CN113453707A - 用于疟疾疫苗的rna - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于疟疾疫苗的编码RNA。该编码RNA包含至少一个异源非翻译区(UTR)，优选3’‑UTR和/或5’‑UTR，和编码区，所述编码区编码衍生自疟原虫的至少一种抗原肽或蛋白质，特别是衍生自疟原虫(如恶性疟原虫)的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白。本发明还涉及包含联合了所述编码RNA与聚合物载体、聚阳离子蛋白或肽或者脂质纳米颗粒(LNP)的组合物和疫苗。此外，本发明涉及试剂盒，特别是包含编码RNA或组合物或疫苗的成套试剂盒。本发明还涉及治疗或预防疟疾的方法，以及编码RNA、组合物、疫苗和试剂盒的第一和第二医药用途。
Description
引言
本发明涉及疟疾疫苗的编码RNA。该编码RNA包含至少一个异源非翻译区(UTR)，优选3’-UTR和/或5’-UTR，和编码衍生自疟原虫的至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，特别是至少一种衍生自疟原虫(如恶性疟原虫)的环子孢子蛋白(CSP)的抗原蛋白。本发明还涉及包含所述编码RNA与聚合物载体、聚阳离子蛋白或肽或者脂质纳米颗粒(LNP)的组合物和疫苗。此外，本发明涉及包含编码RNA或组合物或疫苗的试剂盒，特别是成套试剂盒。本发明还涉及治疗或预防疟疾的方法，以及编码RNA、组合物、疫苗和试剂盒的第一和第二医药用途。
疟疾感染每年造成约2亿临床病例和约50万至60万人死亡。
疟疾是由来自疟原虫属的原生动物寄生虫引起的蚊媒传染病。疟蚊传播疟疾，它们一定是通过先前从感染者身上采集的血粉而感染的。当蚊子叮咬感染人，少量血液会被吸入并且血液中含有疟原虫。感染人类的疟原虫主要有四种：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。其中，恶性疟疾是最致命的一种。
许多疟原虫现在对用于治疗该疾病的最常见的药物免疫。根据根除疟疾研究议程的倡议，只有通过有效的疫苗接种才能实现疟疾的根除。然而，最先进的疟疾候选疫苗RTS，S，在3期临床试验中在保护的延长和持续时间方面表现出不太明显的结果(RTS，SClinical Trials Partnership，2015)。RTS，S含有配制的病毒样颗粒，所述配制的病毒样颗粒围绕与乙型肝炎病毒表面抗原融合的环子孢子蛋白(CSP)的中心的和羧基末端结构域。RTS，S在一定时期内保护约30％至50％的儿童免受临床疾病的伤害。多项研究表明，RTS，S诱导保护性抗体和CD4+T细胞应答，但是几乎没有CD8+T细胞应答。然而，因为CD8+T细胞是对抗疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，所以有效的疟疾疫苗应当能诱导强CD8+T细胞应答。RTS，S被进一步开发，旨在通过产生更具免疫原性的基于CSP的颗粒的疫苗来增强疫苗效力(这种下一代RTS，S类疫苗被称为R21)(Collins，Katharine A.等人，“Enhancing protective immunity to malaria with a highly immunogenic virus-like particle vaccine.”Scientific reports 7(2017)：46621)。与RTS，S相比主要的改进在于，R21颗粒是由单一的CSP-乙肝表面抗原(HBsAg)融合蛋白形成的，这使得疫苗中CSP的比例比RTS，S中的要高得多。临床前研究需要佐剂(Abisco-100和Matrix-M)或基于TRAP的病毒载体来诱导有效的和保护性免疫应答，尤其是诱导CSP特异性CD8+T细胞。佐剂经常诱导组织反应或其他不需要的副作用。新型疟疾抗子孢子候选疫苗，即以matrix-M为佐剂的R21，在对英国和布基纳法索志愿者进行的首次人体试验的I期评估显示，即使在英国和非洲人群中以低至5分之一的10μg剂量施用，其免疫原性与RTS，S/AS01B相当。
因此，与截短的RTS，S疫苗相比，使用更全长的CSP作为抗原可能诱导更广泛的体液应答和细胞抗体应答。此外，更全长的CSP可能提供额外的T细胞表位，从而导致细胞免疫增强，这可能会加强对抗疟疾的保护。此外，针包括R1在内的针对部分N-端区域的抗体使疾病风险降低(Bongfen，Silayuv E.等人，“The N-terminal domain of Plasmodiumfalciparum circumsporozoite protein represents a target of protectiveimmunity.”Vaccine 27.2(2009)：328-335)。然而，使用目前最先进的疫苗技术(例如基于蛋白的疫苗)来生产基于更全长的CSP的疟疾疫苗是不可行的。
报道的全长蛋白CSP生产中的问题可能是由于恶性疟原虫寄生虫的独特性质所致，这包括具有许多赖氨酸和精氨酸重复序列的极富A/T基因组，以及含有多个二硫键的蛋白质。疟疾蛋白在如大肠杆菌等细菌系统中的表达通常导致不溶性表达，这需要从包涵体中纯化和重新折叠蛋白质的步骤。Noe等人利用新型高通量假单胞菌表达平台，开发了全长的、基于重组CSP(rCSP)的抗恶性疟原虫疟疾候选疫苗，所述疫苗适于现行药品生产管理规范(cGMP)的生产(Noe，Amy R.，等人，“A full-length Plasmodium falciparumrecombinant circumsporozoite protein expressed by Pseudomonas fluorescensplatform as a malaria vaccine candidate.”PloS one 9.9(2014)：e107764)。当与各种佐剂一同配制后，该rCSP诱导抗原特异性抗体应答以及CD4+T细胞应答，并在小鼠身上给予保护。此外，带有佐剂的rCSP和以腺病毒35型为载体的CSP(Ad35CS)的异源初免/加强免疫策略在诱导CSP特异性T细胞应答和抗疟疾保护方面稍有改善。佐剂经常诱导组织反应或其他不需要的副作用。
综上所述，提供有效的疟疾疫苗仍然是未得到满足的对全球健康极为重要的医疗需求。
有效的疟疾疫苗应当不仅诱导强烈的体液免疫应答，还诱导CD8+T细胞应答。因此，有效的疟疾疫苗应当理想地提供更全长的CSP以同样覆盖N-端区域的T细胞表位，从而诱导强烈的CD8+T细胞应答。这种疟疾疫苗应当理想地以有效、可靠和规模化的方式生产以确保全球供应。此外，这种新型疫苗的生产应当是具有成本效益的。此外，这种疟疾疫苗应当具有良好的耐受性而不具有可能的副作用，并优选不使用佐剂。
上述的目标通过要求保护的主题解决，即，尤其是，通过提供用于疟疾疫苗的编码RNA解决。
值得注意的是，基于RNA的疟疾疫苗相对于例如基于DNA的疫苗具有一些显著的优势。如本领域通常已知的，DNA的转染可导致严重的问题。例如，DNA的应用具有整合到宿主基因组的风险，这可能影响宿主基因的表达，或者可能通过例如破坏抑癌基因触发致癌基因的表达。此外，DNA疫苗必须穿过几个膜屏障才能到达细胞核，而基于RNA的疫苗不需要穿过屏障到达细胞核，并直接在细胞质中翻译。
有利地，RNA可以大规模生产，并能够生产基于RNA的疟疾疫苗，所述RNA编码例如更具全长的CSP。
此外，期望这种基于RNA的组合物或者疫苗具有至少一些以下有利特征：
-编码RNA构建体在注射部位(例如肌肉)的翻译增强；
-在非常低的剂量和给药方案下，非常有效地诱导针对编码的CSP蛋白的抗原特异性免疫应答；
-适于孕妇免疫接种；
-适于婴儿和/或新生儿接种疫苗；
-适于肌内施用；
-诱导针对疟疾(例如疟原虫的CSP)的特异性和功能性体液免疫应答；
-诱导针对疟疾(例如疟原虫的CSP)的广泛的、功能性T细胞应答；
-诱导针对疟疾(例如疟原虫的CSP)的特异性B细胞记忆；
-快速实现针对疟疾(例如疟原虫的CSP)的免疫保护；
-长期诱导针对疟疾(例如疟原虫的CSP)的免疫应答；
-施用疟疾疫苗后不会过度诱导全身细胞因子或趋化因子应答；这可能在疫苗接种后导致不期望的高反应原性
-疟疾疫苗耐受性好、无副作用、无毒性；
-不会因疫苗接种加重疟疾感染；
-基于RNA的疟疾疫苗的有利稳定性特征；
-疟疾疫苗生产的速度、适应性、简便性和可拓展性；
-有利的疫苗接种方案，只需要一到两次疫苗接种即可得到充分保护。
定义
为了清楚和可读性起见，提供以下定义。这些定义中提到的任何技术特征适用于本发明的每个和所有实施方案。在这些实施方案的上下文中可能会具体提供额外的定义和解释。
数字中的百分比应理解为相对于各项总数的百分比。在其他情况下，除非上下文中另有规定，否则百分比应当理解为重量的百分比(重量％)。
适应性免疫应答：本文中使用的术语“适应性免疫应答”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指免疫系统(适应性免疫系统)的抗原特异性应答。抗原特异性允许产生针对特定病原体或病原体感染细胞的应答。进行这种特定应答的能力通常由体内的“记忆细胞”(B细胞)维持。在本发明的上下文中，该抗原由编码至少一种抗原肽或蛋白(如CSP)的RNA编码序列提供。
抗原：本文中使用的术语“抗原”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指可被免疫系统、优选适应性免疫系统识别的物质，并且其可以触发抗原特异性免疫应答，例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分。通常情况下，抗原可以是或可以包含可以由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。在本发明的上下文中，衍生自包含至少一个表位的例如CSP的肽或蛋白的片段、变体和衍生物也被理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是如本文所述提供的编码RNA的翻译产物。
抗原肽或蛋白：术语“抗原肽或蛋白”或“免疫原性肽或蛋白”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指衍生自(抗原或免疫原性)蛋白/多聚蛋白的肽、蛋白(或多聚蛋白)，其刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此抗原/免疫原性肽或蛋白包含衍生它的蛋白质(例如疟原虫的CSP蛋白)的至少一种表位(如本文定义的)或抗原(如本文定义的)。
阳离子：除非在特定的语境中有明确不同的含义，否则术语“阳离子”指相应的结构带有正电荷，这可以是永久性的，也可以不是永久性的，而是对某些条件例如pH值有反应。因此，术语“阳离子”包括“永久阳离子”和“可阳离子化的”。
可阳离子化的：本文中使用的术语“可阳离子化的”指化合物、基团或原子在其环境的pH值较低时带正电，在其环境的pH值较高时不带电。同样，在不能测定pH值的非水环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在氢离子浓度高时带正电，在氢离子浓度低或活性低时不带电。这取决于可阳离子化或可聚阳离子化的化合物的个体性质，特别是相应的可阳离子化基团或原子在其带电或不带电的pH值或氢离子浓度下的pKa。在稀释的含水环境中，带正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的比例可以用本领域一般技术人员所熟知的所谓的亨德森-哈塞尔巴尔赫方程来估计。例如，在一些实施方案中，如果化合物或部分是可阳离子化的，则优选地其在pH值是约1至9时，优选地4至9、5至8或者甚至6至8时，更优选地pH值是低于9或低于8、或低于7，最优选地在生理pH值，例如约7.3至7.4，即，在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下是带正电的。在其他实施方案中，优选地可阳离子化的化合物或部分在生理pH值例如约7.0至7.4时是主要是中性的，但在较低的pH值下变得带正电。在一些实施方案中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的优选范围是约5至约7。
编码序列/编码区：本文中使用的术语“编码序列”和“编码区”以及相应的缩写“cds”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指可以翻译为肽或蛋白的几个核苷酸三联体的序列。在本发明的上下文中编码序列优选是RNA序列，其由可被三除的数目的核苷酸组成，它以起始密码子开始，并且优选以终止密码子终止。
化合物：如本文中所使用的，“化合物”指化学物质，其是由具有基本相同的化学结构和性质的分子组成的材料。对于小分子化合物，分子的原子组成和结构形式一般相同。对于大分子化合物或者聚合化合物，化合物的分子是高度相似的，但不一定所有都相同。例如，指定为由50个单体单元组成的聚合物片段也可以包含具有例如48个或53个单体单元的单个分子。
衍生自：在核酸的背景下本说明书通篇使用的术语“衍生自”，即用于核酸“衍生自”(另一种)核酸，是指该衍生自(另一种)核酸的核酸与衍生该核酸的核酸具有例如至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列一致性。技术人员应意识到，序列一致性通常是对相同类型的核酸进行计算，即对DNA序列或者对RNA序列进行计算。因此，应理解，如果DNA是“衍生自”RNA或者RNA是“衍生自”DNA，在第一步中，将RNA序列转化为相应的DNA序列(特别是在整个序列中用胸腺嘧啶(T)取代尿嘧啶(U))，或者，反之亦然，将DNA序列转化为相应的RNA序列(特别是在整个序列中用U取代T)。然后，确定DNA序列的序列一致性或RNA序列的序列一致性。优选地，“衍生自”核酸的核酸还指，相对于衍生该核酸的核酸被修饰的核酸，修饰例如以进一步提高RNA的稳定性和/或延长和/或增加蛋白质的产量。在氨基酸序列(例如抗原肽或蛋白)的背景下，术语“衍生自”指该衍生自(另一种)氨基酸序列的氨基酸序列与衍生该氨基酸序列的氨基酸序列具有例如至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
因此应当理解，如果抗原肽或蛋白“衍生自”CSP，则“衍生自”所述CSP的抗原肽或蛋白可以代表所述相应CSP蛋白的变体或片段。此外，“衍生自”所述CSP的抗原肽或蛋白可以在氨基酸序列上有所不同，如上述所定义的，具有一定比例的一致性。
表位：本文中使用的术语“表位”(在本领域中也被称为“抗原决定簇”)是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指T细胞表位和B细胞表位。抗原肽或蛋白的T细胞表位或一部分可以包含优选地长度为约6个至约20个或甚至多于约20个氨基酸的片段，例如，MHC I类分子加工和呈递的片段，优选地长度为约8个至约10个氨基酸，例如8个、9个或10个氨基酸(或者甚至11个或12个氨基酸)，或者MHC II类分子加工和呈递的片段，优选长度为约13个至约20个或甚至多于约20个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以肽片段和MHC分子的复合物的形式被T细胞识别，即，这些片段通常不能以其原生形式被识别。B细胞表位通常是位于(天然)蛋白或肽抗原的外表面的片段，优选地具有5个至15个氨基酸，更优选地具有5个至12个氨基酸，甚至更优选地具有6个至9个氨基酸，其可以被抗体识别，即，以其原生形式被识别。这些蛋白或肽的表位还可以选自此处提及的这些蛋白或肽的任何变体。在本文中，抗原决定簇可以是构象的或不连续的表位，所述表位由本文定义的蛋白或肽的片段组成，所述片段在由本文定义的蛋白和肽的氨基酸序列中是不连续的，但在三维结构中聚集在一起，或是由单一多肽链组成的连续或线性表位。在本发明的上下文中，表位可以是给定的如本文所述的编码RNA的翻译产物。
片段：在核酸序列(例如RNA序列)或者氨基酸序列的背景下本申请通篇使用的术语“片段”通常可以是如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。因此，片段通常由与全长序列内的相应延伸相同的序列组成。在本发明的上下文中，优选的序列片段由实体的连续延伸组成，如对应于衍生该片段的分子中实体的连续延伸的核苷酸或氨基酸，其占衍生该片段的总(即全长)分子(例如疟原虫的CSP)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。在蛋白质或肽的背景下本说明书通篇使用的术语“片段”通常可以包括本文所定义的蛋白或肽的序列，即，与原始蛋白的氨基酸序列相比，其氨基酸序列的N-端和/或C-端被截短。这种截短由此可以发生在氨基酸水平或相应地发生在核酸水平上。因此，与这种本文所定义的片段相关的序列一致性可以优选地指本文所定义的完整蛋白或肽，或者指该蛋白或肽的完整(编码)核酸分子。在抗原的背景下，这种片段可以包含长度为约6个至约20个或甚至多于约20个氨基酸的片段，例如，由MHC I类分子加工和呈递的片段，优选地长度为约6个至约12个氨基酸，例如是6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个氨基酸，或者MHC II类分子加工和呈递的片段，优选长度为约13个或多于13个氨基酸，例如11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或甚至多于20个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别。蛋白或肽的片段可以包含这些蛋白或肽的至少一种表位。
异源：在核酸序列或氨基酸序列的背景下本说明书通篇使用的术语“异源”或“异源序列”指本领域一般技术人员所认识并理解的序列(例如DNA、RNA、氨基酸)，并旨在指衍生自其他基因、其他等位基因、其他物种的序列。如果两个序列不是衍生自相同的基因或相同的等位基因，则通常被理解为“异源”。即，尽管异源序列可能衍生自同一生物体，它们不会自然地(本质上)出现在同一核酸分子中，例如在同一RNA或蛋白中。
体液免疫应答：术语“体液免疫”或“体液免疫应答”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指B细胞介导的抗体产生以及任选地伴随抗体产生的附属过程。通常体液免疫应答的特征可以在于例如Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞产生。体液免疫还可以指抗体的效应功能，其包括病原体和毒素的中和、经典补体激活、和调理素促进吞噬作用和病原体的消除。
(序列的)一致性：在核酸序列或氨基酸序列的背景下本说明书通篇使用的术语“一致性”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指两个序列相同的百分比。为确定两个序列相同的百分比，例如本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的核酸序列编码的氨基酸序列或者氨基酸序列本身，可以对序列进行比对以便随后相互比较。因此，例如，可以将第一序列的位点与第二序列相应的位点进行对比。如果第一序列中的位点与第二序列中的该位点被相同的残基占据，那么这两个序列在这个位点是相同的。如果不是这样，则序列在这一位点上是不相同的。如果与第一序列相比，第二序列中出现插入，则可以在第一个序列中插入空位，以允许进一步比对。如果与第一个序列相比，第二个序列中出现缺失，则可以在第二个序列中插入空位，以允许进一步比对。两个序列相同的百分比则是相同位点数除以包括仅在一个序列中占据位点的位点总数的函数。两个序列相同的百分比可以用算法例如在BLAST程序中集成的算法来确定。
免疫原、免疫原性：术语“免疫原”或“免疫原性”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指能刺激/诱导免疫应答的化合物。优选地，免疫原是肽、多肽或蛋白质。本发明意义上的免疫原是所提供的RNA的翻译产物，其包含编码至少一种本文定义的衍生自CSP的抗原肽或蛋白的至少一种编码序列。通常，免疫原引起适应性免疫应答。
免疫应答：术语“免疫应答”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指适应性免疫系统对特定抗原的特异性反应(所谓特异性或适应性免疫应答)，或者指固有免疫系统的非特异性反应(所谓非特异性或固有免疫应答)，或其结合。
免疫系统：术语“免疫系统”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指可以保护生物体不受感染的生物体系统。如果病原体成功通过生物体的物理屏障并进入该生物体，则固有免疫系统作出立即的但非特异性的应答。如果病原体避开了这种固有应答，脊椎动物拥有第二层保护，即适应性免疫系统。在这里，免疫系统在感染期间调整其应答，以提高其对该病原体的识别。在病原体被消灭后，这种增强的应答以免疫记忆的形式保留，并允许适应性免疫系统在每次遇到这种病原体时做出更快和更强的攻击。据此，免疫系统包括固有免疫系统和适应性免疫系统。通常这两部分每种都含有所谓体液组分或细胞组分。
固有免疫系统：术语“免疫系统”(也称为非特异性免疫系统)是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指通常包含以非特异性方式保护宿主免受其他生物体感染的细胞和机制的系统。这意味着固有系统的细胞可以用通用的方式识别病原体并对病原体做出应答，但与适应性免疫系统不同的是，它不会给宿主提供持久的或者保护性免疫。固有免疫系统可以例如被Toll样受体(TLR)或其他辅助物质激活，所述辅助物质例如脂多糖、TNF-α、CD40配体、或细胞因子、单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子、IL-1至IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子、和hGH、人类Toll样受体(例如TLR1至TLR10)的配体、鼠Toll样受体(例如TLR1至TLR13)的配体、NOD样受体的配体、RIG-I样受体的配体、免疫刺激性核酸、免疫刺激性RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗菌剂或抗病毒剂。
类脂化合物：类脂化合物，也简称类脂，是指类似脂质的化合物，即具有类脂质物理性质的两亲化合物。在本发明的情况下，认为术语脂质包括类脂化合物。
单价疫苗、单价组合物：术语“单价疫苗”、“单价组合物”、“一价疫苗”或“一价组合物”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指仅包含来自病原体(例如疟原虫的CSP)的一种抗原的组合物或者疫苗。因此，所述疫苗或组合物仅包含编码单一生物体的单一抗原的一种RNA。术语“单价疫苗”包括针对一价的免疫。在本发明的上下文中，单价疟疾疫苗或组合物将包含编码RNA，该编码RNA编码衍生自一种特定疟原虫的单一抗原肽或蛋白(例如疟原虫的CSP)。
核酸：术语“核酸”或“核酸分子”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指包含核酸组分的分子，优选由核酸组分组成的分子。术语核酸分子优选地指DNA或RNA分子。其优选与术语多核苷酸同义使用。优选地，核酸或核酸分子是包含或者组成为核苷酸单体的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸主链的磷酸双酯键彼此共价连接。术语“核酸分子”还包括经修饰的核酸分子，例如如本文定义的，碱基修饰、糖修饰或主链修饰的DNA或RNA分子。
核酸序列/RNA序列/氨基酸序列：术语“核酸序列”、“RNA序列”或“氨基酸序列”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，分别指其核苷酸序列或氨基酸序列的特定和单独的顺序。
永久阳离子：本文使用的术语“永久阳离子”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，指相应的化合物或基团或原子在其环境为任何pH值或氢离子活性下都是带正电的。通常，正电荷是由于存在季氮原子而造成的。如果化合物带有多个这样的正电荷，它可以被称为永久聚阳离子，这是永久阳离子的子类。
药物有效量：术语“药物有效量”或“有效量”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指足以引起药物效果的化合物(例如本发明的RNA)的量，药物效果例如在本发明的上下文中指针对疟疾抗原的免疫应答。
多价疫苗、多价组合物：术语“多价疫苗”或“多价组合物”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指包含来自多于一种疟原虫的抗原、或包含来自相同疟原虫的不同抗原或者其任何组合的组合物或疫苗。该术语描述了所述疫苗或组合物具有大于一的化合价。在本发明的上下文中，多价疟疾疫苗将包含编码衍生自几种不同疟原虫的抗原肽或蛋白的RNA，或者包含编码来自同种疟原虫的不同抗原的RNA，或者其组合。在优选的实施方案中，多价疟疾疫苗或组合物包含多于一种、优选2种、3种、4种或甚至多于4种不同的编码RNA种类，其中每种编码RNA编码疟疾的至少一种肽或蛋白(如恶性疟原虫3D7的CSP，和恶性疟原虫NF54的CSP，以及恶性疟原虫GB4的CSP)。公布的专利申请WO2017/1090134A1中公开了生产多价RNA疫苗的方法。
稳定化的RNA：术语“稳定化的RNA”指经过修饰的RNA分子，使得与未经修饰的RNA分子相比，其在分解或降解时，例如通过环境因素或酶消化，例如通过外切酶或内切酶降解时，会更稳定。优选地，本发明上下文中的稳定化的RNA是在细胞中，例如原核或真核细胞中，优选哺乳动物细胞例如人类细胞中得以稳定。该稳定效应也可以作用于细胞外，例如在缓冲液中等，例如，在包含该稳定化的核酸分子的药物组合物的制造过程中。
T细胞应答：本文使用的术语“细胞免疫”或“细胞免疫应答”或“细胞T细胞应答”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活，以及针对抗原释放各种细胞因子。从更一般的意义上讲，细胞免疫不是基于抗体的，而是基于免疫系统细胞的激活。通常，细胞免疫应答的特征可以在于例如激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，其可以诱导细胞例如特异性免疫细胞如树突细胞或其他细胞凋亡，在其表面显示外来抗原的表位。在本发明的上下文中，抗原是由编码衍生自CSP的至少一种抗原肽或蛋白的RNA提供。适当地，编码RNA、组合物、疫苗有利地诱导针对编码的疟疾抗原的细胞T细胞应答。
(序列的)变体：在核酸序列的背景下本说明书通篇使用的术语“变体”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指衍生自另一核酸序列的核酸序列的变体。例如，与衍生该变体的核酸序列相比，核酸序列的变体可能表现出一个或多于一个核苷酸缺失、插入、添加和/或置换。核酸序列的变体可以与衍生该变体的核酸序列有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同。从变体保留了衍生该变体的序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或大于95％的功能的意义上来说，该变体是功能性变体。核酸序列的“变体”在该核酸序列的至少10个、20个、30个、50个、75个或100个核苷酸的延伸上可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸一致性。
在蛋白或肽的背景下本说明书通篇使用的术语“变体”例如旨在指蛋白或肽的变体，其具有在一个或多于一个突变/置换上与原始序列不同的氨基酸序列，例如一个或多于一个经置换、插入和/或缺失的氨基酸。优选地，这些片段和/或变体具有相同或相当的特异性抗原特性(免疫原性变体、抗原变体)。本文中定义的蛋白或肽的“变体”相对于其原始序列即非突变的生理序列可以包含保守性氨基酸置换。这些氨基酸序列及其编码核苷酸序列尤其属于本文所定义的术语变体。来自同一类的氨基酸相互交换的置换称为保守性置换。特别地，这些是具有脂肪族侧链的、带正电或负电的侧链的、侧链上或者氨基酸上带有芳香基团、其侧链可以进入氢桥例如侧链上带有羟基官能团的氨基酸。这表示，例如，具有极性侧链的氨基酸被另一个具有同样极性侧链的氨基酸所置换，或例如，具有疏水侧链的氨基酸被具有相似疏水侧链的氨基酸所置换(例如丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和置换尤其可能在那些不会引起三维结构改变或不影响结合区域的序列位置发生。通过插入或缺失对三维结构的修饰可以例如通过使用CD光谱(圆二色光谱)很容易地确定。蛋白或肽的“变体”在该蛋白或肽的至少10个、20个、30个、50个、75个或100个氨基酸的延伸上可以具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸一致性。优选地，蛋白的变体包括该蛋白的功能性变体，这意味着，在本发明的上下文中，该变体发挥了衍生该变体的蛋白的基本相同的或者至少40％、50％、60％、70％、80％、90％的免疫原性。
5’-端寡嘧啶束(TOP)，TOP-UTR：术语“5’-端寡嘧啶束(TOP)”应当理解为位于核酸分子的5’-端区域的嘧啶核苷酸的延伸，例如某些RNA分子的5’-端区域或某些基因的功能实体例如转录区域的5’-端区域。该序列以胞苷起始，该胞苷通常对应于转录起始位点，然后是通常约3个至30个嘧啶核苷酸的延伸。例如，TOP可以包含3个至30个或者多于30个核苷酸。嘧啶延伸，和该5’-TOP终止于位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸5’方向的一个核苷酸。包含5’-端寡嘧啶束的信使RNA通常被称为TOP mRNA。因此，提供这种信使RNA的基因被称为TOP基因。术语“TOP基序”或“5’TOP基序”应当理解为符合上述定义的5’-TOP的核酸序列。因此，在本发明的上下文中，TOP基序优选地是长度为3个至30个核苷酸的嘧啶核苷酸的延伸。优选地，该TOP基序的组成为至少3个嘧啶核苷酸，优选至少4个嘧啶核苷酸，优选至少4个嘧啶核苷酸，优选至少5个嘧啶核苷酸，更优选至少6个核苷酸，更优选至少7个核苷酸，最优选至少8个嘧啶核苷酸，其中嘧啶核苷酸的延伸优选地在其5’端以胞嘧啶核苷酸起始。在TOP基因和TOP mRNA中，该TOP基序优选地从其5’端以转录起始位点起始，并在所述基因或mRNA的第一个嘌呤核苷酸的5’方向的一个核苷酸终止。本发明意义上的TOP基序优选地位于代表5’-UTR序列的5’端或者位于编码5’-UTR的序列的5’端。因此优选地，如果3个或多于3个嘧啶核苷酸的延伸位于相应序列的5’端，相应序列例如RNA、RNA的5’-UTR元件或者衍生自本文描述的TOP基因的5’-UTR的RNA序列，则其在本发明的意义上被称为“TOP基序”。换言之，3个或多于3个嘧啶核苷酸的延伸不位于5’-UTR或5’-UTR元件的5’端，而是位于5’-UTR或5’-UTR元件的任意位点，则其优选地不被称为“TOP基序”。在一些实施方案中，衍生自TOP基因的5’-UTR的5’-UTR元件的核酸序列，终止于核苷酸的3’端，所述核苷酸位于衍生该核酸序列的基因或RNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游的第1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位或10位。因此，5’-UTR元件不包含蛋白质编码序列的任何部分。因此优选地，该编码序列提供至少一个核酸序列特别是RNA序列的唯一的蛋白质编码部分。
发明内容
本发明基于发明人出人意料的发现，即由本发明的RNA编码的衍生自疟原虫的CSP的至少一种肽或蛋白可以有效地在哺乳动物细胞中表达。更出人意料的是，发明人发现本发明的编码RNA可以在例如小鼠中(例如参见实施例2和实施例3)诱导特异性功能性免疫应答。通过对CSP抗原设计的不同优化，可以进一步增强免疫应答。例如异源跨膜结构域、分泌型信号肽、辅助性T细胞表位或抗原聚类结构域等异源元件可以增强免疫应答(参见例如实施例7、8和9)。此外，优化mRNA设计(改善UTR组合、使用cap 1类似物等)可以有效地增强免疫应答；主要是基于T细胞的免疫应答(参见实施例11、12和13)。有利地，本发明的所述编码RNA诱导了针对编码的CSP的十分有效的抗原特异性免疫应答(体液应答和细胞应答)。此外，本发明的编码RNA包含在脂质纳米颗粒(LNP)中，以很低的剂量和给药方案非常有效地诱导针对CSP的抗原特异性免疫应答(例如参见实施例2、3和6至13)。因此，本发明的编码RNA和包含所述编码RNA的组合物/疫苗适用于在哺乳动物对象中诱导针对疟原虫的CSP的免疫应答。因此该编码RNA和包含所述编码RNA的组合物/疫苗适于用作疫苗，例如用作人类疫苗。
在第一方面，本发明提供了编码RNA，优选用于疫苗的编码RNA，其包括至少一个5’非翻译区(UTR)和/或至少一个3’非翻译区(UTR)，以及至少一个可操作地连接到所述3’-UTR和/或5’-UTR的编码序列，该编码序列编码衍生自疟原虫的CSP的至少一个抗原蛋白或者其免疫原性片段或免疫原性变体。
在第二方面，本发明提供了包含第一方面的编码RNA的组合物，优选免疫原性组合物。适当地，该组合物可以包含与一种或多于一种脂质复合、包封于其中或与之结合从而形成脂质纳米颗粒的第一方面的编码RNA。
在第三方面，本发明提供了疟疾疫苗，其中该疫苗包含第一方面的编码RNA或者第二方面的组合物。
在第四方面，本发明提供了试剂盒或成套试剂盒，其中所述试剂盒或成套试剂盒包含第一方面的编码RNA和/或第二方面的组合物和/或第三方面的疫苗。
本发明还涉及治疗或预防对象的疟疾的方法、编码RNA、组合物和疫苗的第一和第二医药用途。此外，本发明涉及试剂盒，特别是成套试剂盒，其包含该编码RNA、组合物和疫苗。还提供了制备该编码RNA、组合物或疫苗的方法。
具体实施方式
本申请与电子格式的序列表一同提交，该序列表作为本申请说明书的一部分(WIPO标准ST.25)。序列表中包含的信息通过引用其整体并入本文。当本文中引用“SEQ IDNO”时，引用序列表中具有相应标识符的核酸序列或氨基酸(aa)序列。对于许多序列，该序列表还提供了额外的详细信息，例如关于某些结构特征、序列优化、GenBank标识符，或者关于其编码容量的额外的详细信息。特别地，这些信息在WIPO标准ST.25序列表中的数字标识符<223>提供。因此，所述数字标识符<223>提供的信息，其全文明确地并入本文，并且应当理解为本发明说明书的不可分割的一部分。
用于疫苗接种的编码RNA：
在第一方面，本发明涉及编码RNA，优选用于疫苗的编码RNA，其包含：
a)至少一个异源5’非翻译区(5’-UTR)和/或至少一个异源3’非翻译区(3’-UTR)；和
b)可操作地连接到所述3’-UTR和/或5’-UTR的至少一个编码序列，该编码序列编码至少一种抗原蛋白，所述抗原蛋白优选地衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)，或者其免疫原性片段或免疫原性变体。
本文中使用的术语“编码RNA”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指包括包含多个核苷酸三联体的编码序列(“cds”)的RNA，其中所述cds可以被翻译成肽或蛋白。
本文中使用的术语“用于疫苗的编码RNA”应当理解为具有某些有利特征的编码RNA，这些有利特征使该RNA适合于对象例如人类的体内施用。此外，“用于疫苗的编码RNA”优选地在施用于对象例如人类时表达，其被翻译为蛋白质。此外，“用于疫苗的编码RNA”优选地在施用于对象例如人类之后，诱导针对编码蛋白的特异性免疫应答。
优选地，所述“用于疫苗的编码RNA”经肌内施用或皮内施用后造成对象中编码的CSP抗原的表达。
术语“免疫原性片段”或“免疫原性变体”应当理解为相应抗原(例如CSP)的片段/变体，其可以在对象中引起免疫应答。
一般地，本发明的RNA可以包括蛋白质编码区(也称为编码序列“cds”或“ORF”)和5’-和/或3’-非翻译区(UTR)。3’-UTR在序列和尺寸上是可变的；它的跨度在终止密码子和多聚腺苷酸尾之间。重要的是，3’-UTR序列含有几个调控基序，这些基序决定RNA的转化、稳定性和定位，从而控制转录后调控的许多方面。在RNA的医药应用(例如免疫治疗应用、疫苗接种)中，RNA翻译为蛋白质的调控对于治疗安全性和效果来说至关重要。发明人出人意料地发现，某些RNA构建体能够快速和瞬时表达大量CSP抗原肽或蛋白质。此外，当施用于对象时，所述RNA分子诱导平衡的免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。因此，本文提供的编码RNA特别有用并且适合于体内的各种应用，包括针对疟原虫的疫苗接种，并且因此可以是用于治疗和/或预防疟疾的疫苗的合适组分。
疟原虫：
如本文中使用的，术语“疟原虫”指能够在对象中引发疟疾的任何原生动物寄生虫。
通常，疟疾是由疟原虫属(NCBI分类ID：5820)或疟原虫亚属(NCBI分类ID：418103)的寄生原生动物引起的。因此，本领域一般技术人员理解并识别疟原虫属的物种为“疟原虫”。术语“疟原虫属”是指疟原虫属或亚属中的任何物种，并且不限于特定物种、亚种、品系、变体或隔离群等。因此，术语“疟原虫属”可以指任何来源的疟原虫种、疟原虫亚种、疟原虫品系、疟原虫变体、疟原虫隔离群。优选地，“疟原虫属”可以在人类或动物中引起疾病，例如至少与疟疾相关的轻微症状。
在优选的实施方案中，本发明的至少一种抗原蛋白可以衍生自任意一种选自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi，Pk)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale，Po)、类卵形疟原虫(Plasmodium simiovale，Ps)和间日疟原虫(Plasmodium vivax，Pv)的疟原虫。在优选的实施方案中，疟原虫是恶性疟原虫(Pf)、三日疟原虫(Plasmodium malariae，Pm)、卵形疟原虫curtisi亚种(Plasmodium ovalecurtisi，Poc)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri，Pow)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei，Pb)。
根据各种实施方案，第一方面的RNA的编码序列包括或组成为编码衍生自如下面清单1所示任意一种疟原虫的抗原蛋白的核酸序列。因此，对于每一种合适的疟原虫，特别是每一种合适的疟原虫属物种(例如恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)和间日疟原虫(Pv))，都标明了相应的NCBI分类ID(“NCBI-ID”)。
清单1：具有相应的NCBI分类ID的疟原虫/疟原虫属物种和亚种：
物种：恶性疟原虫(Pf)(疟原虫P.falciparum)(5833)；亚种：恶性疟原虫303.1亚种(1245013)；恶性疟原虫309.1亚种(1245014)、恶性疟原虫311亚种(57265)、恶性疟原虫318.1亚种(1245015)、恶性疟原虫326.1亚种(1245016)、恶性疟原虫327.1亚种(1245017)、恶性疟原虫365.1亚种(1245018)、恶性疟原虫366.1亚种(1245019)、恶性疟原虫377.1亚种(1245020)、恶性疟原虫383.1亚种(1245021)、恶性疟原虫397.1亚种(1245022)、恶性疟原虫398.1亚种(1245023)、恶性疟原虫3D7亚种(36329)、恶性疟原虫58.1亚种(1245012)、恶性疟原虫7G8亚种(57266)、恶性疟原虫803_H2亚种(1226433)、恶性疟原虫87_239亚种(685969)、恶性疟原虫B1E4_6273_2clone2亚种(1226423)、恶性疟原虫CAMP/Malaysia亚种(5835)、恶性疟原虫CDC/Honduras亚种(5836)、恶性疟原虫Cp803亚种(1226435)、恶性疟原虫D10亚种(478861)、恶性疟原虫D6亚种(478860)、恶性疟原虫Dd2亚种(57267)、恶性疟原虫FC27/Papua New Guinea亚种(5837)、恶性疟原虫FcB1/Columbia亚种(186763)、恶性疟原虫FCBR/Columbia亚种(33631)、恶性疟原虫FCC-2/Hainan亚种(478862)、恶性疟原虫FCH-5亚种(1036724)、恶性疟原虫FCH/4亚种(132416)、恶性疟原虫FCM17/Senegal亚种(5845)、恶性疟原虫FCR-3/Gambia亚种(5838)、恶性疟原虫Fid3/India亚种(70152)、恶性疟原虫GB4亚种(5833)、恶性疟原虫HB3亚种(137071)、恶性疟原虫IGH-CR14亚种(580059)、恶性疟原虫IMR143亚种(57268)、恶性疟原虫WELLCOME亚种(5848)、恶性疟原虫K1亚种(5839)、恶性疟原虫KF1916亚种(57269)、恶性疟原虫LE5亚种(5840)、恶性疟原虫Mad20/Papua New Guinea亚种(5841)、恶性疟原虫Mad71/Papua New Guinea亚种(70154)、恶性疟原虫MaliPS096_E11亚种(1036727)、恶性疟原虫ML-14亚种(685970)、恶性疟原虫MLW.2745亚种(1226410)、恶性疟原虫MLW.2749亚种(1226408)、恶性疟原虫MLW.2786亚种(1226411)、恶性疟原虫MLW.2788亚种(1226413)、恶性疟原虫MLW.2861亚种(1226420)、恶性疟原虫MLW.2927亚种(1226417)、恶性疟原虫MLW.2928亚种(1226415)、恶性疟原虫MLW.2929亚种(1226421)、恶性疟原虫MLW.2941亚种(1226418)、恶性疟原虫MLW.2953亚种(1226419)、恶性疟原虫MLW.2955亚种(1226412)、恶性疟原虫MLW.2965亚种(1226414)、恶性疟原虫MLW.2970亚种(1226409)、恶性疟原虫MLW.2979亚种(1226422)、恶性疟原虫MLW.2998亚种(1226416)、恶性疟原虫NF135/5.C10亚种(1036726)、恶性疟原虫NF54亚种(5843)、恶性疟原虫NF7/Ghana亚种(5842)、恶性疟原虫Nig32/Nigeria亚种(70150)、恶性疟原虫P27.02亚种(871297)、恶性疟原虫P51.02亚种(871296)、恶性疟原虫Palo Alto/Uganda亚种(57270)、恶性疟原虫RAJ116亚种(580058)、恶性疟原虫RO-33亚种(5834)、恶性疟原虫Santa Lucia亚种(478859)、恶性疟原虫Senegal_V34.04亚种(478863)、恶性疟原虫SenP05.02亚种(871286)、恶性疟原虫SenP08.04亚种(871278)、恶性疟原虫SenP09.04亚种(871279)、恶性疟原虫SenP11.02亚种(871276)、恶性疟原虫SenP19.04亚种(871277)、恶性疟原虫SenP26.04亚种(871275)、恶性疟原虫SenP31.01亚种(871284)、恶性疟原虫SenP60.02亚种(871285)、恶性疟原虫SenT002.09亚种(1107494)、恶性疟原虫SenT015.09.c亚种(1226430)、恶性疟原虫SenT016.10.d亚种(1226436)、恶性疟原虫SenT021.09亚种(1107495)、恶性疟原虫SenT021.10.d亚种(1226437)、恶性疟原虫SenT029.09亚种(1107496)、恶性疟原虫SenT032.09亚种(1107493)、恶性疟原虫SenT033.09亚种(1107497)、恶性疟原虫SenT042.09.c亚种(1226427)、恶性疟原虫SenT046.09.c亚种(1226434)、恶性疟原虫SenT047.09.c亚种(1226425)、恶性疟原虫SenT049.10.d亚种(1226438)、恶性疟原虫SenT061.10.d亚种(1226439)、恶性疟原虫SenT065.10.d亚种(1226440)、恶性疟原虫SenT069.10.d亚种(1226441)、恶性疟原虫SenT076.10.d亚种(1226442)、恶性疟原虫SenT077.09.c亚种(1226426)、恶性疟原虫SenT079.09.c亚种(1226424)、恶性疟原虫SenT079.10.d亚种(1226443)、恶性疟原虫SenT086.09亚种(1107498)、恶性疟原虫SenT090.09亚种(1107499)、恶性疟原虫SenT092.09.c亚种(1226431)、恶性疟原虫SenT104.10.d亚种(1226444)、恶性疟原虫SenT106.09.d亚种(1226445)、恶性疟原虫SenT108.10.d亚种(1226446)、恶性疟原虫SenT109.09.c亚种(1226429)、恶性疟原虫SenT111.09亚种(1107500)、恶性疟原虫SenT111.10.d亚种(1226447)、恶性疟原虫SenT112.09亚种(1107501)、恶性疟原虫SenT112.10.d亚种(1226448)、恶性疟原虫SenT116.09.d亚种(1226449)、恶性疟原虫SenT117.09.d亚种(1226450)、恶性疟原虫SenT118.10.d亚种(1226451)、恶性疟原虫SenT121.09.d亚种(1226452)、恶性疟原虫SenT123.09亚种(1107502)、恶性疟原虫SenT125.10.d亚种(1226453)、恶性疟原虫SenT126.10.d亚种(1226454)、恶性疟原虫SenT127.09亚种(1107503)、恶性疟原虫SenT128.09亚种(1107504)、恶性疟原虫SenT131.10.d亚种(1226455)、恶性疟原虫SenT131.11.d亚种(1226456)、恶性疟原虫SenT135.09亚种(1107505)、恶性疟原虫SenT135.10.d亚种(1226457)、恶性疟原虫SenT137.09亚种(1107506)、恶性疟原虫SenT139.09.d亚种(1226458)、恶性疟原虫SenT142.09亚种(1107507)、恶性疟原虫SenT145.10.d亚种(1226459)、恶性疟原虫SenT147.09.d亚种(1226460)、恶性疟原虫SenT148.09亚种(1107508)、恶性疟原虫SenT149.09亚种(1107509)、恶性疟原虫SenT151.09亚种(1107510)、恶性疟原虫SenT153.09.c亚种(1226428)、恶性疟原虫SenT155.10.d亚种(1226461)、恶性疟原虫SenT161.09.d亚种(1226462)、恶性疟原虫SenT161.10.d亚种(1226726)、恶性疟原虫SenT162.10.d亚种(1226463)、恶性疟原虫SenT165.09亚种(1107511)、恶性疟原虫SenT166.09亚种(1107512)、恶性疟原虫SenT183.10.d亚种(1226464)、恶性疟原虫SenT184.10.d亚种(1226465)、恶性疟原虫SenT250.08.c亚种(1226432)、恶性疟原虫SenT26.04亚种(871281)、恶性疟原虫SenT28.04亚种(871280)、恶性疟原虫SenV34.04亚种(871283)、恶性疟原虫SenV35.04亚种(871282)、恶性疟原虫T4/Thailand亚种(5846)、恶性疟原虫TAK 9亚种(57276)、恶性疟原虫Tanzania亚种(2000708)(1036725)、恶性疟原虫Th10.04_D10亚种(871287)、恶性疟原虫Th105.07亚种(871292)、恶性疟原虫Th113.09亚种(871299)、恶性疟原虫Th130.09亚种(871298)、恶性疟原虫Th15.04亚种(871294)、恶性疟原虫Th230.08亚种(871290)、恶性疟原虫Th231.08亚种(871289)、恶性疟原虫Th232.08亚种(871288)、恶性疟原虫Th74.08亚种(871293)、恶性疟原虫THTN/Thailand亚种(70151)、恶性疟原虫UGK 396.1亚种(1050250)、恶性疟原虫UGK 408.2亚种(1050252)、恶性疟原虫UGK 432.4亚种(1050253)、恶性疟原虫UGK 443.2亚种(1050251)、恶性疟原虫UGK 659.1亚种(1050254)、恶性疟原虫UGK 661.1亚种(1050255)、恶性疟原虫UGK 674.4亚种(1050256)、恶性疟原虫UGK 707.3亚种(1050257)、恶性疟原虫UGK 730.2亚种(1050258)、恶性疟原虫UGK 815.1亚种(1050259)、恶性疟原虫UGT5.1亚种(1237627)、恶性疟原虫V1亚种(5847)、恶性疟原虫V42.05亚种(871295)、恶性疟原虫V92.05亚种(871291)、恶性疟原虫Vietnam Oak-Knoll亚种(FVO)(1036723)、恶性疟原虫VS/1亚种(478864)、恶性疟原虫W2mef亚种(5833)；物种：诺氏疟原虫(Pk)(5850)；亚种：诺氏疟原虫H亚种(5851)、诺氏疟原虫Nuri亚种(5852)；物种：三日疟原虫(Pm)(5858)；物种：三日疟原虫比较亚种(196059)；物种：三日疟原虫比较亚种2型(1583084)；物种：卵形疟原虫(Po)(疟原虫P.ovale)(36330)；亚种：卵形疟原虫curtisi亚种(Poc)(864141)、卵形疟原虫Nigeria1/CDC(573885)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Pow)(864142)；物种：卵形疟原虫比较种(943109)；物种：类卵形疟原虫(35085)；物种：间日疟原虫(Pv)(疟原虫P.vivax)(5855)；亚种：间日疟原虫Brazil I亚种(1033975)、间日疟原虫India VII亚种(1077284)、间日疟原虫IQ07亚种(882766)、间日疟原虫Mauritania I亚种(1035515)、间日疟原虫North Korean亚种(1035514)、间日疟原虫Sal-1亚种(126793)、间日疟原虫Belem亚种(31273)；物种：间日疟原虫比较种(943110)；物种：间日疟原虫比较种EKgor1179_SGA2.9(1318701)；物种：间日疟原虫比较种EKgor514_SGA2.6(1318700)；物种：间日疟原虫比较种FP-2013(1329927)；物种：间日疟原虫样种(27990)。
