ES2959608T3

ES2959608T3 - Composición y métodos de edición del genoma de células B

Info

Publication number: ES2959608T3
Application number: ES16716781T
Authority: ES
Inventors: Michael Goldberg; Vera GREINER
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2016-04-04
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2036-04-04
Also published as: WO2017176806A9; EP4335918A2; EP3440195A1; JP7515254B2; AU2017246411A1; WO2017176806A1; EP3277823A1; WO2016161446A1; CA2981077A1; JP7463442B2; US20180094243A1; AU2016243052B2; AU2022259851B2; JP2019510513A; CN109072193A; EP4541900A2; EP3277823B1; EP4541900A3; CA3019144A1; AU2023274129A1

Abstract

La presente invención proporciona métodos, composiciones y métodos para preparar células B autólogas que secretan un monoclonal de interés útil en inmunoterapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y métodos de edición del genoma de células B

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad y beneficio de Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 62/142,882, presentada el 3 de abril de 2015.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para desarrollar células B diseñadas para inmunoterapia y más específicamente a métodos para modificar células B mediante el uso de edición del genoma para sustituir el receptor endógeno de células B con un anticuerpo monoclonal terapéutico definido.

Antecedentes de la invención

Las terapias con anticuerpos monoclonales se utilizan ampliamente en el tratamiento de una variedad de enfermedades, desde cáncer hasta enfermedades autoinmunes. Aunque confieren enormes beneficios médicos, los anticuerpos deben administrarse mediante inyecciones repetidas (a menudo intravenosas). Para muchos anticuerpos, esta administración debe realizarse en un entorno clínico que requiere desplazamientos, tiempo y profesionales médicos capacitados. Además, los anticuerpos producidos en biorreactores(por ejemplo,utilizando células CHO) pueden tener patrones de glicosilación que no son de origen humano y por tanto pueden generar respuestas inmunes adversas.

Existe una necesidad de composición y métodos para diseñar células B de un paciente para producir y secretar anticuerpos monoclonales contra el objetivo de una enfermedad.

Duvall et al., (MABS, Landes Bioscience, 2011, vol 3, no. 2) describen el uso de células B humanas inalteradas aisladas de tejido de amígdalas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Duvall et al., (Current Drug Discovery Tech UAE, vol 11, no.1, 2014) describe diferentes enfoques para la obtención de anticuerpos a partir de células B humanas.

Tatiana Flisikowska et al., (PLOS, vol.6, no. 6, 2011) describen la eficaz alteración del gen de las inmunoglobulinas y su sustitución dirigida en conejos utilizando nucleasas con dedos de zinc. WO 2008/151081 describe la producción de anticuerpos en animales no humanos que tienen su locus de inmunoglobulina endógeno inactivado por meganucleasas. También describe células B derivadas de animales transgénicos.

El documento US2004158880 describe la producción de anticuerpos en animales no humanos transgénicos que tienen un locus de Ig inactivado.

Sumario de la invención

La invención se define en la reivindicación 1. Otras realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes. La invención proporciona un método para producir un linfocito B humano aislado y sus descendientes que tienen una o más modificaciones genómicas de manera que el linfocito no expresa su receptor de células B endógeno y secreta un anticuerpo monoclonal terapéutico definido.

La invención proporciona un método para preparar células B humanas que producen anticuerpos terapéuticos para inmunoterapia para un sujeto que comprende modificar genómicamente una población de células B primarias mediante edición del genoma para sustituir las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un receptor de células B endógeno con secuencias de nucleótidos introduciendo al menos un corte en un genoma de células B e incorporando ADN exógeno en el sitio de corte mediante recombinación homóloga, en donde dicho corte está en un loci de cadena pesada y ligera del receptor de células B y en donde dicho ADN exógeno codifica el anticuerpo monoclonal terapéutico, en donde la población de células B primarias se activa antes de la modificación.

Opcionalmente, el método incluye además expandir las células B. La población comprende al menos 1 * 106 Células B. La población de células B se activa antes de la modificación. Las células B se activan con una citoquina como la IL-4.

El anticuerpo monoclonal terapéutico es específico para CXCR4, TNF-a, IGHE, IL-1, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-9, IL-13, IL-17A, IL-20, IL-22, IL-23, IL-25, BAFF, RANKL, Intergrin-a4, IL-6R, VEGF-A, VEGFR1, VEGFR2, EGFR, HER2, HER3, CA125, integrina a4p7, integrina a7p7, receptor de interferón a/p, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79B, CD80, CD125, CD137, CD140a, CD147, CD152, CD154, CD200, CD221, CCR4, CCR5, gp120, angiopoyetina 3, PCSK9, HNGF, HGF, GD2, GD3, C5, FAP, ICAM-1, LFA-1, interferón alfa, interferón gamma, proteína inducida por interferón gamma, SLAMF7, HHGFR, receptor TWEAK, NRP1, EpCAM, CEA, antígeno mesotelina relacionado con CEA, MUC1, IGF-1R, TRAIL-R2, DR5, D<l>L4, VWF, MCP-1, p-amiloide, fosfatidilserina, factor Rhesus, CCL11, NARP-1, RTN4, ACVR2B, SOST, NOGO-A, esclerostina, influenza aviar, hemaglutinina de influenza A, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus respiratorio sincitial, glicoproteína del virus de la rabia, glicoproteína B del citomegalovirus, tuberculosis, ébola, Staphylococcus aureus, SARS, MERS, malaria, VPH, VHS, TGF-p, TGF-PR1, NGF, LTA, AOC3, ITGA2, GM-CSF, receptor de GM-CSF, oxLDL, LOXL2, RON, KIR2D, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, episialina, miostatina o VIH-1.

La modificación genómica se logra utilizando una nucleasa diseñada como una nucleasa Cas, una nucleasa con dedos de zinc o una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción. La nucleasa diseñada se transfecta a la célula B mediante nucleofección. Preferiblemente, la modificación se logra usando un complejo de ribonucleoproteína Cas9-ARNg. El ARNg es específico para un locus de inmunoglobina.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.

En casos de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos descritos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes y abarcadas por la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C son una serie de esquemas que representan la reordenación en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina (Fig. 1A), la defensa inmune bacteriana del sistema CRISPR/Cas (Fig. 1B) y la edición del genoma del receptor de células B humanas utilizando el sistema CRISPR Cash (Fig..1C). (Fig. 1A) La región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina se ensambla a partir de segmentos de genes de componente variable (VH), diversidad (DH) y unión (JH) mediante recombinación V(D)J. El proceso de reordenamiento implica la escisión de las secuencias señal de recombinación en el ADN, que flanquean los segmentos del gen reordenado, que se lleva a cabo mediante el complejo gen activador de recombinación 1 (RAG1)-RAG2. La unión de los extremos del ADN requiere proteínas de unión de extremos no homólogas (NHEJ), incluidas Ku70, Ku80, ARTEMIS, la proteína 4 de complementación cruzada de reparación de rayos X (XRCC4), la ADN ligasa IV y la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs). La transcripción a través del locus es impulsada por un promotor corriente arriba del segmento VDJ reordenado (flecha azul), que facilita la síntesis de una p cadena pesada. Luego se asocia con una cadena ligera, formando así una molécula de IgM, que se muestra en la superficie celular de una célula B. Posteriormente, los isotipos secundarios se producen mediante recombinación de cambio de clase (CSR), un proceso que intercambia la región constante de la cadena pesada (CH) con un conjunto de genes de región constante posteriores (se muestra CSR a IgE). Esta reacción de recombinación delecional, que requiere la activación de la enzima citidina desaminasa (AID), implica la generación de roturas del ADN en las regiones de cambio (S), que preceden a los genes de la región constante, seguidas de la reparación del ADN. Esto conduce a un locus CH reordenado y a la eliminación de la secuencia intermedia como un círculo episomal. Las citoquinas estimulan la transcripción (flechas rojas) a través del gen CH y determinan el isotipo de inmunoglobulina al que cambiará la célula B. Las regiones variables reordenadas de las cadenas pesada y ligera también sufren una alta tasa de mutación puntual mediante el proceso de hipermutación somática (SHM) (no mostrado). Los potenciadores de la región reguladora E|j y 3' (3' RR) influyen en la recombinación V(D)J y la CSR, respectivamente.

Figuras 2A y 2B son una serie de esquemas que representan el suministro de ARNg de Cas9 (Fig. 2A) y varios vectores Cas9 que tienen constructos bicistrónicos de GFP y Cas9, incluido un sitio T2A. Los vectores seleccionados tienen diferentes promotores.

Figuras 3A y 3B son una serie de gráficos que representan la eficiencia de la nucleofección de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un constructo eGFP. Las Figuras 3A y 3B son una serie de citometría de flujo y gráficos de barras que representan variaciones en las cantidades de eGFP observadas en PBMC nucleofectadas en función de la concentración de PBMC nucleofectadas (1 x 106 y 1*107 (Figura 3A), y 5*10® y 1x107 (Figura 3B)).

Figuras 4A y 4B son una serie de gráficos que representan la eficiencia de la nucleofección de PBMC con un constructo GFP-Cas9. Las Figuras 3A y 3B son una serie de citometría de flujo y gráficos de barras que representan variaciones en la cantidad de eGFP detectada observadas después de la nucleofección con el constructo GFP-Cas9.

Figuras 5A y 5B son una serie de gráficos que representan la nucleofección de PBMC con un constructo eGFP, un constructo GFP-Cas9 o una condición de control sin ADN, y los efectos resultantes sobre la viabilidad celular después del proceso de nucleofección (Figuras 5A y 5B). La Figura 5B muestra gráficos de viabilidad celular y el porcentaje de PBMC que expresan GFP después de la nucleofección de PBMC.

Figura 6 es una serie de gráficos que demuestran el aislamiento de células B basándose en la expresión del marcador (CD 19); la viabilidad de las células B aisladas después de la transfección con ADN de eGFP, ARNm de eGFP, una condición sin ADN y una condición no transfectada; y el porcentaje de células transfectadas que expresan ADN en función de las condiciones de transfección.

Figura 7A-7D son una serie de gráficos que representan la viabilidad y el porcentaje de células B que son positivas para eGFP después de la nucleofección de células B con un constructo eGFP, un constructo GFP-Cas9, una condición sin ADN y una condición no transfectada. Como variable para estos experimentos se evaluaron varios programas de Nucleofección, U-015, U-017 y V-015 (Figuras 7A y 7B). Se nucleofectaron varios tipos de constructos de ADN, en concentraciones particulares, en células B aisladas para evaluar los efectos sobre la viabilidad de la nucleofectación de constructos de ADN particulares a una concentración seleccionada de los constructos de ADN en las células B (Figura 7C). Se realizaron experimentos similares con líneas celulares, Ramos y U266 (Figura 7D).

Figuras 8A y 8B son una serie de gráficos que representan el efecto sobre la viabilidad celular y el porcentaje de células que expresan GFP al cultivar las células B aisladas en presencia de IL-4 o IL4/IL21/CD40L antes o después de la nucleofección.

Figuras 9A y 9B son una serie de gráficos que representan los efectos de diversas condiciones sobre la viabilidad y/o la expresión de eGFP de las células nucleofectadas. La Figura 9A es una serie de gráficos que representan la viabilidad y la expresión de eGFP de células B nucleofectadas con diversas concentraciones de contratos de ADN representados en los gráficos. La Figura 9B es una serie de gráficos que representan los efectos de la adición de citoquinas (es decir, IL4, o IL4/IL21/aCD40 antes o después de la transfección) sobre la viabilidad celular como lo indica la tinción con 7-AAD, y la cantidad de B positiva para células GFP

Figuras 10A y 10B (Activación de células B 1 semana antes de la transfección) son una serie de gráficos que representan la viabilidad y el porcentaje de células que expresan GFP o CAS9 después de la nucleofección con varios constructos de ADN, en presencia de IL-4 o IL-4/IL-21. /aCD40.

Figuras 11Ay 11B son una serie de gráficos que representan los efectos de varios métodos de aislamiento celular sobre la viabilidad de las células y el porcentaje de células que expresan GFP después de la nucleofección con constructos de ADN. Los métodos de aislamiento probados fueron el Aislamiento y Separación Magnética de Células (MACS®) y RosetteSep®.

Figuras 12A y 12B son una serie de gráficos que representan la viabilidad celular de las células B y el porcentaje de células que expresan GFP en diversas condiciones de transfección utilizando el dispositivo de transfección Neon®.

Figura 13A es una serie de gráficos que representan la viabilidad de las células B y el porcentaje de células B que expresan GFP después de la nucleofección con varios programas Amaxa® (V-015, V-016, V-017). Figura 13B es una serie de gráficos que representan la viabilidad de PBMC y el porcentaje de PBMC que expresan GFP después de la nucleofección con varios programas Amaxa® (V-015, V-016, V-017).

Figuras 14A y 14B (activación con fibroblastos que expresan CD40L) son una serie de gráficos que representan la viabilidad celular, el porcentaje de células que expresan GFP o GFP-Cas9 en células B (Figura 14A) o en PMBC completas (Figura 14B) cocultivadas con células 3T3 irradiadas que expresan CD40L.

Figuras 15A-15C son una serie de gráficos que representan la viabilidad celular, el porcentaje de células que expresan GFP o GFP-Cas9 en células B (Figura 15A y 15B) o en la línea de células B U266 (Figura 15C) cocultivadas con células 3T3 irradiadas que expresan CD40L.

Figura 16 es una serie de gráficos que proporcionan un resumen de los ensayos de nucleofección de células B realizados.

Figuras 17A-D Es un esquema y una serie de gráficos y geles que representan la orientación de CXCR4 en células B humanas con Cas9 RNP Los datos indican que la expresión de CXCR4 en células B se reduce hasta un 70% después de apuntar con Cas9 RNP formando un complejo con la columna vertebral de gCXCR4 extraída del papel PNAS (gCXCR4 PNAS).

Figuras 18A y 18B son una serie de geles que representan la inserción de la plantilla HDR en el locus CXCR4 con Cas9 RNP (Figura 18A) y la optimización de la eficiencia de HDR mediante el inhibidor de NHEJ Scr7 (Figura 18B). Las RNP son ribonucleoproteínas.

Figuras 19A-C son una serie de geles que demuestran la focalización del locus del receptor de células B humanas con Cas9 RNP La Figura 19A es una serie de geles que representan ensayos para determinar secuencias de cebadores para amplificar cuatro loci de corte específicos. La Figura 19B es una serie de geles que representan la identificación de ARNg que se dirigen a loci BCR humanos.

Figura 20 es un gráfico que representa los resultados de los ensayos para determinar la viabilidad de las células B humanas primarias después de la transfección con RNP

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona métodos para producir células B específicas para un objetivo de interés. La célula B puede ser autóloga o alogénica. Los tratamientos actuales con anticuerpos monoclonales requieren inyecciones periódicas, que normalmente requieren que los pacientes se desplacen a centros médicos y/o incurran en morbilidad recurrente.

