文引用方式併入本文。
加帽可改良mRNA之性質，諸如但不限於其穩定性及其轉譯效率。 參見例如Banerjee AK, 「5'-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids」, Microbiol Rev.(1980 Jun); 44(2):175-205，該文獻以全文引用方式併入本文。 在活體內，各加帽過程可由酶執行。 參見例如Perry。此等過程可為耗時、效率低的、並且試管內執行為代價高的。
經由 試管內合成來製備加帽mRNA可對於基礎科學研究、開發藥物、及開發治療劑而言具有顯著重要性。多個因素可有助於產生可具有高表現水準、穩定性、及功能之mRNA。需要允許更有效產生可具有高表現水準、穩定性、功能、或其組合之加帽mRNA之有效 試管內轉錄方法。
在一態樣中，本發明之實施例可包括將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法，該等方法包括提供混合物，該混合物包含緩衝物質、核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，NTP)、約2 mM至約60 mM之濃度的一或多種鎂鹽、DNA模板、重組RNA聚合酶、及包含式(I)、(II)、或(III)之結構的帽類似物： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； 及 在約15℃至約35℃，視情況約18℃至約31℃下，孵育反應混合物約1小時至約12小時，由此產生RNA。
在另一態樣中，緩衝物質可為Tris鹼、HEPES、或Tris-HCl。
在一態樣中，緩衝物質之濃度可為約1 mM至約100 mM、約1 mM至約90 mM、約1 mM至約80 mM、約1 mM至約70 mM、約1 mM至約60 mM、約1 mM至約50 mM、約1 mM至約40 mM、約1 mM至約30 mM、約1 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約5 mM、約10 mM至約20 mM、約10 mM至約30 mM、約10 mM至約40 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約50 mM、約30 mM至約50 mM、約35 mM至約45 mM、約35 mM至約40 mM、約40 mM至約50 mM、約45 mM至約50 mM、約45 mM至約55 mM、約15 mM至約45 mM、約15 mM至約35 mM、約15 mM至約30 mM、或約15 mM至約25 mM。
在一態樣中，NTP之濃度可為約1 mM至約50 mM、約1 mM至約40 mM、約1 mM至約30 mM、約1 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約5 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約10 mM、約9 mM至約10 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約50 mM、約25 mM至約50 mM、約25 mM至約45 mM、約25 mM至約40 mM、約25 mM至約35 mM或約20 mM至約30 mM。
在一態樣中，一或多種鎂鹽之濃度可為約2 mM至約50 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約20 mM、約2 mM至約10 mM、約2 mM至約5 mM、約5 mM至約50 mM、約10 mM至約45 mM、約15 mM至約40 mM、約20 mM至約35 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、約22 mM至約28 mM、或約25 mM至約30 mM。
在一態樣中，DNA模板之濃度可為約0.001 µg/µl至約2 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1.5 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約2 µg/µl、約0.01 µg/µl至約1.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl、約0.02 µg/µl至約0.04 µg/µl、約0.02 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.03 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.04 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.05 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.06 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.07 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.08 µg/µl至約0.1 µg/µl、或約0.09 µg/µl至約0.1 µg/µl。
在一態樣中，重組RNA聚合酶之濃度可為約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約1.5 U/µl、或約1.5 U/µl至約2 U/µl。
在另一態樣中，混合物可進一步包含抗氧化劑。
在另一態樣中，抗氧化劑可為以下濃度之二硫蘇糖醇(DTT)：約1 mM至約50 mM、約2 mM至約50 mM、約3 mM至約50 mM、約4 mM至約50 mM、約5 mM至約50 mM、約6 mM至約50 mM、約7 mM至約50 mM、約8 mM至約50 mM、約9 mM至約50 mM、約10 mM至約50 mM、約10 mM至約40 mM、約15 mM至約30 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約20 mM至約50 mM、約30 mM至約50 mM、或約40 mM至約50 mM。
在另一態樣中，混合物可進一步包含以下濃度之RNA酶抑制劑：約0.001 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約4 U/µl、約0.001 U/µl至約3 U/µl、約0.001 U/µl至約2 U/µl、約0.001 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約5 U/µl、約0.01 U/µl至約4 U/µl、約0.01 U/µl至約3 U/µl、約0.01 U/µl至約2 U/µl、約0.01 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.5 U/µl、約0.01 U/µl至約0.1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.1 U/µl至約5 U/µl、約0.1 U/µl至約4 U/µl、約0.1 U/µl至約3 U/µl、約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.1 U/µl至約1 U/µl、約0.5 U/µl至約5 U/µl、約0.5 U/µl至約4 U/µl、約0.5 U/µl至約3 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約1 U/µl、約1 U/µl至約5 U/µl、約2 U/µl至約5 U/µl、約3 U/µl至約5 U/µl、約4 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約0.005 U/µl、約0.001 U/µl至約0.01 U/µl、約0.005 U/µl至約0.01 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.02 U/µl至約0.03 U/µl、約0.02 U/µl至約0.04 U/µl、或約0.02 U/µl至約0.05 U/µl。
在另一態樣中，帽類似物可為以下濃度：約0.5 mM至約50 mM、約0.5 mM至約40 mM、約0.5 mM至約30 mM、約0.5 mM至約20 mM、約0.5 mM至約10 mM、約0.5 mM至約5 mM、約1 mM至約10 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約6 mM至約9 mM、約6 mM至約8 mM、約6 mM至約7 mM、約7 mM至約8 mM、約7 mM至約9 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約9 mM、約8 mM至約10 mM、或約9 mM至約10 mM。
在另一態樣中，混合物可進一步包含多胺。
在另一態樣中，多胺可為精胺、精脒、或其組合。
在另一態樣中，多胺之濃度可為約0.1 mM至約5 mM、約0.2 mM至約4.9 mM、約0.2 mM至約4.8 mM、約0.2 mM至約4.7 mM、約0.2 mM至約4.6 mM、約0.2 mM至約4.5 mM、約0.2 mM至約4.4 mM、約0.2 mM至約4.3 mM、約0.2 mM至約4.2 mM、約0.2 mM至約4.1 mM、約0.2 mM至約4 mM、約0.2 mM至約3.5 mM、約0.2 mM至約3 mM、約0.2 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.5 mM、約1.0 mM至約2.5 mM、約1.5 mM至約2.5 mM、約0.2 mM至約2 mM、約0.2 mM至約1.5 mM、約0.2 mM至約1 mM、約0.2 mM至約0.9 mM、約0.2 mM至約0.8 mM、約0.2 mM至約0.7 mM、約0.2 mM至約0.6 mM、約0.2 mM至約0.5 mM、約0.2 mM至約0.4 mM、約0.2 mM至約0.3 mM、約1至約25 mM、約1至約20 mM、約1至約15 mM、約1至約10 mM、約1至約5 mM、或約1至約2.5 mM。
在另一態樣中，混合物可進一步包含以下濃度之焦磷酸酶：約0.01 mU/µl至約2 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約2 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.9 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.8 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.7 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.6 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.4 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.3 mU/µl、或約0.1 mU/µl至約0.2 mU/µl。
在另一態樣中，孵育反應混合物可在約15℃至約35℃、約16℃至約35℃、約17℃至約35℃、約18℃至約35℃、約18℃至約34℃、約18℃至約33℃、約18℃至約32℃、約18℃至約31℃、約18℃至約30℃、約18℃至約29℃、約18℃至約28℃、約18℃至約27℃、約18℃至約26℃、約18℃至約25℃、約18℃至約24℃、約18℃至約23℃、約18℃至約22℃、約18℃至約21℃、約18℃至約20℃、約18℃至約19℃、約25℃至約26℃、約25℃至約27℃、約25℃至約28℃、約25℃至約29℃、約25℃至約30℃、約25℃至約31℃、約21℃至約22℃、約21℃至約23℃、約21℃至約24℃、約21℃至約25℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、或約35℃下執行。
在另一態樣中，孵育反應混合物可執行約1小時至約12小時、約1小時至約11小時、約1小時至約10小時、約1小時至約9小時、約1小時至約8小時、約1小時至約7小時、約1小時至約6小時、約1小時至約5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2小時、約2小時至約12小時、約3小時至約12小時、約4小時至約12小時、約5小時至約12小時、約6小時至約12小時、約7小時至約12小時、約8小時至約12小時、約9小時至約12小時、約10小時至約12小時、約11小時至約12小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、或約10小時。
在另一態樣中，孵育反應混合物可在約31℃下執行約1小時至約5小時、約1小時至約4.5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3.5小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2.5小時、約1小時至約2小時、約1小時至約1.5小時、約0.5小時至約1小時、約0.5小時至約1.5小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、或約5小時。
在另一態樣中，DNA模板可包含可操作地連接至包含5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)、3’UTR、及聚A區域之核酸的啟動子，其中啟動子包含序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)，其中X 1為A或G，X 2為A或G，並且X 3為A、T、G、或C，其中5’UTR選自SEQ ID NO：1、3、5、或9，並且3’UTR選自SEQ ID NO：2、4、6、或8，其中聚A區域包含至少60個腺嘌呤鹼基(A)。
在另一態樣中，啟動子可包含選自SEQ ID NO：10-15之序列。
在另一態樣中，5’UTR及3’UTR可分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、1及6、3及2、3及4、3及6、3及8、5及2、5及4、5及6、7及2、7及4、7及6、7及8、9及2、9及4、9及6、或9及8。
在另一態樣中，5’UTR及3’UTR可分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、3及2、1及6、7及4、9及2、或3及6。
在另一態樣中，聚A區域可包含約60至約200個A、約60至約190個A、約60至約180個A、約60至約170個A、約60至約160個A、約60至約150個A、約60至約140個A、約60至約130個A、約60至約120個A、約60至約110個A、約60至約100個A、約70至約190個A、約80至約180個A、約90至約170個A、約100至約160個A、約100至約150個A、約100至約140個A、約100至約130個A、約100至約120個A、約100個A、約110個A、約120個A、約130個A、約140個A、或約150個A。
在另一態樣中，重組RNA聚合酶可選自野生型T7 RNA聚合酶或其變異體。
在另一態樣中，帽類似物可為選自由以下組成之群之類似物 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在另一態樣中，帽類似物可結合至啟動子之-1及/或+1核苷酸。
在一態樣中，本發明之實施例可包括用於將DNA模板 試管內轉錄至RNA之反應混合物，該等混合物包含約45 mM至約55 mM之濃度之緩衝物質、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl之濃度之RNA酶抑制劑、約3 mM至約5 mM之濃度之NTP、約6 mM至約8 mM之濃度之帽類似物、約20 mM至約30 mM之濃度之一或多種鎂鹽、約1.5 mM至約2.5 mM之濃度之多胺、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之濃度之DNA模板、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl之濃度之焦磷酸酶、及約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之濃度之RNA聚合酶，其中帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
在另一態樣中，孵育反應混合物可在約15℃至約35℃下執行約1小時至約12小時。
在另一態樣中，孵育可包括在約18℃至約31℃下孵育反應混合物。
在另一態樣中，孵育可包括在約31℃下孵育反應混合物約3小時。
在一態樣中，本發明之實施例可包括將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法，該等方法包括提供(1) DNA模板，該模板包含可操作地連接至包含5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)、3’UTR、及聚A區域之核酸的啟動子，及(2)帽類似物，該帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， 其中啟動子包含序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)， 其中位置17處之A為-1核苷酸並且位置18處之X 1為+1核苷酸， 當X 1為G，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為G， 當X 1為A，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為A， 當X 1為C，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為C，並且 當X 1為T，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為U， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， 其中帽類似物結合至啟動子之-1及+1核苷酸，並且將DNA模板及帽類似物在反應混合物中孵育，其中孵育包括在約15℃至約35℃下孵育反應混合物約1小時至約12小時，由此產生RNA。
在另一態樣中，啟動子可包含選自SEQ ID NO：10、11、12、13、及14之序列。
在另一態樣中，反應混合物可包含約35 mM至約45 mM之濃度之緩衝物質、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl之濃度之RNA酶抑制劑、約20 mM至約40 mM之濃度之NTP、約6 mM至約8 mM之濃度之帽類似物、約20 mM至約30 mM之濃度之一或多種鎂鹽、約1.5 mM至約2.5 mM之濃度之多胺、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之濃度之DNA模板、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl之濃度之焦磷酸酶、及約1 U/µl至約2 U/µl之濃度之RNA聚合酶。
在一態樣中，本發明之實施例可包括用於將DNA模板 試管內轉錄至RNA之反應混合物，該等混合物包含DNA模板及帽類似物，其中帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C 其中DNA模板包含啟動子；並且其中帽類似物結合至啟動子之至少-1及+1核苷酸，或結合至啟動子之至少+1及+2核苷酸。
在一態樣中，本發明之實施例可包括合成帽類似物之方法，該等方法包括步驟： (a) 使5’-DMT-2’-O-甲基鳥苷(n-ibu)與乙酸酐/吡啶反應，隨後使產物與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(3)： ， (b) 使化合物(3)與5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲醯基-腺苷,2'-O-甲基,3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及四唑反應，隨後與第一氧化劑反應，隨後與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(4)： ， (c) 使化合物(4)與化學磷酸化亞磷醯胺試劑及四唑反應，隨後與第二氧化劑反應，隨後與氫氧化銨反應以便獲得化合物(5)： ， (d) 在二價金屬鹽存在下，使化合物(5)與(2a)或(2b)反應 以便獲得帽類似物(1a)或(1b)： 。
在一態樣中，本發明之實施例可包括合成帽類似物之方法，該等方法包括步驟： (a) 使化合物3： 與5'-DMT-2'-O-甲基-N6-甲基-腺苷3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及四唑反應，隨後與第一氧化劑反應，隨後與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(6)： ， (b) 使化合物(6)與化學磷酸化亞磷醯胺試劑及四唑反應，隨後與第二氧化劑反應，隨後與氫氧化銨反應以便獲得化合物(7)： ， (c) 在二價金屬鹽存在下，使化合物(7)與化合物(2b)反應： 以便獲得帽類似物化合物(8)： 。
在另一態樣中，第一氧化劑及第二氧化劑可各自為(1 S)-(+)-(樟腦磺醯基)噁嗪啶(CSO)或碘。
在另一態樣中，二價金屬鹽可為MnCl 2或ZnCl 2。
在一態樣中，本發明之實施例可包括包含式(I)之帽類似物： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