在优选的实施方案中，第一方面的抗原蛋白可以衍生自恶性疟原虫(NCBI-ID5833，或者根据清单1中相应的亚种)，特别是，衍生自恶性疟原虫3D7(NCBI-ID 36329)或者PfNF54(5843)。
合适的疟疾抗原：
本发明涉及编码RNA，其中所述编码RNA包括编码序列，该序列编码衍生自如上定义的疟原虫的至少一种抗原蛋白、或者衍生自疟原虫的抗原蛋白的免疫原性片段或免疫原性变体。
适当地，至少一种抗原蛋白可以衍生自环孢子虫蛋白(CSP)、肝期抗原1(LSA1)、裂殖子表面蛋白1(MSP1)、顶端膜抗原1(AMA1)、血小板反应蛋白相关的黏附蛋白(TRAP)、VAR2CSA、配子表面抗原(Pfs230)、动合子表面蛋白(Pfs28)、有性期抗原(pfs25)、传播阻断靶蛋白(Pfs45/48)、网状细胞结合蛋白同源体5(RH5)、RH5相互作用蛋白(Ripr)、红细胞膜蛋白1(EMP1)、子孢子表面蛋白2(SSP2)或其组合，或者这些中的任一项的免疫原性片段或免疫原性变体。
合适的抗原蛋白例如AMA1、EMP1、MSP1、SSP2或TRAP可以是衍生自根据WO2017/070624的表3、WO2017/070624的表3内容的蛋白质，特别地，WO2017/070624的表3中公开的NCBI登录号通过引用包括在本文中。
在优选的实施方案中，至少一种抗原蛋白可以衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)，或者其免疫原性片段或免疫原性变体。
CSP是多功能蛋白质，在疟原虫的子孢子表面形成一层致密的芽孢衣。其整体结构在所有疟原虫物种中都高度保守，由侧接包含保守的蛋白裂解位点的NH2-端结构域的中央重复区以及C-端细胞黏附结构域、血小板反应蛋白重复(TSR)结构域组成。在本领域中已经提出，CSP的N-和C-端区域在从卵囊中逸出、侵入唾腺、离开接种部位以及定位并入侵肝细胞的过程中具有功能性作用。从卵囊中释放后，CSP的N-端介导对唾腺的黏附，并且在哺乳动物宿主中，该区域掩盖了TSR，使子孢子保持迁移状态。在肝脏中，受调控的蛋白裂解事件导致暴露TSR的蛋白的N-端有三分之一被去除，这一事件可能对子孢子有效入侵肝细胞至关重要。
由于CSP在疟原虫的子孢子的表面表达，所以CSP可能是抗体介导的免疫的主要靶标。因此，在本发明的上下文中，CSP(或其片段、变体)用作抗原。
合适的CSP氨基酸序列可以衍生自清单2中提供的任意CSP(NCBI蛋白登录号)。
清单2：合适的疟疾抗原的NCBI蛋白登录号：
因此，包含在清单2的登录号的CSP的每个氨基酸序列，以及与包含在清单2的登录号的每个氨基酸序列具有大于80％、95％、90％、95％的一致性的相应变体，也在此作为本公开的一部分。此外，包含在清单2的登录号的氨基酸序列的片段，例如具有包含在清单2的登录号的氨基酸序列的大于60％、70％、80％、90％长度的相应片段，也在此作为本公开的一部分。
在各种实施方案中，与SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085中的任一个或这些序列的任一个的免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的CSP的每个氨基酸序列，都可以是本发明的“衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白”。关于编码衍生自疟原虫的蛋白的这些合适氨基酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
应当指出，除非另有说明，当参考氨基酸(aa)残基及其在CSP中的位置时，本文使用的任意编号指根据SEQ ID NO：1的恶性疟原虫3D7(品种NCBI-ID36329)相应CSP中相应氨基酸残基的位置。在本公开中，以恶性疟原虫3D7(XP_001351122.1，XM_001351086.1；本文中缩写为“Pf(3D7)”)的CSP为例给出相应的氨基酸位置。本领域一般技术人员将能够使与Pf(3D7)的CSP有关的教导适用于本文提供的每个CSP，特别是清单2中提供的每个CSP，优选地适用于在序列表中提供的每个CSP片段(例如SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085)。
恶性疟原虫3D7的全长CSP由397个氨基酸组成，包括以下元件或区域(以氨基酸位置表示)(更多信息可以参考Doud，Michael B.等人，″Unexpected fold in thecircumsporozoite protein target of malaria vaccines.″Proceedings of theNationalAcademy of Sciences 109.20(2012)：7817-7822)：
E1)全长CSP：氨基酸1-397；
E2)分泌型信号序列/信号肽(SP)：氨基酸1-18；
E3)RI区+NANP重复区：氨基酸93-272；
E4)中央重复区：氨基酸105-272；
E5)NANP重复区：氨基酸98-272；
E6)EcCSP片段：氨基酸27-384；
E7)PpCSP片段：氨基酸74-383；
E8)RI区：氨基酸93-97；
E9)RTS，S片段：氨基酸207-395；
E10)RIII区、Th2R表位v1区：氨基酸310-327；
E11)RIII区+TSR(RII+)区：氨基酸310-374；
E12)TSR v3区：氨基酸319-375；
E13)TSR v1区：氨基酸326-374；
E14)TSR v2区：氨基酸328-374；
E15)RII+v1区：氨基酸330-347；
E16)RII+v2区：氨基酸330-351；
E17)糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚：氨基酸375-397；
E18)CSP-delSP-delTSR(v2)-delGPI：氨基酸19-325；
E19)CSP-delTSR(v2)-delGPI：氨基酸1-325；
E20)CSP-delSP-delGPI：氨基酸19-374；
E21)CSP-delSP：氨基酸19-397；
E22)CSP_delGPI：氨基酸1-374；
E23)RIII区、Th2R表位v2区：氨基酸309-327；
E24)Th3R表位v2区：氨基酸346-366；
E25)Th3R+CS.T3表位v2区：氨基酸346-376；
E26)Th3R表位v2区：氨基酸346-365；
E27)Th3R+CS.T3表位v2区：氨基酸346-375。
优选地，当在本发明的上下文中提到CSP蛋白时，其应当理解为存在以上元件E1至E27的至少一种，或者存在以上元件E1至E27的至少一种片段。因此，本发明的编码RNA编码以上描述的元件E1至E27的至少一种或其免疫原性片段或免疫原性变体。
恶性疟原虫3D7的CSP包括若干已描述的表位，例如抗体结合位点3A1(氨基酸69-74)、抗体结合位点2C3(氨基酸75-94)、抗体结合位点3H10/3B4(氨基酸95-100)等。在优选的实施方案中，本发明的编码RNA编码至少一个CSP表位，例如上述示例性表位之一。
表3中提供了衍生自Pf(3D7)的CSP的合适蛋白片段以及编码所述片段的相应的RNA编码序列(A列：表明氨基酸相对于全长蛋白的位置的片段的描述；B列：相应的氨基酸序列)。优选的蛋白片段的实例包括但不限于CSP(1-397)、CSP(19-397)、CSP(19-384)和CSP(199-377)。
在优选的实施方案中，衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白包含衍生自CSP的氨基酸序列延伸，所述CSP的长度是多于180个氨基酸、200个氨基酸、220个氨基酸、240个氨基酸、260个氨基酸、280个氨基酸、300个氨基酸、320个氨基酸、340个氨基酸、360个氨基酸、380个氨基酸、390个氨基酸，其中氨基酸延伸优选地衍生自恶性疟原虫3D7的CSP。
更优选地，衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白包含衍生自CSP的氨基酸序列延伸，所述CSP的长度是300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个氨基酸，其中氨基酸延伸优选地衍生自恶性疟原虫3D7的CSP。
在优选的实施方案中，衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白包含衍生自CSP的氨基酸序列延伸，其中所述延伸相当于至少75％的全长CSP、80％的全长CSP、85％的全长CSP、86％的全长CSP、87％的全长CSP、88％的全长CSP、89％的全长CSP、90％的全长CSP、91％的全长CSP、92％的全长CSP、93％的全长CSP、94％的全长CSP、95％的全长CSP、96％的全长CSP、97％的全长CSP、98％的全长CSP、99％的全长CSP，其中该氨基酸延伸优选地衍生自恶性疟原虫的3D7的CSP，其中全长CSP(即100％的全长)的长度是397个氨基酸。
此处的“相当于”应当理解为氨基酸序列与CSP的氨基酸序列、特别是与衍生自恶性疟原虫3D7的CSP的氨基酸序列相同或者至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同。
在本上下文中，优选地，全长CSP可以用作合适的抗原，并且可以优选地衍生自清单2中提供的任意NCBI蛋白登录号。在本发明优选的实施方案中，适当地使用恶性疟原虫3D7的全长CSP(SEQ ID NO：1)。
在优选的实施方案中，更全长的CSP可以用作合适的抗原，并可以优选地衍生自清单2中提供的任意NCBI蛋白登录号或者可以选自SEQ ID NO：1-36、2481-2886中的任一个。在本发明优选的实施方案中，适当地使用衍生自SEQ ID NO：1的恶性疟原虫3D7的更全长的CSP。
术语“更全长的CSP”应当理解为，与RTS，S片段(CSP(207-395)；SEQ ID NO：2112)相比，在长度上更接近全长氨基酸序列的CSP氨基酸序列。因此，“更全长的CSP”包含衍生自CSP、优选地衍生自恶性疟原虫3D7的CSP的多于190个氨基酸、200个氨基酸、220个氨基酸、240个氨基酸、260个氨基酸、280个氨基酸、300个氨基酸、320个氨基酸、340个氨基酸、360个氨基酸、380个氨基酸、390个氨基酸。换言之，“更全长的CSP”包含衍生自CSP的氨基酸序列延伸，其中所述延伸至少相当于75％的全长CSP、80％的全长CSP、85％的全长CSP、86％的全长CSP、87％的全长CSP、88％的全长CSP、89％的全长CSP、90％的全长CSP、91％的全长CSP、92％的全长CSP、93％的全长CSP、94％的全长CSP、95％的全长CSP、96％的全长CSP、97％的全长CSP、98％的全长CSP、99％的全长CSP。
与例如截短的CSP(例如Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg)相比，更全长的CSP作为抗原诱导更广泛的体液抗体应答、特别是细胞抗体应答。更全长的CSP可以提供额外的T细胞表位，导致细胞免疫增强，这可能会加强相对于疟疾的保护(例如参见实施例6、7、8)。
SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085提供了衍生自疟原虫的合适的CSP蛋白；编码所述CSP蛋白的对应RNA编码序列见表A。关于编码衍生自疟原虫的蛋白的这些合适的氨基酸序列的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
根据另一个优选的实施方案，本发明的编码RNA编码如上文定义的衍生自CSP的至少一种疟疾抗原肽或蛋白，以及另外至少一种其他异源肽或蛋白元件。
适当地，至少一种其他肽或蛋白元件可以促进本发明的编码抗原肽或蛋白的分泌(例如通过分泌型信号序列)、促进本发明的编码抗原肽或蛋白的对质膜的锚定(例如通过跨膜元件)、促进抗原复合物的形成(例如通过多聚结构域)、促进病毒样颗粒的形成(VLP形成序列)。此外，编码RNA还可以编码肽接头元件、自我剪切肽、免疫原性佐剂序列或树突细胞靶序列。合适的多聚结构域可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1116-1167的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。三聚和四聚元件可以选自例如工程化的亮氨酸拉链(采用平行三聚体状态的工程化的α-卷曲螺旋螺旋肽)、来自肠杆菌噬菌体T4、GCN4pII、GCN4-pLI和p53的纤维蛋白折叠结构域。在这种情况下，优选来自肠杆菌噬菌体T4、GCN4pII、GCN4-pLI和p53的纤维蛋白折叠结构域。合适的跨膜元件可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1228-1343的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的VLP形成序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1168-1227的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的肽接头可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1509-1565的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的自我剪切肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1434-1508的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的免疫原性佐剂序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ IDNO：1360-1421的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的树突细胞(DC)可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1344-1359的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。合适的分泌型信号肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1-1115和SEQ ID NO：1728的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。
适当地，本发明的至少一种编码RNA编码衍生自如上文定义的CSP的至少一种疟疾抗原肽或蛋白以及另外的选自异源分泌型信号肽、肽接头元件、辅助表位、抗原聚类结构域或跨膜结构域的至少一种或多于一种异源肽或蛋白元件。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA还编码了异源分泌型信号肽。
在本发明的编码RNA还编码了异源分泌型信号肽的实施方案中，特别优选并适于产生包含异源N-端分泌型信号序列和衍生自CSP的C-端肽或蛋白的融合蛋白，其中所述衍生自CSP的C-端肽或蛋白优选地缺失内源N-端分泌型信号肽。因此，在CSP蛋白的背景下，其适于去除至少前18个氨基酸(代表CSP的分泌型信号序列)，并将异源N-端信号序列融合到CSP抗原上。这种构建体可以理想地改善CSP蛋白(其是由第一方面的RNA编码的)的分泌。
合适的分泌型信号肽可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1-1115和SEQ ID NO：1728的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体，其中所述N-端融合到CSP蛋白(或片段)的分泌型信号肽缺失内源分泌型信号序列。
在一些实施方案中，信号肽选自：专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：423-427，或者这些序列的任一个的片段或变体。在本发明的上下文中，专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：423-427及其相关的公开通过引用并入本文。
在特别优选的实施方案中，信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6208的人SPARC(HsSPARC)。在特别优选的实施方案中，信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6207的人胰岛素异形体1(HsIns-iso1)。在特别优选的实施方案中，信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6205的人白蛋白(HsALB)。在特别优选的实施方案中，信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6206的IgE。
在特别优选的实施方案中，分泌型信号肽是或者衍生自HsALB，其中所述异源信号肽的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：6205或这些中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在本发明的编码RNA还编码异源分泌型信号肽的实施方案中，特别优选并适于产生包含异源N-端分泌型信号肽和衍生自CSP的C-端肽或蛋白的融合蛋白，其中所述衍生自CSP的C-端肽或蛋白优选地缺失内源N-端分泌型信号肽(例如，缺失CSP(1-18))。包含N-端分泌型信号肽的构建体可以理想地改善疟疾蛋白、优选CSP蛋白(其是由第一方面的编码RNA编码的)的分泌。因此，施用第一方面的编码RNA后，抗原、优选的CSP蛋白的分泌改善，可以有利于诱导针对编码的疟原虫属抗原蛋白的免疫应答(参见例如实施例8、图13B、第5组和第6组的对比)。
因此，在各种实施方案中，由SEQ ID NO：2081-2120、10080-10085定义的任意CSP片段还可以包括异源分泌型信号序列，优选地如上文定义的分泌型信号序列，以产生在体内分泌的CSP抗原。特别地，任何由SEQ ID NO：2081-2120、10080-10085定义的CSP片段还可以包括SEQ ID NO：6205-6208的N-端异源分泌型信号序列。
包括异源分泌型信号序列的CSP构建体的实例包括但不限于HsALB_Pf-CSP(19-397)、HsIns-iso1_Pf-CSP(19-397)、HsSPARC_Pf-CSP(19-397)、IgE_Pf-CSP(19-397)、HsALB_Pf-CSP(19-152)、HsALB_Pf-CSP(19-192)、HsALB_Pf-CSP(19-272)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-325)、HsALB_Pf-CSP(19-384)、HsALB_Pf-CSP(19-384)_TM domain HA、HsALB_Pf-CSP(82-397)、HsALB_Pf-CSP(93-192)、HsALB_Pf-CSP(93-272)、HsALB_Pf-CSP(93-397)、HsALB_Pf-CSP(98-192)、HsALB_Pf-CSP(98-272)、HsALB_Pf-CSP(98-374)、HsALB_Pf-CSP(98-397)、HsALB_Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(SGG)_Ferritin、HsALB_Pf-CSP(93-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-397)、HsALB_Pb-CSP(24-340)、HsIns-iso1_Pb-CSP(24-340)、HsSPARC_Pb-CSP(24-340)、IgE_Pb-CSP(24-340)，其中特别优选HsALB_Pf-CSP(19-397)、HsALB_Pf-CSP(19-384)、HsALB_Pf-CSP(19-384)_TM domain HA和HsALB_Pf-CSP(199-377)_HBsAg。上面列出的每种构建体对应的氨基酸序列可在表1中找到。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA还编码了异源肽接头元件。
因此，本发明的编码RNA可以包含至少一种如上文定义的CSP蛋白或片段，和至少一种肽接头元件，其中肽接头可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1509-1565的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。
在特别优选的实施方案中，异源肽接头元件选自SEQ ID NO：6241-6244、10141、10147。
在适当的实施方案中，本发明的编码RNA编码了部分截短的C-端区域。C-端区域的部分区域的缺失可以保护其免受区域的不良影响，避免干扰正常的免疫应答。优选地，在这些C-端截短的CSP蛋白中，保留了CSP衍生的T细胞表位。这些T细胞表位适当地与如上文所述的异源接头序列结合。合适的和优选的T细胞表位区域是例如Th2R：CSP(309-327)、Th2R：CSP(310-327)、Th3R：CSP(346-366)、Th3R：CSP(346-365)、Th3R+CS.T3：CSP(346-375)、Th3R+CS.T3：CSP(346-376)。CSP的αTSR结构域含有若干T细胞表位，其中之一(CS).T3负责与保护相关的CD4+T细胞应答。其他T细胞表位Th2R和Th3R是αTSR的多态性区域(Doud，MichaelB.等人，“Unexpected fold in the circumsporozoite protein target of malariavaccines.”Proceedings of the National Academy of Sciences 109.20(2012)：7817-7822)。优选的衍生自C-端CSP的T细胞辅助表位选自根据SEQ ID NO：2100、2101、2102、2113、10083、10084的氨基酸序列。
C-端区域的部分区域缺失以及T细胞表位与异源接头的结合可以增强免疫应答(参见实施例9、图14和图15)。相对位置及T细胞表位选择的差异影响免疫应答的类型和方向。一些结合使得体液应答增强(例如C-端AAY-CSP(310-327)-AAY-CSP(346-375)和AAY-CSP(346-365)-AAY-CSP(346-375)的构建体)，其他则会导致增强的CD4+和/或CD8+T细胞应答(例如AAY-CSP(310-327)-AAY-CSP(346-375)和G4S-CSP(310-327)-CSP(346-375))。
优选的C-端末端的实例包括但不限于_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)。
包含异源肽接头元件的CSP构建体的实例包括但不限于Pf-CSP_Linker(G4SG4)_TM domain HA、Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、Pf-CSP(199-387)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、LumSynt_Linker(GGS4-GGG)_Pf-CSP(19-397)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(SGG)_Ferritin、HsALB_Pf-CSP(93-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-397)、Pb-CSP_Linker(G4SG4)_TM domain HA。上面列出的每种构建体对应的氨基酸序列可在表1中找到。
包含衍生自CSP的至少一种T细胞辅助表位的CSP构建体的实例是HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-397)。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA还编码了至少一种异源辅助表位。辅助表位可以增强对编码CSP的RNA的免疫应答。
在特别优选的实施方案中，异源辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6272的P2辅助表位。在特别优选的实施方案中，辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6273的PADRE。在特别优选的实施方案中，辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6274的HBsAg(乙型肝炎病毒的表面抗原)。
在实施方案中，辅助表位是或者衍生自P2破伤风毒素、PADRE或HBsAg，其中所述辅助表位的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：6272、6273或6274的任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
优选地，所述异源辅助表位位于如上文定义的CSP抗原的C-端。
优选地，根据SEQ ID NO：6272的破伤风毒素的P2辅助表位的氨基酸序列(衍生自Kovacs-Nolan等人的GenBank X04436.1或NC_004565.1；PMID 16978788；P2：aa 830-844)可以作为本发明的编码RNA的有利的设计基础。已经证明，抗原中包含P2会强烈影响抗体对弱免疫原性B细胞表位的应答。在基于mRNA的疫苗方法中，添加编码P2辅助表位的序列在增强免疫应答方面可能特别有效。
优选地，辅助表位是根据SEQ ID NO：6273的泛HLA DR结合表位(PADRE)或其片段、变体或衍生物。PADRE是免疫显性辅助CD4+T细胞表位。CD4+T细胞在CD8+T效应细胞的产生和记忆性T细胞的免疫应答中起重要作用。CD4+T细胞免疫应答及由此相应的抗原特异性CD8+T细胞应答可以通过编码至少一种本文所述的疟原虫属抗原蛋白和另外地至少一种异源辅助表位泛HLA DR结合表位(PADRE)来增强。在基于mRNA的疫苗方法中，添加编码PADRE辅助表位的序列在增强免疫应答方面可能特别有效。
优选地，至少一种辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6274的HBsAg(乙型肝炎病毒的表面抗原)或其片段、变体或相应的衍生物。HBsAg包含若干CD4T细胞辅助表位(参见例如Desombere，Isabelle等人“Characterization of the T cell recognition ofhepatitis B surface antigen(HBsAg)by good and poor responders to hepatitis Bvaccines.”Clinical&Experimental Immunology 122.3(2000)：390-399)。CD4+T细胞在CD8+T效应细胞的产生和记忆性T细胞的免疫应答中起重要作用。CD4+T细胞免疫应答及由此相应的抗原特异性CD8+T细胞应答可以通过编码至少一种本文所述的疟原虫属抗原蛋白和另外地至少一种衍生自HBsAg的辅助表位来增强。在基于mRNA的疫苗方法中，添加编码衍生自HBsAg的辅助表位的序列在增强免疫应答方面可能特别有效。
包含异源辅助表位的CSP构建体的实例包括但不限于HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(AAY)_P2、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_P2、Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、Pf-CSP(199-387)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(93-384)_Linker(PVTN)_HbsAgcarrier matrix。上面列出的每种构建体对应的氨基酸序列可在表1中找到。
HBsAg(例如根据SEQ ID NO：6274的乙型肝炎病毒的表面抗原)的结构域或片段可以包含一种或多于一种T辅助表位，而且此外该蛋白或其片段可以作为抗原聚类结构域或多聚结构域。
在其他的优选实施方案中，本发明的编码RNA还编码了异源抗原聚类结构域或多聚结构域。
适当地，抗原聚类结构域(多聚结构域或支架部分)是或衍生自铁蛋白、2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)、乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)或胶囊蛋白。
支架蛋白的抗原聚类结构域可以例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工和/或将抗原与结合配偶体结合来例如提高抗原的免疫原性。在一些实施方案中，支架部分是蛋白质，它可以自组装为高度对称、稳定和结构有序的蛋白质纳米颗粒，直径为10nm-150nm，这一尺寸范围非常适合用于与免疫系统的各种细胞进行最佳的相互作用。在一些实施方案中，可以使用病毒蛋白或病毒样颗粒以形成稳定的纳米颗粒结构。
在优选的实施方案中，抗原聚类结构域(多聚结构域)是或者衍生自乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、铁蛋白或2，4-二氧四氢蝶啶合酶，其中所述抗原聚类结构域的氨基酸序列与根据SEQ ID NO：6274、10153、10162的氨基酸序列的任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在本发明的编码RNA还编码异源抗原聚类结构域的实施方案中，特别优选并适于产生包含异源抗原聚类结构域、任选地接头元件和衍生自CSP的肽或蛋白的融合蛋白。包含抗原聚类结构域的构建体可以提高抗原聚集，从而可以例如通过聚集的抗原和宿主细胞受体之间同时发生的多重结合事件来增强免疫应答(更多细节参见López-Sagaseta，Jacinto等人，“Self-assembling protein nanoparticles in the design of vaccines”.Computational and structural biotechnology journal 14(2016)：58-68)。此外，这种构建体还可以包含N-端分泌型信号序列(如上文所定义的)。例如，在一些实施方案中，支架部分是乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成球形颗粒。在基于mRNA的疫苗方法中，添加乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)序列的片段在增强免疫应答方面可能特别有效。
在特别优选的实施方案中，将HBsAg用于促进抗原聚集，并从而可以提高编码疟原虫属抗原、优选CSP或其片段或衍生物的RNA的免疫应答。
在特别优选的实施方案中，抗原聚类结构域(多聚结构域)是或者衍生自乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，其中所述抗原聚类结构域的氨基酸序列优选地与根据SEQ IDNO：6274的氨基酸序列或者这些中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS，LumSynth)是具有颗粒形成特性的酶，存在于广泛的生物体中，参与核黄素的生物合成。Jardine等人报道了他们尝试通过加入2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)来优化候选疫苗，从而增强重组gp120对HIV感染的免疫反应性(Jardine，Joseph等人，“Rational HIV immunogen design to target specific germline B cellreceptors”.Science 340.6133(2013)：711-716)。
在特别优选的实施方案中，将2，4-二氧四氢蝶啶合酶用于促进抗原聚集，并从而提高编码疟原虫属抗原、优选CSP或其片段或衍生物的RNA的免疫应答。
在特别优选的实施方案中，抗原聚类结构域(多聚结构域)是或者衍生自2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)，其中所述抗原聚类结构域的氨基酸序列优选地与根据SEQ ID NO：10153的氨基酸序列或者这些中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
铁蛋白是主要功能为在细胞内储存铁的蛋白质。几乎所有的生物体都产生铁蛋白，所述铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由四个α螺旋束组成，它们自组装成具有正八面体对称性的四级结构。其自组装为纳米颗粒的性质非常适用于运载和暴露抗原。
在特别优选的实施方案中，将铁蛋白用于促进抗原聚集，并从而可以提高对编码疟原虫属抗原、优选CSP或其片段或变体的RNA的免疫应答。
在特别优选的实施方案中，抗原聚类结构域是或者衍生自铁蛋白，其中所述抗原聚类结构域的氨基酸序列优选地与根据SEQ ID NO：10162的氨基酸序列或者这些中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
胶囊蛋白是从嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中分离出来的新型蛋白质笼纳米颗粒，也可以用作在自组装纳米颗粒表面呈现抗原的平台。胶囊蛋白由60个相同的31kDa单体组装而成。
包含异源抗原聚类结构域的CSP构建体的合适的实例包括但不限于HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(SGG)_Ferritin、LumSynt_Linker(GGS4-GGG)_Pf-CSP(19-397)、Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、Pf-CSP(199-387)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(PVTN)_HBsAg、HsALB_Pf-CSP(93-384)_Linker(PVTN)_HBsAg。上面列出的每种构建体对应的氨基酸序列可在表1中找到。
其他合适的多聚结构域/抗原聚类结构域可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1116-1167的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA还编码至少一种异源跨膜结构域。
在特别优选的实施方案中，异源跨膜结构域衍生自根据SEQ ID NO：6302的HA跨膜结构域。
优选地，所述异源跨膜结构域位于如上文定义的CSP抗原的C-端。
包含异源跨膜结构域的CSP构建体的实例是Pf-CSP_Linker(G4SG4)_TM domainHA和HsALB_Pf-CSP(19-384)_TM domain HA。实施例7显示，编码包含异源跨膜结构域的CSP的mRNA诱导体液和细胞免疫应答(图10和图11)。上面列出的每种构建体对应的氨基酸序列可在表1中找到。
表4提供了可以融合到本文定义的CSP抗原上的合适的异源肽或蛋白元件以及编码所述元件的相应RNA编码序列。
因此，如上所述，衍生自疟原虫的CSP的至少一种抗原蛋白可以包含，优选地在N-端至C-端方向上包含：
a)任选地，选自SEQ ID NO：6205-6208或其片段或变体的一种N-端异源分泌型信号序列，其中特别优选的为SEQ ID NO：6205，和
b)衍生自CSP的至少一种抗原蛋白，优选地选自SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085或其片段或变体的任一氨基酸序列，和
c)任选地，选自SEQ ID NO：6272、6273或6274或其片段或变体的至少一种异源辅助表位，和
d)任选地，选自SEQ ID NO：6274、10153或10162或其片段或变体的至少一种异源抗原聚类结构域，和
e)任选地，选自SEQ ID NO：6302或其片段或变体的至少一种异源跨膜结构域。
此外，a)、b)、c)、d)和/或e)可以通过选自SEQ ID NO：6241-6244、10141、10147的至少一种肽接头元件连接。
表1中提供了特别优选和合适的CSP蛋白构建体的详细描述(示意情况参见表1的E列和图26)。
在表1中，所有关于氨基酸(aa)残基的引用及其在CSP蛋白中的位置都指在Pf(3D7)的相应的CSP蛋白(SEQ ID NO：1)中相应aa残基的位置。此外，在本发明的整个说明书(如上所述)中以及在ST25序列表中也使用了用于描述表1中合适的CSP抗原设计的缩写。表1的A列提供了合适的CSP抗原设计的简短描述。表1的B列为对应于全长CSP参考(SEQ IDNO：1)的每种相应抗原设计的氨基酸延伸。表1的C列表示对应于全长CSP参考(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的百分比。表1的D列提供了衍生自Pf(3D7)的CSP抗原设计的相应蛋白的SEQ ID NO。值得注意的是，本发明的说明书明确包括本申请的ST25序列表的标识符<223>下提供的信息(“L”代表“接头”)。表1的E列将CSP抗原设计链接到其相应的示意图，如图26所示。表5中提供了编码表1中构建体的优选的RNA序列。
表1：优选的CSP抗原设计
在各种实施方案中，第一方面的RNA包含编码至少一种抗原肽或蛋白的至少一种编码序列，所述抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085中的任一个或者任意这些序列的免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列。关于编码CSP抗原的这些合适氨基酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在优选的实施方案中，第一方面的RNA包含编码抗原肽或蛋白的至少一种编码序列，所述抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：1、31、2081、2481-2886中的任一个或者任意这些序列的免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列。关于编码CSP抗原的这些合适氨基酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的RNA包含编码至少一种抗原肽或蛋白的至少一种编码序列，所述抗原肽或蛋白包含或组成为与SEQ ID NO：1-36、8742-8753(参见例如表1)中的任一个或者任意这些序列的免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列。关于编码CSP抗原的这些合适氨基酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在其他实施方案中，第一方面的RNA包含编码至少一种抗原肽或蛋白的至少一种编码序列，所述抗原肽或蛋白包含或组成为与专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：13-17中任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列。在这种情况下，专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：13-17，以及其相关的公开，都通过引用并入本文。
在各种实施方案中，第一方面的RNA包含编码衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原肽或蛋白的至少一种编码序列，或其免疫原性片段或免疫原性变体，其中使氨基酸序列发生突变/置换以使得至少一个预测的或潜在的糖基化位点缺失。
在本发明的上下文中可能合适的是，编码的氨基酸序列中糖基化位点发生突变/置换，这意味着可能被糖基化的编码的氨基酸，例如经过在体内施用编码RNA的翻译后，变成不同的氨基酸。因此，在核酸水平上，预测可被糖基化的编码天冬酰胺的密码子(N糖基化位点)被编码谷氨酰胺的密码子置换。
通过相关氨基酸的突变/置换，可以防止糖基化。在这种情况下，编码天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、脯氨酸或色氨酸的至少一种密码子被修饰，使其编码不同的氨基酸，从而使至少一个预测的或潜在的糖基化位点缺失。可以通过使用人工神经网络来对预测的糖基化位点进行预测，该人工神经网络检查常见糖基化位点的序列，例如可以通过使用NetNGlyc1.0Server来预测N-糖基化位点。
在优选的实施方案中，衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白或其免疫原性片段或免疫原性变体发生突变，以使得至少一个预测的或潜在的糖基化位点缺失，例如使天冬酰胺(N)被谷氨酰胺(Q)置换。因此，在核酸水平上，修饰核酸序列以在预测的N-糖基化位点，例如在编码的CSP蛋白或者其片段、变体或衍生物的预测的N-糖基化位点处，编码Q而不是N。在这种情况下，术语“突变的CSP”指其至少一个(预测的)糖基化位点发生突变。
在各种实施方案中，衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白的氨基酸序列或者其免疫原性片段或免疫原性变体发生突变，以使得所有预测的或潜在的糖基化位点缺失。
合适的编码序列：
根据优选的实施方案，编码RNA包含编码如本文所述的衍生自CSP的至少一种抗原肽或蛋白或者其片段和变体的至少一种编码序列。在这种情况下，编码衍生自CSP、优选衍生自Pf(3D7)的CSP的至少一种抗原肽或蛋白或者其片段和变体的任何编码序列应理解为合适的编码序列，并因此包含在第一方面的编码RNA中。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA可以包含或组成为编码本文所述的衍生自CSP的至少一种抗原肽或蛋白、优选地编码SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085中的任一个或其片段或变体的至少一种编码序列。
应当理解，在核酸水平，可以选择任何核酸序列，特别是编码与SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085或其片段或变体的氨基酸序列相同的任何RNA序列，或者编码与SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085中的任一个或其片段或变体有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并可以相应地理解为合适的编码序列，并因此可以包含在第一方面的编码RNA中。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA可以包含或组成为编码SEQ ID NO：1-36、8742-8753中的任一个或者其片段或变体的至少一种编码序列。应当理解，在核酸水平，可以选择任何核酸序列，特别是编码与SEQ ID NO：1-36、8742-8753或其片段或变体相同的氨基酸序列的任何RNA序列，或者编码与SEQ ID NO：1-36、8742-8753中的任一个或其片段或变体有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并可以相应地理解为合适的编码序列，并因此包含在第一方面的编码RNA中。
