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JP2018515139A - 万能ドナー幹細胞および関連する方法 - Google Patents

万能ドナー幹細胞および関連する方法 Download PDF

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Abstract

万能性ドナー幹細胞ならびにそれらの使用および産生の関連方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される万能性ドナー幹細胞は、細胞ベースの移植療法における免疫拒絶を克服するために有用である。特定の実施形態では、本明細書に開示される万能性ドナー幹細胞は、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原を発現しない。同様に、特定の実施形態では、本明細書に開示される万能性ドナー幹細胞は、ＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原に対応する１つまたはそれを超えるヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−Ｃ）を発現せず、それにより、このような細胞は低免疫原性になる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年5月8日に出願された米国仮出願第６２／１５８，９９９号の利益を主張し、その内容は、その全体が本明細書に参照によって援用される。
政府支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられたＤＫ０９７７６８の下で、政府の支援によって行われた。政府は、本発明の一定の権利を有する。
発明の背景
変性疾患は、不均衡な脅威をヒトの健康にもたらす。多くの場合、加齢により、これらの疾患は、罹患組織および器官の進行性悪化をもたらし、最終的には罹患被験体の身体障害および死亡をもたらす。再生医療の将来性は、疾患細胞または欠落細胞を新たな健常細胞で置き換えることである。過去５年間で、再生医療の新たなパラダイムが登場した−患者への移植用の任意の成体細胞型を作製するためのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の使用。原則として、ｈＰＳＣベースの細胞療法は、すべてではないがほとんどの変性病を処置する潜在性を有するが、しかしながら、このような療法の成功は、被験体の免疫応答によって制限され得る。
免疫拒絶を克服するために検討されている戦略としては、ＨＬＡ適合（例えば、一卵性双生児または臍帯バンキング）、被験体への免疫抑制薬の投与、遮断抗体、骨髄抑制／混合キメリズム、ＨＬＡ適合幹細胞貯蔵所（respository）および自己幹細胞療法が挙げられる。細胞補充療法に関連する免疫拒絶を克服するための新規なアプローチ、組成物および方法が必要である。
細胞ベースの品質管理製品として再生細胞療法の基礎を形成する万能性ドナー幹細胞株を作ることによって、細胞ベースの移植療法における免疫拒絶を克服するための効率的な戦略が本明細書に開示される。
本発明者らは、ヒト多能性幹細胞においてＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ系などのゲノム編集ツールを用いて、高度に多様な古典的ＭＨＣ−Ｉ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ）および／またはＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の発現を低減し、またはこれらをノックアウトすることに成功した。特定の態様では、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子および／またはＭＨＣ−ＩＩ遺伝子のこのような発現低減またはノックアウトは、ＮＬＲＣ５遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子ならびにＭＨＣエンハンセオソームの他の成分（例えば、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの転写調節因子）を直接的および／または間接的にターゲティングすることによって達成される。
低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、幹細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートし、それにより、該低免疫原性幹細胞を調製することを含む方法が本明細書に開示される。幹細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートする方法であって、該細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させ、それにより、該１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることを含む方法も開示される。
特定の態様では、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることは、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現を低減、阻害および／または妨害することを含む。特定の実施形態では、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることは、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることを含む。例えば、特定の実施形態では、このような方法は、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの転写調節因子の１つまたはそれよりも多くをコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることを含む。
特定の態様では、本明細書に開示される方法は、幹細胞による１つまたはそれを超える寛容原性因子の発現をモジュレートすることをさらに含む。寛容原性因子の発現をモジュレートすることは、寛容原性因子の発現を増加させることを含み得る。このような寛容原性因子は、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）に挿入され得る。特定の実施形態では、このような寛容原性因子は、免疫拒絶を阻害する。特定の実施形態では、このような寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される。
低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、該幹細胞による１つまたはそれを超える寛容原性因子の発現をモジュレートし、それにより、該低免疫原性幹細胞を調製することを含む方法も本明細書に開示される。特定の実施形態では、寛容原性因子の発現をモジュレートすることは、寛容原性因子の発現を増加させることを含む。このような寛容原性因子は、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）に挿入され得る。特定の実施形態では、このような寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される。特定の実施形態では、このような寛容原性因子は、幹細胞またはそれから調製された分化幹細胞の免疫拒絶を阻害する。
特定の態様では、開示される方法は、例えば、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることによって、細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることをさらに含む。特定の実施形態では、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの転写調節因子は、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
ＮＬＲＣ５を発現しないヒト幹細胞（例えば、ＮＬＲＣ５−／−ノックアウト変異体幹細胞）も本明細書に開示される。同様に、ＣＩＩＴＡを発現しないヒト幹細胞（例えば、ＣＩＩＴＡ−／−ノックアウト変異体幹細胞）も開示される。Ｂ２Ｍを発現しないヒト幹細胞（例えば、Ｂ２Ｍ−／−ノックアウト変異体幹細胞）も開示される。特定の実施形態では、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの１つまたはそれよりも多くを発現しないヒト幹細胞も提供される。さらに他の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くを発現しないヒト幹細胞も開示される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される幹細胞は、１つまたはそれを超える寛容原性因子（例えば、免疫拒絶を阻害する１つまたはそれを超える寛容原性因子）を発現する。特定の態様では、このような寛容原性因子は、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）に挿入される。特定の実施形態では、寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。特定の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、低免疫原性である。
いくつかの実施形態では、細胞は、元の遺伝子型と比べて、または野生型ヒト幹細胞と比べてＭＨＣ−Ｉの発現が低減している特定の実施形態では、細胞は、元の遺伝子型と比べて、または野生型ヒト幹細胞と比べてＭＨＣ−ＩＩの発現が低減している。例えば、このような細胞は、元の遺伝子型と比べて、または野生型ヒト幹細胞と比べてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くにおいて発現が低減している。
ヒト幹細胞であって、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）に挿入された１つまたはそれを超える寛容原性因子を含むように変更されているヒト幹細胞も本明細書に開示される。特定の実施形態では、このような寛容原性因子は、免疫拒絶を阻害する。特定の実施形態では、寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される。特定の態様では、このような細胞は、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの１つまたはそれよりも多くを発現しない。特定の態様では、このような細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くを発現しない。特定の実施形態では、このような細胞は、野生型ヒト幹細胞と比べてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くにおいて発現が低減している。
細胞補充療法のために本明細書に開示される低免疫原性細胞を使用する方法も本明細書に開示される。例えば、本明細書に開示される万能性幹細胞は、適切な条件下でインキュベートされ得、低免疫原性心筋細胞、内皮細胞、肝細胞または膵臓β細胞に分化し得る。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するようにＮＬＲＣ５遺伝子を編集することを含む方法も本明細書に開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＣＩＩＴＡ遺伝子を編集することを含む方法も本明細書に開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＢ２Ｍ遺伝子を編集することを含む方法も本明細書に開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、（ａ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するようにＮＬＲＣ５遺伝子を編集すること；（ｂ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＣＩＩＴＡ遺伝子を編集すること；ならびに／または（ｃ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＢ２Ｍ遺伝子を編集することを含む方法も本明細書に開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するようにＮＬＲＣ５遺伝子を編集することを含む方法も開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＣＩＩＴＡ遺伝子を編集することを含む方法も開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＢ２Ｍ遺伝子を編集することを含む方法も開示される。
低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、（ａ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するようにＮＬＲＣ５遺伝子を編集すること；（ｂ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＣＩＩＴＡ遺伝子を編集すること；ならびに／または（ｃ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するようにＢ２Ｍ遺伝子を編集することを含む方法も本明細書に開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＮＬＲＣ５遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も本明細書に開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も本明細書に開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、Ｂ２Ｍ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も本明細書に開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、（ａ）ＮＬＲＣ５遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；（ｂ）ＣＩＩＴＡ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変；ならびに／または（ｃ）Ｂ２Ｍ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第３のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も本明細書に開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＮＬＲＣ５遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、Ｂ２Ｍ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も開示される。
改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、（ａ）ＮＬＲＣ５遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変；（ｂ）ＣＩＩＴＡ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第２のゲノム改変；ならびに／または（ｃ）Ｂ２Ｍ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第３のゲノム改変を含む低免疫原性幹細胞も本明細書に開示される。
