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JP2022543112A - Ｄｕｘ４発現細胞およびそれらの使用 - Google Patents

Ｄｕｘ４発現細胞およびそれらの使用 Download PDF

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JP2022543112A JP2022506729A JP2022506729A JP2022543112A JP 2022543112 A JP2022543112 A JP 2022543112A JP 2022506729 A JP2022506729 A JP 2022506729A JP 2022506729 A JP2022506729 A JP 2022506729A JP 2022543112 A JP2022543112 A JP 2022543112A
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Abstract

Figure 2022543112000001
本明細書に開示されるのは、幹細胞、それらの分化細胞、初代Ｔ細胞、およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含むＤＵＸ４を発現する細胞、ならびにそれらの使用および生成の関連する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される細胞は、１つ以上のＭＨＣ Ｉおよび／またはＭＨＣ ＩＩヒト白血球抗原を発現しない。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、免疫回避特性を有する。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年８月１日に出願された米国仮出願第６２／８８１，８４０号の優先権を主張し、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。
がんおよび変性疾患は、人間の健康に不相応な脅威を与える。多くの場合、加齢に関連して、これらの疾患は、影響を受けた組織および器官の進行性の悪化をもたらし、最終的には、影響を受けた対象の障害および死をもたらす。再生医療の約束は、罹患した細胞または失われた細胞を新しい健康な細胞に置き換えることである。過去５年間で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用して患者に移植するためのあらゆる成体細胞型を生成するという再生医療の新しいパラダイムが出現した。原則として、ｈＰＳＣベースの細胞療法は、すべてではないにしてもほとんどの変性疾患を治療する可能性があるが、そのような療法の成功は、対象の免疫応答によって制限される可能性がある。
免疫拒絶を克服すると考えられている戦略には、ＨＬＡ一致（例えば、一卵性双生児または臍帯バンク）、対象への免疫抑制薬の投与、遮断抗体、骨髄抑制／混合キメラ現象、ＨＬＡ一致幹細胞リポジトリー、および自己幹細胞療法が含まれる。
細胞療法に関連する免疫拒絶を克服するための新規のアプローチ、組成物および方法の必要性が残っている。
一態様において、本明細書で提供されるのは、細胞におけるＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の発現の低下およびＤＵＸ４の発現を増加させるための修飾を含む、単離された細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現の低下をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼによってＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、細胞におけるＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるもの（例えば、１つの因子）の発現を増加させるための修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態において、単離された細胞は、細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させるための修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼによってＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼによってＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１４の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４の発現を増加させるための修飾は、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変またはコドン最適化された配列である。場合によっては、コドン改変された配列は、配列番号１である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド（核酸）配列である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、修飾は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものの発現を増加させることであり、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。
場合によっては、ＣＤ４７の発現を増加させるための修飾は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、を含む発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４の発現を増加させるための修飾は、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変された配列である。場合によっては、コドン改変された配列は、配列番号１である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものの発現を増加させるための修飾は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７の発現を増加させるための修飾は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。場合によっては、セーフハーバーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座および／またはＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。
いくつかの実施形態において、単離された細胞のいずれもまた、誘導性自殺スイッチを含む。
いくつかの実施形態において、単離された細胞は、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、およびＴ細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、例えば、投与時に患者に対して低免疫原性である。特定の実施形態において、単離された細胞は、低免疫原性幹細胞、低免疫原性分化細胞、低免疫原性胚性幹細胞、低免疫原性多能性幹細胞、低免疫原性成体幹細胞、低免疫原性前駆細胞、低免疫原性体細胞、および低免疫原性Ｔ細胞からなる群から選択される。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを幹細胞に導入し、それによって低免疫原性細胞または免疫認識を回避する細胞を産生することを含む、細胞を調製する方法である。いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを幹細胞に導入することを含み、それによって低免疫原性幹細胞を産生することを含む、低免疫原性幹細胞を調製する方法である。そのような細胞は、例えば、レシピエント対象または患者への投与時に低免疫原性である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変された配列である。場合によっては、コドン改変された配列は、配列番号１である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞は、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。場合によっては、遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞は、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。場合によっては、遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞は、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む。場合によっては、遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞は、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞は、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、誘導された多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、初代Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞を調製するための方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを細胞に導入することを含む、細胞において該ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。
場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、ＣＩＩＴＡ遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、本開示は、表、付録、および配列表を含めて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞を調製するための方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを細胞に導入することを含む、細胞においてＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、Ｂ２Ｍ遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、本開示は、表、付録、および配列表を含めて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４を含む細胞を調製するための方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを細胞に導入することを含む、細胞においてＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、ＮＬＲＣ５遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１１４の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択され、本開示は、表、付録、および配列表を含めて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４発現のための発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４発現のための発現ベクターは、ウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、この方法は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを幹細胞に導入することをさらに含む。ある特定の実施形態において、この方法は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを幹細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、この方法の第２の発現ベクターは、誘導性発現ベクターである。いくつかの実施形態において、この方法の第２の発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、この方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを細胞に導入することをさらに含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を細胞の選択された遺伝子座に導入し、それによって免疫原性の低下を示す細胞を産生することを含む、細胞を調製する方法である。態様において、本明細書で提供されるのは、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を幹細胞の選択された遺伝子座に導入し、それによって低免疫原性幹細胞を産生することを含む、低免疫原性幹細胞を調製する方法である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変された配列である。いくつかの実施形態において、コドン改変された配列は、配列番号１である。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、ＣＩＩＴＡ遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についてのセーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される１つの因子をコードするポリヌクレオチドを幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９５からなる群から選択される１つの因子をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列についての選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列についてのセーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列についてのセーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、またはＳＨＳ２３１１遺伝子座である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、Ｂ２Ｍ遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、幹細胞においてＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される。場合によっては、レアカッティングエンドヌクレアーゼの導入することは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む。場合によっては、ＮＬＲＣ５遺伝子の少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、この方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを幹細胞に導入することをさらに含む。
本明細書で提供されるのは、分化条件下で、本明細書に記載される任意の幹細胞を培養し、本明細書に概説される方法のうちのいずれか１つに従って調製し、それによって分化した細胞を調製することを含む、分化した低免疫原性細胞を調製する方法である。また、本明細書で提供されるのは、分化条件下で、本明細書に概説される方法のうちのいずれか１つに従って調製された低免疫原性幹細胞を培養し、それによって分化した低免疫原性細胞を調製することを含む、分化した低免疫原性細胞を調製する方法である。いくつかの実施形態において、分化条件は、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）、膵島細胞、網膜色素上皮細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、間葉細胞、および内皮細胞からなる群から選択される細胞型への幹細胞の分化に適切である。いくつかの実施形態において、分化した細胞型は、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される。
本明細書に記載される任意の方法に従って調製された分化した低免疫原性細胞の集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を治療する方法もまた、本明細書に提供される。さらに、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される低免疫原性細胞のうちのいずれかの集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を治療する方法である。
本開示は、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、Ｂ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している幹細胞について説明する。本明細書で提供されるのは、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞である。
本開示は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞である。
本開示は、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡならびにＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡならびにＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞である。
本開示は、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。本明細書で提供されるのは、ＣＩＩＴＡならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
本開示は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。いくつかの実施形態において、提供されるのは、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞である。
本開示は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している細胞について説明する。
いくつかの実施形態において、提供される細胞のうちのいずれかは、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、誘導された多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、初代Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明は、概説された細胞のうちのいずれか１つの集団を提供する。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される低免疫原性細胞のうちのいずれか１つから分化した細胞またはその集団である。
低免疫原性細胞、それを産生する方法、およびそれを使用する方法の詳細な説明は、２０１５年５月９日に提出されたＷＯ２０１６／１８３０４１、２０１８年１月１４日に提出されたＷＯ２０１８／１３２７８３、および２０１８年３月２０日に提出されたＷＯ２０１８／１７５３９０において見出され、配列表および図面を含むそれらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の他の目的、利点および実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
配列番号１～２９を含むＤＵＸ４の核酸およびアミノ酸配列を示す。
Ｉ．緒論
ゲノム編集および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成、それに続くそのようなｉＰＳＣの分化は、多能性、エピジェネティックな状態、分化の能力、およびゲノムの安定性に関して、費用および時間がかかり、非常に変動しやすいプロセスのままである。さらに、ゲノム編集および長期培養中に発生する変化は、適応免疫応答を引き起こし、自家幹細胞由来の移植でさえ免疫拒絶をもたらすことが見出されている。幹細胞由来の移植片に対する対象の免疫拒絶の問題を克服するために、本発明者らは、本明細書において、任意の移植可能な細胞型の生きた供給源を表す免疫回避細胞（例えば、低免疫原性細胞、低免疫原性多能性細胞、または低免疫原性Ｔ細胞）を開発し、本明細書に開示する。有利なことに、本明細書に開示される細胞および幹細胞は、対象の遺伝子構造に関係なく、レシピエント対象の免疫系によって拒絶されない。
本明細書に開示される発明は、ＤＵＸ４を利用して、ＭＨＣ Ｉ発現を調節（例えば、低下または排除）する。いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用するゲノム編集技術もまた、ヒト細胞における重要な免疫遺伝子の発現を（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを削除することによって）低下または排除するために使用される。ある特定の実施形態において、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術を使用して、寛容導入因子をヒト細胞に挿入し、それらおよびそれらから調製された分化細胞を、レシピエント対象に移植する際に免疫認識を回避できる細胞にする。このように、本明細書に記載される細胞は、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ発現の発現を低下またはサイレンシングした。
ゲノム編集技法により、所望の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡ切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して結合し、核酸分子の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的とすることに焦点を当てている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端接合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。