在另一態樣中，R為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(I)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(I)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R為CH 3，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(I)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R為CH 3，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(I)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在一態樣中，本發明之實施例可包括包含式(II)之帽類似物： (II) ，其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C。
在另一態樣中，R 1為OCH 3並且R 2為OH，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(II)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R 1為OCH 3並且R 2為OH，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(II)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在另一態樣中，R 1為OH並且R 2為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(II)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R 1為OH並且R 2為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(II)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在一態樣中，本發明之實施例可包括包含式(III)之帽類似物： (III) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
在另一態樣中，R為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(III)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(III)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在另一態樣中，R為CH 3，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(III)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome。
在另一態樣中，R為CH 3，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C，其中式(III)之帽類似物可選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在另一態樣中，本發明之實施例可包括合成帽類似物之方法，該等方法包括步驟： (a) 使化合物(12) 與硫酸二甲酯反應以便獲得化合物(13) ， (b) 使化合物(13)與咪唑、三苯基膦、2，2’-二硫代吡啶反應，隨後與MnCl 2及雙三乙銨硫代磷酸鹽反應以便獲得化合物(14) ， (c) 使化合物(5) 與三苯基膦、咪唑、及2，2’-二硫代吡啶反應以便獲得化合物(15) ，及 (d) 使化合物(15)與化合物(14) 在二甲基甲醯胺及ZnCl 2存在下反應以便獲得化合物(16) 。
本文提供用於 試管內合成mRNA之方法及組成物。提供用於 試管內合成加帽mRNA之方法及組成物。所揭示方法及組成物之態樣可單獨或以任何組合來使用。所揭示方法及組成物可改良mRNA合成之效率並且可提供具有經改良性質之mRNA。
與迄今為止所測試之帽修飾之類型(例如，帽-0及帽-1)無關，轉錄物可能容易受到主要細胞脫帽酶DCP2之活性的影響，該酶與其細胞搭配物DCP1協作來釋放m 7GDP及單磷酸化RNA鏈。另一種蛋白DXO (脫帽核糖核酸外切酶)可充當品質控制因子以便消除反常地加帽轉錄物並且充當脫帽酶。與DCP2相比，DXO可藉由水解第一與第二轉錄核苷酸之間之磷酸二酯鍵，導致釋放m 7GpppN及單磷酸化RNA，從而移除整個帽結構並且可繼續作為核糖核酸外切酶在5’–3’方向上使RNA降解。引起關注地，證明DXO脫帽活性藉由帽-1 2’-O-甲基化來抑制，表明其在區分「自身」與「非自身」RNA中之潛在作用。
來自Drazkowska等人之最近研究顯示第二轉錄核苷酸之2’-O-甲基化以細胞依賴性方式來調控蛋白生物合成(Drazkowska K, Tomecki R, Warminski M, Baran N, Cysewski D, Depaix A, Kasprzyk R, Kowalska J, Jemielity J, Sikorski PJ.2'-O-Methylation of the second transcribed nucleotide within the mRNA 5' cap impacts the protein production level in a cell-specific manner and contributes to RNA immune evasion. Nucleic Acids Res.2022 Sep 9;50(16):9051-9071，該文獻以全文引用方式併入本文)。另外，觀察到用帽-2來加帽之RNA對於DXO介導脫帽及降解之抗性。另外，第二轉錄核苷酸之2’-O-甲基化及作為第一轉錄核苷酸之腺苷之N6-甲基化充當將轉錄物定義為「自身」之決定因素並且有助於轉錄物免疫逃避。
試管內有效地大規模製備帽-2 mRNA對於將此等發現轉化於生物製藥應用中而言可為必不可少的。
所揭示方法及組成物可單獨地或以任何組合來用於執行不同大小之mRNA之試管內合成，諸如但不限於約100b至約20Kb、約200b至約19Kb、約300b至約18Kb、約400b至約17Kb、約500b至約16Kb、約600b至約15Kb、約700b至約14Kb、約800b至約13Kb、約900b至約12Kb、約1Kb至約11Kb、約1Kb至約10Kb、約1Kb至約9Kb、約1Kb至約8Kb、約1Kb至約7Kb、約1Kb至約6Kb、約1Kb至約5Kb、約1Kb至約4Kb、約1Kb至約3Kb、約1Kb至約2Kb、約50b至約200b、約60b至約190b、約70b至約180b、約80b至約160b、約90b至約100b、約90b至約110b、約90b至約120b、約90b至約130b、約90b至約140b、約90b至約150b、約100b至約140b、約110b至約130b、或約110b至約120b範圍內之mRNA。
使用所揭示組成物及/或方法來合成之mRNA可具有許多應用，包括但不限於用於基礎科學研究、用於開發藥物、用於開發診斷劑、用於開發治療劑、用作藥物、用作診斷劑、用作治療劑、或其任何組合。
RNA試管內轉錄方法在此項技術中為已知的(參見例如Geall等人(2013) Semin.Immunol.25(2): 152-159; Brunelle等人(2013) Methods Enzymol.530: 101-14)。用於該等方法中之試劑可包括：具有對於其相應RNA聚合酶具有高結合親和力之啟動子序列的線性DNA模板；用於四種鹼基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿嘧啶)之核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，NTP)；帽類似物；其他修飾核苷酸；DNA依賴性RNA聚合酶(例如，T7、T3或SP6 RNA聚合酶)；鈍化任何污染RNA酶之核糖核酸酶(RNA酶)抑制劑；抑制轉錄的使焦磷酸鹽降解之焦磷酸酶；MgCl 2及/或Mg(OAc) 2，供應作為RNA聚合酶之輔因子的Mg 2+；抗氧化劑(例如DTT)；多胺，諸如精脒；及保持合適pH值之緩衝劑。
用於RNA試管內轉錄之常見緩衝系統可包括4-(2-羥基-乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及參(羥甲基)胺基甲烷(Tris)。緩衝劑之pH值可通常調整至6至8.5之pH值。一些常用轉錄緩衝劑可含有80 mM HEPES/KOH, pH 7.5及40 mM Tris/HCl, pH 7.5。
轉錄緩衝劑亦可含有通常在5-50 mM之間之範圍內的鎂鹽，諸如MgCl 2及/或Mg(OAc) 2。鎂離子(Mg 2+)可為RNA試管內轉錄緩衝系統中之基本組分，因為游離Mg 2+可充當RNA聚合酶之催化中心之輔因子並且可對於RNA聚合反應起關鍵作用。在擴散結合中，完全水合Mg離子亦可經由非特異性遠程靜電相互作用來與RNA產物相互作用。
RNA 試管內轉錄反應可作為分批反應來執行，其中所有組分組合，然後孵育以便允許合成RNA分子直到反應終止為止。另外，開發分批補料反應以便增加RNA 試管內轉錄反應之效率(Kern等人(1997) Biotechnol.Prog.13: 747-756；Kern等人(1999) Biotechnol.Prog.15: 174-184)。在分批補料系統中，所有組分組合，然後隨著時間的推移，添加額外量之一些試劑( 例如，NTP、MgCl 2及/或Mg(OAc) 2)以便保持恆定反應條件。
為了清楚及易讀，提供以下定義。在此等定義中提到的任何技術特徵可在本發明之每個實施例中閱讀。額外定義及解釋可在此等實施例之上下文中具體提供。
試管內轉錄：術語「 試管內轉錄」或「RNA 試管內轉錄」可涉及其中在無細胞系統中( 試管內)合成RNA的過程。DNA，尤其質體DNA，用作產生RNA轉錄物之模板。RNA可藉由合適DNA模板之DNA依賴性 試管內轉錄來獲得，根據本揭示案，該模板可較佳為線性化質體DNA模板。用於控制 試管內轉錄之啟動子可為任何DNA依賴性RNA聚合酶之任何啟動子。DNA依賴性RNA聚合酶之特定非限制性實例為T7、T3、及SP6 RNA聚合酶。 試管內RNA轉錄之DNA模板可例如藉由選殖核酸，尤其對應於待 試管內轉錄之相應RNA的cDNA，並且將其引入用於試管內轉錄之合適載體，例如，質體DNA中來獲得。在本揭示案之一個較佳實施例中，DNA模板可在其 試管內轉錄之前用合適限制酶來線性化。cDNA可藉由mRNA之反轉錄或化學合成來獲得。另外，用於 試管內RNA合成之DNA模板亦可藉由基因合成來獲得。
例如，用於 試管內轉錄之試劑可包括： 1) 具有對於其相應RNA聚合酶諸如噬菌體編碼RNA聚合酶具有高結合親和力之啟動子序列的線性化DNA模板； 2) 用於四種鹼基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及尿嘧啶)之核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，NTP)； 3) 視情況如以下定義之帽類似物； 4) 能夠結合至線性化DNA模板內之啟動子序列之DNA依賴性RNA聚合酶(例如，T7、T3或SP6 RNA聚合酶)； 5) 視情況鈍化任何污染RNA酶之核糖核酸酶(RNA酶)抑制劑； 6) 視情況使焦磷酸鹽降解之焦磷酸酶，該酶可抑制轉錄； 7) MgCl 2及/或乙酸鎂(Mg(C 2H 3O 2) 2)(Mg(OAc) 2)，供應作為聚合酶之輔因子的Mg 2+離子； 8) 保持合適pH值之緩衝劑，亦可含有最佳濃度下之抗氧化劑( 例如，DTT)，胺諸如甜菜鹼及/或多胺，諸如精脒。
在實施例中，在根據本揭示案之RNA 試管內轉錄方法中，僅為將所轉錄RNA 試管內轉譯至蛋白所需要，但是不為RNA 試管內轉錄所需要的試劑不予使用。具體而言，用於RNA試管內轉錄之混合物可不含有任何蛋白原性胺基酸或tRNA。此外，混合物可不含有任何蛋白原性胺基酸、tRNA或含有核糖體之細胞萃取物。
本文使用之術語「共轉錄」係指經由使用RNA聚合酶例如T7 RNA聚合酶之一個步驟試管內轉錄反應，用帽結構來製備之mRNA。相比之下，一或多種傳統轉錄後加帽方法可能需要經由使用RNA聚合酶之 試管內轉錄(in vitro transcription，IVT)來製備未加帽RNA，然後使用加帽酶 例如痘苗加帽酶來添加帽，並且藉助於2’-O-甲基轉移酶在mRNA之+1鹼基處添加甲基化。
核酸：術語「核酸」意謂任何DNA或RNA分子並且與多核苷酸同義使用。此外，如本文定義之核酸之修飾或衍生物明確包含在一般術語「核酸」中。例如，肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)亦包含在術語「核酸」中。
核酸模板：核酸模板提供藉由 試管內轉錄過程來轉錄至RNA之核酸序列並且因此包含與由此轉錄之RNA序列互補的核酸序列。除了轉錄至RNA之核酸序列以外，核酸模板包含用於 試管內轉錄過程之RNA聚合酶以高親和力與其結合之啟動子。
較佳地，核酸模板可為線性化質體DNA模板。線性模板DNA可藉由在合適條件下，使質體DNA與限制酶接觸以使得限制酶在其識別位點處切割質體DNA並且破壞圓形質體結構來獲得。質體DNA較佳緊鄰在待轉錄至RNA中之序列末端之後切割。因此，線性模板DNA包含不彼此連接之游離5′末端及游離3′末端。若質體DNA含有用於限制酶之僅一個識別位點，線性模板DNA具有與質體DNA相同數目之核苷酸。若質體DNA含有用於限制酶之一個以上識別位點，線性模板DNA具有比質體DNA更小數目之核苷酸。然後，線性模板DNA為質體DNA之片段，該片段含有 試管內轉錄必不可少的元件，該等元件為RNA轉錄之啟動子元件及模板DNA元件。線性模板DNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)可藉由鹼基配對規則來決定轉錄RNA之序列。
在其他實施例中，核酸模板可選自合成雙鏈DNA構建體、具有包含RNA聚合酶結合之啟動子之雙鏈DNA區域的單鏈DNA模板、具有啟動子及終止子序列之環狀雙鏈DNA模板或藉由PCR或等溫擴增來擴增之線性DNA模板。
根據本揭示案之較佳實施例，包含於本文所述 試管內轉錄混合物中之核酸模板之濃度可在約1至約200 nM、約10 nM至約150 nM、約20 nM至約140 nM、約30 nM至約130 nM、約40 nM至約120 nM、約50 nM至約110 nM、約60 nM至約100 nM、約65 nM至約90 nM、約65 nM至約80 nM、約65 nM至約75 nM、約65 nM至約70 nM、約70 nM至約75 nM、約1至約40 nM、約1至約30 nM、約1至約20 nM、或約1至約10 nM範圍內。甚至更佳地，核酸模板之濃度可為約10至約30 nM。最佳地，核酸模板之濃度可為約40、50、60、70、80、90、或100 nM。
RNA，mRNA：RNA為核糖核酸之常用縮寫。其為核酸分子， 亦即，由核苷酸單體組成之聚合物。此等核苷酸通常為沿著所謂主鏈來彼此連接的腺苷-單磷酸(adenosine-monophosphate，AMP)、尿苷-單磷酸(uridine-monophosphate，UMP)、鳥苷-單磷酸(guanosine-monophosphate，GMP)及胞苷-單磷酸(cytidine-monophosphate，CMP)單體或其類似物。主鏈藉由第一單體之糖， 亦即，核糖，與第二、相鄰單體之磷酸鹽部分之間的磷酸二酯鍵來形成。單體之特定順序， 亦即，連接至糖/磷酸主鏈之鹼基之順序被稱為RNA序列。通常，RNA可藉由 例如細胞內部之DNA序列之轉錄來獲得。在真核細胞中，轉錄通常在細胞核或線粒體內部執行。 在活體內，DNA之轉錄通常產生所謂過早RNA，該RNA必須處理成所謂信使RNA，通常縮寫為mRNA。 例如真核生物體中之過早RNA之處理包括各種不同轉譯後修飾，諸如，剪接、5′-加帽、多腺苷酸化、從細胞核或線粒體中輸出及其類似修飾。此等過程之總和亦被稱為RNA之成熟。成熟信使RNA通常提供可轉譯成特定肽或蛋白之胺基酸序列的核苷酸序列。通常，成熟mRNA包含5′-帽、視情況5′UTR、開放閱讀框、視情況3′UTR、及聚(A)序列。
除了信使RNA以外，存在可涉及調節轉錄及/或轉譯、及免疫刺激的多種非編碼類型之RNA。術語「RNA」進一步涵蓋RNA分子，諸如病毒RNA、逆轉錄病毒RNA及複製子RNA、小干擾RNA (siRNA)、反義RNA、CRISPR/Cas9引導RNA、核酶、適體、核糖開關、免疫刺激RNA、轉移RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、微小RNA (miRNA)、及Piwi-相互作用RNA (piRNA)。
二羧酸或其鹽：二羧酸為具有兩個羧基(—COOH)之有機酸。該術語包括具有通式HO 2C—(CH 2) n—CO 2H之線性飽和二羧酸諸如草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸及癸二酸。其亦包括具有至少一個雙鍵之不飽和二羧酸諸如順丁烯二酸及反丁烯二酸以及具有至少一個額外官能基之經取代二羧酸諸如蘋果酸、酒石酸、菊苣酸及二巰基丁二酸。二羧酸之鹽包含二羧酸陰離子及合適陽離子諸如Na +、K +、Ca 2+或Mg 2+。
三羧酸或其鹽：三羧酸為具有三個羧基(—COOH)之有機酸。三羧酸之實例包括檸檬酸、異檸檬酸、烏頭酸、苯均三酸、次氮基三乙酸及丙烷-1,2,3-三羧酸。在本發明之緩衝系統及方法中，較佳使用檸檬酸(3-羧基-3-羥基戊烷-1,5-雙酸)。三羧酸之鹽包含三羧酸陰離子及合適陽離子，諸如Na +、K +、Ca 2+或Mg 2+。較佳地，使用檸檬酸鈉或檸檬酸鎂。若檸檬酸鎂添加至RNA試管內轉錄反應，可能不需要將鎂鹽添加至反應，因為檸檬酸鎂內之鎂離子可充當RNA聚合酶之輔因子。因此，在此情況下用於RNA試管內轉錄之反應混合物包含檸檬酸鎂、緩衝物質、核糖核苷三磷酸、核酸模板及RNA聚合酶。
緩衝物質：緩衝物質為在添加另一種酸或鹼之後，用於將溶液之酸性(pH)保持在選定值附近的弱酸或鹼。因此，緩衝物質之功能為在將酸或鹼添加至溶液時，防止pH之快速變化。用於本發明之合適緩衝物質包括Tris (2-胺基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇)及HEPES (2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)。緩衝物質可進一步包含用於調整pH之酸或鹼，諸如在Tris情況下之HCl (Tris-HCl)及在HEPES情況下之KOH (HEPES-KOH)。在本發明之一個較佳實施例中，檸檬酸用於調整緩衝物質，較佳Tris鹼之pH，以使得不需要添加其他酸。在替代實施例中，緩衝物質之pH用酸或鹼諸如HCl及KOH來調整並且除了pH調整緩衝物質以外，二或三羧酸之鹽較佳檸檬酸鹽存在於反應混合物中。
本文所述 試管內轉錄之混合物內之緩衝物質之濃度可為約10至約100 mM、約10至約80 mM、約10至約50 mM、約10至約40 mM、約10至約30 mM或約10至約20 mM。較佳地，緩衝物質之濃度為40 mM。
較佳地緩衝劑具有約6至約8.5、約6.5至約8.0、約7.0至約7.5、甚至更佳約7.5或約8.0之pH值。
核糖核苷三磷酸：核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，NTP) GTP、ATP、CTP及UTP為在 試管內轉錄過程期間聚合的單體。它們可具有一價或二價陽離子作為相對離子。較佳地一價陽離子選自由Li +、Na +、K +、NH4 +或參(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)組成之群。較佳地，二價陽離子選自由Mg 2+、Ba 2+及Mn 2+組成之群。更佳地，一價陽離子為Na +或參(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)。
NTP濃度可為約1 mM至約50 mM、約1 mM至約40 mM、約1 mM至約30 mM、約1 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約5 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約10 mM、約9 mM至約10 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約50 mM、約25 mM至約50 mM、約25 mM至約45 mM、約25 mM至約40 mM、約25 mM至約35 mM或約20 mM至約30 mM。
根據本發明之較佳實施例， 試管內轉錄反應混合物中之至少一種核糖核苷三磷酸之一部分或全部用如以下定義之經修飾核苷三磷酸來置換。
經修飾核苷三磷酸：如本文使用之術語「經修飾核苷三磷酸」係指包括主鏈修飾以及糖修飾或鹼基修飾之化學修飾。此等經修飾核苷三磷酸亦在本文中被稱為(核苷酸)類似物。
在此情況下，如本文定義之經修飾核苷三磷酸為核苷酸類似物/修飾， 例如，主鏈修飾、糖修飾或鹼基修飾。與本發明有關之主鏈修飾為其中核苷酸之主鏈之磷酸鹽經化學修飾的修飾。與本發明有關之糖修飾為核苷酸之糖之化學修飾。此外，與本發明有關之鹼基修飾為核苷酸之鹼基部分之化學修飾。在此情況下，核苷酸類似物或修飾較佳選自適用於轉錄及/或轉譯之核苷酸類似物。
糖修飾
可用於本發明之上下文中的經修飾核苷及核苷酸可在糖部分中經修飾。例如，2′羥基(OH)可用許多不同「氧基」或「脫氧」取代基來修飾或置換。「氧基」-2′羥基修飾之實例包括但是不限於烷氧基或芳氧基(—OR，例如，R═H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、—O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR；「鎖」核酸(locked nucleic acid，LNA)，其中2′羥基 例如藉由亞甲基橋來連接至相同核糖之4′碳；及胺基(—O-胺基，其中胺基 例如NRR可為烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)或胺基烷氧基。