Por el contrario, la presente invención proporciona métodos para preparar células B específicas de la diana que, después de la inyección en el paciente, producirán de manera constante anticuerpos terapéuticos específicos de la diana. Esta producción constante de anticuerpos también puede dar lugar a mejores resultados clínicos, ya que la concentración del fármaco debe permanecer relativamente constante y no fluctuar, como ocurre entre inyecciones. Además, algunos anticuerpos terapéuticos comerciales contienen porciones que no son humanas y, por tanto, pueden generar respuestas inmunitarias neutralizantes o incluso adversas. Debido a que los anticuerpos terapéuticos serán producidos por células humanas mediante los métodos de la invención, sus regiones constantes serán completamente humanas y, por lo tanto, no se esperan efectos inmunológicos adversos.

Específicamente, los métodos de la presente invención emplean el uso de edición del genoma para sustituir los receptores endógenos de células B (BCR) de células B de pacientes con secuencias de anticuerpos monoclonales terapéuticos definidos. Se editarán las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de las BCR y se aislarán las células B modificadas con el genoma resultante. Debido a que las células plasmáticas pueden diferenciarse en células de memoria, habrá una población residual de células productoras de anticuerpos durante un período de tiempo prolongado, potencialmente durante toda la vida del paciente.

Por consiguiente, la invención proporciona métodos dirigidos al uso de ADN exógeno, enzimas nucleasas tales como proteínas de unión a ADN y ARN guía para localizar las enzimas nucleasas en secuencias de ADN específicas dentro de una célula B. Tras el corte del ADN endógeno, el ADN exógeno se incorporará en ese sitio mediante recombinación homóloga.

Preferiblemente, el ADN se cortará en o cerca de IGHV3-23 e IGHJ6 así como IGKV3-20 e IGKJ5. Loci de interés adicionales incluyen IGHV1-69, IGHV3-30, IGHJ4, IGKV1-39 e IGKJ4. Más específicamente, el ADN se cortará entre chr2p11.2:88,857,000 y chr2p11.2:89,350,000 (incluye loci IGKC e IGKV, ensamblaje primario NC_000002.12 Cromosoma 2 de referencia GRCh38.p2), así como entre chr14q32.33:105,624,000 y chr14q32.33:106,880,000 (incluye loci IGHG4 e IGHV, NC_000014.9 Conjunto primario de referencia del cromosoma 2 GRCh38.p2). Opcionalmente, el ADN se cortará entre chr2p 22026076 y chr2p22922913 (incluye loci IGLC e IGLV)

En diversas realizaciones, se incluye un interruptor de seguridad inducible que permite activar y desactivar la producción del anticuerpo terapéutico. Los interruptores de seguridad adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una Caspasa 9 inducible.

Anticuerpos monoclonales terapéuticos

Las células B producidas mediante los métodos de la invención están diseñadas para secretar un anticuerpo monoclonal terapéutico. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, 3F8,8H9, Abagovomab, Abciximab, Abrilumab, Actoxumab, Adalimumab, Adecatumumab, Aducanumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD518, Alemtuzumab,Alirocumab, Altumomab pentetate, Amatuximab, Anatumomab mafenatox, Anifrolumab,Anrukinzumab, (= IMA-638), Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atinumab, Atlizumab (= tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Bezlotoxumab, Biciromab, Bimagrumab, Bivatuzumab mertansine, Blinatumomab, Blosozumab, Brentuximab vedotin, Briakinumab, Brodalumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansine, Cantuzumab ravtansine, Caplacizumab, Capromab pendetide, Carlumab, Catumaxomab, CC49, immunoconjugado de cBR96-doxorrubicina, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuximab, Ch.14.18, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clazakizumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetan, Conatumumab, Concizumab, Crenezumab, CR6261, Dacetuzumab, Daclizumab, Dalotuzumab, Daratumumab, Demcizumab, Denosumab, Detumomab, Dinutuximab, Diridavumab, Dorlimomab aritox, Drozitumab, Duligotumab, Dupilumab, Durvalumab, Dusigitumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Eldelumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Emibetuzumab, Enavatuzumab, Enfortumab vedotin, Enlimomab pegol, Enokizumab, Enoticumab, Ensituximab, Epitumomab cituxetan, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Etrolizumab, Evinacumab, Evolocumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzumab, Fasinumab, FBTA05, Felvizumab, Fezakinumab, Ficlatuzumab, Figitumumab, Flanvotumab, Fletikumab, Fontolizumab, Foralumab, Foravirumab, Fresolimumab, Fulranumab, Futuximab, Galiximab, Ganitumab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicin, Gevokizumab, Girentuximab, Glembatumumab vedotin, Golimumab, Gomiliximab, Guselkumab, Ibalizumab, Ibritumomab tiuxetan, Icrucumab, Igovomab, IMAB362, Imciromab, Imgatuzumab, Inclacumab, Indatuximab ravtansine, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicin, Ipilimumab, Iratumumab, Itolizumab, Ixekizumab, Keliximab, Labetuzumab, Lambrolizumab, Lampalizumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lifastuzumab vedotin, Ligelizumab, Lintuzumab, Lirilumab, Lodelcizumab, Lorvotuzumab mertansine, Lucatumumab, Lulizumab pegol, Lumiliximab, Mapatumumab, Margetuximab, Maslimomab, Mavrilimumab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Mogamulizumab, Morolimumab, Motavizumab, Moxetumomab pasudotox, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Namilumab, Naptumomab estafenatox, Narnatumab, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nesvacumab, Nimotuzumab, Nivolumab, Nofetumomab merpentan, Obiltoxaximab, Ocaratuzumab, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Olokizumab, Omalizumab, Onartuzumab, Ontuxizumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Orticumab, Otelixizumab, Otlertuzumab, Oxelumab, Ozanezumab, Ozoralizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Pankomab, Panobacumab, Parsatuzumab, Pascolizumab, Pateclizumab, Patritumab, Pembrolizumab, Pemtumomab, Perakizumab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pidilizumab, Pinatuzumab vedotin, Pintumomab, Placulumab, Polatuzumab vedotin, Ponezumab, Priliximab, Pritoxaximab, Pritumumab, PRO 140, Quilizumab, Racotumomab, Radretumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Roledumab, Romosozumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Samalizumab, Sarilumab, Satumomab pendetide, Secukinumab, Seribantumab, Setoxaximab, Sevirumab, Sibrotuzumab, SGN-CD19A, SGN-CD33A, Sifalimumab, Siltuximab, Simtuzumab, Siplizumab, Sirukumab, Sofituzumab vedotin, Solanezumab, Solitomab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Suvizumab, Tabalumab, Tacatuzumab tetraxetan, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tarextumab, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Teprotumumab, TGN1412, Ticilimumab (= tremelimumab), Tildrakizumab, Tigatuzumab, TNX-650, Tocilizumab (= atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Tovetumab, Tralokinumab, Trastuzumab, TRBS07, Tregalizumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleukin, Tuvirumab, Ublituximab, Urelumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Vantictumab, Vapaliximab, Varlilumab, Vatelizumab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Vesencumab, Visilizumab, Volociximab, Vorsetuzumab mafodotin, Votumumab, Zalutumumab Zanolimumab, Zatuximab, Ziralimumab, y Zolimomab.

Los anticuerpos terapéuticos pueden ser específicos para TNF-a, IGHE, IL-1, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-9, IL-13, IL- 17A, IL-20, IL-22, IL-23, IL-25, BAFF, RANKL, Intergrin-a4, IL-6R, VEGF-A, VEGFR1, VEGFR2, EGFR, HER2, HER3, CA125, integrina a4p7, integrina a7p7, receptor de interferón a/p, CXCR4, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79B, CD80, CD125, CD137, CD140a, CD147, CD152, CD154, CD200, CD221, CCR4, CCR5, gp120, angiopoyetina 3, PCSK9, HNGF, HGF, GD2, GD3, C5, FAP, ICAM-1, LFA-1, interferón alfa, interferón gamma, proteína inducida por interferón gamma, SLAMF7, HHGFR, receptor TWEAK, NRP1, EpCAM, CEA, antígeno mesotelina relacionado con CEA, MUC1, IGF-1R, TRAIL-R2, DR5, D<l>L4, VWF, MCP-1, p-amiloide, fosfatidilserina, factor Rhesus, CCL11, CXCR4 NARP-1, RTN4, ACVR2B, SOST, NOGO-A, esclerostina, influenza aviar, hemaglutinina de influenza A, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus respiratorio sincitial, glicoproteína del virus de la rabia, glicoproteína B del citomegalovirus, tuberculosis, ébola, Staphylococcus aureus, SARS, MERS, malaria, VPH, VHS, TGF-p, TGF-PR1, NGF, LTA, AOC3, ITGA2, GM-CSF, receptor de GM-CSF, oxLDL, LOXL2, RON, KIR2D, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, episialina, miostatina o VIH-1

Edición de gen

La edición de genes, o edición del genoma, es un tipo de ingeniería genética en la que se inserta, reemplaza o elimina ADN de un genoma utilizando nucleasas diseñadas artificialmente. Las nucleasas crean roturas bicatenarias específicas (DSB) en ubicaciones deseadas del genoma. Los mecanismos de reparación endógenos de la célula pueden reparar posteriormente las roturas inducidas mediante procesos naturales, como la recombinación homóloga (HR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Las nucleasas diseñadas incluyen, por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas y endonucleasas de anidamiento rediseñadas con meganucleasas.

Dominios de unión al ADN

En el presente documento se describen composiciones que comprenden un dominio de unión al ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen de inmunoglobulina. Se puede utilizar cualquier dominio de unión a ADN en las composiciones y métodos descritos en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión al ADN comprende una proteína con dedos de zinc. Preferiblemente, la proteína con dedos de zinc no se produce de forma natural porque está diseñada para unirse a un sitio objetivo de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; U.S. Pat. Nos. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; y U.S. Patent Publication Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión con dedos de zinc diseñado puede tener una especificidad de unión novedosa en comparación con una proteína con dedos de zinc (ZFP) natural. Los métodos de ingeniería incluyen, entre otros, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete particular o cuadruplete. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos 6,453,242 y 6,534,261.

Los métodos de selección de ejemplo, que incluyen presentación en fagos y sistemas de dos híbridos, se describen en Patentes U.S. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; y 6,242,568; así como en WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2,338,237. Además, se ha descrito una mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en Patente U.S. No. 6,794,136.

Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc múltiples pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase también, Patente de EE.UU. Nos 6,479,626; 6,903,185; y 7,153,949 para secuencias enlazadoras de ejemplo de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, se ha descrito una mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en Patente U.S. No. 6794,136.

Selección de sitios objetivo; Los expertos en la técnica conocen las ZFP y los métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) y se describen en detalle en U.S. Pat. Nos. 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión al ADN es una proteína con dedos de zinc diseñada que se une (de una manera específica de secuencia) a un sitio diana en un gen HLA o gen regulador de HLA y modula la expresión de HLA. Las ZFP pueden unirse selectivamente a un haplotipo de interés específico. Para una discusión sobre los haplotipos HLA identificados en la población de Estados Unidos y su frecuencia según las diferentes razas, véase Maiers et al. (2007) Human Immunology 68: 779-788 ■

En algunas realizaciones, el dominio de unión al ADN puede derivar de una nucleasa. Por ejemplo, las secuencias de reconocimiento de endonucleasas y meganucleasas de anidamiento, tales como I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, Pl-Sce, I-ScelV, I-Csml, I-Panl, I-Scell, I-Ppol, I-Scelll, I-Ciel, I-Tevl, I-Tevll y I-Tevlll se conocen. Véase también U.S. Pat. No.

5,420,032; U.S. Pat. No. 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de las endonucleasas y meganucleasas dirigidas se puede diseñar para unirse a sitios objetivo no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; U.S. Publicación de patente de EE. UU. N° 20070117128.

En otras realizaciones, el dominio de unión al ADN comprende un dominio diseñado a partir de un efector TAL similar a los derivados de los patógenos vegetales Xanthomonas (ver Boch et al., (2009) Science 326: 1509-1512 and Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326: 1501) and Ralstonia (see Heuer et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384); Solicictudes de patente Nos. 20110301073 y 20110145940. Se sabe que las bacterias fitopatógenas del género Xanthomonas causan muchas enfermedades en importantes plantas de cultivo. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema de secreción conservado de tipo III (T3S), que puede inyectar más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran los efectores similares a activadores de la transcripción (TALE), que imitan los activadores transcripcionales de las plantas y manipulan el transcriptoma de las plantas (ver Kay y col. (2007) Ciencia 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión al<a>D<n>y un dominio de activación transcripcional. Uno de los TALE mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y WO2010079430). Los TALE contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, cada repetición contiene aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión, consulte Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163 (3): 256-272). Además, en la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum, se han encontrado dos genes, denominados brg11 y hpx17, que son homólogos a la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa GMI1000 de biovar 1 de R. solanacearum y en la cepa RS1000 de biovar 4 (véase Heuer et al. (2007) Appl y Envir Micro 73(13): 4379-4384). Estos genes son 98,9% idénticos en la secuencia de nucleótidos entre sí, pero se diferencian por una eliminación de 1.575 pb en el dominio repetido de hpx17. Sin embargo, ambos productos genéticos tienen menos del 40% de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas.

Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o proteínas de dedos de zinc de múltiples dedos o TALE pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase también Patente de EE.UU. Nos 6,479,626; 6,903,185; y 7,153,949 para secuencias enlazadoras de ejemplo de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, se ha descrito una mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en Patente de EE.UU. No. 6,794,136.

Proteínas de fusión

En determinadas realizaciones, la proteína de fusión comprende un dominio de unión al ADN y un dominio de escisión (nucleasa). Como tal, la modificación genética se puede lograr usando una nucleasa, por ejemplo una nucleasa modificada genéticamente. La tecnología de nucleasas diseñadas se basa en la ingeniería de proteínas de unión al ADN naturales. Por ejemplo, se ha descrito la ingeniería de endonucleasas dirigidas con especificidades de unión al ADN adaptadas. Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Amould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458. Además, también se ha descrito la ingeniería de ZFP Véase, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,979,539; 6,933,113; 7,163,824; y 7,013,219.

En realizaciones preferidas, la nucleasa comprende un sistema CRISPR/Cas. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas), que codifica los componentes de ARN del sistema, y el locus Cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60) forman las secuencias genéticas del sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Los loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión de ácidos nucleicos mediada por CRISPR.

El CRISPR tipo II es uno de los sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo roturas específicas de la doble cadena del ADN en cuatro pasos secuenciales. Primero, se transcriben dos ARN no codificantes, la matriz de pre-ARNcr y el ARNcrtra, del locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNcrtra se hibrida con las regiones repetidas del pre-ARNcr y media el procesamiento del pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. En tercer lugar, el complejo ARNcr:ARNcrtra maduro dirige Cas9 al ADN objetivo mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick entre el espaciador del ARNcr y el protoespaciador en el ADN objetivo junto al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento del objetivo.. Finalmente, Cas9 media la escisión del ADN objetivo para crear una rotura bicatenaria dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas consta de tres pasos: (i) inserción de secuencias de ADN extraño en la matriz CRISPR para evitar futuros ataques, en un proceso llamado "adaptación", (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) Interferencia mediada por a Rn por el ácido nucleico extraño. Así, en la célula bacteriana, varias de las llamadas proteínas 'Cas' están implicadas en la función natural del sistema CRISPR/Cas y desempeñan funciones como la inserción del ADN extraño, etc.