在其他的实施方案中，第一方面的编码RNA可以包含或者组成为编码专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：13-17中的任一个或者其片段或变体的至少一种编码序列。应当理解，在核酸水平，可以选择任何核酸序列，特别是编码与专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：13-17相同的氨基酸序列或这些序列中任一项的片段或变体的任何RNA序列，或者编码与专利申请WO2017/070624A1的SEQ ID NO：13-17中的任一个或其片段或变体有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的任何核酸序列(例如DNA序列、RNA序列)，并可以相应地理解为合适的编码序列，并因此包含在第一方面的编码RNA中。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含编码序列，所述编码序列包含至少一种核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。关于这些合适的核酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含编码序列，所述编码序列包含至少一种核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：37-328、8754-8855或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。关于这些合适的核酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在更优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含编码序列，所述编码序列包含至少一种核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：37、40、41、71、77、107、113、143、149、179、185、215、221、251、257、287、293、323、2121、2161、2201、2241、2281、2321、2361、2401、2441、2887-6134或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。关于这些合适的核酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在更优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含编码序列，所述编码序列包含至少一种核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO：44、80、116、152、188、224、260、296、8755或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(编码HsALB_Pf-CSP(19-397))。关于这些合适的核酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA是人工RNA。
本文使用的术语“人工RNA”旨在指非天然存在的RNA。换言之，人工RNA可以理解为非天然的核酸分子。这种RNA分子可以是非天然的，因为它有自身序列(例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或因为有其他修饰，例如核苷酸的结构修饰。一般地，人工RNA可以通过基因工程设计和/或产生，以符合所需的人工核苷酸序列(即异源序列)。在这种情况下，人工RNA可以是不天然存在的序列，即，其与野生型序列至少有一个核苷酸不同。术语“人工序列”并不限于指“一种单一的分子”，而应理解为包含本质上相同的分子的集合。因此，它也可以指多个本质相同的RNA分子。本发明的RNA优选为人工RNA。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA是经修饰的和/或稳定化的人工RNA。
因此，根据优选的实施方案，本发明的RNA可以作为“稳定化的人工RNA”或“稳定化的编码RNA”提供，即表现出增强的体内降解抗性的RNA和/或表现出增强的体内稳定性的RNA，和/或表现出增强的体内可翻译性的RNA。在下文中将描述在此上下文中适用于“稳定化”RNA的具体合适的修饰。
这种稳定化可通过提供如本文所述的“干燥RNA”和/或“纯化RNA”来实现。替代地或除此之外，例如，这种稳定化可以例如通过本发明的编码RNA的经修饰的磷酸酯主链来实现。关于本发明的主链修饰是包含在RNA内的核苷酸主链中的磷酸酯被化学修饰的修饰。在这方面可以优选使用的核苷酸包含例如硫代磷酸酯修饰的磷酸酯主链，优选地磷酸酯主链中所含的至少一个磷酸氧被硫原子所取代。稳定化的RNA还可以包括例如：非离子磷酸酯类似物，例如烷基和芳基膦酸酯，其中带电的膦酸酯氧被烷基或芳基取代，或磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电的氧残基以烷基化形式存在。这种主链修饰通常包括但不限于甲基膦酸酯、磷酰胺和硫代磷酸酯(例如胞苷5’-O-(1-硫代磷酸酯))的修饰。
下文描述了能够“稳定化”本发明的RNA的合适的修饰。
根据实施方案，RNA是经修饰的RNA，其中修饰指化学修饰，其包括主链修饰以及糖修饰或碱基修饰。
经修饰的RNA可以包含核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在本发明的上下文中，主链修饰是RNA中核苷酸主链的磷酸酯被化学修饰的修饰。在本发明的上下文中，糖修饰是RNA中核苷酸的糖的化学修饰。
此外，在本发明的上下文中，碱基修饰是RNA中核苷酸的碱基部分的化学修饰。在这种情况下，核苷酸类似物或修饰优选地选自可用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
在特别优选的实施方案中，可并入如本文所述的经修饰的RNA的核苷酸类似物/修饰优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸酯、2-氨基嘌呤-核苷-5’-三磷酸酯、2-氨基腺苷-5’-三磷酸酯、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-三磷酸酯、2-硫代胞苷-5’-三磷酸酯、2-硫代尿苷-5’-三磷酸酯、2’-氟胸苷-5’-三磷酸酯、2’-O-甲基肌苷-5’-三磷酸酯、4-硫代尿苷-5’-三磷酸酯、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸酯、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸酯、5-溴胞苷-5’-三磷酸酯、5-溴尿苷-5’-三磷酸酯、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、5-碘胞苷-5’-三磷酸酯、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-碘尿苷-5’-三磷酸酯、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯、5-甲基尿苷-5’-三磷酸酯、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸酯、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸酯、6-氯嘌呤核苷5’-三磷酸酯、7-脱氮腺苷-5’-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸酯、8-叠氮腺苷-5’-三磷酸酯、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸酯、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸酯、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸酯、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯、假尿苷-5’-三磷酸酯、或者嘌呤霉素-5’-三磷酸酯、黄苷-5’-三磷酸酯。用于碱基修饰的特别优选的核苷酸选自碱基修饰的核苷酸：5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯、5-溴胞苷-5’-三磷酸酯、和假尿苷-5’-三磷酸酯、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂胞苷、伪异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-伪异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-伪异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代伪异胞苷、4-硫代-1-甲基-伪异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-伪异胞苷、1-甲基-1-脱氮-伪异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-伪异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-伪异胞苷、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基腺嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基鸟苷、6-硫代-7-甲基鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、伪异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5，6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、伪异胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮-腺苷、7-脱氮-腺苷。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，编码序列中100％的尿嘧啶具有化学修饰，优选化学修饰位于尿嘧啶的第5位。
在本发明的上下文中，特别优选的是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。因此，第一方面的RNA包含选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷的至少一种经修饰的核苷酸。
在优选的实施方案中，RNA包含至少一个密码子被修饰的编码序列。
在优选的实施方案中，由至少一个密码子被修饰的编码序列所编码的氨基酸序列与由相应野生型编码序列所编码的氨基酸序列相比优选地不被修饰。
术语“密码子被修饰的编码序列”指与相应野生型编码序列相比有至少一个密码子(编码一种氨基酸的核苷酸三联体)不同的编码序列。适当地，在本发明的上下文中，密码子被修饰的编码序列可以表现出增强的体内降解抗性和/或增强的体内稳定性和/或增强的体内可翻译性。密码子修饰在最广泛的意义上利用了遗传密码的简并，其中多个密码子可以编码相同的氨基酸，并可以互换使用(参见表2)，以优化/修饰编码序列，用于上述的体内应用。
在第一方面的特别优选的实施方案中，至少一种序列是密码子被修饰的编码序列，其中密码子被修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任何组合，或其任何组合。
在优选的实施方案中，可以对RNA进行修饰，其中相对于相应的野生型编码序列的C含量，至少一种编码序列的C含量可以增加，优选地最大化(在此称为“C最大化的编码序列”)。与相应野生型核酸编码序列所编码的氨基酸序列相比，由RNA的C最大化的编码序列所编码的氨基酸序列优选地不被修饰。可以采用根据WO2015/062738的修饰方法适当地进行C最大化的编码序列的生成。在这种情况下，WO2015/062738的公开内容通过引用并入本文。在整篇说明书，包括序列表的标识符<223>中，C最大化的编码序列由缩写“opt2”表示。
在实施方案中，可以对RNA进行修饰，其中相对于相应的野生型编码序列中的G/C含量，至少一个编码序列的G/C含量可以被修饰(在此称为“G/C含量修饰的编码序列”)。在这种情况下，术语“G/C优化”或“G/C含量修饰”指与相应的野生型RNA序列相比，包含的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸被修饰、优选地数量增加的RNA。这种增加的数量可以是由含有腺苷或胸腺嘧啶核苷酸的密码子被含有鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸的密码子置换造成的。有利地，G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量增加的RNA序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量增加的序列更稳定。与由相应野生型序列所编码的氨基酸序列相比，由RNA的G/C含量修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选地不被修饰。优选地，RNA序列的编码序列中的G/C含量相比于相应的野生型RNA序列的编码序列中的G/C含量增加了至少10％、20％、30％、优选地至少40％。
在优选的实施方案中，可以对RNA进行修饰，其中相对于相应的野生型编码序列中的G/C含量，至少一个编码序列的G/C含量可以被优化(在此称为“G/C含量优化的编码序列”)。在这种情况下，“优化”是指其中G/C含量优选地增加到基本上最高可能的G/C含量的编码序列。与由相应野生型编码序列所编码的氨基酸序列相比，由RNA的G/C含量优化的编码序列所编码的氨基酸序列优选地不被修饰。可以采用根据WO2002/098443的G/C含量优化法生成G/C含量优化的RNA序列。在这种情况下，WO2002/098443公开内容的全部范围包括在本发明中。在整篇说明书，包括序列表的标识符<223>中，G/C优化的的编码序列由缩写“opt1、opt5、opt6、opt11”表示。
在实施方案中，可以对RNA进行修饰，其中至少一个编码序列的密码子可以适合于人密码子使用(在此称为“人密码子使用适应性编码序列”)。编码相同氨基酸的密码子以不同频率出现在对象中，例如在人类中。因此，优选地对RNA的编码序列进行修饰，以使编码相同氨基酸的密码子的频率与该密码子根据例如如表2所示的人密码子使用情况下自然出现的频率相对应。例如，就氨基酸Ala来说，优选地将野生型编码序列调整为使密码子“GCC”的使用频率是0.40、密码子“GCT”的使用频率是0.28、密码子“GCA”的使用频率是0.22、密码子“GCG”的使用频率是0.10等(参见表2)。因此，对由RNA编码序列所编码的每个氨基酸都应用这一过程(如Ala的示例)，以获得适合于人密码子使用的序列。在整篇说明书，包括序列表的标识符<223>中，人密码子使用适应性编码序列由缩写“opt3”表示。
表2：显示每种氨基酸的频率的人密码子使用表
*：最频繁的人密码子
在实施方案中，可以对RNA进行修饰，其中在至少一个编码序列中的密码子适应指数(CAI)可以被增加或者优选地最大化(在此称为“CAI最大化的编码序列”)。因此，优选将在例如人类细胞中相对少见的野生型核酸序列中所有密码子换成在例如人类细胞中常见的相应密码子，其中常见的密码子编码与相对少见的密码子相同的氨基酸。适当地，每种编码的氨基酸都使用最频繁的密码子(参见表2，最频繁的人密码子用星号标记)。适当地，第一方面的RNA包括至少一种编码序列，其中至少一种编码序列的密码子适应指数(CAI)是至少0.5、至少0.8、至少0.9或者至少0.95。最优选地，至少一种编码序列的密码子适应指数(CAI)是1。例如，就氨基酸Ala来说，将野生型编码序列调整为使所述氨基酸总是使用最频繁的人密码子“GCC”。因此，对由RNA编码序列所编码的每个氨基酸都应用这一过程(如Ala的示例)，以获得CAI最大化的编码序列。在整篇说明书，包括序列表的标识符<223>中，CAI最大化的编码序列由缩写“opt4”表示。
在优选的实施方案中，第一方面的RNA包含含有密码子被修饰的核酸序列的至少一种编码序列，所述密码子被修饰的核酸序列与选自SEQ ID NO：41-328、2161-2480、3293-6134、8754-8855、10092-10139的密码子被修饰的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。关于这些合适的核酸序列编码中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的RNA包含含有密码子被修饰的核酸序列的至少一种编码序列，所述密码子被修饰的核酸序列与选自SEQ ID NO：41-328、8754-8855的密码子被修饰的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。关于这些合适的核酸序列编码中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含含有密码子被修饰的核酸序列的至少一种编码序列，所述密码子被修饰的核酸序列与根据SEQ ID NO：41-112、2161-2240、3293-3698、8754-8783、10092-10103的G/C优化的核酸序列的任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(“opt1”)。关于这些合适的核酸序列编码中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含含有密码子被修饰的核酸序列的至少一种编码序列，所述密码子被修饰的核酸序列与根据SEQ ID NO：41-112、8754-8783的G/C优化的核酸序列的任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(“opt1”)。关于这些合适的核酸序列编码中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
在特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含含有密码子被修饰的核酸序列的至少一种编码序列，所述密码子被修饰的核酸序列与根据SEQ ID NO：44、80、8755的G/C优化的核酸序列的任一个或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(“opt1”)。关于这些合适的核酸序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
如上所述，第一方面的编码RNA包括至少一种编码序列，所述编码序列含有编码疟原虫的CSP的核酸序列。优选地，所述CSP是如本文定义的更全长的CSP，更优选地是如本文定义的全长CSP。所述CSP优选地衍生自恶性疟原虫(Pf)。或者，该CSP可衍生自诺氏疟原虫(Pk)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫curtisi亚种(Poc)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Pow)、卵形疟原虫(Po)、间日疟原虫(Pv)、伯氏疟原虫(Pb)。
表A中公开了疟原虫的CSP蛋白和编码序列。其中，第1至7行对应于衍生自所述疟原虫种的CSP。对应的物种在A列中提供(缩写，例如参见清单1)。表A的B列提供了相应的氨基酸序列的SEQ ID NO，表A的C列提供了相应的野生型RNA编码序列的SEQ ID NO，表A的D列至J列提供了每个片段的密码子被修饰的编码序列的SEQ ID NO(按以下顺序：“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”)。关于这些合适序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
表A：CSP抗原及相应的编码序列：
表3中公开了CSP的片段，例如如上文所述的片段(E1-E27)。其中，每一行(第1行至第46行)对应于衍生自Pf(3D7)的CSP的特定片段，例如，第1行代表全长CSP。在本说明书中描述的所有氨基酸位置都对应于Pf(3D7)的CSP(1行，B列，SEQ ID NO：1)的氨基酸位置。表3的A列提供了片段的描述，并指出了相对于全长蛋白的氨基酸位置。例如，第4行提供的序列“CSP(19-397)_CSP-delSP”指从第19位氨基酸至397位氨基酸的CSP片段，其特征在于构建体缺失信号肽(“delSP”)。表3的B列提供了相应的氨基酸序列的SEQ ID NO，表3的C列提供了相应的野生型RNA编码序列的SEQ ID NO，表3的D列提供了每个片段的密码子被修饰的编码序列的SEQ ID NO(按以下顺序：“opt1”、“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”)。关于这些合适序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
表3：CSP片段及相应的编码序列：
表4中公开了适用于本发明的情况的异源元件，例如如上文所述的元件(分泌型信号肽、辅助表位等)。其中，每一行(第1行至第16行)对应于特定的异源元件。表4的A列提供了这些片段的描述。例如，第3行提供的序列“signal peptide_HsALB”指衍生自人白蛋白的异源信号肽。表4的B列提供了相应的氨基酸序列的SEQ ID NO，表4的C列提供了相应的野生型RNA编码序列的SEQ ID NO，表4的D列提供了每个片段的密码子被修饰的编码序列的SEQID NO(“opt1”、“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”)。关于这些合适序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
表4：异源元件和相应的编码序列：
在各种实施方案中，本发明的编码RNA包含含有核酸序列的至少一种编码序列，所述核酸序列包含，优选地在从5’至3’的方向上包含至少一种以下的核酸序列：
a)任选地，至少一种核酸序列，其编码选自SEQ ID NO：6209-6240，10140或其片段或变体的异源分泌型信号序列，和，任选地
b)编码衍生自CSP的抗原蛋白的至少一种核酸序列，优选地选自SEQ ID NO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139或其片段或变体的任一核酸序列，和
c)任选地，至少一种的核酸序列，其编码选自SEQ ID NO：6275、6276、6277、6278、6281、6284、6287、6290、6293、6296、6299、6279、6282、6285、6288、6291、6294、6297、6300、6280、6283、6286、6289、6292、6295、6298、6301或其片段或变体的异源辅助表位。
d)任选地，至少一种核酸序列，其编码选自SEQ ID NO：6277、6280、6283、6286、6289、6292、6295、6298、6301、10154、10155、10156、10157、10158、10159、10160、10161、10163、10164、10165、10166、10167、10168、10169、10170、10171或其片段或变体的异源抗原聚类结构域。
e)任选地，至少一种核酸序列，其编码选自SEQ ID NO：6303-6311或其片段或变体的异源跨膜结构域。
此外，a)、b)、c)、d)和e)可以用接头元件连接，优选地通过编码选自SEQ ID NO：6245-6271、10142-10146、10148-10152或其片段或变体的接头元件的至少一种核酸序列用接头元件连接。
表5中提供了第一方面的编码RNA的特别优选的和合适的编码序列。其中，每行(第1行至第41行)对应于本发明的特定CSP构建体。表5的A列提供了这些CSP构建体的描述(参见表1)。表5的B列提供了相应的氨基酸序列的SEQ ID NO(参见表1)。表5的C列提供了相应的opt1 RNA编码序列的SEQ ID NO，表5的D列提供了相应的“opt2”RNA编码序列的SEQ IDNO，表5的E列提供了相应的“opt3”RNA编码序列的SEQ ID NO，表5的F列提供了相应的“opt4”RNA编码序列的SEQ ID NO，表5的G列提供了相应的“opt5”RNA编码序列的SEQ IDNO，表5的G列提供了相应的“opt5”RNA编码序列的SEQ ID NO，表5的H列提供了相应的“opt6”RNA编码序列的SEQ ID NO，表5的I列提供了相应的“opt11”RNA编码序列的SEQ IDNO。关于这些合适的编码序列中每一种的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从标识符<223>下提供的详细信息中获得。
表5：本发明优选的编码序列
RNA元件、mRNA元件：
在实施方案中，第一方面的编码RNA可以是单顺反子的、双顺反子的或多顺反子的。
本文中使用的术语“单顺反子的”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指只包含一种编码序列的RNA。本文中使用的术语“双顺反子的”或“多顺反子的”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指具有两个(双顺反子的)或多于两个(多顺反子的)编码序列的RNA。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA是单顺反子的。
在实施方案中，编码RNA是单顺反子的，且所述RNA的编码序列编码至少两种不同的衍生自疟原虫的抗原肽或蛋白(例如疟原虫属CSP)。因此，所述编码序列可以编码至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种和多于八种衍生自疟原虫的抗原肽或蛋白(例如疟原虫属CSP)，其可以连接或不连接氨基酸接头序列，其中所述接头序列可以包括刚性接头、柔性接头、可裂解接头、或其组合。这种构建体在本文中称为“多抗原构建体”。
在实施方案中，编码RNA可以是双顺反子的或多顺反子的并且包含至少两种编码序列，其中所述至少两种编码序列编码衍生自疟原虫的两种或多于两种不同的抗原肽或蛋白(例如疟原虫属CSP)。因此，在双顺反子的或多顺反子的RNA中的编码序列适当地编码如本文定义的不同抗原蛋白或肽或者其免疫原性片段或免疫原性变体。优选地，所述双顺反子的或多顺反子的构建体中的编码序列可以被至少一种IRES(内部核糖体进入位点)序列分开。因此，术语“编码两种或多于两种抗原肽或蛋白”可以表示但不限于，双顺反子的或多顺反子的RNA编码例如衍生自不同疟原虫的至少两种、三种、四种、五种、六种或多于六种(优选不同的)抗原肽或蛋白。可选地，该双顺反子的或多顺反子的RNA可以编码例如衍生自相同疟原虫的至少两种、三种、四种、五种、六种或多于六种(优选不同的)抗原肽或蛋白。在这种情况下，合适的IRES序列可以选自根据专利申请WO2017/081082的SEQ ID NO：1566-1662的氨基酸序列，或者这些序列的片段或变体。在这种情况下，WO2017/081082的与IRES序列相关的公开内容通过引用并入本文。
应当理解，在本发明的上下文中，可以通过单顺反子的、双顺反子的和多顺反子的RNA构建体和/或多抗原构建体的任意组合，产生编码序列的特定组合，以获得编码如本文定义的多种抗原肽或蛋白的组合物。
优选地，第一方面的编码RNA通常包括约50个至约20000个核苷酸，或约500个至约10000个核苷酸，或约1000个至约10000个核苷酸，或优选地约1000个至约5000个核苷酸，或甚至更优选地约1000个至约2500个核苷酸。
根据优选的实施方案，第一方面的编码RNA可以是mRNA、自我复制RNA、环状RNA或RNA复制子。
在实施方案中，第一方面的编码RNA是环状RNA。如本文所使用的，“环状RNA”或“circRNA”应当理解为编码至少一种本文所定义的抗原肽或蛋白的环状多核苷酸构建体。因此，在优选的实施方案中，所述环状RNA包含编码衍生自疟原虫的至少一种抗原蛋白(例如疟原虫属CSP)的至少一种编码序列，或其免疫原性片段或免疫原性变体。环状RNA的生产可以使用本领域中的各种方法进行。因此，US6210931、US5773244、WO1992/001813、WO2015/034925和WO2016/011222中提供的生产环状RNA的方法通过引用并入本文。
在实施方案中，编码RNA是RNA复制子。术语“RNA复制子”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指优化的自我复制RNA。这种构建体可以包括衍生自例如甲病毒(例如SFV、SIN、VEE或RRV)的复制酶元件，以及用目标核酸置换病毒结构蛋白。或者，可在独立的编码RNA构建体上提供复制酶。复制酶的下游可以是控制RNA复制子的复制的亚基因组启动子。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA是mRNA。
术语“RNA”或“mRNA”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指核糖核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常为腺苷-一磷酸、尿苷-一磷酸、鸟苷-一磷酸和胞苷-一磷酸单体，其沿所谓的主链彼此连接。主链由在第一相邻单体的糖(即核糖)和第二相邻单体的磷酸酯部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定次序称为RNA序列。mRNA(信使RNA)通常提供可被翻译为特定肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明的上下文中，编码RNA、优选地第一方面的mRNA，可以提供编码衍生自疟原虫的抗原的至少一种编码序列，编码序列在施用后(例如，在施用于对象例如人类对象后)被翻译为功能性抗原。因此，编码RNA、优选地mRNA，适用于疫苗、优选疟疾疫苗。
适当地，RNA可以通过添加5’-帽结构来修饰，其优选地稳定该RNA和/或增强编码的抗原的表达。
RNA可以通过添加5’-帽结构来适当地修饰，其优选地稳定本文所述的RNA和/或增强编码的抗原的表达和/或减少先天性免疫系统的刺激(向对象施用后)。在RNA为线性编码RNA例如mRNA或线性编码RNA复制子的实施方案中，5’-帽结构特别重要。
因此，在优选的实施方案中，RNA特别是第一方面的mRNA包含5’-帽结构，优选地包含m7G(m7G(5’)ppp(5’)G)、cap0、cap1、cap2、经修饰的cap0或经修饰的cap1结构。
在特别优选的实施方案中，第一方面的mRNA包含cap1。
本文使用的术语“5’-帽结构”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指位于RNA分子例如mRNA分子的5’端的5’修饰的核苷酸，特别是鸟嘌呤核苷酸。优选地，5’-帽结构通过5’-5’-三磷酸连接与RNA连接。
在本发明的上下文中合适的5’-帽结构是cap0(第一个核碱基甲基化，例如m7GpppN)、cap1(m7GpppN相邻的核苷酸的核糖额外甲基化)、cap2(m7GpppN下游第二个核苷酸的核糖额外甲基化)、cap3(m7GpppN下游第三个核苷酸的核糖额外甲基化)、cap4(m7GpppN下游第四个核苷酸的核糖额外甲基化)、ARCA(抗反向帽类似物)、经修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮-鸟苷。
5’-帽(cap0或cap1)结构可以是在化学RNA合成或RNA体外转录(共转录加帽)中使用帽类似物形成的。
本文中使用的术语“帽类似物”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指具有加帽功能的非聚合的二核苷酸或三核苷酸，因为当合并在核酸分子的5’端时，它可以促进翻译或定位，和/或防止核酸分子特别是RNA分子的降解。非聚合意味着帽类似物仅合并在5’端，因为它不具有5’三磷酸酯，因此不能通过模板依赖性聚合酶特别是通过模板依赖性RNA聚合酶在3’方向上延伸。帽类似物的实例包括但不限于选自m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽类似物(例如GpppG)；二甲基化帽类似物(例如m2，7GpppG)、三甲基化帽类似物(例如m2，2，7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(例如m7Gpppm7G)、或抗反向帽类似物(例如ARCA；m7，2’OmeGpppG、m7，2’dGpppG、m7，3’OmeGpppG、m7，3’dGpppG及其四磷酸盐/酯衍生物)的化学结构。其他的帽类似物已经在先前描述过(WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)。WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/053297、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797在其上下文中描述了其他合适的帽类似物，其中关于帽类似物的公开内容通过引用并入本文。
在实施方案中，经修饰的cap1结构是使用公开于WO2017/053297、WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797的三核苷酸帽类似物形成的。特别地，可衍生自WO2017/053297的权利要求1至5中所公开的结构的任何帽结构都可适用于共转录形成经修饰的cap1结构。此外，可衍生自WO2018/075827的权利要求1或权利要求21所定义的结构的任何帽结构都可适用于共转录形成经修饰的cap1结构。
在优选的实施方案中，可适当地使用如本文定义的三核苷酸帽类似物在如本文定义的RNA体外转录反应中共转录添加5’-帽结构。
在特别优选的实施方案中，编码RNA，特别是第一方面的mRNA包含cap1结构。如实施例部分所述，cap1结构的存在特别重要，因为它可以增加针对疟原虫CSP的特异性免疫应答的诱导(参见实施例11和12)。
优选的帽类似物是二核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)G(m7G)或3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G，以共转录形成cap0结构。更优选的帽类似物是三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG，以共转录形成cap1结构。
在其他实施方案中，5’-帽结构的形成是通过使用加帽酶(例如牛痘病毒加帽酶和/或帽依赖性2’-O甲基转移酶)进行酶促加帽以产生cap0或cap1或cap2结构。可以利用WO2016/193226公开的方法和手段，使用固定化加帽酶和/或帽依赖性2’-O甲基转移酶添加5’-帽结构(cap0或cap1)。
在优选的实施方案中，如使用加帽分析法所确定的，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％的编码RNA(种类)包含cap1结构。在优选的实施方案中，如使用加帽分析法所确定的，少于约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％的编码RNA(种类)不包含cap1结构。在优选的实施方案中，如使用加帽分析法所确定的，少于约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％的编码RNA(种类)包含cap0结构。在优选的实施方案中，如使用加帽分析法所确定的，少于约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％的编码RNA(种类)包含cap1中间结构。
术语“编码RNA种类”并不限于指“一种单一的分子”，而应理解为包含由本质上相同的RNA分子的集合。因此，它可以指多个本质上相同的编码RNA分子。
为了确定加帽程度或cap1中间体的存在，可以使用如公布的PCT申请WO2015/101416中所述，特别是如公布的PCT申请WO2015/101416的权利要求27至46中所述的加帽分析法。PCT/EP2018/08667或者公布的PCT申请WO2014/152673和WO2014/152659中描述了其他可用于确定编码RNA的加帽程度的加帽分析法。
在优选的实施方案中，编码RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)帽结构。在这种实施方案中，编码RNA包含5’端m7G帽，以及m7GpppN相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化腺苷。优选地，如使用加帽分析法所确定的，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％的编码RNA(种类)包含这种cap1结构。
在其他优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)帽结构。在这种实施方案中，编码RNA包含5’端m7G帽，以及相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化鸟苷。优选地，如使用加帽分析法所确定的，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％的编码RNA(种类)包含这种cap1结构。
在特别优选的实施方案中，第一方面的RNA包含cap1结构，其中所述cap1结构可以是酶促形成的或共转录形成的(例如使用m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)，或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)类似物)。
在优选的实施方案中，第一方面的RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)帽结构。在这种实施方案中，编码RNA包含5’端m7G帽，以及m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化腺苷。
在其他优选的实施方案中，第一方面的RNA包含m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)帽结构。在这种实施方案中，编码RNA包含5’端m7G帽，以及相邻核苷酸的核糖的额外甲基化，在这种情况下，是2’O甲基化鸟苷。
因此，无论何时在本发明的上下文中提及合适的RNA或mRNA序列，所述RNA或mRNA序列的第一个核苷酸，即m7G(5’)ppp结构下游的核苷酸，可以是2’O甲基化鸟苷或2’O甲基化腺苷。
在实施方案中，与相应野生型核酸的核糖体结合位点周围的A/U含量相比，编码RNA的核糖体结合位点周围的A/U含量可以增加。这种修饰(增加核糖体结合位点周围的A/U含量)提高了核糖体与核酸、优选RNA的结合效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合，进而具有有效翻译RNA的效果。
因此，在优选的实施方案中，编码RNA包含也称为“Kozak序列”的核糖体结合位点，其与序列SEQ ID NO：6175、6176中的任一个或者其片段或变体相同或者至少80％、85％、90％、95％相同。
在优选的实施方案中，本发明的RNA包含至少一种poly(N)序列，例如至少一种多聚腺苷酸序列、至少一种多聚尿苷酸序列、至少一种多聚胞苷酸序列、或其组合。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA包含至少一种多聚腺苷酸序列。
本文中使用的术语“多聚腺苷酸序列”、“多聚腺苷酸尾”或“3’-多聚腺苷酸尾”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指通常位于RNA的3’端、最多为约1000个腺苷核苷酸的腺苷核苷酸的序列。优选地，所述多聚腺苷酸序列基本上是均聚的，例如，例如100个腺苷核苷酸的多聚腺苷酸序列的长度基本上为100个核苷酸。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列可被不同于腺苷核苷酸的至少一个核苷酸中断，例如，例如100个腺苷核苷酸的多聚腺苷酸序列的长度可以超过100个核苷酸(包括100个腺苷核苷酸和另外所述的至少一个不同于腺苷核苷酸的核苷酸)。
适合位于如本文所定义的3’-UTR下游的多聚腺苷酸序列可包含约10个至约500个腺苷核苷酸、约10个至约200个腺苷核苷酸、约40个至约200个腺苷核苷酸或约40个至约150个腺苷核苷酸。适当地，多聚腺苷酸序列的长度可以是至少约或甚至超过约10个、50个、64个、75个、100个、200个、300个、400个、或500个腺苷核苷酸。适当地，第一方面的RNA的多聚腺苷酸序列可以是足够长的，以结合至少2个、3个、4个、5个或者多于5个PolyA结合蛋白。在优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约50个至约250个腺苷。在特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约64个腺苷核苷酸。在其他特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约75个腺苷核苷酸。
在优选的实施方案中，编码RNA包含至少一种多聚腺苷酸序列，所述多聚腺苷酸序列包含约30个至约200个腺苷核苷酸。在优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约64个腺苷核苷酸(A64)。在特别优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约100个腺苷核苷酸(A100)。在优选的实施方案中，多聚腺苷酸序列包含约150个腺苷核苷酸。
如本文定义的多聚腺苷酸序列适合位于编码RNA的3’端。因此，优选地编码RNA的3’端核苷酸(即多核苷酸链的最后一个3’端核苷酸)是具有至少一种多聚腺苷酸序列的3’端A核苷酸。术语“位于3’端”应当理解为恰好位于3’端——换言之，编码RNA的3’端由末端为A核苷酸的多聚腺苷酸序列组成。具有由多聚腺苷酸序列组成的3’端的序列的实例为例如SEQ ID NO：8013-8741、9774-10079。具有(恰好)位于3’端的多聚腺苷酸序列的序列的其他实例还参见表9(具有hSL-A100的“3’端”列)或表6B的H列。在编码疟疾抗原蛋白(例如CSP)的编码RNA的3’端恰好存在多聚腺苷酸序列是有利的，因为包含具有hSL-A100的3’端的所有mRNA疫苗都诱导非常强的体液和细胞免疫应答(参见实施例13)。
优选地，RNA的多聚腺苷酸序列是在RNA体外转录过程中由DNA模板获得的。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列是在体外通过一般化学合成方法获得的，而无需由DNA模板转录获得。在其他实施方案中，多聚腺苷酸序列是通过使用可商购获得的多聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案(在RNA体外转录后)通过RNA的酶促多聚腺苷酸化形成的，或者，是例如使用WO2016/174271中描述的方法和装置通过使用固定化多聚腺苷酸聚合酶形成的。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自模板DNA的多聚腺苷酸序列，并且可以包含由酶促多聚腺苷酸化产生的至少一种其他多聚腺苷酸序列，例如如WO2016/091391中所述。
在使用RNA的酶促多聚腺苷酸化的实施方案中，应当理解，例如如序列表中提供的RNA或mRNA可以额外包含约30个至约500个腺苷核苷酸。
在优选的实施方案中，编码RNA可以包含至少一种多聚胞苷酸序列。
本文使用的术语“多聚胞苷酸序列”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指通常位于RNA的3’端、最多为约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸的序列。
在优选的实施方案中，适合位于如本文所定义的3’-UTR下游的3’端的多聚胞苷酸序列，包含约10个至约200个胞嘧啶核苷酸、约10个至约100个胞嘧啶核苷酸、约20个至约70个胞嘧啶核苷酸、约20个至约60个胞嘧啶核苷酸或约10个至约40个胞嘧啶核苷酸。在特别优选的实施方案中，多聚胞苷酸序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。
优选地，本发明的RNA序列中的多聚胞苷酸序列是通过RNA体外转录衍生自DNA模板的。在其他实施方案中，多聚胞苷酸序列是在体外通过一般化学合成方法或酶促获得的，而无需由DNA模板转录获得。
在其他实施方案中，本发明的RNA不包含如本文定义的多聚胞苷酸序列。
在其他实施方案中，本发明的编码RNA包含如本文定义的多聚腺苷酸序列，优选(恰好)位于3’端的A100，并且不包含多聚胞苷酸序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的编码RNA包含如本文定义的cap1结构和至少一种如本文定义的多聚腺苷酸序列。优选地，所述cap1结构是通过如本文定义的共转录加帽获得的，并且所述多聚腺苷酸序列优选地(恰好)位于3’端。
在优选的实施方案中，第一方面的编码RNA包含至少一种组蛋白茎环(序列)。
本文使用的术语“组蛋白茎环”(在例如序列表中，缩写为“hSL”)是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指主要存在于组蛋白mRNA中的核酸序列。示例性的组蛋白茎环序列描述于Lopez等人(Davila Lopez等人，(2008)，RNA，14(1))。
组蛋白茎环序列/结构可以适当地选自公开于WO2012/019780的组蛋白茎环序列，其与组蛋白茎环序列/组蛋白茎环结构相关的公开内容通过引用并入本文。本发明中可以使用的组蛋白茎环序列可以优选地衍生自WO2012/019780的式(I)或式(II)。根据更优选的实施方案，本文定义的RNA可以包含衍生自专利申请WO2012/019780的特定式(Ia)或(IIa)中的至少一个的至少一种组蛋白茎环序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的RNA包含至少一种组蛋白茎环序列，其中所述组蛋白茎环序列包含与SEQ ID NO：6173或6174或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在其他实施方案中，第一方面的RNA不包含如本文定义的组蛋白茎环。
在实施方案中，本发明的RNA包含3’端序列元件。所述3’端序列元件包括多聚腺苷酸序列和组蛋白茎环序列，其中所述序列元件位于本发明的RNA的3’端。
因此，本发明的RNA可以包含3’端序列元件，所述3’端序列元件包含或组成为与SEQ ID NO：6179-6200、10173-10196或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在各种实施方案中，RNA可以包含根据SEQ ID NO：6177、6178或者其片段或变体的5’端序列元件。这种5’端序列元件包含例如T7 RNA聚合酶的结合位点。此外，所述5’端起始序列的第一个核苷酸优选地可以包含2’O甲基化，例如2’O甲基化鸟苷或2’O甲基化腺苷。