「脫氧」修飾包括氫、胺基( 例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基、或胺基酸)；或胺基可經由連接子來連接至糖，其中連接子包含原子C、N、及O中之一或多者。
糖基團亦可含有與核糖中之相應碳相比，具有相反立體化學組態的一或多個碳。因此，經修飾核苷酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。
主鏈修飾
磷酸主鏈可進一步在經修飾核苷及核苷酸中經修飾。主鏈之磷酸基團可藉由用不同取代基置換氧原子中之一或多者來修飾。此外，經修飾核苷及核苷酸可包括未修飾磷酸部分用如本文所述經修飾磷酸來完全置換。經修飾磷酸基團之實例包括但是不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸鹽、硼烷磷酸酯、膦酸氫酯、醯胺磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有藉由硫來置換之兩個非連接氧。磷酸連接子亦可藉由用氮(橋接醯胺磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基-膦酸酯)來置換連接氧來修飾。
鹼基修飾
可用於本揭示案中之經修飾核苷及核苷酸可在核苷鹼基部分中進一步經修飾。發現於RNA中之核苷鹼基之實例包括但是不限於腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。例如，本文所述核苷及核苷酸可在主要槽面上經化學修飾。在一些實施例中，主要槽化學修飾可包括胺基、硫醇基、烷基、或鹵基。
在本發明之特別較佳實施例中，核苷酸類似物/修飾可以選自鹼基修飾，該等修飾較佳選自2-胺基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-胺基嘌呤-核苷-5'-三磷酸；2-胺基腺苷-5′-三磷酸、2′-胺基-2′-脫氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5′-三磷酸、2-硫尿苷-5′-三磷酸、2′-氟胸苷-5′-三磷酸、2 '-O-甲基肌苷-5'-三磷酸4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷- 5'-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5′-三磷酸、5-溴-2 ′-脫氧胞苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸、5-碘胞苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脫氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2′-脫氧胞苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸、6-氮雜胞苷-5′-三磷酸、6-氮雜尿苷-5′-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5′ -三磷酸、7-脫氮腺苷-5'-三磷酸、7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸、8-疊氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑核苷-5' -三磷酸、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5′-三磷酸、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸、O6-甲基鳥苷- 5′-三磷酸、假尿苷-5′-三磷酸或嘌呤黴素-5′-三磷酸、黃嘌呤核苷-5'-三磷酸。特別較佳用於鹼基修飾之核苷酸選自由以下組成的鹼基修飾核苷酸之群：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸及假尿苷- 5'-三磷酸。
在一些實施例中，修飾核苷可包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4 -硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5 -丙炔基-尿苷、1丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1 -牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脫氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、及4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。
在一些實施例中，修飾核苷可包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脫氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-脫氮雜-假異胞苷、澤布拉林(zebularine)、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫代-澤布拉林、2-硫代-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。
在其他實施例中，修飾核苷可包括2-胺基嘌呤、2，6-二胺基嘌呤、7-脫氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜-2-胺基嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜- 2-胺基嘌呤、7-脫氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-脫氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式羥基異戊烯基)腺苷、2 -甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯胺基甲醯腺苷、N6-蘇胺醯胺基甲醯腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯胺基甲醯腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤。
在其他實施例中，修飾核苷可包括肌苷、1-甲基-肌苷、維奧苷、威布糖、7-脫氮雜-鳥苷、7-脫氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-脫氮雜-鳥苷、6-硫代-7-脫氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基次黃苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷及N2,N2-二甲基-6 -硫代鳥苷。
在一些實施例中，核苷酸可在主要槽面上經修飾並且可包括用甲基或鹵基來置換尿嘧啶之C-5上之氫。
在具體實施例中，修飾核苷為5'-O-(1-硫代磷酸鹽)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸鹽)-胞苷、5'-O -(1-硫代磷酸鹽)-鳥苷、5'-O-(1-硫代磷酸鹽)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸鹽)-假尿苷。
在進一步具體實施例中，修飾核苷酸可以包括選自6-氮雜-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-異-胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫代尿苷、4-硫代尿苷、6-氮雜尿苷、5-羥基尿苷、脫氧胸苷、5-甲基尿苷、吡咯並胞苷、肌苷、α-硫代鳥苷、6-甲基鳥苷、5-甲基胞苷、8-側氧基-鳥苷、7-脫氮雜-鳥苷、N1-甲基腺苷、2-胺基-6-氯嘌呤、N6-甲基-2-胺基嘌呤、假異胞苷、6-氯嘌呤、N6-甲基腺苷、α-硫代腺苷、8-疊氮腺苷、7-脫氮雜腺苷的核苷修飾。
鎂鹽：鎂鹽包含鎂陽離子及合適陰離子，諸如氯化物或乙酸根陰離子。較佳地，鎂鹽為氯化鎂。在本文所述 試管內轉錄混合物中。較佳地，初始游離Mg 2+濃度可為約1至約100 mM、約1至約75 mM、約1至約50 mM、約1至約25 mM、或約1至約10 mM。甚至更佳初始游離Mg 2+濃度為約5至約50 mM、約10至約45 mM、約15至約40 mM、或約16至約37 mM，例如，約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或37 mM。熟習此項技術者可理解Mg 2+濃度之選擇可藉由初始總NTP濃度影響，意味著若在試管內轉錄混合物中使用更高總NTP濃度，可能需要使用更高Mg 2+濃度。在一些實施例中，鎂鹽之濃度可為約2 mM至約50 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約20 mM、約2 mM至約10 mM、約2 mM至約5 mM、約5 mM至約50 mM、約10 mM至約45 mM、約15 mM至約40 mM、約20 mM至約35 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、約22 mM至約28 mM、或約25 mM至約30 mM。
RNA聚合酶：RNA聚合酶為催化DNA模板轉錄至RNA的酶。用於本揭示案中之合適RNA聚合酶可包括T7、T3、SP6及 大腸桿菌RNA聚合酶。較佳地，可使用T7 RNA聚合酶。亦較佳，用於本揭示案中之RNA聚合酶可為重組RNA聚合酶，意味著其作為單一組分並且不作為含有除了RNA聚合酶以外之其他組分的細胞萃取物之一部分來添加至RNA 試管內轉錄反應。熟習此項技術者知道RNA聚合酶之選擇取決於存在於DNA模板的必須藉由合適RNA聚合酶來結合之啟動子。較佳地，本文所述 試管內轉錄混合物中之RNA聚合酶之濃度可為約0.001 µg/µl至約2 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1.5 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl、約0.1 µg/µl至約1 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.9 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.8 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.7 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.6 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.5 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.4 µg/µl、約0.1 µg/µl至約0.3 µg/µl、或約0.1 µg/µl至約0.2 µg/µl。視情況，本文所述 試管內轉錄混合物中之RNA聚合酶之濃度可為約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約1.5 U/µl、或約1.5 U/µl至約2 U/µl。熟習此項技術者可理解RNA聚合酶濃度之選擇可藉由DNA模板之濃度影響。
焦磷酸酶：焦磷酸酶為使二磷酸鍵水解的酸酐水解酶。在 試管內轉錄反應中，其可用於使在核糖核苷三磷酸併入新生RNA鏈中之後釋放的二磷酸內之鍵水解。較佳地，本文所述 試管內轉錄混合物中之焦磷酸酶之濃度可為約0.01 mU/µl至約2 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約2 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.9 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.8 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.7 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.6 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.4 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.3 mU/µl、或約0.1 mU/µl至約0.2 mU/µl。甚至更佳焦磷酸酶之濃度可為約0.3 mU/µl或可為約0.5 mU/µl。
5′-帽結構：5′帽通常為添加至RNA分子之5′末端的經修飾核苷酸，尤其鳥嘌呤核苷酸。較佳地，5′帽可使用5′-5′-三磷酸鍵來添加。5′帽可甲基化， 例如，m7GpppN，其中N為攜帶5′帽之核酸之末端5′核苷酸，通常RNA之5′末端。天然存在之5′帽可包括m7GpppN。
5′帽結構可藉由帽類似物來形成。
帽類似物：帽類似物係指具有帽功能之不可延伸二核苷酸或三核苷酸，此意味著其促進轉譯或定位，及/或在併入RNA分子之5′末端時，防止RNA分子之降解。沒有5’末端三磷酸結構之加帽mRNA減少其免疫原性副作用。不可延伸意味著因為帽類似物不具有5′三磷酸，所以帽類似物僅併入5′末端處並且因此不能藉由模板依賴性RNA聚合酶在3′方向上延伸。
在一些實施例中，帽類似物可包括具有式(I)之結構的帽-2類似物： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
當R=H時，帽-2類似物可包括以下： m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome。
當R=CH 3時，帽-2類似物可包括以下： m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
在一些實施例中，帽類似物可包括具有式(II)之結構的帽-2類似物： (II) ，其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
當R 1為OCH 3並且R 2為OH時，帽-2類似物可包括以下： m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
當R 1為OH並且R 2為H時，帽-2類似物可包括以下： m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
較佳地，帽類似物可以約1至約20 mM、約1至約17.5 mM、約1至約15 mM、約1至約12.5 mM、約1至約10 mM、約1至約7.5 mM、約1至約5 mM或約1至約2.5 mM範圍內之起始濃度添加。甚至更佳帽類似物可以約5至約20 mM、約7.5至約20 mM、約10至約20 mM或約12.5至約20 mM之起始濃度添加。在一些實施例中，帽類似物可為約0.5 mM至約50 mM、約0.5 mM至約40 mM、約0.5 mM至約30 mM、約0.5 mM至約20 mM、約0.5 mM至約10 mM、約0.5 mM至約5 mM、約1 mM至約10 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約6 mM至約9 mM、約6 mM至約8 mM、約6 mM至約7 mM、約7 mM至約8 mM、約7 mM至約9 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約9 mM、約8 mM至約10 mM、或約9 mM至約10 mM之濃度。
核糖核酸酶抑制劑：核糖核酸酶抑制劑抑制使RNA降解之核糖核酸酶的作用。較佳地，本文所述 試管內轉錄混合物中之核糖核酸酶抑制劑之濃度可為約0.001 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約4 U/µl、約0.001 U/µl至約3 U/µl、約0.001 U/µl至約2 U/µl、約0.001 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約5 U/µl、約0.01 U/µl至約4 U/µl、約0.01 U/µl至約3 U/µl、約0.01 U/µl至約2 U/µl、約0.01 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.5 U/µl、約0.01 U/µl至約0.1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.1 U/µl至約5 U/µl、約0.1 U/µl至約4 U/µl、約0.1 U/µl至約3 U/µl、約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.1 U/µl至約1 U/µl、約0.5 U/µl至約5 U/µl、約0.5 U/µl至約4 U/µl、約0.5 U/µl至約3 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約1 U/µl、約1 U/µl至約5 U/µl、約2 U/µl至約5 U/µl、約3 U/µl至約5 U/µl、約4 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約0.005 U/µl、約0.001 U/µl至約0.01 U/µl、約0.005 U/µl至約0.01 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.02 U/µl至約0.03 U/µl、約0.02 U/µl至約0.04 U/µl、或約0.02 U/µl至約0.05 U/µl。
抗氧化劑：抗氧化劑抑制其他分子之氧化。用於本揭示案中之合適抗氧化劑可包括但是不限於DTT (二硫蘇糖醇)、TCEP (參(2-羧乙基)膦)、NAC (N-乙醯半胱胺酸)、β-巰基乙醇、麩胱甘肽、半胱胺酸及胱胺酸。較佳地，DTT可用於試管內轉錄反應中。
本文所述 試管內轉錄混合物中之較佳DTT之抗氧化劑之濃度可為約1至約50 mM、約5至約48 mM、約8至約47 mM、約10至約46 mM、約15至約45 mM、約18至約44 mM、約20至約43 mM、約23至約42 mM、約25至約41 mM或約28至約40 mM。較佳地，濃度可為約20 mM。
胺：較佳地，待用於本發明中之胺可為甜菜鹼(三甲基甘胺酸)。較佳甜菜鹼之胺之濃度可為約10 mM至約2M，較佳其可為約0.7 M至約1.3 M。
多胺：較佳地，多胺可選自由精胺及精脒組成之群。較佳地多胺之濃度可為約1至約25 mM、約1至約20 mM、約1至約15 mM、約1至約10 mM、約1至約5 mM、或約1至約2.5 mM。甚至更佳多胺之濃度可為約2 mM。約2 mM之精脒之濃度可為最佳的。
DNA酶：DNA酶為藉由催化DNA主鏈中之磷酸二酯鍵之水解裂解來水解DNA的酶。合適DNA酶可從牛胰腺分離並且可從不同供應商諸如Sigma-Aldrich、New England Biolabs、Qiagen及ThermoFisher獲得。較佳地，DNA酶可不含任何RNA酶活性。在本揭示案之方法中，用DNA酶處理可在RNA試管內轉錄反應之後，藉由將DNA酶添加至用於RNA試管內轉錄之反應混合物來執行。較佳地，合適量之氯化鈣可與DNA酶一起添加至RNA試管內轉錄混合物。CaCl 2之合適量可為約1至約5 mM、較佳約2至約4 mM並且更佳地其可為約3 mM。DNA可用DNA酶處理約1至約5小時，較佳約1.5至約3小時及更佳地約2小時。DNA酶處理可較佳在約37℃之溫度下執行。在一個實施例中，約3 mM CaCl 2及約200 U/ml DNA酶I可添加至RNA試管內轉錄混合物並且所得混合物可在約37℃下孵育約兩個小時。在另一實施例中，約3 mM CaCl 2及約400 U/ml DNA酶I可添加至RNA試管內轉錄混合物並且所得混合物可在約37℃下孵育約兩個小時。在另一實施例中，DNA酶可添加至RNA試管內轉錄混合物並且所得混合物可在約31℃下孵育約30分鐘。DNA酶處理可藉由添加EDTA或另一種螯合劑來停止。較佳地，DNA酶處理可藉由添加EDTA至約25 mM之最終濃度來停止。
本發明之實施例可提供以時間有效方式來 試管內合成例如不限於約1Kb-20Kb，諸如1Kb-15Kb，或1Kb-10Kb範圍內之不同大小的具有高加帽效率、均勻聚A尾、高產率及完整性之mRNA的組合解決方案。本發明之實施例可包括設計DNA模板中之T7啟動子序列以便提供與帽類似物之高親和力，以便 試管內用T7 RNA聚合酶來轉錄加帽mRNA。此DNA模板啟動子設計可包括T7 Ф6.5啟動子，繼之以序列GG。此設計可確保有效開始轉錄，以便藉由一個步驟方法，在5’末端處製備具有高保真度之加帽mRNA。
mRNA之5’末端加帽
決定mRNA轉譯效率之關鍵因素中之一者可為其5’末端加帽。通常，加帽使用加帽酶來執行，並且雖然加帽效率可為較高的，但是過程為耗費時間的及昂貴的。因此需要允許更快產生更高效率加帽mRNA之有效共轉錄方法。此需求藉由Ishikawa M., Ishikawa, 等人, 「Preparation of eukaryotic mRNA having differently methylated adenosine at the 5′-terminus and the effect of the methyl group in translation」, Nucleic Acids Symposium Series第53卷，第1期，2009年9月-10月，第129–130頁來部分地解決。Ishikawa證明使用m7GpppA*pG結構(其中A*為腺苷或甲基化腺苷衍生物)之三核苷酸帽類似物，經由一個步驟 試管內轉錄來製備加帽mRNA。藉由使用此等分子，Ishikawa獲得攜帶A、A m、 m6A、或 m6A m作為第一轉錄核苷酸之報告5’加帽mRNA並且研究其在兔網狀細胞系統中之轉譯性質。另一研究亦確認使用帽類似物之mRNA之共轉錄加帽。Sikorski, P.J., 等人, 2020, 「The identity and methylation status of the first transcribed nucleotide in eukaryotic mRNA 5′ cap modulates protein expression in living cells」, Nucleic acids research,48(4), 第1607-1626頁。