本発明の上記で議論されるおよび多くの他の特徴および付随する利点は、以下の発明の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、申請して必要な料金を支払えば、特許庁によって提供される。
図１は、再生医療の将来性を示す。
図２Ａ〜２Ｂは、移植におけるＨＬＡ障壁を図示する。図２Ａは、臓器移植中のドナー適合性を規定するＭＨＣ−Ｉ表面分子およびＭＨＣ−ＩＩ表面分子を図示する。図２Ｂは、ＨＬＡ領域６ｐ２１．１−２１．３を示す。
図３Ａ〜３Ｂは、抗原提示の転写調節因子のターゲティングを示す。図３Ａは、ＭＨＣ−ＩＩエンハンセオソームのモデルを示す。図３Ｂは、ＭＨＣ−ＩプロモーターにおけるＮＬＲＣ５エンハンセオソームのモデルを表す。
図４は、ＷＴ ＨｕＥＳ９および示されている改変変異体細胞株におけるＭＨＣ−Ｉ発現を示す。細胞をＩＦＮγで４８時間刺激し、ＭＨＣ−Ｉ発現をＦＡＣＳによって評価した。
図５Ａ〜５Ｃは、ＣＩＩＴＡ欠損幹細胞由来マクロファージがＭＨＣ−ＩＩ発現を欠くことを示す。図５Ａは、マクロファージ分化のタイムラインを表す。図５Ｂは、５日目のＭ−ＣＳＦ培地における幹細胞由来マクロファージの明視野像を示す。図５Ｃは、ＩＦＮγで刺激した４８時間後にｑＰＣＲによって評価した場合の、誘導マクロファージにおけるＭＨＣ−ＩＩ発現を示し、野生型細胞と比べたＭＨＣ−ＩＩ発現の低減を証明する。図５Ｃに示されているように、ＭＨＣ−ＩＩ発現は、図１０Ａ〜１０Ｂに表されているＣＩＩＴＡ遺伝子の第１のコードエクソンをターゲティングすることによって効率的に抑止され得る。
図６は、ヒト化ＮＳＧマウス−ＢＬＴマウスに３カ月間与えてヒト免疫系を完全に再構成した後、示されているゲノム編集幹細胞株を注射する、本明細書に開示される奇形腫拒絶研究のタイムラインを示す。
図７は、ヒト化マウスにおけるゲノム編集幹細胞の生着の改善を実証する。図６に表されている奇形腫拒絶研究後に観察された奇形腫型の定量が示されている。奇形腫サンプルの形態を精査すると、ＭＨＣ−Ｉ発現のレベルと相関する明確な表現型が観察された。
図８Ａ〜８Ｃは、浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が免疫拒絶を示すことを実証する。図８Ａおよび８Ｂは、奇形腫浸潤性ＣＤ３＋リンパ球の免疫染色を示す。図８Ｃは、増殖マーカーであり、増殖性ＣＤ８＋Ｔ細胞（白色の矢印）を強調する、ＣＤ８およびＫｉ６７の共染色を示す。核ＤＡＰＩ染色は、青色で示されている。
図９Ａ〜９Ｄは、ＴＡＬＥＮを使用したＮＬＲＣ５の欠失が、人工多能性幹細胞由来肝細胞様細胞（ＨＬＣ）におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減をもたらすことを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５遺伝子座を示す。図９Ｂは、ＮＬＲＣ５発現を抑止するためのＮＬＲＣ５遺伝子座のターゲティングを示す。図９Ｃ〜９Ｄは、ＮＬＴＣ５−／−ＨＬＣにおけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。
図１０Ａ〜１０Ｂは、ＣＩＩＴＡ遺伝子の第１のコードエクソンのターゲティングを示す。図１０Ａは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を表す。図１０Ｂは、ＭＨＣ−ＩＩ発現を抑止するためのＣＩＩＴＡ遺伝子座のターゲティングを示す。
図１１Ａ〜１１Ｃは、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇなどの寛容原性因子がセーフハーバー遺伝子座から発現され得ることを実証する。
図１２は、Ｃａｓタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示す。黄色ハイライトは、Ｒｕｖ−Ｃ様ドメインを示す。下線は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを示す。
図１３は、ＭＨＣ−ＩＩエンハンセオソームおよびＭＨＣ−Ｉエンハンセオソームの比較を示す。
図１４Ａ〜１４Ｊは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃのターゲティングを実証する。図１４Ａは、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃノックアウト戦略を表す。ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の上流およびＨＬＡ−Ｃの下流に２つのショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計した（これは、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子の切除を可能にする）。ｓｇＲＮＡ＃１およびｓｇＲＮＡ＃２はＨＬＡ−Ｂ上流領域をターゲティングし、ｓｇＲＮＡ＃３およびｓｇＲＮＡ＃４はＨＬＡ−Ｃ下流領域をターゲティングする。図１４Ｂは、ＰＣＲスクリーニングにより、クローン１Ｄがホモ接合ノックアウトクローンであることを確認したことを示す。図１４Ｂは、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの欠失の成功に関するＰＣＲ検証戦略を示す概略図を含む。５４５ｂｐおよび４７２ｂｐの予測アンプリコンサイズを有する、各切断部位に隣接する野生型（ＷＴ）プライマーの２つのペアを設計した。ＫＯプライマーを用いて生成された約６８０ｂｐのＰＣＲバンドの存在、および２つの異なるセットのＷＴプライマーを使用した場合のバンドの非存在によって、クローン１Ｄは、ホモ接合ノックアウトクローンとして同定された。示されている標的としたＨｕＥＳ８クローンからゲノムＤＮＡを単離した。図１４Ｃは、１Ｄ ＫＯクローンにおけるＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ欠失の配列確認を示す概略図を提供する。１Ｄ ＰＣＲ産物の配列決定の結果により、ＨｕＥＳ８におけるＨＬＡ−Ｂ遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子の欠失の成功が実証された。図１４Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＨｕＥＳ８細胞におけるＨＬＡ−Ｂ ｍＲＮＡ発現およびＨＬＡ−Ｃ ｍＲＮＡ発現の喪失を確認することを示す。ＨＬＡ−Ｂ特異的プライマーおよびＨＬＡ−Ｃ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、クローン１ＤにおけるＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＣのｍＲＮＡ発現が排除されることが実証された。ＧＡＰＤＨ、ＴＯＰ１およびＨＰＲＴ１を内部対照として使用した。図１４Ｅは、ＷＴおよびクローン１Ｄから得られたＨＬＡ−Ｂ ＲＴ−ＰＣＲバンドの配列確認を示す概略図を提供する。ＨＬＡ−Ｂプライマーを用いて増幅されたＷＴ ＲＴ−ＰＣＲ産物および１Ｄ ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、ＢＬＡＳＴを使用してそれぞれＨＬＡ−Ｂ ｍＲＮＡおよびＨＬＡ−Ａ ｍＲＮＡとして同定した。これらの結果により、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の非存在下では、ＨＬＡ−Ｂ特異的プライマーは、ＨｕＥＳ８クローン１ＤにおけるＨＬＡ−Ａ ｍＲＮＡを増幅することが実証された。図１４Ｆは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒによるＨｕＥＳ８クローン１Ｄの核型分析を示す。ＨｕＥＳ８クローン１Ｄは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒセットによって評価した正常核型を示す。図１４Ｇは、二重ｓｇＲＮＡアプローチを使用したＨＬＡ−Ａノックアウト戦略を示す概略図を提供する。概略図は、ＨＬＡ−Ａの上流および下流に結合するように設計した２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＃５およびｓｇＲＮＡ＃６）の位置を示す。図１４Ｈは、ＴＩＤＥを使用したＨＬＡ−Ａ ｓｇＲＮＡのオンターゲット切断効率を示す。ＴＩＤＥを使用して２９３Ｔ細胞において、ｓｇＲＮＡ＃５およびｓｇＲＮＡ＃６の切断効率を決定した。図１４Ｉは、ＰＣＲスクリーニングにより、クローン４Ｅがヘテロ接合ＨＬＡ−Ａノックアウトクローンあることが確認されたことを実証する。ＰＣＲスクリーニング戦略により、ＨｕＥＳ８におけるＨＬＡ−Ａの欠失が確認された。１つのプライマーが切断部位の上流にアニーリングし、１つのプライマーが切断部位の下流にアニーリングするＫＯプライマーを設計した。ＨＬＡ−Ａ欠失により、得られたアンプリコンは、２％アガロースゲル上で２２０ｂｐとして観察される。５８９ｂｐおよび５７１ｂｐの予測アンプリコンサイズを有する、各切断部位に隣接するＷＴプライマーの２つのペアを設計した。ゲノムＤＮＡから増幅されたＫＯプライマーおよびＷＴプライマーを用いて生成されたバンドの存在によって、クローン４Ｅは、ヘテロ接合クローンとして同定された。図１４Ｊは、配列決定により、ＨｕＥＳ８細胞におけるＨＬＡ−Ａの欠失の成功が確認されることを示す概略図を含む。ＫＯプライマーを使用してクローン４ＥのゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の配列決定は、ＨｕＥＳ８におけるＨＬＡ−Ａの欠失の成功を実証する。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１５Ａ〜１５Ｄは、ＢＪ−ＲＩＰＳＣ細胞およびＨｕＥＳ９細胞におけるＴＡＬＥＮ誘導性ＣＩＩＴＡ変異およびＮＬＲＣ５変異を示す。図１５Ａは、ＢＪ−ＲＩＰＳＣにおけるＴＡＬＥＮ誘導性ＣＩＩＴＡ変異の概略図を提供する。図１５Ｂは、ＢＪ−ＲＩＰＳＣにおけるＴＡＬＥＮ誘導性ＮＬＲＣ５変異の概略図を提供する。図１５Ｃは、ＨｕＥＳ９におけるＴＡＬＥＮ誘導性ＮＬＲＣ５変異の概略図を提供する。図１５Ｄは、ＨｕＥＳ９におけるＴＡＬＥＮ誘導性ＣＩＩＴＡ変異の概略図を提供する。 同上 同上 同上
図１６Ａ〜１６Ｇは、ＭＨＣクラスＩ発現の低減およびＭＨＣクラスＩＩ発現の完全喪失を達成するための、ＣＲＩＳＰＲ系を利用したＮＬＲＣ５およびＣＩＩＴＡのターゲティングを実証する。図１６Ａは、ＮＬＲＣ５−／−Ｔｈｐ１細胞におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減（Ｔｈｐ１細胞におけるＮＬＲＣ５ターゲティング戦略を含む）を示す。＋は、４８時間のＩＦＮγ刺激を示す。図１６Ｂは、複数のターゲティング戦略の概略図を提供する。図１６Ｂは、ＣＲＩＳＰＲを使用したＮＬＲＣ５のターゲティングの概略図、ＣＲＩＳＰＲを使用したＢ２Ｍのターゲティングの概略図、ＴＡＬＥＮを使用したＣＩＩＴＡのターゲティングの概略図、およびＣＲＩＳＰＲを使用したＣＩＩＴＡのターゲティングの概略図を提供する。図１６Ｃは、ＮＬＲＣ５ ＣＲＩＳＰＲまたはＢ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲを用いたターゲティング後のＨｕＥＳ９細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現の低減を示す。グラフは、幹細胞における低い基底ＭＨＣ−Ｉ発現を示す。ＭＨＣ−Ｉ発現は、ＩＦＮγ刺激によって増加され得る。ＩＦＮγ処理ＮＬＲＣ５−／−細胞では、ＭＨＣ−Ｉ発現の約５０％の低減が起こる。Ｂ２Ｍ−／−細胞では、ＭＨＣ−Ｉ表面発現の完全喪失が示されている。図１５Ｄは、Ｔｈｐ−１のレンチウイルス形質導入を示す。二重ベクターレンチウイルスＧｅＣＫＯ系を使用する。２成分系は、Ｌｅｎｔｉ−Ｃａｓ９−Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（これは、安定Ｔｈｐ−１ Ｃａｓ９細胞株を樹立するように作用する）およびＬｅｎｔｉ−Ｇｕｉｄｅ−ｐｕｒｏ（これは、ガイドに移入するように作用する）を含む。図１６Ｅは、Ｔｈｐ−１のレンチウイルス形質導入に使用した様々なＣＲＩＳＰＲを示す。ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５およびＩＲＦ１をターゲティングするＣＲＩＳＰＲが提供されている。図１６Ｆは、ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５が、それぞれＭＨＣ−ＩＩおよびＭＨＣ−Ｉに対して独立に作用することを示す。ＮＬＲＣ５およびＣＩＩＴＡをコードするレンチウイルスをＴｈｐ１に形質導入した。Ｂ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲを陽性対照として使用する。すべての細胞を５０Ｕ ＩＦＮγでＯＮ刺激して、ＨＬＡ発現を増強した。ＨＬＡ−Ａ２ １：２００；ＤＲ １：１００。図１６Ｇは、ＩＲＦ１のターゲティングがＭＨＣ−ＩＩ発現の喪失をもたらすことを示す。ＣＲＩＳＰＲ形質導入の１０日後のＴｈｐ１。すべての細胞を５０Ｕ ＩＦＮγでＯＮ刺激した。ＨＬＡ−Ａ２ １：２００；ＤＲ １：１００。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１７Ａ〜１７Ｋは、ヒト多能性幹細胞（ＨｕＥＳ９）およびＴｈｐ−１細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現の低減を達成するための、ＣＲＩＳＰＲ系を利用したＩＲＦ１のターゲティングを実証する。図１７Ａは、ＩＲＦ１遺伝子座をターゲティングする二重ＣＲＩＳＰＲ戦略を示す。３つの異なるＣＲＩＳＰＲが示されている。図１７Ｂは、異なるＩＲＦ１ガイドの組み合わせの試験を実証する。異なるガイドの組み合わせのスクリーニング結果が提供されている。図１７Ｃは、ＩＲＦ１の標的とした欠失のための「二重ガイド戦略」を示す。二重ガイド戦略のスクリーニング結果が提供されている。図１７Ｄは、ＩＲＦ−１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失の配列確認を示す概略図を提供する。図１７Ｅは、ＩＲＦ−１ターゲティングＨｕＥＳ９細胞のスクリーニング結果を提供する。スクリーニングは、ＣＲＩＳＰＲ＃２および＃３を使用した二重ＣＲＩＳＰＲ戦略のスクリーニングである。ＰＣＲバンドの存在は、ターゲティングの成功を示唆している。図１７Ｆにより、ＩＲＦ−１クローンの再確認が実証された。プライマーＫＹＭ０７およびＴＭ３７７を使用したスクリーニング結果が提供されている。図１７Ｇは、ＩＲＦ−１クローンの遺伝子型を実証する。スクリーニング結果が提供されている。図１７Ｈは、クローン１２におけるＩＲＦ−１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失の配列確認を示す概略図を提供する。図１７Ｉは、クローン１７におけるＩＲＦ−１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失の配列確認を示す概略図を提供する。図１７Ｊは、クローン２１におけるＩＲＦ−１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失の配列確認を示す概略図を提供する。図１７Ｋは、ＩＦＮγ処理後のＩＲＦ１−／−ＨｕＥＳ９クローンにおけるＭＨＣクラスＩ誘導の障害を示す。Ｐ４２は、ＷＴである；Ｃ７は、Ｂ２Ｍ ＫＯである；＋は、４８時間のＩＦＮγ処理を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１８Ａ〜図１８Ｈは、ＣＲＩＳＰＲを利用した２９３Ｔ細胞におけるＲＦＸ５、ＲＦＸ−ＡＮＫおよびＲＦＸ−ＡＰのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを実証する。