在实施方案中，RNA可以包含代表催化性核酸分子的切割位点的序列元件，其中催化性核酸分子可以是核酶或DNA酶。所述元件可例如允许如WO2015/101416所述分析RNA的加帽效率/质量，或允许如WO2017/001058所述分析RNA的poly(N)序列长度/质量。催化性核酸分子的切割位点可以位于临近RNA的5’端的地方(即，与5’端帽结构距离约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约1个至约30个、约1个至约20个、约5个至约15个核苷酸)。或者或另外，如上所述的催化性核酸分子的切割位点还可以位于临近RNA的3’端的地方(即，与3’端距离约50个至约300个、约50个至约200个、约50个至约150个核苷酸)。所述元件可以例如允许如WO2017/001058所述分析RNA的poly(N)序列长度/质量。
UTR：
本发明的RNA可以包含蛋白质编码区(“编码序列”或“cds”)和5’-UTR和/或3’-UTR。值得注意的是，UTR可以包含决定RNA转化、稳定性和定位的调控序列元件。此外，UTR可以包含增强翻译的序列元件。在RNA的医药应用中，RNA翻译为至少一种肽或蛋白对治疗效果至关重要。3’-UTR和/或5’-UTR的特定组合可以增强可操作地连接的编码序列的表达，所述编码序列编码本发明的肽或蛋白。包含所述UTR组合的RNA分子有利地在给对象施用后、优选在肌内施用后能够快速和瞬时表达抗原肽或蛋白。因此，包含如本文所述的3’-UTR和/或5’-UTR的特定组合的编码RNA特别适合作为疫苗施用，特别是适合施用到对象的肌肉、真皮或表皮。
适当地，第一方面的RNA可以包含至少一种异源5’-UTR和/或至少一种异源3’-UTR。所述异源5’-UTR或3’-UTR可以衍生自天然存在的基因或可以是工程合成的。在优选的实施方案中，第一方面的RNA包含至少一种可操作地连接到至少一种(异源)3’-UTR和/或至少一种(异源)5’-UTR的编码序列。
在优选的实施方案中，至少一种RNA包含至少一种异源3’-UTR。
术语“3’-非翻译区”、“3’-UTR”或“3’-UTR元件”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指位于编码序列的3’(即，下游)且不翻译成蛋白的一部分核酸分子。3’-UTR可以是RNA例如mRNA的一部分，其位于cds和末端多聚腺苷酸序列之间。3’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这种调节元件可以是例如核糖体结合位点、微RNA结合位点等。
优选地，RNA包含3’-UTR，其可以衍生自与半衰期增强的RNA(即，提供稳定的RNA)相关的基因。
在一些实施方案中，3’-UTR包含一个或多于一个多聚腺苷化信号、影响RNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点、或一个或多于一个微RNA或微RNA结合位点。
微RNA(或miRNA)是19个至25个核苷酸长的非编码RNA，其与核酸分子的3’-UTR结合，并且通过降低核酸分子的稳定性或抑制翻译来下调基因表达。例如，已知微RNA调节RNA，从而调节蛋白质表达，例如在肝脏(miR-122)、心脏(miR-ld、miR-149)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)中。本发明的RNA可以包含一种或多于一种微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子。这种序列可以例如对应于任何已知的微RNA，例如如美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005中所述，其全部内容通过引用并入本文。
因此，可以将如上文定义的微RNA或微RNA结合位点从3’-UTR中移除或者引入3’-UTR中，以使RNA表达适合所需的细胞类型或组织。
在第一方面的优选的实施方案中，RNA包含至少一种异源3’-UTR，其中至少一种异源3’-UTR包含衍生自基因的3’-UTR的核酸序列，所述基因选自PSMB3、ALB7、α珠蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9或者这些基因的同源物、片段或变体。
在本发明的上下文中，优选为衍生自α珠蛋白(称为“muag”)、ALB7基因或PSMB3基因或者这些基因的任一个的同源物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
在优选的实施方案中，编码RNA的3’-UTR包含衍生自PSMB3基因的3’-UTR的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自ALB7基因的3’-UTR，其中所述衍生自ALB7基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6169或6170或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自α珠蛋白基因的3’-UTR，其中所述衍生自α珠蛋白基因(“muag”)的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6171或6172或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在优选的实施方案中，RNA可以包含衍生自PSMB3基因的3’-UTR，其中所述衍生自PSMB3基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6157或6158或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自CASP1基因的3’-UTR，其中所述衍生自CASP1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6159或6160或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自COX6B1基因的3’-UTR，其中所述衍生自COX6B1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6161或6162或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自GNAS基因的3’-UTR，其中所述衍生自GNAS基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6163或6164或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自NDUFA1基因的3’-UTR，其中所述衍生自NDUFA1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6165或6166或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自RPS9基因的3’-UTR，其中所述衍生自RPS9基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6167或6168或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
因此，第一方面的编码RNA可以适当地包含至少一种3’-UTR，所述3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6157至6172或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2016/107877中所述的3’-UTR，WO2016/107877中与3’-UTR相关的公开内容通过引用并入本文。合适的3’-UTR为WO2016/107877的SEQ ID NO：1至24和SEQ ID NO：49至318，或者这些序列的片段或变体。因此，RNA的3’-UTR可以包含或组成为与根据WO2016/107877的SEQ ID NO：1至24和SEQ ID NO：49至318的核酸序列相应的RNA序列。在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2017/036580中所述的3’-UTR，WO2017/036580中与3’-UTR相关的公开内容通过引用并入本文。合适的3’-UTR为WO2017/036580的SEQ ID NO：152至204，或者这些序列的片段或变体。因此，RNA的3’-UTR可以包含或组成为根据WO2017/036580的SEQ ID NO：152至204的核酸序列相应的RNA序列。在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2016/022914中所述的3’-UTR，WO2016/022914中与3’-UTR序列相关的公开内容通过引用并入本文。特别优选的3’-UTR是根据WO2016/022914的SEQ ID NO：20至36的核酸序列或者这些序列的片段或变体。在本上下文中，特别优选地，RNA的3’-UTR包含或组成为根据WO2016/022914的SEQ ID NO：20至36的核酸序列相应的RNA序列。
在优选的实施方案中，至少一种RNA包含至少一种异源5’-UTR。
术语“5’-非翻译区”或“5’-UTR”或“5’-UTR元件”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指位于编码序列的5’(即，上游)且不翻译成蛋白质的一部分核酸分子。5’-UTR可以是位于编码序列的5’的一部分RNA。通常，5’-UTR以转录起始位点开始，到编码序列的起始密码子之前结束。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这种调节元件可以是例如核糖体结合位点、微RNA结合位点等。5’-UTR可进行转录后修饰，例如通过酶促或转录后添加(如上文所定义的)5’-帽结构。
优选地，RNA包含5’-UTR，其可衍生自与半衰期增强的RNA(即，提供稳定的RNA)相关的基因。
在一些实施方案中，5’-UTR包含一个或多于一个影响RNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点、或一个或多于一个微RNA或微RNA结合位点。
因此，可以将如本文定义的微RNA或微RNA结合位点从5’-UTR中移除或者引入5’-UTR中，以使RNA表达适合所需的细胞类型或组织。
在第一方面的优选的实施方案中，RNA包含至少一种异源5’-UTR，其中至少一种异源5’-UTR包含衍生自基因的5’-UTR的核酸序列，所述基因选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2或者这些基因的任一个的同源物、片段或变体。
在本发明的上下文中，特别优选为衍生自HSD17B4基因、SLC7A3基因或RPL32基因或者这些基因的任一个的同源物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列。
在优选的实施方案中，编码RNA的5’-UTR包含衍生自SLC7A3基因的5’-UTR的核酸序列。
在特别优选的实施方案中，编码RNA的5’-UTR包含衍生自HSD17B4基因的5’-UTR的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自RPL32基因的5’-UTR，其中所述衍生自RPL32基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6155或6156或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在优选的实施方案中，RNA可以包含衍生自HSD17B4基因的5’-UTR，其中所述衍生自HSD17B4基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6135或6136或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自ASAH1基因的5’-UTR，其中所述衍生自ASAH1基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6137或6138或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自ATP5A1基因的5’-UTR，其中所述衍生自ATP5A1基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6139或6140或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自MP68基因的5’-UTR，其中所述衍生自MP68基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6141或6142或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自NDUFA4基因的5’-UTR，其中所述衍生自NDUFA4基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6143或6144或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自NOSIP基因的5’-UTR，其中所述衍生自NOSIP基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6145或6146或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自RPL31基因的5’-UTR，其中所述衍生自RPL31基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6147或6148或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在优选的实施方案中，RNA可以包含衍生自SLC7A3基因的5’-UTR，其中所述衍生自SLC7A3基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6149或6150或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自TUBB4B基因的5’-UTR，其中所述衍生自TUBB4B基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6151或6152或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在实施方案中，RNA可以包含衍生自UBQLN2基因的5’-UTR，其中所述衍生自UBQLN2基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6153或6154或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
因此，第一方面的RNA可以适当地包含至少一种5’-UTR，所述5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6135至6156或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2013/143700中所述的5’-UTR，WO2013/143700中与5’-UTR相关的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是衍生自WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422或者这些序列的片段或变体的核酸序列。在本上下文中，优选地，RNA的5’-UTR包含或组成为根据WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQID NO：1422的核酸序列相应的RNA序列。在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2016/107877中所述的5’-UTR，WO2016/107877中与5’-UTR序列相关的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据W02016/107877的SEQ ID NO：25至30和SEQ ID NO：319至382的核酸序列，或者这些序列的片段或变体。在本上下文中，特别优选地，RNA的5’-UTR包含或组成为根据WO2016/107877的SEQ ID NO：25至30和SEQ ID NO：319至382的核酸序列相应的RNA序列。在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2017/036580中所述的5’-UTR，WO2017/036580中与5’-UTR序列相关的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据W02017/036580的SEQ ID NO：1至151或者这些序列的片段或变体的核酸序列。在本上下文中，特别优选地，RNA的5’-UTR包含或组成为根据WO2017/036580的SEQ ID NO：1至151的核酸序列相应的RNA序列。在其他实施方案中，第一方面的RNA包含如WO2016/022914中所述的5’-UTR，WO2016/022914中与5’-UTR序列相关的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5’-UTR是根据WO2016/022914的SEQ ID NO：3至19或者这些序列的片段或变体的核酸序列。在本上下文中，特别优选地，RNA的5’-UTR包含或组成为根据WO2016/022914的SEQ IDNO：3至19的核酸序列相应的RNA序列。
适当地，在优选的实施方案中，第一方面的RNA包含编码衍生自疟原虫的至少一种肽或蛋白的至少一种编码序列，该编码序列可操作地连接到选自以下5’UTR/3’UTR组合(也称为“mRNA设计”)的3’-UTR和/或5’-UTR：
a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(NDUFA4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rp131/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)、i-2(RPL32/ALB7)或i-3(α-珠蛋白基因)。
在第一方面的特别优选的实施方案中，RNA包含本文描述的编码衍生自疟原虫的至少一种肽或蛋白的至少一种编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到选自HSD17B4的5’-UTR和选自PSMB3的3’-UTR(mRNA设计a-1(HSD17B4/PSMB3))。
在第一方面的优选的实施方案中，RNA包含本文描述的编码衍生自疟原虫的至少一种肽或蛋白的至少一种编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到选自SLC7A3的5’-UTR和选自PSMB3的3’-UTR(mRNA设计a-3(SLC7A3/PSMB3))。
因此，第一方面的RNA包含如本文定义的编码至少一种肽或蛋白的至少一种编码序列，其中所述RNA的施用导致编码的肽或蛋白在对象中的表达和/或激活，其中所述如本文定义的编码序列可操作地连接到5’-UTR和/或3’-UTR上，其中适当地
-所述衍生自HSD17B4基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6135或6136或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自ASAH1基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6137或6138或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自ATP5A1基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6139或6140或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自MP68基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6141或6142或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自NDUFA4基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6143或6144或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自NOSIP基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6145或6146或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自RPL31基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6147或6148或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自RPL32基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6155或6156或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自SLC7A3基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6149或6150或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自TUBB4B基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6151或6152或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自UBQLN2基因的5’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6153或6154或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自PSMB3基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6157或6158或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自CASP1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6159或6160或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自COX6B1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6161或6162或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自GNAS基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6163或6164或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自NDUFA1基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6165或6166或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
-所述衍生自RPS9基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6167或6168或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自ALB7基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6169或6170或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列；
-所述衍生自α-珠蛋白基因的3’-UTR包含或组成为与SEQ ID NO：6171或6172或者其片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
适合用于疟疾疫苗的mRNA：
在第一方面的各种实施方案中，编码RNA优选mRNA包含以下元件，优选地在5’至3’的方向上包含以下元件：
A)5’-帽结构，优选如本文所述的5’-帽结构；
B)5’端起始元件，优选如本文所述的5’端起始元件；
C)任选地，催化性核酸分子的切割位点，优选如本文所述的催化性核酸分子的切割位点；
D)任选地，5’-UTR，优选如本文所述的5’-UTR；
F)核糖体结合位点，优选如本文所述的核糖体结合位点；
E)至少一种编码序列，优选如本文所述的编码序列；
F)3’-UTR，优选如本文所述的3’-UTR；
G)任选地，多聚腺苷酸序列，优选如本文所述的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，多聚胞苷酸序列，优选如本文所述的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，组蛋白茎环，优选如本文所述的组蛋白茎环；
J)任选地，3’端序列元件，优选如本文所述的3’端序列元件。
在第一方面的优选实施方案中，编码RNA，优选mRNA包含以下元件，优选地在5’至3’的方向上包含以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)任选地，催化性核酸分子的切割位点，优选如本文所述的催化性核酸分子的切割位点；
D)任选地，选自SEQ ID NO：6135-6156或其片段或变体的5’-UTR。
F)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点。
E)选自SEQ ID NO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139或其片段或变体的至少一种编码序列；
F)选自SEQ ID NO：6157至6172的3’-UTR；
G)任选地，包含约50个至约500个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环；
J)任选地，选自SEQ ID NO：6179-6200、10173-10196的3’端序列元件。
在第一方面更优选的实施方案中，编码RNA优选mRNA包含以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)根据如本文所述的a-1、a-2、a-3、a-4、a-5、b-1、b-2、b-3、b-4、b-5、c-1、c-2、c-3、c-4、c-5、d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、e-1、e-2、e-3、e-4、e-5、e-6、f-1、f-2、f-3、f-4、f-5、g-1、g-2、g-3、g-4、g-5、h-1、h-2、h-3、h-4、h-5、i-1、i-2或i-3的3’-UTR和/或5’-UTR元件，其中优选a-1、a-3、i-2、i-3；
D)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO：37-328、8754-8855或其片段或变体的至少一种编码序列；
G)包含约50个至约500个腺苷，优选约64个至约100个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶，优选约30个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环。
在第一方面特别优选的实施方案中，编码RNA，优选mRNA包含以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)根据a-1、a-3、i-2、i-3的3’-UTR和/或5’-UTR元件；
D)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO：44、80、116、152、188、224、260、296、8755(HsALB_Pf-CSP(19-397))或其片段或变体的至少一种编码序列；
G)包含约50个至约500个腺苷，优选约64个或约100个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶，优选约30个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环。
本发明优选的氨基酸序列、编码序列和mRNA序列提供于表6A和6B。其中，每一行都表示本发明的特定的合适的CSP构建体，其中CSP构建体的描述示于A列，氨基酸序列的SEQID NO示于B列。相应的登录号和其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
表6A和6B的C列(野生型cds)和D列(opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt11 cds)提供了编码相应CSP构建体的编码序列的相应SEQ ID NO。其他信息提供于序列表中相应SEQ IDNO的标识符<223>下。
对于表6A，E列至H列提供了包含优选的编码序列的相应RNA序列，其中E列(“a-1”)提供了具有如本文所述的有利的UTR组合“a-1”的RNA序列，其中F列(“i-2”)提供了具有如本文所述的有利的UTR组合“i-2”的RNA序列，其中G列(“i-3”)提供了具有如本文所述的有利的UTR组合“i-3”的RNA序列，其中H列(“a-3”)提供了具有如本文所述的有利的UTR组合“a-3”的RNA序列。
表6A：编码CSP的优选的mRNA构建体
本发明优选的氨基酸序列、编码序列和mRNA序列提供于表6A和6B。其中，每一行表示本发明的特定的合适的CSP构建体，其中CSP构建体的描述示于A列，氨基酸序列的SEQ IDNO示于B列。相应的登录号和其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
表6A和6B的C列(野生型cds)和D列(opt1、opt2、opt3、opt4、opt5、opt11 cds)提供了编码相应CSP构建体的编码序列的相应SEQ ID NO。其他信息提供于序列表中相应SEQ IDNO的标识符<223>下。
在表6B中，E列至H列中提供了包含优选的3’端/3’末端的相应RNA序列，其中E列提供了具有如本文所述的有利的3’端/3’末端“A64-N5-C30-hSL-N5”的RNA序列，其中F列提供了具有如本文所述的有利的3’端“hSL-A64-N5”的RNA序列，其中G列提供了具有如本文所述的有利的3’端/3’末端“hSL-A100-N5”的RNA序列，其中H列提供了具有如本文所述的有利的3’端/3’末端“hSL-A100”的RNA序列。
表6B：编码CSP的优选的mRNA构建体
在优选的实施方案中，编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：329-2080、6312-8741、8856-10079的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
在特别优选的实施方案中，编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：329-2080、6312-8741、8856-10079的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
在优选的实施方案中，编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：329、333、369、405、441、477、513、549、585、332、363、399、435、471、507、543、579、615、621、625、661、697、733、769、805、841、877、624、655、691、727、763、799、835、871、907、913、917、953、989、1025、1061、1097、1133、1169、916、947、983、1019、1055、1091、1127、1163、1199、1205、1209、1245、1281、1317、1353、1389、1425、1461、1208、1239、1275、1311、1347、1383、1419、1455、1491、1497、1501、1537、1573、1609、1645、1681、1717、1753、1500、1531、1567、1603、1639、1675、1711、1747、1783、1789、1793、1829、1865、1901、1937、1973、2009、2045、1792、1823、1859、1895、1931、1967、2003、2039、2075、6312、6315、6345、6375、6405、6435、6465、6495、6525、6555、6558、6588、6618、6648、6678、6708、6738、6768、6798、6801、6831、6861、6891、6921、6951、6981、7011、7041、7044、7074、7104、7134、7164、7194、7224、7254、7284、7287、7317、7347、7377、7407、7437、7467、7497、7527、7530、7560、7590、7620、7650、7680、7710、7740、7770、7773、7803、7833、7863、7893、7923、7953、7983、8013、8016、8046、8076、8106、8136、8166、8196、8226、8256、8259、8289、8319、8349、8379、8409、8439、8469、8499、8502、8532、8562、8592、8622、8652、8682、8712的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
在优选的实施方案中，编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：336、372、408、444、480、516、552、588、628、664、700、736、772、808、844、880、8857、6561、6591、6621、6651、6681、6711、6741、6771、9163、7290、7320、7350、7380、7410、7440、7470、7500、9469、8019、8049、8079、8109、8139、8169、8199、8229、9775、920、956、992、1028、1064、1100、1136、1172、1212、1248、1284、1320、1356、1392、1428、1464、1504、1540、1576、1612、1648、1684、1720、1756、1796、1832、1868、1904、1940、1976、2012、2048、9061、7047、7077、7107、7137、7167、7197、7227、7257、9367、7776、7806、7836、7866、7896、7926、7956、7986、9673、8505、8535、8565、8595、8625、8655、8685、8715、9979、6318、6348、6378、6408、6438、6468、6498、6528、8959、6804、6834、6864、6894、6924、6954、6984、7014、9265、7533、7563、7593、7623、7653、7683、7713、7743、9571、8262、8292、8322、8352、8382、8412、8442、8472、9877(编码HsALB_Pf-CSP(19-397))的核酸序列或者这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。其他信息提供于序列表中相应SEQ ID NO的标识符<223>下。
如说明书通篇所述的，关于合适的氨基酸序列或核酸序列(编码序列、mRNA序列)的其他信息也可以从序列表中获得，特别是从如后文所述的标识符<223>下提供的详细信息中获得。
需要注意的是，在整个序列表中，数字标识符<223>下提供的信息遵循相同的结构：“<序列_描述符>来自<构建体_标识符>”。<序列_描述符>指序列的种类(例如“衍生和/或经修饰的蛋白质序列”、“衍生和/或经修饰的CDS”、“包含衍生和/或经修饰序列的mRNA产品设计a-1”或“包含衍生和/或经修饰序列的mRNA产品设计i-2”或“包含衍生和/或经修饰序列的mRNA产品设计i-3”等)，以及该序列是否包含或组成为野生型序列(“wt”)或该序列是否包含或组成为序列优化的序列(例如“opt1”、“opt2”、“opt3”、“opt4”、“opt5”、“opt6”、“opt11”；序列优化将在下面进一步详细描述)。数字标识符<223>下提供的<构建体_标识符>具有以下结构：(“有机体_构建体名称”或“有机体_登录号_构建体名称”)，并旨在帮助本领域技术人员明确地获得编码根据本发明的相同CSP蛋白质的合适的核酸序列(例如RNA、mRNA)。
RNA制备方法：
本发明的编码RNA，优选mRNA可以通过本领域已知的方法制备，所述方法包括化学合成如固相RNA合成，以及体外法如RNA体外转录反应。
在优选的实施方案中，编码RNA，优选mRNA是通过RNA体外转录获得的。
因此，本发明的编码RNA优选为体外转录的RNA。
术语“RNA体外转录”或“体外转录”指其中RNA在无细胞系统(体外)合成的过程。RNA可通过合适的DNA模板的DNA依赖性体外转录获得，根据本发明，所述DNA模板是线性化的质粒DNA模板或PCR扩增DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是用于任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的特定实例是T7、T3、SP6或Syn5RNA聚合酶。在本发明优选的实施方案中，在DNA模板进行RNA体外转录之前，用合适的限制性内切酶使DNA模板线性化。
用于RNA体外转录的试剂通常包括：DNA模板(线性化的质粒DNA或PCR产物)，其具有对其相应的RNA聚合酶例如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6或Syn5)具有高结合亲和力的启动子序列；四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTP)；任选地，如本文定义的帽类似物(例如m7G(5’)ppp(5’)G(m7G))；任选地，其他如本文定义的经修饰的核苷酸；DNA依赖性RNA聚合酶，其能够与DNA模板中的启动子序列(例如T7、T3、SP6或Syn5RNA聚合酶)结合；任选地，核糖核酸酶(RNA酶)抑制剂，以灭活任何潜在的污染RNA酶；任选地，降解焦磷酸盐的焦磷酸酶，其可以抑制RNA体外转录；MgCl2，其提供Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；维持适当pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其也可包含抗氧化剂(例如DTT)，和/或最佳浓度的多胺例如亚精胺，例如WO2017/109161中所公开的包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲体系。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA的cap1结构是使用三核苷酸帽类似物m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或者m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG的共转录加帽获得的。可以适用于制备本发明的编码RNA的优选的cap1类似物是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
在实施方案中，RNA体外转录中使用的核苷酸混合物还可以含有如本文所述的经修饰的核苷酸。在这种情况下，优选的经修饰的核苷酸包含假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。在特定的实施方案中，核苷酸混合物中的尿嘧啶核苷酸(部分地或完全地)被假尿苷(ψ)和/或N1-甲基假尿苷(m1ψ)置换，以获得经修饰的编码RNA。
在优选的实施方案中，可以针对给定的RNA序列优化RNA体外转录反应中使用的核苷酸混合物(即混合物中每种核苷酸的分数)，优选如WO2015/188933所述的。
在必须产生如本文所定义的多于一种不同编码RNA的实施方案中，例如必须产生2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的编码RNA(例如编码不同的CSP抗原，或例如编码不同抗原的组合；参见第二方面)的实施方案中，可适当使用WO2017/109134中所述的过程。
在RNA疫苗生产的情况下，可能需要提供GMP级RNA。GMP级RNA可以使用监管机构批准的制造工艺来生产。因此，在特别优选的实施方案中，RNA生产按照现行药品生产质量管理规范(GMP)进行，在DNA和RNA水平上实施各种质量控制步骤，优选地根据WO2016/180430进行。在优选的实施方案中，本发明的RNA是GMP级RNA，特别是GMP级mRNA。因此，用于疫苗的编码RNA是GMP级RNA。
优选使用
(CureVac，Tübingen，德国；根据WO2008/077592的RP-HPLC)和/或切向流过滤(如WO2016/193206中所述)对获得的RNA产物进行纯化。
在更优选的实施方案中，编码RNA，优选纯化的编码RNA根据WO2016/165831或WO2011/069586进行冻干，以产生如本文定义的温度稳定的干燥的编码RNA(粉末)。本发明的RNA，特别是纯化的RNA也可以使用根据WO2016/184575或WO2016/184576的喷雾干燥或喷雾冷冻干燥，以产生如本文定义的温度稳定的RNA(粉末)。因此，在制备和纯化的RNA的上下文中，WO2017/109161、WO2015/188933、WO2016/180430、WO2008/077592、WO2016/193206、WO2016/165831、WO2011/069586、WO2016/184575和WO2016/184576的公开内容通过引用并入本文。
因此，在优选的实施方案中，编码RNA是干燥的RNA，特别是干燥的mRNA。
本文中使用的术语“干燥的RNA”应当理解为已经经过如上文所述的冻干或喷雾干燥或喷雾冷冻干燥以获得温度稳定的干燥的RNA(粉末)的RNA。
在优选的实施方案中，本发明的编码RNA是纯化的RNA，特别是纯化的mRNA。
在本文中使用的术语“纯化的RNA”或“纯化的mRNA”应当理解为，经过某些纯化步骤(例如HPLC、TFF、Oligo d(T)纯化、沉淀步骤)后与起始材料(例如体外转录的RNA)相比纯度更高的RNA。纯化的RNA中基本上不存在的典型杂质包括肽或蛋白(例如衍生自DNA依赖性RNA体外转录的酶，例如RNA聚合酶、RNA酶、焦磷酸酶、限制性内切核酸酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、流产性RNA序列、RNA片段(短的双链RNA片段、流产性序列等)、游离核苷酸(经修饰的核苷酸、常规NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲成分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可能衍生自例如发酵过程的其他潜在杂质包括细菌杂质(生物负荷、细菌DNA)或衍生自纯化过程的杂质(有机溶剂等)。因此，在这方面，“RNA纯度”应尽可能接近100％。对于RNA纯度来说，还希望全长RNA转录物的量尽可能接近100％。因此，本文使用的“纯化的RNA”的纯度大于75％、80％、85％，非常具体的是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，最优选99％或者高于99％。纯度可以例如通过分析型HPLC法测定，其中上面提供的百分比对应于目标RNA的峰面积与体现副产物的所有峰的总面积之间的比率。或者，纯度可以例如通过分析型琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳来测定。
应当理解，本文定义的“干燥的RNA”和本文定义的“纯化的RNA”或本文定义的“GMP级mRNA”可以具有优越的稳定性特征(体外、体内)和提高的效率(例如mRNA在体内的可翻译性更好)，因此特别适合用于医药目的，例如疫苗。此外，本文定义的“干燥的RNA”和本文定义的“纯化的RNA”或“GMP级mRNA”可以特别适合用于如本文定义的医药用途。
因此，在优选的实施方案中，第一方面的用于疫苗的编码RNA可以是GMP级编码RNA、纯化的编码RNA和/或干燥的编码RNA。
在如本文定义的共转录加帽之后，以及在如本文定义的纯化之后，可以使用如公布的PCT申请WO2015/101416，特别是公布的PCT申请WO2015/101416中的权利要求27至46所述的加帽分析法来测定获得的编码RNA的加帽程度。或者，可以使用PCT/EP2018/08667中所述的加帽分析法。
组合物、药物组合物：
第二方面涉及包含第一方面的至少一种编码RNA的组合物。
值得注意的是，也可以阅读涉及第二方面的组合物的实施方案并理解为第三方面的疫苗的合适的实施方案。同时，也可以阅读涉及第三方面的疫苗的实施方案并理解为第二方面的组合物(包括第一方面的RNA)的合适的实施方案。
在第二方面的优选的实施方案中，所述组合物包含根据第一方面的编码疟原虫的CSP的至少一种RNA，或者其免疫原性片段或免疫原性变体，其中所述组合物优选地是在肌内施用或皮内施用。
优选地，所述组合物的肌内施用或皮内施用后的结果是编码的CSP抗原在对象中表达。优选地，第二方面的组合物适合用于疫苗，特别地，适合用于疟疾疫苗。
该组合物可以包含安全和有效量的如本文所述的RNA。本文使用的“安全和有效量”指足以使得编码的CSP抗原蛋白表达和/或激活的RNA量。同时，“安全和有效量”足够小，以避免严重的副作用。
如上文定义的组合物的RNA的“安全和有效量”还会因以下在随行医生的知识和经验范围内的条件而变化：待治疗的特定状况和所治疗患者的年龄和身体状况、病况的严重程度、治疗持续时间、伴随治疗的性质、所使用的特定药学上可接受的载体的性质以及类似的因素。此外，如本文描述的RNA或组合物的“安全和有效量”可以取决于施用途径(例如肌内施用、皮内施用)、施用装置(针头注射、注射装置)、和/或复合/制剂(例如RNA与聚合物载体或LNP结合)。此外，RNA或组合物的“安全和有效量”可以取决于治疗对象的状况(婴儿、免疫功能不全的人类对象等)。因此，合适的“安全和有效量”必须进行调整并由技术人员选择和定义。