在實施例中，可提供增加加帽效率之方法及/或組成物。在實施例中，可提供增加加帽效率至高於約50%效率、高於約55%效率、高於約60%效率、高於約65%效率、高於約70%效率、高於約75%效率、高於約80%效率、高於約85%效率、高於約90%效率、高於約95%效率、高於約96%效率、高於約96.5%效率、高於約97%效率、高於約97.5%效率、高於約98%效率、高於約98.5%效率、高於約99%效率、高於約99.5%效率之方法及/或組成物，如藉由用RNA酶H來切割mRNA，隨後用LC-MS來量測加帽效率之方法來量測。
在實施例中，帽類似物可啟動試管內轉錄，以便在一鍋式反應中合成加帽mRNA。在實施例中，反向G帽之後的甲基-A之第一鹼基可結合至DNA模板之-1位置，並且G之第二鹼基可結合至DNA模板之+1位置，從而藉由RNA聚合酶來形成複合物，在轉錄過程期間募集下一個核糖核苷三磷酸(ribonucleoside triphosphate，NTP)以便伸長RNA。例如，如第1圖中示出，當帽-2類似物(m 7GpppA 2’-OmeG 2’-Ome)用於IVT中時，反向G帽之後之甲基-A之第一鹼基結合至DNA模板之-1位置，G之第二鹼基結合至DNA模板之+1位置，從而藉由T7 RNA聚合酶來形成複合物，在轉錄過程期間募集下一個NTP以便伸長RNA。
在實施例中，提供包含一或多種如本文描述之帽類似物的組成物。在實施例中，提供使用一或多種如本文描述之帽類似物的方法。在實施例中，如本文描述之帽類似物可與本文描述之組成物及/或方法結合及/或與傳統組成物及/或方法結合使用。在實施例中，本文所述方法及/或組成物可增加mRNA加帽效率至高於約50%效率、高於約55%效率、高於約60%效率、高於約65%效率、高於約70%效率、高於約75%效率、高於約80%效率、高於約85%效率、高於約90%效率、高於約95%效率、高於約96%效率、高於約96.5%效率、高於約97%效率、高於約97.5%效率、高於約98%效率、高於約98.5%效率、高於約99%效率、高於約99.5%效率、或多達約100%效率。
啟動子
DNA模板中之啟動子設計可對於依賴DNA之RNA聚合酶啟動 試管內轉錄而言為至關重要的。在實施例中，其中可使用T7 RNA聚合酶(衍生自T7噬菌體之單一亞單位聚合酶)，DNA模板啟動子設計可包括T7 Ф6.5啟動子，繼之以序列GG、GA或AGG。在實施例中，此設計可實現高度有效開始轉錄，以便藉由一個步驟方法，在5’末端處製備具有高保真度之mRNA。
在實施例中，啟動子可具有序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)，其中X 1為A或G，X 2為A或G，並且X 3為A、T、G、或C，
在實施例中，其中可使用T7 RNA聚合酶，表1中之至少一個啟動子序列可用於啟動 試管內轉錄。啟動子可經由基因合成或次選殖來添加至質體載體中。 表1
SEQ ID NO 序列
10 TAATACGACTCACTATAGGG
11 TAATACGACTCACTATAGG
12 TAATACGACTCACTATAAGG
13 TAATACGACTCACTATAGAT
14 TAATACGACTCACTATAGA
15 TAATACGACTCACTATTAGG
在實施例中，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15中之至少一者可用於啟動 試管內轉錄。
在實施例中，提供包含一或多種如本文描述之啟動子之組成物。在實施例中，提供包含一或多種如本文描述之啟動子之載體。在實施例中，提供使用一或多種如本文描述之啟動子的方法。在實施例中，提供包含有包含一或多種如本文描述之啟動子之mRNA的組成物。在實施例中，提供包含有包含一或多種如本文描述之啟動子之mRNA的載體。在實施例中，提供使用包含一或多種如本文描述之啟動子之mRNA的方法。
在一些實施例中，試管內轉錄可在-1位置處開始，從而可有助於藉由T7 RNA聚合酶來形成更有利複合物並且依次產生更多全長RNA。採用使用開始位點之-1及+1位置用於試管內轉錄允許選擇第一mRNA鹼基(不包括帽鹼基)之更大靈活性並且為如表1所描述的用於產生mRNA之定製序列保留+2位置。在試管內轉錄期間併入帽分子的當前一般實務使用+1位置用於開始mRNA合成，從而需要模板在TATA盒之T7啟動子序列之後具有AG或AT之正確序列。本發明之實施例可包括使用具有規則T7啟動子序列之DNA模板的方法，該模板在T7啟動子之TATA盒之後具有GG，從而不需要對於用於共轉錄製備帽-1 mRNA之DNA模板進行特定誘變。
在一些實施例中，將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法可包括提供(1) DNA模板，該模板包含可操作地連接至含有5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)、3’UTR、及聚A區域之核酸的啟動子，及(2)含有式(I)或(II)之結構的帽類似物： ，(I) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， (II) ，其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。 其中啟動子可含有序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)， 其中位置17處之A為-1核苷酸並且位置18處之X 1為+1核苷酸， 當X 1為G，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A或m 6A並且B 2為G， 當X 1為A，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A或m 6A並且B 2為A， 當X 1為C，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A或m 6A並且B 2為C，及 當X 1為T，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A或m 6A並且B 2為U， 其中帽類似物結合至啟動子之-1及+1核苷酸，並且將DNA模板及帽類似物在反應混合物中孵育，其中孵育可包括在約15℃至約35℃下孵育反應混合物約1小時至約12小時，由此產生RNA。
啟動子可含有選自SEQ ID NO：10、11、12、13、及14之序列。
在一些實施例中，將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法可包括提供(1) DNA模板，該模板包含可操作地連接至含有5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)、3’UTR、及聚A區域之核酸的啟動子，及(2)帽類似物，其中帽類似物結合至啟動子之-1及+1核苷酸，並且將DNA模板及帽類似物在反應混合物中孵育，其中孵育可包括將反應混合物在約15℃至約35℃，較佳約18℃至約31℃下孵育較佳約1小時至約12小時之適當時間，由此產生RNA。
在一些實施例中，將DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法可包括提供(1) DNA模板，該模板包含可操作地連接至含有5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之開放閱讀框(open reading frame，ORF)、3’UTR、及聚A區域之核酸的啟動子，及(2)帽類似物，其中帽類似物結合至啟動子之-1及+1核苷酸，並且將DNA模板及帽類似物在反應混合物中孵育，由此產生RNA。
在一些實施例中，反應混合物包含NTP及RNA聚合酶。在一些實施例中，反應混合物可進一步包含以下中之一或多者：緩衝物質、RNA酶抑制劑、鎂鹽、多胺、及焦磷酸酶。
在一些實施例中，反應混合物包含：約45 mM至約55 mM之濃度之緩衝物質、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl之濃度之RNA酶抑制劑、約1 mM至約10 mM之濃度之NTP、約6 mM至約8 mM之濃度之帽類似物、約20 mM至約30 mM之濃度之一或多種鎂鹽、約1.5 mM至約2.5 mM之濃度之多胺、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之濃度之DNA模板、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl之濃度之焦磷酸酶、及約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之濃度之RNA聚合酶。
5’ UTR及3’ UTR
mRNA分子可側接有5’末端及3’末端未轉譯區域(UTR)。5’-UTR可藉由核糖體來識別以便允許開始轉譯，並且3’UTR可含有可影響mRNA之表現及半衰期的調控序列。5’及3’UTR之多個不同組合可實現在哺乳動物細胞中表現時之mRNA之高表現效率。
Cao, 等人(Cao， 等人，「High-throughput 5’UTR engineering for enhanced protein production in non-viral gene therapies」, Nature Communications, (2021) 12:4138, 第1-10頁，該文獻以全文引用方式併入本文)報道經由高通量篩選過程來產生人工5’UTR之方法。
在實施例中，可使用人工選擇5’UTR、及人類血紅蛋白或小鼠血紅蛋白3’UTR之組合以便產生高度有效表現mRNA序列之構建體。可選擇並且使用其組合來構建用於 試管內轉錄(in vitro transcription，IVT)之載體。其可用於產生具有高度有效蛋白表現能力之mRNA。在實施例中，使用表2闡述之一或多種UTR ( 參見以下，實例1)。在實施例中，表2闡述之一或多種UTR可以任何組合來使用。在實施例中，如表2闡述，UTR可成對使用，並且配對之成員在同一列中。在實施例中，SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.2配對，SEQ ID NO.3與SEQ ID NO.2配對，SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.4配對，SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.6配對，SEQ ID NO.3與SEQ ID NO.6配對，及/或SEQ ID NO.9與SEQ ID NO.2配對。在實施例中，使用表5闡述之UTR中之一或多者可實現在哺乳動物細胞中表現時之mRNA之高表現效率。在實施例中，使用表5闡述之UTR對中之一或多者可實現在哺乳動物細胞中表現時之mRNA之高表現效率。
不同5’UTR及3’UTR對可以例如從5’至3’方向之取向來選殖至載體中：啟動子例如T7啟動子(SEQ ID NO：10)、5’UTR、Kozak序列(GCCACC)、eGFP編碼序列、及3’UTR。然後，載體可次選殖至pVAX載體中以便產生用於mRNA製備之質體。5’UTR及3’UTR對之實例展示於表2中。 表2
5’-UTR 3’-UTR
#1 CTTGTCTCGCTCCGGGGAACGCTCGGAAACTCCCGGCCGCCGCCACCCGCGTCTGTTCTGTTACACAAGGGAAGAAAAGCCGCTGCCGCACTCCGAGTGT (SEQ ID NO: 1) TAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA (SEQ ID NO: 2)
#2 CTTGTCTCGCTCCGGGGAACGCTCGGAAACTCCCGGCCGCCGCCACCCGCGTCTGTTCTGTTACACAAGGGAAGAAAAGCCGCTGCCGCACTCCGAGTGT (SEQ ID NO: 1) TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTCTAG (SEQ ID NO: 4)
#3 CTTGTCTCGCTCCGGGGAACGCTCGGAAACTCCCGGCCGCCGCCACCCGCGTCTGTTCTGTTACACAAGGGAAGAAAAGCCGCTGCCGCACTCCGAGTGT (SEQ ID NO: 1) CTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAGCTAGC (SEQ ID NO: 8)
#4 CACTCGCGCTGCCATCACTCTTCCGCCGTCTTCGCCGCCATCCTCGGCGCGACTCGCTTCTTTCGGTTCTACCAGGTAGAGTCCGCCGCCATCCTCCACC (SEQ ID NO: 3) TAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA (SEQ ID NO: 2)
#5 GAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC (SEQ ID NO: 5) CTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAGCTAGC (SEQ ID NO: 8)
#6 CTTGTCTCGCTCCGGGGAACGCTCGGAAACTCCCGGCCGCCGCCACCCGCGTCTGTTCTGTTACACAAGGGAAGAAAAGCCGCTGCCGCACTCCGAGTGT (SEQ ID NO: 1) ATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATC (SEQ ID NO: 6)
#7 ATCTGAATGG AGCAGCCAAG CTTGACACTC TAAACCCCTG GACCCTTCTT TTTTGCCCTTGGCT (SEQ ID NO: 7) TTAATTAAGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTCTAG (SEQ ID NO: 4)
#8 AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA (SEQ ID NO: 9) TAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA (SEQ ID NO: 2)
在實施例中，T7啟動子序列、UTR可經由基因合成來添加至開放閱讀框編碼序列，然後可次選殖至質體載體中以便產生用於試管內轉錄應用之大規模質體DNA。提供包含一或多種如本文描述之UTR之組成物。在實施例中，提供包含一或多種如本文描述之UTR之載體。在實施例中，提供使用一或多種如本文描述之UTR的方法。在實施例中，提供包含有包含一或多種如本文描述之UTR之mRNA的組成物。在實施例中，提供包含有包含一或多種如本文描述之UTR之mRNA的載體。在實施例中，提供使用包含一或多種如本文描述之UTR之mRNA的方法。
聚A尾
聚A尾品質(諸如長度以及長度及分佈之均勻性)可直接影響mRNA表現效率。 試管內將聚A尾添加至mRNA產物之傳統方法使用聚A聚合酶。 參見例如Cao, G.J.及Sarkar, N., 「Identification of the gene for an Escherichia coli poly(A) polymerase」, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1992) 89(21), 10380-10384，該文獻以全文引用方式併入本文。然而，此等方法通常產生具有廣泛分佈之聚A尾長度的產物，其中僅約70%之mRNA加尾。
除了加帽及聚A尾長度及分佈以外，mRNA純度及完整性可為影響mRNA之性質諸如但是不限於其穩定性及/或表現效率的重要因素。純化、啟動子序列、5’及/或3’UTR序列，及/或轉錄條件可有助於產生高品質mRNA。
試管內將聚A尾添加至mRNA產物之傳統方法使用聚A聚合酶，如例如Cao等人( Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89, 10380-10384)所描述。但是此方法可產生具有廣泛分佈之聚A尾長度的聚A產物， 例如其中僅約70%之mRNA經多腺苷酸化。
在實施例中，方法及/或組成物可包括提供加帽類似物、提供及/或改良聚A尾之長度及/或分佈的方法、提供有效啟動子、提供有效UTR諸如UTR對、提供有效轉錄條件、提供有效轉錄系統、提供有效純化、或其任何組合。
在實施例中，可提供在轉錄mRNA分子之間，增加聚A尾之長度及/或分佈之均勻性的方法及/或組成物。在實施例中，方法及/或組成物可產生mRNA群體，其中高於約70%加尾，其中至少約71%加尾，其中至少約72%加尾，其中至少約73%加尾，其中至少約74%加尾，其中至少約75%加尾，其中至少約76%加尾，其中至少約77%加尾，其中至少約78%加尾，其中至少約79%加尾，其中至少約80%加尾，其中至少約85%加尾，其中至少約90%加尾，其中至少約95%加尾，其中至少約99%加尾。
在實施例中，方法及/或組成物可產生mRNA群體，其中聚A尾之長度(腺嘌呤之數目)在mRNA分子之間變化至多約70至約130個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約60至約120個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約50至約100個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約40至約90個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約50至約80個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約40至約70個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約30至約50個腺嘌呤、或在mRNA分子之間至多約20至約40個腺嘌呤。mRNA之聚A尾長度可藉由用RNA酶T1來消化mRNA之方法來量測，隨後用寡-dT磁性珠粒來純化及回收聚A片段，然後藉由Bioanalyzer毛細管凝膠電泳來測試聚A片段長度。
在實施例中，在轉錄之前，將聚A尾添加至DNA模板。在實施例中，可提供在轉錄之前，將聚A尾添加至DNA模板之方法。在實施例中，聚A尾經由聚合酶鏈反應(PCR)來添加至DNA模板，與藉由基因合成來插入質體載體中之傳統方法相比，該反應為添加聚A尾之新方法。在實施例中，將聚A尾添加至DNA模板可導致產生更均勻聚A加尾mRNA產物、具有更長聚A尾之產物、或兩者，該等結果中之各者或兩者可導致更有效mRNA表現。
在實施例中，提供包含有包含藉由如本文描述之PCR來添加之聚A尾之mRNA的組成物。在實施例中，提供包含藉由如本文描述之PCR來添加至載體之聚A尾的載體。在實施例中，提供pVAX1或pUC57載體，該載體包含胺苄青黴素耐受基因、T7啟動子序列、5’UTR及3’UTR序列、包含藉由如本文描述之PCR來添加之聚A尾(例如，100A)的mRNA。
在實施例中，所揭示方法及/或組成物可產生mRNA群體，其中高於約70%加尾，其中至少約71%加尾，其中至少約72%加尾，其中至少約73%加尾，其中至少約74%加尾，其中至少約75%加尾，其中至少約76%加尾，其中至少約77%加尾，其中至少約78%加尾，其中至少約79%加尾，其中至少約80%加尾，其中至少約85%加尾，其中至少約90%加尾，其中至少約95%加尾，其中至少約99%加尾，其中至少約100%加尾。
在實施例中，所揭示方法及/或組成物可產生mRNA群體，其中聚A尾之長度(腺嘌呤之數目)在mRNA分子之間變化至多約70至約130個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約60至約120個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約50至約100個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約40至約90個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約50至約80個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約40至約70個腺嘌呤、在mRNA分子之間至多約30至約50個腺嘌呤、或在mRNA分子之間至多約20至約40個腺嘌呤。