En determinadas realizaciones, la proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas de origen natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, entre otros, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional de hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término "derivado" abarca tanto variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido, como modificaciones covalentes y fusiones de los mismos. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, entre otros, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, puede obtenerse a partir de una célula o producirsein vitroo por una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce de forma natural proteína Cas o una célula que produce de forma natural proteína Cas y está diseñada genéticamente para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido exógenamente, que codifica una Cas que es igual o diferente al Cas endógeno. En algunos casos, la célula no produce proteína Cas de forma natural y está diseñada genéticamente para producir una proteína Cas.

El método también incluye la introducción de ARN de guía única (ARNsg) en la célula o en el organismo. Los ARN guía (ARNsg) incluyen secuencias de nucleótidos que son complementarias al ADN cromosómico objetivo. Los ARNsg pueden ser, por ejemplo, ARN guía de cadena única diseñados que comprenden una secuencia de ARNcr (complementaria de la secuencia de ADN diana) y una secuencia de ARNcrtra común, o como híbridos de ARNcr-ARNcrtra. Los ARNsg se pueden introducir en la célula o en el organismo como ADN (con un promotor apropiado), como ARN transcritoin vitroo como ARN sintetizado.

Además, las ZFP y/o TALE se han fusionado con dominios de nucleasa para crear ZFN y TALEN, una entidad funcional que es capaz de reconocer su objetivo de ácido nucleico previsto a través de su dominio de unión al ADN diseñado (ZFP o TALE) y hacer que el ADN se cortarse cerca del sitio de unión al ADN mediante la actividad de la nucleasa. Véase, por ejemplo, Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160. Más recientemente, estas nucleasas se han utilizado para la modificación del genoma en diversos organismos. Véase, por ejemplo, Publicaciones de patentes de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y publicación internacional WO 07/014.275.

Por tanto, los métodos y composiciones descritos en el presente documento son ampliamente aplicables y pueden implicar cualquier nucleasa de interés. Ejemplos no limitantes de nucleasas incluyen meganucleasas, TALEN y nucleasas con dedos de zinc. La nucleasa puede comprender dominios de unión y escisión de ADN heterólogos (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de escisión heterólogos) o, alternativamente, el dominio de unión a ADN de una nucleasa de origen natural puede alterarse para unirse a un dominio de escisión seleccionado. sitio objetivo (por ejemplo, una meganucleasa que ha sido diseñada para unirse a un sitio diferente al sitio de unión afín).

En cualquiera de las nucleasas descritas en el presente documento, la nucleasa puede comprender un dominio de unión al ADN TALE diseñado y un dominio de nucleasa (por ejemplo, dominio de endonucleasa y/o meganucleasa), también denominados TALEN. Se han publicado métodos y composiciones para diseñar estas proteínas TALEN para una interacción robusta y específica del sitio con la secuencia objetivo elegida por el usuario (véase Patente de EE.UU. N° 8,586,526). En algunas realizaciones, TALEN comprende un dominio de escisión o medio dominio de escisión de endonucleasa (por ejemplo, Fold). En otras realizaciones, la nucleasa TALE es una mega TAL. Estas meganucleasas TAL son proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión al ADN TALE y un dominio de escisión de meganucleasa. El dominio de escisión de la meganucleasa es activo como monómero y no requiere dimerización para su actividad. (véase Boissel et al., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224). Además, el dominio de nucleasa también puede exhibir funcionalidad de unión al ADN.

En aún otras realizaciones, la nucleasa comprende una TALEN compacta (cTALEN). Se trata de proteínas de fusión de cadena sencilla que unen un dominio de unión al ADN de TALE a un dominio de nucleasa TevI. La proteína de fusión puede actuar como una nickasa localizada por la región TALE o puede crear una rotura de doble hebra, dependiendo de dónde se encuentre el dominio de unión al ADN de TALE con respecto al dominio de nucleasa TevI (véase Beurdeley et al. (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782). Se puede usar cualquier TALEN en combinación con TALEN adicionales (por ejemplo, uno o más TALEN (cTALEN o FokI-TALEN) con uno o más mega-TAL) u otras enzimas de escisión de ADN.

En ciertas realizaciones, la nucleasa comprende una meganucleasa (endonucleasa localizada) o una porción de la misma que exhibe actividad de escisión. Las meganucleasas naturales reconocen sitios de escisión de 15 a 40 pares de bases y comúnmente se agrupan en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cyst y la familia HNH. Las endonucleasas de localización de ejemplo incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I- TevI, I-TevII y I-TevIII. Se conocen sus secuencias de reconocimiento. Véase también U.S. Pat. No. 5,420,032; U.S. Pat. No. 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.

280:345-353 y el catálogo New England Biolabs.

Los dominios de unión al ADN de meganucleasas naturales, principalmente de la familia LAGLIDADG, se han utilizado para promover la modificación genómica específica de sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamíferos y ratones, pero este enfoque se ha limitado a la modificación de cualquiera de los genes homólogos. que conservan la secuencia de reconocimiento de la meganucleasa (Monet et al. (1999), Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88 93) o a genomas prediseñados en los que se ha introducido una secuencia de reconocimiento (Route et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chilton et al. (2003), Plant Physiology. 133: 956-65; Puchta et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5055-60; Rong et al. (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble et al. (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622). En consecuencia, se han realizado intentos de diseñar meganucleasas para exhibir una nueva especificidad de unión en sitios médica o biotecnológicamente relevantes (Porteus et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2952-62; Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; U.S. Patent Publication Nos. 20070117128; 20060206949; 20060153826; 20060078552; and 20040002092). Además, los dominios de unión a ADN de meganucleasas de origen natural o diseñados pueden unirse operativamente con un dominio de escisión de una nucleasa heteróloga (por ejemplo, FokI), y/o los dominios de escisión de meganucleasas pueden unirse operativamente con un dominio de unión a ADN heterólogo (por ejemplo, ZFP o TALE).

En otras realizaciones, la nucleasa es una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o una fusión de nucleasa y dominio de unión a ADN TALE (TALEN). Las ZFN y TALEN comprenden un dominio de unión al ADN (proteína de dedos de zinc o dominio de unión al ADN TALE) que ha sido diseñado para unirse a un sitio objetivo de elección y un dominio de escisión o un semidominio de escisión (por ejemplo, de una restricción y/o meganucleasa como se describe en el presente documento).

Como se describió en detalle anteriormente, los dominios de unión a dedos de zinc y los dominios de unión a ADN TALE pueden diseñarse para unirse a una secuencia de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.

19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Un dominio de unión con dedos de zinc diseñado o una proteína TALE puede tener una especificidad de unión novedosa en comparación con una proteína natural. Los métodos de ingeniería incluyen, entre otros, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc o TALE individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc o unidades de repeticiones TALE que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos 6.453.242 y 6.534.261.

La selección de sitios diana y métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en detalle en Patente de EE.UU. Nos 7.888.121 y 8.409.861 □

Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc, TALE y/o proteínas con dedos de zinc múltiples se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. (por ejemplo, TGEKP (SEQ ID NO:3), TGGQRP (SEQ ID NO:4), TGQKP (SEQ ID NO:5) y/o TGSQKP (SEQ ID NO:6)). Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras de ejemplo de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Véase también, Solicitud de patente provisional de EE. UU. N° 61/343,729.

Por tanto, las nucleasas tales como ZFN, TALEN y/o meganucleasas pueden comprender cualquier dominio de unión a ADN y cualquier dominio (de escisión) de nucleasa (dominio de escisión, semidominio de escisión). Como se señaló anteriormente, el dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión a ADN, por ejemplo un dominio de unión a ADN efector TAL o dedo de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o una meganucleasa dominio de unión a ADN y un dominio de escisión de un dominio de unión a ADN diferente. nucleasa. Los dominios de escisión heterólogos pueden obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas de ejemplo de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, entre otras, endonucleasas de restricción y endonucleasas de anidamiento. Véase, por ejemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (por ejemplo, nucleasa S1; nucleasa de frijol mungo; ADNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; ver también Linn et al. (eds.) Nucleasas, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) pueden usarse como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.

De manera similar, se puede derivar un semidominio de escisión de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se estableció anteriormente, que requiera dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Alternativamente, se puede utilizar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de escisión puede derivarse de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están dispuestos preferentemente, uno con respecto al otro, de manera que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloca los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permite la semidominios de escisión para formar un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en determinadas realizaciones, los bordes cercanos de los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número integral de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse de forma específica a una secuencia al ADN (en un sitio de reconocimiento) y escindir el ADN en el sitio de unión o cerca de él. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima Fok I de tipo IIS cataliza la escisión bicatenaria del ADN a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una cadena y a 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o medio dominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión a dedos de zinc, que pueden diseñarse o no.

Una enzima de restricción de tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es FokI. Esta enzima particular es activa como un dímero, como lo describe Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Por consiguiente, para los fines de la presente divulgación, la porción de la enzima FokI utilizada en las proteínas de fusión divulgadas se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones de dedos de zinc-FokI, se pueden usar dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un medio dominio de escisión de FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede usar una única molécula polipeptídica que contiene un dominio de unión con dedos de zinc y dos semidominios de escisión de FokI. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de la secuencia dirigida usando fusiones de dedos de zinc-FokI se proporcionan en otra parte de esta divulgación.

Un dominio de escisión o semidominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que retenga actividad de escisión, o que conserve la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizar) para crear un dominio de escisión funcional.

Enzimas de restricción de tipo IIS de ejemplo se describen en la publicación internacional WO 07/014.275, . Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos están contemplados en la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión diseñados (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en Patente de EE.UU. Nos 7,914,796; 8,034,598 y 8,623,618; y Publicación de patente de EE. UU. N° 20110201055,.

Los residuos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491,496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de FokI son todos objetivos para influir en la dimerización de semidominios de escisión de FokI.

Los semidominios de escisión diseñados aquí descritos se pueden preparar usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida de semidominios de escisión de tipo salvaje (FokI) como se describe en Patente de EE.UU. Nos 7.914.796; 8.034.598 y 8.623.618; y Publicación de patente de EE. UU. N° 20110201055.

Alternativamente, las nucleasas pueden ensamblarsein vivoen el sitio diana del ácido nucleico usando la tecnología denominada "enzima dividida" (véase, por ejemplo, Publicación de patente de EE. UU. N° 20090068164). Los componentes de tales enzimas divididas pueden expresarse en constructos de expresión separadas o pueden unirse en un marco de lectura abierto donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A de autoescisión o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión a dedos de zinc individuales o dominios de un dominio de unión a ácido nucleico de meganucleasa.

Las nucleasas pueden seleccionarse para determinar su actividad antes de su uso, por ejemplo en un sistema cromosómico basado en levadura como se describe en WO 2009/042163 y 20090068164. Los constructos de expresión de nucleasas pueden diseñarse fácilmente usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Publicaciones de patentes de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y publicación internacional WO 07/014.275. La expresión de la nucleasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible, por ejemplo el promotor de galactoquinasa que se activa (desreprime) en presencia de rafinosa y/o galactosa y se reprime en presencia de glucosa.

Administración

Los métodos para administrar proteínas que comprenden dominios de unión a ADN como se describen en el presente documento se describen, por ejemplo, en Patente de EE.UU. Nos 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; y 7,163,824,.

Los dominios de unión a ADN y las proteínas de fusión que comprenden estos dominios de unión a ADN como se describen en el presente documento también pueden administrarse usando vectores que contienen secuencias que codifican una o más de las proteínas de unión a ADN. Además, también se pueden administrar ácidos nucleicos adicionales (por ejemplo, donantes y/o secuencias que codifican proteínas HLA no clásicas) a través de estos vectores. Puede usarse cualquier sistema de vectores, incluidos, entre otros, vectores plásmidos, constructos lineales, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etc. Véase, también, Patente de EE.UU. Nos. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; y 7,163,824, .

Además, será evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más secuencias codificantes de proteínas de unión al ADN y/o ácidos nucleicos adicionales, según corresponda. Por lo tanto, cuando se introducen en la célula una o más proteínas de unión a ADN como se describen en el presente documento, y ADN adicionales según corresponda, pueden transportarse en el mismo vector o en vectores diferentes. Cuando se usan múltiples constructos, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples proteínas de unión al ADN y ácidos nucleicos adicionales según se desee.

Se pueden usar métodos convencionales de transferencia de genes basados en virus y no virus para introducir ácidos nucleicos que codifican proteínas de unión a ADN diseñadas en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana y para co-introducir secuencias de nucleótidos adicionales según se desee. Dichos métodos también se pueden usar para administrar ácidos nucleicos (por ejemplo, proteínas codificantes de unión a ADN, donantes y/o proteínas HLA no clásicas) a célulasin vitro.En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos se administran para usos de terapia génicain vivooex vivo.

Los sistemas de administración de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo, un ácido nucleico complejado con un vehículo de administración tal como un liposoma o polímero o ribonucleoproteínas.

Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de su administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1 154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de administración no viral incluyen electroporación, nucleofección, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, ARNm, ribonucleoproteínas, viriones artificiales y captación de ADN mejorada por agentes. También se puede utilizar la sonoporación utilizando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para la administración de. En una realización preferida, se administran uno o más ácidos nucleicos como ARNm. También se prefiere el uso de ARNm protegidos para aumentar la eficiencia traduccional y/o la estabilidad del ARNm. Se prefieren especialmente las tapas ARCA (análogo de tapa anti-reversa) o variantes de las mismas. Véase Patente de EE.UU. Nos 7,074,596 y 8,153,773.

Lo más preferiblemente, las proteínas que comprenden dominios de unión al ADN se administran como ribonucleoproteínas (RNP). La RNP comprende una nucleasa y un dominio de unión al ADN, como un ARNg. Preferiblemente, el RNP es Cas9-ARNg.

Sistemas de administración de ácidos nucleicos de ejemplo adicionales incluyen los proporcionados por Lonza (Colonia, Alemania), Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, Mass.) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase por ejemplo Patente de EE.UU. N° 6.008.336). La lipofección se describe, por ejemplo, en Patente de<e>E.UU. N° 5.049.386, Patente de EE.UU. N° 4.946.787; y Patente de EE.UU. N° 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam.TM, Lipofectin.TM y Lipofectamine.TM. ARNiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para una lipofección eficaz de polinucleótidos con reconocimiento de receptores incluyen los de Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024. La administración puede ser a células (administraciónex vivo)o tejidos diana (administraciónin vivo).

La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, incluidos liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.

52:4817-4820 (1992); U.S. Pat. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, y 4,946,787).