在本发明的上下文中，“组合物”指任何类型的组合物，其中特定的成分(例如编码CSP的RNA，例如与聚合物载体或LNP结合)可以任选地与任何其他组分合并，通常与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂合并。该组合物可以是例如粉末或颗粒的干燥组合物，或者例如冻干形式的固体单元。或者，该组合物可以是液体形式，并且每种组分可以独立地以溶解的或分散的(例如悬浮的或乳化的)形式并入。
在第二方面的优选的实施方案中，组合物包含至少一种第一方面的编码RNA和任选地至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在第二方面的特别优选的实施方案中，组合物包含至少一种编码RNA，其中编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：37-328、329-2080、2121-2480、2887-6134、6312-8741、8754-8855、8856-10079、10086-10139的核酸序列相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列，和任选地，至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在本文中使用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”优选地包括施用的组合物的液体或非液体基质。如果组合物以液体形式提供，则载体可以是水，例如无热原水；等渗盐水或缓冲(含水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。可以使用水或优选缓冲剂，更优选含水缓冲剂，其含有钠盐，优选至少50mM的钠盐、钙盐，优选至少0.01mM的钙盐和任选地钾盐，优选至少3mM的钾盐。根据优选的实施方案，钠盐、钙盐和任选的钾盐可以以其卤化物例如氯化物、碘化物或溴化物的形式存在、以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式存在。钠盐的实例包括NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，钙盐的实例包括CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。
此外，前述阳离子的有机阴离子可以在缓冲液中。因此，在实施方案中，本发明的RNA组合物可以包含药学上可接受的载体或赋形剂，其使用一种或多于一种药学上可接受的载体或赋形剂以例如增加稳定性、增加细胞转染、允许持续或延迟、增加编码的CSP蛋白在体内的翻译和/或改变编码的CSP蛋白在体内的释放特性。除常规赋形剂例如任何和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载剂、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂以外，本发明的赋形剂可以包括但不限于类脂、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用多核苷酸转染的细胞、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。在实施方案中，也可以使用适合施用于对象的一种或多于一种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物。本文中使用的术语“相容的”指组合物的组分能够以不发生相互作用的方式与组合物中的至少一种RNA和任选地多种RNA混合，在典型的使用条件下(例如，肌内或皮内施用)，所述相互作用会大大降低组合物的生物学活性或药物效力。药学上可接受的载体或赋形剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性使其适合于向待治疗的对象施用。可以用作药学上可接受的载体或赋形剂的化合物可以是糖类，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、纤维素乙酸酯；黄芪胶粉；麦芽；明胶；动物油脂；固体助流剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。
可以优选地选择组合物的至少一种药学上可接受的载体或赋形剂以适合于所述组合物的肌内递送或皮内递送。因此，组合物优选地是药物组合物，其适合于肌内施用或皮内施用。
预期施用组合物，优选药物组合物的对象包括但不限于人类和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本发明的药物组合物适当地可以是无菌的和/或无热原的。
此外，也可以使用一种或多于一种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物，其适合向人施用。在本文中使用的术语“相容的”指组合物的组分能够以不发生相互作用的方式与组合物中的至少一种RNA和任选地其他编码RNA混合，在典型的使用条件下，所述相互作用会大大降低组合物的生物学活性或药物效力。药学上可接受的载体、填充剂和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性使其适于向待治疗的人施用。可以用作药学上可接受的载体、填充剂或其组分的化合物是糖类，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；右旋糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、纤维素乙酸酯；黄芪胶粉；麦芽；明胶；动物油脂；固体助流剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。
组合物中还可以包括的其他添加剂是乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如月桂醇硫酸钠；着色剂；增味剂；药物载体；成片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
在实施方案中，在本文中定义的组合物可以包含多种或至少多于一种如本发明第一方面的上下文中所定义的编码RNA种类。
在实施方案中，组合物中包含的至少一种RNA是双顺反子核酸或多顺反子核酸，特别地是如本文定义的双顺反子核酸或多顺反子核酸，其编码衍生自相同疟原虫和/或不同疟原虫的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种不同的抗原肽或蛋白。
在实施方案中，本文中定义的组合物可以包含多种或至少多于一种如本发明第一方面的上下文中所定义的编码RNA种类。优选地，本文定义的组合物可以包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的分别如第一方面的上下文中所定义的编码RNA。
在实施方案中，组合物可以包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的如第一方面的上下文中所定义的编码RNA种类，每一种编码衍生自遗传上相同的疟原虫的至少一种抗原肽或蛋白质，或其片段或变体。特别地，所述(遗传上)相同的疟原虫表达(本质上)相同的蛋白质库或肽库，其中所有蛋白质或肽具有(本质上)相同的氨基酸序列。特别地，所述(遗传上)相同的疟原虫表达本质上相同的蛋白质、肽或者多蛋白，其中这些蛋白质、肽或者多肽的氨基酸序列优选地没有差异。清单1中提供了示例性疟原虫的非限制性清单。
在优选的实施方案中，组合物包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种编码RNA构建体种类，每一种编码如第一方面所定义的不同CSP疟疾抗原(构建体)，优选地其中每种编码RNA构建体选自SEQ ID NO：329-2080、6312-8741、8856-10079。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含
(i)编码至少一种更全长的CSP的至少一种编码RNA，和
(ii)编码至少一种带有HBsAg的截短的CSP片段的至少一种编码RNA。
在优选的实施方案中，第二方面的组合物包含
(i)编码诱导强烈体液免疫应答的至少一种CSP变体的至少一种编码RNA，和
(ii)编码诱导强烈细胞免疫应答的至少一种CSP片段的至少一种编码RNA。
在更优选的实施方案中，第二方面的组合物包含
(i)编码诱导强烈B细胞免疫应答的至少一种CSP变体的至少一种编码RNA，
(ii)编码诱导强烈CD4+T细胞应答的至少一种CSP片段的至少一种编码RNA；和
(ii)编码诱导强烈CD8+T细胞应答的至少一种CSP片段的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种不同的如第一方面的上下文中所定义的编码RNA，每一种编码衍生自遗传上不同的疟原虫的至少一种肽或蛋白质，或其片段或变体。本说明书中全文使用的术语“不同”或“不同的疟原虫”应当理解为至少两种相应的疟原虫之间的差异，其中该差异表现在不同疟原虫各自的基因组上。特别地，所述(遗传上)不同的疟原虫可以表达至少一种不同的蛋白质、肽或多肽，其中所述至少一种不同的蛋白质、肽或多蛋白优选地有至少一个氨基酸不同。
在其他实施方案中，组合物包含至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或甚至多于10种编码RNA构建体种类，每一种编码选自CSP、LSA1、MSP1、AMA1、TRAP、VAR2CSA、Pfs230、Pfs28、pfs25、Pfs45/48、RH5、Ripr、EMP1、SSP2或这些的任意组合或免疫原性片段或免疫原性变体的不同疟疾抗原。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码选自LSA1、MSP1、AMA1、TRAP、VAR2CSA、Pfs230、Pfs28、pfs25、Pfs45/48、RH5、Ripr、EMP1、SSP2的抗原的一种编码RNA种类。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的两种编码RNA种类，所述两种编码RNA种类的每一种编码选自LSA1、MSP1、AMA1、TRAP、VAR2CSA、Pfs230、Pfs28、pfs25、Pfs45/48、RH5、Ripr、EMP1、SSP2的不同抗原。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的三种编码RNA种类，所述三种编码RNA种类的每一种编码选自LSA1、MSP1、AMA1、TRAP、VAR2CSA、Pfs230、Pfs28、pfs25、Pfs45/48、RH5、Ripr、EMP1、SSP2的不同抗原。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码VAR2CSA的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码VAR2CSA的至少一种编码RNA，和编码Pfs25和/或Pfs230的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码VAR2CSA的至少一种编码RNA，和编码Pfs230和/或Pfs28的至少一种编码RNA，以及另外的编码LSA1、MSP1、AMA1、TRAP、VAR2CSA、pfs25、Pfs45/48、RH5、Ripr、EMP1、SSP2的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码AMA1的至少一种编码RNA，和编码TRAP的至少一种编码RNA，和编码MSP1的至少一种编码RNA，和/或编码LSA的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码Vaqr2CSA的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码Pfs230、PFS28、Pfs25、Pfs48/50CyRPA、RH5和/或RIPR的至少一种编码RNA。
在实施方案中，组合物包含编码如第一方面的上下文中所定义的CSP的至少一种编码RNA，以及另外的编码AMA1、TRAP、MSP1、LSA、Vaqr2CSA、Pfs230、PFS28、Pfs25、Pfs48/50CyRPA、RH5和/或RIPR的至少一种编码RNA。
复合：
在第二方面优选的实施方案中，将至少一种编码RNA或者多个编码RNA(RNA种类)进行复合或结合以获得配制的组合物。在此情况下，制剂可以具有转染剂的功能。在此情况下，制剂还可以具有保护编码RNA不被降解的功能。
在第二方面优选的实施方案中，将至少一种编码RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物，优选阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或结合，或者至少部分地复合或部分地结合。
值得注意的是，也可以阅读与“至少一种编码RNA”相关的实施方案并理解为多于一种或多种例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种如第一方面的上下文中所述的RNA的合适的实施方案。
在本文中使用的术语“阳离子或聚阳离子化合物”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指带电分子，其在pH值是约1至9、pH值是约3至8、pH值是约4至8、pH值是约5至8，更优选地pH值是约6至8、更优选地pH值是约7至8、最优选地在生理pH值例如是约7.2至约7.5时带正电荷。因此，阳离子组分，例如阳离子肽、阳离子蛋白、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质，可以是在生理条件下带正电荷的任意带正电化合物或聚合物。“阳离子或聚阳离子肽或蛋白”可以包括例如选自Arg、His、Lys或Orn的至少一种带正电的氨基酸，或者多于一种带正电的氨基酸。因此，“聚阳离子”组分也属于在给定条件下显示多于一个正电荷的范围内。
在本上下文中特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可以选自下列阳离子或聚阳离子肽或蛋白或其片段：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白质，例如多聚-L-赖氨酸(PLL)、聚精氨酸、碱性多肽、细胞穿膜肽(CPP)，包括HIV结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat衍生的肽、穿膜肽、VP22衍生的肽或类似肽、HSV VP22(单纯疱疹)、MAP、KALA或蛋白转导结构域(PTD)、PpT620、富脯氨酸肽、富精氨酸肽、富赖氨酸肽、MPG肽、Pep-1、L-寡聚体、降钙素肽、触角足衍生的肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运素(Transportan)、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT衍生的肽、SAP或组蛋白。更优选地，本文定义的核酸，优选本文定义的mRNA，与一种或多于一种聚阳离子、优选鱼精蛋白或oligofectamine，最优选鱼精蛋白复合。
在第二方面的优选实施方案中，至少一种编码RNA与鱼精蛋白复合。
可以用作转染剂或复合剂的其他优选阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如壳聚糖、聚凝胺等；阳离子脂质，例如DOTMA、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油酰基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、oligofectamine；或者阳离子或聚阳离子聚合物，例如经修饰的聚氨基酸例如β-氨基酸聚合物或反向聚酰胺等，经修饰的聚乙烯类例如PVP等，经修饰的丙烯酸酯例如pDMAEMA等，经修饰的聚β氨基酯(PBAE)，例如二胺末端改性的1，4-丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物，例如多丙基胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，例如PEI、聚丙烯亚胺等，聚丙烯胺，基于糖骨架的聚合物例如基于环糊精的聚合物、基于右旋糖酐的聚合物等，基于硅烷骨架的聚合物，例如PMOXA-PDMS共聚物等，由一个或多于一个阳离子嵌段(例如，选自上文所述的阳离子聚合物)和一个或多于一个亲水或疏水嵌段(例如聚乙二醇)组成的嵌段聚合物；等。
在本文中，特别优选地，至少一种编码RNA与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合物载体，优选阳离子蛋白或肽复合或者至少部分复合。在此上下文中，WO2010/037539和WO2012/113513的公开内容通过引用并入本文。部分是指只有一部分编码RNA与阳离子化合物复合，而其余的RNA(包含在本发明(药物)组合物中)是未复合(“游离”)形式。
在第二方面优选的实施方案中，组合物包含与至少一种阳离子或多阳离子化合物优选鱼精蛋白复合的至少一种编码RNA以及至少一种游离编码RNA。
在这种情况下，特别优选地，至少一种编码RNA与鱼精蛋白复合或者至少部分复合。优选地，核酸特别是与鱼精蛋白复合的RNA的RNA与游离RNA的摩尔比可以是约0.001∶1至约1∶0.001，包括约1∶1的比例。适当地，通过将鱼精蛋白-海藻糖溶液以2∶1的RNA∶鱼精蛋白的重量比(重量/重量)添加到RNA样品中，来使复合RNA与鱼精蛋白复合。
可以用来复合的其他优选阳离子或聚阳离子蛋白或肽可以衍生自专利申请WO2009/030481或WO2011/026641的式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，WO2009/030481或WO2011/026641的相关公开内容通过引用并入本文。
在第二方面优选的实施方案中，至少一种编码RNA与优选地选自SEQ ID NO：6201-6204或其任何组合的至少一种阳离子或聚阳离子蛋白或肽复合或至少部分复合。
根据实施方案，本发明的组合物包含如第一方面的上下文中所定义的编码RNA和聚合物载体。
在本文中使用的术语“聚合物载体”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指促进另一种化合物(例如货物RNA)的转运和/或复合的化合物。聚合物载体通常是由聚合物形成的载体。聚合物载体可通过共价或非共价相互作用与其货物(例如编码RNA)结合。聚合物可以基于不同的子单元，例如共聚物。
在本上下文中合适的聚合物载体可以包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、右旋糖酐、白蛋白、明胶、褐藻胶、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、聚乙二醇化鱼精蛋白、聚乙二醇化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)、二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(DSP)、二甲基-3，3’-二硫代双亚氨丙酸酯(DTBP)、聚(乙烯亚胺)双氨基甲酸酯(PEIC)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、组氨酸修饰的PLL、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯亚胺)(PPI)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚(酰胺乙烯亚胺)(SS-PAEI)、三乙烯四胺(TETA)、聚(β-氨基酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(PHP)、聚(烯丙胺)、聚(α-[4-氨丁基]-L-乙醇酸)(PAGA)、聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶
)、聚(磷腈)(PPZ)、聚(磷酸酯)(PPE)、聚(氨基磷酸酯)(PPA)、聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)(pHPMA)、聚(甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯)(pDMAEMA)、聚(2-氨基乙基丙烯磷酸酯)(PPE_EA)、半乳糖化壳聚糖、N-十二烷基壳聚糖、组蛋白、胶原蛋白和右旋糖酐-精胺。在一种实施方案中，聚合物可以是惰性聚合物，例如但不限于PEG。在一种实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物，例如但不限于PEI、PLL、TETA、聚(烯丙胺)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶
)、pHPMA和pDMAEMA。在一种实施方案中，聚合物可以是生物可降解的PEI，例如但不限于DSP、DTBP和PEIC。在一种实施方案中，聚合物可以是生物可降解的，例如但不限于组氨酸修饰的PLL、SS-PAEI、聚(β-氨基酯)、PHP、PAGA、PLGA、PPZ、PPE、PPA和PPE-EA。
当PEI存在时，它可以是分子量为10kDa至40kDa的支化PEI，例如25kDa的支化PEI(Sigma#408727)。
在一些实施方案中，基于聚合物的纳米颗粒包含PEI。在一些实施方案中，PEI是支化PEI。PEI可以是分子量为10kDa至40kDa例如25kDa的支化PEI。在一些实施方案中，PEI是直链PEI。在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸小于约60nm(例如小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm或者小于约25nm)。合适的纳米颗粒可以是25nm至60nm，例如30nm至50nm。
合适的聚合物载体可以是由二硫化物交联的阳离子化合物形成的聚合物载体。二硫化物交联的阳离子化合物可以是彼此相同的或不同的。聚合物载体还可以包括其他组分。根据本发明使用的聚合物载体可以包括阳离子肽、蛋白质或聚合物和任选地其他如本文定义的组分的混合物，它们通过二硫键(通过-SH基团)交联。
在本上下文中，优选根据专利申请WO2012/013326的式{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa’)x(Cys)y}和式Cys，{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys2的聚合物载体，WO2012/013326的相关公开内容通过引用并入本文。
在实施方案中，用于使编码RNA复合的聚合物载体可以衍生自根据专利申请WO2011/026641的式(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的聚合物载体分子，WO2011/026641的相关公开内容通过引用并入本文。
在实施方案中，聚合物载体化合物形成于、或包含或组成为肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO：6201)或CysArg12(SEQ ID NO：6202)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO：6203)。在特别优选的实施方案中，聚合物载体化合物的组成为(R12C)-(R12C)二聚体、(WR12C)-(WR12C)二聚体、或(CR12)-(CR12C)-(CR12)三聚体，其中二聚体(如(WR12C))或三聚体(如(CR12))中的单个肽元件通过-SH基团连接。
在第二方面优选的实施方案中，第一方面的至少一种编码RNA与聚乙二醇/肽聚合物复合或结合，所述聚乙二醇/肽聚合物包含HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：6204作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：6204作为肽单体)、HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：10172作为肽单体)和/或包含HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(SEQ ID NO：10172的肽单体)。
在其他实施方案中，组合物包含至少一种编码RNA，其中所述至少一种编码RNA与聚合物载体和任选地如WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1中所述的至少一种脂质组分复合或结合。在这种情况下，WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1的公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方案中，聚合物载体是肽聚合物，优选如上文定义的聚乙二醇/肽聚合物，和脂质组分，优选类脂组分。
在第二方面优选的实施方案中，至少一种第一方面的编码RNA与聚合物载体，优选与如上文定义的聚乙二醇/肽聚合物，和类脂组分复合或结合，其中类脂组分是根据式A的化合物。
其中
-RA每次出现时独立地选自未经取代的、环状的或无环的、支化的或非支化的C1-20脂族基团；经取代或未经取代的、环状或无环的、支化的或非支化的C1-20杂脂族基团；经取代的或未经取代的芳基；经取代或未经取代的杂芳基；
其中至少一个RA是
-R5每次出现时独立地选自未经取代的、环状的或无环的、支化的或非支化的C8-16脂肪族；经取代的或未经取代的芳基；或经取代或未经取代的杂芳基；
-x每次出现时是1至10的整数；
-y每次出现时是1至10的整数；
或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，类脂组分可以是选自表7的类脂。
表7：适用于本发明的类脂：
根据优选的实施方案，肽聚合物包含表7的类脂，优选如上文所述的类脂3-C12-OH，用来与至少一种第一方面的编码RNA复合以形成复合物，所述复合物的N/P比是约0.1至约20，或约0.2至约15，或约2至约15，或约2至约12，其中N/P比定义为阳离子肽或聚合物的碱性基团的氮原子与核酸的磷酸基团的摩尔比。在这种情况下，WO2017/212009A1中的公开内容，特别是WO2017/212009A1中的权利要求1至10，和与此相关的具体公开内容通过引用并入本文。
LNP中的包封/复合：
在第二方面优选的实施方案中，至少一种编码RNA与一种或多于一种类脂(例如阳离子脂质和/或中性脂质)进行复合、包封、部分包封、或结合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体。
合并脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体的RNA可以完全或部分位于脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体的内部空间、膜内或者与膜外表面结合。核酸并入到脂质体在本文中也称为“包封”，其中RNA完全地包含在脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体的内部空间中。将RNA并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体的目的是保护RNA免受环境的影响，所述环境可能含有降解RNA的酶或化学物质和/或导致RNA快速流失的系统或受体。此外，将RNA并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体可以促进RNA的摄取，因此可以增强编码抗原CSP的RNA的治疗效果。因此，将RNA并入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体可以特别适用于疫苗，例如用于肌内施用或皮内施用。
在本文中，术语“复合”或“结合”指第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质基本稳定地组合成不含共价结合的更大的复合物或组装体。
术语“脂质纳米颗粒”，也称为“LNP”，并不限于任何特定的形貌，并且包括例如在含水环境和/或RNA存在的情况下，阳离子脂质和任选地一种或多于一种其他脂质结合时产生的任何形貌。例如，脂质体、脂质复合物、脂复合物等都在脂质纳米颗粒(LNP)的范畴内。
脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂复合物和/或纳米脂质体可以有不同的尺寸，例如但不限于，多室脂质体(MLV)，其直径可以是数百纳米，并且可能包含一系列由狭窄的水室隔开的同心双层，小单室脂质体(SUV)，其直径可以小于50nm，和大单室脂质体(LUV)，其直径可以是50nm至500nm。
本发明的LNP适当地被表征为具有内部含水空间的微泡，该内部水空间由一个或多于一个双层的膜与外部介质隔开。LNP的双层膜通常由两亲分子形成，例如合成或天然来源的脂质，其包含空间上分离的亲水结构域和疏水结构域。脂质体的双层膜也可以由两亲聚合物和表面活性剂(如聚合体、囊泡等)形成。在本发明的上下文中，LNP通常用于将第一方面的RNA输运到目标组织。
因此，在第二方面优选的实施方案中，至少一种RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中所述LNP特别适用于肌内施用和/或皮内施用。
LNP通常包含阳离子脂质和选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇化脂质)中一种或多于一种的赋形剂。编码RNA可以包封进LNP的脂质部分或者由LNP的一些或整个脂质部分包裹的含水空间中。编码RNA或其部分也可以与LNP结合和复合。LNP可以包括能够形成颗粒的任何脂质，核酸附着在颗粒上，或者一种或多于一种核酸被包封进颗粒中。优选地，包含核酸的LNP包括一种或多于一种阳离子脂质，和一种或多于一种稳定化脂质。稳定化脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
LNP的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即，当pH值低于脂质的可电离基团的pK时，它变得质子化，但在较高的pH值时，它会逐渐变得中性。在低于pK的pH值中，脂质能够与带负电荷的核酸相结合。在特定的实施方案中，阳离子脂质包括两性离子脂质，其在pH降低时带有正电荷。
LNP可以包括任何其他阳离子脂质或可阳离子化的脂质，即，在选定的pH值例如生理pH值下，可以携带净正电荷的任何脂质种类。
这样的脂质包括但不限于DSDMA、N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、1，2-二油酰三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(也称为N-((2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵和1，2-二油酰基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐)、N-(1-(2，3-二油酰基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰基氧基丙胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二-y-亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、98N12-5、1，2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2，2-二亚油基-4-二甲基氨乙基-[1，3]-二氧戊环)HGT4003、1，2-二亚油基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油基氧基-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八烷基-9，12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、ALNY-100((3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八烷基-9，12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺))、1，1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4，7，13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1，N16-双十一烷基-4，7，10，13-四氮杂十六烷-1，16-二酰胺)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基氧基)-N，N-二甲基丙烷-1-胺(MC3醚)、4-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基氧基)-N，N-二甲基丁烷-1-胺(MC4醚)、
(可商购获得的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺，来自GIBCO/BRL，GrandIsland，N.Y.)；
(可商购获得的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧基酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和
(可商购获得的阳离子脂质，其包含双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)于乙醇中，来自Promega Corp.，Madison，Wis.)，或上述任何一项的任何组合。其他用于本发明的组合物和方法的合适阳离子脂质包括如国际专利申请WO2010/053572(特别地，第[00225]段所述的CI 2-200)和WO2012/170930中所述的那些，二者均通过引用并入本文、HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见US20150140070A1)。
在一些实施方案中，脂质选自98N12-5、C12-200和ckk-E12。
在一种实施方案中，其他阳离子脂质是氨基脂质。
代表性的氨基脂质包括但不限于1，2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在一个实施方案中，第一方面的编码RNA可配制在氨基醇类脂质中。
可以用于本发明的氨基醇类脂质可以通过如美国专利第8450298号中描述的方法制备，其全部内容通过引用并入本文。合适的(可电离的)脂质还可以是如WO2017/075531A1的表1、表2、表3中公开的化合物和权利要求1至24中所定义的化合物，其通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，可离子化的脂质还可以是如WO2015/074085A1中公开的化合物(即，ATX-001至ATX-032，或者如权利要求1至26中所述的化合物)、美国申请第61/905724号和第15/614499号或者美国专利第9593077和第9567296中所描述的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
在这种情况下，可以是衍生自通式(X1)的任何脂质
其中，R1和R2是相同的或不同的，每一个是由1个至9个碳原子组成的直链烷基或支化烷基、由2个至11个碳原子组成的烯基或炔基，L1和L2是相同的或不同的，每一个是由5个至18个碳原子组成的直链亚烷基或亚烯基或者与N形成杂环，X1是键，或者是-CO-O-以形成-L2-CO-O-R2，X2是S或O，L3是键、或由1个至6个碳原子组成的直链亚烷基或支化亚烷基、或与N形成杂环，R3是由1个至6个碳原子组成的直链亚烷基或支化亚烷基，R4和R5是相同的或不同的，每一个是氢或者由1个至6个碳原子组成直链烷基或支化烷基；或可以适当使用其药学上可接受的盐。
在其他实施方案中，合适的阳离子脂质还可以是如WO2017/117530A1中公开的化合物(即，脂质13、脂质14、脂质15、脂质16、脂质17、脂质18、脂质19、脂质20或权利要求中所述的化合物)，其全部内容通过引用并入本文。
在这种情况下，可以是衍生自通式(X2)的任何脂质
其中
X是直链或支化亚烷基或亚烯基、单环芳烃或杂环芳烃、双环芳烃或杂环芳烃、三环芳烃或杂环芳烃；
Y是键、亚乙基，或未经取代的或经取代的芳香环或杂芳环；Z是S或O；
L是1个至6个碳原子的直链亚烷基或支化亚烷基；
R3和R4独立地是1个至6个碳原子的直链烷基或支化烷基；
R1和R2独立地是1个至20个碳原子的直链或支化烷基或烯基；r是0至6；和
m、n、p和q独立地是1至18；
其中当n＝q、m＝p且R1＝R2时，X与Y不同；
其中当X＝Y、n＝q且m＝p时，R1与R2不同；
其中当X＝Y、n＝q且R1＝R2时，m与p不同；和
其中当X＝Y、m＝p且R1＝R2时，n与q不同；
或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，可以使用衍生自式(X2)的脂质，其中，X是键、直链或支化亚烷基或亚烯基，或者单环芳烃或杂芳烃、双环芳烃或杂芳烃、三环芳烃或杂芳烃；Y是单环芳烃或杂芳烃、双环芳烃或杂芳烃、三环芳烃或杂芳烃；Z是S或O；L是1个至6个碳原子的直链或支化亚烷基；R3和R4独立地是1个至6个碳原子的直链或支化烷基；R1和R2独立地是1个至20个碳原子的直链或支化烷基或烯基；r是0至6；并且m、n、p和q独立地是1至18；或可以适当使用其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，可离子化的脂质还可以选自WO2018/078053A1中公开的脂质(即，衍生自WO2018/078053A1的式I、式II和式III的脂质，或者如WO2018/078053A1的权利要求1至12中所述的脂质)，WO2018/078053A1的全部公开内容通过引用并入本文。在这种情况下，在本发明的上下文中可以适当地使用公开于WO2018/078053A1的表7的脂质(例如衍生自式I-1至I-41的脂质)和公开于WO2018/078053A1的表8的脂质(例如衍生自式II-1至II-36的脂质)。因此，WO2018/078053A1的式I-1至I-41和式II-1至II-36，和相关的特定公开内容，通过引用并入本文。
在第二方面特别优选的实施方案中，合适的脂质可以是根据式(III)的阳离子脂质
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中，R1、R2、R3、L1、L2、G1、G2和G3如下所述。
式(III)进一步定义如下：
L1或L2中的一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，而L1或L2中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或者是直接的键；
G1和G2各自独立地是未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3元至8元环烷基或亚环烷基；R6每次出现时独立地为H、OH或C1-C24烷基；n是1至15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地是1至12的整数。
在式(III)的任意的前述实施方案中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每一个都是-O(C＝O)-。在上述任何一种的一些不同实施方案中，L1或L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每一个都是-(C＝O)O-。
在第二方面优选的实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；
G3是C1-C24亚烷基或C1-C24亚烯基；和
R3是H或OR5。
在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IHE)或(IIIF)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，n是2至12的整数，例如2至8的整数或2至4的整数。在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在式(III)的一些前述的其他实施方案中，y和z各自独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9的整数或4至6的整数。在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在其他前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。在式(III)的一些实施方案中，G3是未经取代的。在其他实施方案中，G3是经取代的。在各种不同的实施方案中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C1-C24亚烯基。在式(III)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2每一个独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；且a是2至12的整数，其中分别选择R7a、R7b和a，以使得R1和R2各自独立地包含6个至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9的整数或8至12的整数。在式(III)的一些前述实施方案中，R7a至少有一次出现时是H。例如，在一些实施方法中，R7a每次出现时都是H。在前述的其他不同的实施方案中，R7b至少有一次出现时是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或者二者具有以下结构之一：
在第二方面优选的实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中：
L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-或(C＝O)-O-；和
R1和R2各自独立地具有以下结构之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在第二方面优选的实施方案中，LNP的阳离子脂质是式III的化合物，其中R3是OH。
在第二方面特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP选自III-1至III-36的结构(参见表8)。
表8：衍生自式(III)的代表性脂质化合物
在一些实施方案中，LNP包括式(III)的脂质、第一方面的编码RNA和选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的一种或多于一种赋形剂。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-7。
在优选的实施方案中，LNP包括阳离子脂质，其选自：
在第二方面特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP包括以下阳离子脂质(根据表8的式HI-3的脂质)：
在特定的实施方案中，如本文定义的阳离子脂质，优选地如表8中公开的阳离子脂质，更优选地阳离子脂质化合物III-3，存在于LNP中，它的量相对于LNP的总脂质含量为约百分之30摩尔至约百分之95摩尔。如果LNP中并入了多于一种阳离子脂质，则该百分比适用于组合的阳离子脂质。
在一个实施方案中，存在于LNP中的阳离子脂质的量为约百分之30摩尔至约百分之70摩尔。在一个实施方案中，存在于LNP中的阳离子脂质的量为约百分之40摩尔至约百分之60摩尔，例如分别为约百分之40摩尔、百分之41摩尔、百分之42摩尔、百分之43摩尔、百分之44摩尔、百分之45摩尔、百分之46摩尔、百分之47摩尔、百分之48摩尔、百分之49摩尔、百分之50摩尔、百分之51摩尔、百分之52摩尔、百分之53摩尔、百分之54摩尔、百分之55摩尔、百分之56摩尔、百分之57摩尔、百分之58摩尔、百分之59摩尔或百分之60摩尔。在实施方案中，存在于LNP中的阳离子脂质的量为约百分之47摩尔至约百分之48摩尔，例如分别为约百分之47.0摩尔、百分之47.1摩尔、百分之47.2摩尔、百分之47.3摩尔、百分之47.4摩尔、百分之47.5摩尔、百分之47.6摩尔、百分之47.7摩尔、百分之47.8摩尔、百分之47.9摩尔、百分之50.0摩尔，其中特别优选百分之47.7摩尔。
在一些实施方案中，阳离子脂质存在的比例是存在于LNP中总脂质含量的约20摩尔％至约70摩尔％或75摩尔％，或者约45摩尔％至约65摩尔％，或者约20摩尔％、25摩尔％、30摩尔％、35摩尔％、40摩尔％、45摩尔％、约50摩尔％、55摩尔％、60摩尔％、65摩尔％或约70摩尔％。在其他实施方案中，LNP中包含约25摩尔％至约75摩尔％的阳离子脂质，例如约20摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％、约45摩尔％至约65摩尔％、约60摩尔％、约57.5摩尔％、约57.1摩尔％、约50摩尔％或约40摩尔％(基于脂质纳米颗粒中共100摩尔％的脂质)。在一些实施方案中，阳离子脂质与第一方面的编码RNA的比例是约3至约15，例如约5至约13或约7至约11。
在本发明的一些实施方案中，LNP包括上述任意脂质的组合物或混合物。
其他合适的(阳离子或可离子化的)脂质公开于WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354、美国专利第7893302号、第7404969号、第8283333号、第8466122号和第8569256号和美国专利公开第US2010/0036115号、第US2012/0202871号、第US2013/0064894号、第US2013/0129785号、第US2013/0150625号、第US2013/0178541号、第US2013/0225836号、第US2014/0039032号和第WO2017/112865号。在这种情况下，WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354、美国专利第7893302号、第7404969号、第8283333号、第8466122号和第8569256号和美国专利公开第US2010/0036115号、第US2012/0202871号、第US2013/0064894号、第US2013/0129785号、第US2013/0150625号、第US2013/0178541号、第US2013/0225836号、第US2014/0039032号和第WO2017/112865号中特别地涉及适用于LNP的(阳离子)脂质的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，脂质选自98N12-5、C12-200和ckk-E12。