図１８Ａは、２９３Ｔ細胞におけるＲＦＸ５の二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１８Ｂは、ＲＦＸ５のターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。図１８Ｃは、２９３Ｔ細胞におけるＲＦＸ−ＡＮＫの二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１８Ｄは、ＲＦＸ−ＡＮＫのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。図１８Ｅは、ＲＦＸ５およびＲＦＸ−ＡＮＫのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。図１８Ｆは、ＲＦＸ５およびＲＦＸ−ＡＮＫのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す棒グラフを提供する。図１８Ｇは、２９３Ｔ細胞におけるＲＦＸ−ＡＰの二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１８Ｈは、ＲＦＸ−ＡＰのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１９Ａ〜１９Ｅは、ＣＲＩＳＰＲを利用したＮＦＹ−Ａ、ＮＦＹ−ＢおよびＮＦＹ−Ｃのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを実証する。図１９Ａは、２９３Ｔ細胞におけるＮＦＹ−Ａの二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１９Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＮＦＹ−Ｃの二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１９Ｃは、ＮＦＹ−ＣおよびＮＦＹ−Ａのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。図１９Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるＮＦＹ−Ｂの二重ガイドターゲティングを実証する。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図１９Ｅは、ＮＦＹ−Ｂのターゲティングが、ＭＨＣクラスＩ発現の低減をもたらすことを示す。 同上 同上 同上 同上
図２０Ａ〜２０Ｄは、ＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送が、ＴＡＰ１遺伝子（ＥＲ−常在性（ＥＲ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ）ペプチド輸送体）を破壊することによって抑制され得ることを示す。図２０Ａは、ＴＡＰ１ ＣＲＩＳＰＲ発現が、ジャーカットＴ細胞におけるＭＨＣ−Ｉ表面発現を低減することを示す。４つの異なるＣＲＩＳＰＲの組み合わせを調査した。図２０Ｂは、ＴＡＰ１ ＣＲＩＳＰＲ発現が、ジャーカットＴ細胞におけるＭＨＣ−Ｉ表面発現を低減することを実証する。図２０Ｃは、ジャーカット（Ｃａｓ９）Ｔ細胞におけるＨＬＡ表面発現の排除を実証する。ジャーカット細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらによる急性Ｔ細胞白血病を有する１４歳の末梢血から樹立した。図２０Ｄは、ジャーカット（Ｃａｓ９）Ｔ細胞におけるＨＬＡ表面発現の排除を示す。細胞をＩＦＮγで４８時間処理した。 同上 同上 同上
図２１Ａ〜２１Ｄは、ＨＬＡ遺伝子における保存領域をターゲティングすることによって、すべてのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の同時欠失を可能にするＨＬＡ Ｒａｚｏｒとして同定されたＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの使用を実証する。図２１Ａは、ＨＬＡ Ｒａｚｏｒを使用したＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮによる、すべてのＨＬＡに見られる保存配列のターゲティングを示す概略図を提供する。２つの紫色の囲み枠は、ｐａｎＨＬＡ ＴＡＬＥＮペアの結合部位を示す。青色の矢印は、試験したｐａｎＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲを示す；ＰＡＭは、青色で囲まれている。図２１Ｂは、トランスフェクションの７２時間後の２９３Ｔ細胞およびＨｕＥＳ９細胞におけるｐａｎ−ＨＬＡ ＴＡＬＥＮの発現を示す。図２１Ｃは、ＨＬＡ−Ｒａｚｏｒ ＣＲＩＳＰＲがＭＨＣクラスＩ発現を鈍らせることを示す。Ｃａｓ９−ＧＦＰを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後の結果が示されている。図２１Ｄは、２つの異なるＨＬＡ Ｒａｚｏｒの活性の比較を示す概略図を提供する。２つのＨＬＡ Ｒａｚｏｒガイドが示されている。 同上 同上 同上
図２２Ａ〜図２２Ｆは、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇノックイン戦略の結果を示す。図２２Ａは、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇノックイン戦略を示す概略図を提供する。クローンスクリーニングのためのＷＴプライマーおよびノックイン（ＫＩ）プライマーを設計した。ＷＴプライマーを有するアンプリコンは４８８ｂｐと予測され、ＫＩプライマーを有するアンプリコンは４０３ｂｐおよび９１５ｂｐと予測される。図２２Ｂは、ノックインドナープラスミドの設計を表す。ノックインドナープラスミドの設計は、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−ＧのリーディングフレームがＴ２Ａによって連結され、それらの発現がＣＡＧＧＳプロモーターによって駆動されることを示す。ＳＡ−２Ａ遺伝子トラップエレメントの後に、ピューロマイシンを薬物耐性マーカーとして使用した。図２２Ｃは、２９３Ｔ細胞における異所性ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇ発現を実証する。ドナープラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇの発現をＦＡＣＳ分析によって調査した。ＡＰＣ結合体化ＰＤ−Ｌ１抗体およびＦＩＴＣ結合体化ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用した。図２２Ｄは、ＪＥＧ−３細胞における異所性ＨＬＡ−Ｇ発現を示す。ドナープラスミドをＨＬＡ−Ｇ−／−ＪＥＧ−３細胞株にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に、異所性ＨＬＡ−Ｇ発現をＦＡＣＳ分析によって調査した。ＰＥ結合体化ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＭＥＭ／Ｇ９）を使用して、表面ＨＬＡ−Ｇ表面発現を検出した。図２２Ｅは、クローン１ＧがＰＤ−Ｌ１／ＨＬＡ−Ｇのヘテロ接合ＫＩクローンとして確認するＰＣＲスクリーニング結果を提供する。ＷＴプライマーおよびＫＩ特異的プライマーの両方を使用して標的としたＨｕＥＳ８細胞のゲノムＤＮＡから増幅されたバンドの存在によって、クローン１Ｇは、ヘテロ接合ＫＩクローンとして同定された。図２２Ｆは、ＨｕＥＳ８におけるセーフハーバー遺伝子座からの安定なＰＤ−Ｌ１発現およびＨＬＡ−Ｇ発現を示す。ＡＰＣ結合体化ＰＤ−Ｌ１抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって、ＨｕＥＳ８ ＫＩクローン１Ｇにおいて、ＰＤ−Ｌ１の発現を検証した。 同上 同上 同上 同上 同上
図２３は、ノックイン戦略を使用した、２９３Ｔ細胞およびｈＰＳＣにおけるＣＤ４７の発現を実証する。ヒトＣＤ４７を、ＣＡＧプロモーターによって駆動される発現プラスミド（これは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰをさらに含有する）にクローニングした。２９３Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４７（ヒト「ドント・イート・ミー」シグナル）（これは、マクロファージによる細胞の貪食を防止する）を既に発現する。ＣＤ４７特異的抗体を使用したＦＡＣＳによって検出した場合、２９３Ｔ細胞およびヒト多能性幹細胞（ＨｕＥＳ９）の両方において、発現は、ＣＤ４７の過剰発現によって増加され得る。ＣＤ４７の過剰発現は、マクロファージ貪食から細胞を保護することによって、幹細胞由来移植物の生着を支援する。
図２４は、ＨｕＥＳ９におけるＴＲＡＣおよびＴＲＢＣの欠失がＴＣＲ発現を破壊することを実証する。二重ガイドＲＮＡアプローチを使用して、欠失をＨｕＥＳ９細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座およびＴＲＢＣ遺伝子座に導入した。ＴＣＲＡ ｗｔバンドは２４９ｂｐであり、欠失後には２０９ｂｐである。ＴＣＲＢ ｗｔバンドは１６２ｂｐであり、欠失後には１４０ｂｐである。＊で示されているバンドは、ＨｕＥＳ９細胞におけるＴＣＲＢ ＫＯである；＊＊で示されているバンドは、ＨｕＥＳ９細胞におけるＴＣＲＡ ＫＯである；＊＊＊で示されているバンドは、ＨｕＥＳ９ Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−細胞におけるＴＣＲＡ ＫＯである。ＨｕＥＳ９ Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−細胞におけるＴＣＲＡ ＫＯは、Ｂ２Ｍ−／−、ＣＩＩＴＡ−／−およびＴＣＲ−／−についてのトリプルノックアウト幹細胞株である。Ｔ細胞に分化すると、このトリプルノックアウト幹細胞株は、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩおよびＴＣＲ表面発現を欠く。
図２５Ａ〜２５Ｄは、様々な細胞株におけるＣＤ２７４／Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１のターゲティングを実証する。図２５Ａは、ＣＤ２７４／Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１をターゲティングする場合に使用され得るＣＲＩＳＰＲガイド配列の例を示す。ＣＤ２７４／Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１ノックアウト細胞株が示されている。図２５Ｂは、ＪＥＧ−３細胞における標的としたＢ７−Ｈ１コロニーのスクリーニングを示す。スクリーニングにより、２２／２６５、すなわち約８．３％のＣＲＩＳＰＲ切断効率が判明した。図２５Ｃは、５０１メラノーマノックアウトクローンの再確認を実証する。図２５Ｄは、ＭａｌＭｅメラノーマノックアウトクローンの再確認を実証する。 同上 同上 同上
図２６Ａ〜２６Ｐは、共阻害／共刺激受容体またはそれらのリガンドのターゲティングを実証する。各標的について、示されている４つのＣＲＩＳＰＲをクローニングし、２９３Ｔ細胞におけるオンターゲット活性について試験した。両ＣＲＩＳＰＲの切断が起こった場合のＰＣＲバンドの予想サイズは、ゲル画像の下に示されている。図２６Ａは、Ｔ細胞上の共刺激／共阻害分子およびそれらの受容体を示す。図２６Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴの二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｃは、２９３Ｔ細胞におけるＴＩＭ３の二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｄは、２９３Ｔ細胞におけるＨＶＥＭの二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｅは、２９３Ｔ細胞における２Ｂ４／ＣＤ２４４の二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｆは、２９３Ｔ細胞におけるＣＤ２８の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１、＃２および＃３が機能することが見出された。図２６Ｇは、２９３Ｔ細胞におけるＯＸ４０の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１、＃２および＃４が機能することが見出された。図２６Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるＢ７１の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１、＃３および＃４が機能することが見出された。図２６Ｉは、２９３Ｔ細胞におけるＣＤ２２６の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１および＃２が機能することが見出された。図２６Ｊは、２９３Ｔ細胞におけるＣＤ２の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１、＃２および＃３が機能することが見出された。図２６Ｋは、２９３Ｔ細胞におけるＬＡＧ３の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃２および＃３が機能することが見出された。図２６Ｌは、２９３Ｔ細胞におけるＢＴＬＡの二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｍは、２９３Ｔ細胞におけるＩＣＯＳの二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃２、＃３および＃４が機能することが見出された。図２６Ｎは、２９３Ｔ細胞におけるＣＤ２７の二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１および＃２が機能することが見出された。図２６Ｏは、２９３Ｔ細胞におけるＳＴ２の二重ガイドターゲティングを実証する。４つのＣＲＩＳＰＲすべてが機能することが見出された。図２６Ｐは、２９３Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの二重ガイドターゲティングを実証する。ＣＲＩＳＰＲ＃１および＃３が機能することが見出された。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図２７は、試験した様々な細胞株、および細胞株を試験した標的を表す。ＨｕＥＳ８およびＨｕＥＳ９は、ヒトＥＳ細胞株である。ＢＪ−ＲｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ株である。表に示されていない他のすべてのエンハンセオソーム成分（例えば、ＲＦＸおよびＮＦＹ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてのみ試験した。