細菌研究證明重複序列，例如，CTG.CAG，以及質體複製及轉錄之模式及水準可在重複之擴展及缺失中發揮作用。在對pUC19中之插入物之轉錄進行驅動的lacZ啟動子之誘導之後，所選殖重複序列之缺失頻率可增加多達20倍(Bowater等人，1997.Transcription increases the deletion frequency of long CTG·CAG triplet repeats from plasmids in Escherichia coli. Nucleic Acids Res25: 2861–2868；該文獻之內容以引用方式併入本文)。常見載體可通常保持在高拷貝數下並且可誘導抗生素抗性基因、指示基因(諸如藍色/白色篩選基因)及插入片段之轉錄及轉譯，從而導致某些類別之DNA序列的不穩定性。作為極端重複及極其低GC比率序列，聚A序列可容易在質體選殖及複製之過程中失去。若出現此序列，受上游及下游啟動子之誘導活性影響的意外轉錄及轉譯可進一步增加聚A序列之不穩定性。為了避免載體中之類似啟動子對於所插入序列之啟始活性，常見策略可包括分割所插入基因(若所插入基因具有顯著細胞毒性)或相對於從載體之啟動子的轉錄，在「逆」取向上進行ORF之定向選殖。然而，此等兩個策略可不適合於含有聚A序列之基因選殖。分割可消除表現之後的所選殖基因之遺傳毒性，但是此策略不可解決聚A序列之不穩定性之問題，因為未消除轉錄過程，而逆插入僅可消除某一方向上之啟動子之影響。因此，本發明之實施例可包括藉由在多個選殖位點之上游及下游插入轉錄終止子來修飾載體，從而可有效地中斷多個選殖位點之上游及下游啟動子對於所插入基因之影響。此策略有效地改良在質體選殖及複製過程中之聚A序列之穩定性，尤其對於一些極其不穩定的含有聚A之匣而言。結果示出，在向多個選殖位點之上游及下游添加轉錄終止子之後，純系之陽性率達到25%-50% (在添加終止子之前幾乎為0)，並且聚A尾之A鹼基之數目從70-110增加至約120。另外，在所插入匣之上游及下游添加終止子之後，質體之產率亦增加32.5%。不限於特定理論，此增加可歸因於插入轉錄終止子恢復複製起點之活性(Stueber等人，1982.Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes. EMBO J1: 1399–1404；該文獻之內容以引用方式併入本文)。在多個選殖位點之上游及下游處使用轉錄終止子來促進選殖細胞毒性序列或重複序列諸如聚A尾在此項技術中未曾報道。
轉錄終止序列可為當在轉錄上安置於編碼開放閱讀框之核苷酸序列之下游時，導致開放閱讀框轉錄結束的任何核苷酸序列。此等序列在此項技術中為已知的並且可為原核、真核或噬菌體來源。終止子序列之實例包括但是不限於PTH-終止子、PET-T7終止子、T3-Tφ終止子、pBR322-P4終止子、水泡性口炎病毒終止子、rrnB-T1終止子、rrnB-T2終止子、λt0終止子、rrnC終止子、Ttadc轉錄終止子、及酵母識別終止序列諸如Matα (α-因子)轉錄終止子、原生α-因子轉錄終止序列、ADR1轉錄終止序列、ADH2轉錄終止序列、及GAPD轉錄終止序列。轉錄終止子序列之非詳盡清單可在可於partsregistry.org/Terminators/Catalog處獲得之iGEM註冊表中發現。2、3、4、5、6、7、或更多個系列之第一轉錄終止子序列可直接安置於所關注基因(或開放閱讀框)之最終核苷酸之3’或在至少1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1,000或更多個核苷酸之距離處，位於所關注基因(或開放閱讀框)之最終核苷酸之3’。串聯轉錄終止子序列之間之核苷酸之數目可變化，例如，轉錄終止子序列可藉由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或更多個核苷酸來分隔。
載體
在實施例中，提供包括以下中之一或多者的載體：(i)如本文描述之聚A尾、(ii)一或多種如本文描述之UTR、(iii)一或多種如本文描述之啟動子、或(iv)其組合。在實施例中，載體可具有各種用途，包括但是不限於用於插入目標模板核苷酸序列。在實施例中，作為非限制性實例，用於目標模板核苷酸序列之此載體可用於選殖或轉錄目標模板核苷酸序列。在實施例中，轉錄可包括 試管內轉錄。在實施例中，轉錄可使用T7 RNA聚合酶來執行。在實施例中，載體可為質體或病毒載體，例如但是不限於pVAX1及/或pUC57。
mRNA純度
mRNA之完整性可影響細胞表現；因此用高完整性mRNA來開始轉譯可為重要的。用於轉錄之條件可影響所產生mRNA之品質。一些轉錄條件可產生更高截短產物。
mRNA之完整性可為影響細胞表現之關鍵因素中之一者，因此以高完整性mRNA來開始可為首要的。mRNA完整性存在兩個方面。通常，RNA由於其化學不穩定性而傾向於比DNA更快降解，因此儲存條件影響RNA之品質。另外，轉錄條件亦可產生更高截短產物並且因此可憑經驗地決定最佳緩衝條件以便在較寬範圍之mRNA大小上具有更高完整性並且亦具有更高產率。
用於純化之條件可影響所產生mRNA之品質。例如，製成mRNA產物中之 m7GpppA *pG殘基之三核苷酸帽類似物可與加帽mRNA競爭以便募集核糖體，因而抑制細胞中之mRNA轉譯效率。 試管內轉錄之後的純化可為獲得最終純化mRNA產物中之重要步驟。
本揭示案進一步提供獲得純mRNA產物的解決方案，該產物具有最少的可干擾並且損害mRNA產物之性能的污染帽類似物、游離NTP、及其他蛋白。mRNA純度係指粗轉錄mRNA產物中之全長mRNA物質比率，該比率可藉由毛細管凝膠電泳中之全長峰比率來定量。
在實施例中，如本文描述之純化可產生非常純mRNA產物，該產物具有最少的可干擾及/或損害mRNA產物之穩定性及/或轉譯效率的污染類似物、游離NTP，及/或其他蛋白。在實施例中，純化方法包括使用二氧化矽膜管柱來結合核酸，然後用水中之約60%至約80%乙醇，較佳水中之約70%至約80%乙醇來洗滌，隨後在水中溶離。
出於相同目的，可採用具有LiCl沉澱、或基於親和力之磁性珠粒純化的其他習知純化方法。在實施例中，如本文描述之純化方法可與本文描述之組成物及/或方法結合及/或與傳統組成物及/或方法結合使用。
在實施例中，可提供增加所轉錄mRNA之純度的方法及/或組成物。在實施例中，可提供導致獲得具有約79%或更大純度之mRNA；具有約79.5%或更大純度之mRNA；具有約80%或更大純度之mRNA；具有約80.5%或更大純度之mRNA；具有約81%或更大純度之mRNA；具有約81.5%或更大純度之mRNA；具有約82%或更大純度之mRNA；具有約82.5%或更大純度之mRNA；具有約83%或更大純度之mRNA；具有約83.5%或更大純度之mRNA；具有約84%或更大純度之mRNA；具有約84.5%或更大純度之mRNA；具有約85%或更大純度之mRNA；具有約85.5%或更大純度之mRNA；具有約86%或更大純度之mRNA；具有約86.5%或更大純度之mRNA；具有約87%或更大純度之mRNA；具有約87.5%或更大純度之mRNA；具有約88%或更大純度之mRNA；具有約88.5%或更大純度之mRNA；具有約89%或更大純度之mRNA；具有約89.5%或更大純度之mRNA；具有約90%或更大純度之mRNA；具有約91%或更大純度之mRNA；具有約92%或更大純度之mRNA；具有約93%或更大純度之mRNA；具有約94%或更大純度之mRNA；具有約95%或更大純度之mRNA；具有約96%或更大純度之mRNA；具有約97%或更大純度之mRNA；具有約98%或更大純度之mRNA；具有約99%或更大純度之mRNA；或具有約100%純度之mRNA的方法及/或組成物。mRNA純度可藉由使用Bio analyzer設備之毛細管凝膠電泳來量測，目標峰面積比率(目標長度±15%)可針對其純度量測來進行計算。
在實施例中，可提供增加轉錄mRNA之純度或完整性的方法及/或組成物。從試管內轉錄來獲得高品質長mRNA為極大挑戰，因為長mRNA傾向於更容易降解。
在一些實施例中，IVT可在約15℃至約35℃、約16℃至約35℃、約17℃至約35℃、約18℃至約35℃、約18℃至約34℃、約18℃至約33℃、約18℃至約32℃、約18℃至約31℃、約18℃至約30℃、約18℃至約29℃、約18℃至約28℃、約18℃至約27℃、約18℃至約26℃、約18℃至約25℃、約18℃至約24℃、約18℃至約23℃、約18℃至約22℃、約18℃至約21℃、約18℃至約20℃、約18℃至約19℃、約25℃至約26℃、約25℃至約27℃、約25℃至約28℃、約25℃至約29℃、約25℃至約30℃、約25℃至約31℃、約21℃至約22℃、約21℃至約23℃、約21℃至約24℃、約21℃至約25℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、或約35℃下執行。
在一些實施例中，可執行IVT約1小時至約12小時、約1小時至約11小時、約1小時至約10小時、約1小時至約9小時、約1小時至約8小時、約1小時至約7小時、約1小時至約6小時、約1小時至約5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2小時、約2小時至約12小時、約3小時至約12小時、約4小時至約12小時、約5小時至約12小時、約6小時至約12小時、約7小時至約12小時、約8小時至約12小時、約9小時至約12小時、約10小時至約12小時、約11小時至約12小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、或約10小時。
在一些實施例中，IVT可在約31℃下執行約1小時至約5小時、約1小時至約4.5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3.5小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2.5小時、約1小時至約2小時、約1小時至約1.5小時、約0.5小時至約1小時、約0.5小時至約1.5小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、或約5小時。
T7 RNA聚合酶介導轉錄
在真核生物中，信使RNA (mRNA)之轉錄藉由RNA聚合酶II來進行。此為具有複雜調節之錯綜多亞單位酶。為了執行大規模 試管內轉錄，研究人員通常使用衍生自T7、T3、SP6、K1-5、K1E、K1F或K11噬菌體之單一亞單位噬菌體聚合酶。此家族之聚合酶使用約17個核苷酸之簡單、最少啟動子序列，該等序列可不需要輔助蛋白並且可具有啟始核苷酸序列之最少限制因素。雖然本申請案著重於T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)，熟習此項技術者理解本揭示案可對於其他RNA聚合酶實施。
T7 RNA聚合酶(RNAP)以至少兩種蛋白狀態存在。第一者被稱為「無效複合物」並且可與轉錄啟始相關。第二者為被稱為「伸長複合物」的非常持續之構型。 試管內轉錄可分解為六個步驟：1) RNA聚合酶結合至啟動子序列、2)啟始轉錄、3)被稱為無效轉錄之非持續伸長、在此期間聚合酶經常釋放DNA模板及短無效轉錄物、4)開放複合物轉變為閉合複合物、5)持續伸長、及6)轉錄終止。在轉錄期間產生的大量RNA可含有約2-8個核苷酸之長度的短無效片段( Biochemistry19:3245-3253 (1980); Nucleic Acids Res.9:31-45 (1981); Nucleic Acids Res.15:8783-8798 (1987); Biochemistry27:3966-3974 (1988)，該等文獻中之各者以全文引用方式併入本文)。在合成約10-14個鹼基之後，RNA聚合酶可從無效循環中逃脫，同時失去與啟動子DNA之序列特異性接觸，並且形成持續伸長複合物，其中RNA鏈可以不依賴於序列之方式來延伸( J. Mol.Biol.183:165-177(1985); Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:3614-3618(1986); Mol.Cell Biol.7:3371-3379 (1987)，該等文獻中之各者以全文引用方式併入本文)。 表3
轉錄物中之位置
轉錄物序列
SEQ.ID.NO: 21
啟動子頂部鏈
啟動子底部鏈 SEQ.ID.NO: 22
模板中之位置
最具活性III類T7啟動子之共有序列可涵蓋在轉錄開始位點上游17 bp及下游6 bp之序列( Cell16:815-25.(1979)，該文獻以全文引用方式併入本文)。第一轉錄核苷酸之位置通常被稱為RNA之+1轉錄物核苷酸，第二轉錄核苷酸為+2轉錄物核苷酸依此類推(表3)。在轉錄期間，兩個鏈可熔融以便形成轉錄泡並且雙鏈體(在表3中3′至5′展示)之底部鏈為用於轉錄之模板。對於轉錄物核苷酸+3及以上，模板鏈可主要經由Watson-Crick鹼基配對相互作用來定義轉錄核苷酸之同一性。在本文中，編碼第一RNA轉錄物核苷酸之核苷酸定義為模板之+1核苷酸。在表3展示之實例中，+1轉錄物核苷酸為G並且+1模板核苷酸為C。同樣地，+4轉錄物核苷酸為A並且+4模板核苷酸為T。
已知T7 RNAP亦可隨著短寡核苷酸引子來啟始。例如，已知T7基因組中之13個啟動子可隨著pppGpG來啟始( J. Mol.Biol.370:256-268 (2007)，該文獻以全文引用方式併入本文)。已經證明T7 RNAP可從二核苷酸引子來啟始( Biochemistry24:5716-5723 (1985)，該文獻以全文引用方式併入本文)。Axelrod 等人顯示未加帽GpA二核苷酸可從分別為2′-脫氧胞苷及2′-脫氧胸苷(「CT」模板)之+1及+2模板核苷酸來啟始。其反應條件為200微莫耳(μM)二聚體及100 μM ATP、CTP、GTP及UTP。其反應混合物亦包含100 μM 3′ dATP、3′ dCTP 3′ dUTP或50 μM 3′ dGTP。他們僅觀察到GpA啟始RNA並且並非來自GTP啟始的GpA啟始RNA及5′三磷酸RNA的混合物。由於所使用反應條件，此情況為可能的。100 μM GTP完全低於第一啟始鳥苷之T7聚合酶之2 mM Kd ( J. Mol.Biol.(2007) 370, 256-268，該文獻以全文引用方式併入本文)。由於GTP與啟始寡核苷酸競爭啟始，使用低GTP濃度青睞GpA啟始但是可導致低轉錄產率(最大計算產率估計為＜150 ug/mL之反應)。當在具有ApG、CpG、UpG或GpG之「CT」模板上啟始轉錄時，觀察到形成具有額外未模板化5′核苷酸(分別為A、C、U或G)之RNA轉錄物。
Ishikawa等人證明結構 m7GpppApG， m7Gppp m6ApG， m7GpppA 2′OmepG或 m7Gppp m6A 2′OmepG之加帽啟始寡核苷酸三聚體可在模板位置+1及+2處具有2′-脫氧胞苷殘基之模板(「CC」模板； Nucleic Acids Symposium SeriesNo. 53: 129 (2009)，該文獻以全文引用方式併入本文)上啟始轉錄。作者闡明，「來自使用 m7G5′pppG之案例的不同結果可由 m7G5′pppN1pG中之額外腺苷(N1)與−1位置處之T7啟動子中之2′-脫氧胸苷之間的鹼基配對造成」。此方法明顯不同於本揭示案描述之方法，其中啟始加帽寡核苷酸三聚體之+1及+2核苷酸與模板核苷酸之+1及+2配對。Ishikawa等人使用6 mM啟始寡核苷酸三聚體、0.9 mM GTP及各自7.5 mM之ATP、CTP及UTP。相對於競爭GTP，作者使用高於6倍過量之加帽啟始寡核苷酸引子，轉錄反應之最昂貴核苷酸組分，以便驅動忽略pppRNA的朝向加帽RNA的轉錄反應，從而增加合成RNA之總成本。另一方面，低濃度之GTP (0.9 mM)限制轉錄反應中之RNA之總產率(理論上小於1.4 mg/mL)。相反，本文所述方法可能不需要為了達成有效RNA加帽及RNA之更高產率(約2至10 mg/mL)而限制任何NTP之濃度，並且因此允許以商業上可用成本來產生高品質mRNA。
T7 RNA聚合酶
在一些實施例中，T7 RNA聚合酶之至少一個修飾可選自由以下組成之群：P266L、P270L、P270S、P270A、P270Y、Q744L、Q744P、Q744R、Y639F、H784A、E593G、Y639V、V685A、H784G、S430P、N433T、S633P、F849I及F880Y。在一些實施例中，至少一個修飾包括Y639F及H784A。在一些實施例中，至少一個修飾包括E593G、Y639V、V685A及H784G。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I及F880Y。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I、F880Y及P266L。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I、F880Y、Y639F及H784A。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I、F880Y、P266L、Y639F及H784A。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I、F880Y、E593G、Y639V、V685A及H784G。在一些實施例中，至少一個修飾包括S430P、N433T、S633P、F849I、F880Y、P266L、E593G、Y639V、V685A及H784G。
在一些實施例中，T7 RNA聚合酶之至少一個修飾促進啟始-伸長過渡。在一些實施例中，至少一個修飾增加啟動子清除。在一些實施例中，至少一個修飾增加聚合酶之穩定性及/或活性。在一些實施例中，至少一個修飾增加聚合酶之熱穩定性。
試管內轉錄中之鎂離子
鎂離子(Mg 2+)為RNA 試管內轉錄緩衝系統中的用帽類似物而不是用GTP來啟始轉錄的基本組分。RNA 試管內轉錄之習知緩衝系統( 例如，HEPES緩衝液、Tris-HCl緩衝液)可含有高濃度之游離鎂離子，因為可需要游離Mg 2+離子來保證RNA聚合酶之高活性。在試管內轉錄過程期間，Mg 2+在反應期間與NTP複合，保持沒有額外游離Mg 2+離子存在於緩衝系統中對於確保所轉錄mRNA之高加帽效率及高完整性而言為至關重要的。因此，更高濃度之Mg 2+可導致問題，尤其在高產率/工業規模RNA生產之背景中。在RNA之生產中，與游離Mg 2+離子相關之一些問題可包括鎂驅動沉澱物，該等沉澱物可導致游離Mg 2+濃度下降，導致鎂離子從RNA聚合酶反應中心中耗盡。彼之結果為不太有效RNA 試管內轉錄。為了評估Mg濃度對於mRNA IVT產率及完整性之影響，在遞增Mg濃度存在下執行IVT。藉由在IVT反應中，將最終Mg濃度分別保持在16.5 mM、21 mM、29 mM、及37 mM，在IVT反應系統中，在與NTP及帽類似物複合之後的游離Mg 2+之濃度分別為-12 mM、-8 mM、0 mM及+8 mM。在IVT系統中，當Mg 2+濃度增加時，mRNA產率減少並且當Mg 2+濃度增加時，mRNA完整性亦減少。 實例 實例1
合成帽類似物
一般。
5’-DMT-2’-O-甲基-鳥苷(n-ibu)及5’-DMT-2’-O-甲基-N6-甲基-腺苷3’-亞磷醯胺購自ChemGenes, Inc., (Wilmington, MA)。化學磷酸化試劑[5’-磷酸醯胺(O-DMT-2,2’-磺醯二乙醇)]購自Biosearch Technologies。TLC以購自Sigma-Aldrich之鋁背矽膠60 F 254板來運作。 1H及 31P NMR光譜在Bruker 300 MHz光譜儀上獲得。HPLC層析圖在使用HALO 90A C18管柱(4.6 x 150 mm)及具有50 mM TEAB緩衝液，pH 7.8/乙腈之梯度溶離的Agilent 1290 Infinity II系統上獲得。TLC及/或HPLC分析通常用於監測反應完成。UV光譜資料在VWR UV-3100PL分光光度計上獲得。緩衝溶液使用從Mill-Q EQ 7000超純水系統分配之水來製備。所報道化合物如先前描述來製備： 2a：Sawai等人(Synthesis and Reactions of Nucleoside 5‘-Diphosphate Imidazolide.A Non-enzymatic Capping Agent for 5‘-Monophosphorylated Oligo ribonucleotides in Aqueous Solution, J. Org.Chem., 1999, 64, 5836-5840); 2band 9: Jemielity等人(Novel 「anti-reverse」 cap analogues with superior translational properties, RNA, 2003, 9, 1108-1122)。該等文獻之內容以全文引用方式併入本文。
合成帽-2類似物
製備中間物 3，(第2圖)。
向5’-DMT-2’-O-甲基鳥苷(n-ibu)(1.0 g，1.49 mmol)於20 ml無水吡啶中之溶液添加由9:1，乙酸酐/無水THF組成之3.4 ml溶液。所得溶液在氬氣氛下攪拌22 hr.然後將溶液蒸發至乾。
然後將殘餘物在10 ml.之80%乙酸水溶液中攪拌2 hr。溶劑在減壓下剝離並且殘餘物藉由矽膠層析，用乙酸乙酯中之0 10%甲醇之梯度溶離來純化。將純產物溶離份彙集並且蒸發提供白色泡沫：590-mg (96%)產率；TLC (乙酸乙酯/甲醇[9:1]) Rf=0.48；'H NMR (二甲基-d6亞碸) δ 12.10 (1H, br s), 11.68 (1H br s), 8.33 (1H, s), 5.88 (1H, d, J = 9.0 Hz), 5.44 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.31 (1H, t, J = 6.0 Hz), 4.56 (1H, m), 4.14 (1H, br t), 3.63 (2H, t, J = 3.0 Hz), 3.26 (3H, s), 2.77 (1H, m), 2.13 (3H, s), 1.14 & 1.11 (6H, 2 x s)；質譜(ESI+) m/z410.16 (M + H+)。
製備中間物 4，(第3圖)。
將中間物 3(585 mg，1.43 mmol)及5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲醯基-腺苷,2'-O-甲基,3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(1.27 g，1.48 mmol)溶解於40 ml無水乙腈中。添加四唑(6.0 ml之無水乙腈中之0.45 M溶液)並且所得溶液在氬氣氛下攪拌18 h。向此溶液添加(1 S)-(+)-(樟腦磺醯基)噁嗪啶(CSO)氧化劑(6.0 ml之乙腈中之0.50 M溶液)並且所得溶液攪拌16 h。將溶劑剝離並且殘餘物在10 ml之80%乙酸水溶液中攪拌16 h。將溶液在減壓下蒸發至乾並且殘餘物藉由矽膠層析，用乙酸乙酯中之0 15%甲醇之移動相梯度溶離來純化。將純溶離份彙集並且蒸發以便提供非晶固體：865-mg (67%)產率；TLC (乙酸乙酯 / 甲醇 [9:1]) [9:1]) R f = 0.21; 31P NMR (二甲基-d6亞碸) δ -2.11 & -2.21 (1P,2 x s, 非鏡像異構對)；質譜 (ESI+) m/z910.42 (M + H+)。
製備中間物 5(第3圖)。
在室溫下，在氬氣氛下，將中間物 4(124 mg，0.136 mmol)及「化學磷酸化試劑」(197 mg，0.30 mmol)在3.0 ml無水乙腈中之0.45M四唑中攪拌4.0 hr。HPLC分析指示偶合反應完成並且將3.0 ml之CSO氧化劑溶液(無水乙腈中之0.50 M)直接添加至反應溶液。繼續攪拌1.0 hr，然後將溶劑在減壓下剝離。