在一些实施方案中，如本文定义的氨基脂质或阳离子脂质具有至少一种可质子化或可脱质子化基团，使脂质在pH值为或低于生理pH值(例如pH 7.4)时带正电荷，在第二pH、优选地为或高于生理pH值时呈中性。当然，应理解，质子根据pH值的添加或移除是平衡过程，并且所提到的带电或中性脂质指的是主要种类的性质，并不要求所有脂质都必须以带电或中性形式存在。不排除具有一个以上可质子化或可脱质子化基团的脂质或是两性离子的脂质，它们同样可以适用于本发明的上下文中。
在一些实施方案中，可质子化的脂质的可质子化基团的pKa是约4至约11，例如pKa是约5至约7。
LNP可以包含两种或多于两种(不同的)阳离子脂质。可以选择阳离子脂质来贡献不同的有利性质。例如，LNP中可以使用具有不同的性质例如胺的pKa、化学稳定性、循环半衰期、组织半衰期、组织净积累或毒性的阳离子脂质。特别地，可以选择阳离子脂质，使得混合的LNP的性质比单种脂质的单一LNP的性质更理想。
可以考虑RNA货物的量来选择永久性阳离子脂质或类脂的量。在一种实施方案中，可以选择这些量以使得组合物中纳米颗粒的N/P比是约0.1至约20。在这种情况下，N/P比定义为脂质或类脂中含有碱性氮的基团中的氮原子(“N”)与用作货物的RNA中的磷酸基团(“P”)的摩尔比。N/P比可以基于例如1μgRNA通常包含约3纳摩尔磷酸残基的情况来计算，前提是RNA显示出碱基的统计分布。脂质或类脂的“N”值可以基于其分子量和永久性阳离子和——如果存在的话——可阳离子化的基团的相对含量来计算。
LNP的体内特征和行为可以通过在LNP表面添加亲水聚合物涂层例如聚乙二醇(PEG)来修饰，以赋予空间稳定性。此外，LNP可以通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)附着在LNP表面或附着的PEG链的末端(例如通过聚乙二醇化脂质)用于特异性靶向。
在一些实施方案中，LNP包含聚合物缀合脂质。术语“聚合物缀合脂质”指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物聚合脂质的实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域中已知的，并包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
在特定的实施方案中，LNP包含其他的稳定化脂质，其为聚乙二醇脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的甘油二酯、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在优选的实施方案中，聚乙二醇脂质是PEG-2000-DMG。在一个实施方案中，聚乙二醇脂质是PEG-c-DOMG)。在其他实施方案中，LNP包括聚乙二醇化甘油二酯(PEG-DAG)例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、聚乙二醇琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)例如4-O-(2’，3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或者聚乙二醇二烷氧基丙基氨基甲酸酯例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2，3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2，3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在第二方面优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP还包括式(IV)的聚乙二醇化脂质：
或其药学上可接受的盐、其互变异构体或立体异构体，其中R8和R9各自独立地是含有10个至30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多于一个酯键中断；且w的平均值是30至60。
在根据式(IV)的聚乙二醇化脂质的一些前述实施方案中，当w是42时，R8和R9不都是正十八烷基。在一些其他实施方案中，R8和R9各自独立地是含有10个至18个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有12个至16个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有12个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有14个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是含有16个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在另外的实施方案中，R8和R9各自独立地是含有18个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方案中，R8是含有12个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，且R9是含有14个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链。
在各种实施方案中，可选择w的范围，使根据式(IV)的聚乙二醇化脂质的PEG部分的平均分子量是约400g/mol至约6000g/mol。在一些实施方案中，w平均值是约50。
在第二方面优选的实施方案中，根据式(IV)的聚乙二醇化脂质的R8和R9是饱和烷基链。
在第二方面特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP还包括聚乙二醇化脂质，其中聚乙二醇脂质具有式(IVa)
其中n的平均值是30至60，例如约28至约32、约30至约34、32至约36、约34至约38、36至约40、约38至约42、40至约44、约42至约46、44至约48、约46至约50、48至约52、约50至约54、52至约56、约54至约58、56至约60、约58至约62。在优选的实施方案中，n是约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54。在最优选的实施方案中，n的平均值是49。
在其他实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构之一：
其中n是整数，选择n的数值使得聚乙二醇化脂质的平均分子量是约2500g/mol，最优选地n是约49。
适用于本上下文中的聚乙二醇脂质的其他实例见US2015/0376115A1和WO2015/199952，每项的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，LNP包含基于LNP中脂质的总摩尔量的小于约百分之3摩尔、百分之2摩尔或百分之1摩尔的PEG或PEG修饰的脂质。在其他实施方案中，LNP包含约0.1摩尔％至约20摩尔％的PEG修饰的脂质，例如约0.5摩尔％至约10摩尔％、约0.5摩尔％至约5摩尔％、约10摩尔％、约5摩尔％、约3.5摩尔％、约3摩尔％、约2.5摩尔％、约2摩尔％、约1.5摩尔％、约1摩尔％、约0.5摩尔％或约0.3摩尔％(基于LNP中脂质的总摩尔量)。在优选的实施方案中，LNP包含约1.0摩尔％至约2.0摩尔％的PEG修饰的脂质，例如约1.2摩尔％至约1.9摩尔％、约1.2摩尔％至约1.8摩尔％、约1.3摩尔％至约1.8摩尔％、约1.4摩尔％至约1.8摩尔％、约1.5摩尔％至约1.8摩尔％、约1.6摩尔％至约1.8摩尔％，特别是约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％，最优选地约1.7摩尔％(基于LNP中脂质的100％总摩尔量)。在各种实施方案中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比是约100∶1至约25∶1。
在优选的实施方案中，LNP还包括一种或多于一种其他脂质，这些脂质可以在其形成过程中稳定颗粒的形成(例如中性脂质和/或一种或多于一种类固醇或类固醇类似物)。
在第二方面优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP还包括一种或多于一种中性脂质和/或一种或多于一种类固醇或类固醇类似物。
合适的稳定化脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质中的任一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
在第二方面的实施方案中，LNP还包含一种或多于一种中性脂质，其中中性脂质选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-双甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1，2-二反油酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(transDOPE)或其混合物。
在一些实施方案中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比是约2∶1至约8∶1。
在第二方面优选的实施方案中，中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。阳离子脂质与DSPC的摩尔比可以是约2∶1至约8∶1。
在第二方面优选的实施方案中，类固醇是胆固醇。阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可以是约2∶1至约1∶1。
在一些实施方案中，胆固醇可以是聚乙二醇化的。
固醇可以是脂质颗粒的约10摩尔％至约60摩尔％或约25摩尔％至约40摩尔％。在一种实施方案中，固醇是脂质颗粒中存在的所有脂质的约10摩尔％、约15摩尔％、约20摩尔％、约25摩尔％、约30摩尔％、约35摩尔％、约40摩尔％、约45摩尔％、约50摩尔％、约55摩尔％或约60摩尔％。在其他实施方案中，LNP包含约5摩尔％至约50摩尔％的固醇，例如约15摩尔％至约45摩尔％、约20摩尔％至约40摩尔％、约48摩尔％、约40摩尔％、约38.5摩尔％、约35摩尔％、约34.4摩尔％、约31.5摩尔％或约31摩尔％(基于脂质纳米颗粒中脂质的100％的总摩尔数)。
优选地，脂质纳米颗粒(LNP)包含：(a)至少一种第一方面的编码RNA，(b)阳离子脂质，(c)抗聚集剂(例如聚乙二醇脂质(PEG)或PEG修饰的脂质)，(d)任选地，非阳离子脂质(例如中性脂质)，和(e)任选地，固醇。
在一些实施方案中，阳离子脂质(如上文定义的)、非阳离子脂质(如上文定义的)、胆固醇(如上文定义的)和/或PEG修饰的脂质(如上文定义的)可以以各种相对摩尔比进行组合。例如，相应地，阳离子脂质与非阳离子脂质与基于胆固醇的脂质与聚乙二醇化脂质的比可以是约30-60∶20-35∶20-30∶1-15，或者分别是约40∶30∶25∶5、50∶25∶20∶5、50∶27∶20∶3、40∶30∶20∶10、40∶32∶20∶8、40∶32∶25∶3或40∶33∶25∶2的比例，或者是约50∶25∶20∶5、50∶20∶25∶5、50∶27∶20∶3、40∶30∶20∶10、40∶30∶25∶5或40∶32∶20∶8、40∶32∶25∶3或40∶33∶25∶2的比例。
在一些实施方案中，LNP包括式(III)的脂质、至少一种如本文定义的编码RNA、中性脂质、固醇和聚乙二醇化脂质。在优选的实施方案中，式(III)的脂质是脂质化合物III-3，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇，聚乙二醇化脂质是式(IVa)的化合物。
在第二方面优选的实施方案中，LNP基本上组成为(i)至少一种阳离子脂质；(ii)中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)聚乙二醇脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的固醇：0.5％至15％的聚乙二醇脂质。
在第二方面特别优选的实施方案中，第一方面的编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)，其中LNP基本上组成为
(i)至少一种如本文定义的阳离子脂质，优选式(III)的脂质，更优选脂质III-3；
(ii)如本文定义的中性脂质，优选1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)如本文定义的类固醇和或类固醇类似物，优选胆固醇；和
(iv)如本文定义的聚乙二醇脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选式(IVa)的聚乙二醇化脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质：5％至25％的中性脂质：25％至55％的固醇：0.5％至15％的聚乙二醇脂质。
在一个优选的实施方案中，脂质纳米颗粒包括：式(III)的阳离子脂质和/或式(IV)的聚乙二醇脂质，任选地中性脂质，优选地1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和任选地固醇，优选胆固醇，其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比任选地是约2∶1至8∶1，其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比任选地是约2∶1至1∶1。
在特别优选的实施方案中，包含第一方面的编码RNA的第二方面的组合物包含脂质纳米颗粒(LNP、LNP-III-3)，其摩尔比为大约50∶10∶38.5∶1.5，优选大约47.5∶10∶40.8∶1.7，或更优选47.4∶10∶40.9∶1.7(即，阳离子脂质(优选脂质III-3)、DSPC、胆固醇和聚乙二醇脂质(优选式(IVa)的聚乙二醇脂质，其中n＝49)的比例(摩尔％)；溶解于乙醇中)。
脂质纳米颗粒中RNA的总量可以改变，并根据例如RNA与总脂质的重量/重量比来定义。在本发明的一个实施方案中，编码RNA与总脂质的比小于0.06重量/重量，优选0.03重量/重量至0.04重量/重量。
在一些实施方案中，包含第一方面的编码RNA的第二方面的组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)，其仅由三种脂质组分组成，即咪唑胆固醇酯(ICE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。
在各种实施方案中，如本文定义的LNP的平均直径是约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70nm至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm，或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm，并且是基本上无毒的。如本文中所使用的，平均直径可以由如本领域通常已知的通过动态光散射测定的z-平均来表示。
纳米颗粒的多分散性指数(PDI)通常是0.1至0.5。在特定的实施方案中，PDI低于0.2。通常，PDI是由动态光散射测定的。
在本发明另一种优选的实施方案中，脂质纳米颗粒的流体力学直径分别是约50nm至约300nm或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm或约60nm至约120nm。
在本发明另一种优选的实施方案中，脂质纳米颗粒的流体力学直径分别是约50nm至约300nm或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm或约60nm至约120nm。
在组合物中包含多于一种或多种例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种第一方面的RNA的实施方案中，所述多于一种或者所述多种例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种RNA可以与一种或多于一种脂质复合，从而形成包含多于一种或多种例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种不同RNA的LNP。
在实施方案中，如本文所述的LNP可进行冻干以提高制剂和/或RNA的储存稳定性。在实施方案中，如本文所述的LNP可进行喷雾干燥以提高制剂和/或RNA的储存稳定性。用于冻干和/或喷雾干燥的冻干保护剂可选自海藻糖、蔗糖、甘露糖、右旋糖酐和菊糖。
在一个实施方案中，本发明中使用的脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、固醇；中性脂质；和聚合物缀合脂质，优选聚乙二醇化脂质。优选地，聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质或聚乙二醇脂质。在特定实施方案中，脂质纳米颗粒包括类似于阳离子脂质
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15；NOF Corporation，东京，日本)的阳离子脂质，其具有下式
如下文进一步描述的，这些脂质纳米颗粒被称为“GN01”。
此外，在特定的实施方案中，GN01脂质纳米颗粒包括中性脂质，其结构类似于1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)：
此外，在特定的实施方案中，GN01脂质纳米颗粒包含聚合物缀合脂质，优选聚乙二醇化脂质，1，2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)，其具有以下结构：
如在本领域中使用的，认为“DMG-PEG 2000”是1，2-DMG PEG2000和1，3-DMGPEG2000的混合物，比例为约97∶3。
因此，根据优选的实施方案之一的GN01脂质纳米颗粒(GN01-LNP)包括SS-EC阳离子脂质、中性脂质DPhyPE、胆固醇和聚合物缀合脂质(聚乙二醇化脂质)1，2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
在优选的实施方式中，GN01 LNP包括：
(a)量为45摩尔％至65摩尔％的阳离子脂质SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15；NOFCorporation，东京，日本)；
(b)量为25摩尔％至45摩尔％的胆固醇；
(c)量为8摩尔％至12摩尔％的DPhyPE；和
(d)量为1摩尔％至3摩尔％的PEG-DMG 2000；
每一种的量均相对于GN01脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在更优选的实施方案中，如本文所述的GN01脂质纳米颗粒包含59摩尔％的阳离子脂质、10摩尔％的中性脂质、29.3摩尔％的固醇和1.7摩尔％的聚合物缀合脂质，优选聚乙二醇化脂质。在最优选的实施方案中，如本文所述的GN01脂质纳米颗粒包含59摩尔％的阳离子脂质SS-EC、10摩尔％的DPhyPE、29.3摩尔％的胆固醇和1.7摩尔％的DMG-PEG 2000。
阳离子脂质的量相对于GN01脂质纳米颗粒中mRNA化合物的量也可表示为重量比(缩写为例如“m/m”)。例如，GN01脂质纳米颗粒中包含的mRNA化合物的量使脂质与mRNA的重量比是约20至约60，或约10至约50。在其他实施方案中，阳离子脂质与核酸或mRNA的比是约3至约15，例如约5至约13、约4至约8或约7至约11。在本发明非常优选的实施方案中，总脂质/mRNA的质量比是约40或40，即，质量过量约40倍或40倍，以确保mRNA的包封。另一种优选的RNA/脂质比是约1至约10、约2至约5、约2至约4或优选地约3。
此外，可以考虑核酸货物例如mRNA化合物的量来选择阳离子脂质的量。在一种实施方案中，N/P比可以是约1至约50。在另一种实施方案中，该比例是约1至约20、约1至约10、约1至约5。在一种优选的实施方案中，可以选择这些量以使得GN01脂质纳米颗粒或组合物的N/P比是约10至约20。在其他非常优选的实施方案中，N/P是14(即正电荷摩尔过量14倍，以确保mRNA的包封)。
在本发明的GN01脂质纳米颗粒的特别优选的实施方案中，使用59摩尔％的阳离子脂质
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15，见实施例部分；NOF Corporation，东京，日本)、29.3摩尔％的胆固醇作为类固醇、10摩尔％的DPhyPE作为中性脂质/磷脂和1.7摩尔％的DMG-PEG 2000作为聚合物聚合脂质。所述LNP组合物在本文中以及在工作实施例中被称为“GN01”。SS-EC在pH值为4时带正电，在pH值为7时为中性，这有利于本发明的LNP和制剂/组合物。与使用DPhyPE有关的其他发明优点是由于庞大的尾部而具有高的融合能力，由此它能够以高水平与核内体的脂质融合。对于“GN01”，N/P(脂质与mRNA的摩尔比)优选是14，且总脂质/mRNA的重量比优选是40(m/m)。
佐剂：
根据其他实施方案，第二方面的组合物可以包含至少一种佐剂。适当地，优选地添加佐剂以增强组合物的免疫刺激性能。
在本文中使用的术语“佐剂”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指药剂和/或免疫剂，其可以修饰例如增强其他试剂的效果(在本文中：编码RNA的效果)，或者其可以适用于支持组合物的施用和递送。术语“佐剂”指代广谱物质。通常，这些物质能够提高抗原的免疫原性。例如，佐剂应当能够被先天性免疫系统识别，并例如可以引起先天性免疫应答(即，非特异性免疫应答)。“佐剂”通常不引起适应性免疫应答。在本发明的上下文中，佐剂可以增强由编码RNA提供的抗原肽或蛋白的效果。在这种情况下，至少一种佐剂可以选自技术人员已知并且适用于当前情况的任何佐剂，即支持在对象例如人类对象中诱导免疫应答。
因此，第二方面的组合物可以包含至少一种佐剂，其中所述至少一种佐剂可以适当地选自WO2016/203025中提供的任何佐剂。在WO2016/203025的权利要求2至17中任一项公开的佐剂，优选地WO2016/203025的权利要求17中公开的佐剂是特别合适的，其相关的具体内容通过引用并入本文。
除了本文所述的组分外，第二方面组合物可以包括至少一种其他组分，所述其他组分可以选自其他抗原(例如肽或蛋白的形式)或其他编码抗原的核酸；其他免疫治疗剂；一种或多于一种辅助物质(细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子)；或任何其他化合物，所述化合物由于其对人Toll样受体的结合亲和力(作为配体)而已知具有免疫刺激；和/或佐剂核酸，优选免疫刺激的RNA(isRNA)，例如CpG-RNA等。
疫苗：
在第三方面，本发明提供了疟疾疫苗，其中该疫苗包括第一方面的编码RNA，和任选地第二方面的组合物。
值得注意的是，涉及第二方面的组合物的实施方案同样可以阅读并理解为第三方面的疫苗的合适的实施方案。并且，同样可以阅读涉及第三方面的疫苗的实施方案并理解为第二方面的组合物(包含第一方面的RNA)的合适的实施方案。
术语“疫苗”是本领域一般技术人员所认识并理解的，例如，旨在指提供至少一种表位或抗原，优选免疫原的预防性材料或治疗性材料。在本发明的上下文中，抗原或抗原功能是由发明的第一方面的编码RNA(所述RNA包含编码衍生自CSP的抗原肽或蛋白的编码序列)或者第二方面的组合物(包含第一方面的RNA)所提供的。
在第三方面优选的实施方案中，包含第一方面的RNA或第二方面的组合物的疫苗引起适应性免疫应答，优选针对疟原虫的适应性免疫应答。
在第三方面优选的实施方案中，包含第一方面的RNA或第二方面的组合物的疫苗诱导强烈的体液或细胞免疫应答，优选强烈的CD4+和CD8+T细胞应答。
根据第三方面优选的实施方案，本文中定义的疫苗还可以包含药学上可接受的载体和任选地至少一种如第二方面的上下文中所述的佐剂。
在上下文中，合适的佐剂可以选自WO2016/203025的权利要求17中公开的佐剂。
在优选的实施方案中，疫苗是单价疫苗。
在实施方案中，疫苗是多价疫苗，其包含多种或至少多于一种如第一方面的上下文中定义的编码RNA种类。同样可以阅读与在第二方面的上下文中公开的多价组合物相关的实施方案并理解为第三方面的多价疫苗的合适的实施方案。
第三方面的疫苗通常包括安全和有效量的第一方面的编码RNA。如本文所使用的，“安全和有效量”是指足以显著诱导与疟原虫感染有关的疾病或病症的积极改变的编码RNA的量。同时，“安全和有效量”足够小，以避免严重的副作用。关于本发明的疫苗或组合物，表述“安全和有效量”优选地指编码RNA的量，其适于刺激适应性免疫系统，既不会产生过度或破坏性免疫应答，优选地也不会产生低于可测量水平的免疫应答。
如上文定义的组合物或疫苗的编码RNA的“安全和有效量”还会因在随行医生的知识和经验范围内的以下条件而变化：待治疗的特定状况和待治疗患者的年龄和身体状况、病况的严重程度、治疗持续时间、伴随治疗的性质、所使用的特定药学上可接受的载体的性质以及类似的因素。此外，编码RNA、组合物、疫苗的“安全和有效量”可以取决于施用途径(皮内、肌内)、施用装置(喷射注射、针头注射、微针贴片)、和/或复合(鱼精蛋白复合或LNP包封)。此外，编码RNA、组合物、疫苗的“安全和有效量”可以取决于待治疗对象的状况(婴儿、孕妇、免疫功能不全的人类对象等)。因此，合适的“安全和有效量”必须相应地调整并由技术人员选择和定义”。
在一些实施方案中，“安全和有效量”是指等于重组疟疾蛋白疫苗标准治疗剂量至少减少至2分之一、至少4分之一、至少10分之一、至少100分之一、至少1000分之一的剂量，其中在对象中产生的抗抗原多肽抗体滴度等于在施用了标准治疗剂量的重组疟疾蛋白疫苗、纯化的疟疾蛋白疫苗、减毒疟疾活疫苗、灭活疟疾疫苗或疟疾VLP疫苗的对照对象中产生的抗抗原多肽抗体滴度。在一些实施方案中，对照是在施用了包含疟疾的结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)疫苗的对象中产生的抗抗原多肽抗体滴度。
根据本发明疫苗可以作为药物组合物或者疫苗用于人类医药目的，以及兽医医药目的(哺乳动物、脊椎动物、鸟类物种)。
因此，本文中使用的药学上可接受的载体优选地包括本发明的疫苗的液体或非液体基质。如果本发明的疫苗以液体形式提供，则载体会是水，通常为无热原水；等渗盐水或缓冲(含水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。优选地，如WO2006/122828中所述，将乳酸林格氏液用作根据本发明的疫苗或组合物的液体基质，其中与合适的缓冲液相关的公开内容通过引用并入本文。
确定本文所定义的药学上可接受的载体的选择原则上由根据本发明的药物组合物或疫苗的施用方式来确定。疫苗优选地局部施用。局部施用的途径通常包括例如局部施用途径，以及皮内、透皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内、关节内和舌下注射。更优选地，根据本发明的组合物或疫苗可以通过皮内、皮下或肌内途径施用，优选通过注射施用，其可以是无针注射和/或针头注射。因此，组合物/疫苗优选地配制成液体或固体形式。待施用的根据本发明的疫苗或组合物的合适量可以通过常规实验来确定，例如通过使用动物模型确定。这些模型包括但不限于兔、羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。用于注射的优选的单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。这种溶液的pH值应调整至约7.4。用于注射的合适的载体包括水凝胶、用于控制释放或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原蛋白基质。
如本文定义的本发明的疫苗或组合物还可以包括一种或多于一种如上文所述的辅助物质，以进一步提高免疫原性。由此优选地实现了本发明的组合物/疫苗中包含的编码RNA和辅助物质的协同作用，所述辅助物质任选地可以与如上文所述的本发明的疫苗或组合物共同配制(或分别配制)。这些增强免疫原性的试剂或化合物可以分别提供(不与本发明的疫苗或组合物共同配制)并单独施用。
本发明的疫苗或组合物中可以包括的其他添加剂为乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如月桂醇硫酸钠；着色剂；增味剂；药物载体；成片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
试剂盒或成套试剂盒、应用、医药用途、治疗方法：
在第四方面，本发明提供了试剂盒或成套试剂盒，其中所述试剂盒或成套试剂盒包含第一方面的编码RNA、第二方面的组合物(包含所述RNA)和/或第三方面的疫苗。此外，第四方面的试剂盒或成套试剂盒可以包含用于溶解的液体载剂和/或提供关于组分的施用和剂量的信息的技术说明。
试剂盒还可以包含第二方面的组合物和/或第三方面的疫苗的上下文中所述的其他组分。
所述试剂盒的技术说明可以包括关于施用和剂量以及患者组的信息。这种试剂盒，优选成套试剂盒，可以应用于例如本文提到的任意应用或用途，优选第一方面的编码RNA、第二方面的组合物或第三方面的疫苗的用途，用于治疗或预防疟原虫引起的感染或疾病或与之相关的病症。优选地，在试剂盒的单独部分中提供第一方面的编码RNA、第二方面的组合物或第三方面的疫苗，其中第一方面的编码RNA、第二方面的组合物或第三方面的疫苗优选地是冻干的。试剂盒还可以包含溶解第一方面的编码RNA、第二方面的组合物或第三方面的疫苗的载体(例如缓冲溶液)作为一部分。
在优选的实施方案中，如本文中定义的试剂盒或成套试剂盒包含乳酸林格氏液。
上述试剂盒中任意一种均可用于如本文定义的治疗或预防。更优选地，上述试剂盒中任一种均可用作疫苗，优选如本文所述的针对由疟原虫引起的感染的疫苗。
医药用途：
在其他方面，本发明涉及第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒的第一医药用途。
因此，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒用于药物。
本发明还提供了第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒的几种应用和用途。
特别地，所述RNA、组合物、疫苗或者试剂盒或成套试剂盒可以用于人类医药目的和兽医医药目的，优选用于人类医药目的。
特别地，所述RNA、组合物、疫苗或者试剂盒或成套试剂盒用作人类医药目的的药物，其中所述RNA、组合物、疫苗或者试剂盒或成套试剂盒可以特别地适用于小婴儿、新生儿、免疫功能不全的受者、以及孕妇和哺乳期妇女和老年人。
在另一个方面，本发明涉及第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒的第二医药用途。
在实施方案中，第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒用于治疗或预防病原体(例如原生动物寄生虫)感染，特别是疟原虫感染，或者与这种感染相关的病症。
在实施方案中，第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒用于治疗或预防疟原虫的感染，特别是恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)和间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫curtisi亚种(Poc)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Pow)或伯氏疟原虫(Pb)的感染。
在优选的实施方案中，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒用于治疗或预防恶性疟原虫(Pf)感染。
特别地，第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒可以用于治疗或预防疟原虫的感染，特别是恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)和间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫curtisi亚种(Poc)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Pow)或伯氏疟原虫(Pb)的感染，或者与这种感染相关的病症，用于人类医药目的和兽医医药目的，优选用于人类医药目的。
如本文中使用的，“与疟疾感染相关的病症”可以优选地包括疟疾感染的典型症状或并发症。
特别地，第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒可以用于预防(暴露前预防或暴露后预防)和/或治疗处理由疟原虫引起的感染的方法。
如本文定义的组合物或疫苗可以优选地局部施用。特别地，组合物或疫苗可以通过皮内、皮下、鼻内或肌内途径施用。本发明的组合物或疫苗因此优选地配制成液体(或者是固体)形式。在实施方案中，本发明的疫苗可以通过常规的针头注射或无针喷射注射来施用。优选地在上下文中，RNA、组合物、疫苗通过肌内针头注射施用。
本文中使用的术语“喷射注射”指无针注射方法，其中，将含有例如至少一种第一方面的RNA的液体(本发明的疫苗、组合物)强制通过孔口，从而产生能够根据注射设置穿透哺乳动物皮肤、皮下组织或肌肉组织的超细高压液体流。原则上，液体流穿透皮肤，通过皮肤将液体流推入目标组织。优选地，喷射注射用于本文公开的RNA、组合物、疫苗的皮内、皮下或肌内注射。
在实施方案中，包含在如本文定义的组合物或疫苗中的RNA的提供的量是约100ng至约500μg、量是约1μg至约200μg、量是约1μg至约100μg、量是约5μg至约100μg，优选量是约10μg至约50μg，特别地，量是约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg。
在一些实施方案中，包含编码RNA的疫苗以在对象中产生抗原特异性免疫应答的有效量来配制。在一些实施方案中，所述有效量指总剂量是1μg至200μg、1μg至100μg或5μg至100μg。
在一些实施方案中，对象是约5岁或者小于约5岁的对象。例如，对象的年龄可以是约1岁至约5岁(例如约1岁、约2岁、约3岁、约4岁或约5岁)，或者年龄是约6个月至约1岁(例如约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约12个月)。在一些实施方案中，对象是约12个月或小于约12个月(例如是约12个月、约11个月、约10个月、约9个月、约8个月、约7个月、约6个月、约5个月、约4个月、约3个月、约2个月或约1个月)的对象。在一些实施方案中，对象是约6个月或者小于约6个月的对象。
在一些实施方案中，对象是年龄为约20岁至约50岁(例如约20岁、约25岁、约30岁、约35岁、约40岁、约45岁或约50岁)的成人。在一些实施方案中，对象是约60岁、约70岁或大于约70岁(例如约60岁、约65岁、约70岁、约75岁、约80岁、约85岁或约90岁)的老年对象。
在一些实施方案中，对象已经暴露于疟疾。
依据施用途径(皮内、肌内、鼻内)、施用装置(喷射注射、针头注射、微针贴片)和/或复合(优选LNP包封)以及患者组，合适量应相应地调整并由技术人员选择和定义。
在一个实施方案中，用于对象的治疗或预防疟疾的免疫方案包括组合物或疫苗的一次单次给药。
在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的5μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的10μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的20μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的30μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的40μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的50μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的100μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是在一次疫苗接种中给对象施用的200μg的剂量。
在优选的实施方案中，用于治疗或预防如本文定义的感染的免疫方案，即针对疟疾使对象免疫的免疫方案，通常包括组合物或疫苗的一系列单次给药。本文中使用的单次给药，分别指初次/第一次给药、第二次给药或任何其他给药，优选地这样施用以“加强”免疫应答。
在优选的实施方案中，用于治疗或预防如本文定义的感染的免疫方案，即针对疟疾使对象免疫的免疫方案，包括在第一次(初次)免疫和第二次(加强)免疫之间的延长注射间隔。
发明人可以证明，延长在初次疫苗接种和加强疫苗接种之间的注射间隔可以增强体液免疫应答(参见例如实施例12)。
在更优选的实施方案中，用于治疗或预防如本文定义的感染的免疫方案包括延长在第0天的第一次(初次)免疫和第56天的第二次(加强)免疫之间的注射间隔。
在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的5μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的10μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的20μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的30μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的40μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的50μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的100μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是共分两次给对象施用的200μg的剂量。
在优选的实施方案中，疫苗/组合物使对象对疟疾(例如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和/或卵形疟原虫)免疫超过2年、3年、4年或者5年至10年。
治疗和使用方法，诊断方法和用途：
在另一个方面，本发明涉及治疗或预防病症的方法。
在优选的实施方案中，本发明涉及治疗或预防病症的方法，其中所述方法包括给需要的对象应用或施用第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒。
在优选的实施方案中，病症指疟原虫的感染，特别是恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)和间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫curtisi亚种(Poc)、卵形疟原虫wallikeri亚种(Pow)或伯氏疟原虫(Pb)的感染，或者与这些感染相关的病症。
在优选的实施方案中，本发明涉及治疗或预防如上文所述的病症的方法，其中所述方法包括给有需要的对象应用或施用第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒，其中有需要的对象优选是哺乳动物对象。在特别优选的实施方案中，哺乳动物对象是人类对象，特别是婴儿、新生儿、孕妇、哺乳期妇女、老年人或免疫功能不全的人类对象。
特别地，这种方法可以优选地包括以下步骤：
a)提供第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒；
b)将所述第一方面的RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒应用或施用至组织或生物体；
c)任选地，施用针对疟原虫的免疫球蛋白(IgG)；
d)任选地，施用其他物质(佐剂、辅助物质、其他抗原、疫苗)。
根据其他方面，本发明还提供了包含衍生自疟原虫的至少一种肽或蛋白或其片段或变体的至少一种多肽的表达方法，其中所述方法优选地包括以下步骤：
a)提供第一方面的编码RNA或第二方面的组合物；和
b)将所述编码RNA或组合物应用或施用到表达系统(细胞)、组织或生物体。
该方法可以应用于实验室、研究、诊断、肽或蛋白质的商业生产和/或用于治疗目的。该方法还可以在治疗特定疾病的情况下实施，特别是在治疗传染病，特别是疟疾感染的情况下实施。
同样地，根据另一方面，本发明还提供了第一方面的编码RNA、第二方面的组合物、第三方面的疫苗或者第四方面的试剂盒或成套试剂盒优选地用于诊断或治疗目的中的用途，例如用于编码的疟疾抗原肽或蛋白的表达中的用途，例如，通过将所述编码RNA、包含所述RNA的组合物、包含所述编码RNA的疫苗应用或施用到例如无细胞的表达系统、细胞(例如表达宿主细胞或体细胞)、组织或者生物体。在特定实施方案中，在将所述编码RNA、包含所述编码RNA的组合物、包含所述编码RNA的疫苗应用或施用到组织或生物体之后，通过例如获得诱导的疟疾抗体如疟疾特异性(单克隆)抗体的步骤。
该用途可应用于(诊断)实验室、研究、诊断、肽、蛋白质或疟疾抗体的商业生产和/或用于治疗目的。该用途可以在体外、体内或离体进行。该用途还可在治疗特定疾病的情况下进行，特别是在治疗疟疾感染或相关病症的情况下进行。
优选的实施方案/条款的列表
在下文中提供了本发明特别优选的实施方案(条款1至58)。
条款
1.一种用于疫苗的编码RNA，其包含
a)至少一个异源5’非翻译区(5’-UTR)和/或至少一个异源3’非翻译区(3’-UTR)；和
b)可操作地连接到所述3’-UTR和/或5’-UTR的至少一个编码序列，该编码序列编码衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白，或者其免疫原性片段或免疫原性变体。
2.根据条款1所述的编码RNA，其中疟原虫选自恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)或间日疟原虫(Pv)。
3.根据条款1或2所述的编码RNA，其中疟原虫是恶性疟原虫(Pf)，优选恶性疟原虫3D7。
4.根据条款1至3中任一项所述的编码RNA，其中编码序列编码来自疟原虫的CSP的至少一种抗原蛋白，所述抗原蛋白与SEQ ID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080-10085中任一项或其任意免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
5.根据条款1至4中任一项所述的编码RNA，其中编码序列编码至少一种更全长的CSP或其免疫原性片段或免疫原性变体。
6.根据条款1至5中任一项所述的编码RNA，其中编码序列还编码至少一种异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自异源信号肽、接头、辅助表位、抗原聚类结构域或跨膜结构域。
7.根据条款6所述的编码RNA，其中异源信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6208的SPARC、根据SEQ ID NO：6207的HsIns-iso1、根据SEQ ID NO：6205的HsALB、根据SEQ ID NO：6206的IgE，或这些中任一项的片段或变体，其中特别优选HsALB。
8.根据条款6所述的编码RNA，其中接头元件是选自SEQ ID NO：6241-6244、10141、10147的元件(L)。
9.根据条款8所述的编码RNA，其中至少一种接头元件将优选地选自SEQ ID NO：2100、2101、2102、2113、10083、10084的至少一种CSP衍生的T细胞表位与CSP片段组合，和/或其中CSP片段优选地与根据_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE、_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)、_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)的C-端组合。
10.根据条款6所述的编码RNA，其中辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6272的P2辅助表位、根据SEQ ID NO：6273的PADRE、根据SEQ ID NO：6274的HBsAg，或者这些中任一项的片段或变体。
11.根据条款6所述的编码RNA，其中抗原聚类结构域衍生自根据SEQ ID NO：10162的铁蛋白、根据SEQ ID NO：10153的2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)、根据SEQ ID NO：6274的乙型肝炎病毒(HBsAg)的表面抗原，或者这些中任一项的片段或变体。
12.根据条款6所述的编码RNA，其中跨膜结构域衍生自根据SEQ ID NO：6302或者其片段或变体的HA跨膜结构域。
13.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种抗原蛋白包括，优选地在N-端至C-端方向上包括：
a)任选地，一种选自SEQ ID NO：6205-6208的异源分泌型信号序列；
b)衍生自疟原虫的CSP的至少一种蛋白，或其片段或变体；
c)任选地，选自SEQ ID NO：6272、6273或6274或其片段或变体的至少一种异源辅助表位；
d)任选地，选自SEQ ID NO：6274、10153或10162或其片段或变体的至少一种异源抗原聚类结构域，和
e)任选地，选自SEQ ID NO：6302或其片段或变体的至少一种异源跨膜结构域，
其中a)、b)、c)、d)和/或e)可以优选地通过选自SEQ ID NO：6241-6244、10141、10147的至少一种肽接头元件连接。
14.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白或者其免疫原性片段或免疫原性变体发生突变，以使得至少一个预测的或潜在的糖基化位点缺失。