図２８Ａ〜２８Ｊは、改変ＥＳ細胞が、ＨＬＡ発現が低減または存在しない様々な異なる細胞型に分化し得ることを与える。図２８Ａは、改変ＥＳ細胞が、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、肝細胞、β細胞および神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化し得ることを与える。図２８Ｂは、ＮＬＲＣ５−／−ヒトＥＳ細胞におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。幹細胞では、基底ＭＨＣ−Ｉ発現が低い。発現は、ＩＦＮγ刺激によって増加され得る。ＩＦＮγ処理ＮＬＲＣ５−／−細胞では、ＭＨＣ−Ｉ発現の約５０％の低減が起こる。図２８Ｃは、ＮＬＲＣ５−／−ヒト間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。ＨｕＥＳ９細胞およびＭＰＣの比較が提供されている。図２８Ｄは、幹細胞由来ＮＬＲＣ５−／−内皮細胞（ＥＣ）におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。図２８Ｅは、ＥＣが同様の分化効率を示すことを実証する。図２８Ｆは、Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＥＣにおけるＨＬＡ発現の喪失を示す。Ｎ＝３、４８時間のＩＦＮγ処理。図２８Ｇは、ＮＬＲＣ５−／−肝細胞様細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現の低減を実証する。ターゲティング戦略およびＣＲＩＳＰＲ設計を実証する概略図が含まれている。最終肝細胞分化の７日目に、ＨＬＣは、ＢＪ−ＲｉＰＳＣから生成される。図２８Ｈは、ＣＩＩＴＡの変異が、ｈＥＳＣ由来マクロファージにおけるＭＨＣクラスＩＩ発現を抑止することを実証する。ターゲティング戦略およびＣＲＩＳＰＲ設計を実証する概略図が含まれている。ＨｕＥＳ９由来ｉＭФ、５日目のＭ−ＣＳＦ。図２８Ｉは、神経前駆細胞（ＮＰＣ）分化を示す。Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＴＩＡ−／−ＨｕＥＳ９は、ネスチン＋神経ロゼット（白色の矢印）を形成する。図２８Ｊは、β細胞分化のためのスピン培養への幹細胞の適合を実証する。これは、β細胞分化プロトコールにおける第１工程である。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図２９Ａ〜２９Ｂは、奇形腫モデルにおけるインビボデータを提供する。図２９Ａは、「低免疫原性」ＤＫＯ細胞株が生成されたことを与える。生成した細胞株としては、ＷＴ ＨｕＥＳ９、ＮＬＲＣ５−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＨｕＥＳ９およびＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＨｕＥＳ９が挙げられる。ＷＴ細胞株は、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩの発現を示した。ＮＬＲＣ５−／−ＣＩＩＴＡ−／−細胞株は、ＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示し、ＭＨＣ−ＩＩ発現を示さなかった。Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−細胞株は、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩの発現を示さなかった。図２９Ｂは、ヒト化マウスにおけるゲノム編集幹細胞の生着の改善を示す。試験した３つの細胞株は、ＷＴ ＨｕＥＳ９、ＮＬＲＣ５−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＨｕＥＳ９およびＢ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＨｕＥＳ９であった。 同上
図３０Ａ〜３０Ｄは、ＪＥＧ−３細胞におけるＢ７−Ｈ３のＣＲＩＳＰＲターゲティングを実証する。図３０Ａは、Ｂ７−Ｈ３をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲガイド配列を提供する。図３０Ｂは、ＪＥＧ−３細胞における標的としたＢ７−Ｈ３コロニーのスクリーニングを示す。ＣＲＩＳＰＲ切断効率は、１５／８０、すなわち約１８．７％であることが示されている。図３０Ｃは、配列決定によるＢ７−Ｈ３ノックアウトの確認を示す。図３０Ｄは、標的としたＪＥＧ３クローンにおけるＢ７−Ｈ３表面発現の喪失を実証する。 同上 同上 同上
図３１は、Ｂ２Ｍ−／−ジャーカットＣａｓ９ Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ表面発現の喪失を示す。Ｂ２Ｍ−／−ジャーカットＣａｓ９ Ｔ細胞が、Ｂ２Ｍのノックアウトを含まないジャーカットＣａｓ９ Ｔ細胞と比較されている。
図３２Ａ〜３２Ｈは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した、ヒト細胞における臨床関連遺伝子座のターゲティングを実証する。図３２Ａは、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡの概略図である。図３２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現のヒストグラムである。図３２Ｃは、様々なｇＲＮＡを用いた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ欠失効率を示す；ｎ＝３（平均±ＳＥＭ）。図３２Ｄは、ＣＣＲ５をターゲティングするｇＲＮＡの概略図である。オレンジ色および緑色の矢印は、分析領域を増幅するために使用したプライマーペアを表す。図３２Ｅは、Ｋ５６２細胞におけるＣＣＲ５をターゲティングする各ｇＲＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を示す。％インデルは、各ガイドの下に示されている。図３２Ｆは、２９３Ｔ細胞と比較した、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞における選択したｇＲＮＡのＢ２Ｍ欠失効率を示す；ｎ＝６（平均±ＳＥＭ）。図３２Ｇは、Ｋ５６２細胞およびＨＳＰＣにおけるＣＣＲ５をターゲティングするｃｒＣＣＲ５＿ＡおよびｃｒＣＣＲ５＿ＢのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を示す。図３２Ｈは、サンガーシーケンシングによって決定した場合の、ＨＳＰＣ（ｎ＝２）におけるＣＣＲ５をターゲティングするｃｒＣＣＲ５＿ＡおよびｃｒＣＣＲ５＿Ｂのクローン欠失効率を示す（注：ｃｒＢ２Ｍ＿１４は、コード配列の２０Ｋｂ下流に位置するので、パネルＡの概略図に表されていない）。
図３３Ａ〜３３Ｅは、Ｂ２Ｍをターゲティングする様々なｇＲＮＡのオンターゲット変異効率の評価を実証する。図３３Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座をターゲティングするすべてのｇＲＮＡについてのＢ２Ｍ欠失効率を示す。３回の独立した実験のプールデータが、平均±ＳＥＭとして示されている。図３３Ｂは、ＣＥＬ Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって％インデルとして測定した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における選択ガイドのＢ２Ｍ欠失効率を示す。図３３Ｃは、Ｃａｓ９およびガイドｃｒＢ２Ｍ＿１３をトランスフェクトした場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および一次ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現の比較である。図３３Ｄは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子座をターゲティングする選択ガイドのＢ２Ｍ欠失効率を示す。図３３Ｅは、ＣＥＬ Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって％インデルとして測定した、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞における選択ガイドのＢ２Ｍ欠失効率を示す。
図３４Ａ〜３４Ｅは、一次ヒト造血幹細胞およびエフェクター細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集のための二重ｇＲＮＡアプローチを表す。図３４Ａは、Ｂ２Ｍ遺伝子座をターゲティングするための二重ｇＲＮＡアプローチの概略図である。ｇＲＮＡペアは、赤色である。各ｇＲＮＡの組み合わせに関するＣａｓ９部位間の塩基対のオフセット（右のパネル）。図３４Ｂは、６つの二重ｇＲＮＡの組み合わせに関する、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ欠失効率を示す（ｎ＝３；平均±ＳＥＭ）。図３４Ｃは、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｃｒＢ２Ｍ＿１３もしくはｃｒＢ２Ｍ＿８のみまたはその組み合わせのいずれかのＢ２Ｍ発現の喪失を示すＦＡＣＳプロットである。図３４Ｄは、ＣＣＲ５をターゲティングするための二重ｇＲＮＡアプローチの概略図である。ｇＲＮＡペアは、赤色で示されている。オレンジ色および緑色の矢頭は、領域を増幅するために使用したプライマーペアを表す。各ｇＲＮＡペアに関するＣａｓ９部位間のオフセット（右のパネル）。図３４Ｅは、ＰＣＲによって分析した、ｃｒＣＣＲ５＿Ｄ＋Ｑで標的としたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来クローンのゲル電気泳動画像である。２つのｇＲＮＡ切断部位間の２０５ｂｐ領域の欠失に注目すべきである（上のパネル；ＷＴ：野生型；ΔＣＣＲ５：欠失；緑色＊は、ＷＴクローンを表す；オレンジ色＊は、ヘテロ接合クローンを表す；赤色＊は、ホモ接合欠失クローンを表す）。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるＣＣＲ５をターゲティングする３つの二重ｇＲＮＡの組み合わせについてのクローン欠失効率（ｎ＝４；％平均±ＳＥＭ；下のパネル）。
図３５Ａ〜３５Ｇは、二重ｇＲＮＡの組み合わせのターゲティング効率を実証する。図３５Ａは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、３例の独立したドナーからの６つの二重ｇＲＮＡの組み合わせについてのＢ２Ｍ欠失効率を示す。図３５Ｂは、Ｂ２Ｍ欠失（上のパネル）後のＭＨＣクラスＩ表面発現の喪失（下のパネル）を示すＦＡＣＳプロットである。図３５Ｃは、Ｂ２Ｍ遺伝子座のためのシングルセルネステッドＰＣＲ戦略の概略図である（左のパネル）。黒色および灰色の矢頭：対照プライマーペア、オレンジ色および緑色の矢頭：ターゲティング領域に隣接するプライマーペア。％Ｂ２Ｍヌル単一細胞が示されている（右のパネル、ｎ＝３０１）。図３５Ｄは、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的とした領域の予測欠失を示すサンガーシーケンシングクロマトグラムである。図３５Ｅは、複数のドナーから得られたＣＤ３４＋ＨＳＰＣ−ｍＰＢにおける３つの二重ｇＲＮＡの組み合わせについてのクローンＣＣＲ５欠失効率を示す。個々のコロニーから単離したＤＮＡを、ＰＣＲおよびゲル電気泳動によって分析した。図３５Ｆは、一次ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ５の欠失を決定するためのシングルセルネステッドＰＣＲ戦略の概略図である（左のパネル）。％ＣＣＲ５ヌル単一細胞が示されている（右のパネル、ｎ＝３６３）。図３５Ｇは、サンガーシーケンシングクロマトグラムが標的とした領域における予測欠失を示すことを示す。
図３６は、２９３Ｔ細胞における選択ガイドのＢ２Ｍ欠失効率を実証する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの矢印は、ヌクレアーゼ切断結合を示す。
図３７は、ＡｓＣｐｆ１およびガイドｃｒＢ２Ｍをトランスフェクトした場合の２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現の比較を実証する。
図３８は、ＬｂＣｐｆ１およびガイドｃｒＢ２Ｍをトランスフェクトした場合の２９３Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ表面発現の比較を実証する。
図３９は、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ設計およびクローニング情報を表す。
図４０Ａ〜４０Ｇは、ＴＡＬＥＮを使用した、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＪＥＧ３細胞の作製および特性評価を実証する。図４０Ａは、Ｂ２Ｍ ＴＡＬＥＮの設計および誘導される変異を表す。図４０Ｂは、転写産物およびタンパク質レベルにおけるＢ２Ｍの分析を表す。図４０Ｃは、表面発現レベルにおけるＢ２Ｍの分析を実証する。図４０Ｄは、ΔＢ２ＭクローンがＭＨＣ−Ｉ表面発現を欠くことを実証する。図４０Ｅは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｇ表面発現を欠くことを実証する。図４０Ｆは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｃ表面発現を欠くことを実証する。図４０Ｇは、ΔＢ２ＭクローンがＨＬＡ−Ｅ表面発現を欠くことを実証する。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図４１は、本発明の例示的なＴＣＲターゲティング戦略を実証する。図４１は、それぞれ、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の第１のコーディングエクソンをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡの位置を示す概略図である。
図４２Ａ〜図４２Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＴ細胞受容体の欠失を実証する。図４２Ａは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを安定発現するジャーカットＴ細胞におけるＴＣＲ欠失の成功を明らかにする、抗ＣＤ３抗体を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示す。図４２Ｂは、ＴＣＲａ遺伝子座およびＴＣＲｂ遺伝子座における切断を確認する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
図４３Ａ〜図４３Ｂは、初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＣＲ欠失を実証する。図４３Ａは、２人の独立したドナーから得たＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴＣＲａ遺伝子座およびＴＣＲｂ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ切断を実証する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。図４３Ｂは、ＦＡＣＳ分析によって実証されたＴＣＲ表面発現の喪失を示す
図４４Ａ〜図４４Ｃは、本発明の例示的なＰＤ−１遺伝子座ターゲティング戦略を実証する。図４４Ａは、ＰＤ−１ターゲティング戦略の概略図である。図４４Ｂは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤ−１遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図４４Ｃは、ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）をターゲティングする２つのＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後のＰＤ−１遺伝子座における予測欠失を確認した配列決定の概略図である。
