JPH11503306A

JPH11503306A - Ｃ−ヌクレオシド誘導体および核酸検出におけるその使用

Info

Publication number: JPH11503306A
Application number: JP8527272A
Authority: JP
Inventors: ミューレッガー，クラウス; ダーエルツ，ハーバートフォン; シーラ，フランク; ローゼマイヤー，ヘルムット
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 1999-03-26
Anticipated expiration: 2016-03-12
Also published as: ATE211481T1; DE19509038A1; CA2215176C; ES2170222T3; DE59608542D1; EP0815117B1; JP3639308B2; EP0815117A1; CA2215176A1; WO1996028460A1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般式Ｉ〜Ｖ：

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ−ヌクレオシド誘導体および核酸検出におけるその使用本発明は、Ｃ−ヌクレオシドおよびその誘導体、並びに核酸のラベリング（標識付け）、検出およびシークエンシング（塩基配列決定）におけるその使用に関する。核酸は遺伝情報の運搬体または伝達物質として生物界で中心的な役割を担っている。それゆえ、M．Miescher による発見以来、核酸は広範な科学的興味を刺激し、その機能、構造および作用機序の解明へと向かわせた。近年、分子生物学における核酸の基礎的な作用機序についての知識が増えるにつれて、遺伝子の新しい組合せを作ることが可能となった。この技術は例えば医学的診断・治療および植物の品種改良の分野で新たな機会を開くものである。こうした関係を解明しかつ諸問題を解決するための重要な手段は、その特異的検出およびその配列（すなわち、その一次配列）に関しての核酸の検出であったし、今もそうである。核酸の特異的検出能は、水素橋により塩基対を形成することで他の核酸と相互作用またはハイブリダイゼーションを行う核酸分子の性質に基づいている。こうして、適当な方法でラベルした、すなわちインジケーター基を有する、核酸（プローブ）を用いて相補的な核酸（標的）を検出することができる。一次構造（配列）、すなわち核酸の複素環式塩基の配列、を決定するにはシークエンシング技術を用いる。核酸配列のこの情報は、その後、分子生物学の問題および方法において核酸を標的と定めて特異的に使用する場合に不可欠である。また、シークエンシングには核酸間の特異的ハイブリダイゼーションも利用される。上述したように、このためにもラベルした核酸フラグメントが用いられる。その結果として、核酸の適当なラベリングがあらゆる検出法にとって絶対に必要な前提条件となる。 ³²Ｐや³⁵Ｓなどの適当なアイソトープによる放射性ラベリングは、この目的のために初期段階ですでに用いられていた。しかしながら、放射性試薬を用いることの欠点は明白である。すなわち、こうした作業には特別に装備した施設が必要であるし、また、放射性廃棄物の管理された厄介な処分問題が浮上する。さらに、放射性ラベリング用の試薬は高価であり、ラベルしたサンプルを長期間保存することも上記核種の半減期が短いため可能でない。それゆえ、近年、こうした重大な欠点を回避するため、すなわち放射性ラベリングを避けるために、多くの試みがなされている。そうするにあたって、このタイプのラベルの高感度は可能な限り保持されるべきである。実際、大きな進歩がすでに達成されている〔例えば、Nonradioactive Labelin g and Detection of Biomolecules（Kessler，C.発行）Springer Verlag，Berli n，Heidelberg，1992 を参照のこと〕。核酸の検出にとって絶対に必要な条件は、可能であれば非放射能的に、核酸を前もってラベルしなければならないということである。通常、核酸の放射性ラベリングは対応する放射性ヌクレオシド三リン酸の酵素触媒による取り込みにより行われるが、非放射性ラベリングは適当なシグナルまたはリポーター基を組み入れることによって達成されねばならない。特に適していることが判明した非放射性インジケーター分子は、中でも、ハプテン（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）、または蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）である。これらのシグナル基はいろいろな方法で核酸に結合させたり、組み入れることが可能である。