15.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列编码与SEQID NO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080中任一项或这些中任一项的免疫原性片段或免疫原性变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列。
16.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括与SEQID NO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种核酸序列。
17.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括至少一种化学修饰或至少一种经修饰的核苷酸，优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。
18.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列是密码子被修饰的编码序列，其中由至少一种密码子被修饰的编码序列所编码的氨基酸序列与相应野生型编码序列所编码的氨基酸序列相比优选地不被修饰。
19.根据条款18所述的编码RNA，其中至少一种密码子被修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任何组合。
20.根据条款18或19所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括密码子被修饰的编码序列，所述密码子被修饰的编码序列包括与SEQ ID NO：：41-328、2161-2480、3293-6134、8754-8855、10092-10139中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
21.根据条款18至20中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括密码子被修饰的编码序列，所述密码子被修饰的编码序列包括与SEQ ID NO：41-328、8754-8855中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
22.根据条款18至121中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括G/C优化的编码序列，所述G/C优化的编码序列包括与SEQ ID NO：41-112、2161-2240、3293-3698、8754-8783、10092-10103中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
23.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA是mRNA、自我复制RNA、环状RNA或RNA复制子。
24.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA是mRNA。
25.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含5’-帽结构，优选地包含m7G、cap0、cap1、cap2、经修饰的cap0或经修饰的cap1结构，其中优选cap1结构。
26.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中RNA包含至少一种多聚腺苷酸序列和/或至少一种多聚胞苷酸序列，所述多聚腺苷酸序列优选包含30个至150个腺苷核苷酸，所述多聚胞苷酸序列优选包含10个至40个胞嘧啶核苷酸，其中优选具有约64个腺苷核苷酸(A64)或约100个腺苷核苷酸(A100)的多聚腺苷酸序列。
27.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中RNA包含(恰好)位于编码RNA的3’端的至少一种多聚腺苷酸序列。
28.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中RNA包含至少一种组蛋白茎环，其中所述组蛋白茎环优选地包含根据SEQ ID NO：6173或6174或者其片段或变体的核酸序列。
29.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种异源3’-UTR包含衍生自选自PSMB3、ALB7、α珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或者这些基因中任一项的同源物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
30.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中至少一种异源5’-UTR包含衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或者这些基因中任一项的同源物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列。
31.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其包含：
a-1.衍生自HSD17B4基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种5’-UTR，和衍生自PSMB3基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体至少一种3’-UTR；或者
a-3.衍生自SLC7A3基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种5’-UTR，和衍生自PSMB3基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种3’-UTR；或者
i-2.衍生自RPL32基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种5’-UTR，和衍生自ALB7基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种3’-UTR；或者
i-3.衍生自α-珠蛋白基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体的至少一种3’-UTR。
32.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA优选地在5’至3’方向上包括以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)任选地，催化性核酸分子的切割位点，优选如本文所述的催化性核酸分子的切割位点；
D)任选地，选自SEQ ID NO：6135-6156或其片段或变体的5’-UTR；
F)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139或其片段或变体的至少一种编码序列；
F)选自SEQ ID NO：6157至6172的3’-UTR；
G)任选地，包含约50个至约500个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环；
J)任选地，选自SEQ ID NO：6179-6200、10173-10196的3’端序列元件。
33.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含以下元件，优选地在5’端至3’方向上包含以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)根据如本文所述的a-1、a-2、a-3、a-4、a-5、b-1、b-2、b-3、b-4、b-5、c-1、c-2、c-3、c-4、c-5、d-1、d-2、d-3、d-4、d-5、e-1、e-2、e-3、e-4、e-5、e-6、f-1、f-2、f-3、f-4、f-5、g-1、g-2、g-3、g-4、g-5、h-1、h-2、h-3、h-4、h-5、i-1、i-2或i-3的3’-UTR和/或5’-UTR，其中优选a-1、a-3、i-2、i-3；
D)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO：37-328、8754-8855或其片段或变体的至少一种编码序列；
G)包含约50个至约500个腺苷，优选约64个至约100个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶，优选约30个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环。
34.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含以下元件，优选地在5’端至3’方向上包含以下元件：
A)选自m7G(5’)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)的5’-帽结构；
B)选自SEQ ID NO：6177或6178或其片段或变体的5’端起始元件；
C)根据a-1、a-3、i-2、i-3的3’-UTR和/或5’-UTR元件；
D)选自SEQ ID NO：6175、6176或其片段或变体的核糖体结合位点；
E)选自SEQ ID NO：44、80、116、152、188、224、260、296、8755(HsALB_Pf-CSP(19-397))或其片段或变体的至少一种编码序列；
G)包含约50个至约500个腺苷，优选约64个至约100个腺苷的多聚腺苷酸序列；
H)任选地，包含约10个至约100个胞嘧啶，优选约30个胞嘧啶的多聚胞苷酸序列；
I)任选地，选自SEQ ID NO：6173或6174的组蛋白茎环。
35.根据前述条款中的任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含或组成为与选自SEQ ID NO：329-2080、6312-8741、8856-10079的核酸序列或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
36.一种组合物，其包含至少一种如条款1至35中任一项所述的编码RNA，其中所述组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体。
37.根据条款36所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物，优选阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任何组合复合或结合，或者至少部分复合或结合。
38.根据条款37所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种脂质复合或结合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒、脂复合物和/或纳米脂质体。
39.根据条款38所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)。
40.根据条款39所述的组合物，其中LNP基本上组成为
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；和
(iv)至少一种聚乙二醇脂质，
其中(i)至(iv)的摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质，约5％至25％的中性脂质，约25％至55％的固醇，约0.5％至15％的聚乙二醇脂质。
41.根据条款40所述的组合物，其中LNP包括根据式III-3的阳离子脂质：
42.根据条款40至41中任一项所述的组合物，其中LNP包括聚乙二醇脂质，其中聚乙二醇脂质是式(IVa)的聚乙二醇脂质：
其中n的平均值是30至60，优选地其中n的平均值是约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54，最优选地其中n的平均值是49。
44.根据条款40至43中任一项所述的组合物，其中LNP包括一种或多于一种中性脂质和/或一种或多于一种类固醇或类固醇类似物。
45.根据条款44所述的组合物，其中中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，优选地其中阳离子脂质与DSPC的摩尔比是约2∶1至约8∶1。
46.根据条款44所述的组合物，其中类固醇是胆固醇，优选地其中阳离子脂质与胆固醇的摩尔比是约2∶1至约1∶1。
47.根据条款40所述的组合物，其中LNP包括
SS-EC。
48.根据条款40至47中任一项所述的组合物，其中LNP包括聚乙二醇脂质，其中聚乙二醇脂质是DMG-PEG 2000。
49.根据条款40和47至48中任一项所述的组合物，其中LNP还包括1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)和胆固醇。
50.根据条款40至49所述的组合物，其中LNP优选地选自LNP-GN01或LNP-III-3。
51.一种疫苗，其包括根据条款1至35中任一项所定义的编码RNA或根据条款36至50中任一项所定义的组合物。
52.根据条款51所述的疫苗，其中疫苗引起适应性免疫应答。
53.一种试剂盒或成套试剂盒，其包含根据条款1至35中任一项所述的编码RNA、根据条款36至50中任一项所定义的组合物和/或根据条款51至52中任一项所定义的疫苗，任选地包括用于溶解的液体载剂，以及任选地提供关于组分的施用和剂量的信息的技术说明。
54.根据条款1至35中任一项所定义的编码RNA、根据条款36至50中任一项所定义的组合物、根据条款51至52中任一项所定义的疫苗或根据条款53所述的试剂盒或成套试剂盒，用作药物。
55.根据条款1至35中任一项所定义的编码RNA、根据条款36至50中任一项所定义的组合物、根据条款51至52中任一项所定义的疫苗或根据条款53所定义的试剂盒或成套试剂盒，用于疟疾或者与这种感染相关的病症的治疗或预防。
56.一种治疗或预防病症的方法，其中所述方法包括给有需要的对象应用或施用根据条款1至35中任一项所定义的编码RNA、根据条款36至50中任一项所定义的组合物、根据条款51至52中任一项所定义的疫苗或根据条款53所定义的试剂盒或成套试剂盒。
57.根据条款56所述的方法，其中病症是疟疾感染或者与这种感染相关的病症。
58.根据条款56或57所述的方法，其中有需要的对象是哺乳动物对象，优选人类对象。
清单和表格的简要说明
清单1：疟原虫/疟原虫种和亚种及其相应的NCBI分类ID
清单2：合适的疟疾抗原的NCBI蛋白登录号
表1：优选的CSP抗原设计
表2：显示每种氨基酸的频率的人密码子使用表
表A：CSP抗原及相应的编码序列
表3：CSP片段及相应的编码序列
表4：异源元件和相应的编码序列
表5：本发明优选的编码序列
表6A：编码CSP的优选的mRNA构建体
表6B：编码CSP的优选的mRNA构建体
表7：适用于本发明的类脂
表8：衍生自式(III)的代表性脂质化合物
表9：编码本发明实施例中使用的CSP的mRNA构建体(参见实施例部分)
表B：GN01-LNP制剂的脂质纳米颗粒组合物概述
表10：实施例2的疫苗接种方案(参见实施例部分)
表C：用于ICS的CSP肽混合物
表11：实施例3的疫苗接种方案(参见实施例部分)
表12：实施例4的用于蛋白质印迹分析的RNA构建体(参见实施例部分)
表13A：实施例6的疫苗接种方案
表13B：实施例7的疫苗接种方案
表14：实施例8的疫苗接种方案
表15：实施例9的疫苗接种方案
表16：实施例10的疫苗接种方案
表17：实施例11的疫苗接种方案
表18：实施例12的疫苗接种方案
表19：实施例13的疫苗接种方案
表20：用于蛋白质印迹分析的RNA构建体
表21：实施例15中使用的mRNA构建体的概述
表22：根据实施例16.1的被动转移分析的概述
表23：实施例16.2的疫苗接种方案
表24：实施例17的动物分组和疫苗接种方案的实例
附图说明
图1显示，使用ELISA试验，配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。图1A：在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图1B：在疫苗接种后42天的IgG1和IgG2a终点滴度；图1C：在疫苗接种后56天的IgG1和IgG2a终点滴度。第1组和第2组：LNP配制的疫苗；第3组：NaCl 0.9％；第4组：鱼精蛋白配制的疫苗。疫苗接种方案见表10。其他细节在实施例2中提供。
图2显示，使用基于FACS的抗体检测试验，配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了结合CSP特异性抗体应答。图2A：疫苗接种后21天的阳性细胞；图2B：疫苗接种后42天的阳性细胞；图2C：疫苗接种后56天的阳性细胞。第1组和第2组：LNP配制的疫苗；第3组：NaCl0.9％；第4组：鱼精蛋白配制的疫苗。疫苗接种方案见表10。其他细节在实施例2中提供。
图3显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第56天)，配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组和第2组：LNP配制的疫苗；第3组：NaCl 0.9％；第4组：鱼精蛋白配制的疫苗。疫苗接种方案见表10。其他细节在实施例2中提供。
图4显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。显示了在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2终点滴度。A组至C组：LNP配制的CSP mRNA；D组：LNP配制的RTS，S mRNA；E组：阴性对照。疫苗接种方案见表11。其他细节在实施例3中提供。
图5显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。显示了在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2终点滴度。A组至C组：LNP配制的CSP mRNA；D组：LNP配制的RTS，S mRNA；E组：阴性对照。疫苗接种方案见表11。其他细节在实施例3中提供。
图6显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，LNP配制的编码CSP的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。A组至C组：LNP配制的CSP mRNA；D组：LNP配制的RTS，S mRNA；E组：阴性对照。疫苗接种方案见表11。其他细节在实施例3中提供。
图7显示，使用蛋白质印迹分析，编码不同CSP构建体设计的mRNA构建体在哺乳动物细胞中表达并分泌。A：R7111，B：R7641，C：R7642，D：R7643，E：R7647，F：R7649和G：R7650；M＝尺寸梯度(参见表12)。其他细节在实施例4中提供。
图8显示，使用ELISA试验，配制的编码CSP变体的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。图8A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图8B：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；第1组和第2组：LNP配制的CSP疫苗；第3组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表13A。其他细节在实施例6中提供。
图9显示，使用细胞内细胞因子染色试验，配制的编码不同CSP变体的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组和第2组：LNP配制的CSP疫苗；第3组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表13A。其他细节在实施例6中提供。
图10显示，使用ELISA试验，配制的编码不同CSP变体的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。图10A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图10B：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图10C：包被C-端肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图10D：包被C-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图10E：包被N-端肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图10F：包被N-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度。第1组至第3组：LNP配制的CSP疫苗；第4组：具有无关Poly：C RNA的LNP。疫苗接种方案见表13B。其他细节在实施例7中提供。
图11显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，配制的编码不同CSP变体的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组至第3组：LNP配制的CSP疫苗；第4组：具有无关Poly：C RNA的LNP。疫苗接种方案见表13B。其他细节在实施例7中提供。
图12显示，使用ELISA试验，配制的编码C-端截短的CSP的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。图12A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图12B：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图12C：包被C-端肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图12D：包被C-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度。第1组至第6组：LNP配制的CSP疫苗(C-端截短的)；第7组：具有Poly：C RNA的LNP。疫苗接种方案见表14。其他细节在实施例8中提供。
图13显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，配制的编码C-端截短的CSP的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。图13A：所有的组。图13B：仅第5组至第7组，以显示第5组和第6组的对比。第1组至第6组：LNP配制的CSP疫苗(C-端截短的)；第7组：具有Poly：C RNA的LNP。疫苗接种方案见表14。其他细节在实施例8中提供。
图14显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码具有不同C-端的CSP的mRNA在小鼠中诱导了体液免疫应答。图14A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图14B：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图14C：包被C-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图14D：包被N-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度。第1组至第8组：LNP配制的CSP疫苗(C-端不同)；第9组：LNP配制的无关RNA。疫苗接种方案见表15。其他细节在实施例9中提供。
图15显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，LNO配制的编码C-端不同的CSP的mRNA在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组至第8组：LNP配制的CSP疫苗(C-端不同)；第9组：LNP配制的不相关的RNA。疫苗接种方案见表15。其他细节在实施例9中提供。
图16显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码CSP的mRNA疫苗(N-端截短或者C-端的NANP重复区截短)在小鼠中诱导了体液免疫应答。图16A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图16B：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图16C：包被C-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图16D：包被N-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度。第1组至第8组：LNP配制的CSP疫苗(N-端截短或者C-端的NANP重复区截短)；第9组：LNP配制的无关RNA。疫苗接种方案见表16。其他细节在实施例10中提供。
图17显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，LNP配制的编码CSP的mRNA疫苗(N-端截短或者C-端的NANP重复区截短)在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组至第8组：LNP配制的CSP疫苗(N-端截短或者C-端的NANP重复区截短)；第9组：LNP配制的无关RNA。疫苗接种方案见表16。其他细节在实施例10中提供。
图18显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码CSP的加帽不同的mRNA疫苗在小鼠中诱导了体液免疫应答。图18A：包被：[NANP]7肽；在疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图18B：包被：[NANP]7肽或C-端肽或N-端肽；在疫苗接种后35天的IgG1终点滴度；图18C：包被：[NANP]7肽或C-端肽或N-端肽；在疫苗接种后35天的IgG2a终点滴度。第1组和第2组：LNP配制的加帽不同的mRNACSP疫苗；第3组：LNP配制的无关RNA。疫苗接种方案见表17。其他细节在实施例11中提供。
图19显示，使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，LNP配制的编码CSP的加帽不同的mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组和第2组：LNP配制的加帽不同的mRNA CSP疫苗；第3组：具有无关RNA的LNP。疫苗接种方案见表17。其他细节在实施例11中提供。
图20显示，使用ELISA试验，LNP配制的编码CSP的(加帽不同的)mRNA疫苗在小鼠中诱导了体液免疫应答。延长在初次疫苗接种和加强疫苗接种之间的注射间隔可以增强体液免疫应答。图20：包被：[NANP]7肽；所示的不同天数的IgG1和IgG2a终点滴度；第1组、第2组、第4组和第5组：具有加帽不同的CSP的LNP疫苗；第3组和第6组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表18。其他细节在实施例12中提供。
图21显示，使用细胞内细胞因子染色试验，配制的编码CSP的加帽不同的mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组、第2组、第4组和第5组：具有加帽不同的CSP的LNP疫苗；第3组和第6组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表18。其他细节在实施例12中提供。
图22显示，使用ELISA试验，与使用何种3’端无关，编码CSP的mRNA疫苗在小鼠中诱导了体液免疫应答。图22A：包被：[NANP]7肽；在首次疫苗接种后21天的IgG1和IgG2a终点滴度；图22B：包被：[NANP]7肽；在首次疫苗接种后35天的IgG1和IgG2a终点滴度；第1组至第6组：编码CSP的具有不同3’端和未经修饰或经修饰的尿嘧啶的mRNA疫苗；第7组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表19。其他细节在实施例13中提供。
图23显示，使用细胞内细胞因子染色试验，与使用何种3’端无关，编码CSP的mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。第1组至第6组：编码CSP的具有不同3’端和未经修饰或经修饰的尿嘧啶的mRNA疫苗；第7组：NaCl缓冲液。疫苗接种方案见表19。其他细节在实施例13中提供。
图24显示，无论使用何种3’端，表达都是相当的。N-端截短的CSP的构建体(G组和H组)显示出略微更高的表达。实验基本上如实施例14中所述的进行。更多细节参见表20。
图25显示，使用兔网织红细胞裂解物系统，编码疟疾CSP抗原的所有mRNA构建体都导致了可检测的蛋白质的表达。其他细节在实施例15和表21中提供。
图26显示了优选的CSP构建体/蛋白质设计的示意图；CSP：疟原虫的环子孢子蛋白(片段以氨基酸位置表示)；SP：异源信号肽；L：接头；HA-TM：流感HA的跨膜结构域；HBsAg：乙型肝炎表面抗原；破伤风：破伤风毒素的P2T细胞辅助表位；PADRE：泛HLA DR结合表位；铁蛋白：铁储存蛋白铁蛋白；2，4-二氧四氢蝶啶：2，4-二氧四氢蝶啶合酶。更多信息可以在表1中找到。
实施例
在下文中，呈现了说明本发明的各种实施方案和方面的特定实施例。然而，本发明的范围不应受本文所述具体实施方案的限制。给出以下制备方法和实施例，以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方案的限制，所述示例性实施方案仅旨在作为本发明的单个方面的说明，并且功能等同的方法落入本发明的范围内。实际上，根据本文的前述描述、附图和以下实施例，除本文所述的修改外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。所有这些修改均落入所附权利要求的范围内。
实施例1：RNA构建体、组合物和疫苗的制备
本实施例提供了获得本发明的编码RNA的方法，以及产生本发明的组合物或疫苗的方法。
1.1.DNA和mRNA构建体的制备
制备编码不同CSP蛋白的DNA序列并用于之后的RNA体外转录反应。为了稳定化和优化表达，所述DNA序列是通过引入G/C优化的编码序列来修饰野生型编码DNA序列而制备的(例如，“cds opt1”)。将序列引入pUC衍生的DNA载体以使其包含稳定3’-UTR序列和5’-UTR序列，还包含腺苷的延伸(例如A64或A100)，和任选地组蛋白茎环(hSL)结构，以及30个胞嘧啶的延伸(例如C30)(参见表9，a，CSP构建体设计的示意图参见图26)。
获得的质粒DNA构建体使用本领域中已知的常用方案在细菌中进行转化和繁殖。最后，提取、纯化质粒DNA构建体并用于之后的RNA体外转录(参见1.2节)。
或者，DNA质粒用作PCR扩增的模板(参见1.3节)。
1.2.由质粒DNA模板进行RNA体外转录：
使用限制性内切酶使根据1.1段制备的DNA质粒线性化，并在合适的缓冲液条件下，在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(例如m7GpppG)的存在下，使用T7 RNA聚合酶，来用于DNA依赖性RNA体外转录。将m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG帽类似物用于制备一些RNA构建体，以产生cap1结构(例如R8143、R8229、R8233、R8232、R8230、R8231、R8238)。获得的RNA构建体用RP-HPLC(
CureVac AG，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化，并用于体外和体内实验。表9中提供了产生的RNA序列/构建体，其中指出了编码的CSP构建体和相应的UTR元件(mRNA设计a-1(HSD17B4/PSMB3)、mRNA设计a-3(SLC7A3/PSMB3)、mRNA设计i-3(-/muag)和mRNA设计i-2(RPL32/ALB7))。CSP蛋白和片段衍生自恶性疟原虫3D7(XP_001351122.1、XM_001351086.1；本文中缩写为“Pf(3D7)”)或伯氏疟原虫ANKA(XP_022712148.1、XM_022858407.1；本文中缩写为“Pb(ANKA”))。
除了表9中提供的信息外，可以从ST.25序列表中<223>标识符提供的信息中获得与特定mRNA构建体SEQ ID NO有关的其他信息。
为获得经修饰的mRNA，在合适的缓冲液条件下，在经修饰的核苷酸混合物(ATP、GTP、CTP、假尿苷(ψ)或N1-甲基假尿苷(m1ψ))和帽类似物(m7GpppG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG)的存在下进行RNA体外转录。将获得的ψ-修饰的mRNA用RP-HPLC(
CureVac AG，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化，并用于进一步实验。
一些RNA构建体在无帽类似物的条件下进行体外转录。帽结构(cap1)使用本领域公知的加帽酶以酶促方式添加。简而言之，使用带有2’-O-甲基转移酶的m7G加帽试剂盒对体外转录的mRNA进行加帽，以获得cap1加帽的RNA。
例如根据WO2016/180430，在美国现行药品生产质量管理规范下生产用于临床开发的RNA，从而在DNA和RNA水平上实施各种质量控制步骤。
1.3.由PCR扩增DNA模板进行RNA体外转录：
在合适的缓冲液条件下，根据1.1段制备的纯化的PCR扩增DNA模板在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(m7GpppG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG)的存在下，使用DNA依赖性T7 RNA聚合酶进行体外转录。或者，在合适的缓冲液条件下，在经修饰的核苷酸混合物(ATP、GTP、CTP、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或假尿苷(ψ)和帽类似物(m7GpppG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG)的存在下，使用DNA依赖性T7 RNA聚合酶进行体外转录PCR扩增的DNA。一些mRNA构建体在无帽类似物的条件下进行体外转录，且帽结构(cap1)用本领域公知的加帽酶以酶促方式添加，例如使用带有2’-O-甲基转移酶的m7G加帽试剂盒。获得的mRNA例如用RP-HPLC(
CureVac AG，Tübingen，德国；WO2008/077592)纯化，并用于体外和体内实验。
表9：本发明实施例中使用的编码CSP的mRNA构建体
1.4.1：LNP(LNP-IH-3)配制的mRNA组合物的制备：
使用阳离子脂质、结构脂质、聚乙二醇脂质和胆固醇制备LNP(LNP-III-3)。使用微流控混合装置将脂质(乙醇)溶液与RNA(含水缓冲液)溶液混合。获得的LNP通过透析在碳水化合物缓冲液中重新缓冲，并使用超速离心管最终浓缩至目标浓度。LNP配制的mRNA在用于体外或体内实验前在-80℃下储存。
基本上根据如WO2015/199952、WO2017/004143和WO2017/075531中描述的一般过程来制备和测试脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子脂质和聚合物缀合脂质(聚乙二醇脂质)，其全部内容通过引用并入本文。LNP配制的RNA通过可离子化的氨基脂质(阳离子脂质)、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质制备。简而言之，将式III-3的阳离子脂质化合物、DSPC、胆固醇和式IVa的聚乙二醇脂质以大约50∶10∶38.5∶1.5或47.4∶10∶40.9∶1.7的摩尔比(％)溶解于乙醇中。按照RNA与总脂质的比为0.03重量/重量至0.04重量/重量，制备包含式III-3的阳离子脂质化合物和式IVa的聚乙二醇脂质的LNP。在10mM至50mM的pH为4的柠檬酸盐缓冲液中将RNA稀释至0.05mg/mL至0.2mg/mL。用注射泵将乙醇脂质溶液与RNA含水溶液按约1∶5至1∶3(体积/体积)的比例混合，总流速大于约15毫升/分钟。然后去除乙醇，通过透析将外部缓冲液替换为包含蔗糖的PBS缓冲液。最后，脂质纳米颗粒通过0.2μm孔无菌过滤器过滤，并将LNP配制的RNA组合物调整至总RNA为约1mg/ml。通过使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern，UK)的准弹性光散射测定，脂质纳米颗粒的粒径是60nm至90nm。对于本说明书中提到的其他阳离子脂质化合物，其配制过程基本类似。在体内应用前，将获得的LNP配制的RNA组合物(1mg/ml总RNA)用生理盐水稀释到所需的目标浓度。
下文表B中详细描述了LNP组合物LNP-III-3的脂质纳米颗粒组合物。
实施例1.4.2：使用NanoAssemblrTM微流控系统制备LNP(GN01-LNP)：
根据标准规程使用NanoAssemblrTM微流控系统(Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，BC)制备GN01-LNP。GN01-LNP包括阳离子脂质
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15；NOF Corporation，东京，日本)。
在本发明实施例中，使用
SS-EC(NOF Corporation，东京，日本)制备脂质纳米颗粒组合物。此外，使用了胆固醇(Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)、中性脂质/磷脂DPhyPE(Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)和DMG-PEG 2000(NOFCorporation，东京，日本)。
按照标准规程将脂质溶解于酒精溶液(乙醇)。相应的脂质纳米颗粒组合物详见下表B。
具体地，LNP的制备是通过混合适当体积的乙醇缓冲液中的脂质储备溶液与含有适量的本文说明的mRNA的含水相(25mM乙酸钠，pH 4.0)；胆固醇、磷脂和聚合物缀合脂质：20mg/ml在EtOH中，阳离子脂质，除GN01外：20mg/ml在EtOH中，GN01脂质：30mg/ml在叔丁醇中。
简而言之，将mRNA在pH为4的10mM至50mM乙酸盐缓冲液中稀释至0.05mg/ml至0.2mg/ml。将注射泵安装到NanoAssemblrTM(Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，BC)的入口部件中，并用于将乙醇脂质溶液与mRNA含水溶液以约1∶5(体积/体积)至1∶3(体积/体积)的比例混合，其中总流速为约14毫升/分钟至约18毫升/分钟。
然后去除乙醇，通过透析将外部缓冲液替换为PBS(Slide-A-LyzerTM DialysisCassettes，ThermoFisher)。最后，脂质纳米颗粒通过0.2μm孔无菌过滤器过滤。通过使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments Ltd.；Malvern，UK)的准弹性光散射测定，脂质纳米颗粒的粒径是约90nm至约140nm。
表B：GN01-LNP和LNP III-3制剂的脂质纳米颗粒组合物概述
1.5.鱼精蛋白复合的mRNA组合物的制备
在用于体内免疫实验前，将RNA构建体与鱼精蛋白复合。RNA制剂由50％游离RNA和50％与鱼精蛋白以2∶1的重量比复合的RNA的混合物组成。首先，通过将鱼精蛋白-乳酸林格氏液加入mRNA中，使mRNA与鱼精蛋白复合。孵育10分钟后，当稳定产生复合物时，添加游离mRNA，并用乳酸林格氏液调节最终浓度。
1.6.设计的mRNA构建体的表达分析：
使用本领域中通常已知的蛋白质印迹或FACS测试如表9中所示的mRNA构建体在细胞培养物中的表达。实施例4中描述了一个实例。
实施例2：用x鱼精蛋白配制和LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例表明，编码CSP的疟疾mRNA疫苗在Balb/c小鼠中诱导体液和细胞免疫应答。
根据实施例1制备了编码全长CSP的疟疾mRNA构建体。将mRNA配制在脂质纳米颗粒中(参见实施例1.4.2)，或者用鱼精蛋白配制(参见实施例1.5)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天、21天和42天施用，并按表10所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组3)中使用了NaCl缓冲液。在第21天、第42天和第56天采集血清样本，以测定体液免疫应答。
表10：实施例2的疫苗接种方案
2.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
使用用于包被的疟疾[NANP]7肽(根据SEQ ID NO：10209)进行ELISA。使用相应的血清稀释液孵育包被的酶标板，并使用生物素化的同种型特异性抗小鼠抗体，然后以Amplex为底物使用链霉抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)，来检测特异性抗体与相应疟疾[NANP]7肽的结合。在疫苗接种后第21天、第42天和第56天通过ELISA测定针对疟疾[NANP]7肽的抗体(IgG1、IgG2a)终点滴度。结果如图1A至C所示(A：第21天；B：第42天；C：第56天)。
2.2.结合CSP特异性免疫应答的检测：
使用Lipofectamine用2ug编码CSP的mRNA(R7111)来转染Hela细胞。转染后20小时收获细胞，并以每孔1x105接种到96孔板中。将细胞与接种疫苗的小鼠的血清样品一起孵育(稀释1∶50)，然后用FITC缀合的抗小鼠IgG抗体孵育。用DIVA软件在BD-FACS-Canto-II上采集细胞，通过FlowJo进行分析。结果如图2A至C所示(A：第21天；B：第42天；C：第56天)。
2.3.细胞内细胞因子染色(ICS)：
根据本领域已知的标准规程，在第56天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。简言之，通过细胞筛网研磨分离的脾脏，在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞裂解。用PBS/1％FBS进行充分洗涤后，将脾细胞接种到96孔板中(每孔2x106个细胞)。在2.5μg/ml的抗-CD28抗体(BD Biosciences)和蛋白质转运抑制剂的存在下，在37℃下用CSP肽的混合物(1μg/ml)(见表C)刺激细胞6小时。刺激后，根据制造商的说明，洗涤细胞，并使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)对其进行细胞内细胞因子染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1∶100)、CD8-PE-Cy7(1∶200)、TNF-PE(1∶100)、IFNγ-APC(1∶100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1∶200)(BD Biosciences)，并与1∶100稀释的Fcγ-block一起孵育。使用Aqua Dye(Invitrogen)区分活/死细胞。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)获得细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞仪的数据。结果如图3所示。
表C：用于ICS的CSP肽混合物
结果：
如图1和图2所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。在测试条件下，应用于第1组的LNP配制的疫苗(1μg剂量)诱导了最强烈的免疫应答。
如图3所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，与鱼精蛋白配制的mRNA CSP疫苗(10μg剂量，第4组)相比，在测试条件下，第1组(1μg剂量)表现出强烈的CD8+T细胞和CD4+T细胞应答，第2组(1μg剂量)表现出中等的CD8+T细胞应答和CD4+T细胞应答。
因为CD8+T细胞可以是对抗由疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，所以有效的疟疾疫苗应当能诱导强烈的CD8+T细胞应答。因此，这些发现突出了本发明的基于mRNA的疟疾疫苗的其中一个有利特征。
实施例3：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠疫苗接种
本实施例表明，编码CSP的疟疾mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液和细胞免疫应答。值得注意的是，本发明的基于mRNA的疟疾疫苗诱导了强烈的CD8+T细胞应答。
根据实施例1制备了编码全长CSP的疟疾mRNA候选疫苗，并在脂质纳米颗粒中配制mRNA构建体(参见实施例1.4.2)。在第0天和第21天肌内施用LNP制剂(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，其中RNA剂量、制剂和对照组如表11所示。一个对照组(D)接种了编码RTS，S的mRNA。阴性对照组(E)接种了在LNP中配制的不相关的RNA。在第21天和第35天采集血清样本用于ELISA。
表11：实施例3的疫苗接种方案
3.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例3.1所述使用用于包被的疟疾肽[NANP]7以进行ELISA。
结果如图4和图5所示。
3.2.细胞内细胞因子染色：
细胞内细胞因子染色基本上如实施例3.2中所述进行。结果如图6所示。
结果：
如图4和图5所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。在测试条件下，与RTS，S组(带有HBsAg的CSP片段)(D组；10μg剂量)相当，应用到A组的LNP配制的疫苗(1μg剂量)诱导了最强的免疫应答。
如图6所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，A组(1μg剂量)和B组(1μg剂量)显示出强烈的CD8+T细胞和CD4+T细胞应答，而RTS，S组(带有HBsAg的CSP片段)(D组；10μg剂量)仅显示出CD4+T细胞应答。