図４５〜図３５Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＰＤ−１発現の喪失を実証する。図４５Ａは、活性化ジャーカットＴ細胞におけるＰＤ−１発現の喪失を実証する、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。図４５Ｂは、ＰＤ−１遺伝子座における切断を確認する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
図４６Ａ〜図４６Ｃは、本発明の例示的なＣＴＬＡ４遺伝子座ターゲティング戦略を実証する。図４６Ａは、ＣＴＬＡ４ターゲティング戦略の概略図である。図４６Ｂは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図４６Ｃは、ＣＴＬＡ４遺伝子（ＣＴＬＡ４）をターゲティングする２つのＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後のＣＴＬＡ４遺伝子座における予測欠失を確認した配列決定の概略図である。
図４７Ａおよび図４７Ｂは、ジャーカットＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４遺伝子座における切断を実証する。図４７Ａは、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略が、ジャーカットＴ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子座をターゲティングする両ＣＲＩＳＰＲによって切断をもたらすことを実証する。図４７Ｂは、ジャーカットＴ細胞における両ＣＴＬＡ４ ＣＲＩＳＰＲによる切断の成功を実証する、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイの結果を示す。
以下の表８〜５５は、それぞれ添付書類１〜４７として本明細書と共に提出される：
表８−ＨＬＡ−Ａをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表９−ＨＬＡ−Ｂをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１０−ＨＬＡ−Ｃをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１１−ＲＦＸ−ＡＮＫをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１２−ＣＩＩＴＡをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１３−ＮＦＹ−Ａをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１４−ＮＬＲＣ５をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１５−Ｂ２Ｍをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１６−ＲＦＸ５をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１７−ＲＦＸ−ＡＰをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１８−ＨＬＡ−Ｇをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表１９−ＨＬＡ−Ｅをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２０−ＮＦＹ−Ｂをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２１−ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２２−ＮＦＹ−Ｃをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２３−ＩＲＦ１をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２４−ＴＡＰ１をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２５−ＧＩＴＲをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２６−４１ＢＢをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２７−ＣＤ２８をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２８−Ｂ７−１をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表２９−ＣＤ４７をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３０−Ｂ７−２をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３１−ＯＸ４０をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３２−ＣＤ２７をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３３−ＨＶＥＭをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３４−ＳＬＡＭをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３５−ＣＤ２２６をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３６−ＩＣＯＳをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３７−ＬＡＧ３をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３８−ＴＩＧＩＴをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表３９−ＴＩＭ３をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４０−ＣＤ１６０をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４１−ＢＴＬＡをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４２−ＣＤ２４４をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４３−ＬＦＡ−１をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４４−ＳＴ２をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４５−ＨＬＡ−Ｆをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４６−ＣＤ３０をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４７−Ｂ７−Ｈ３をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４８−ＶＩＳＴＡをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表４９−ＴＬＴをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表５０−ＰＤ−Ｌ２をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表５１−ＣＤ５８をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表５２−ＣＤ５８をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；
表５３−ＣＤ２をターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列；および
表５４−ＨＥＬＩＯＳをターゲティングするために有用な例示的ｇＲＮＡ配列。
添付書類１〜４７（それぞれ表８〜５４）は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる：
添付書類１（ファイル名：Ｔａｂｌｅ８．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２２３，０２６バイト）；
添付書類２（ファイル名：Ｔａｂｌｅ９．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：３２７，８９５バイト）；
添付書類３（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１０．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２８０，８４９バイト）；
添付書類４（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１１．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：９９８，０４６バイト）；
添付書類５（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１２．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：４，７１７，８２３バイト）；
添付書類６（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１３．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２，８１３，４０７バイト）；
添付書類７（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１４．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：６，５６８，７４２バイト）；
添付書類８（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１５．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：７２８，６８５バイト）；
添付書類９（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１６．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：７６６，１０６バイト）；
添付書類１０（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１７．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：８７４，４３５バイト）；
添付書類１１（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１８．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２３２，５３６バイト）；
添付書類１２（ファイル名：Ｔａｂｌｅ１９．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：５３９，９３２バイト）；
添付書類１３（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２０．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２，２５６，０８４バイト）；
添付書類１４（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２１．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：１，３０３，０８１バイト）；
添付書類１５（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２２．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：６，８２１，２９９バイト）；
添付書類１６（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２３．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：１，０９５，３８６バイト）；
添付書類１７（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２４．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：９４１，２８１バイト）；
添付書類１８（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２５．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：３７８，３６８バイト）；
添付書類１９（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２６．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：２，７０６，５０９バイト）；
添付書類２０（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２７．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：３，５７８，９７７バイト）；
添付書類２１（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２８．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：３，６３８，０３９バイト）；
添付書類２２（ファイル名：Ｔａｂｌｅ２９．ｔｘｔ；作成日：２０１６年５月９日；ファイルサイズ：５，０８３，６４５バイト）；
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発明の詳細な説明
幹細胞生物学の最近の進歩は、例えば、図１に一般に表されているように、制限されない移植用供給源として被験体自身の細胞を使用することを企図することを可能にした。残念ながら、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のゲノム編集および作製と、それに続くこのようなｉＰＳＣの分化は依然として、多能性、エピジェネティック状態、分化能力およびゲノム安定性に関して、費用および時間のかかる非常に多様なプロセスである。また、ゲノム編集および長期培養中に起こる変化は、適応免疫応答をトリガーし、たとえ自己幹細胞由来移植物であっても免疫拒絶反応をもたらすことが見出された。幹細胞由来移植物による被験体の免疫拒絶の問題を克服するために、本発明者らは、任意の移植可能な細胞型のための生存供給源を表わす万能性ドナー幹細胞を開発し、本明細書に開示する。好都合なことに、本明細書に開示される万能性幹細胞は、レシピエント被験体の遺伝的構成にかかわらず、該被験体の免疫系によって拒絶されない。