比較的簡単な方法は、例えば、上記のタイプの活性化インジケーター分子を用いて、末端アミノ官能基を有するオリゴヌクレオチドの5'末端をラベルすることである。しかし、この方法は１個または数個のインジケーター分子を低分子オリゴマーにのみ導入することを可能にするにすぎず、より高い感度を達成する目的で、より長鎖の高分子核酸のより濃密なラベリングを達成するには、通常、deno vo（新規）合成のラインに沿ってポリメラーゼを用いてリポーター基を有するヌクレオシド三リン酸を組み込む必要がある。これに相当する方法は当業者にはニックトランスレーション[Rigby，P.W．ら，(1977)，J．Mol．Biol.，113，237]およびランダムプライムドラベリング[ran dom primed labelling; Feinberg，A.P．& Vogelstein，B.，(1984)，Anal. Biochem.，137，266]として知られている。別の方法はいわゆる3'-テイリング反応で、酵素ターミナルトランスフェラーゼを用いて行うものである。これらの方法においてこれまでに使用されてきたヌクレオシド三リン酸は、ほとんど例外なく、デオキシリボヌクレオチド系列では複素環式塩基アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの、そしてリボヌクレオチド系列ではアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの適切に修飾された誘導体である。この種の誘導体は例えば、Langerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，6635(1981);Muhl egger ら，Biol．Chem．Hoppe-Seyler 371，953(1990)および EP 0 063879 に記載されている。この場合は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中にもともと存在するビルディングブロックがラベルされた形で、すなわちシグナル基をもつ形で用いられる。Ｎ−ヌクレオシドの主な欠点は、酸性ｐＨ条件およびヌクレアーゼによる分解性に対するＮ−グリコシド結合の感受性である。さらに、個々のＣ−ヌクレオシド(例えば、Suhadolnik，R.J.，Nucleoside An tibiotics，Wiley-Interscience，New York 1970)およびその治療用途（抗ウイルスまたは制がん）が久しく知られている。加えて、蛍光性Ｃ−ヌクレオシド誘導体と、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドへのその組み込みが記載されている(WO 93/16094)。しかしながら、これらのＣ−ヌクレオシドのいわゆる固有の蛍光は、フルオレセインや対応するローダミン誘導体のような特殊な蛍光体よりも量子効率の点で何倍も低いものである。自己蛍光性Ｃ−ヌクレオシドの更なる欠点はその比較的低い励起および発光波長である。その結果、このような誘導体に基づく検出系は検出感度が低い一方で、測定環境（例えば、生物学的物質、ゲルマトリックスの自己蛍光など）のスペクトル干渉の影響を非常に受けやすくなる。こうして、既知のヌクレオシドおよびヌクレオシド誘導体は、特に核酸検出に対してよからぬ作用を及ぼすなどの欠点を数多く抱えている。それゆえ、本発明の目的は、上記の欠点を取り除いた、すなわち、特に安定であると同時に酵素的にプロセシングすることができ、より実用的な波長で核酸の検出に適している、核酸検出用のシグナル基で修飾されたヌクレオシド誘導体を提供することである。この目的は、一般式Ｉ−Ｖ：〔各式中、 R₁、R₂、R₃、R₄は同一であっても異なっていてもよく、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、カルボキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、低級アルキルオキシ、アリールオキシ、アラルキル、アラルキルオキシまたはリポーター基を表し、 R₅およびR₆はそれぞれが水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、低級アルキルオキシ、低級アルケノキシ、低級アルキノキシ、保護基またはリポーター基を表し、 R₇は水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート基、適当な方法で開裂可能なエステルまたはアミド残基、またはリポーター基を表し、 R₆とR₇は一緒になってC-2'とC-3'間の追加の結合またはアセタール基を形成し、 R₈は水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ基を表し、 R₉は水素、モノ- 、ジ- もしくはトリホスフェート基またはこれらのリン酸エステルのα、βもしくはγ- チオホスフェート類似体、または保護基を表す〕で表されるのピロロ-[3,2-d]ピリミジン、ピラゾロ-[4,3-d]ピリミジンおよびピリミジン- フラノシド並びにそれらの可能な互変異性体および塩により達成される。