特定の実施形態の実施は、特に反対に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは、説明の目的で以下に説明されている。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、およびＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどのジャーナルにおける研究論文を参照されたい。
ＩＩ．定義
細胞を特徴付けるために本明細書で使用される場合、「低免疫原性」という用語は、一般に、そのような細胞が生着または移植される対象による免疫拒絶の傾向が少ないことを意味する。例えば、改変されていないか、または修飾されていない野生型細胞と比較して、そのような低免疫原性細胞は、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶の傾向が、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以下だけ少ない。いくつかの態様において、ゲノム編集技術を使用して、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節し、したがって、低免疫原性細胞を生成する。いくつかの実施形態において、低免疫原性細胞は、ＭＨＣミスマッチの同種異系レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。場合によっては、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞から産生された分化細胞は、ＭＨＣミスマッチの同種異系レシピエントに投与される（例えば、移植またはグラフトされる）ときに免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態において、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性適応免疫拒絶および／または自然免疫細胞拒絶から保護される。
細胞の低免疫原性は、適応免疫応答および自然免疫応答を誘発する細胞の能力など、細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。そのような免疫応答は、当業者によって認識されているアッセイを使用して測定することができる。いくつかの実施形態において、免疫応答アッセイは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞殺傷、ＮＫ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、およびマクロファージ活性に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞およびそれらの誘導体は、対象への投与時に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞による殺傷の減少を受ける。場合によっては、細胞およびそれらの誘導体は、修飾されていない細胞または野生型細胞と比較して、マクロファージ貪食が減少していることを示す。いくつかの実施形態において、低免疫原性細胞は、対応する修飾されていない野生型細胞と比較して、レシピエント対象において免疫応答の低下または減少を誘発する。いくつかの実施形態において、低免疫原性細胞は、レシピエント対象において非免疫原性であるか、または免疫応答を誘発することができない。
本明細書で使用される「免疫抑制因子」または「免疫調節因子」または「寛容原性因子」には、投与、移植、または生着時に低免疫因子、補体阻害剤、および宿主またはレシピエント対象の免疫系によって認識される細胞の能力を調節するかまたはそれに影響する他の因子が含まれる。
本明細書で使用される「免疫シグナル伝達因子」は、場合によっては、免疫シグナル伝達経路を活性化する分子、タンパク質、ペプチドなどを指す。
本明細書で使用される「セーフハーバー遺伝子座」は、導入遺伝子または外因性遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座を指す。例示的な「セーフハーバー」遺伝子座には、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子、およびＲｏｓａ遺伝子（例えば、ＲＯＳＡ２６）が含まれる。
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡもしくは任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。調節はまた完全であり得、すなわち、遺伝子発現が完全に不活性化されるか、もしくは野生型レベル以上に活性化される、またはそれは部分的であり得、遺伝子発現は部分的に低下するか、または野生型レベルのある部分まで部分的に活性化される。
「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して交換可能に使用され、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに適用される機能を媒介することができるという可能性を考慮に入れる。例示として、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答して、コード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に機能的に連結される。転写調節配列は、一般に、シスにおいてコード配列と機能的に連結されているが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していなくても、コード配列に機能的に連結されている転写調節配列である。
「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング、発現ビヒクル、および組み込みベクターが含まれる。ベクターまたは構築物を細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、パーティクルガン法、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃内膜、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）または外胚葉（例えば、表皮組織および神経系組織）のうちのいずれかに分化する可能性を有する。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語は、非多能性細胞に由来する一種の多能性幹細胞である「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」も包含する。親細胞の例には、様々な手段によって多能性の未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれる。そのような「ｉＰＳ」または「ｉＰＳＣ」細胞は、ある特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、またはある特定のタンパク質の外因性適用によって創出することができる。ｉＰＳ細胞を誘導するための方法は当技術分野で知られており、以下でさらに説明される。（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）、Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）、Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）、およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）を参照。それぞれは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成は、下で概説される。本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞である。
「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」複合体とは、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトには、クラスＩおよびクラスＩＩの２つのＭＨＣ、「ＨＬＡ－Ｉ」および「ＨＬＡ－ＩＩ」がある。ＨＬＡ－Ｉには、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃの３つのタンパク質が含まれ、細胞内からペプチドを提示し、ＨＬＡ－Ｉ複合体によって提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞としても知られる）を引きつける。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連している。ＨＬＡ－ＩＩには、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲの５つのタンパク質が含まれており、これらは細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。これは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。「ＭＨＣ」または「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）由来であるかまたはマウス（ＭＨＣ）由来であるかに依存するため、限定することを意味するものではないことを理解されたい。したがって、哺乳動物細胞に関連するため、これらの用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
単離された細胞に適用される「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作または手順を実施することを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ）が本明細書に記載される方法に従ってエクスビボで改変された細胞または細胞集団を個体に投与することを指す。個体は通常、病気もしくは負傷しているか、または集団の平均的なメンバーと比較して病気になるリスクが高く、そのような注意、ケア、または管理を必要とする。
本明細書で使用される場合、「治療すること」および「治療」という用語は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の軽減または疾患の改善、例えば、有益なまたは望ましい臨床結果を有するように、本明細書に記載される方法に従ってエクスビボで改変された標的ポリヌクレオチド配列を有する有効量の細胞を対象に投与することを指す。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分的もしく全体的）が含まれるが、これらに限定されない。治療はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することを指し得る。したがって、当業者は、治療が病状を改善する可能性があるが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることを認識している。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、予防を含む。あるいは、疾患の進行が低減または停止した場合、治療は「効果的」である。治療はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。治療を必要とするものには、すでにポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害と診断されているもの、および遺伝的感受性または他の要因のためにそのような障害を発症する可能性が高いものが含まれる。
疾患または障害の「治療」または「予防」とは、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防し、進行を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止し、そのような疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を悪化または憎悪させることを意味する。一実施形態において、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。
本明細書で使用される場合、「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」という用語は、所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば、本発明の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載される細胞を対象に配置する文脈において交換可能に使用される。細胞は、所望の部位に直接移植することができるか、あるいは、移植された細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存し続ける対象における所望の位置への送達をもたらす、任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、最短で数時間、例えば２４時間～数日、最長で数年であり得る。場合によっては、細胞は、移植された細胞を移植位置に維持し、移植された細胞の移動を回避するために、肝臓内または皮下、例えばカプセル内など、所望の部位以外の場所に投与することもできる。
追加または代替の態様において、本発明は、例えば、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムなどのヌクレアーゼシステムを利用して、熟練者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ならびにＴＡＬＥＮを利用する方法の例が本明細書で詳細に説明されているが、本発明は、これらの方法／システムの使用に限定されないことを理解されたい。熟練者に知られている標的細胞における発現を低下または除去するために、例えば、Ｂ２Ｍを標的とする他の方法を、本明細書で利用することができる。
本発明の方法を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。本発明は、任意の目的のために細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、変異体細胞を産生するように改変される。本明細書で使用される場合、「変異体細胞」は、その元の遺伝子型とは異なる結果として生じる遺伝子型を有する細胞を指す。場合によっては、「変異体細胞」は、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して正常に機能する遺伝子が改変された場合に、変異体表現型を示す。他の例において、「変異体細胞」は、例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して変異体遺伝子型を修正した場合に、野生型表現型を示す。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を修正または修復するために（例えば、細胞に対して正常な表現型を回復するために）改変される。いくつかの実施形態において、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を誘導するために（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するために）改変される。
いくつかの実施形態において、改変は、インデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせから生じる変異を指す。当業者によって理解されるように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態において、改変は、点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換を指す。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における任意の長さのインデルまたは点変異を誘導することができる。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を干渉する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を削除することを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）の標的ポリヌクレオチド配列にインデルを誘導することによって標的ポリヌクレオチド配列を変更することにより達成することができる。当業者は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、本明細書に記載される詳細に基づいて標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトする方法を容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態において、改変は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な適用に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、研究目的のためにインビトロで実施することができる。エクスビボ目的のために、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列をノックアウトすることは、標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を（例えば、エクスビボで細胞内の変異体対立遺伝子をノックアウトし、ノックアウトされた変異体対立遺伝子を含む細胞を対象に導入することによって）治療または予防するために有用であり得る。
本明細書における「ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を付加するプロセスを意味する。これにより、コードされたタンパク質のレベルが上昇する。当業者によって理解されるように、これは、遺伝子の１つ以上の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、またはタンパク質の発現を増加させる内因性遺伝子の調節成分を改変することを含む、いくつかの方法で達成することができる。これは、プロモーターを修飾すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を修飾することによって達成され得る。
いくつかの実施形態において、改変は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低下をもたらす。「減少する」、「低下した」、「低下」、および「減少」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少する」、「低下した」、「低下」、「減少」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％を含むそれ以下の減少（すなわち、参照試料と比較して値の消失）、または参照レベルと比較して１０～１００％の間の任意の減少を意味する。
「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは１００％を含むそれ以下の増加、または１０～１００％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍以上の間の任意の増加を意味する。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、参照される分子または参照されるポリペプチドが、目的の細胞に導入されることを意味することを意図している。ポリペプチドは、例えば、染色体への組み込みなどによる細胞の遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、発現可能な形態のコード核酸の、細胞への導入を指す。「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子、構築物、因子などである。「細胞内の正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、ニューロンの胚発生中にのみ存在する分子は、成体ニューロン細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能しているバージョン、または正常に機能している内因性分子の機能不全のバージョンを含み得る。
外因性分子または因子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、もしくは上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体などの高分子であり得る。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二本鎖を形成することができるもの、および三本鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
「内因性」という用語は、細胞内に存在する参照される分子またはポリペプチドを指す。同様に、コード核酸の発現に関して使用される場合の用語は、細胞内に含まれ、外因的に導入されないコード核酸の発現を指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一性」パーセントという用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズムのうちの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応物に対して比較およびアラインメントした場合に同じである、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性パーセント」は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、あるいは、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較では、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似の方法を検索することによって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実装によって、または目視検査によって（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）によって行われ得る。
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米・国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公表されている。