El uso de sistemas basados en virus de ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican proteínas de unión a ADN diseñadas y/u otros donantes, según se desee, aprovecha procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas y transportar la carga viral al núcleo. Los vectores virales se pueden administrar directamente a los pacientes(in vivo)o se pueden usar para tratar célulasin vitroy las células modificadas se administran a los pacientes(ex vivo).Los sistemas convencionales basados en virus para la administración de ácidos nucleicos incluyen, entre otros, vectores de virus retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados, vaccinia y herpes simple para transferencia de genes. La integración en el genoma del huésped es posible con los métodos de transferencia de genes de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo da como resultado una expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse mediante la incorporación de proteínas de la envoltura extraña, ampliando la posible población diana de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que pueden transducir o infectar células que no se dividen y normalmente producen títulos virales elevados. La selección de un sistema de transferencia de genes retrovirales depende del tejido diana. Los vectores retrovirales se componen de repeticiones terminales largas (LTR) que actúan en cis y tienen capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que luego se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol.

66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden utilizar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de lograr una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con dichos vectores se han obtenido títulos elevados y niveles elevados de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producciónin vitrode ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génicain vivoyex vivo(véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, incluidas U.S. Pat. No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Actualmente hay al menos seis enfoques de vectores virales disponibles para la transferencia de genes en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos con genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han utilizado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico utilizado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50 % o más para los vectores empaquetados MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas de administración de genes alternativos prometedores basados en el virus adenoasociado de tipo 2 parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que retiene sólo el AAV 145 mediante repeticiones terminales invertidas que flanquean el casete de expresión del transgén. La transferencia eficiente de genes y la entrega estable de transgenes debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave de este sistema de vector. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). También se pueden usar otros serotipos de AAV, incluidos AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV8.2, AAV9 y AAVrh10 y AAV pseudotipificados tales como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6 de acuerdo con la presente invención..

Los vectores adenovirales recombinantes (Ad) con replicación deficiente pueden producirse con títulos elevados e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus están diseñados de manera que un transgén reemplace los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector de replicación defectuosa se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidosin vivo,incluidas células diferenciadas que no se dividen, como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Las células empaquetadoras se utilizan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Dichas células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células psi.2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en terapia génica generalmente son generados por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores normalmente contienen las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetado y la posterior integración en un huésped (si corresponde), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones virales que faltan son aportadas en trans por la línea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica normalmente solo poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV, que son necesarias para el empaquetado y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, a saber, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como ayudante. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

Edición genética de células B

La invención proporciona métodos de edición de genes para sustituir los receptores endógenos de células B (BCR) de células B con secuencias de anticuerpos monoclonales terapéuticos definidos. Se editarán las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de B<c>R. Por ejemplo, se editan IGHV, IGHD, IGHJ, IGHC, IGKV, IGKJ, IGKC, IGLV, IGLJ, IGLC o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones preferidas, los receptores de células B se editan en IGHV, IGKV y en todas las regiones IGHV/J. En algunas realizaciones, múltiples regiones receptoras de células B se dirigen conjuntamente para la modificación. Por ejemplo, IgHV e IhGJ, o IgHV e IgKV, o cualquier combinación de los mismos, están codirigidos. En algunas realizaciones, es posible la modificación o edición en múltiples loci de receptores de células B. En algunas realizaciones, los receptores de células B pueden dirigirse a la inserción genómica a través de fragmentos V/J.

Las células B se editan aislando primero las células B de una muestra del sujeto. La muestra es, por ejemplo, sangre, médula ósea o una muestra de tejido. Por ejemplo, las células B se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), de la médula ósea o del bazo.

Las células B se aíslan mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las células B se aíslan mediante citometría de flujo, aislamiento y separación celular magnéticos (MACS), RosetteSep o análisis de anticuerpos. Se pueden utilizar una o más técnicas de aislamiento para proporcionar una población de células B aislada con suficiente pureza, viabilidad y rendimiento.

Preferiblemente, las células B se aíslan mediante MACS, que se utiliza para el aislamiento celular. Más preferentemente, las células B se aíslan mediante RosetteSep.

La pureza de las células B aisladas es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%o más. Las células B aisladas son al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más viables.

Opcionalmente, después del aislamiento, las células B se expanden en cultivo para tener un número suficiente de células para la edición de genes. Las células B se cultivan y expanden mediante métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, las células B se cultivan en Rp M i 10 % FBS, 1 % P/S, 1 % HEPES, 1 % L-Glutamina. Las células B se cultivan a una densidad de aproximadamente o entre 0,5 y 10x106 células/mL. Preferiblemente, las células B se cultivan a aproximadamente entre 2-4x106 células/mL.

En algunas realizaciones, las células B se cultivan en un medio de cultivo celular que contiene una citoquina. La citoquina activa la célula B. La citoquina es, por ejemplo, similar a IL-1, IL-1 a, IL-1p, IL-1RA, IL-18, cadena g común (CD132), IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, cadena b común (CD131), IL-3, IL-5, GM-CSF, similar a IL-6, IL-6, IL-11, G-CSF, IL-12, LIF, OSM, similar a IL-10, IL-10, IL-20, IL-21, IL-14, IL-16, IL-17, IFN-a, IFN-p, IFN-y, CD154, LT-p, TNF-aTNF-p, 4-1BBL, APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGF-P1, TGF-p2, TGF-p3, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF, aCD40 o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente la citoquina es lL-4, lL-21, CD40L o cualquier combinación de las mismas. Lo más preferiblemente, las células B se activan con IL-4 antes de la transfección. Preferiblemente, las células B se activan durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más días antes de la transfección.

La citoquina está en una concentración de aproximadamente y entre aproximadamente 1 ng/ml y 20 ng/ml. La concentración de citoquina para la activación de las células B es aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ng/ml. En realizaciones preferidas, la concentración de la citoquina es de aproximadamente 5 ng/ml.

Las células B se editan mediante el uso de ADN exógeno, enzimas nucleasas, como proteínas de unión al ADN, y ARN guía para localizar las enzimas nucleasas en secuencias de ADN específicas dentro de una célula B. Las nucleasas y los ARN guía se administran (es decir, transfección) a la célula B mediante métodos conocidos en la técnica tales como los descritossupra.Preferiblemente, las células B se transfectan mediante nucleofección.

En algunas realizaciones, las células B se cultivan conjuntamente con células CD40L+ o células 3T3 antes de la transfección. Las células B se cultivan conjuntamente durante al menos 12, 24, 36, 48 o 72 horas antes de la transfección.

La viabilidad y eficacia de la transfección de células B aumentan con el número de células que se transfectan. Por ejemplo, de viabilidad y eficiencia óptimas al menos 1*104 a 1*108 de células B se transfectan. Preferiblemente 1*106 a 1*107 son transfectadas. Lo más preferiblemente, al menos entre aproximadamente 1*106 a 5*106- 1x107 de células B se transfectan.

Las células B se transfectan mediante nucleofección mediante el uso de un instrumento de nucleofección. Se puede utilizar cualquier instrumento de nucleofección, por ejemplo MaxCyte, Neon® o Amaxa® Preferiblemente, se utiliza el nucleofector Amaxa®. Cualquier programa Nucleofector Amaxa® se utiliza. Preferiblemente se utiliza el programa V-015, U-015 o V-015. Lo más preferible es utilizar el programa V-015.

Las células B se transfectan con nucleasas y ARN guía como ADN, ARNm, proteínas, es decir, ribonuceoproteína. Preferiblemente, las células B se transfectan con nucleasas y ARN guía como constructo de ADN. El ADN es un ADN plásmido circularizado o linealizado.

Opcionalmente, el plásmido tiene un promotor. Los promotores de ejemplo incluyen un promotor EFS, un promotor EF-1a o un promotor Cbh. Preferiblemente, el promotor es el promotor EF-1a.

Opcionalmente, el plásmido incluye una o más secuencias reguladoras diversas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, iniciadores, elementos promotores, péptidos señal y señales de poliadenilación.

El ADN se prepara y aísla mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el ADN se prepara mediante el uso de Maxiprep, Midiprep o Miniprep. Preferiblemente, el constructo de ADN se aísla mediante el uso de un Maxipre tal como un Maxiprep no endolibre.

El ADN se transfecta a una concentración de aproximadamente 1 ug a 10 ug de ADN. La concentración de ADN es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10ug. Preferiblemente, la concentración de ADN es 5 ug.

Más preferiblemente, las células B se transfectan con un complejo de ribonucleoproteína (RNP) de una proteína nucleasa y un ARN guía. Lo más preferiblemente, las células B se transfectan con un RNP CAS-9. El ARNsg se dirige a cualquier locus del gen de inmunoglobulina.

Por ejemplo, los ARN<sg>pueden incluir ARNg (justo corriente arriba de) IGHV3-23: TGAACAGAGAGAACTCACCA, ARNg (justo corriente abajo de) IGHJ6: GCATTGCAGTTGGTCCTCG, ARNg (justo corriente arriba de) IGKV3-20: TTAGGACCCAGAGGGAACCA, o ARNg (justo corriente abajo de) IGKJ6: GGGCATTTAAGATTTGCCAT o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las células B se pueden incubar en presencia de una o más citoquinas después de la transfección. La citoquina puede ser cualquier citoquina. La citoquina activa la célula B. Por ejemplo, la citoquina puede ser similar a IL-1, IL-1a, IL-ip, IL-1RA, IL-18, cadena g común (CD132), IL-2, IL-4, IL-7, IL -9, IL-13, IL-15, cadena b común (CD131), IL-3, IL-5, GM-CSF, similar a IL-6, IL-6, IL-11, G-CSF, IL-12, LIF, OSM, similar a IL-10, IL-10, IL-20, IL-21, IL-14, IL-16, IL-17, IFN-a, IFN-p, IFN-<y>, CD154, LT -p, TNF-aTNF-p, 4-1BBL, APRIL, CD70, CD153, CD178, GITRL, LIGHT, OX40L, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGF-pi, TGF-P2, TGF-P3, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF, aCD40 o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente la citoquina es IL-4, IL-21, CD40L o cualquier combinación de las mismas. Lo más preferiblemente, las células B se activan con IL-4 después de la transfección. Preferiblemente, las células B se activan durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más días después de la transfección.

La citoquina está en una concentración de aproximadamente y entre aproximadamente 1 ng/ml y 20 ng/ml. La concentración de citoquina para la activación de las células B es aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ng /ml. En realizaciones preferidas, la concentración de la citoquina es de aproximadamente 5 ng/ml.

Después de la transfección, la población de células B editadas con el genoma está libre de componentes utilizados durante la producción, por ejemplo, componentes de cultivo celular, ADN, ARN, ribonucleoproteínas y sustancialmente libre de micoplasma, endotoxinas y contaminación microbiana. Preferiblemente, la población de células B editadas con genoma tiene menos de 10, 5, 3, 2 o 1 UFC/hisopo. Lo más preferible es que la población de células B editadas con genoma tenga 0 UFC/hisopo. El nivel de endotoxinas en la población de células B con genoma editado es inferior a 20 UE/ml, menos de 10 UE/ml o menos de 5 UE/ml. La viabilidad de las células B editadas con el genoma es de al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 % o más.

Las células B editadas con el genoma se utilizan directamente después del proceso de edición de genes(p.ej.,en métodos de detección de descubrimiento de antígenos o en métodos terapéuticos) o después de un corto período de cultivo.

Las células B editadas con el genoma se irradian antes de su uso clínico. La irradiación induce la expresión de citoquinas, que promueven la actividad de las células efectoras inmunitarias.

Aplicaciones

Los métodos divulgados se pueden usar para cualquier aplicación en la que se desee modular la expresión y/o funcionalidad del receptor de células B. Preferiblemente, los métodos de la invención se usan para inmunoterapia. Específicamente, terapia con anticuerpos monoclonales que se usa para tratar, por ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes, osteoporosis, degeneración macular, esclerosis múltiple o enfermedades cardiovasculares.

Definiciones

También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante. Tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye combinaciones de dos o más células, o cultivos completos de células; La referencia a "un polinucleótido" incluye, como cuestión práctica, muchas copias de ese polinucleótido. A menos que se definan aquí y más adelante en el recordatorio de la especificación, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

Como se usa en el presente documento, "porción de proteína de unión a ADN" es un segmento de una proteína o polipéptido de unión a ADN capaz de unirse específicamente a una secuencia de ADN particular. La unión es específica de un sitio de secuencia de a Dn particular. La porción de proteína de unión a ADN puede incluir un segmento truncado de una proteína de unión a ADN o un fragmento de una proteína de unión a ADN.

Como se usan en el presente documento, los términos "polinucleótido", "ácido nucleico", "oligonucleótido", "oligómero", "oligo" o términos equivalentes, se refieren a moléculas que comprenden una disposición polimérica de monómeros de bases de nucleótidos, donde la secuencia de monómeros define el polinucleótido. Los polinucleótidos pueden incluir polímeros de desoxirribonucleótidos para producir ácido desoxirribonucleico (ADN) y polímeros de ribonucleótidos para producir ácido ribonucleico (<a>R<n>). Un polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario. Cuando es monocatenario, el polinucleótido puede corresponder a la cadena en sentido o antisentido de un gen. Un polinucleótido monocatenario puede hibridarse con una porción complementaria de un polinucleótido diana para formar un dúplex, que puede ser un homodúplex o un heterodúplex.

La longitud de un polinucleótido no está limitada en ningún aspecto. Los enlaces entre nucleótidos pueden ser enlaces fosfodiéster de tipo internucleótido, o cualquier otro tipo de enlace. Un polinucleótido puede producirse por medios biológicos (por ejemplo, enzimáticamente), ya seain vivo(en una célula) oin vitro(en un sistema libre de células). Un polinucleótido se puede sintetizar químicamente utilizando sistemas libres de enzimas. Un polinucleótido puede ser enzimáticamente extensible o enzimáticamente no extensible.

Por convención, se dice que los polinucleótidos que están formados por enlaces fosfodiéster 3'-5' (incluidos los polinucleótidos naturales) tienen extremos 5' y extremos 3' porque los monómeros de nucleótidos que se incorporan al polímero están unidos de tal manera que el fosfato 5' de un anillo de pentosa mononucleótido está unido al oxígeno 3' (hidroxilo) de su vecino en una dirección a través del enlace fosfodiéster. Así, el extremo 5' de una molécula de polinucleótido generalmente tiene un grupo fosfato libre en la posición 5' del anillo de pentosa del nucleótido, mientras que el extremo 3' de la molécula de polinucleótido tiene un grupo hidroxilo libre en la posición 3' del anillo de pentosa. Dentro de una molécula de polinucleótido, una posición que está orientada en 5' con respecto a otra posición se dice que está ubicada "corriente arriba", mientras que una posición que está en 3' con respecto a otra posición se dice que está "corriente abajo". Esta terminología refleja el hecho de que las polimerasas proceden y extienden una cadena de polinucleótidos en sentido 5' a 3' a lo largo de la cadena plantilla. A menos que se indique lo contrario, siempre que se represente una secuencia de polinucleótidos, se entenderá que los nucleótidos están en orientación 5' a 3' de izquierda a derecha.