検出可能な基としては、特にハプテン、蛍光体、金属キレート基、化学発光体、タンパク質またはインターカレーターなどのリポーター基が入る。一般式Ｉ〜Ｖの化合物において、残基R₅およびR₇のアセタール官能基がリポーター基で置換されているものが好適である。さらに、リポーター基がいわゆるリンカー基を介してアグリコンまたはフラノース環に結合されている化合物が特に適しているとわかった。適当なリンカー基は当業者には公知である（例えば、Muhlegger，K．ら，Biol．Chem．Hoppe-Seyl er 371，953-965(1990)またはLivak，K.J．ら，Nucl．Acids Res．20,4831-4837 （1992）を参照のこと）。さらに、一般式Ｉ〜IVの化合物において、R₁が水素、ヒドロキシまたはアミノ基を表し、R₂がヒドロキシ、場合により置換されたアミノ基またはリポーター基を表し、R₃とR₄が水素、ハロゲンまたはリポーター基を表し、R₅が水素を表し、 R₆が水素またはヒドロキシを表し、R₇が水素、ヒドロキシ、チオ、場合により置換されたアミノ基、ホスホルアミダイトまたはリポーター基を表し、R₆とR₇が一緒になってアセタール官能基を表し、R₈が水素を表し、そしてR₉がトリホスフェート基を表す化合物が好適である。一般式Ｖの好適な化合物は、R₁がヒドロキシ、場合により置換されたチオもしくはアミノ基、またはリポーター基を表し、R₂とR₃が水素、低級アルキルまたはリポーター基を表し、R₅が水素を表し、R₆が水素またはヒドロキシを表し、R₇が水素、ヒドロキシ、チオ、場合により置換されたアミノ基、ホスホルアミダイトまたはリポーター基を表し、R₆とR₇が一緒になってアセタール官能基を表し、R₈ が水素を表し、そしてR₉がトリホスフェート基を表す化合物である。自然界にもともと存在する前駆物質から出発することにより、新しい修飾Ｃ− ヌクレオシドを合成することが得策である。したがって、例えばアデノシン類似体としてのフォルマイシン(formycin)Ａを脱アミノ化してフォルマイシンＢ（イノシン類似体）を形成することができる。その後これをハロゲン化し、さらに求核的に置換することができ、こうした方法により本発明のタイプの化合物のような、興味のある、一連の新規化合物を製造することが可能である。重要な 2'-デオキシ- ヌクレオシドを合成するには、自然界に存在する上記のリボヌクレオシド、例えばフォルマイシンＡを脱酸素化する。この場合、今日では、Bartonによる脱酸素化反応が主に用いられている（Barton，D.H.R．& Mothe rwell，W.B.，Pure Appl．Chem.，53，15(1981)）。さらに、Ｃ−ヌクレオシドは、例えば“Chemistry of Nukleosides and Nukle otides”3，42-535（L.B．Townsend 発行）Plenum Press，New York and London ，1994 中にK.A．Watanabe により詳述されるように、化学的に合成することができる。核酸をさまざまなシグナル基でラベルし、その後に核酸を検出して配列決定するために本発明の化合物を使用することは、特に有利であることが判明した。一般式Ｉ〜Ｖの本発明によるＣ−ヌクレオシドは、特に古典的なＮ−グリコシド結合で結合されたヌクレオシドおよびヌクレオチド、例えばアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジンおよび対応するそのリン酸エステル類と比べて、多くの利点を有する。一つの利点は例えば酸性ｐＨ条件に対するＣ−グリコシド結合の化学的安定性である。さらに重要な利点は、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる酵素分解に対するこれらの化合物の安定性である。こうした酵素は生物学的物質中に存在して、核酸検出を極度に妨害しうる。一方、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼは、多かれ少なかれ修飾されているヌクレオシド 5'-三リン酸を受け入れることに関して、すなわちde novo 合成においてこのようなヌクレオチドを物質として認識して取り込むことに関して、高い識別力があることが知られている。特に、ヌクレオチドへのシグナル基の結合は取り込みおよび取り込み速度に影響を及ぼすことが実験により示されている。