「対象」および「個体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、動物、例えば、細胞を得ることができる、および／または本明細書に記載される細胞による予防的治療を含む治療が提供されるヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的なこれらの感染症、状態または病状の治療について、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で交換可能に使用される「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語は、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚を含むがこれらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物、または飼いならされた哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどの他の哺乳動物、または生産哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなどである。
請求項はいかなる選択的な要素も除外するように作成することができることに留意されたい。そのため、この記載は、請求項要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「だけ」、「のみ」などの排他的な用語の使用に対して先の記載として役立つことを意図している。この開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書に記載され、例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離されるか、または組み合わされる、別個の構成要素および特徴を有している。あらゆる列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、または論理的に可能な他の順序で実行してよい。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験に使用してもよいが、代表的な例示的な方法および材料をここに記載する。
本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じである。値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値と、その指定範囲の任意の他の指定値または介在値とは、本発明に包含される、ことが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は独立して、そのより小さい範囲に含まれ得、また、本発明に包含され、指定範囲内の任意の具体的に除外された制限値に従う。指定範囲が制限値の一方または両方を含む場合、それらの含まれた制限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に示される。「約」という用語は、その後に続く正確な数字およびその用語の後に続く数字に近いか、またはほぼその数字である数字を文字通り支持するために本明細書で使用される。ある数字が、具体的に引用されている数字に近いか、または近似であるかを決定する際に、引用されていない数字に近いか、または近似である数字は、提示されている文脈において、具体的に引用されている数字と実質的に等価を提供する数字であり得る。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。さらに、引用された各刊行物、特許、または特許出願は、刊行物が引用されたものに関連する主題を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の発明が、先行発明のためにかかる刊行物に先行する権利が与えられていない、ことを認めるものと解釈するべきではない。さらに、提示される公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
Ａ．低免疫原性細胞
本明細書で提供されるのは、ＭＨＣ Ｉ分子、ＭＨＣ ＩＩ分子、またはＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子の発現を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の修飾を含む細胞である。ある特定の態様において、ＤＵＸ４の発現を増加させることを含む修飾。いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる１つ以上のゲノム修飾およびＤＵＸ４の発現を増加させる修飾を含む。言い換えれば、操作された細胞は、外因性のＤＵＸ４タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の低下またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる１つ以上のゲノム修飾およびＤＵＸ４の発現を増加させる修飾を含む。場合によっては、操作された細胞は、外因性のＤＵＸ４核酸およびタンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の低下またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または排除する１つ以上のゲノム修飾、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または排除する１つ以上のゲノム修飾、およびＤＵＸ４の発現を増加させる修飾を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、外因性ＤＵＸ４タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の低下またはサイレンシングした表面発現を示し、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の低下または欠如した表面発現を示す。
いくつかの実施形態において、細胞はまた、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものの発現を増加させるための修飾を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、またはＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集システムは、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を修飾するために使用される。いくつかの実施形態において、標的されたポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、およびＮＬＲＣ５を含む群から選択される１つ以上である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｂ２ＭおよびＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。特定の実施形態において、細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集修飾を含む。ある特定の実施形態において、細胞のゲノムは、ＨＬＡ発現の重要な構成要素を低減または削除するように改変されている。
いくつかの態様において、本開示は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを削除するように遺伝子が編集され、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む、細胞（例えば、幹細胞、分化細胞、もしくはＴ細胞）またはその集団を提供する。ある特定の態様において、本開示は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを削除するように遺伝子が編集され、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む、細胞（例えば、幹細胞、分化細胞、もしくはＴ細胞）またはその集団を提供する。特定の態様において、本開示は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを削除するように１つ以上の遺伝子が編集され、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の表面発現を低下または排除するゲノムを含む、細胞（例えば、幹細胞、分化細胞、もしくはＴ細胞）またはその集団を提供する。
ある特定の実施形態において、ＭＨＣ Ｉの発現は、ＤＵＸ４の発現を過剰発現または増加させることによって調節される。場合によっては、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変された配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４のコドン改変された配列は、配列番号１を含む。場合によっては、コドン改変された配列は、配列番号１である。他の場合において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。場合によっては、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態において、ＭＨＣ Ｉ分子および／またはＭＨＣ ＩＩ分子の発現は、ゲノムＤＮＡの隣接するストレッチを標的および削除し、それによってＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、およびＮＬＲＣ５からなる群から選択される標的遺伝子の発現を低下または排除することによって調節される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、外因性ＤＵＸ４タンパク質および不活化または修飾されたＣＩＩＴＡ遺伝子配列、および場合によっては、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を不活化または修飾する追加の遺伝子修飾を含む、遺伝子編集された細胞（例えば、修飾されたヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、外因性ＤＵＸ４タンパク質および不活化または修飾されたＣＩＩＴＡ遺伝子配列、および場合によっては、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を不活化または修飾する追加の遺伝子修飾を含む、遺伝子編集された細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、外因性ＤＵＸ４タンパク質および不活化または修飾されたＢ２Ｍ遺伝子配列、および場合によっては、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を不活化または修飾する追加の遺伝子修飾を含む、遺伝子編集された細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるのは、外因性ＤＵＸ４タンパク質および不活化または修飾されたＢ２Ｍ遺伝子配列、および場合によっては、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列およびＮＬＲＣ５遺伝子配列を不活化または修飾する追加の遺伝子修飾を含む、遺伝子編集された細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞には、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来するか、または産生される分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、およびそれらの任意の子孫が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される。
いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞は、レシピエント対象（例えば、細胞を投与された患者）とは異なる１つ以上のドナー対象からの初代Ｔ細胞のプールからのものである。初代Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上のドナー対象から取得し、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞は、１つまたは複数の個体から採取され、場合によっては、初代Ｔ細胞または初代Ｔ細胞のプールは、インビトロで培養される。いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞または初代Ｔ細胞のプールは、ＤＵＸ４および／またはＣＤ４７を外因的に発現するように操作され、インビトロで培養される。
ある特定の実施形態において、初代Ｔ細胞または初代Ｔ細胞のプールは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される。ＣＡＲは、当業者に知られている任意のものであり得る。有用なＣＡＲには、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、およびＢＣＭＡを含む群から選択される抗原に結合するものが含まれる。場合によっては、ＣＡＲは、チサゲンレクロイセルおよびアキシカブタゲンシロルユーセル、または臨床試験で調査中の他のものなど、ＦＤＡ承認されたＣＡＲ－Ｔ細胞療法で使用されるものと同じであるか、または同等である。
いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞または初代Ｔ細胞のプールは、修飾されていない初代Ｔ細胞と比較して、内因性Ｔ細胞受容体の発現の低下を示すように操作される。ある特定の実施形態において、初代Ｔ細胞または初代Ｔ細胞のプールは、修飾されていない初代Ｔ細胞と比較して、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、またはＣＴＬＡ４およびＰＤ１の両方の発現の低下を示すように操作される。Ｔ細胞を含む細胞を遺伝子修飾する方法は、例えば、ＷＯ２０１６／１８３０４１において詳細に記載されており、本開示は、表、付録、配列表および図面を含めて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む第１世代のＣＡＲ；（ｂ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む第２世代のＣＡＲ；（ｃ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第３世代のＣＡＲ；ならびに（ｄ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第４世代のＣＡＲを含む群から選択されるＣＡＲを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、（ａ）腫瘍性細胞に特徴的な抗原を標的とする抗原結合ドメイン；（ｂ）Ｔ細胞に特徴的な抗原を標的とする抗原結合ドメイン；（ｃ）自己免疫疾患または炎症性疾患に特徴的な抗原を標的とする抗原結合ドメイン；（ｄ）老化細胞に特徴的な抗原を標的とする抗原結合ドメイン；（ｅ）感染性疾患に特徴的な抗原を標的とする抗原結合ドメイン；ならびに（ｆ）細胞の細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメインを含むがこれらに限定されない群から選択される。
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体、抗原結合部分またはその断片、ｓｃＦｖ、およびＦａｂを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９またはＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＦＭＣ６３などであるがこれに限定されない抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＦｃεＲＩγ、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、およびそれらの機能的バリアントの膜貫通領域を含む群から選択されるものを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。例えば、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み得る。または、シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。ある特定の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。他の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。場合によっては、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは同じではない。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、同じではない２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、および／またはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、サイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、および／またはＴ細胞活性化中のＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。
本明細書に記載されるように、第４世代のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、およびＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むことができる。場合によっては、サイトカイン遺伝子は、低免疫原性細胞の内因性または外因性サイトカイン遺伝子である。場合によっては、サイトカイン遺伝子は、炎症誘発性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態において、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、およびそれらの機能的断片を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのシグナル伝達が成功するとサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子もしくは機能的ドメインまたはそれらの断片を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的バリアント、および（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはそれらの機能的バリアントを含む。他の実施形態において、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント；および（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはそれらの機能的バリアントを含む。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはそれらの機能的バリアント；（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント；（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはそれらの機能的バリアント；および（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；（ｉｉ）ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインまたはそれらの機能的バリアント；（ｉｉｉ）４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはその機能的バリアント；および（ｉｖ）ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントを含む。
ＣＡＲ構築物を導入するか、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するための方法は、当業者に周知である。詳細な説明は、例えば、Ｖｏｒｍｉｔｔａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８，５３，１６２－１８１、およびＥｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４３，１１３－１１７において見出される。
いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞に由来する細胞は、例えば、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）またはＴ細胞受容体β定数領域（ＴＲＢＣ））の破壊による、内因性Ｔ細胞受容体の発現の低下を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、キメラ抗原受容体、ＤＵＸ４、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の寛容原性因子）は、破壊されたＴ細胞受容体遺伝子において挿入される。
いくつかの実施形態において、初代Ｔ細胞に由来する細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の発現の低下および／またはプログラム細胞死（ＰＤ１）を含む。ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ならびにＣＴＬＡ４およびＰＤ１の両方の発現を低下または排除する方法は、レアカッティングエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉技術を利用する遺伝子修飾技術などであるが、これらに限定されない当業者によって認識される任意のものを含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、任意のＣａｓタンパク質、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。