向殘餘物添加20 ml之1/1濃氫氧化銨/甲醇。將反應容器密封並且允許在37℃下靜置2天。將溶劑剝離殘餘物與20 ml水混合，然後過濾。將濾液施加至DEAE-Sephadex A25管柱並且用0 0.70 M TEAB緩衝液，pH 7.8之梯度來溶離。將純產物溶離份彙集並且蒸發至乾。TEAB鹽藉由從水多次蒸發來移除。最終殘餘物溶解於最小體積之10% DMF水溶液中並且產物之三乙銨鹽藉由添加乙腈來沉澱：57-mg (45%)產率。'H NMR (D2O) δ 8.31 (1H, s), 8.02 (1H, s), 7.43 (1H, s), 5.96 (1H d, J = 5.1 Hz), 5.8 (1H, d, J = 5.1 Hz), 4.83 (1H, m), 4.53 (1H, t, J = 4.4 Hz), 4.35 (3H, m), 4.22 (1H, m), 4.10 (2H, m), 3.97 (2H, m), 3.37 (3H, s), 3.34 (3H, s), 3.08 & 1.16 (q及t, 三乙銨相對離子)；31P NMR (D2O) δ 0.26 (1P, s), -0.78 (1P, s)；質譜 (ESI) m/z720.2。
製備中間物 1a(第3圖)。
在室溫下將中間物 5(12.8 mg，0.014 mmol)、 2a(16.7 mg，0.027 mmol)、及MnCl2 (2.5 mg，0.020 mmol)之混合物在無水DMSO (257 µl)中攪拌18 hr。添加EDTA (75 µl之水中之0.5 M溶液)並且用水將溶液稀釋至2.0 ml。將此溶液施加至DEAE-Sephadex A25管柱並且用0 0.70 M TEAB緩衝液，pH 7.8之梯度溶離。將產物溶離份彙集並且在減壓下蒸發至乾。TEAB緩衝鹽藉由從水多次蒸發來消除。殘餘物藉由逆相(C18)高壓液相層析來進一步純化：4.7-umol (34%)產率；質譜(ESI) m/z1,159.8。
製備中間物 1b(第3圖)。
在室溫下，將中間物 5(7.0 mg，0.076 mmol)、 2a(7.0 mg，0.011 mmol)、及MnCl2 (2.5 mg，0.016 mmol)之混合物在無水DMSO (200 µl)中攪拌18 hr。添加EDTA (50ul之水中之0.5 M溶液)並且用水將溶液稀釋至5.0 ml，然後凍乾。粗產物藉由逆相(C18)高壓液相層析來純化：5.9-umol (78%)產率；質譜(ESI) m/z1,173.2。
WO2022036858揭示使用包括磷酸水解酶、鳥苷基轉移酶、及T4 RNA連接酶1之酶來製備帽-2類似物之方法。相比之下，本發明之實施例可在帽-2類似物之製備中不包括酶。以下展示WO2022036858揭示之方法與本揭示案中之方法之間的比較。
WO2022036858 本揭示案
(a) 將2'-O-甲基-ATP、2'-O-甲基-GTP、2'-O-甲基-CTP及2'-O-甲基-UTP分別溶解在無RNA酶水中，然後與磷酸水解酶混合並且將2×反應緩衝液混合並且孵育以便獲得2'-O-甲基-ADP、2'-O-甲基-GDP、2'-O-甲基-CDP及2'-O-甲基-UDP (a) 將含有乙酸酐/無水吡啶之溶液添加至5’-DMT-2’-O-甲基鳥苷(n-ibu)之溶液。然後將來自此反應之產物在80%乙酸中孵育以便獲得化合物(3)：
(b) 將步驟1)獲得之2'-O-甲基-ADP、2'-O-甲基-GDP、2'-O-甲基-CDP及2'-O-甲基-UDP溶解在無RNA中然後將酶水分別與7-甲基鳥苷、7-甲基-3'-O-甲基鳥苷、鳥苷基轉移酶、及2×反應緩衝液混合，並且孵育以便獲得m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)及3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)； (b) 將四唑添加至含有化合物(3)及5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲醯基-腺苷,2'-O-甲基,3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺之溶液。然後添加合適氧化劑(諸如CSO)，隨後在80%乙酸水溶液中孵育以便獲得化合物(4)： ，
(c) 將m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)及3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')( 2'OMeA/G/C/U)溶解在無RNA酶水中，與T4 RNA連接酶1混合，然後與2'-O-甲基-ATP、2'-O-甲基-GTP、2'-O -甲基-CTP及2'-O-甲基-UTP混合，然後與2×T4 RNA連接酶反應緩衝液混合並且孵育以便獲得新穎帽-2結構5'帽類似物。 (c) 使化合物(4)與化學磷酸化試劑及四唑反應，隨後CSO，以便在用氫氧化銨溶液進一步處理之後，獲得化合物(5)。
(d) 在MnCl 2或ZnCl 2存在下，使化合物(5)與(2a)或(2b)反應： 以便獲得帽-2類似物(1a)或(1b)： 。
合成N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)-帽-2類似物
製備中間物 7(第4圖)。
將中間物 3(51 mg，0.125 mmol)及5'-DMT-2'-O-甲基-N6-甲基-腺苷3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(100 mg，0.125 mmol)溶解在四唑溶液(1.0 ml之無水乙腈中之0.45 M溶液)中並且在氬氣氛下攪拌2 h。向此溶液添加CSO氧化劑(1.0 ml之乙腈中之0.50 M溶液)並且將所得溶液攪拌20 min。將溶劑剝離並且在室溫下，將殘餘物在1.0 ml之80%乙酸水溶液中攪拌16 h。在減壓下將溶液蒸發至乾並且殘餘物藉由矽膠層析，用乙酸乙酯中之0 20%甲醇之移動相梯度溶離來純化。將中間物 6之純溶離份彙集並且蒸發以便提供非晶固體：80 mg (87%)產率。
將中間物 6(80 mg，0.109 mmol)及化學磷酸化試劑(100 mg，0.152 mmol)溶解在四唑溶液(1.0 ml之無水乙腈中之0.45 M溶液)中並且在氬氣氛下攪拌2 h。向此溶液添加CSO氧化劑(1.0 ml之乙腈中之0.50 M溶液)並且將所得溶液攪拌20 min然後將溶劑剝離。將殘餘物再溶解於甲醇/氫氧化銨之50/50混合物中並且將密封反應容器在37℃下孵育2天。然後將反應溶液蒸發至乾，再溶解於12 ml水中並且負載至DEAE Sephedex A25管柱上並且用0 0.60 M TEAB緩衝液，pH 7之梯度溶離。將純產物溶離份彙集並且蒸發至乾。過量TEAB緩衝鹽藉由從水執行多次蒸發來移除。獲得呈非晶固體的三乙銨鹽形式之中間物 7：28 mg 產率；TLC (正丁醇/水/乙酸, [5:3:1]) R f = 0.13；質譜(ESI) m/z734.2。
製備帽試劑類似物 8(第4圖)。
在室溫下，將三乙銨鹽形式之中間物 7(6.9 mg，0.007 mmol)、三乙銨鹽形式之 2b(10.0 mg，0.016 mmol)、及MnCl2 (2.0 mg，0.016 mmol)之混合物在無水DMSO (200 µl)中攪拌40 hr。添加EDTA (100 µl之水中之0.5 M溶液)並且用水將溶液稀釋至5.0 ml並且凍乾。殘餘物藉由逆相(C18)高壓液相層析來純化：6.0 mg (54%)產率；質譜(ESI) m/z1,187.6。 實例2
試管內轉錄
線性化DNA質體及PCR產物可用作藉由試管內轉錄來製備mRNA之DNA模板。為了測試試管內轉錄條件，含有T7啟動子(SEQ ID NO：10或12)、5’-UTR (SEQ ID NO：9)、eGFP編碼序列、3’-UTR (SEQ ID NO：2)、及聚A尾(100A)之質體載體藉由BspQ1或Bbs1限制酶來線性化，並且使用磁性珠粒來純化。線性化質體用T7 RNA聚合酶(野生型)、帽類似物(帽-2)、10x轉錄緩衝液、NTP、及RNA酶抑制劑來轉錄以便製備加帽mRNA。
試管內轉錄混合物及條件如表4-6闡述。更具體而言，含有HEPES緩衝液之10x緩衝液藉由添加乙酸鎂、精脒、及DTT來製備並且儲存於-20℃下供使用。在試管內轉錄反應中，將緩衝液、無DNA酶及無RNA酶水、NTP (如表中指定之濃度)、及帽類似物添加至反應管，隨後添加DNA模板、T7聚合酶、RNA酶抑制劑、及無機焦磷酸酶。反應保持在20-40℃範圍內之指定溫度下1至6小時以便發生轉錄。然後，DNA模板藉由用DNA酶1無RNA酶之酶消化來移除。
帽類似物可為本文所述任何加帽類似物。對於表4-6描述之IVT反應，使用帽-2類似物m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome及m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome。對於此等實例，m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome在本文中被稱為帽-2。在m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome中，甲氧基(–OCH 3)置換更接近於m7G之3’-OH基團。此修飾類似於抗逆帽類似物(ARCA：3´-O-Me-m7GpppG)中之修飾。Stepinski等人(Stepinski J, Waddell C, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE (2001) Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 「anti-reverse」 cap analogues 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG.RNA 7：1486–1495；該文獻之內容以引用方式併入本文)展示ARCA中之此3’-O修飾防止產生在逆取向中加帽之mRNA。m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome被稱為ARCA-帽-2。IVT反應亦使用AG帽-1類似物來執行。
HEPES緩衝液為水中之400 mM HEPES，pH 7.5。RNA聚合酶可為野生型T7 RNA聚合酶或具有增強穩定性及/或併入帽-2類似物之能力之突變的T7 RNA聚合酶。試管內轉錄可在0.2 mL至15 mL範圍內之無DNA酶無RNA酶塑膠管中，在規定溫度下在具有或不具有振盪的情況下建立。
三個IVT條件(IVT1、IVT2、及IVT3)如表4-6中指定來進行測試。表4顯示其中相等濃度之NTP用於IVT的IVT1條件。表5顯示其中GTP濃度如展示減少的IVT2條件。表6顯示其中ATP及GTP之濃度如展示減少的IVT3條件。 表4. IVT1條件
組分 條件 單位
緩衝液類型 Hepes, pH 7.5 NA
緩衝液濃度 40 mM
DTT 20 mM
RNA酶抑制劑 0.02 U/μL
CTP或修飾CTP 9.47 mM
UTP或修飾UTP 9.47 mM
ATP 9.47 mM
GTP 9.47 mM
帽類似物 7.6 mM
Mg(OAc) 2 28 mM
精脒 2 mM
DNA* 0.03 µg/µl
無機焦磷酸酶 0.3 mU/μL
RNA聚合酶 1.5 U/μL
孵育溫度 31 ℃
孵育時間 3 小時
表5. IVT2條件
組分 條件 單位
緩衝液類型 Hepes, pH 7.5 NA
緩衝液濃度 40 mM
DTT 20 mM
RNA酶抑制劑 0.02 U/μL
CTP或修飾CTP 9.47 mM
UTP或修飾UTP 9.47 mM
ATP 9.47 mM
GTP 1.9 mM
帽類似物 7.6 mM
Mg(OAc) 2 28 mM
精脒 2 mM
DNA* 0.03 µg/µl
無機焦磷酸酶 0.3 mU/μL
RNA聚合酶 1.5 U/μL
孵育溫度 31 ℃
孵育時間 3 小時
表6. IVT3條件
組分 條件 單位
緩衝液類型 Hepes, pH 7.5 NA
緩衝液濃度 40 mM
DTT 20 mM
RNA酶抑制劑 0.02 U/μL
CTP 9.47 mM
N1-甲基-假UTP 9.47 mM
ATP 3.79 mM
GTP 1.9 mM
帽類似物 7.6 mM
Mg(OAc) 2 28 mM
精脒 2 mM
DNA* 0.03 µg/µl
無機焦磷酸酶 0.3 mU/μL
RNA聚合酶 1.5 U/μL
孵育溫度 31 ℃
孵育時間 3 小時
使用二氧化矽膜管柱，mRNA從IVT反應純化。簡言之，來自試管內轉錄之mRNA與緩衝液及乙醇混合，並且添加至二氧化矽膜管柱，隨後用70%乙醇洗滌並且用水或用於mRNA之其他儲存緩衝液來溶離。
二氧化矽管柱純化mRNA之量藉由Nanodrop來決定以便計算IVT反應之總產率，該產率表示為每微升IVT反應所獲得之mRNA之量(微克)。
藉由本揭示案之方法來製備之mRNA之完整性經受藉由Agilent Bioanalyzer之完整性分析以便基於大小來評估純度。使用Agilent RNA Nano 6000套組。所分析之mRNA之純度經由塗片分析來分析以便計算目標長度±10% mRNA群體之比率。
mRNA之加帽效率藉由RNA酶H消化及LC-MS來檢查，如Beverly等人(「Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS.」 Anal Bioanal Chem.2016 Jul;408(18):5021-30；該文獻之內容以引用方式併入本文)所描述。簡言之，將短生物素化RNA/DNA混合探針黏接至mRNA，然後用RNA酶H消化。然後將含有探針及mRNA之5’末端的雙鏈體純化以便進行LC-MS分析。
因而用啟動子SEQ ID NO 10或12來製備之eGFP mRNA用於A549細胞中之表現效率檢定。A549細胞在前一天接種於96孔透明底部黑色板中。eGFP mRNA樣品一式三份，在200 ng/孔mRNA下加上0.4 µl脂質體MessengerMax與OptiMEM一起轉染至接種細胞中。將細胞與mRNA一起孵育隔夜，然後表現效率使用板閱讀器，基於eGFP mRNA處理細胞之相對螢光強度來評定。該等值藉由如藉由Cyquant XTT細胞生存力檢定來測試之相對細胞數目來標準化。並且用帽-2帽類似物來製備之mRNA之標準化值與用AG帽-1帽類似物來製備之彼等進行比較。 結果
編碼eGFP之質體模板用於使用以上條件及程序來產生mRNA。IVT反應之mRNA產率呈現於表7中。 帽-2: ARCA-帽2：
使用IVT1條件及啟動子#2 (SEQ ID NO：10)，使用帽-2 (8.07 µg/µl)或ARCA-帽-2 (7.65 µg/µl)之mRNA產率與使用AG帽-1之mRNA產率(6.99 µg/µl)相似。使用帽-2 (2.12 µg/µl)及ARCA-帽-2 (2.09 µg/µl)，使用啟動子#1 (SEQ ID NO：12)之mRNA產率比使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)之mRNA產率更低。
使用IVT2條件，使用帽-2及啟動子#1 (SEQ ID NO：12)之mRNA產率為2.14 µg/µl並且使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)之mRNA產率為2.56 µg/µl。使用ARCA-帽-2之mRNA產率使用啟動子#1 (SEQ ID NO：12)為2.08 µg/µl並且使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)為2.06 µg/µl。
使用IVT3條件，使用帽-2及啟動子#1 (SEQ ID NO：12)之mRNA產率為1.98 µg/µl並且使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)之mRNA產率為2.62 µg/µl。使用ARCA-帽-2及啟動子#1 (SEQ ID NO：12)之mRNA產率為1.8 µg/µl並且使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)之mRNA產率為2.85 µg/µl。
表7.具有經修改IVT條件之IVT反應產率 表7. 使用不同帽類似物及模板的IVT反應之產率(µg/µl)
IVT/ 啟動子 (SEQ ID NO) AG 帽 -1 帽 -2 ARCA- 帽 -2
IVT1 12 7.31 2.12 2.09
10 6.99 8.07 7.65
IVT2 12 2.64 2.14 2.08
10 2.87 2.56 2.06
IVT3 12 1.8 1.98 1.8
10 2.62 2.62 2.85
在Agilent Bioanalyzer上，使用RNA Nano 6000套組，將用帽-2或ARCA-帽-2來加帽之IVT mRNA之完整性與用AG帽-1來加帽之彼等進行比較。結果展示於表8中。對於啟動子#1 (SEQ ID NO：12)模板，使用AG帽-1來製備之mRNA具有900-1150nt範圍中之71-78%純度。比較而言，用帽-2及ARCA-帽-2來製備之mRNA具有相同範圍中之82-83%及80-84%純度。對於啟動子#2 (SEQ ID NO：10)模板，用AG帽-1來製備之mRNA具有900-1150 nt範圍中之85-93%純度，與分別用帽-2及ARCA-帽-2來製備之mRNA之89-91%及89%形成比較。
表8. 來自具有經修改條件之IVT反應的mRNA完整性(900-1150 nt)
IVT/ 啟動子 (SEQ ID NO) AG 帽 -1 帽 -2 ARCA- 帽 -2
IVT1 12 87% 84% 83%
10 92% 89% 83%
IVT2 12 88% 81% 80%
10 78% 81% 79%
IVT3 12 78% 82% 80%
10 78% 79% 79%
mRNA之加帽效率藉由如以上描述之RNA酶H消化及LC-MS來檢查。使用IVT1條件，以＞80%加帽效率，AG帽-1帽類似物可有效地共轉錄併入IVT mRNA中。使用相同IVT1條件，使用帽-2之共轉錄加帽為低效率的。如表9展示，使用IVT1條件及啟動子#1 (SEQ ID NO：12)，帽-2及ARCA-帽-2分別具有34.6%及14.4%加帽效率。與使用啟動子#1 (SEQ ID NO：12)相比，使用啟動子#1 (SEQ ID NO：10)與帽-2之加帽效率更好(44.4%)，但是對於ARCA-帽II而言較差(2.3%)。使用經修改IVT條件，mRNA之共轉錄加帽效率改良。使用啟動子#1 (SEQ ID NO：12)及帽-2，加帽效率在IVT2及IVT3條件中分別為69.6%及63.0%。使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)，觀察到額外改良，例如，在IVT2及IVT3條件中分別為71.2%及67.5%。類似地，使用ARCA-帽-2及啟動子#2 (SEQ ID NO：12)，效率為62.6% (IVT2)及67.9% (IVT3)。雖然與IVT1 (2.30%)比較，在經修改IVT2 (20.5%)及IVT3 (17.45%)條件中，使用啟動子#1 (SEQ ID NO：10)，ARCA-帽-2之加帽效率改良，但是效率小於在IVT2 (71.2%)及IVT3 (67.5%)中使用帽-2之效率。 表9. 不同mRNA之加帽效率
IVT/ 啟動子 (SEQ ID NO) 帽 -2 ARCA- 帽 -2
IVT1 12 34.60% 14.40%
10 44.40% 2.30%
IVT2 12 69.6% 62.6%
10 71.2% 20.5%
IVT3 12 63.0% 67.90%
10 67.50% 17.45%
mRNA亦轉染至A549細胞中以便決定其可轉譯性。A549細胞在前一天接種並且在24小時後使用板閱讀器來檢查。如第5圖中示出，與其不佳加帽效率一致，如與使用AG帽-1來產生之mRNA相比，使用帽-2及ARCA-帽-2及IVT1條件與啟動子#1 (SEQ ID NO：12)或啟動子#2 (SEQ ID NO：10)來產生之mRNA顯示不佳表現，例如，使用啟動子#1 (SEQ ID NO：12)之AG帽-1水準＜30%並且使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)之AG帽-1水準為約10%。在經修改IVT條件(IVT2及IVT3)中使用啟動子#2 (SEQ ID NO：12)導致mRNA表現顯著增加，與其經改良之加帽效率一致。例如，相對於AG帽-1 mRNA，在IVT2條件中使用帽-2及ARCA-帽II獲得＞75% mRNA表現水準。使用帽-2及ARCA-帽II，分別獲得幾乎60%及80% mRNA表現水準。在IVT2及IVT3條件中，藉由使用啟動子#2 (SEQ ID NO：10)，亦觀察到經改良之表現，儘管在較低水準下。例如，相對於AG帽-1 mRNA，藉由在IVT2條件中使用帽-2及ARCA-帽II，觀察到＞40%之mRNA表現水準並且藉由在IVT3條件中使用帽-2及ARCA-帽II，觀察到＞20%之mRNA表現水準。 實例3
A. 製備帽試劑類似物 11(m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome) (第6圖)
中間物 9(16 mg, 0.028 mmol)與三苯基膦(28 mg, 0.11 mmol)、咪唑(13 mg, 0.19 mmol)及2, 2’-二硫代吡啶(25 mg, 0.11 mmol)組合。混合物溶解於無水DMSO (146 ul)中並且添加三乙基胺(19 ul)。所得溶液在室溫下攪拌45分鐘，然後用1.8 ml之丙酮中之冰冷0.2 M高氯酸鈉來稀釋。反應溶液用丙酮中之冰冷0.2 M高氯酸鈉溶液來稀釋總計1.8 ml並且將形成之沉澱物離心沉降至球團。將上清液丟棄，並且將球團用1.8 ml冰冷丙酮來洗滌並且再次旋轉沉降至球團。將此丙酮清洗週期再重複四次，然後產物球團在高真空下乾燥以便提供呈乳白色固體之中間物 10。此固體與中間物 5(9.0 mg, 0.0098 mmol)及MgCl 2(3.2 mg, 0.025 mmol)組合。混合物溶解於無水DMSO (160 ul)中並且所得溶液在攝氏37度下孵育18小時。添加EDTA (400 ul之0.5 M溶液)並且所得溶液然後用水來稀釋至5.0 ml並且凍乾。將粗反應產物溶解於水中並且藉由逆相(C18)高壓液相層析來純化：5.3 umol (54%)產率之 11；質譜(ESI) m/z1,172。