本発明によるヌクレオシドおよびそれらの誘導体が、例えばニックトランスレーションまたはランダムプライムドラベリングの上記方法を用いて、適当なポリメラーゼにより核酸中に非常に効率よく取り込まれる事実は、現在の技術水準から容易に推し量ることはできず、それゆえ、当業者には驚くべきことと見なされるに違いない。上記の方法は一般に、核酸検出において、例えば膜上での、またはマイクロタイタープレートでのブロッティング法による定量的検出のために用いられる。シークエンシング、すなわち核酸の塩基配列決定においては、短い（開始）オリゴヌクレオチド（プライマー）およびポリメラーゼを用いて、配列決定すべき核酸上に相補的な反対鎖が新たに合成される。ある種の遺伝子またはゲノム断片を検出するin situハイブリダイゼーションでは、基本的に同じこと、すなわちラベルしたヌクレオチドの特異的取り込みが細胞内で起こる。上記のプライマー、すなわち短鎖オリゴヌクレオチドは鋳型鎖と安定した塩基対を形成するばかりでなく、最適な機能を確実にするために内因性ヌクレアーゼによって攻撃されないようにすべきである。それは、古典的なＮ−ヌクレオシドの代わりに、ビルディングブロックとして本発明によるＣ−ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドにより実現される。同じことがこのようなＣ−ヌクレオシドビルディングブロックを含有する長鎖ポリヌクレオチドおよび核酸にも当てはまる。これらも本発明の主題である。それゆえ、対応するオリゴヌクレオチド並びにそれらの製造前駆物質であるヌクレオシドホスホルアミダイトおよびヌクレオシドＨ−ホスホネートも本発明の主題である。今日、オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で公知の方法により合成されるのが常である。このような合成法は本質的に上記のホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートの段階的合成に基づいており、すなわち、これらのモノマービルディングブロックを連続的に結合させてオリゴマーを形成させる（例えば、T．Brown & D.J.S .Brown，Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach(1991)(Ecks tein．F．発行),IRL Press at Oxford University Press，Oxford，New York，T okyoを参照のこと）。図１の説明ＩおよびIIはDIG-dUTP取り込みでラベルしたpBR328 DNAを示し、III はDIG-3- O-スクシニル- ε- アミノ- カプロイル-[7-アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン-5'-トリホスフェート取り込みでラベルしたpBR328 DNAを示す。本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明することにする。実施例１ N¹- カルボキシメチル-7- アミノ-3-(β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン 70mg（0.25mmol）のフォルマイシンＡ、400mg（2.2mmol）のヨード酢酸エチルおよび400mg(2.88mmol)のK₂CO₃を５mlのメタノール／水（１：１）中で室温にて３時間攪拌した。次いで、この溶液を蒸発乾固させ、４mlの水に取り上げ、分離用HPLC(RP-18，25 x 1cm)でクロマトグラフにかけた。水で主要ゾーンを溶出し（Ｒ_E＝７分）、これを集めて濃縮した。凍結乾燥後に48mg(59%)の表題化合物を得た。 2'-デオキシ- フォルマイシンＡから出発して同様の方法で対応する 2'-デオキシ誘導体を製造できる。実施例２ 7- クロロ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ -[4,3-d]- ピリミジン 2'-デオキシ- フォルマイシンＢから出発して（リボフラノシル誘導体について L.B．Townsendらによって J．Chem．Soc．(C)1971，2443 に記載されるごとく）表題化合物を合成した。出発化合物は Barton 脱酸素化（Barton，D.H.R．& Motherwell，W.B.，Pure Appl．Chem.，53，15(1981)）により市販のフォルマイシンＢから得られた。実施例３ 7-[1,6- ジアミノヘキシル]-3-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン実施例２から得られた135mg（0.5mmol）のクロロ- ヌクレオシドを15mlのエタノール中に溶解し、300mg(約2.5mmol)のヘキサメチレンジアミンと混合し、３時間還流した。 