いくつかの実施形態において、記載された操作された細胞の集団は、レシピエント対象への投与時に、低下したレベルの免疫活性化を誘発するか、または免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態において、細胞は、レシピエント対象において、低下したレベルの全身性ＴＨ１活性化を誘発するか、または全身性ＴＨ１活性化を誘発しない。いくつかの実施形態において、細胞は、レシピエント対象において、低下したレベルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化を誘発するか、またはＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態において、細胞は、レシピエント対象への投与時に、細胞に対して低下したレベルのドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発するか、またはドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。いくつかの実施形態において、細胞は、レシピエント対象における細胞に対して、低下したレベルのＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生を誘発するか、またはＩｇＭおよびＩｇＧ抗体産生を誘発しない。いくつかの実施形態において、細胞は、レシピエント対象への投与時に、細胞の低下したレベルの細胞傷害性Ｔ細胞殺傷を誘発する。
Ｂ．ＤＵＸ４
いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４などの寛容原性または免疫抑制因子の発現を増加させるように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞もしくはＣＡＲ－Ｔ細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４の発現の増加を提供するために細胞のゲノムを改変するための方法を提供する。一態様において、本開示は、外因的に発現されたＤＵＸ４タンパク質を含む細胞またはその集団を提供する。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現の増加は、以下のＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）のうちの１つ以上の発現を抑制、低下、または排除する。
ＤＵＸ４は、胚組織および人工多能性幹細胞において活性であり、正常で健康な体細胞ではサイレントである転写因子である（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＥＬｉｆｅ４、Ｄｅ Ｉａｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４９，９４１－９４５、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４９，９２５－９３４、Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，ｅ１００１１８１、Ｗｈｉｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ）。ＤＵＸ４の発現は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子発現（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃの発現）のＩＦＮ－γを介した誘導を遮断するように作用する。ＤＵＸ４の発現は、ＭＨＣクラスＩによる抑制された抗原提示に関係している（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ，２０１９，５０，１－１４）。ＤＵＸ４は、卵割期の遺伝子発現（転写）プログラムにおいて転写因子として機能する。その標的遺伝子には、コーディング遺伝子、非コーディング遺伝子、および反復要素が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＵＸ４には少なくとも２つのアイソフォームがあり、最長のアイソフォームは、ＤＵＸ４のＣ末端転写活性化ドメインを含む。アイソフォームは、代替スプライシングによって産生される。例えば、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，２２，３８－５１、Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ，ｅ１００１１８１を参照されたい。ＤＵＸ４の活性なアイソフォームは、そのＮ末端ＤＮＡ結合ドメインおよびそのＣ末端活性化ドメインを含む。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，４４，５１６１－５１７３を参照されたい。
ＤＵＸ４のＣｐＧモチーフの数を低減することは、ＤＵＸ４導入遺伝子のサイレンシングを減少させることが示されている（Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１６，２５（２０）：４４１９－４４３１）。配列番号１（図１Ａ）は、ＤＵＸ４タンパク質配列を維持しながらＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、ＤＵＸ４のコドン改変された配列を表す。
ある特定の態様において、少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドを利用して、細胞、例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞によるＤＵＸ４の外因性発現を容易にすることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムは、免疫拒絶を積極的に阻害するために、ＡＡＶＳ１遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座への寛容原性因子の挿入などの寛容原性因子の挿入を容易にするために使用される。場合によっては、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、またはＳＨＳ２３１遺伝子座などであるが、これらに限定されないセーフハーバー遺伝子座に挿入される。
いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９を含む群から選択される配列に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の配列同一性を有する、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９を含む群から選択される。配列番号２～２９として記載されるアミノ酸配列を図１Ａ～１Ｇに示す。
場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＤＵＸ４ポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、寛容原性因子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながら、ＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含む、コドン改変された配列である。場合によっては、ＤＵＸ４のコドン改変された配列は、配列番号１を含む。場合によっては、ＤＵＸ４のコドン改変された配列は、配列番号１である。他の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１を含むＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９を含む群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＵＸ４ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、および配列番号２９を含む群から選択される、ＤＵＸ４ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
ＤＵＸ４発現の増加は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、イムノアッセイなどの既知の技法を使用してアッセイすることができる。
Ｃ．ＣＩＩＴＡ
ある特定の態様において、本明細書に開示される発明は、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）発現を標的および調節する（例えば、低下または排除する）ことによって、ＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現を調節する（例えば、低下または排除する）。いくつかの態様において、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して発生する。ＣＩＩＴＡは、ＬＲまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣ ＩＩの転写を調節する。
いくつかの実施形態において、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡの相同体である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。
いくつかの態様において、ＣＩＩＴＡの発現の低下または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲ）のうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態において、本明細書に概説される細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＰＣＲによるＣＩＩＴＡ遺伝子の結果として生じる遺伝子修飾およびＨＬＡ－ＩＩ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によるアッセイであり得る。別の実施形態において、ＮＬＲＣ５タンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態において、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、不活性化する遺伝子修飾の存在を確認するために使用される。
Ｄ．Ｂ２Ｍ
ある特定の実施形態において、本明細書に開示される本発明は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍの発現を標的および調節する（例えば、低下または排除する）ことによって、ＭＨＣ－１遺伝子の発現を調節する（例えば、低下または排除する）。いくつかの態様において、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して発生する。Ｂ２Ｍの発現を調節する（例えば、低下または削除する）ことによって、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送が遮断され、レシピエント対象に生着したときに免疫寛容を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者において低免疫原性であるとみなされる。
いくつかの実施形態において、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍの相同体である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。
いくつかの態様において、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）のうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態において、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＰＣＲによるＢ２Ｍ遺伝子の結果として生じる遺伝子修飾およびＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によるアッセイであり得る。別の実施形態において、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態において、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、不活性化する遺伝子修飾の存在を確認するために使用される。
Ｅ．ＮＬＲＣ５
ある特定の態様において、本明細書に開示される発明は、ＮＬＲファミリー、５／ＮＯＤ２７／ＣＬＲ１６．１（ＮＬＲＣ５）を含むＣＡＲＤドメインの発現を標的および調節する（例えば、低下または排除する）ことによって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節する（例えば、低下または排除する）。いくつかの態様において、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して発生する。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉを介した免疫応答の重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ－γによって高度に誘導され、核に移行することができる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
いくつかの実施形態において、本発明の標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のバリアントである。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５の相同体である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のオルソログである。
いくつかの態様において、ＮＬＲＣ５の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣ Ｉ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）のうちの１つ以上の発現を低下または排除する。
いくつかの実施形態において、本明細書に概説される細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼによってＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録３または表１４の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
ＮＬＲＣ５遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＰＣＲによるＮＬＲＣ５遺伝子の結果として生じる遺伝子修飾およびＨＬＡ－Ｉ発現の低下は、ＦＡＣＳ分析によるアッセイであり得る。別の実施形態において、ＮＬＲＣ５タンパク質発現は、ＮＬＲＣ５タンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態において、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、不活性化する遺伝子修飾の存在を確認するために使用される。
Ｆ．追加の寛容原性因子
ある特定の実施形態において、１つ以上の寛容原性または免疫抑制因子をゲノム編集された細胞に挿入または再挿入して、ユニバーサルドナー幹細胞などの免疫特権のあるユニバーサルドナー細胞を創出することができる。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）は、１つ以上の寛容原性因子を発現するようにさらに修飾されている。例示的な寛容原性因子には、限定されないが、ＤＵＸ４、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９のうちの１つ以上が含まれる。いくつかの実施形態において、寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９を含む群から選択される。
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムを使用して、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、またはＳＨＳ２３１遺伝子座などであるが、これらに限定されないセーフハーバー遺伝子座への寛容原性因子などの寛容原性因子の挿入を容易にし、免疫拒絶を積極的に阻害する。
いくつかの態様において、本開示は、ＣＤ４７を発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＤ４７を発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、一次細胞または細胞株へのＣＤ４７の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録４または表２９の配列番号２００７８４～２３１８８５からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｃを発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｃを発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＨＬＡ－Ｃの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録５または表１０の配列番号３２７８～５１８３からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅを発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｅを発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＨＬＡ－Ｅの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録６または表１９の配列番号１８９８５９～１９３１８３からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｆを発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｆを発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＨＬＡ－Ｆの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録７または表４５の配列番号６８８８０８～３９９７５４からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｇを発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ｇを発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＨＬＡ－Ｇの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録８または表１８の配列番号１８８３７２～１８９８５８からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１を発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＰＤ－Ｌ１を発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＰＤ－Ｌ１の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録９または表２１の配列番号１９３１８４～２００７８３からなる群から選択され、その開示は参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、本開示は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＣＴＬＡ４－Ｉｇの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されるいずれか１つから選択される。
いくつかの態様において、本開示は、ＣＩ阻害剤を発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＩ阻害剤を発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＣＩ阻害剤の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されるいずれか１つから選択される。