B. 製備m 7G 3’OmePP SpA 2’OmepG 2’Ome( 16)
B-1. 製備中間物 13及 14(第7圖)
3’-O-甲基鳥苷-5’-磷酸( 12)根據Jemielity等人, RNA, 2003, 9, 1108-1122來製備。中間物 12(132 mg，0.28 mmol)之三乙銨鹽溶解於4.0 ml水中並且溶液用乙酸來調整至pH 4.0。在10分鐘時期內逐滴添加硫酸二甲酯(0.38 ml)並且將反應溶液攪拌4小時，並且為了將反應溶液保持在pH 3.75–4.25之間，添加氫氧化鈉溶液。4小時反應期之後，反應溶液用二氯甲烷(3 x 16 ml)來萃取並且將包含於水相中之粗產物藉由使用TEAB，pH 7.8–乙腈梯度之逆相(C18) HPLC來純化。將純產物溶離份凍乾以便提供白色固體：110-mg (81%)產率之呈三乙銨鹽之中間物 13。
中間物 13(104 mg, 0.18 mmol)與咪唑(85 mg, 1.25 mmol)、三苯基膦(188 mg, 0.74 mmol)及2, 2’-二硫代吡啶(164 mg, 0.72 mmol)組合。混合物溶解於2.0 ml之含有三乙基胺(130 ul)之乾燥DMSO中。所得溶液在室溫下攪拌4.0 hr。然後用冰冷0.2 M高氯酸鈉/丙酮溶液，將反應溶液稀釋至25 ml。將形成之沉澱物離心沉降至球團並且將上清液丟棄。將球團懸浮於25 ml冰冷丙酮中，渦旋並且離心以便形成球團。再次將上清液丟棄並且將此過程再重複3個週期。最終球團在高真空下乾燥，提供呈白色固體之5’-磷酸咪唑類似物 13：101-mg產率。
將5’-磷酸咪唑類似物 13(101 mg)與MnCl2 (3.0 mg，0.024 mmol)組合並且在室溫下，在4.0 ml之二甲基甲醯胺中之0.25 M雙三乙銨硫代磷酸鹽中攪拌1.0小時。然後，用水將反應溶液稀釋至50 ml。粗產物藉由使用0 0.70 M TEAB，pH 8.3緩衝液之梯度的離子交換層析(DEAE Sephedex A25樹脂)來純化。將純產物溶離份彙集並且從水蒸發幾次以便移除揮發性鹽物質。將純化產物(雙三乙銨鹽形式之 14)凍乾以便提供白色固體：63-mg (87%產率)；質譜(ESI) m/z486。
B-2. 製備中間物 15(第8圖)
中間物 5(28 mg, 0.030 mmol)與三苯基膦(49 mg, 0.19 mmol)、咪唑(22 mg, 0.32 mmol)、2, 2’-二硫代吡啶(42 mg, 0.18 mmol)組合。將混合物溶解於含有三乙基胺(33 ul)之無水DMSO (250 ul)中。將反應在RT下攪拌30分鐘，然後用15 ml冰冷0.2 M高氯酸鈉/丙酮溶液來稀釋。將形成之沉澱物離心沉降至球團並且將上清液丟棄。球團用15 ml冰冷丙酮來洗滌並且再次旋轉沉降至球團。將上清液丟棄並且將此過程再重複三次。最終，球團在高真空下乾燥以便提供白色固體：20-mg (82%)產率之呈二鈉鹽形式之中間物 15。
B-3. 製備帽試劑類似物 16(第8圖)
將中間物 15(20 mg，0.025 mmol)及中間物 14(9.0 mg，0.015 mmol)組合並且在37℃下，在含有無水氯化鋅(22 mg)之無水二甲基甲醯胺(145 ul)中攪拌18小時。添加EDTA (400 ul之0.5 M溶液)並且溶液用水來稀釋至5.0 ml並且凍乾。將粉末再溶解於水中並且兩種形式之帽類似物 16(非鏡像異構物)藉由使用50 mM TEAB，pH 8.0-乙腈梯度之逆相(C18) HPLC來一起分離。將純產物溶離份彙集並且凍乾以便提供白色固體：2.0 umol產率(在255 nm下分光光度計決定；消光係數=30,540)；質譜(ESI) m/z1188。 實例4
為了測試使用帽-2類似物藉由IVT來產生之mRNA之活體內蛋白表現，向小鼠注射ALC0315-LNP調配物，該調配物囊封使用藉由IVT來產生之帽2類似物(帽2-Fluc)或帽1類似物(帽1-Fluc)，藉由IVT來產生之螢火蟲螢光素酶(Fluc) mRNA。用於此實例之帽1類似物及帽2類似物在以下展示： 帽1類似物(帽1-AG)： 帽2類似物(ARCA-帽2-AG, R = CH 3, B1 = A, B2 = G)：
用PBS注射之小鼠充當陰性對照。在注射後超過96小時，藉由IVIS活體成像來檢查Fluc蛋白之表現。第9圖顯示帽2-Fluc mRNA之表現水準與帽1-Fluc mRNA之表現水準類似。生物分佈亦在96小時之後藉由生物發光來量測。第10圖顯示帽1-Fluc mRNA及帽2-Fluc mRNA之表現主要分佈至肝臟。第11圖顯示與用PBS注射比較，用帽1-Fluc mRNA或帽2-Fluc mRNA注射不影響小鼠體重。
本揭示案之優勢可包括(1)可增加mRNA之產率、完整性、及純度之 試管內轉錄反應混合物及條件，(2)結合至 試管內轉錄之啟動子之-1及/或+1核苷酸，因而產生更多全長mRNA，允許對於第一mRNA鹼基之選擇的更大靈活性，並且提供為定製序列保留之+2位置的DNA模板及帽類似物，及(3)帽-2類似物，該等類似物具有充當將轉錄物定義為「自身」之決定因素並且有助於轉錄物免疫逃避的第二轉錄核苷酸之2’-O-甲基化及作為第一轉錄核苷酸之腺苷之N6-甲基化。
本說明書中引用之所有參考文獻以引用方式併入本文，如同各參考文獻具體地及個別地指示以引用方式併入一般。任何參考文獻之引用針對其在申請日期之前的揭示內容並且不應理解為承認本揭示案由於先前發明而無權使此參考提早日期。
應理解以上描述元件中之各者、或兩者或兩者以上一起亦可適用於不同於以上描述之類型的其他類型之方法中。無需進一步分析，前述由此完全展現本揭示案之要旨，其他人藉由應用當前知識，可將其容易地調適用於各種應用而不忽略特徵，從先前技術之觀點，該等特徵適當地構成隨附請求項中闡述之本揭示案之一般或特定態樣的重要特性。前述實施例僅作為舉例來提供；本揭示案之範圍僅藉由以下請求項來限制。
無
第1圖顯示根據本發明之一個實施例，使用帽類似物在-1位置處啟動試管內轉錄。
第2圖顯示根據本發明之一個實施例，製備帽-2類似物合成中間物之過程。
第3圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，製備帽-2類似物之過程。
第4圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，製備額外帽-2類似物之過程。
第5圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，藉由使用各種帽類似物來製備之mRNA之表現水準。
第6圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，製備額外帽-2類似物之過程。
第7圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，製備額外帽-2類似物之過程。
第8圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，製備額外帽-2類似物之過程。
第9圖顯示根據本揭示案之另一個實施例，藉由使用各種帽類似物來製備之mRNA之活體內表現水準。
第10圖顯示根據本揭示案之一個實施例，藉由使用各種帽類似物來製備之mRNA之生物分佈。
第11圖顯示根據本發明之一個實施例，藉由使用各種帽類似物來製備之mRNA對於小鼠體重之效應。
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Claims (85)

  1. 一種用於將一DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法，該方法包括 提供一混合物，該混合物包含 一緩衝物質、 核糖核苷三磷酸(NTP)、 約2 mM至約60 mM之一濃度之一或多種鎂鹽、 該DNA模板、 一重組RNA聚合酶、及 包含式(I)、(II)、或(III)之結構的一帽類似物： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； 及 在約15℃至約35℃，視情況約18℃至約31℃下，孵育該反應混合物約1小時至約12小時，由此產生該RNA。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該緩衝物質為Tris鹼、HEPES、或Tris-HCl。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該緩衝物質之濃度為約1 mM至約100 mM、約1 mM至約90 mM、約1 mM至約80 mM、約1 mM至約70 mM、約1 mM至約60 mM、約1 mM至約50 mM、約1 mM至約40 mM、約1 mM至約30 mM、約1 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約5 mM、約10 mM至約20 mM、約10 mM至約30 mM、約10 mM至約40 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約50 mM、約30 mM至約50 mM、約35 mM至約45 mM、約35 mM至約40 mM、約40 mM至約50 mM、約45 mM至約50 mM、約45 mM至約55 mM、約15 mM至約45 mM、約15 mM至約35 mM、約15 mM至約30 mM、或約15 mM至約25 mM。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之方法，其中該等NTP之濃度為約1 mM至約50 mM、約1 mM至約40 mM、約1 mM至約30 mM、約1 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約5 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約10 mM、約9 mM至約10 mM、約10 mM至約50 mM、約20 mM至約50 mM、約25 mM至約50 mM、約25 mM至約45 mM、約25 mM至約40 mM、約25 mM至約35 mM或約20 mM至約30 mM。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之方法，其中該一或多種鎂鹽之濃度為約2 mM至約50 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約40 mM、約2 mM至約30 mM、約2 mM至約20 mM、約2 mM至約10 mM、約2 mM至約5 mM、約5 mM至約50 mM、約10 mM至約45 mM、約15 mM至約40 mM、約20 mM至約35 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、約22 mM至約28 mM、或約25 mM至約30 mM。
  6. 如請求項1-5中任一項所述之方法，其中該DNA模板之濃度為約0.001 µg/µl至約2 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1.5 µg/µl、約0.001 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約2 µg/µl、約0.01 µg/µl至約1.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.5 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl、約0.02 µg/µl至約0.04 µg/µl、約0.02 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.03 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.04 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.05 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.06 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.07 µg/µl至約0.1 µg/µl、約0.08 µg/µl至約0.1 µg/µl、或約0.09 µg/µl至約0.1 µg/µl。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之方法，其中該重組RNA聚合酶之濃度為約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約2 U/µl、約1 U/µl至約1.5 U/µl、或約1.5 U/µl至約2 U/µl。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之方法，其中該混合物進一步包含一抗氧化劑。
  9. 如請求項8所述之方法，該抗氧化劑為以下一濃度之二硫蘇糖醇(DTT)：約1 mM至約50 mM、約2 mM至約50 mM、約3 mM至約50 mM、約4 mM至約50 mM、約5 mM至約50 mM、約6 mM至約50 mM、約7 mM至約50 mM、約8 mM至約50 mM、約9 mM至約50 mM、約10 mM至約50 mM、約10 mM至約40 mM、約15 mM至約30 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約20 mM至約50 mM、約30 mM至約50 mM、或約40 mM至約50 mM。
  10. 如請求項1-9中任一項所述之方法，其中該混合物進一步包含以下一濃度之一RNA酶抑制劑：約0.001 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約4 U/µl、約0.001 U/µl至約3 U/µl、約0.001 U/µl至約2 U/µl、約0.001 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約5 U/µl、約0.01 U/µl至約4 U/µl、約0.01 U/µl至約3 U/µl、約0.01 U/µl至約2 U/µl、約0.01 U/µl至約1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.5 U/µl、約0.01 U/µl至約0.1 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.1 U/µl至約5 U/µl、約0.1 U/µl至約4 U/µl、約0.1 U/µl至約3 U/µl、約0.1 U/µl至約2 U/µl、約0.1 U/µl至約1 U/µl、約0.5 U/µl至約5 U/µl、約0.5 U/µl至約4 U/µl、約0.5 U/µl至約3 U/µl、約0.5 U/µl至約2 U/µl、約0.5 U/µl至約1 U/µl、約1 U/µl至約5 U/µl、約2 U/µl至約5 U/µl、約3 U/µl至約5 U/µl、約4 U/µl至約5 U/µl、約0.001 U/µl至約0.005 U/µl、約0.001 U/µl至約0.01 U/µl、約0.005 U/µl至約0.01 U/µl、約0.01 U/µl至約0.05 U/µl、約0.01 U/µl至約0.04 U/µl、約0.01 U/µl至約0.03 U/µl、約0.01 U/µl至約0.02 U/µl、約0.02 U/µl至約0.03 U/µl、約0.02 U/µl至約0.04 U/µl、或約0.02 U/µl至約0.05 U/µl。
  11. 如請求項1-10中任一項所述之方法，其中該帽類似物為以下一濃度：約0.5 mM至約50 mM、約0.5 mM至約40 mM、約0.5 mM至約30 mM、約0.5 mM至約20 mM、約0.5 mM至約10 mM、約0.5 mM至約5 mM、約1 mM至約10 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約3 mM至約9 mM、約3 mM至約8 mM、約3 mM至約7 mM、約3 mM至約6 mM、約3 mM至約5 mM、約3 mM至約4 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約6 mM至約9 mM、約6 mM至約8 mM、約6 mM至約7 mM、約7 mM至約8 mM、約7 mM至約9 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約9 mM、約8 mM至約10 mM、或約9 mM至約10 mM。
  12. 如請求項1-11中任一項所述之方法，其中該混合物進一步包含一多胺。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該多胺為精胺、精脒、或其一組合。
  14. 如請求項12或13所述之方法，其中該多胺之濃度為約0.1 mM至約5 mM、約0.2 mM至約4.9 mM、約0.2 mM至約4.8 mM、約0.2 mM至約4.7 mM、約0.2 mM至約4.6 mM、約0.2 mM至約4.5 mM、約0.2 mM至約4.4 mM、約0.2 mM至約4.3 mM、約0.2 mM至約4.2 mM、約0.2 mM至約4.1 mM、約0.2 mM至約4 mM、約0.2 mM至約3.5 mM、約0.2 mM至約3 mM、約0.2 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.5 mM、約1.0 mM至約2.5 mM、約1.5 mM至約2.5 mM、約0.2 mM至約2 mM、約0.2 mM至約1.5 mM、約0.2 mM至約1 mM、約0.2 mM至約0.9 mM、約0.2 mM至約0.8 mM、約0.2 mM至約0.7 mM、約0.2 mM至約0.6 mM、約0.2 mM至約0.5 mM、約0.2 mM至約0.4 mM、約0.2 mM至約0.3 mM、約1至約25 mM、約1至約20 mM、約1至約15 mM、約1至約10 mM、約1至約5 mM、或約1至約2.5 mM。
  15. 如請求項1-14中任一項所述之方法，其中該混合物進一步包含以下一濃度之一焦磷酸酶：約0.01 mU/µl至約2 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.01 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約2 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約1 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.9 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.8 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.7 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.6 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.4 mU/µl、約0.1 mU/µl至約0.3 mU/µl、或約0.1 mU/µl至約0.2 mU/µl。
  16. 如請求項1-15中任一項所述之方法，其中孵育該反應混合物在約15℃至約35℃、約16℃至約35℃、約17℃至約35℃、約18℃至約35℃、約18℃至約34℃、約18℃至約33℃、約18℃至約32℃、約18℃至約31℃、約18℃至約30℃、約18℃至約29℃、約18℃至約28℃、約18℃至約27℃、約18℃至約26℃、約18℃至約25℃、約18℃至約24℃、約18℃至約23℃、約18℃至約22℃、約18℃至約21℃、約18℃至約20℃、約18℃至約19℃、約25℃至約26℃、約25℃至約27℃、約25℃至約28℃、約25℃至約29℃、約25℃至約30℃、約25℃至約31℃、約21℃至約22℃、約21℃至約23℃、約21℃至約24℃、約21℃至約25℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、或約35℃下執行。
  17. 如請求項1-16中任一項所述之方法，其中孵育該反應混合物執行約1小時至約12小時、約1小時至約11小時、約1小時至約10小時、約1小時至約9小時、約1小時至約8小時、約1小時至約7小時、約1小時至約6小時、約1小時至約5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2小時、約2小時至約12小時、約3小時至約12小時、約4小時至約12小時、約5小時至約12小時、約6小時至約12小時、約7小時至約12小時、約8小時至約12小時、約9小時至約12小時、約10小時至約12小時、約11小時至約12小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、或約10小時。
  18. 如請求項1-17中任一項所述之方法，其中孵育該反應混合物在約31℃下執行約1小時至約5小時、約1小時至約4.5小時、約1小時至約4小時、約1小時至約3.5小時、約1小時至約3小時、約1小時至約2.5小時、約1小時至約2小時、約1小時至約1.5小時、約0.5小時至約1小時、約0.5小時至約1.5小時、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、或約5小時。