本明細書に開示される発明は、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＴＡＬＥＮ系）を用いて、ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳＣにおいて、（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）重要な免疫遺伝子の発現を低減もしくは排除し、または特定の場合には寛容誘導因子を挿入して、それらおよびそれらから調製された分化細胞を低免疫原性にし、このような細胞が移植される被験体による免疫拒絶を受けにくくする。細胞を特性評価するために本明細書で使用される場合、「低免疫原性」という用語は、一般に、このような細胞が、このような細胞が移植される被験体による免疫拒絶を受けにくいことを意味する。例えば、非改変野生型細胞と比べて、このような低免疫原性細胞は、このような細胞が移植される被験体による免疫拒絶に対して約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれを超えて受けにくいものであり得る。いくつかの態様では、ゲノム編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＴＡＬＥＮ系）は、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子およびＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）ために使用される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、幹細胞であって、そのゲノムが、ＨＬＡ発現の重要な成分を低減しまたは欠失させるように変更されている幹細胞に関する。同様に、特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、幹細胞であって、そのゲノムが、１つまたはそれを超える寛容誘導因子を挿入するように変更されている幹細胞に関する。本発明は、例えば、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用して、当業者に利用可能な任意の方法で標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを企図する。このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、様々なＣａｓタンパク質を用い得る（Ｈａｆｔら、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）およびＴＡＬＥＮを利用する方法の例が本明細書に詳細に記載されるが、本発明は、これらの方法／系の使用に限定されないことを理解すべきである。ポリヌクレオチド配列をターゲティングして標的細胞における発現を低減または除去する当業者に公知の他の方法が本明細書で利用され得る。
本発明は、細胞における標的ポリヌクレオチド配列を任意の目的で、しかし特に、コードされる産物の発現または活性が低減または排除されるように変化させること、例えば、改変することまたは切断することを企図する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、抗原提示の転写調節因子をターゲティングして低免疫原性幹細胞を産生するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣ）における標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異細胞を生産するように変化される。本明細書で使用される場合、「突然変異細胞」は、一般的に、得られた遺伝子型がその元の遺伝子型または野生型細胞と異なる細胞を指す。いくつかの場合では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して正常機能ステム遺伝子を変化させた場合、「突然変異細胞」は、突然変異表現型を示す。いくつかの実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子突然変異を修正または修復するように（例えば、正常表現型を細胞に戻すように）変化される。いくつかの実施形態では、細胞における標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子突然変異を誘導するように（例えば、遺伝子またはゲノム要素の機能を破壊するように）変化される。
いくつかの実施形態では、変化は、インデルである。本明細書で使用される場合、「インデル」は、挿入、欠失またはそれらの組み合わせから生じる突然変異を指す。当業者であれば認識するように、インデルの長さが３の倍数ではない限り、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、フレームシフト突然変異をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、変化は、点突然変異である。本明細書で使用される場合、「点突然変異」は、１つのヌクレオチドを置き換える置換を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列における任意の長さのインデルまたは点突然変異を誘導するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。例えば、細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、治療目的および研究目的の両方のためにインビトロで、インビボでまたはエクスビボで実施され得る。細胞における標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、（例えば、細胞における突然変異対立遺伝子をエクスビボでノックアウトし、ノックアウトした突然変異対立遺伝子を含む細胞を被験体に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するために有用であり得る。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列またはその発現産物の機能を妨害する方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失させることを含む。
いくつかの実施形態では、変化は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低減をもたらす。「減少させる」、「低減された」、「低減」および「減少」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の減少を指すために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「減少された」、「低減された」、「低減」および「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の減少もしくは最大１００％（それを含む）の減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在レベル）、または参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の減少を含む。
「増加された」、「増加させる」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される；いかなる誤解も避けるために、「増加された」、「増加させる」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の増加もしくは最大１００％（それを含む）の増加、または参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍もしくは少なくとも約３倍もしくは少なくとも約４倍もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加もしくは２倍〜１０倍もしくはそれを超える任意の増加を意味する。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、正常を２標準偏差（２ＳＤ）下回る（すなわち、低い）マーカーの濃度を意味する。この用語は、差異があるという統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に正しい場合に、帰無仮説の棄却を判定する確率として定義される。判定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
いくつかの実施形態では、変化は、ホモ接合変化である。いくつかの実施形態では、変化は、ヘテロ接合変化である。
いくつかの実施形態では、変化は、望ましくない配列から所望の配列への標的ポリヌクレオチド配列の修正をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的ポリヌクレオチド配列における任意の種類の突然変異またはエラーを修正するために使用され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、欠失により標的ポリヌクレオチド配列から消失したヌクレオチド配列を挿入するために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、挿入突然変異により標的ポリヌクレオチド配列からヌクレオチド配列を欠失させまたは切除するために使用され得る。いくつかの場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、（例えば、機能喪失突然変異により損なわれた機能を標的ポリヌクレオチド配列に回復させるために）誤ったヌクレオチド配列を正しいヌクレオチド配列で置き換えるために使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、驚くほど高い効率で、標的ポリヌクレオチドを変化させ得る。特定の実施形態では、変化の効率は、少なくとも約５％である。特定の実施形態では、変化の効率は、少なくとも約１０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約１０％〜約８０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約３０％〜約８０％である。特定の実施形態では、変化の効率は、約５０％〜約８０％である。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約８０％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約８５％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％を超えるかまたはそれに等しい。いくつかの実施形態では、変化の効率は、約１００％に等しい。
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、およびＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができる少なくとも１〜２つのリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および単一のリボ核酸またはＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができるリボ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の少なくとも１つのペアを含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸のポリマー）によって結合された一連のアミノ酸残基を指すために互換的に使用され、改変アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む。例示的なポリペプチドまたはタンパク質としては、上記ものの遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、パラログ、断片および他の等価物、変異体ならびに類似体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれを超えるアミノ酸置換基または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの場合では、置換および／または改変は、タンパク質分解を防止もしくは低減し、および／または細胞におけるポリペプチドの半減期を延長し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分を含む改変（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、末端キャッピングなど）を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、限定されないが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８およびＣａｓ９が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、大腸菌サブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ２としても公知）を含む。大腸菌サブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４およびＣａｓ５ｅが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ３としても公知）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３およびＣｓｙ４が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ４としても公知）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ１としても公知）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的Ｃａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２およびＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ７としても公知）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２およびＣａｓ５ｔが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２およびＣａｓ５ｈが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ５としても公知）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５およびＣａｓ５ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ６としても公知）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパクとしては、限定されないが、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４およびＣｓｍ５が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、限定されないが、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５およびＣｍｒ６が挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、トランス−コード小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓタンパク質を含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１としても公知）は、１３６８アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質の例示的なアミノ酸配列（配列番号１）は、図１２に示されている。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡに非相補的な標的ＤＮＡを切断するＲｕｖＣ−様ドメイン（残基７〜２２、７５９〜７６６および９８２〜９８９）およびｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン（残基８１０〜８７２）を含む２つのエンドヌクレアーゼドメインを含有する。図１２では、ＲｕｖＣ様ドメインは黄色で強調されており、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは下線が付されている。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種由来のＣｐｆ１またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの態様では、Ｃｐｆ１は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６タンパク質またはその機能的部分である。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００アミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。Ｃｐｆ１は、単一のリボヌクレアーゼドメインを使用して、互い違いのパターンで標的ＤＮＡを切断する。互い違いのＤＮＡ二本鎖切断は、４または５ｎｔの５’オーバーハングをもたらす。