Tal como se utiliza en el presente documento, no se pretende que el término "polinucleótido" se limite a estructuras de polinucleótidos de origen natural, secuencias de nucleótidos de origen natural, cadenas principales de origen natural o enlaces internucleotídicos de origen natural. Alguien familiarizado con la técnica conoce bien la amplia variedad de análogos de polinucleótidos, nucleótidos no naturales, enlaces de enlace fosfodiéster no naturales y análogos de internucleótidos que encuentran uso en la invención.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "secuencia de nucleótidos", "secuencia de un polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de polinucleótidos" y expresiones equivalentes o similares se refieren al orden de los monómeros de nucleótidos en el polímero de nucleótidos. Por convención, una secuencia de nucleótidos normalmente se escribe en la dirección 5' a 3'. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polinucleotídica particular de la invención abarca opcionalmente secuencias complementarias, además de la secuencia indicada explícitamente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "gen" generalmente se refiere a una combinación de elementos polinucleotídicos que, cuando se unen operativamente de forma nativa o recombinante, proporcionan algún producto o función. El término "gen" debe interpretarse de manera amplia y puede abarcar formas de ARNm, ADNc, ARNc y ADN genómico de un gen. En algunos usos, el término "gen" abarca las secuencias transcritas, incluidas las regiones 5' y 3' no traducidas (5'-UTR y 3'-UTR), exones e intrones. En algunos genes, la región transcrita contendrá "marcos de lectura abiertos" que codifican polipéptidos. En algunos usos del término, un "gen" comprende sólo las secuencias codificantes (por ejemplo, un "marco de lectura abierto" o "región codificante") necesarias para codificar un polipéptido. En algunos aspectos, los genes no codifican un polipéptido, por ejemplo, genes de ARN ribosómico (ARNr) y genes de ARN de transferencia (ARNt). En algunos aspectos, el término "gen" incluye no sólo las secuencias transcritas, sino que además también incluye regiones no transcritas que incluyen regiones reguladoras, potenciadores y promotores corriente arriba y corriente abajo. El término "gen" abarca ARNm, ADNc y formas genómicas de un gen.

En algunos aspectos, la forma genómica o clon genómico de un gen incluye las secuencias del ARNm transcrito así como otras secuencias no transcritas que se encuentran fuera de la transcripción. Las regiones reguladoras que se encuentran fuera de la unidad de transcripción del ARNm se denominan secuencias flanqueantes 5' o 3'. Una forma genómica funcional de un gen normalmente contiene elementos reguladores necesarios, y a veces suficientes, para la regulación de la transcripción. El término "promotor" se usa generalmente para describir una región de ADN, típicamente, pero no exclusivamente, 5' del sitio de inicio de la transcripción, suficiente para conferir un inicio de transcripción preciso. En algunos aspectos, un "promotor" también incluye otros elementos reguladores que actúan en cis que son necesarios para niveles fuertes o elevados de transcripción, o confieren transcripción inducible. En algunas realizaciones, un promotor es constitutivamente activo, mientras que en realizaciones alternativas, el promotor es condicionalmente activo (por ejemplo, cuando la transcripción se inicia solo bajo ciertas condiciones fisiológicas).

Generalmente, el término "elemento regulador" se refiere a cualquier elemento genético que actúa en cis y que controla algún aspecto de la expresión de secuencias de ácidos nucleicos. En algunos usos, el término "promotor" comprende esencialmente las secuencias mínimas necesarias para iniciar la transcripción. En algunos usos, el término "promotor" incluye las secuencias para iniciar la transcripción y, además, también incluye secuencias que pueden regular positiva o negativamente la transcripción, comúnmente denominadas "elementos potenciadores" y "elementos represores", respectivamente.

Los elementos reguladores específicos del ADN, incluidos los promotores y potenciadores, generalmente solo funcionan dentro de una clase de organismos. Por ejemplo, los elementos reguladores del genoma bacteriano generalmente no funcionan en organismos eucariotas. Sin embargo, los elementos reguladores de organismos más estrechamente relacionados muestran con frecuencia una funcionalidad cruzada. Por ejemplo, los elementos reguladores del ADN de un organismo mamífero particular, como el ser humano, funcionarán con mayor frecuencia en otras especies de mamíferos, como el ratón. Además, al diseñar genes recombinantes que funcionarán en muchas especies, existen secuencias de consenso para muchos tipos de elementos reguladores que se sabe que funcionan en todas las especies, por ejemplo, en todas las células de mamíferos, incluidas las células huésped de ratón y las células huésped humanas.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "en combinación operable", "en orden operable", "enlazado operativamente", "unido operativamente" y expresiones similares, cuando se usan en referencia a ácidos nucleicos, se refieren al enlace operativo de secuencias de ácidos nucleicos colocadas en relaciones funcionales entre sí. Por ejemplo, un promotor unido operativamente, elementos potenciadores, un marco de lectura abierto, una UTR 5' y 3' y secuencias terminadoras dan como resultado la producción precisa de una molécula de ARN. En algunos aspectos, los elementos de ácido nucleico enlazados operativamente dan como resultado la transcripción de un marco de lectura abierto y, en última instancia, la producción de un polipéptido (es decir, la expresión del marco de lectura abierto).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "genoma" se refiere a la información genética total o al material hereditario que posee un organismo (incluidos los virus), es decir, el complemento genético completo de un organismo o virus. El genoma generalmente se refiere a todo el material genético en los cromosomas de un organismo y, además, a la información genética extracromosómica que se transmite de manera estable a las células hijas (por ejemplo, el genoma mitocondrial). Un genoma puede comprender ARN o ADN. Un genoma puede ser lineal (mamíferos) o circular (bacteriano). El material genómico normalmente reside en unidades discretas como los cromosomas.

Como se usa en el presente documento, un "polipéptido" es cualquier polímero de aminoácidos (naturales o no naturales, o una combinación de los mismos), de cualquier longitud, unidos típicamente, pero no exclusivamente, mediante enlaces peptídicos covalentes. Un polipéptido puede ser de cualquier fuente, por ejemplo, un polipéptido de origen natural, un polipéptido producido mediante técnicas de genética molecular recombinante, un polipéptido de una célula o un polipéptido producido enzimáticamente en un sistema libre de células. También se puede producir un polipéptido utilizando métodos de síntesis química (no enzimática). Un polipéptido se caracteriza por la secuencia de aminoácidos en el polímero. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" es sinónimo de polipéptido. El término "péptido" normalmente se refiere a un polipéptido pequeño y normalmente es más pequeño que una proteína. A menos que se indique lo contrario, no se pretende que un polipéptido esté limitado por poseer o no poseer ninguna actividad biológica particular.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "utilización de codones" o "sesgo de codones" o "utilización de codones preferida" o similares se refieren, en un aspecto, a diferencias en la frecuencia de aparición de cualquier codón entre los codones sinónimos que codifican para un aminoácido único en el ADN o ARN que codifica proteínas (donde muchos aminoácidos tienen la capacidad de ser codificados por más de un codón). En otro aspecto, el "sesgo de uso de codones" también puede referirse a diferencias entre dos especies en los sesgos de codones que muestra cada especie. Diferentes organismos a menudo muestran diferentes sesgos de codones, donde se prefieren preferencias por cuales codones de entre los codones sinónimos se favorecen en las secuencias codificantes de ese organismo.

Como se usan en el presente documento, los términos "vector", "vehículo", "constructo", "plantilla" y "plásmido" se usan en referencia a cualquier molécula de polinucleótido recombinante que puede propagarse y usarse para transferir segmento(s) de ácido nucleico de un organismo a otro. Los vectores generalmente comprenden partes que median en la propagación y manipulación del vector (por ejemplo, uno o más orígenes de replicación, genes que confieren resistencia a fármacos o antibióticos, un sitio de clonación múltiple, elementos promotores/potenciadores unidos operativamente que permiten la expresión de un gen clonado, etc.). Los vectores son generalmente moléculas de ácido nucleico recombinantes, a menudo derivadas de bacteriófagos o virus de plantas o animales. Los plásmidos y cósmidos se refieren a dos de dichos vectores recombinantes. Un "vector de clonación" o "vector lanzadera" o "vector de subclonación" contiene partes unidas operativamente que facilitan las etapas de subclonación (por ejemplo, un sitio de clonación múltiple que contiene múltiples secuencias diana de endonucleasas de restricción). Un vector de ácido nucleico puede ser una molécula lineal o en forma circular, dependiendo del tipo de vector o del tipo de aplicación. Algunos vectores de ácido nucleico circulares pueden linealizarse intencionalmente antes de su administración a una célula. Los vectores también pueden servir como plantilla para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para generar constructos lineales, que pueden tener secuencias adicionales en sus extremos que están codificadas por los cebadores utilizados. Tales constructos también pueden ser suministrados en una célula.

Como se usa en el presente documento, el término "vector de expresión" se refiere a un vector recombinante que comprende elementos polinucleotídicos enlzados operativamente que facilitan y optimizan la expresión de un gen deseado (por ejemplo, un gen que codifica una proteína) en un organismo huésped particular (por ejemplo, un vectior de expresión bacteriana o vector de expresión de mamíferos). Las secuencias de polinucleótidos que facilitan la expresión génica pueden incluir, por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias de terminación de la transcripción y sitios de unión a ribosomas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula que contenga un ácido nucleico heterólogo. El ácido nucleico heterólogo puede ser un vector, tal como un vector lanzadera o un vector de expresión, o un molde de ADN lineal, o un ARN transcritoin vitro.En algunos aspectos, la célula huésped es capaz de impulsar la expresión de genes codificados en el vector. En algunos aspectos, la célula huésped soporta la replicación y propagación del vector. Las células huésped pueden ser células Bacterianas tales como E. coli o células de mamífero (por ejemplo, células humanas o células de ratón). Cuando se usa una célula huésped adecuada (tal como una célula de ratón adecuada) para crear una línea celular integrada de manera estable, esa línea celular se puede usar para crear un organismo transgénico completo.

Los métodos (es decir, medios) para administrar vectores/constructos u otros ácidos nucleicos (tales como ARN transcritoin vitro)en células huésped tales como células Bacterianas y células de mamíferos son bien conocidos por un experto en la técnica y no se proporcionan en detalle en el presente documento. Cualquier método para la administración de ácido nucleico a una célula huésped encuentra uso en la invención.

Por ejemplo, los métodos para administrar vectores u otras moléculas de ácido nucleico en células Bacterianas (denominado transformación) tal como Escherichia coli son rutinarios e incluyen métodos de electroporación y transformación de células de E. coli que se han vuelto competentes mediante un tratamiento previo con cationes divalentes tales como CaCh.

Los métodos para administrar vectores u otros ácidos nucleicos (tales como ARN) en células de mamíferos en cultivo (denominado transfección) son rutinarios, y varios métodos de transfección encuentran uso en la invención. Estos incluyen, pero no se limitan a precipitación con fosfato cálcico, electroporación y métodos basados en lípidos (liposomas o lipoplexes) como Transfectamine.RTM. (Life Technologies.TM.) y TransFectin.TM. (Bio-Rad Laboratories), transfecciones de polímeros catiónicos, por ejemplo usando DEAE-dextrano, inyección directa de ácido nucleico, inyección de partículas biolísticas y transducción viral usando portadores virales diseñados (denominada transducción, usando, por ejemplo, virus del herpes simple, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus vaccinia, virus Sindbis) y sonoporación. Cualquiera de estos métodos encuentra uso con la invención. Los términos transfección y nucleofección se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" en referencia a un ácido nucleico o polipéptido indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico recombinante, gen, polinucleótido, polipéptido, etc.) ha sido alterado por intervención humana. Generalmente, la disposición de partes de una molécula recombinante no es una configuración nativa, o la secuencia primaria del polinucleótido o polipéptido recombinante ha sido manipulada de alguna manera. Una secuencia de nucleótidos de origen natural se convierte en un polinucleótido recombinante si se elimina de la ubicación nativa en la que se originó (por ejemplo, un cromosoma), o si se transcribe a partir de un constructo de ADN recombinante. Un marco de lectura abierto de un gen es una molécula recombinante si esa secuencia de nucleótidos se ha eliminado de su contexto natural y se ha clonado en cualquier tipo de vector de ácido nucleico (incluso si ese ORF tiene la misma secuencia de nucleótidos que el gen natural) o plantilla de PCR. Los expertos en la técnica conocen bien los protocolos y reactivos para producir moléculas recombinantes, especialmente ácidos nucleicos recombinantes. En algunas realizaciones, el término "línea celular recombinante" se refiere a cualquier línea celular que contenga un ácido nucleico recombinante, es decir, un ácido nucleico que no es nativo de esa célula huésped.

Como se usa en el presente documento, los términos "heterólogo" o "exógeno" aplicados a polinucleótidos o polipéptidos se refieren a moléculas que han sido reordenadas o suministradas artificialmente a un sistema biológico y pueden no estar en una configuración nativa (por ejemplo, con respecto a la secuencia, genómica, posición o disposición de las partes) o no son nativos de ese sistema biológico en particular. Estos términos indican que el material relevante se originó a partir de una fuente distinta de la fuente natural o se refiere a moléculas que tienen una configuración, ubicación genética o disposición de partes no natural o no nativa. Los términos "exógeno" y "heterólogo" a veces se utilizan indistintamente con "recombinante".

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "nativo" o "endógeno" se refieren a moléculas que se encuentran en un sistema biológico, célula, tejido, especie o cromosoma de origen natural bajo estudio, así como a secuencias que se encuentran dentro del sistema biológico específico. célula, tejido, especie o cromosoma que se manipula. Un gen "nativo" o "endógeno" es generalmente un gen que no incluye secuencias de nucleótidos distintas de las secuencias de nucleótidos con las que normalmente está asociado en la naturaleza (por ejemplo, un cromosoma nuclear, un cromosoma mitocondrial o un cromosoma de cloroplasto). Un gen, transcrito o polipéptido endógeno está codificado por su locus natural y no se suministra artificialmente a la célula.

Como se usa en el presente documento, el término "marcador" generalmente se refiere a una característica o rasgo biológico que, cuando está presente en una célula (por ejemplo, se expresa), da como resultado un atributo o fenotipo que visualiza o identifica que la célula contiene ese marcador. Comúnmente se usan una variedad de tipos de marcadores y pueden ser, por ejemplo, marcadores visuales tales como desarrollo de color, por ejemplo, complementación de lacZ (p-galactosidasa) o fluorescencia, por ejemplo, tal como la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) o proteínas de fusión GFP, RFP, BFP, marcadores seleccionables, marcadores fenotípicos (tasa de crecimiento, morfología celular, color de colonia o morfología de colonia, sensibilidad a la temperatura), marcadores auxotróficos (requisitos de crecimiento), sensibilidades y resistencias a antibióticos, marcadores moleculares como biomoléculas que se distinguen por sensibilidad antigénica (por ejemplo, antígenos de grupos sanguíneos y marcadores de histocompatibilidad), marcadores de superficie celular (por ejemplo, H2KK), marcadores enzimáticos y marcadores de ácidos nucleicos, por ejemplo, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y diversos otros polimorfismos genéticos amplificables.