  19. 如請求項1-18中任一項所述之方法，其中該DNA模板包含可操作地連接至包含一5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之一開放閱讀框(ORF)、一3’UTR、及一聚A區域之一核酸的一啟動子， 其中該啟動子包含一序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)，其中X 1為A或G，X 2為A或G，並且X 3為A、T、G、或C， 其中該5’UTR選自SEQ ID NO：1、3、5、或9，並且該3’UTR選自SEQ ID NO：2、4、6、或8， 其中該聚A區域包含至少60個腺嘌呤鹼基(A)。
  20. 如請求項19所述之方法，其中該啟動子包含選自SEQ ID NO：10-15之一序列。
  21. 如請求項19或20所述之方法，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、1及6、3及2、3及4、3及6、3及8、5及2、5及4、5及6、7及2、7及4、7及6、7及8、9及2、9及4、9及6、或9及8。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、3及2、1及6、7及4、9及2、或3及6。
  23. 如請求項19-22中任一項所述之方法，其中該聚A區域包含約60至約200個A、約60至約190個A、約60至約180個A、約60至約170個A、約60至約160個A、約60至約150個A、約60至約140個A、約60至約130個A、約60至約120個A、約60至約110個A、約60至約100個A、約70至約190個A、約80至約180個A、約90至約170個A、約100至約160個A、約100至約150個A、約100至約140個A、約100至約130個A、約100至約120個A、約100個A、約110個A、約120個A、約130個A、約140個A、或約150個A。
  24. 如請求項1-23中任一項所述之方法，其中該重組RNA聚合酶選自野生型T7 RNA聚合酶或其一變異體。
  25. 如請求項1-24中任一項所述之方法，其中該帽類似物為選自由以下組成之群之帽類似物 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome,、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Omem 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  26. 如請求項19-25中任一項之方法，其中該帽類似物結合至該啟動子之-1及/或+1核苷酸。
  27. 一種用於將一DNA模板 試管內轉錄至RNA之反應混合物，該反應混合物包含 約45 mM至約55 mM之一濃度之一緩衝物質、 約0.01 U/µl至約0.03 U/µl之一濃度之一RNA酶抑制劑、 約3 mM至約5 mM之一濃度之NTP、 約6 mM至約8 mM之一濃度之一帽類似物、 約20 mM至約30 mM之一濃度之一或多種鎂鹽、 約1.5 mM至約2.5 mM之一濃度之一多胺、 約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之一濃度之一DNA模板、 約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl之一濃度之一焦磷酸酶、及 約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之一濃度之一RNA聚合酶， 其中該帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
  28. 如請求項27所述之反應混合物，其中該緩衝物質為Tris鹼、HEPES、或Tris-HCl。
  29. 如請求項27或28所述之反應混合物，該反應混合物進一步包含一抗氧化劑。
  30. 如請求項27-29中任一項所述之反應混合物，其中該帽類似物為選自由以下組成之群之帽類似物 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  31. 如請求項27-30中任一項所述之反應混合物，其中該一或多種鎂鹽為MgCl 2及/或乙酸鎂(Mg(C 2H 3O 2) 2) (Mg(OAc) 2)。
  32. 如請求項27-31中任一項所述之反應混合物，其中該多胺為精胺、精脒、或其一組合。
  33. 如請求項27-32中任一項所述之反應混合物，其中該DNA模板包含可操作地連接至包含一5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之一開放閱讀框(ORF)、一3’UTR、及一聚A區域之一核酸的一啟動子， 其中該啟動子包含一序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)，其中X 1為A或G，X 2為A或G，並且X 3為A、T、G、或C， 其中該5’UTR選自SEQ ID NO：1、3、5、或9，並且該3’UTR選自SEQ ID NO：2、4、6、或8， 其中該聚A區域包含至少60個腺嘌呤鹼基(A)。
  34. 如請求項33所述之反應混合物，其中該啟動子包含選自SEQ ID NO：10-15之一序列。
  35. 如請求項33或34所述之反應混合物，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、1及6、3及2、3及4、3及6、3及8、5及2、5及4、5及6、7及2、7及4、7及6、7及8、9及2、9及4、9及6、或9及8。
  36. 如請求項35所述之反應混合物，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、3及2、1及6、7及4、9及2、或3及6。
  37. 如請求項33-36中任一項所述之反應混合物，其中該聚A區域包含約60至約200個A、約60至約190個A、約60至約180個A、約60至約170個A、約60至約160個A、約60至約150個A、約60至約140個A、約60至約130個A、約60至約120個A、約60至約110個A、約60至約100個A、約70至約190個A、約80至約180個A、約90至約170個A、約100至約160個A、約100至約150個A、約100至約140個A、約100至約130個A、約100至約120個A、約100個A、約110個A、約120個A、約130個A、約140個A、或約150個A。
  38. 如請求項27-37中任一項所述之反應混合物，其中該重組RNA聚合酶選自野生型T7 RNA聚合酶或其一變異體。
  39. 一種用於將一DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法，該方法包括 提供如請求項27-38中任一項所述之反應混合物，及 在約15℃至約35℃下孵育該反應混合物約1小時至約12小時，由此產生該RNA。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該孵育包括將該反應混合物在約18℃至約31℃下孵育。
  41. 如請求項39所述之方法，其中該孵育包括將該反應混合物在約31℃下孵育約3小時。
  42. 一種用於將一DNA模板 試管內轉錄至RNA之方法，該方法包括 提供(1) 一DNA模板，該模板包含可操作地連接至包含一5’未轉譯區域(5’UTR)、編碼所關注RNA之一開放閱讀框(ORF)、一3’UTR、及一聚A區域之一核酸的一啟動子，及 (2) 一帽類似物，該帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C， (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， 其中該啟動子包含一序列TAATACGACTCACTATAX 1X 2X 3(SEQ ID NO：16)， 其中位置17處之A為-1核苷酸並且位置18處之X 1為+1核苷酸， 當X 1為G，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為G， 當X 1為A，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為A， 當X 1為C，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為C，並且 當X 1為T，X 2及X 3各自為A、T、G、或C時，則B 1為A並且B 2為U， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； 其中該帽類似物結合至該啟動子之-1及+1核苷酸，並且 將該DNA模板及該帽類似物在一反應混合物中孵育，其中該孵育包括在約15℃至約35℃下孵育該反應混合物約1小時至約12小時，由此產生該RNA。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該啟動子包含選自SEQ ID NO：10、11、12、13、及14之一序列。
  44. 如請求項42或43所述之方法，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、1及6、3及2、3及4、3及6、3及8、5及2、5及4、5及6、7及2、7及4、7及6、7及8、9及2、9及4、9及6、或9及8。
  45. 如請求項44所述之方法，其中該5’UTR及該3’UTR分別為SEQ ID NO：1及2、1及4、3及2、1及6、7及4、9及2、或3及6。
  46. 如請求項42-45中任一項所述之方法，其中該聚A區域包含約60至約200個A、約60至約190個A、約60至約180個A、約60至約170個A、約60至約160個A、約60至約150個A、約60至約140個A、約60至約130個A、約60至約120個A、約60至約110個A、約60至約100個A、約70至約190個A、約80至約180個A、約90至約170個A、約100至約160個A、約100至約150個A、約100至約140個A、約100至約130個A、約100至約120個A、約100個A、約110個A、約120個A、約130個A、約140個A、或約150個A。
  47. 如請求項42-46中任一項所述之方法，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 、m 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  48. 如請求項42-47中任一項所述之方法，其中該反應混合物包含 約35 mM至約45 mM之一濃度之一緩衝物質、 約0.01 U/µl至約0.03 U/µl之一濃度之一RNA酶抑制劑、 約20 mM至約40 mM之一濃度之NTP、 約6 mM至約8 mM之一濃度之該帽類似物、 約20 mM至約30 mM之一濃度之一或多種鎂鹽、 約1.5 mM至約2.5 mM之一濃度之一多胺、 約0.01 µg/µl至約0.05 µg/µl之一濃度之該DNA模板、 約0.1 mU/µl至約0.5 mU/µl之一濃度之一焦磷酸酶、及 約1 U/µl至約2 U/µl之一濃度之一RNA聚合酶。
  49. 如請求項48所述之方法，其中該RNA聚合酶選自野生型T7 RNA聚合酶或其一變異體。
  50. 如請求項42所述之方法，其中該孵育包括將該反應混合物在約18℃至約31℃下孵育。
  51. 如請求項50所述之方法，其中該孵育包括將該反應混合物在約31℃下孵育約3小時。
  52. 如請求項19-26及42-51中任一項所述之方法，其中該DNA模板進一步包含位於該開放閱讀框(ORF)上游及/或下游的至少一個轉錄終止子。
  53. 一種用於將一DNA模板 試管內轉錄至RNA之反應混合物，該反應混合物包含一DNA模板及一帽類似物，其中該帽類似物包含式(I)、(II)、或(III)之結構： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； (II) ， 其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C， (III) 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C； 其中該DNA模板包含一啟動子；並且其中該帽類似物結合至該啟動子之至少-1及+1核苷酸，或結合至該啟動子之至少+1及+2核苷酸。
  54. 一種用於合成一帽類似物之方法，該方法包括以下步驟： (a) 使5’-DMT-2’-O-甲基鳥苷(n-ibu)與一乙酸酐/吡啶反應，隨後使產物與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(3)： ， (b) 使該化合物(3)與5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲醯基-腺苷,2'-O-甲基,3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及四唑反應，隨後與一第一氧化劑反應，隨後與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(4)： ， (c) 使該化合物(4)與一化學磷酸化亞磷醯胺試劑及四唑反應，隨後與一第二氧化劑反應，隨後與氫氧化銨反應以便獲得化合物(5)： ， (d) 在一二價金屬鹽存在下，使該化合物(5)與(2a)或(2b)反應 : 以便獲得帽類似物(1a)或(1b)： 。
  55. 一種用於合成一帽類似物之方法，該方法包括以下步驟： (a) 使化合物3： 與5'-DMT-2'-O-甲基-N6-甲基-腺苷3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及四唑反應，隨後與一第一氧化劑反應，隨後與乙酸水溶液反應，以便獲得化合物(6)： ， (b) 使該化合物(6)與一化學磷酸化亞磷醯胺試劑及四唑反應，隨後與一第二氧化劑反應，隨後與氫氧化銨反應以便獲得化合物(7)： ， (c) 在一二價金屬鹽存在下，使該化合物(7)與化合物(2b)反應： 以便獲得帽類似物化合物(8)： 。
  56. 如請求項54或55所述之方法，其中該第一氧化劑及該第二氧化劑各自為(1 S)-(+)-(樟腦磺醯基)噁嗪啶(CSO)或碘。
  57. 如請求項54-56中任一項之方法，其中該二價金屬鹽為MnCl 2或ZnCl 2。
  58. 一種包含式(I)之帽類似物： (I) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
  59. 如請求項58所述之帽類似物，其中R為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  60. 如請求項59所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7GpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7GpppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7GpppA 2’OmepC 2’Ome。
  61. 如請求項58所述之帽類似物，其中R為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  62. 如請求項61所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7Gpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpppm 6A 2’OmepC 2’Ome。
  63. 如請求項58所述之帽類似物，其中R為CH 3，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  64. 如請求項63所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7G 3’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’OmepppA 2’OmepC 2’Ome。
  65. 如請求項58所述之帽類似物，其中R為CH 3，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  66. 如請求項65所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  67. 一種包含式(II)之帽類似物： (II) ，其中 R 1為OCH 3並且R 2為OH或H，或 R 1為OH並且R 2為H，或 R 1為H並且R 2為H或OCH 3，或 R 1及R 2各自為OCH 3， B1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B2為A、U、G、或C。
  68. 如請求項67所述之帽類似物，其中R 1為OCH 3並且R 2為OH，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  69. 如請求項68所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群： m 7G 2’OmepppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’OmepppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 2’OmepppA 2’OmepC 2’Ome。
  70. 如請求項67所述之帽類似物，其中R 1為OCH 3並且R 2為OH，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  71. 如請求項70所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群： m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 2’Omepppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  72. 如請求項67所述之帽類似物，其中R 1為OH並且R 2為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  73. 如請求項72所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群： m 7G 3’HpppA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’HpppA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’HpppA 2’OmepC 2’Ome。
  74. 如請求項67所述之帽類似物，其中R 1為OH並且R 2為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  75. 如請求項74所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群： m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Hpppm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  76. 一種包含式(III)之帽類似物： (III) ， 其中R為H或CH 3；並且B 1為A或N6-甲基-腺嘌呤(m 6A)，並且B 2為A、U、G、或C。
  77. 如請求項76所述之帽類似物，其中R為H，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  78. 如請求項77所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7Gpp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp SpA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpp SpA 2’OmepC 2’Ome。
  79. 如請求項76所述之帽類似物，其中R為H，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  80. 如請求項78所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7Gpp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome。
  81. 如請求項76所述之帽類似物，其中R為CH 3，B 1為A並且B 2為A、U、G、或C。
  82. 如請求項81所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp SpA 2’OmepC 2’Ome。
  83. 如請求項76所述之帽類似物，其中R為CH 3，B 1為m 6A並且B 2為A、U、G、或C。
  84. 如請求項83所述之帽類似物，其中該帽類似物選自由以下組成之群 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepA 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepU 2’Ome、 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepG 2’Ome、及 m 7G 3’Omepp Spm 6A 2’OmepC 2’Ome 。
  85. 一種用於合成一帽類似物之方法，該方法包括以下步驟： (a) 使化合物(12) 與硫酸二甲酯反應以便獲得化合物(13) ， (b) 使該化合物(13)與咪唑、三苯基膦、2，2’-二硫代吡啶反應，隨後與MnCl 2及雙三乙銨硫代磷酸鹽反應以便獲得化合物(14) ， (c) 使化合物(5) 與三苯基膦、咪唑、及2，2’-二硫代吡啶反應以便獲得化合物(15) ，及 (d) 使該化合物(15)與該化合物(14) 在二甲基甲醯胺及ZnCl2存在下反應以便獲得化合物(16) 。
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