本明細書で使用される場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体形成し、標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持するペプチドの一部を指す。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインからなる群より選択される作動可能に連結されたＣｐｆ１タンパク質機能ドメインの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。
本発明は、標的ポリヌクレオチド配列とＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）とを接触させる様々な方法を企図することを認識すべきである。いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」および「細胞透過性ペプチド」は、それぞれ、細胞への分子の取り込みを促進するポリペプチドまたはペプチドを指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、（例えば、正、負または全中性の電荷を有する）荷電タンパク質にコンジュゲートまたは融合され得る。このような連結は、共有結合性であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の細胞透過能力を有意に増加させるために、Ｃａｓタンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７−５２）。特定の実施形態では、細胞への侵入を促進するために、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例示的ＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニンおよびペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣｐｆ１ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の適切な技術によって達成され得る。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載される改変ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載される改変ｍＲＮＡ（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および少なくとも１〜２つのリボ核酸がをコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１〜２つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載される改変核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。
本発明の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズすることができる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、単一のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つは、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は両方とも、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに配向させてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者であれば認識するように、本発明のリボ核酸は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ポリヌクレオチドの配列に応じて、様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択され得る。１〜２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小化するように選択され得る。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフ（これは、標的モチーフ間に位置する突然変
異対立遺伝子に隣接する）に直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号２〜８１７９７６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号２〜８１７９７６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つは、配列番号２〜８１７９７６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸は、配列番号２〜８１７９７６のリボ核酸配列からなる群より選択される配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸はそれぞれ、Ｃａｓタンパク質を細胞における標的としたポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けてそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは２つリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的としたポリヌクレオチド配列の同一鎖上の配列に相補的であり、および／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的としたポリヌクレオチド配列の反対鎖上の配列に相補的であり、および／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的としたポリヌクレオチド配列の反対鎖上の配列に相補的ではなく、および／またはそれにハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的としたポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、および／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的としたポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、および／またはそれにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＲＧモチーフの直前にある。いくつかの態様では、ＮＲＧモチーフは、ＮＧＧまたはＮＡＧである。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＡＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇで始まる２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、Ｇ（Ｎ）１９ＮＧＧである。いくつかの実施形態は、標的モチーフは、（Ｎ）２０ＮＧＧである。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、ＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＲＧ（例えば、ＮＧＧまたはＮＡＧ）モチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＮＧＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＮＮＲＲＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＮＡＧＡＡＷモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＮＮＮＧＡＴＴモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり、Ｔ． ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＡＡＡＡＣモチーフの直前にある。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅのＣｐｆ１タンパク質によって認識される５’Ｔリッチ領域（例えば、ＴＴＴＮモチーフ）を有する１７〜２３ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。
いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。当業者であれば、様々な技術が、オフターゲット効果を最小化するための適切な標的モチーフを選択するために使用され得ることを認識する（例えば、バイオインフォマティクス分析）。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１〜２つのリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフ（これは、標的モチーフ間に位置する突然変異対立遺伝子に隣接する）に直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。
いくつかの態様では、細胞における標的としたポリヌクレオチド配列は、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）を使用して、細胞における１つまたはそれを超える重要な免疫遺伝子の発現および／または活性を低減または排除するように変更される。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞における標的としたポリヌクレオチド配列が、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して）細胞の一方または両方の対立遺伝子から連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させる（例えば、１つまたはそれを超える重要な免疫遺伝子を欠失させる）ように変更されることを提供する。いくつかの実施形態では、細胞における標的としたポリヌクレオチド配列は、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して）遺伝子変異を細胞の一方または両方の対立遺伝子に挿入するように変更される。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される万能性幹細胞は、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した）相補的ゲノム編集アプローチに供され得、それにより、このような幹細胞は、細胞の一方または両方の対立遺伝子から連続した一続きのゲノムＤＮＡ（例えば、重要な免疫遺伝子）を両方とも欠失させて、およびＨＬＡ−ＧまたはＰＤ−Ｌ１などの１つまたはそれを超える寛容誘導因子を細胞の一方または両方の対立遺伝子に挿入して、免疫系を局所的に抑制し、移植物の生着を改善するように改変される。
ＨＬＡ発現を評価するために、および例えば前臨床ヒト化マウスモデルにおいて万能性幹細胞株の免疫原性を評価するために、本明細書に開示される万能性幹細胞は、関連細胞型に分化され得る。例えば、本明細書に開示される万能性幹細胞は、適切な条件下でインキュベートされ得、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、低免疫原性心筋細胞、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、肝細胞、β細胞（例えば、膵臓β細胞）または神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化され得る。
本明細書に開示される万能性幹細胞および方法は、厳格に試験された万能性ドナー幹細胞株であって、成長して非常に多数の細胞に分化し、すべての医療機関に広く利用可能であり、変性病を患っている患者を処置するために要求に応じて使用され得る万能性ドナー幹細胞株への道を開くことによって、再生医療に多大な影響を有し、それにより、自己移植用供給源として患者自身の細胞をケースバイケースで使用する必要がなくなる。また、得られる細胞産物は免疫攻撃から保護されるので、それらは、自己細胞が依然として免疫攻撃を受けやすい自己免疫疾患（例えば、ＭＳ（多発性硬化症）および糖尿病）のための新たな形の処置を代表する。しかしながら、免疫特権のある万能性ドナー幹細胞由来細胞産物は、自己免疫拒絶から保護される。
本明細書に開示される万能性幹細胞は、例えば、被験体における疾患または状態の存在または進行を診断、モニタリング、処置および／または治癒するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「被験体」は、ヒトまたは動物を意味する。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。特定の実施形態では、被験体は、青年である。特定の実施形態では、被験体は、インビボ、インビトロおよび／または胎内で処置される。特定の態様では、本明細書に開示される方法による処置を必要とする被験体は状態を有するか、またはこのような状態を発症すると疑われるかもしくはそのリスクが高い。
図２Ａに表されているように、ＨＬＡは、被験体における幹細胞または分化幹細胞の移植の成功に対する免疫学的障壁を表わす。移植に対するＨＬＡ免疫学的障壁を克服するために有用な新規な組成物、細胞および関連方法が本明細書に開示される。図２Ｂに示されているように、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、臓器移植中のドナー適合性を規定する表面分子の高度に多型の遺伝子ファミリーをコードするヒト染色体６ｐ２１上の遺伝子座である。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）は、抗原をＴリンパ球に提示することによって、適応免疫応答の活性化において重要な役割を果たす。ＭＨＣ−ＩＩエンハンセオソームおよびＭＨＣ−Ｉエンハンセオソームの比較は、図１３に提供されている。ヒトは、ウイルス、がん性細胞および移植細胞の検出および排除に不可欠な３つの古典的ＭＨＣ−Ｉａ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ）を有する。加えて、免疫調節機能を有する３つの非古典的ＭＨＣ−Ｉｂ分子（ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇ）がある。細胞ベースの移植療法などの特定の状況では、ＭＨＣは重要な細胞機能を果たす一方、それらは免疫拒絶にも寄与し得る。移植細胞のこのようなＨＬＡベースの免疫拒絶に対処するために有用な新規な細胞、組成物および方法が本明細書で提供される。