いくつかの態様において、本開示は、ＩＬ－３５を発現するように修飾されたゲノムを含む細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＩＬ－３５を発現するようにゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、細胞または細胞株へのＩＬ－３５の挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、配列表を含む、ＷＯ２０１６／１８３０４１に開示されるいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態において、寛容原性因子は、発現ベクターを使用して細胞において発現される。例えば、細胞内でＣＤ４７を発現するための発現ベクターは、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６／１８３０４１および２０１８年１月１４日に出願されたＷＯ２０１８／１３２７８３に記載されているＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含み、表、付録、および配列表を含むそれらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。発現ベクターは、誘導可能な発現ベクターであり得る。発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどであるがこれに限定されないウイルスベクターであり得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＮＦＹ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＴＡＰ１、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、ＣＤ４７、Ｂ７－２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＬＦＡ－１、ＳＴ２、ＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ３０、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＬＴ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ５８、ＣＤ２、およびＨＥＬＩＯＳを含む群から選択されるポリペプチドのうちのいずれか１つを発現するように修飾されたゲノムを含む、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、初代Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞）またはそれらの集団を提供する。いくつかの態様において、本開示は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＮＦＹ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＴＡＰ１、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、ＣＤ４７、Ｂ７－２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＬＦＡ－１、ＳＴ２、ＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ３０、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＬＴ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ５８、ＣＤ２、およびＨＥＬＩＯＳを含む群から選択されるポリペプチドのうちのいずれか１つを発現するように細胞ゲノムを改変するための方法を提供する。ある特定の態様において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸を利用して、幹細胞株への選択されたポリペプチドの挿入を容易にすることができる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのリボ核酸または少なくとも一対のリボ核酸は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録１～４７および配列表に開示されるいずれか１つから選択され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加およびＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加およびＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加ならびにＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。
いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加およびＢ２Ｍの発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加およびＣＩＩＴＡの発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加およびＮＬＲＣ５の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９を含むがこれらに限定されない群から選択される１つ以上の因子の発現の増加を示すことができる。
いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍの発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＮＬＲＣ５の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２ＭおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。いくつかの実施形態において、細胞およびそれらの集団は、ＤＵＸ４およびＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現の低下を示す。本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９を含むがこれらに限定されない群から選択される１つ以上の発現の増加を示すことができる。
当業者は、遺伝子、タンパク質または分子の発現の増加または低下などの発現レベルを参照するか、または同等の細胞と比較することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、ＤＵＸ４の発現が増加した操作された幹細胞は、修飾されていない幹細胞と比較して、より高いレベルのＤＵＸ４タンパク質を有する修飾された幹細胞を指す。
Ｇ．遺伝子発現を修飾する方法
いくつかの実施形態において、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成することができる。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質導入またはウイルスベクターを使用した感染が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載されるように、修飾されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載されるように、修飾されたｍＲＮＡ（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）を含む。
本発明は、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して当業者が利用できる任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。そのようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を用いることができる（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変できるようにするそのようなＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＶシステムである。
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者は、任意の特定の細胞において改変される望ましい標的ポリヌクレオチド配列が、ゲノム配列の発現が障害に関連するか、またはそうでなければ病原体の細胞への侵入を容易にする任意のゲノム配列に対応し得ることを容易に理解するであろう。例えば、細胞内で改変するための望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する単一のポリヌクレオチド多型を含むゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であり得る。そのような実施例において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞を野生型対立遺伝子で置き換えることによって、細胞内の疾患に関連するＳＮＰを修正することができる。別の実施例として、細胞への病原体の侵入または増殖に関与する標的遺伝子のポリヌクレオチド配列は、病原体が細胞に侵入するか、または細胞内で増殖するのを防ぐために標的遺伝子の機能を破壊するための削除または挿入に好適な標的であり得る。
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。
いくつかの実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズすることができる少なくとも１～２つのリボ核酸を含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって接合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指すために交換可能に使用され、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、断片ならびに上記の他の同等物、バリアント、および類似体が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、置換および／または修飾は、タンパク質分解を防止または低減し、かつ／または細胞内のポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、部分を含めるための修飾（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプ（ＣＡＳＳ２としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。大腸菌サブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、およびＣａｓ５ｅが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｙｐｅｓｔサブタイプ（ＣＡＳＳ３としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、およびＣｓｙ４が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｍｅｎｉサブタイプ（ＣＡＳＳ４としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｄｖｕｌｇサブタイプ（ＣＡＳＳ１としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、およびＣａｓ５ｄが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｎｅａｐサブタイプ（ＣＡＳＳ７としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、およびＣａｓ５ｈが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ａｐｅｒｎサブタイプ（ＣＡＳＳ５としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、およびＣａｓ５ａが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｍｔｕｂｅサブタイプ（ＣＡＳＳ６としても知られる）のＣａｓタンパク質を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質には、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、およびＣｓｍ５が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質のうちのいずれか１つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態において、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）タンパク質機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。
いくつかの実施形態において、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、それぞれ、細胞への分子の取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含むことができる。
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、荷電タンパク質（例えば、正、負、または全体的に中性の電荷を運ぶ）にコンジュゲートまたは融合することができる。そのような連結は、共有結合であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、細胞に浸透するＣａｓタンパク質の能力を有意に増加させるために、正に超荷電したＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、細胞へのその侵入を容易にするためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例示的なＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、およびペネトラチンが含まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１タンパク質は、正に超荷電したＧＦＰに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成することができる。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質導入またはウイルスベクターを使用した感染が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載されるように、修飾されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載されるように、修飾されたｍＲＮＡ（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態において、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、リボ核酸のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向け、ハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向け、ハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸の両方は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。本発明のリボ核酸は、当業者によって理解されるように、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて、様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択することができる。１～２つのリボ核酸を選択して、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限にすることもできる。いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸は、細胞内の他のすべてのゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸は、細胞内の他のすべてのゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸のそれぞれは、標的モチーフ間に位置する変異体対立遺伝子に隣接するＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの実施形態において、１～２つのリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的ではなく、かつ／またはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態において、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、かつ／またはハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾された核酸（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）によってコードされる。
表１における本明細書に記載される遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的に有用な例示的なｇＲＮＡ配列を参照する。配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６／１８３０４１に見出すことができ、表、付録、および配列表を含む開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2022543112000002
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法論を使用して作製される。
「ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、典型的には転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えばＩ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡおよびＦｏｋ－Ｉのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態において、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＯｎｕＩまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい実施形態において、該ヌクレアーゼは、単量体のＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２／１３８９２７に記載されているＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインと操作されたＴＡＬリピートの融合など、特定の認識および切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数のリピート配列を含み、それぞれのリピートは、核酸標的配列のそれぞれのヌクレオチド塩基に特異的な１２位および１３位（ＲＶＤ）に二残基を含む。同様のモジュラーベース／ベース核酸結合特性（ＭＢＢＢＤ）を備えた結合ドメインは、異なる細菌種で出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質から誘導することもできる。新しいモジュラータンパク質には、ＴＡＬリピートよりも多くの配列変動性を示すという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮおよびＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴおよびＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態において、重要なアミノ酸１２および１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧに対するそれらの特異性を調節するために、特にこの特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に対して変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは、市販されている。
いくつかの実施形態において、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的な方法で、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。個々のＤＮＡ結合ドメインは、通常「フィンガー」と称される。ＺＦＰには、少なくとも１つのフィンガー、通常は２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。それぞれのフィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、通常は３～４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。それぞれのフィンガーは通常、およそ３０アミノ酸、亜鉛キレート化、ＤＮＡ結合サブドメインを含む。研究は、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの２つのシステイン残基とともに、亜鉛と配位した２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることを実証した（例えば、Ｂｅｒｇ ＆ Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照）。
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは非常に特異的であり、長さが１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲で、通常は長さが１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントであり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．およびＢ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは生細胞内の固有の部位を切断することができ、それによって切断部位の近くで遺伝子標的を１０００倍以上増強する（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、寛容原性因子、細胞表面分子、例えば、受容体またはリガンドなどであるが、これらに限定されないポリペプチドの発現をノックダウン（例えば、減少、排除、または阻害）するためのＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法には、合成ＲＮＡｉ分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および当業者によって認識されている他の一過性ノックダウン法を利用する方法が含まれる。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉ用試薬は、市販されている。例えば、ＣＩＩＴＡ ｓｉＲＮＡを導入すること、またはＣＩＩＴＡ ｓｈＲＮＡ発現ウイルスを細胞に導入することによって、ＣＩＩＴＡを幹細胞内でノックダウンすることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ干渉は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５からなる群から選択される少なくとも１つの発現を低下または阻害するために用いられる。ＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍの発現は、ＲＮＡｉベースの構築物を細胞に導入することによって低下または排除される。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４および／またはＰＤ１の発現は、ＲＮＡｉベースの構築物を免疫細胞、例えば、Ｔ細胞または初代Ｔ細胞に導入することによって低下または排除される。
Ｈ．寛容原性因子の過剰発現