Como se usa en el presente documento, la expresión "marcador seleccionable" o "marcador de detección" o "marcador de selección positiva" se refiere a un marcador que, cuando está presente en una célula, da como resultado un atributo o fenotipo que permite la selección o segregación de esas células de otras células. que no expresan el rasgo marcador seleccionable. Se utilizan diversos genes como marcadores seleccionables, por ejemplo, son ampliamente conocidos los genes que codifican la resistencia a fármacos o el rescate auxotrófico. Por ejemplo, la resistencia a la kanamicina (neomicina) se puede utilizar como rasgo para seleccionar bacterias que han adoptado un plásmido que porta un gen que codifica la resistencia bacteriana a la kanamicina (por ejemplo, la enzima neomicina fosfotransferasa II). Las células no transfectadas eventualmente morirán cuando el cultivo se trate con neomicina o un antibiótico similar.

También se puede utilizar un mecanismo similar para seleccionar células de mamífero transfectadas que contengan un vector que porta un gen que codifica la resistencia a neomicina (cualquiera de dos genes de aminoglucósido fosfotransferasa; el marcador neoseleccionable). Este proceso de selección se puede utilizar para establecer líneas celulares de mamíferos transfectadas de forma estable. La geneticina (G418) se usa comúnmente para seleccionar células de mamíferos que contienen copias integradas de manera estable del material genético transfectado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "selección negativa" o "marcador de detección negativa" se refiere a un marcador que, cuando está presente (por ejemplo, expresado, activado o similar) permite la identificación de una célula que no comprende una propiedad o rasgo seleccionado (por ejemplo, en comparación con una célula que sí posee la propiedad o rasgo).

Se conoce una amplia variedad de marcadores seleccionables positivos y negativos para su uso en procariotas y eucariotas, y están ampliamente disponibles herramientas de marcadores seleccionables para la selección de plásmidos en bacterias y células de mamíferos. Los sistemas de selección bacteriana incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, resistencia a ampicilina (p-lactamasa), resistencia a cloranfenicol, resistencia a kanamicina (aminoglucósido fosfotransferasas) y resistencia a tetraciclina. Los sistemas de marcadores seleccionables de mamíferos incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, neomicina/G418 (neomicina fosfotransferasa II), resistencia a metotrexato (dihidrofolato reductasa; DHFR), resistencia a higromicina-B (higromicina-B fosfotransferasa) y resistencia a blasticidina (blasticidina S desaminasa).

Como se usa en el presente documento, el término "informador" se refiere generalmente a una fracción, compuesto químico u otro componente que puede usarse para visualizar, cuantificar o identificar componentes deseados de un sistema de interés. Los informadores son comúnmente, pero no exclusivamente, genes que codifican proteínas informadoras. Por ejemplo, un "gen informador" es un gen que, cuando se expresa en una célula, permite la visualización o identificación de esa célula, o permite la cuantificación de la expresión de un gen recombinante. Por ejemplo, un gen indicador puede codificar una proteína, por ejemplo, una enzima cuya actividad puede cuantificarse, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o proteína luciferasa de luciérnaga. Los informadores también incluyen proteínas fluorescentes, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) o cualquiera de las variantes recombinantes de GFP, incluyendo GFP mejorada (EGFP), proteínas fluorescentes azules (BFP y derivados), proteína fluorescente cian (CFP y otros derivados), proteína fluorescente amarilla (YFP y otros derivados) y proteína fluorescente roja (RFP y otros derivados).

Como se usa en el presente documento, el término "etiqueta" como se usa en etiquetas de proteínas se refiere generalmente a secuencias peptídicas que están fusionadas genéticamente con otros marcos de lectura abiertos de proteínas, produciendo así proteínas de fusión recombinantes. Idealmente, la etiqueta fusionada no interfiere con la actividad o función biológica nativa de la proteína más grande a la que está fusionada. Las etiquetas de proteínas se utilizan para diversos fines, por ejemplo, entre otros, etiquetas para facilitar la purificación, detección o visualización de las proteínas de fusión. Algunas etiquetas peptídicas se pueden eliminar mediante agentes químicos o mediante medios enzimáticos, como mediante proteólisis específica del objetivo (por ejemplo, mediante TEV).

Dependiendo del uso, los términos "marcador", "informador" y "etiqueta" pueden superponerse en su definición, donde la misma proteína o polipéptido puede usarse como marcador, informador o etiqueta en diferentes aplicaciones. En algunos escenarios, un polipéptido puede funcionar simultáneamente como indicador y/o etiqueta y/o marcador, todo en el mismo gen o proteína recombinante.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "procariota" se refiere a organismos pertenecientes al Reino Monera (también denominado Procarya), generalmente distinguibles de los eucariotas por su organización unicelular, reproducción asexual por gemación o fisión, la falta de un núcleo unido a una membrana u otros orgánulos unidos a membrana, un cromosoma circular, la presencia de operones, la ausencia de intrones, limitación de mensajes y ARNm poli-A, una estructura ribosómica distintiva y otras características bioquímicas. Los procariotas incluyen los subreinos Eubacteria ("bacterias verdaderas") y Archaea (a veces denominadas "arqueobacterias").

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "bacteria" o "bacteriano" se refieren a Eubacteria procarióticas y se distinguen de Archaea basándose en una serie de criterios morfológicos y bioquímicos bien definidos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "eucariota" se refiere a organismos (típicamente organismos multicelulares) que pertenecen al Reino Eucarya y generalmente se distinguen de los procariotas por la presencia de un núcleo unido a una membrana y otros orgánulos unidos a una membrana, material genético lineal (es decir, cromosomas lineales), la ausencia de operones, la presencia de intrones, limitación de mensajes y ARNm poli-A, una estructura ribosomal distintiva y otras características bioquímicas.

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "mamífero" o "animal mamífero" se refieren a un grupo de organismos eucariotas que son amniotas endotérmicos que se distinguen de los reptiles y las aves por la posesión de pelo, tres huesos del oído medio, glándulas mamarias en las hembras, una neocorteza cerebral y la mayoría da a luz a jóvenes vivos. El grupo más grande de mamíferos, los placentarios (Eutheria), tienen una placenta que alimenta a la descendencia durante el embarazo. Los placentarios incluyen los órdenes Rodentia (incluidos ratones y ratas) y primates (incluidos los humanos).

Un "sujeto" en el contexto de la presente invención es preferiblemente un mamífero. El mamífero puede ser un humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limitan a estos ejemplos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "codificar" se refiere en términos generales a cualquier proceso mediante el cual la información de una macromolécula polimérica se utiliza para dirigir la producción de una segunda molécula que es diferente de la primera. La segunda molécula puede tener una estructura química diferente de la naturaleza química de la primera molécula.

Por ejemplo, en algunos aspectos, el término "codificar" describe el proceso de replicación de ADN semiconservador, donde una hebra de una molécula de ADN bicatenario se utiliza como plantilla para codificar una hebra hermana complementaria recién sintetizada por una molécula dependiente de ADN. ADN polimerasa. En otros aspectos, una molécula de ADN puede codificar una molécula de ARN (por ejemplo, mediante el proceso de transcripción que utiliza una enzima ARN polimerasa dependiente de ADN). Además, una molécula de ARN puede codificar un polipéptido, como en el proceso de traducción. Cuando se utiliza para describir el proceso de traducción, el término "codificar" también se extiende al codón triplete que codifica un aminoácido. En algunos aspectos, una molécula de ARN puede codificar una molécula de ADN, por ejemplo, mediante el proceso de transcripción inversa que incorpora una ADN polimerasa dependiente de ARN. En otro aspecto, una molécula de ADN puede codificar un polipéptido, donde se entiende que "codificar", tal como se usa en ese caso, incorpora tanto los procesos de transcripción como los de traducción.

Como se usa en el presente documento, el término "derivado de" se refiere a un proceso mediante el cual un primer componente (por ejemplo, una primera molécula), o información de ese primer componente, se usa para aislar, derivar o fabricar un segundo componente diferente (por ejemplo, un segunda molécula que es diferente de la primera). Por ejemplo, los polinucleótidos Cas9 con codones optimizados de mamífero de la invención se derivan de la secuencia de aminoácidos de la proteína Cas9 de tipo salvaje. Además, los polinucleótidos Cas9 con codones optimizados de mamífero variantes de la invención, incluyendo la nickasa mutante simple Cas9 y la nucleasa nula mutante doble Cas9, se derivan del polinucleótido que codifica la proteína Cas9 con codones optimizados de mamífero de tipo salvaje.

Como se usa en el presente documento, la expresión "variante" se refiere a una primera composición (por ejemplo, una primera molécula), que está relacionada con una segunda composición (por ejemplo, una segunda molécula, también denominada molécula "padre"). La molécula variante puede derivarse de, aislarse de, basarse en u ser homóloga a la molécula original. Por ejemplo, las formas mutantes de Cas9 con codones optimizados de mamíferos (hspCas9), incluida la nickasa mutante única de Cas9 y la nucleasa nula doble mutante de Cas9, son variantes de la Cas9 de tipo salvaje con codones optimizados de mamíferos (hspCas9). El término variante se puede utilizar para describir polinucleótidos o polipéptidos.

Tal como se aplica a los polinucleótidos, una molécula variante puede tener una identidad de secuencia de nucleótidos completa con la molécula original o, alternativamente, puede tener menos del 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la molécula original. Por ejemplo, una variante de una secuencia de nucleótidos de un gen puede ser una segunda secuencia de nucleótidos que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más idéntica en secuencia de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos original. Las variantes de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos que comprenden el polinucleótido original completo y comprenden además secuencias de nucleótidos fusionados adicionales. Las variantes de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos que son porciones o subsecuencias del polinucleótido original; por ejemplo, la invención también abarca subsecuencias únicas (por ejemplo, según se determina mediante técnicas estándar de comparación y alineación de secuencias) de los polinucleótidos divulgados en el presente documento.

En otro aspecto, las variantes de polinucleótidos incluyen secuencias de nucleótidos que contienen cambios menores, triviales o intrascendentes en la secuencia de nucleótidos original. Por ejemplo, los cambios menores, triviales o intrascendentes incluyen cambios en la secuencia de nucleótidos que (i) no cambian la secuencia de aminoácidos del polipéptido correspondiente, (ii) ocurren fuera del marco de lectura abierto que codifica la proteína de un polinucleótido, (iii) dan como resultado eliminaciones o inserciones que pueden afectar la secuencia de aminoácidos correspondiente pero tienenpoco o ningún impacto sobre la actividad biológica del polipéptido, y/o (iv) dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. En el caso en el que un polinucleótido no codifique una proteína (por ejemplo, un ARNt o un ARNcr o un ARNcrtra o un ARNsg), las variantes de ese polinucleótido pueden incluir cambios de nucleótidos que no dan como resultado la pérdida de función del polinucleótido. En otro aspecto, la invención abarca variantes conservadoras de las secuencias de nucleótidos divulgadas que producen secuencias de nucleótidos funcionalmente idénticas. Un experto apreciará que la invención abarca muchas variantes de las secuencias de nucleótidos divulgadas.

También se divulgan variantes de polipéptidos. Tal como se aplica a las proteínas, un polipéptido variante puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos completa con el polipéptido original o, alternativamente, puede tener menos del 100% de identidad de aminoácidos con la proteína original. Por ejemplo, una variante de una secuencia de aminoácidos puede ser una segunda secuencia de aminoácidos que es al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o más idéntica en secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos original.

Las variantes polipeptídicas incluyen polipéptidos que comprenden el polipéptido original completo y además comprenden secuencias de aminoácidos fusionadas adicionales. Las variantes polipeptídicas también incluyen polipéptidos que son porciones o subsecuencias del polipéptido original; por ejemplo, la invención también abarca subsecuencias únicas (por ejemplo, determinadas mediante técnicas estándar de comparación y alineación de secuencias) de los polipéptidos divulgados en el presente documento.

En otro aspecto, las variantes polipeptídicas incluyen polipéptidos que contienen cambios menores, triviales o intrascendentes en la secuencia de aminoácidos original. Por ejemplo, los cambios menores, triviales o intrascendentes incluyen cambios de aminoácidos (incluidas sustituciones, eliminaciones e inserciones) que tienen poco o ningún impacto en la actividad biológica del polipéptido y producen polipéptidos funcionalmente idénticos, incluidas las adiciones de secuencias peptídicas no funcionales.. En otros aspectos, los polipéptidos variantes cambian la actividad biológica de la molécula original, por ejemplo, variantes mutantes del polipéptido Cas9 que han modificado o perdido actividad nucleasa. Un experto apreciará que la invención abarca muchas variantes de los polipéptidos divulgados.

En algunos aspectos, las variantes de polinucleótidos o polipéptidos pueden incluir moléculas variantes que alteran, añaden o eliminan un pequeño porcentaje de las posiciones de nucleótidos o aminoácidos, por ejemplo, normalmente menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 5%, menos del 4%, menos del 2% o menos del 1%.

Como se usa en el presente documento, el término "sustituciones conservadora" en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos se refiere a cambios en la secuencia de nucleótidos que (i) no dan como resultado ningún cambio correspondiente en la secuencia de aminoácidos debido a la redundancia del código de codón triplete, o (ii) dan como resultado una sustitución del aminoácido progenitor original por un aminoácido que tiene una estructura químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica, donde un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene propiedades químicas similares (por ejemplo, cadenas laterales aromáticas o cadenas laterales cargadas positivamente) y por lo tanto no cambia sustancialmente la propiedades funcionales de la molécula polipeptídica resultante.

Los siguientes son agrupaciones de aminoácidos naturales que contienen propiedades químicas similares, donde la sustitución dentro de un grupo es una sustitución de aminoácidos "conservadora". Esta agrupación que se indica a continuación no es rígida, ya que estos aminoácidos naturales pueden ubicarse en diferentes agrupaciones cuando se consideran diferentes propiedades funcionales. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares y/o alifáticas incluyen: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y prolina. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga incluyen: serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas incluyen: fenilalanina, tirosinay triptófano. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas positivamente incluyen: lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas negativamente incluyen: aspartato y glutamato.

Como se usa en el presente documento, los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales ("idénticas") o tienen un porcentaje específico de aminoácido. residuos o nucleótidos que son idénticos ("porcentaje de identidad") cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima con una segunda molécula, medida usando un algoritmo de comparación de secuencias (por ejemplo, mediante una alineación BLAST, o cualquier otro algoritmo conocido por los expertos), o, alternativamente, mediante inspección visual.

La expresión "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 90-95%, aproximadamente 95 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Estas secuencias "sustancialmente idénticas" normalmente se consideran "homólogas", sin hacer referencia a la ascendencia real. Preferiblemente, la "identidad sustancial" entre los nucleótidos existe sobre una región de los polinucleótidos al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, o en al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, lo más preferiblemente en toda la longitud del polinucleótido. Preferiblemente, la "identidad sustancial" entre polipéptidos existe en una región del polipéptido de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de longitud, más preferiblemente en una región de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda su longitud.

La expresión "similitud de secuencia" en el contexto de dos polipéptidos se refiere al grado de relación entre dos o más secuencias o subsecuencias. Tales secuencias normalmente tendrán cierto grado de identidad de secuencia de aminoácidos y, además, cuando existe una falta de identidad de aminoácidos, hay algún porcentaje de sustituciones dentro de grupos de aminoácidos funcionalmente relacionados. Por ejemplo, la sustitución (desalineación) de una serina por una treonina en un polipéptido es similitud de secuencia (pero no identidad).