TLC(シリカゲル; クロロホルム- メタノール 80:20)で、表題化合物へのほぼ定量的な変換が観察された。反応混合物を0.1M HClで中和し、蒸発させ、濃縮物を10mlのエタノールに溶解した。濾過により未溶解成分を取り除いた後、シリカゲル 60 カラムでクロマトグラフにかけ、クロロホルム- メタノールの混合溶媒（９：１）で溶出した。フラクションを合わせ、蒸発させ、ジオキサンから凍結乾燥させた（85mg＝理論量の48.5%）。 C₁₆H₂₆N₆O₃(350.2)の元素分析：計算値 C 54.9，H 7.4，N 24.0 実測値 C 55.3，H 7.6，N 23.7実施例４ 7-[N- トリフルオロアセトアミドヘキシル]-アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D-エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン実施例３から得られた80mg（0.23mmol）のヌクレオシドを10mlの無水ピリジンに溶解し、150 μl(約１mmol)の無水トリフルオロ酢酸と混合した。室温で５時間放置後、TLC でアシル化の完了を確認した。その後反応溶液を減圧で蒸発させ、メタノールとの共蒸発を３回行った。これをジオキサンから凍結乾燥させて目的の化合物を100mg(理論量の98％)得た。実施例５ 7-[N- トリフルオロアセトアミドヘキシル]-アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン-5'-トリホスフェート Yoshikawa らの方法［Tetrahedron Lett．50，5065(1967)]にしたがって、実施例４から得られた50mg（0.11mmol）の保護ヌクレオシドを POCl₃でリン酸化して5'モノホスフェートに変換した。Hoard & Ottの方法［J．Am．Chem．Soc．87, (1965)］にしたがって、この化合物をカルボニルジイミダゾールで活性化し、ピロリン酸と反応させることにより、DEAEセファデックスでのイオン交換クロマトグラフィー後に45mg(59％)の収量で目的のトリホスフェートを得た。³¹ P-NMR(0.1M EDTA/D₂O/Eth₃N): -5.4（d，P-γ）; -10.7（d，P- α); -21.2(t ，P- β)実施例６フルオレセイン-5(6)-カルボキサミドヘキシル-[7-アミノ-3-(2'- デオキシ- β -D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン-5'-トリホスフェート］実施例５から得られた35mg（0.05mmol）のトリフルオロアセチル基で保護した化合物を５mlの濃アンモニア液中で室温にて１時間放置し、続いて減圧下で蒸発させた。残留物を５mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液(pH8.5)に取り上げ、５mlのアミン不含ジメチルホルムアミドに溶解した31mg(0.065mmol)の5(6)- カルボキシ- フルオレセイン-N- ヒドロキシ- スクシンイミドエステルと混合した。これを室温で一夜放置した。反応混合物をDEAEセファデックスカラム（30 x 1cm）にかけて直線状のLiCl勾配（毎回 200mlのH₂O から0.4M LiCl まで）で溶出した。関係のあるフラクションを合わせ、蒸発させ、濃縮物をアセトン／エタノール（２：１）で沈殿させ、乾燥させて表題化合物を28mg(59%)得た。スペクトルデータ(0.1Mリン酸塩緩衝液，pH9.0): 励起_max[nm]: 495 発光_max[nm]: 521 ジゴキシゲニン-3-0- スクシニル-E- アミノカプロイル-[7-アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-1H- ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジン-5'-トリホスフェート]は、ヌクレオシドをジゴキシゲニン-3-0- スクシニル- アミノカプロン酸-N- ヒドロキシ- スクシンイミドエステルと反応させることにより同様に製造てきる。実施例７ N¹- ｛8-[N-t- ブトキシカルボニル]-アミノ-(3,6-ジオキサ)オクチル-1- アミドメチル｝-7- アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル）ピラゾロ-[4,3-d]ピリミジン 125mg（0.5mmol）の 2'-デオキシ- フォルマイシンＡ、369mg（1mmol）の(N¹- ブロモアセトアミド-N⁸-t-ブトキシカルボニル)-1,8-ジアミノ-3,6- ジオキサオクタンおよび1.4gのK₂CO₃を４mlのメタノール／水（１：１）中で室温にて３時間攪拌した。