これらの技術のすべてについて、本明細書に概説されるような組換え核酸を生成するために、周知の組換え技法が使用される。ある特定の実施形態において、寛容原性因子をコードする組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療される宿主細胞および対象に適切となる。様々な宿主細胞について、多くの種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、当技術分野で知られている。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。当技術分野で知られている構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または複数のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、または発現構築物は、染色体に挿入され得る。特定の実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための調節配列には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素が含まれる。ある特定の実施形態において、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、発現されることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、または抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現のために設計される。
好適な哺乳動物プロモーターの例には、例えば、以下の遺伝子からのプロモーターが含まれる：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端リピート配列領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端リピート領域、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン、または熱ショックプロモーターである。追加の実施形態において、哺乳動物宿主細胞で使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態において、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例には、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、および熱ショックプロモーターが含まれる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片として便利に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子（例えば、ＤＵＸ４、ＣＤ４７、または別の寛容原性因子）の発現は、融合タンパク質または（１）内因性ＤＵＸ４、ＣＤ４７、もしくは他の遺伝子に特異的な部位特異的結合ドメインおよび（２）転写アクチベーターを含むタンパク質複合体の発現によって増加する。
いくつかの実施形態において、調節因子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの部位特異的ＤＮＡ結合核酸分子から構成される。いくつかの実施形態において、この方法は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＺＦＰを含む融合タンパク質などの部位特異的ＤＮＡ結合標的タンパク質によって達成される。
いくつかの態様において、調節因子は、標的領域で遺伝子に特異的に結合するか、またはハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を使用するなどの部位特異的結合ドメインを含む。いくつかの態様において、提供されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、修飾ヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼにカップリングまたは複合体化される。例えば、いくつかの実施形態において、投与は、メガヌクレアーゼなどの修飾ヌクレアーゼのＤＮＡ標的タンパク質、またはクラスター化された規則的に散在する短いパリンドローム核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含む融合を使用して影響を受ける。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を欠くように修飾される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレアーゼは、触媒的に死んだｄＣａｓ９である。
いくつかの実施形態において、部位特異的結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ（Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなど）の認識配列。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、および米国特許公開第２００７／０１１７１２８号（すべては参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、およびＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的な基準には、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報および結合データを格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国公開第２０１１／０３０１０７３も参照されたい（すべては参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、部位特異的結合ドメインは、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合する、より大きなタンパク質内のタンパク質またはドメインである。
ＺＦＰの中には、個々のフィンガーの組み立てによって生成される、通常９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。ＺＦＰには、単一のフィンガードメインが、およそ３０アミノ酸長であり、亜鉛を通じて単一のβターンの２つのシステインと配位された２つの不変のヒスチジン残基を含み、２、３、４、５、または６つのフィンガーを有するαヘリックスを含むものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックスの４つのヘリックス位置（－１、２、３、および６）でアミノ酸置換を行うことによって改変することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在しない、例えば、選択された標的部位に結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい（すべては参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共同で、ジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者がジンクフィンガーの構築および検証を全体としてバイパスできるようにし、数千のタンパク質に特異的に標的されたジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態において、市販のジンクフィンガーが使用されるか、またはカスタム設計される。
いくつかの実施形態において、部位特異的結合ドメインは、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などの、天然に存在するか、または操作された（非天然に存在する）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、部位特異的結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を指示する転写物および他の要素を集合的に指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡもしくは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－メイト配列（「直接リピート」および内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈におけるｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接リピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「スペーサー」、もしくは「標的配列」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を含む。
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む、標的ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。いくつかの実施例において、ｇＲＮＡの標的ドメインは、標的核酸上の標的配列に対して相補的、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的、例えば、完全に相補的である。
いくつかの実施形態において、標的部位は、標的遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。
いくつかの実施形態において、標的ドメインは、転写開始、１つ以上の転写エンハンサーもしくはアクチベーターの結合、および／またはＲＮＡポリメラーゼを促進するために、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするように構成される。１つ以上のｇＲＮＡを使用して、遺伝子のプロモーター領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、遺伝子の１つ以上の領域を標的とすることができる。ある特定の態様において、標的部位は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側の６００塩基対以内にある。
プロモーターおよびアクチベーターを含む、エキソン配列および調節領域の配列を含む、遺伝子を標的とする配列であるか、またはそれを含むｇＲＮＡ配列を設計または同定することは、当業者のレベルの範囲内である。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集用のゲノムワイドなｇＲＮＡデータベースが公開されており、これは、ヒトゲノムまたはマウスゲノムの遺伝子の構成的エキソンにある例示的なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を含む（例えば、ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍｌを参照。Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４、ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／；ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／も参照）。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子への最小限のオフターゲット結合を有する配列であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態において、調節因子は、機能的ドメイン、例えば、転写アクチベーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、転写アクチベーターは、標的遺伝子の１つ以上の転写制御要素などの１つ以上の調節要素であるか、またはそれを含み、それによって上記のような部位特異的ドメインがそのような遺伝子の発現を駆動することが認識される。いくつかの実施形態において、転写アクチベーターは、標的遺伝子の発現を駆動する。場合によっては、転写アクチベーターは、異種トランス活性化ドメインの全部または一部であり得るか、またはそれらを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、転写アクチベーターは、単純ヘルペス由来のトランス活性化ドメイン、Ｄｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼドメイン、ｐ６５、ＶＰ１６、およびＶＰ６４から選択される。
いくつかの実施形態において、調節因子は、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦ－ＴＦ）である。いくつかの実施形態において、調節因子は、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。
ある特定の実施形態において、調節因子は、転写調節ドメインをさらに含む。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、がん原遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連因子および修飾因子；ＤＮＡ再配置酵素およびそれらの関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバーなどのメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子および修飾因子を含む。例えば、米国公開第２０１３／０２５３０４０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
活性化を達成するための好適なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ １６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１９７）を参照）核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８）を参照）、核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））、またはＶＰ６４（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）などの人工キメラ機能的ドメインが含まれる。追加の例示的な活性化ドメインには、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐｌ、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯＪ．１１，４９６１－４９６８（１９９２）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２３：２５５－２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３、およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃｌ、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－１、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：４１９－４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４、およびＨｏｂｏ ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。
遺伝子リプレッサーを作製するために使用することができる例示的な抑制ドメインには、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，２５：３３８－３４２を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１およびＷｕ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照されたい。
場合によっては、ドメインは、染色体の後成的調節に関与している。いくつかの実施形態において、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、およびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔｌ０９などの核局在化したタイプＡである（Ｂｅｍｄｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｎｕ（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８（６）：６８２－６８９）。他の例において、ドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤ ＡＣ）、例えば、クラスＩ（ＨＤＡＣ－ｌ、２、３、および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７、および９）、ＨＤ ＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ ６および１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－ｌ １）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる、ＳＩＲＴ１～７）である（Ｍｏｔｔａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０（３）：３８９８－３９４１を参照）。いくつかの実施形態で使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例には、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂｌ、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－ａ、ＰＫＣｐｉ、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦおよびＣＫ２が含まれる。いくつかの実施形態において、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔｌ、ＰＲＭＴ １／６、ＰＲＭＴ ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７およびＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択され得る。スモイル化およびビオチニル化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８および１２）を、いくつかの実施形態において使用することもできる（例えば、Ｋｏｕｓａｒｉｄｅｓ（２００７）Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５を参照）。
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、任意選択で、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０培地Ｔ抗原からのものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素など）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の構成要素間で保存されるように設計される。
一方では機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド成分と、他方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、小溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に知られている生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）カタログを参照されたい。小溝結合剤とポリペプチドとの間の融合を行うための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５。同様に、ポリペプチド成分機能的ドメインと関連してｓｇＲＮＡ核酸成分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦおよびヌクレアーゼもまた、当業者に知られており、本明細書で詳述されている。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成することができる。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質導入またはウイルスベクターを使用した感染が含まれる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。
一旦改変されると、本明細書に記載される分子のうちのいずれかの発現の存在は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイなどの既知の技法を使用してアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む多能性細胞を提供する。これらは、多能性細胞が望ましくない方法で成長および分裂した場合に死に至る可能性のある「安全スイッチ」として機能するように組み込まれている。「自殺遺伝子」除去アプローチは、特定の化合物によって活性化された場合にのみ細胞殺傷をもたらすタンパク質をコードする遺伝子移入ベクターに自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、無毒の化合物を高毒性の代謝物に選択的に変換する酵素をコードしている可能性がある。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に排除される。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーは、ガンシクロビルである。他の実施形態において、自殺遺伝子は、大腸菌シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）、両方とも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