Como se usa en el presente documento, el término "homólogo" se refiere a dos o más secuencias de aminoácidos cuando se derivan, de forma natural o artificial, de una proteína ancestral común o una secuencia de aminoácidos. De manera similar, las secuencias de nucleótidos son homólogas cuando se derivan, natural o artificialmente, de un ácido nucleico ancestral común. La homología en las proteínas generalmente se infiere a partir de la identidad de secuencia de aminoácidos y la similitud de secuencia entre dos o más proteínas. El porcentaje preciso de identidad y/o similitud entre secuencias que es útil para establecer la homología varía según el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero habitualmente se utiliza tan solo un 25% de similitud de secuencia para establecer la homología. También se pueden usar niveles más altos de similitud de secuencia, por ejemplo, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % o más, para establecer homología. Generalmente están disponibles métodos para determinar porcentajes de similitud de secuencia (por ejemplo, BLASTP y BLASTN usando parámetros predeterminados).

Como se usan en el presente documento, los términos "porción", "subsecuencia", "segmento" o "fragmento", o términos similares se refieren a cualquier porción de una secuencia más grande (por ejemplo, una subsecuencia de nucleótidos o una subsecuencia de aminoácidos) que es más pequeña que la secuencia completa de la que se deriva. La longitud mínima de una subsecuencia generalmente no está limitada, excepto que una longitud mínima puede ser útil en vista de su función prevista. La subsecuencia puede derivarse de cualquier porción de la molécula original. En algunos aspectos, la porción o subsecuencia conserva una característica crítica o actividad biológica de la molécula más grande, o corresponde a un dominio funcional particular de la molécula original, por ejemplo, el dominio de unión al ADN o el dominio de activación transcripcional. Las porciones de polinucleótidos pueden tener cualquier longitud, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o 500 o más nucleótidos de longitud.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "kit" se utiliza en referencia a una combinación de artículos que facilitan un proceso, método, ensayo, análisis o manipulación de una muestra. Los kits pueden contener instrucciones escritas que describan cómo usar el kit (por ejemplo, instrucciones que describen los métodos de la presente invención), reactivos químicos o enzimas necesarios para el método, cebadores y sondas, así como cualquier otro componente.

Una población de células "aislada" está "sustancialmente libre" de células y materiales con los que está asociada en la naturaleza. Por "sustancialmente libre" o "sustancialmente pura" se entiende que al menos el 50% de la población es el tipo de célula deseado, preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al menos el 90%.

Ejemplos

Ejemplo 1: Enfoque experimental

Cas9 se incluye con fines de ejemplo; Se pueden utilizar otros sistemas CRISPR-Cas (por ejemplo, Staphylococcus aureus) para lograr el mismo objetivo. Dichos sistemas Cas pueden tener diferentes especificidades de sustrato, por lo que las secuencias de ARNg y los sitios diana genómicos podrían diferir, aunque el enfoque seguiría siendo el mismo.

1)Aislar células B humanas (Miltenyi: Kit de aislamiento de células B II, 130-091-151)

2) Realizar Nucleofección (Lonza: Kit de nucleofector de células B humanas),

a. Optimizar la escisión de hAAVS1 variando el número de células y las concentraciones de ARNm/plásmido/ARNsg

i. ARNm modificado con Cas9-2A-GFP o Cas9+GFP y ARNg validado dirigido a hAAVS1

^ puede clasificar las células positivas para GFP mediante FACS para enriquecerlas con células nucleofectadas

ii. Analizar ADN (ensayo MiSeq o Surveyor)

b. Examinar los ARNsg para identificar los ARNsg que cortan los loci de interés en las cadenas pesada y ligera: secuencias de prueba predichas a partir de software disponible públicamente

i. en cada experimento de Nucleofección(por ejemplo,2*10® células B), transfectar un ARNsg predicho para cada uno de los cuatro sitios objetivo (corriente arriba y corriente abajo de la cadena pesada y de la cadena ligera = 4) ^ después de la amplificación por PCR de cada locus, realizar MiSeq para verificar el cortador óptimo entre los ARNsg predichos para cada sitio

c. Optimizar la inserción de la plantilla de donante de recombinación homóloga (HR)

i. Variar la cantidad de ARNm/plásmido/proteína Cas9, ARNsg y plantilla del donante (que codifica cadenas pesadas y ligeras recombinadas de anticuerpos monoclonales terapéuticos conocidos, flanqueados por brazos de homología) 1. La plantilla donante debe sustituir NGG de PAM por NNG o NGN (siendo más deseable una mutación sinónima) para evitar la escisión de la plantilla.

2. Los insertos codificarán codones de parada siguiendo las regiones constantes de inmunoglobulina codificadas para evitar la expresión de cualquier secuencia posterior que se empalme en el nuevo ARNm.

ii. ARNm modificado con Cas9-2A-GFP o Cas9+GFP o proteínas Cas9+GFP recombinantes o proteína de fusión Cas9/GFP recombinante y plantilla de PCR de donante h R (puede incluir cadenas pesadas y ligeras y sus brazos de homología en una única plantilla que puede ser lineal o ligada en un pseudovector circular mediante la inclusión de un sitio de restricción común en los terminales de la plantilla para la generación de extremos adhesivos compatibles) o un vector donante tradicional (por ejemplo, CFP+ ambos HR)

1. Si las células B pueden vivir sin señalización tónica de BCR, entonces se puede lograr la optimización de la FC funcional insertando dos indicadores fluorescentes(por ejemplo,EGFP, mCherry) en loci de cadena pesada y ligera 2. De acuerdo con Lonza (fabricante de Nuclefector), deben entrar 4 ARNsg libres en cada célula (Gibson también puede ensamblarlo en un vector común para estar seguro de la cotransfección)

iii. Nucleofect Cas9/GFP, 4 ARNsg y dos inserciones HR (cadena pesada y cadena ligera, cada una flanqueada por brazos de homología de >500 pb en cada extremo) en células B humanas ^ clasificar células positivas para GFP, aislar ADN genómico, enviar para MiSeq

3) Confirmar HR: PCR a través del límite del sitio de inserción para confirmar la presencia de inserciones específicas (se utilizará como control negativo el ADN genómico de la población de células B previa a la nucleofección) a. Clonar células y realizar secuenciación de Sanger a través de la unión

b. También puede realizar RFLP en células B clonadas aisladas (aunque RFLP probablemente no funcione en control negativo debido al repertorio heterogéneo)

4) Confirmar el reemplazo funcional del anticuerpo monoclonal: realizar citometría de flujo utilizando proteína diana recombinante biotinilada o marcada con fluorescencia

a. Aislar células B con la modificación genómica deseada mediante FACS

i. Realizar una secuenciación profunda en varios clones para identificar células con modificaciones genómicas no deseadas fuera del objetivo, que se eliminarán de la consideración.

ii. Los clones de células B deseados pueden nucleofectarse con ARNm que codifica XBP-1 para facilitar la diferenciación en células plasmáticas de larga vida y promover altos niveles de secreción de inmunoglobulinas. iii. (Para aplicaciones alogénicas, realizar edición genómica para mutar o eliminar loci HLA relevantes. El ADN que codifica<c>D48 se puede insertar en un locus de puerto seguro (por ejemplo, Rosa26) según sea necesario para antagonizar la posible citotoxicidad mediada por células NK.)

Ejemplo 2: ARNsgs de ejemplo

ARNg (justo corriente arriba de) IGHV3-23: TGAACAGAGAGACCACA

ARNg (justo corriente abajo de) IGHJ6: GCATTGCAGTTGGTCCTCG

ARNg (justo corriente arriba de) IGKV3-20: TTAGGACCCAGAGGGAACCA

ARNg (justo corriente abajo de) IGKJ6: GGGCATTTAAGATTTGCCAT

Ejemplo 3: secuencias de inserto anti-TNF-ALFA

Usando adalimumab como ejemplo: http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cg¡/deta¡ls.cg¡?pbcode=7860

>Cadena pesada (VDJ-IGHG1)

ATGGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCAGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGC CAGCGGCTTCACCTTCGACGACTACGCCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGAAAAGGCCTGGAATGGGTGT CCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGACAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGAC AACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAA AGTTTCCTACCTGAGCACCGCCAGCAGCCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCCTCG GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGC CAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAG CGTC CTCAC CGTC CTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGC C C C GAGAAC CACAGGTGTACAC CCTGCCCC CAT C C C GGGATGAGC TGAC CAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTC C CGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

>Cadena_ligera (VJ-IGKC)

ATGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAG AGCCAGCCAGGGCATCCGGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCT ACGCCGCCAGCACACTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTG ACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCGGTACAACAGAGCCCCCTACACCTT TGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG GGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTC ACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

Las secuencias reguladoras, tales como iniciadores, elementos promotores, péptidos señal y señales de poliadenilación, pueden incluirse en los insertos según sea necesario.

Ejemplo 4: Edición de células B en el locus CXCR4

Los datos presentados en este documento demuestran que el CXCR4 puede ser objeto de modificación genética mediante la administración de ARNg de Cas9. Por ejemplo, el locus CXCR4 fue el objetivo del corte genómico (es decir, demostrado con el ensayo de corte T7E1) en tres líneas celulares (Ramos, Raji y U266) y en células B primarias (Figuras 17A-17D, 18A y 18B).

Los datos demuestran la eficacia de la focalización del locus CXCR4 mediante una marcada disminución/pérdida de proteína después del corte de proteína en células B primarias (Figura 17B).

Además, la inserción genómica se demostró mediante el ensayo de digestión con enzima de restricción HindIII, en el que las muestras que fueron positivas para la digestión con HindIII tuvieron una inserción de la plantilla HDR en el locus CXCR4, mientras que aquellas muestras que son negativas no tuvieron una inserción de la plantilla HDR. Esto se demuestra en tres líneas de células B, Ramos, Raji y U266 (Figuras 18A y 18B).

La inserción genómica en el locus CXCR4 también se determinó mediante el uso del ensayo MiSeq en tres líneas celulares Ramos, Raji y U266, así como en células B primarias aisladas.

Los datos demuestran que el corte en el locus CXCR4 en células B humanas primarias sólo tiene éxito tras la transfección de proteínas (RNP). (ADN-Cas9 frente a ARNm frente a proteína). Además, los datos indican además una mayor viabilidad con proteína en relación con los ácidos nucleicos, y ese corte se observó sólo tras la transfección con proteína como lo demuestran el ensayo T7 y el análisis TIDE (Figuras 17C, 17D, 18A y 18B).

Ejemplo 4: Edición de células B en el locus del receptor de células B

Los datos presentados en el presente documento también demuestran el corte/direccionamiento genómico del locus de células B (Figuras 19A-19C). Los datos indican, mediante el uso del ensayo de corte T7E1, que el corte genómico se produce en el locus del receptor de células B en las dos líneas de células B que se probaron, Raji y Ramos, así como en células B primarias aisladas. Los cebadores seleccionados para amplificar los lugares de corte se muestran en la Figura 19A.

Los datos presentados en las Figuras 19B y 19C también demuestran que la inserción genómica en loci de receptores múltiples de células B se logró (según lo analizado mediante el ensayo de digestión con enzimas de restricción HindIII) en Raji en el IGHV (incluso al co-dirigido a IGKV) y a través de regiones IGHV/J, que demuestra la capacidad de reemplazar todo el fragmento variable de anticuerpo (Figuras 19B y 19C). En la línea celular Ramos B, los datos indican que se puede direccionar el IGHV (Figuras 19B y 19C).

Los datos demuestran además que los receptores de células B estaban dirigidos a la inserción genómica a través de V/J, lo que sirve como prueba de concepto de la capacidad de reemplazar todo el fragmento variable del anticuerpo. Esto se demuestra con la línea celular Raji mediante la inserción del sitio de inserción HindIII, y en las células B primarias mediante un amplicón de PCR del tamaño correcto (es decir, no se observa ningún amplicón en ausencia de inserción).

Los datos también demostraron que la inserción genómica se logra mediante la expresión de proteínas independientes de loci de cadena pesada y de cadena ligera mediante citometría de flujo (es decir, péptido FLAG en IgH y péptido HA en IgK) con resolución unicelular en células B primarias.

Los datos de MiSeq demuestran que las líneas celulares Raji y Ramos se procesaron con éxito para lograr la recombinación homóloga (HR) en loci de cadena pesada y ligera, como lo demuestra la inserción de secuencias reconocidas por las enzimas de restricción (Res) [R4, R5, R13]. así como péptidos codificantes [R10, R14], incluso cuando se seleccionan simultáneamente múltiples loci [R5,R15,R18,B5].

Además, las células B primarias alcanzaron HR en los loci de cadena pesada y ligera, como lo demuestra la inserción de secuencias reconocidas por las enzimas de restricción (RE) [B13], así como péptidos codificantes, incluso cuando se marcan múltiples loci simultáneamente (Figuras 17-19). ). También podemos lograr la traducción funcional de proteínas desde los sitios de inserción, como lo demuestran los datos de citometría de flujo.

Hemos confirmado que se pueden direccionar simultáneamente a múltiples loci (por ejemplo, IgHV+IgHJ, IgHV+IgKV) sin pérdida de eficiencia en ninguno de los locus. [H = cadena pesada, K = cadena ligera].

En algunas realizaciones, se requieren ribonucleoproteínas (RNP) de ARNg Cas9 para editar células B humanas primarias. Se probaron muchas estrategias de nucleofección basadas en ácidos nucleicos (ARNm y múltiples vectores plasmídicos con varios promotores). El corte se logró con la transfección de la proteína recombinante complejada con el ARNg.

En resumen:

1) La recombinación homóloga (HR) en células B humanas primarias requiere la activación de las células antes de la transfección (tres días son muy superiores a dos días y cinco días son incluso mejores). La reactivación después de la transfección también puede mejorar la eficiencia de la HR. Sorprendentemente, la activación inmediatamente después de la transfección (incluso durante cinco días) no produce HR.

2) Se requiere la transfección de la proteína recombinante Cas9 complejada con ARNg en forma de ribonucleoproteínas (RNP) para lograr la edición del genoma en células B humanas primarias. Ni el ADN ni el ARNm que codifican la proteína Cas9 producen edición (HR o NHEJ).

3) Hemos demostrado la edición de células B humanas primarias en múltiples loci y la inserción de múltiples plantillas HR, incluidos múltiples péptidos que podrían coexpresarse (de los loci de la cadena pesada y la cadena ligera del receptor de células B).

Ejemplo 6: Optimización de la transfección

Se ensayaron diversas condiciones para establecer condiciones óptimas para la transfección de células B y PBMC (Figuras 3-16). Las variables analizadas incluyeron el efecto de la concentración celular sobre la eficiencia de la transfección (Figuras 3-5), el tipo de transfección(es decirprogramas de nucleofección optimizados utilizados) (Figuras 6, 7, 12 y 13), si los constructos de ADN transfectados se cortaron o están intactos (Figura 7C), si las células se cultivan en presencia de IL o IL4/IL21/CD40L antes o después de la transfección (Figuras 8-10, 14), la concentración del constructo de ADN utilizado para la transfección (Figura 9A, 15A, 15B) y el tipo de aislamiento celular utilizado (es decir, aislamiento MACS o RosetteSep) (Figura 11).