これを実施例１に記載したように処理した。RP-18 カラムでのクロマトグラフィー後に135mg（50%）の表題化合物を得た。実施例８ N¹- ｛8-アミノ-(3,6-ジオキサ)オクチル-1- アミドメチル｝-7- アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピラゾロ-[4,3-d]ピリミジン-5' -トリホスフェート実施例７から得られた135mg(0.25mmol)の保護ヌクレオシドを実施例５に記載したとおりにトリホスフェートに変換した。RP-18 カラムでのクロマトグラフィー後にトリフルオロ酢酸で１時間処理してBoc 保護基を除去した。最後に、QAE セファデックスでのクロマトグラフィーにかけて25mgの表題化合物を得た。³¹ P-NMR(0.1M EDTA/D₂O/Eth₃N): -6.4(d，P-γ); -11.1(d，P- α); -21.6(t，p - β)実施例９ジゴキシゲニン-3-0- スクシニル-E- アミノカプロイル-｛N¹-[8-アミノ-(3,6- ジオキサ)オクチル-1- アミドメチル]-7-アミノ-3-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル) ピラゾロ-[4,3-d]ピリミジン-5'-トリホスフェート｝実施例８から得られた17mg(0.024mmol)の化合物を５mlの0.1Mホウ酸塩緩衝液( pH8.5)に取り上げ、５mlのアミン不含ジメチルホルムアミドに溶解した25mg(0.0 36mmol)のジゴキシゲニン-3-0- スクシニル- アミノカプロン酸-N- ヒドロキシ- スクシンイミドエステルと混合した。これを室温で５時間攪拌し、続いてRP-18 シリカゲルでクロマトグラフにかけた。脱塩および凍結乾燥後に３mg(約10%)のラベルしたトリホスフェートを得た。実施例10 4- オキソ-7-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-3H,5H-ピロロ -[3,2-d]ピリミジン M.-I．Lim らによってTetrahedron Lett．1980，21，1013に記載されたリボフラノシル誘導体からBarton脱酸素化により表題化合物を得た。実施例11 4- クロロ-7-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-3H,5H-ピロロ -[3,2-d]ピリミジン Townsendらによって J．Chem．Soc．(C)，1971，2443に記載された方法により POCl₃でハロゲン化して表題化合物を合成した。実施例12 4-[1,6- ジアミノヘキシル]-7-(2'- デオキシ- β-D-エリトロ- ペントフラノシル)-3H,5H-ピロロ-[3,2-d]ピリミジン実施例３と同様に、実施例11から得られた塩素化化合物から出発してジアミノヘキサンとの反応により表題誘導体を得た。実施例13 フルオレセイン-5(6)-カルボキサミドヘキシル-[4-アミノ-7-(2'- デオキシ- β -D- エリトロ- ペントフラノシル)-3H,5H-ピロロ-[3,2-d]ピリミジン-5'-トリホスフェート] 実施例12から得られた誘導体から出発して、ジアミノ官能基をトリフレートで保護し、トリホスフェートを製造し、フルオレセイン-5(6)-カルボキサミド-N- ヒドロキシ- スクシンイミドエステルと反応させる各工程を経て表題化合物を合成した。各製造工程は実施例４、５および６に記載してある。実施例14 5-(2'- デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン- 5'-トリホスフェート J．Org．Chem．1982，47，485 にしたがって市販の5-( β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-ピリミジン-2,4- ジオン（シュードウリジン）の脱酸素化により製造した、650mg(2.85mmol)の5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)-ピリミジン-2,4- ジオンを、Ludwigの方法［Acta Biochem．et Biophys． Acad．Sci．Hung．(1981)，16，131］に従うワンポット法で5'-トリホスフェートに変換した。LiCl勾配（水から0.5Mまで）を用いるQAE セファデックスでのアニオン交換クロマトグラフィー、アセトン／エタノール（２：１）中での沈殿および乾燥により850mg（60%）の表題化合物を得た。