他の実施形態において、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態において、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。これは、一連のアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。したがって、本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の投与によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、ＣＩＤは、小分子薬物ＡＰＩ ９０３である。二量体化は、アポトーシスの急速な誘導を引き起こす。（ＷＯ２０１１／１４６８６２、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照。それぞれは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
Ｉ．人工多能性幹細胞の生成
本発明は、投与時にレシピエント患者への免疫認識を回避することができる多能性細胞を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、人工多能性幹細胞を生成することを含む。マウスおよびヒトの多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと称される、マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣまたはヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の生成は、当技術分野で一般に知られている。当業者によって理解されるように、ｉＰＣＳの生成のための様々な異なる方法が存在する。最初の誘導は、４つの転写因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウスの胚性または成体の線維芽細胞から行われた。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）を参照されたい。これは参照によりその全体が、具体的にはそこに概説されている技法について本明細書に組み込まれる。それ以来、多くの方法が開発されてきた。レビューについては、Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）およびＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３（両方とも参照によりそれら全体が、具体的にはｈｉＰＳＣを生成するための方法について本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい（例えば、後者の参考文献の第３章を参照）。
一般に、ｉＰＳＣは、宿主細胞における１つ以上の再プログラミング因子の一過性発現によって生成され、通常はエピソームベクターを使用して導入される。これらの条件下では、少量の細胞が誘導されてｉＰＳＣになる（一般に、選択マーカーが使用されていないため、このステップの効率は低くなる）。細胞が「再プログラム」されて多能性になると、それらはエピソームベクターを失い、内因性遺伝子を使用して因子を産生する。
当業者によっても理解されるように、使用することができるまたは使用される再プログラミング因子の数は変動し得る。一般的に、使用される再プログラミング因子が少ないと、細胞の多能性状態への変換効率が低下し、「多能性」も低下する。例えば、再プログラミング因子が少ないと、細胞が完全に多能性ではないが、より少ない細胞型に分化することができるのみであり得る。
いくつかの実施形態において、単一の再プログラミング因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態において、２つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４およびＫＬＦ４が使用される。他の実施形態において、３つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２が使用される。他の実施形態において、４つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２およびｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態において、５、６、または７つの再プログラミング因子を、ＳＯＫＭＮＬＴ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、およびＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択して使用することができる。一般に、当技術分野で知られており、市販されているようなこれらの再プログラミング因子遺伝子は、エピソームベクター上で提供される。
一般に、当技術分野で知られているように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載される再プログラミング因子を一時的に発現することによって、血球、線維芽細胞などであるがこれらに限定されない非多能性細胞から作製される。
Ｊ．低免疫原性表現型および多能性の保持についてのアッセイ
低免疫原性細胞（例えば、免疫認識を回避する細胞）が生成されると、ＷＯ２０１８／１３２７８３に記載されているように、それらの免疫原性および／または多能性の保持についてアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、低免疫原性は、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図１３および図１５に例示されるようないくつかの技法を使用してアッセイされる。これらの技法には、同種異系宿主への移植、および宿主の免疫系から逃れる低免疫原性の多能性細胞増殖（例えば、奇形腫）についてのモニタリングが含まれる。場合によっては、低免疫原性の多能性細胞誘導体は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、次いで生物発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、そのような細胞に対する宿主動物のＴ細胞および／またはＢ細胞応答を試験して、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。Ｔ細胞機能は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価される。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。追加的または代替的に、細胞は、自然免疫応答を回避するそれらの能力、例えば、ＮＫ細胞の殺傷について、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図１４および１５に一般に示されているようにアッセイすることができる。
同様に、多能性の保持は、いくつかの方法で試験される。一実施形態において、多能性は、本明細書に一般に記載され、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図２９に示されるようなある特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加的または代替的に、多能性細胞は、多能性の指標として１つ以上の細胞型に分化する。
当業者によって理解されるように、多能性細胞におけるＭＨＣ Ｉ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の正常な低下は、当技術分野で知られている下記のような技法、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用する、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のα鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用するＦＡＣＳ技法を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認することができる。これは、上記のように、１つ以上のＨＬＡ細胞表面成分に対する抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。
多能性細胞またはそれらの誘導体におけるＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の正常な低下は、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技法、ＲＴ－ＰＣＲ技法などの当技術分野で知られている技法を使用して測定することができる。
さらに、細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認することができる。この場合も、このアッセイは、当技術分野で知られているように行われ（例えば、ＷＯ２０１８／１３２７８３の図２１を参照）、一般に、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、およびほとんどのＤＱ抗原に結合する商業的抗体に基づいて、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。
ＨＬＡ ＩおよびＩＩ（またはＭＨＣ ＩおよびＩＩ）の低減に加えて、本発明の細胞は、マクロファージ食作用およびＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低減している。結果として生じる細胞は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子の発現により、免疫マクロファージおよび自然経路を「逃れる」。
Ｋ．多能性幹細胞の維持
多能性幹細胞が生成されると、ｉＰＳＣを維持することについて知られているように、未分化状態を維持することができる。例えば、細胞は、分化を防ぎ、多能性を維持する培養培地を使用して、マトリゲル上で培養することができる。さらに、それらは、多能性を維持するための条件下で培養培地中にあり得る。
Ｌ．多能性幹細胞の分化
本発明は、対象へのその後の移植のために異なる細胞型に分化する多能性細胞を提供する。当業者によって理解されるように、分化のための方法は、既知の技法を使用する所望の細胞型に依存する。細胞は懸濁状態で分化し、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン／トロンビン形態などのゲルマトリックス形態になり、細胞の生存を容易にすることができる。場合によっては、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野で知られているようにアッセイされる。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、肝臓細胞機能の喪失または肝硬変に対処するために肝臓細胞に分化される。多能性細胞を肝臓細胞に分化させるために使用することができる技法がいくつかある。例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）およびＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）（すべては参照によりそれら全体が、具体的には分化のための方法論および試薬について本明細書に組み込まれる）を参照されたい。分化は、一般に、アルブミン、αフェトプロテイン、およびフィブリノーゲンを含むがこれらに限定されない肝臓細胞関連および／または特異的マーカーの存在を評価することによって、当技術分野で知られているようにアッセイされる。分化は、アンモニアの代謝、ＬＤＬの貯蔵および取り込み、ＩＣＧの取り込みおよび放出、ならびにグリコーゲン貯蔵など、機能的に測定することもできる。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植のために、β様細胞または膵島オルガノイドに分化される。細胞システムは、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法である。例えば、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、Ｐａｇｌｉｕｃａらは、ヒトｉＰＳＣからのβ細胞の分化の成功について報告している（ｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生のためのそこで概説されている方法および試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｖｅｇａｓらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生、それに続く宿主による免疫拒絶を回避するためのカプセル化を示す（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生するためのそこで概説されている方法および試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）。
分化は、当技術分野で知られているように、一般に、インスリンを含むがこれに限定されないβ細胞関連または特異的マーカーの存在を評価することによってアッセイされる。分化は、グルコース代謝を測定するなど、機能的に測定することもできる。一般に、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２（その全体が、具体的にはそこで概説されているバイオマーカーについて本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、眼の視力を脅かす疾患に対処するために、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化される。ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その全体が、具体的には分化技法および試薬のためのそこで概説されている方法および試薬について、参照により本明細書に組み込まれる）で概説されている技法を使用して、ＲＰＥ細胞に分化されている。Ｍａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８（またＲＰＥ細胞のシートの生成および患者への移植のための技法について、その全体が組み込まれる）も参照されたい。
分化は、一般に、ＲＰＥ関連および／もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７（その全体が、具体的には結果セクションの最初の段落で概説されているマーカーについて、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、心血管疾患に対処するために心筋細胞に分化される。ｈｉＰＳＣを心筋細胞に分化させるための技法は、当技術分野で知られており、実施例で論じられている。分化は、当技術分野で知られているように、一般に心筋細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによってアッセイすることができる。例えば、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１（その全体が、具体的には心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法について、参照に本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化されて新しい血管を形成し、末梢動脈疾患に対処する。内皮細胞を分化させる技法が知られている。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から内皮細胞を生成するための方法および試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照されたい。分化は、一般に、内皮細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、多能性細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌することができる、甲状腺前駆細胞および甲状腺濾胞性器官に分化される。甲状腺細胞を分化させる技法は、当技術分野で知られている。例えば、その全体が、具体的にはヒト多能性幹細胞から甲状腺細胞を生成するための方法および試薬について、ならびに移植技法についても参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照されたい。分化は、一般に、甲状腺細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
Ｍ．細胞の移植
当業者によって理解されるように、細胞およびそれらの誘導体は、細胞型およびこれらの細胞の最終的な使用の両方に依存する、当技術分野で知られている技法を使用して移植することができる。一般に、本発明の細胞は、静脈内に、または患者の特定の場所に注射することによって移植することができる。特定の場所に移植する場合、細胞をゲルマトリックスに懸濁して、細胞が保持されている間の分散を防ぐことができる。
Ｎ．
実施例１：ヒトｉＰＳ細胞を発現するＤＵＸ４の生成
ＤＵＸ４を外因的に発現するヒトｉＰＳ細胞（ＤＵＸ－ＫＩ）は、構成的再設計されたＥＦ１ａプロモーター（Ｇｅｎ Ｔａｒｇｅｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の制御下でＤＵＸ４を発現するレンチウイルスベクターでｉＰＳ細胞を形質導入することによって生成される。野生型（ｗｔ）およびＤＵＸ－ＫＩ細胞におけるＭＨＣ Ｉの発現レベルは、ＩＦＮ－γ刺激の有無にかかわらずアッセイされる。ヒトｉＰＳＣ（ｗｔおよびＤＵＸ－ＫＩ）を、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γを含むかまたは含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の６ウェルプレートにプレーティングし、１４時間インキュベートする。処理後、細胞を採取し、ＦＩＴＣコンジュゲートした抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｗ６／３２）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣコンジュゲートしたマウスＩｇＧ１ｋアイソタイプが一致した対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識する。結果は、アイソタイプが一致した対照Ｉｇ染色に対する倍率変化として、またはアイソタイプが一致した対照Ｉｇに対するδ蛍光変化として表される。ＤＵＸ－ＫＩ細胞中のＭＨＣ Ｉレベルは、ＩＦＮ－γ刺激がなくてもｗｔより低いことが観察される。ＩＦＮ－γによる刺激後、ｗｔ細胞は、ＭＨＣ Ｉ発現の２～５倍の増加を示すが、ＤＵＸ－ＫＩ細胞では増加が見られないか、または最小限である。
ＮＫ細胞殺傷アッセイおよびマクロファージ殺傷アッセイは、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ ＳＰプラットフォームおよびＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で実施される。９６ウェルＥプレート（ＡＣＥＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）をコラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングし、ＣＤ４７（ＤＵＸ－ＫＩ ＣＤ４７＋）ｉＰＳＣを外因的に発現する４×１０５ ｗｔ、ＤＵＸ－ＫＩ、またはＤＵＸ－ＫＩ ｉＰＳ細胞を、１００μｌの細胞特異的培地にプレーティングする。細胞指数値が０．７に達した後、１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－２またはヒトＩＬ－１５（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）の有無にかかわらず、０．５：１、０．８：１、または１：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比で、ヒトＮＫ細胞またはヒトマクロファージを付加する。負の対照として、細胞を２％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００で処理する。データを標準化し、ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ）で分析する。ＮＫ細胞およびマクロファージの両方を使用すると、ｗｔ細胞についての殺傷は観察されないが、ＤＵＸ－ＫＩ細胞は急速に殺傷される。ＤＵＸ－ＫＩ ＣＤ４７＋細胞にＣＤ４７を付加すると、殺傷効果が逆転し、ＮＫ細胞またはマクロファージのいずれかの存在下で細胞が生存する。
ＮＫ細胞およびマクロファージによるＤＵＸ４細胞のインビボでの殺傷は、養子移入によって測定される。５×１０６ ｗｔ ｈｉＰＳＣを、５×１０６ ＤＵＸ４ ｔｇ ｈｉＰＳＣまたは５×１０６ ＤＵＸ－ＫＩ ＣＤ４７＋ｈｉＰＳＣと混合し、混合物を５μＭ ＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色する。ヒトＩＬ－２（１ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および２．５×１０６ヒト初代ＮＫ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または２．５×１０６ヒトマクロファージ（ＰＢＭＣから分化）を含む生理食塩水中の細胞を、免疫不全ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（０１３０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射する。ヒト初代ＮＫ細胞は、注射の１２時間前にインビトロでヒトＩＬ－２で前処理される。４８時間後、腹部から細胞を収集し、ＡＰＣコンジュゲートした抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体（クローンＧ４６＿２．６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で４５分間染色する。ＣＦＳＥ陽性およびＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ陰性の集団は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析され、ｗｔ群とＤＵＸ４－ＫＩ群との間で比較される。野生型と比較して、ＤＵＸ－ＫＩ集団ではＣＳＦＥ＋／ＨＬＡ－集団の低減が見られるが、ＤＵＸ－ＫＩ ＣＤ４７＋細胞ではＣＳＦＥ＋／ＨＬＡ－集団の低減は見られない。