因为CD8+T细胞是对抗由疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，所以有效的疟疾疫苗应当能诱导强烈的CD8+T细胞应答。因此，这些发现突出了本发明的基于mRNA的疟疾疫苗的其中一个有利特征。
实施例4：编码CSP的不同mRNA构建体在293T细胞中的表达分析
本实施例表明了编码经修饰的CSP构建体的RNA构建体在哺乳动物细胞中的表达和分泌。
为确定一些RNA构建体的体外蛋白质表达，用编码CSP抗原的mRNA瞬时转染293T细胞。在转染前24小时，将293T细胞以500000个细胞/孔的密度接种到细胞培养基的6孔板中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)作为转染剂，用1μg RNA转染细胞。实验中使用了如下mRNA构建体：R7111、R7641、R7642、R7643、R7647、R7649和R7650(参见表12)。
表12：用于蛋白质印迹分析的RNA构建体，实施例4
蛋白质印迹分析使用本领域公知的方式进行，使用针对CSP重复区的小鼠抗2A10单克隆抗体(1∶5000稀释)作为第一抗体，并与第二抗-小鼠抗体IgG IRDye 800CW(1∶10000稀释)组合(参见图7A和图7B)。
结果：
对于五个测试的RNA构建体(R7642；R7643；R7647；R7649和R7650)，在转染的293T细胞的上清液中可检测到编码的CSP蛋白(参见图7A)。证实所有七个构建体均在相应的细胞裂解物中表达(参见图7B)。
实施例5：基于mRNA的疟疾疫苗的功能免疫原性的评价(预测)
本实施例旨在用改进的ELISA测定、被动转移模型(实施例5.1)和激发模型(实施例5.2)评估本发明的基于mRNA的疟疾疫苗的功能免疫原性。
5.1.接种各种基于CSP的mRNA疫苗的小鼠的血清分析：
用建立的ELISA模型，以重组CSP和子孢子作为阳性对照，分析接种了LNP配制的基于CSP的疫苗的小鼠大约2ml血清样本。
此外，在被动转移模型中分析了500μl小鼠血清：血清样品中的CSP抗体被动转移到小鼠中(n＝4)，所述小鼠在注射伯氏疟原虫-恶性疟原虫CSP嵌合子孢子或5次传染性蚊子叮咬后2小时或16小时被感染。然后评估小鼠肝脏中寄生虫负荷的减少。
5.2.接种各种基于CSP的mRNA疫苗的小鼠的感染研究
在感染模型中测试了LNP配制的基于mRNA的疟疾疫苗。在第0天和第21天给小鼠接种疫苗，并通过携带转基因的伯氏疟原虫的传染性蚊子叮咬5次以感染小鼠(在疫苗接种后第35天开始)。然后评估小鼠肝脏中寄生虫负荷的减少。
在第0天和第21天肌内注射LNP配制的编码CSP的mRNA疫苗。从疫苗接种后第35天开始，通过携带转基因的伯氏疟原虫的传染性蚊子叮咬5次感染接种疫苗的小鼠。转基因的伯氏疟原虫品种表达全长恶性疟原虫CSP蛋白。这种寄生虫会在小鼠和蚊子中产生传染性很强的子孢子。
实施例6：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例表明，编码全长CSP的疟疾mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液和细胞免疫应答。
根据实施例1制备编码全长CSP(Pf-CSP)或者带有HBsAg(Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg)的CSP片段CSP(199-377)的疟疾mRNA构建体。在脂质纳米颗粒GN01-LNP中配制mRNA(参见实施例1.4.2)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表13A所示的RNA剂量、配方和施用途径来施用。阴性对照组(3)中使用了NaCl缓冲液。在第21天和第35天采集血清样本，以测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表13A：实施例6的疫苗接种方案
| 组 | 小鼠编号 | 疗法 | mRNA ID | 剂量 | 途径 | 体积 |
| 1 | 6 | Pf-CSP | R7111 | 5ug | 肌肉注射 | 1x25uL |
| 2 | 6 | Pf-CSP(199-377)_Linker(PVTN)_HBsAg | R7271 | 5ug | 肌肉注射 | 1x25uL |
| 3 | 6 | NaCl缓冲液 | 肌肉注射 | 1x25uL |
6.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
ELISA基本上如实施例2.1中所述进行。结果如图8所示。
6.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。简言之，分离的脾脏通过细胞筛网研磨，在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞裂解。使用PBS/1％FBS进行充分洗涤后，将脾细胞接种到96孔板中(每孔2x106个细胞)。在37℃下，在2.5μg/ml的抗CD28抗体(BD Biosciences)和蛋白质转运抑制剂的存在下，用根据SEQ IDNO：10212-10276的CSP肽库(0.5μg/ml，ThermoFisher)和一种CSP肽(0.5μg/ml，根据SEQ IDNO：10208的CSP_peptide_12，EMC Microcollections GmbH，参见表Cm)刺激细胞6小时。刺激后，根据制造商的说明，洗涤细胞，并使用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)对其进行细胞内细胞因子染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1∶100)、CD8-PE-Cy7(1∶200)、TNF-PE(1∶100)、IFNγ-APC(1∶100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1∶200)(BDBiosciences)，并与1∶100稀释的Fcγ-block一起孵育。使用Aqua Dye(Invitrogen)来区分活/死细胞。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)获得细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞仪数据。结果如图9所示。
结果：
如图8所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。在测试条件下，相比于LNP配制的包含带有HBsAg的CSP(199-377)片段的mRNA疫苗(第2组；表12)，应用到第1组的LNP配制的疫苗(全长CSP)(5μg剂量)诱导了稍强的免疫应答。
如图9所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，第1组(全长CSP)(5μg剂量)显示出强烈的CD8+T细胞和CD4+T细胞应答，而LNP配制的包含带有HBsAg的CSP(199-377)片段的mRNA疫苗(第2组；表12)仅显示出CD4+T细胞应答。
因为CD8+T细胞可以是对抗由疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，所以有效的疟疾疫苗应当能诱导强烈的CD8+T细胞应答。因此，这些发现突出了本发明的基于mRNA的疟疾疫苗的其中一个有利特征。与截短的LNP配制的包含带有HBsAg的CSP(199-377)片段的mRNA疫苗相比，更全长的CSP作为抗原诱导更广泛的体液抗体应答，特别是细胞抗体应答。更全长的CSP可以提供额外的T细胞表位，导致细胞免疫增强，这可能潜在地加强对疟疾的保护。
实施例7：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例显示CSP的C-端对于mRNA疟疾疫苗诱导CD4+-T细胞应答十分重要。
根据实施例1制备了编码CSP变体(例如包括异源跨膜结构域(第1组)、GPI锚点缺失突变(第2组)或者C-端截短/缺失的CSP变体(第3组))的疟疾mRNA疫苗构建体。在脂质纳米颗粒GN01-LNP中配制mRNA(参见实施例1.4.2)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表13B所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(4)接种了无关RNA(聚胞苷酸(多聚胞苷酸RNA)(Sigma))。在第21天和第35天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，以测定细胞免疫应答。
表13B：实施例7的疫苗接种方案
| 组 | 小鼠编号 | 疗法 | mRNA ID | 剂量 | 途径 | 体积 |
| 1 | 8 | HsALB_Pf-CSP(19-384)_TM domain HA | R7641 | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
| 2 | 8 | HsALB_Pf-CSP(19-384)(无GPI-锚定) | R7642 | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
| 3 | 8 | HsALB_Pf-CSP(19-272) | R7647 | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
| 4 | 5 | Poly：C | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
7.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
使用用于包被的疟疾[NANP]7肽、C-端肽或N-端肽(分别根据SEQ ID NO：10209、10211、10210)来进行ELISA。使用相应的血清稀释液孵育包被的酶标板，并以Amplex为底物使用生物素化的同种型特异性抗小鼠抗体，然后使用链霉抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)，来检测特异性抗体分别与疟疾[NANP]7肽、C-端肽或N-端肽的结合。在疫苗接种后第21天和第35天通过ELISA检测分别针对疟疾[NANP]7肽、C-端肽或N-端肽的抗体(IgG1、IgG2a)的终点滴度。结果如图10A-F所示。
7.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例2.3中所述进行。结果如图11所示。
结果：
如图10所示，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。在测试条件下，应用于第1组和第2组的“更全长的”mRNA疫苗(表13)诱导了最强烈的免疫应答。因此，这些发现显示C-端的表位通常对于诱导体液免疫应答以及诱导针对免疫显性NANP区的表位很重要(参见例如图10A和10B：使用NANP包被材料进行ELISA分析)。
如图11所示，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，与具有HA跨膜结构域的第1组和具有C-端截短的CSP变体的第3组相比，无GPI锚定的mRNA疫苗(第2组，表13)显示出更强的CD8+T细胞和CD4+T细胞应答。这些发现再次表明，C-端的表位对诱导CD4+T细胞应答很重要，因为(应用到第2组的)“更全长的”mRNA相比于(应用到第3组的)编码截短的CSP变体的mRNA疫苗引起了更强的T细胞应答(CD4+T细胞)。
实施例8：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例显示C-端对于mRNA疟疾疫苗诱导CD4+T细胞应答很重要。
根据实施例1制备了编码CSP变体的疟疾mRNA构建体(包括异源跨膜结构域(第1组)、或异源分泌型信号肽(第1、2、3、5组)、GPI锚点缺失的CSP构建体(第2组)、或C-端截短的CSP(第3组)、带有异源HbsAg的CSP片段(第4组))。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表14所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(7)接种了无关RNA(聚胞苷酸(多聚胞苷酸RNA)(Sigma))。在第21天和第35天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表14：实施例8的疫苗接种方案
8.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例7.1中所述进行ELISA。结果如图12A至D所示。
8.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例2.3中所述进行。结果如图13所示。
结果：
如图12所示，几乎所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。在测试条件下，应用到第1组、第2组和第5组的带有异源分泌型信号肽的“更全长的”mRNA疫苗，相对于带有截短的变体的mRNA疫苗(应用到第3组)或带有全长的天然信号肽的mRNA疫苗(应用到第6组)(表14)诱导了更强的体液免疫应答。因此，这些发现显示C-端的表位对诱导针对免疫显性NANP区的表位很重要(参见例如图12A和12B：用[NANP]7包被进行ELISA分析)。
如图13A所示，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，GPI锚点缺失的mRNA疫苗(第2组，表14)显示出最强的CD8+T细胞应答。带有截短的C-端的mRNA疫苗(第3组，表14)显示出较低的CD4+T细胞应答。这些发现再次表明，C-端的表位对于特别是诱导CD4+T细胞应答很重要，因为“更全长的”mRNA(应用到第1组、第2组、第5组和第6组)相比于编码截短的CSP变体的mRNA疫苗(应用到第3组)引起了更强的CD4+T细胞应答。
如图13A所示，以及在图13B中更清楚地可见，在测试条件下，相对于带有野生型信号肽(第6组，表14)的mRNA疟疾疫苗，用异源分泌型信号肽(人血白蛋白信号肽，第5组，表14)编码的mRNA疟疾疫苗显示出更强的CD8+T细胞应答和略微更强CD4+T细胞应答。
实施例9：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例显示，在CSP的C-端包含不同T细胞表位的mRNA疫苗诱导了显著不同的体液以及细胞免疫应答。
根据实施例1制备了编码带有不同C-端变体的CSP的疟疾mRNA构建体。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表15所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(9)中接种了不相关的RNA。在第21天和第35天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表15：实施例9的疫苗接种方案
9.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例7.1中所述进行ELISA。结果如图14A-D所示。
9.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。简言之，分离的脾脏通过细胞筛网研磨，在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞溶解。用PBS/1％FBS进行充分洗涤后，将脾细胞接种到96孔板中(每孔2x106个细胞)。在37℃下，在2.5μg/ml的抗CD28抗体(BD Biosciences)和蛋白质转运抑制剂的存在下，用刺激CD4+T细胞的CSP肽混合物(1μg/ml，EMC Microcollections GmbH)(参见表C)或用刺激CD8+T细胞的根据SEQ ID NO：10212-10276的CSP肽库(0.5μg/ml，ThermoFisher)，刺激细胞6小时。刺激后，根据制造商的说明，洗涤细胞，并用Cytofix/Cytoperm试剂(BD Biosciences)对其进行细胞内细胞因子染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1∶100)、CD8-PE-Cy7(1∶200)、TNF-PE(1∶100)、IFNγ-APC(1∶100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1∶200)(BDBiosciences)，并与1∶100稀释的Fcγ-block一起孵育。用Aqua Dye(Invitrogen)区分活/死细胞。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)获得细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞仪数据。结果如图15所示。
结果：
如图14和图15所示，几乎所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液和/或细胞免疫应答。
在测试条件下，带有C-端_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)和_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-365)_Linker(AAY)_PADRE(R8100和R8101，第2组和第3组，表15)的构建体表现出强烈的体液免疫应答。带有_Linker(AAY)_Pf-CSP(310-327)_Linker(AAY)_Pf-CSP(346-375)(R8100，第2组，表15)的构建体还显示出强烈的CD8+T细胞应答，并且带有_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)(R8104，第6组，表15)的构建体也显示出强烈的CD8+T细胞应答。这两种构建体(R8100和R8104，第2组和第6组，表15)在所有测试的C-端构建体中还显示出最佳的CD4+T细胞应答。
T细胞表位之间的相对位置，例如通过引入异源接头元件所达到的相对位置，也影响了体液或细胞免疫应答的诱导。包括例如引入的AAY接头的mRNA疫苗(R8100，第二组，表15)相比于G4S接头诱导了更强的体液免疫应答，并因此改变了T细胞表位的位置(R8103，第5组)。
这些发现还表明，如构建体HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Pf-CSP(346-375)(R8104，第6组，表15)中直接连接表位比分离的用附加接头HsALB_Pf-CSP(19-272)_Linker(G4S)_Pf-CSP(310-327)_Linker(G4S)_Pf-CSP(346-375)(R8103，第5组，表15)诱导更强烈的CD8+T细胞应答。
因此，检测不同的接头和表位组合对诱导最佳的体液和细胞免疫应答很重要。每一个被测试的组合都显示出它在不同阶段诱导免疫应答的能力。包含编码不同CSP抗原设计的不同mRNA的疫苗组合物可能是达到平衡且强烈的体液和细胞免疫应答的有力工具。
实施例10：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例显示疟疾mRNA疫苗的N-端的不同长度和C端的不同NANP重复区诱导了不同的体液和细胞免疫应答。
根据实施例1制备了编码在C-端和N-端变体带有不同NANP重复区变体的CSP的疟疾mRNA构建体。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表16所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(9)接种了无关RNA。在第21天和第35天采集血清样品，用于测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表16：实施例10的疫苗接种方案
10.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例7.1中所述进行ELISA。结果如图16A-D所示。
10.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例9.2中所述进行。结果如图17所示。
结果：
如图16所示，几乎所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了体液免疫应答。在测试条件下，在C-端带有截短的NANP重复区的mRNA疫苗(第1组至第3组，表16)相比于在N-端截短的mRNA疫苗(第4组至第6组，表16)表现出更弱的抗体应答。因此，这些发现表明，在C-端和NANP重复区的表位对诱导体液免疫应答是重要的。
如图17所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，在C-端带有截短的NANP重复区的mRNA疫苗(第1组至第3组，表16)显示出最强的CD8+T细胞应答，但也显示出更弱的CD4+T细胞应答，反之，N-端截短的mRNA疫苗(第4组至第6组，表16)显示出最强的CD4+T细胞应答和更弱的CD8+T细胞应答。因此，这些发现说明N-端的表位对于诱导CD8+T细胞应答很重要，而C-端的表位对于诱导CD4+T细胞免疫应答很重要。
实施例11：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例显示包含不同的加帽mRNA(cap1或cap0)的mRNA疟疾疫苗可以诱导不同的体液免疫应答和细胞免疫应答。
根据实施例1制备了加帽不同的编码CSP的疟疾mRNA构建体。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表17所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(3)中接种了无关RNA。在第21天和第35天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第35天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表17：实施例11的疫苗接种方案
| 组 | 小鼠编号 | 疗法 | 加帽 | mRNA ID | 剂量 | 途径 | 体积 |
| 1 | 8 | HsALB_Pf-CSP(19-384) | cap0 | R7642 | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
| 2 | 8 | HsALB_Pf-CSP(19-384) | cap1 | R8230 | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
| 3 | 5 | 无关RNA | 1ug | 肌肉注射 | 1x20uL |
11.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例7.1中所述进行ELISA。结果如图18所示。
11.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例9.2中所述进行。结果如图19所示。
结果：
如图18所示，与使用何种帽无关，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液免疫应答。
如图19所示，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，带有cap1的mRNA疫苗(第2组，表18)表现出非常强烈的CD8+T细胞应答以及强烈的CD4+T细胞应答。
实施例12：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠免疫接种
本实施例说明，加帽不同的mRNA疟疾疫苗诱导了不同的体液和细胞免疫应答，并且在初次免疫和加强免疫之间的更长的间隔可以诱导更强烈的免疫应答。
根据实施例1制备了加帽不同的编码CSP的疟疾mRNA构建体。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天或第56天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表18所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。两组阴性对照组(第3组和第6组)中施用了NaCl缓冲液。在第21天、第35天、第49天、第70天和第84天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第84天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表18：实施例12的疫苗接种方案
12.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例7.1中所述进行ELISA。结果如图20所示。
12.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第84天分离来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例6.2中所述进行。结果如图21所示。
结果：
如图20所示，所有测试的LNP配制的CSP mRNA疫苗均以相当的水平在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答。当在第56天而不是第21天进行加强免疫时，LNP配制的CSPmRNA疫苗诱导的体液免疫应答得到增强。延长在初次疫苗接种和加强疫苗接种之间的注射间隔使得体液免疫应答增强(如IgG1和IgG2a终点滴度所示(第5组和第6组，第70天和第84天)。包含cap1而非cap0的CSP疫苗通常显示出更明显的免疫应答，尤其是在早期时间点。
如图21所示，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，带有cap1的mRNA疫苗表现出非常强烈的CD8+T细胞应答和强烈的CD4+T细胞应答。
实施例13：用LNP配制的编码CSP的mRNA对小鼠接种疫苗
本实施例说明带有包含不同形式的3’端(例如hSL-A64-N5或hSL-A100)的mRNA的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了强烈的体液和细胞免疫应答。此外，包含具有经化学修饰的核苷酸(例如假尿苷ψ)的mRNA的mRNA疫苗诱导了免疫应答。
根据实施例1制备了包含带有不同3’端的编码CSP的mRNA构建体的疟疾mRNA疫苗。在脂质纳米颗粒(LNP-III-3)中配制mRNA(参见实施例1.4.1)。不同的mRNA候选疫苗分别在第0天和21天进行肌内施用(肌肉注射；胫骨肌，Balb/c小鼠)，并按表18所示的RNA剂量、配方和施用途径施用。一组阴性对照组(7)中施用了NaCl缓冲液。在第21天和第35天采集血清样本，用于测定体液免疫应答。在第84天提取脾细胞，用于测定细胞免疫应答。
表19：实施例13的疫苗接种方案
13.1.通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
基本上如实施例5.1中所述进行ELISA。结果如图22所示。
13.2.细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准试验方案，在第35天分离来自接种小鼠的脾细胞。细胞内细胞因子染色基本上如实施例6.2中所述进行。结果如图23所示。
结果：
如图22所示，与带有何种3’端无关，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答。此外，包含具有经化学修饰的核苷酸(例如假尿苷ψ)的mRNA的mRNA疫苗也诱导了体液免疫应答。
如图23所示，与带有何种3’端无关，所有LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导了强烈的细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。值得注意的是，在测试条件下，与包含未经修饰的核苷酸的mRNA疫苗相比，包含假尿苷(ψ)修饰的核苷酸的mRNA疫苗表现出更低的CD8+T细胞应答和CD4+T细胞应答。无论带有何种3’端，都产生了强烈的体液和细胞免疫应答。
实施例14：不同的编码CSP的mRNA构建体在293T细胞中的表达分析
本实施例显示了包含可选的3’端的编码不同CSP构建体的mRNA构建体在哺乳动物细胞中的表达。
为确定一些RNA构建体的体外蛋白质表达，使用编码CSP抗原的mRNA瞬时转染293T细胞。在转染前24小时，将293T细胞以500000个细胞/孔的密度接种到有细胞培养基的6孔板中。以Lipofectamine 2000(Invitrogen)作为转染剂，使用1μg RNA转染细胞。对细胞裂解物进行SDS-PAGE，并使用本领域公知的方式进行蛋白质印迹分析，使用针对CSP重复区域和C-端的兔抗CSP恶性疟原虫血清(Alpha Diagnostics)(1∶1000稀释)或小鼠抗α-微管蛋白抗体(1∶1000；Abcam)作为第一抗体，并与第二抗体山羊抗兔抗体IgG IRDye 800CW(Li-Cor，1∶10000稀释)或山羊抗小鼠IgG
680RD(Li-Cor，1∶100000稀释)组合(参见图24)。使用Li-Cor检测系统(Odyssey CLx成像系统)结合Image Studio Lite软件进行检测和量化。表19中包含实验中使用的mRNA构建体：
表20：用于蛋白质印迹分析的RNA构建体
结果：
如图24所示，所有测试的mRNA构建体表达了可检测的CSP蛋白，这是基于mRNA的疟疾疫苗的前提。
实施例15：编码CSP的不同mRNA构建体的表达分析
为确定mRNA构建体的体外蛋白质表达，按照生产方案将具有不同异源N-端(A组和B组，表20)或具有不同异源信号肽(C组和D组，表20)的构建体与Promega兔网织红细胞裂解物系统的组分混合。裂解物包含蛋白质合成所需的细胞组分(tRNA、核糖体、氨基酸、起始因子、延伸因子和终止因子)。阳性对照中使用了来自裂解物体系试剂盒的荧光素酶RNA。通过SDS-Page和蛋白质印迹分析(IRDye 800CW链霉抗生物素蛋白抗体(1∶2000))对翻译结果进行分析。表20中总结了测试的RNA构建体。
表21：实施例15中使用的mRNA构建体的概述
| 组 | 疗法 | 3’端 | mRNA ID |
| A | HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(SGG)_Ferritin | A64-N5-C30-hSL-N5 | R8780 |
| B | HsALB_Pf-CSP(19-384)_Linker(SGG)_Ferritin | hSL-A100 | R8781 |
| C | LumSynt_Linker(GGS4-GGG)_Pf-CSP(19-397) | A64-N5-C30-hSL-N5 | R8782 |
| D | LumSynt_Linker(GGS4-GGG)_Pf-CSP(19-397) | hSL-A100 | R8783 |
| E | 来自裂解物体系试剂盒的对照RNA | ||
| F | 无RNA酶水 | ||
| M | 蛋白质分子量标样 |
结果：
如图25所示，使用的mRNA构建体产生了可检测的CSP蛋白的表达，这是基于mRNA的疟疾疫苗的前提。
实施例16：疟疾mRNA疫苗在感染中的功能免疫原性
本实施例旨在用改进的ELISA试验、被动转移激发模型(实施例16.1)和主动感染模型(实施例16.2)评估本发明的基于mRNA的疟疾疫苗的功能免疫原性。
16.1.接种各种基于CSP的mRNA疫苗的小鼠的血清分析：
用建立的ELISA模型，以重组CSP和子孢子作为阳性对照，来分析接种了LNP配制的基于CSP的疫苗的小鼠血清样品。
此外，在被动转移模型中分析了400μl小鼠血清：血清样品中的CSP抗体被动转移到小鼠中(n＝4)，所述小鼠在注射伯氏疟原虫-恶性疟原虫CSP嵌合子孢子后2小时被感染(参见表22)。然后评估小鼠肝脏中寄生虫负荷的减少。
表22：根据实施例16.1的被动转移分析的概述
16.2.接种各种基于CSP的mRNA疫苗的小鼠的主动感染分析：
在主动感染模型中测试了LNP配制的基于mRNA的疟疾疫苗。然后评估小鼠肝脏中寄生虫负荷的减少。
在第0天和第21天肌肉注射LNP配制的编码CSP的mRNA疫苗。从疫苗接种后第35天开始，用伯氏疟原虫-恶性疟原虫CSP嵌合子孢子感染接种疫苗的小鼠(见表23)。
表23：实施例16.2的疫苗接种方案
实施例17：多价疟疾mRNA疫苗的分析
本实施例显示根据本发明的包含不同CSP构建体的mRNA疫苗组合物例如包含但不限于：
●至少一种编码更全长的CSP的mRNA(I)，和至少一种编码带有HBsAg的截短的CSP片段的第二mRNA(II)，或者
●至少两种不同的mRNA构建体，其包含不同的异源或CSP衍生的T细胞辅助表位(I)和(II)，或者
●至少一种编码带有异源信号肽的更全长的CSP的mRNA(I)，和至少一种编码带有HBsAg的截短的CSP片段的第二mRNA(II)。
根据实施例1制备了编码不同的疟疾mRNA疫苗的RNA，并根据实施例1.4.1或1.4.2将其在LNP中配制，所述mRNA疫苗编码CSP或其片段或变体(见表24)。在第0天和第21天对Balb/c小鼠(每组9只小鼠)进行肌内疫苗接种(肌肉注射)。在第21天和第28天收集血清以测试体液免疫应答。在第28天收集脾细胞以通过如上文所述的ICS测试细胞免疫应答。
表24：实施例17的动物分组和疫苗接种方案的实例
| 组 | 小鼠编号 | 疫苗组合物 |
| A | 9 | 0.9％NaCl缓冲液(阴性对照) |
| B | 9 | 编码CSP(I)的mRNA |
| C | 9 | 编码CSP(II)的mRNA |
| D | 9 | 编码CSP(I)的mRNA和编码CSP(II)的mRNA |
实施例18：疟疾mRNA疫苗在健康成年人中的安全性、反应原性和免疫原性
为证明疟疾mRNA疫苗的安全性、反应原性和免疫原性，启动了I期临床试验。
对于临床开发，使用了在GMP条件下生产的RNA(例如使用如WO2016/180430中所述的过程)。
在该疟疾mRNA疫苗的I期试验中，将以一次剂量或两次剂量的方式将不同剂量的候选mRNA疫苗施用给健康的成年人对象。将对象按顺序分入不同的试验组，接受一次剂量或两次剂量的疟疾mRNA疫苗。在28天后或者优选地56天后对两次剂量组的对象施用第二剂。另一组的对照对象会在第1天接受单次剂量的生理盐水。使用日记卡收集征集性(接种疫苗后1天至7天)和非征集性(接种疫苗后1天至28天)不良事件(AE)的安全信息。严重的AE、导致提前退出试验或接受第二剂疫苗的AE、特别关注的AE和医疗参与的AE将在整个试验中(第1天至最后一次疫苗给药后365天)进行收集。内部安全审查小组和DSMB将按照预先定义的时间表审查指定的安全数据。
Claims (38)
1.一种用于疫苗的编码RNA，其包括：
a)至少一个异源5’非翻译区(5’-UTR)和/或至少一个异源3’非翻译区(3’-UTR)；和
b)可操作地连接到所述3’-UTR和/或5’-UTR的至少一个编码序列，所述编码序列编码衍生自疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)的至少一种抗原蛋白、或者其免疫原性片段或免疫原性变体。
2.根据权利要求1所述的编码RNA，其中疟原虫选自恶性疟原虫(Pf)、诺氏疟原虫(Pk)、卵形疟原虫(Po)、类卵形疟原虫(Ps)或间日疟原虫(Pv)。
3.根据权利要求1或2所述的编码RNA，其中疟原虫是恶性疟原虫(Pf)，优选恶性疟原虫3D7。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的编码RNA，其中编码序列还编码至少一种异源肽或蛋白质元件，所述异源肽或蛋白质元件选自异源信号肽、接头、辅助表位、抗原聚类结构域或跨膜结构域。
5.根据权利要求4所述的编码RNA，其中异源信号肽衍生自根据SEQ ID NO：6208的SPARC、根据SEQ ID NO：6207的HsIns-iso1、根据SEQ ID NO：6205的HsALB或根据SEQ IDNO：6206的lgE，或者这些中任一项的片段或变体。
6.根据权利要求4所述的编码RNA，其中辅助表位衍生自根据SEQ ID NO：6272的P2辅助表位、根据SEQ ID NO：6273的PADRE辅助表位、根据SEQ ID NO：6274的HBsAg载体基质，或者这些中任一项的片段或变体。
7.根据权利要求4所述的编码RNA，其中抗原聚类结构域衍生自根据SEQ ID NO：10162的铁蛋白、根据SEQ ID NO：10153的2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)、根据SEQ ID NO：6274的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，或者这些中任一项的片段或变体。
8.根据权利要求4所述的编码RNA，其中跨膜结构域衍生自根据SEQ ID NO：6302的HA的跨膜结构域，或者其片段或变体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种抗原蛋白包含，优选地以N-端至C-端的方向包含：
a)任选地，选自SEQ ID NO：6205-6208的一种异源分泌型信号序列；
b)衍生自疟原虫的CSP的至少一种蛋白，或其片段或变体；
c)任选地，选自SEQ ID NO：6272、6273或6274或其片段或变体的至少一种异源辅助表位；
d)任选地，选自SEQ ID NO：6274、10153或10162或其片段或变体的至少一种异源抗原聚类结构域，和
e)任选地，选自SEQ ID NO：6302或其片段或变体的至少一种异源跨膜结构域，
其中a)、b)、c)、d)和/或e)可以是相连的，优选地是通过选自SEQ ID NO：6241-6244、10141、10147的至少一种肽接头元件相连的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列编码与SEQ IDNO：1-36、2081-2120、2481-2886、8742-8753、10080中任一项相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种氨基酸序列，或这些中的任意免疫原性片段或免疫原性变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括与SEQ IDNO：37-328、2121-2480、2887-6134、8754-8855、10086-10139中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一种核酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列是密码子被修饰的编码序列，其中与由相应的野生型编码序列所编码的氨基酸序列相比，由至少一种密码子被修饰的编码序列所编码的氨基酸序列优选地不被修饰。
13.根据权利要求12所述的编码RNA，其中至少一种密码子被修饰的编码序列选自C最大化的编码序列、CAI最大化的编码序列、人密码子使用适应性编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列或其任何组合。
14.根据权利要求11或13所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括密码子被修饰的编码序列，所述密码子被修饰的编码序列包括与SEQ ID NO：41-328、2161-2480、3293-6134、8754-8855、10092-10139中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括密码子被修饰的编码序列，所述密码子被修饰的编码序列包括与SEQ ID NO：41-328、8754-8855中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的编码RNA，其中至少一种编码序列包括G/C优化的编码序列，所述G/C优化的编码序列包括与SEQ ID NO：41-112、2161-2240、3293-3698、8754-8783、10092-10103中任一项或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中编码RNA是mRNA、自我复制RNA、环状RNA或RNA复制子。
18.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中编码RNA是mRNA。
19.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含5’-帽结构，优选地m7G、cap0、cap1、cap2、经修饰的cap0或经修饰的cap1结构。
20.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含至少一种多聚腺苷酸序列，优选包含30个至150个腺苷核苷酸的多聚腺苷酸序列和/或至少一种多聚胞苷酸序列，优选包含10个至40个胞嘧啶核苷酸的多聚胞苷酸序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中RNA包含至少一种组蛋白茎环，其中所述组蛋白茎环优选地包含根据SEQ ID NO：6173或6174或者其片段或变体的核酸序列。
22.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种异源3’-UTR包含衍生自基因的3’-UTR的核酸序列，所述基因选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9或者这些基因中任一项的同源物、片段或变体。
23.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中至少一种异源5’-UTR包含衍生自基因的5’-UTR的核酸序列，所述基因选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2或者选自这些基因中任一项的同源物、片段或变体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其包括：
a-1.至少一种5’-UTR和至少一种3’-UTR，所述5’-UTR衍生自HSD17B4基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体，所述3’-UTR衍生自PSMB3基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体；或者
a-3.至少一种5’-UTR和至少一种3’-UTR，所述5’-UTR衍生自SLC7A3基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体，所述3’-UTR衍生自PSMB3基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体；或者
i-2.至少一种5’-UTR和至少一种3’-UTR，所述5’-UTR衍生自RPL32基因的5’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体，所述3’-UTR衍生自ALB7基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体；或者
i-3.至少一种3’-UTR，其衍生自α-珠蛋白基因的3’-UTR，或其相应的RNA序列、同源物、片段或变体。
25.根据前述权利要求中任一项所述的编码RNA，其中编码RNA包含或组成为与选自SEQID NO：329-2080、6312-8741、8856-10079的核酸序列或这些序列中任一项的片段或变体相同或者至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的RNA序列。
26.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至24中任一项所定义的编码RNA，其中所述组合物任选地包含至少一种药学上可接受的载体。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种阳离子或聚阳离子化合物，优选阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白、阳离子或聚阳离子肽或其任意组合复合或结合，或者至少部分复合或部分结合。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种脂质复合或结合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒、脂复合物和/或纳米脂质体。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中至少一种编码RNA与一种或多于一种脂质复合，从而形成脂质纳米颗粒(LNP)。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中LNP基本上组成为：
(i)至少一种阳离子脂质；
(ii)至少一种中性脂质；
(iii)至少一种类固醇和或类固醇类似物；和
(iv)至少一种聚乙二醇化脂质，
其中(i)至(iv)是摩尔比为约20％至60％的阳离子脂质，5％至25％的中性脂质，25％至55％的固醇，和0.5％至15％的聚乙二醇化脂质。
31.一种疫苗，其包含根据权利要求1至25中任一项所述的编码RNA或根据权利要求26至30中任一项所述的组合物。
32.根据权利要求31所述的疫苗，其中疫苗引起适应性免疫应答。
33.一种试剂盒或成套试剂盒，其包含根据权利要求1至25中任一项所述的编码RNA、根据权利要求26至30中任一项所述的组合物和/或根据权利要求31至32中任一项所述的疫苗，任选地包含用于溶解的液体载剂，和任选地提供关于组分的施用和剂量的信息的技术说明。
34.根据权利要求1至25中任一项所述的编码RNA、根据权利要求26至30中任一项所述的组合物、根据权利要求31至32中任一项所述的疫苗或根据权利要求33所述的试剂盒或成套试剂盒，其用作药物。
35.根据权利要求1至25中任一项所述的编码RNA、根据权利要求26至30中任一项所述的组合物、根据权利要求31至32中任一项所述的疫苗或根据权利要求33所述的试剂盒或成套试剂盒，其用于治疗或预防疟疾或者与这种感染相关的病症。
36.一种治疗或预防病症的方法，其中所述方法包括向有需要的对象应用或施用根据权利要求1至25中任一项所述的编码RNA、根据权利要求26至30中任一项所述的组合物、根据权利要求31至32中任一项所述的疫苗或根据权利要求33所述的试剂盒或成套试剂盒。
37.根据权利要求36所述的方法，其中病症是疟疾感染或者与这种感染相关的病症。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中有需要的对象是哺乳动物对象，优选人类对象。
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