³¹ P-NMR(0.1M EDTA/D₂O/Eth₃N): -6.8(d，P-γ); -11.0 (d，P- α); -22.0(t， p- β) 実施例15 N¹-[ エトキシプロピオニル]-5-(2'-デオキシ- β-D-エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェート実施例14から得られた100mg（0.2mmol）の2'-デオキシ- シュードウリジン-5' -トリホスフェートを５mlの１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH8.9)中に溶解し、５mlのエタノールと混合した。３ml（約30mmol）のアクリル酸エチルエステルを加え、混合物を室温で6.5 時間攪拌した。その後はTLC(イソ酪酸／濃アンモニア／水＝66／１／33)で遊離体をもはや観察できなかった。反応混合物を減圧下で蒸発させ、数mlのエタノールおよび水とともに１回共蒸発させた。粗生成物をそれ以上精製することなく実施例16に記載のごとく処理した。実施例16 N¹-[1,3- ジアミノプロピル]-5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェート実施例15からの生成物を５mlの水に溶解し、５mlのエタノールおよび２mlの1, 3-ジアミノプロパンと混合した。これを室温で一夜攪拌し、その後オイルポンプを使って残留物がねばっこくなるまで減圧下で濃縮した。これを数mlの水に取り上げ、希酢酸でpH６に調整した。酢酸トリエチルアンモニウム／アセトニトリル勾配を用いるRP 18 でのクロマトグラフィー／脱塩により1000 A₂₆₀単位(約0.1m mol)の粗混合物を得、この混合物から、LiClを用いるQAE セファデックスでのイオン交換クロマトグラフィー後に目的物質を単離した。 TLC(イソ酪酸／濃アンモニア／水＝66／１／33)：Ｒf 約0.3 ：ニンヒドリンと陽性反応実施例17 N¹-[ ジゴキシゲニン-3-0- メチルカルボニル- ε- アミノカプロイル-1,3- ジアミノプロピル- プロピオニル]-5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェート実施例16から得られた4.5mg(5μmol)のジアミノプロピル誘導体を１mlの0.1M ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)中に溶解し、１mlのアミン不含ジメチルホルムアミドに溶解した５mg(7.5 μmol)のジゴキシゲニン-3-0- メチルカルボニル- ε- アミノ- カプロン酸-N- ヒドロキシスクシンイミドエステルを加えた。この透明な溶液を室温で約３時間放置させた。その後反応溶液を蒸発させ、残留物を１mlの水に取り上げ、RP 18 クロマトグラフィー（カラム：Inertsil，250 x 8m m，酢酸トリエチルアンモニウム／アセトニトリル）により精製した。揮発性成分を減圧下で除去し、凍結乾燥した後７mg(90%)の表題化合物を得た。実施例18 テトラメチルローダミン-5(6)-カルボキサミド-｛N¹-[8-N-(3,6- ジオキサ)オクチル-1- アミド- メチル]-5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル )ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェート｝実施例17と同様にして、0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)/DMF中で実施例1 6からの18mg(30μmol)のトリホスフェートおよび17mg(32μmol)のテトラメチルローダミン-5(6)-カルボン酸-N- ヒドロキシ- スクシンイミドエステルを反応させることにより、TMR でラベルしたヌクレオチドを10.5mg得た。スペクトルデータ（0.1Mホウ酸Na緩衝液，pH8.5）：励起_max[nm]: 551 発光_max[nm]: 575実施例19 N¹-[ ジゴキシゲニン-3-0- メチルカルボニル- ε- アミノカプロイル-1,3- ジアミノプロピル- プロピオニル]-5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェートの取り込みによる非放射性ＤＮＡラベリングおよび検出 Boehringer Mannheim 社から販売されているキット（注文番号 1093 657）を使ってＤＮＡラベリングおよびＤＮＡ検出を行った。必要な作業工程はすべて説明書に記載されている。