マクロファージ食作用もまた、ＢＬＩによって測定される。ルシフェラーゼを発現するＤＵＸ４ ｈｉＰＳＣ（ＤＵＸ４－ＫＩ）、ｗｔ ｈｉＰＳＣ、またはＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現するｈｉＰＳＣ（ＤＵＸ４－ＫＩ ＣＤ４７＋）をカウントし、２４ウェル当たり１×１０５細胞の濃度でプレーティングする。１６時間後、ヒトマクロファージを１：１のＥ：Ｔ比でｈｉＰＳＣに付加する。１２０分後、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を付加することによって、ルシフェラーゼの発現を確認する。対照として、標的細胞は未処理であるか、または２％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００で処理されている。シグナルは、Ａｍｉ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いて最大光子数／秒／平方センチメートル／ステリジアン（ｓｔｅｒｉｄｉａｎ）（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）で定量化される。食作用は、ＤＵＸ４－ＫＩ細胞について観察されるが、ｗｔまたはＤＵＸ４－ＫＩ ＣＤ４７＋細胞については観察されない。
ＮＫ細胞特異的Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイでは、ヒト初代ＮＫ細胞を、ｗｔ、ＤＵＸ４－ＫＩ、またはＤＵＸ４－ＫＩ ＣＤ４７＋ｈｉＰＳＣと共培養し、それらのＩＦＮ－γ放出を測定する。Ｋ５６２細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を正の対照として使用する。ミトマイシン処理した（５０μｇ／ｍｌで３０分間）刺激細胞を、ＮＫ細胞（１ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－２で刺激）と１：１のＥ：Ｔ比で２４時間インキュベートし、ＩＦＮ－γスポット頻度を、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを使用して列挙する。ＮＫ細胞の活性化は、ＤＵＸ４－ＫＩ細胞で観察されるが、ｗｔまたはＤＵＸ４－ＫＩ ＣＤ４７＋細胞では観察されない。
移植研究は、ｈｉＰＳＣ移植片に同種であるヒト化ＣＤ３４＋造血幹細胞移植ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２４：１７８５－８８）で再実施した。このヒト化マウスモデルでは、同系対照が入手可能でないため、バックグラウンド測定値をナイーブマウスで収集する。５日後、ＷＴ ｈｉＰＳＣのレシピエントは、脾細胞のＩＦＮ－γスポット頻度が高く、ＩｇＭレベルが上昇したことを示す。ＤＵＸ４＋、ＣＩＩＴＡ－／－、ＣＤ４７＋ｈｉＰＳＣのレシピエントは、検出可能な細胞ＩＦＮ－γ応答もしくは抗体応答をマウントしないか、または大幅に少ない細胞ＩＦＮ－γ応答もしくは抗体応答をマウントしない。
これらの実験は、ＤＵＸ４の過剰発現が、細胞内のＭＨＣ Ｉ発現を大幅に下方調節し、自然免疫応答（ＮＫ細胞およびマクロファージ）を増加させる可能性があることを実証する。ＣＤ４７を付加すると、この自然応答が排除され、自然免疫応答および適応免疫応答の両方を回避する細胞が得られる。
すべての見出しおよび節の表記は、明確さおよび参照目的のために使用されているにすぎず、決して限定するものとみなされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本発明の趣旨および範囲に従って、必要に応じて異なる見出しおよび節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれているかのように具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
当業者に明らかであるように、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正および変形が加えられてもよい。本明細書に記載の特定の実施形態および実施例はほんの一例として提供されており、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲に加えて、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims (88)

  1. 単離された細胞であって、前記細胞においてＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の発現低下およびＤＵＸ４の発現を増加させるための修飾を含む、単離された細胞。
  2. 前記細胞が、ＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現低下をさらに含む、請求項１に記載の単離された細胞。
  3. 前記細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項１または２に記載の単離された細胞。
  4. 前記細胞が、前記細胞におけるＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、Ｍｆｇｅ８、およびＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されるものの発現を増加させるための修飾をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  5. 前記細胞が、前記細胞におけるＣＤ４７の発現を増加させるための修飾をさらに含む、請求項４に記載の単離された細胞。
  6. 前記細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼによって前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  7. 前記細胞が、ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼによって前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  8. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項３～７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  9. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼによって前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  10. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼによって前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  11. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼによって前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  12. ＤＵＸ４の発現を増加させるための前記修飾が、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを前記細胞に導入することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  13. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、前記ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながらＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含むコドン改変された配列である、請求項１２に記載の単離された細胞。
  14. 前記コドン改変された配列が、配列番号１である、請求項１３に記載の単離された細胞。
  15. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項１２に記載の単離された細胞。
  16. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項１２または１５に記載の単離された細胞。
  17. ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される１つ以上の発現を増加させるための前記修飾が、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される前記１つ以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを前記細胞に導入することを含む、請求項４～１６のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  18. ＣＤ４７の発現を増加させるための前記修飾が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを前記細胞に導入することを含む、請求項４～１７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  19. を含む前記発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  20. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  21. ＤＵＸ４の発現を増加させるための前記修飾が、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  22. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、前記ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながらＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含むコドン改変された配列である、請求項２１に記載の単離された細胞。
  23. 前記コドン改変された配列が、配列番号１である、請求項２２に記載の単離された細胞。
  24. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項２１に記載の単離された細胞。
  25. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項２１または２４に記載の単離された細胞。
  26. ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものの発現を増加させるための前記修飾が、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項４～１７または２１～２５のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  27. ＣＤ４７の発現を増加させるための前記修飾が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を前記細胞の選択された遺伝子座に導入することを含む、請求項２６に記載の単離された細胞。
  28. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座ならびに／またはＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードする前記ポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  29. 前記セーフハーバーが、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項２８に記載の単離された細胞。
  30. 誘導性自殺スイッチをさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  31. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、初代Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  32. ＤＵＸ４を含む細胞を調製する方法であって、前記方法が、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを前記細胞に導入し、それによってＤＵＸ４を含む前記細胞を産生することを含む、方法。
  33. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、前記ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながらＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含むコドン改変された配列である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記コドン改変された配列が、配列番号１である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項３２または３５に記載の方法。
  37. ＤＵＸ４を含む前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. ＤＵＸ４を含む前記細胞が、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターをさらに含む、請求項３２～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記第２の発現ベクターが、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記第２の発現ベクターが、誘導性発現ベクターである、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記第２の発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ＤＵＸ４を含む前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項３２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. ＤＵＸ４を含む前記細胞が、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするためのホーミングヌクレアーゼからなる群から選択されるレアカッティングエンドヌクレアーゼを含む、前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾をさらに含む、請求項３２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記遺伝子修飾が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、初代Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項３２～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列を前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入し、それによって低免疫原性幹細胞を産生することを含む、方法。
  51. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、前記ＤＵＸ４タンパク質配列を保存しながらＣｐＧ部位の総数を低減するための１つ以上の塩基置換を含むコドン改変された配列である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記コドン改変された配列が、配列番号１である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列である、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号２～２９からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、請求項５０または５３に記載の方法。
  55. ＣＩＩＴＡ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチド配列についての前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものをコードするポリヌクレオチド配列を前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチド配列を前記幹細胞の選択された遺伝子座に導入することをさらに含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記選択された遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. Ｂ２Ｍ遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. ＮＬＲＣ５遺伝子を選択的に不活性化するレアカッティングエンドヌクレアーゼを幹細胞に導入することを含む、前記幹細胞において前記ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾を生成することをさらに含み、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびホーミングヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５０～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記レアカッティングエンドヌクレアーゼの前記導入することが、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸を導入することを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを前記幹細胞に導入することをさらに含む、請求項５０～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 分化した低免疫原性細胞を調製する方法であって、分化条件下で、請求項５０～６７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された前記低免疫原性幹細胞を培養し、それによって分化した低免疫原性細胞を調製することを含む、方法。
  69. 前記分化条件が、心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される細胞型への幹細胞の分化に適切である、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項６８または６９に記載の方法に従って調製された分化した低免疫原性細胞の集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を治療する方法。
  71. ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  72. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  73. Ｂ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  74. ＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  75. ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  76. ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  77. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  78. ＣＩＩＴＡを発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  79. ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  80. ＣＩＩＴＡならびにＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  81. ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍを発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  82. ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  83. ＣＩＩＴＡならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択される少なくとも１つを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  84. ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  85. ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ならびにＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４、ならびにＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、Ｃ１阻害剤、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＩＬ－３５からなる群から選択されるものを発現し、ＭＨＣクラスＩならびに／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  86. ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、およびＮＬＲＣ５を発現せず、ＤＵＸ４およびＣＤ４７を発現し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現が低下している、細胞。
  87. 前記細胞が、幹細胞、分化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、前駆細胞、体細胞、初代Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項７１～８６のいずれか一項に記載の細胞。
  88. 心臓細胞、神経細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、膵島細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、血液細胞、および上皮細胞からなる群から選択される分化細胞を生成するために分化条件下で培養することによって、請求項８７に記載の多能性幹細胞または人工多能性幹細胞から生成された、分化細胞。
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