Viabilidad celular

Los datos muestran que la viabilidad y eficiencia de la transfección con eGFP en PBMC se pueden mejorar aumentando el número de células.(es deciraumentando el número de células de 1*10® a 5*10® - 1x10e7 (Figura 5A).

Otras observaciones con respecto al efecto sobre la concentración celular en la transfección de constructos de ADN indican que la viabilidad, pero no la eficiencia de la transfección con GFP-Cas9 en PBMC, puede mejorarse aumentando el número de células (Figura 5A); esa viabilidad es más baja después de la transfección con Cas9 y disminuye ligeramente con el tiempo (Figura 5B); y esa expresión de GFP disminuye después de 48 horas (Figura 5B).

Los ensayos que comparan la eficacia de la transfección con ADN plasmídico en comparación con ARNm indican que el ADN plasmídico proporciona una mayor eficacia que el ARNm (Figura 6).

Nucleofección

De los diversos programas de nucleofección probados, el programa de nucleofección V-015 da como resultado la mayor viabilidad celular y el fondo más bajo en el control de la transfección (-ADN), y la mayor eficiencia de transfección para eGFP y Cas9 (Figura 7A-7D). Otras observaciones de estos ensayos indican que la preparación de ADN normal funciona mejor que la preparación endolibre (es decir, comparar Cas9 y EF); el ADN linealizado funciona mejor que el ADN plasmídico (es decir, comparar Cas9 cortado y Cas9); El ARNm de GFP funciona mejor con una cantidad mayor pero aún tiene una eficiencia baja (es decir, mGFP 10 ug, 20 ug); la transfección con el dispositivo MaxCyte no funciona; y esa viabilidad no se ve muy afectada por diferentes condiciones (es decir, ligeramente mayor para la transfección de ARNm y la preparación endolibre) (Figuras 7A-7D). Los ensayos que utilizan transfección con líneas celulares indican que existe una alta eficiencia de transfección para U266/eGFP, que la transfección Cas9 funciona mejor en U266 que en células B primarias, que existe una alta viabilidad para las células U266 transfectadas, que en la línea celular Ramos hay pobre eficiencia excepto el ARNm de GFP (mGFP) y, además, hay poca viabilidad en la línea celular de Ramos después de la transfección (Figura 7D).

Cultivo de células B en presencia de citoquinas

Se realizaron varias optimizaciones de la transfección primaria de células B (Figuras 8-10). Los datos de estos experimentos de optimización indican que el cultivo de células con IL-4/IL-21/CD40L después de la transfección aumenta la eficiencia de la transfección con eGFP y Cas9 (Figura 8B). También se ensayaron varios vectores Cas9 que tenían diferentes promotores. Estos resultados indican que el vector # 63592 (promotor EFS) funciona mejor que el #48138 (promotor Cbh) utilizado hasta ahora, el ARNm autosintetizado de GFP y Cas9 /- 5meC no funciona en comparación con el ARNm de GFP de trilink, la viabilidad es mayor para la transfección de ARNm, y que no existe una diferencia apreciable entre la expresión el día 1 y el día 2 después de la transfección (Figuras 8A-8B). Las variaciones en las cantidades de ADN utilizadas en los ensayos indicaron que 5ug funcionan mejor que 2ug; sin embargo, la viabilidad disminuye (Figura 9A).

La activación de las células B 1 semana antes de la transfección muestra que la IL-4 proporciona una mayor eficiencia de transfección que la IL-4/IL-21/aCD40, la viabilidad de las células disminuye y que la activación durante 1 semana es demasiado larga (es decir, las células se sobreestimulan y comienzan morir) (Figuras 10A y 10B).

También se evaluó la influencia de la activación de las células B aisladas con cocultivo con fibroblastos que expresan CD40L (Figuras 14A y 14B). Para estos ensayos, las células B se cultivaron conjuntamente con células 3T3 irradiadas durante 24, 48 o 72 minutos antes de la transfección. Los datos de estos ensayos indican que las células 3T3 positivas para CD40L suprimen la eficacia de la transfección con GFP; que existe una eficiencia cada vez mayor para la expresión de Cas9; y esa viabilidad aumenta para la transfección después del cocultivo con células 3T3. Estos mismos ensayos se repitieron con PBMC completas (Figura 14B). Los datos de estos experimentos indican que la presencia de células CD40L positivas no aumenta la eficiencia de la transfección ni para GFP ni para Cas9, y que la viabilidad de las células aumenta después del cocultivo con células 3T3.

Aislamiento celular

También se evaluó la influencia sobre la transfección dependiendo de la manera en que se aislaron las células (Figuras 11Ay 11B). Se evaluaron dos métodos de aislamiento: MACS y RosettSep. Los datos obtenidos de estos ensayos indican que existe una mayor eficiencia de transfección en células B aisladas de RosetteSep. Para las células aisladas con MACs , el tratamiento con citoquinas disminuyó la expresión transgénica, mientras que en las células aisladas con RosetteSep, las citoquinas tienen un efecto positivo en la transfección de células de uno de los donantes (donante A), pero no tuvieron efecto en el otro donante (donante B) (Figura 11A y 11B).

Efecto variable múltiple sobre la nucleofección

Otros ensayos realizados evaluaron la influencia de la activación de las células B, las cantidades de células B utilizadas y la concentración de los constructos de ADN transfectados (Figuras 15A-15C). Para estos ensayos, se sembraron diferentes cantidades de células B en células 3T3 y se cocultivaron durante 24 y 48 horas, seguido de transfección con diversas concentraciones de constructos de ADN. Los datos de estos ensayos indican que cuanto mayor es el número de células, más prolongada es la activación celular y mayor es la concentración de ADN, todo ello tuvo un efecto positivo tanto en la transfección de GFP como de Cas9, pero la eficiencia de la transfección fue baja. La viabilidad celular disminuyó sólo ligeramente después de la nucleofección cuando las células B se precultivaron con células 3T3. Otros ensayos realizados indicaron que cuanto mayor era el número de células B en combinación con 5 ug de plásmido Cas9 funcionaba mejor (Figura 15B).

En conjunto, los datos de estos experimentos se resumen a continuación:

El paso de recuperación después de la nucleofección es importante para la viabilidad.

Numero de celular: aumentado de 1*10® a 5*10® - 1 X107

preparación de ADN: Maxiprep normal funciona mejor que endoFree Maxiprep

cantidad de ADN: aumentado de 2 a 5 ug

ARNm versus ADN plásmido: el ADN plasmídico funciona mejor que el ARNm

ADN plasmídico circularizado versus linealizado: el ADN linealizado parece dar una mayor eficiencia de transfección que el ADN circularizado

Diferentes promotores: El promotor EF-1a funciona mejor

Programa de nucleofección: V-015 funciona mejor

Dispositivos de electroporación: Amaxa es la única que funciona.

Activación: 5 ng/ml de IL-4 antes y después de la transfección dan mejores resultados

Ejemplo 7: Direccionar al locus CXCR4 en células B humanas con CAS9 RNP

El trabajo en este campo ha demostrado la generación de células T humanas primarias en reemplazo utilizando ribonucleoproteínas Cas9(VéaseSchumann et al., "Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins," PNAS Vol. 112, No. 33, páginas 10437-10442.) La estructura principal de gCXCR4 descrita en la referencia de Schumann se utiliza en ciertos ensayos siguientes y se denomina gCxCR4 PNAS.

Los ensayos que se utilizaron para determinar el direccionamiento de CXCR4 en células B humanas aisladas con Cas9 RNP incluyeron análisis FACS de células aisladas electroporadas con constructo Cas9RNP y plantilla HindlII HDR y análisis MiSEQ. El flujo de trabajo para estos ensayos se representa esquemáticamente en la Figura 17A. Los datos de estos ensayos indican que la expresión de CXCR4 en células B se reduce hasta un 70% después de apuntar con Cas9 RNP formando complejo con la estructura principal de gCXCR4 descrita en Schumann (Figura 17B). Téngase en cuenta que gCXCR4-1 y gCXCR4-2 son preparaciones de gCXCR4 diferentes que utilizan una estructura principal de gCXCR4 diferente. Los datos indican además que los tres constructos de gCXCR4 muestran corte en el ensayo T7E1 y que la columna vertebral de gCXCR4 descrita en Schumann es la más eficiente (consistente con los resultados de la citometría de flujo) (Figura 17C). Téngase en cuenta que el control G/C es el control positivo T7E1 (producto de PCR con G7C SNP). Asrtrix en la Figura 17C es una banda no especificada. Los datos de estos experimentos de focalización indican: el corte en el locus CXCR4 con Cas9 RNP es establemente reproducible; La relación Cas9/gCXCR4 de 1:5 es la más eficiente; el cambio de medio (MC) después de la transfección no aumenta la eficiencia de corte; un programa diferente de nucleofección (U-015) disminuye ligeramente la eficiencia de corte; y que también funciona menos Cas9 (eficiencia ligeramente reducida) (Figura 17D).

La inserción de la plantilla HDR en el locus CXCR4 con Cas9 RNP se representa en los geles presentados en las Figuras 18A y 18B. Los datos de estos ensayos indican que el gCXCR4 PNA<s>sintetizado a partir de un oligo diferente (gCXCR4 PNAS2) también funciona, sin embargo, tiene una eficiencia de corte ligeramente reducida; esa plantilla HDR de 100 pmol da como resultado la mejor eficiencia de corte; y que el tratamiento con Scr7 parece aumentar la eficiencia de corte. Téngase en cuenta que el resumen HindlII negativo indica que no se ha introducido la plantilla HDR (Figura 18A y 18B).

Ejemplo 8: Direccionar el locus del receptor de células B humanas con CAS9 RNP

Se determinaron pares de cebadores que amplificaban cuatro loci de corte específicos (Figura 19A). También se determinaron los ARNg que se dirigen a loci de BCR humanos (Figuras 19B-C).

También se evaluó la viabilidad de las células B humanas primarias después de la transfección con ribonucleoproteínas (RNP) (Figura 20). Los datos de estos experimentos indican que la viabilidad de las células B no cambia apreciablemente cuando la concentración de células B utilizadas en el procedimiento de transfección está entre 2x10® y 5*10®. Además, la transfección RNP se puede realizar con 2*10® células mientras que para la transfección de ADN de 1*107 se requieren células para mantener una viabilidad similar. La viabilidad no se reduce de 2 días a 5 días después de la transfección, en comparación con la transfección de ADN donde la viabilidad normalmente se reduce significativamente sólo 2 días después de la transfección. Estas observaciones son dignas de mención ya que se necesita tiempo para permitir que se produzca la recombinación homóloga, dado que son necesarios 5 días de activación pre y post transfección.

Ejemplo 9: Aislamiento y cultivo de células B

Se aislaron células B a partir de PBMC obtenidas de sangre de collar humano mediante el método de Ficoll.

Para el aislamiento y separación de células magnéticas (MACS), las células B se analizaron con selección negativa utilizando reactivos de Miltenyi. La pureza de las células B aisladas fue aproximadamente del 95%, con una viabilidad entre el 80 y el 90%. Las columnas LS producen una mayor cantidad de celdas (aproximadamente el doble) en comparación con la columna LS.

El aislamiento de RosetteSep (basado en el análisis de células B con un cóctel de anticuerpos-StemCell) produjo aproximadamente 4 veces más células que mediante el uso de MACS, con una pureza de aproximadamente el 90 % y una viabilidad de aproximadamente el 95 %.

Las células B aisladas se cultivaron en RPMI 10% FBS, 1% P/S, 1% HEPES, 1% L-Glutamina, a una densidad de 2-4 x 106 células/ml. En determinadas condiciones también se añadieron suplementos. Se observó que la viabilidad es mayor sin p-ME y que las células se pueden cultivar durante mucho más tiempo con mayor viabilidad con IL-4. Otras realizaciones

Si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar células B humanas que producen anticuerpos terapéuticos para inmunoterapia para un sujeto que comprende modificar genómicamente una población de células B primarias mediante edición del genoma para sustituir las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un receptor endógeno de células B con secuencias de nucleótidos introduciendo al menos un corte en un genoma de células B e incorporando ADN exógeno en el sitio de corte mediante recombinación homóloga, en el que dicho corte está en un loci de cadena pesada y ligera del receptor de células B y en el que dicho ADN exógeno codifica el anticuerpo monoclonal terapéutico, en el que la población de células B primarias se activa antes de la modificación.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además expandir dicha población de células B humanas antes de la modificación.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las células B humanas se activan con IL-4.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el corte genómico se introduce usando una nucleasa diseñada, opcionalmente en el que la nucleasa diseñada se transfecta en la célula B humana mediante nucleofección.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la nucleasa diseñada es una nucleasa Cas, una nucleasa con dedos de zinc o una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción.

6. El método de la reivindicación 4, en el que la modificación se logra usando un complejo de ribonucleoproteína Cas9-ARNg.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el ARNg es específico para un locus de inmunoglobina.

8. El método de la reivindicación 7, en el que las células B humanas se activan con IL-4.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal terapéutico es específico para TNF-a, IGHE, IL-1, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL -9, IL-13, IL-17A, IL-20, IL-22, IL-23, IL-25, BAFF, RANKL, integrina-a4, IL-6R, VEGF-A, VEGFR1, VEGFR2, EGFR, HER2, HER3, CA125, integrina a4p7, integrina a7p7, receptor de interferón a/p, CXCR4, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79B, CD80, CD125, CD137, CD140a, CD147, CD152, CD154, CD200, CD221, CCR4, CCR5, gp120, angiopoyetina 3, PCSK9, HNGF, HGF, GD2, GD3, C5, FAP, ICAM-1, LFA-1, interferón alfa, interferón gamma, proteína inducida por interferón gamma, SLAMF7, HHGFR, receptor TWEAK, NRP1, EpCAM, CEA, antígeno mesotelina relacionado con CEA, MUC1, IGF-1R, TRAIL-R2, DR5, DLL4, VWF, MCP-1, p-amiloide, fosfatidilserina, factor Rhesus, CCL11, NARP-1, RTN4, ACVR2B, SOST, NOGO-A, esclerostina, influenza aviar, influenza Hemaglutinina A, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus respiratorio sincitial, glicoproteína del virus de la rabia, glicoproteína B del citomegalovirus, tuberculosis, ébola, Staphylococcus aureus, SARS, MERS, malaria, VPH, VHS, TGF-p, TGF- pR1, NGF, LTA, AOC3, ITGA2, GM-CSF, receptor de GM-CSF, oxLDL, LOXL2, RON, KIR2D, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, episialina, miostatina, o VIH-1.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el corte se introduce en IGHV, IGHD, IGHJ, IGHC, IGKV, IGKJ, IGKC, IGLV, IGLJ, IGLC, o cualquier combinación de los mismos.