ラベリング反応の場合は、キットのdNTP混合物を（DIG-dUTPに変えて）実施例 17からのN¹-[ジゴキシゲニン-3-0- メチルカルボニル- ε- アミノカプロイル-1 ,3- ジアミノプロピル- プロピオニル]-5-(2'-デオキシ- β-D- エリトロ- ペントフラノシル)ピリミジン-2,4- ジオン-5'-トリホスフェートで１種類だけ取り替えた。免疫学的検出反応は、本発明による実施例17からの化合物の取り込みが、DIG- dUTPを用いたときと同程度の、ラベルしたＤＮＡの検出感度をもつことを示した。図１には、この系で達成された検出および感度を示してある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シーラ，フランクドイツ連邦共和国ディー49076 オスナブルーク，グーテンバーグシュトラーセ 44 (72)発明者ローゼマイヤー，ヘルムットドイツ連邦共和国ディー49076 オスナブルーク，ルーマンシュトラーセ 39 【要約の続き】で表されるピロロ-[3,2-d]ピリミジン、ピラゾロ-[4,3- d]ピリミジンおよびピリミジン- フラノシド（すなわち、いわゆるＣ−ヌクレオシド）または適当な誘導体並びにそれらの製造方法に関する。本化合物は特にＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼの基質として適しており、かくして、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み入れることができる。したがって、本化合物は核酸のラベリングおよび検出に、またはＤＮＡシークエンシングに特に適している。

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式Ｉ〜Ｖ：〔各式中、 R₁、R₂、R₃、R₄は同一であっても異なっていてもよく、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、カルボキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリール、低級アルキルオキシ、アリールオキシ、アラルキル、アラルキルオキシまたはリポーター基を表し、 R₅およびR₆はそれぞれが水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、低級アルキルオキシ、低級アルケノキシ、低級アルキノキシ、保護基またはリポーター基を表し、 R₇は水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート基、適当な方法で開裂可能なエステルまたはアミド残基、またはリポーター基を表し、 R₆とR₇は一緒になってC-2'とC-3'間の追加の結合またはアセタール基を形成し、 R₈は水素、ヒドロキシ、チオまたは置換チオ、アミノまたは置換アミノ基を表し、 R₉は水素、モノ- 、ジ- もしくはトリホスフェート基またはこれらのリン酸エステルのα、βもしくはγ- チオホスフェート類似体、または保護基を表す〕で表されるのピロロ-[3,2-d]- ピリミジン、ピラゾロ-[4,3-d]- ピリミジンおよびピリミジン- フラノシド並びにそれらの可能な互変異性体および塩。２．アセタール官能基がリポーター基で置換されている、請求項１に記載の化合物。３．リポーター基がハプテン、蛍光体、金属キレート、化学発光体、タンパク質またはインターカレーターを示す、請求項１または２に記載の化合物。４．リポーター基がリンカー基を介して結合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。５．ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの基質としての請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。６．核酸をラベルするための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。７．核酸を検出するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。８．ＤＮＡシークエンシングにおける請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。９．in situ ハイブリダイゼーションにおける請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。 10．オリゴヌクレオチドの化学合成のためのR₇がホスホルアミダイトまたはＨ− ホスホネートである請求項１に記載の化合物の使用。 11．請求項１〜４に記載した化合物を１個または数個含有するオリゴヌクレオチド。 12．請求項１〜４に記載した化合物を１個または数個含有する核酸。