ノックアウト
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩの発現を調節する幹細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的としたポリヌクレオチド配列のゲノム改変に関する。いくつかの態様では、遺伝子編集系は、１つまたはそれを超える標的としたポリヌクレオチド配列を改変するために使用される。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、１つまたはそれを超える標的としたポリヌクレオチド配列を欠失させるために使用される。ＭＨＣ−Ｉ分子は、ＭＨＣコード重鎖および不変サブユニットβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）から構成される。抗原由来ペプチドは、細胞表面のＭＨＣ−Ｉ−Ｂ２Ｍ複合体によって、抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するＣＤ８ Ｔ細胞に提示される。ペプチドは、ＭＨＣクラスＩペプチドを生成するために最適化された特殊なプロテアソームまたは免疫プロテアソームであって、いくつかのＩＦＮ−γ誘導性サブユニットを含有する特殊なプロテアソームまたは免疫プロテアソームによって、細胞質タンパク質の分解から主に産生される。抗原提示細胞に主に見出されるＭＨＣ−ＩＩとは異なり、ＭＨＣ−Ｉａは、ほぼすべての有核細胞において遍在的に発現される（Ｐａｍｅｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９８）１６：３２３−３５８．）。ＭＨＣ−Ｉ遺伝子およびＭＨＣ−ＩＩ遺伝子は両方とも、ＩＦＮ−γ刺激によって高度に誘導性である。
ＨＬＡ障壁の効率的な除去は、以下の１つまたはそれよりも多くによって達成され得る：（１）多型ＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）およびＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の直接的なターゲティング；（２）すべてのＭＨＣ−Ｉ分子の表面輸送を防止するＢ２Ｍの除去；ならびに／または（３）ＨＬＡ発現に重要なＭＨＣエンハンセオソームの成分、例えばＮＬＲＣ５、ＲＦＸ−５、−ＡＮＫおよび−ＡＰ、ＩＲＦ１、ＮＦ−ＹならびにＣＩＩＴＡの欠失。
特定の実施形態では、ＨＬＡ発現は妨害される。いくつかの態様では、ＨＬＡ発現は、個々のＨＬＡをターゲティングし（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−Ｃの発現をノックアウトし）、ＨＬＡ発現の転写調節因子をターゲティングし（例えば、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ−Ａ、ＮＦＹ−Ｂ、ＮＦＹ−Ｃおよび／またはＩＲＦ−１の発現をノックアウトし）、ＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送を遮断し（例えば、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＡＰ１の発現をノックアウトし）、および／またはＨＬＡ−Ｒａｚｏｒをターゲティングすることによって妨害される。
特定の態様では、本明細書に開示される幹細胞は、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩに対応する１つまたはそれを超えるヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂおよび／またはＨＬＡ−Ｃ）を発現しないので、低免疫原性であることを特徴とする。例えば、特定の態様では、本明細書に開示される幹細胞は、幹細胞またはそれから調製された分化幹細胞が以下のＭＨＣ−Ｉ分子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つもしくはそれよりも多くを発現しないか、またはその発現の低減を示すように改変されている。いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くは、細胞の「ノックアウト」であり得る。ノックアウトＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子および／またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子を有する細胞は、各ノックアウト遺伝子の発現の低減または排除を示し得る。図１３Ａ〜Ｊを参照のこと。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ａ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２〜１４１８からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＨＬＡ−Ａ配列を変更するための方法であって、該ＨＬＡ−Ａ配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＨＬＡ−Ａポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＨＬＡ−Ａポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の該少なくとも１つのペアが配列番号２〜１４１８からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１４１９〜３２７７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＨＬＡ−Ｂ配列を変更するための方法であって、該ＨＬＡ−Ｂ配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＨＬＡ−Ｂポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＨＬＡ−Ｂポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の該少なくとも１つのペアが配列番号１４１９〜３２７７からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３２７８〜５１８３からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＨＬＡ−Ｃ配列を変更するための方法であって、該ＨＬＡ−Ｃ配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＨＬＡ−Ｃポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＨＬＡ−Ｃポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の該少なくとも１つのペアが配列番号３２７８〜５１８３からなる群より選択される、方法を提供する。
特定の実施形態では、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの発現は、連続した一続きのゲノムＤＮＡをターゲティングおよび欠失させ、それにより、標的遺伝子、例えばＮＬＲＣ５の発現を低減または排除することによってモジュレートされる。本明細書で使用される場合、「モジュレートする」という用語は、当技術分野におけるその使用と一致して使用される（すなわち、目的のプロセス、経路または現象の定性的または定量的な変化、変更または改変を引き起こしまたは促すことを意味する）。限定されないが、このような変化は、プロセス、経路または現象の異なる成分または分岐の相対的な強度または活性の増加、減少または変化であり得る。特定の態様では、標的遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ−Ａ、ＮＦＹ−Ｂ、ＮＦＹ−ＣまたはＩＲＦ−１である。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、クラスＩＩ転写活性化因子（ＣＩＩＴＡ）発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。ＣＩＩＴＡは、タンパク質のＮＬＲまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによって、ＭＨＣ−ＩＩの転写を調節する。Ｂ細胞および樹状細胞では、発生段階に応じて、ＣＩＩＴＡの発現が誘導され、ほとんどの細胞型においてＩＦＮ−γによって誘導可能である。ＣＩＩＴＡとは別に、ＮＬＲタンパク質は細胞質に局在し、微生物産物および外因性危険シグナルを認識して炎症および／または細胞死をもたらすことによって、先天性免疫応答に寄与する。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、クラスＩＩ転写活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＬＲＣ５および／またはＢ２Ｍ）を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＣＩＩＴＡゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＣＩＩＴＡゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＣＩＩＴＡポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、ＮＬＲファミリーのＣＡＲＤドメイン含有５／ＮＯＤ２７／ＣＬＲ１６．１（ＮＬＲＣ５）の発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ−Ｉ媒介性免疫応答の重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ−γによって高度に誘導性であり、核内に移行し得る。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＮＬＲＣ５遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍ）を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＮＬＲＣ５ゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＮＬＲＣ５ゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＬＲＣ５遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＬＲＣ５遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＬＲＣ５ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される方法を提供する。
特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、補助鎖（accessory chain）Ｂ２Ｍの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。Ｂ２Ｍの発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ分子の表面輸送が遮断され、細胞が低免疫原性になる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＬＲＣ５および／またはＣＩＩＴＡ）を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＢ２Ｍゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的Ｂ２Ｍゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的Ｂ２Ｍポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＲＦＸ５の発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＲＦＸ５遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８５６４５〜９０１１５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＲＦＸ５遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＲＦＸ５ゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＲＦＸ５ゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸ５遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８５６４５〜９０１１５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号８５６４５〜９０１１５からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸ５遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８５６４５〜９０１１５からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸ５ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号８５６４５〜９０１１５からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＲＦＸＡの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＲＦＸＡＰ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９０１１６〜９５６３５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＲＦＸＡＰ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＲＦＸＡＰゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＲＦＸＡＰゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸＡＰ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９０１１６〜９５６３５からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号９０１１６〜９５６３５からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸＡＰ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９０１１６〜９５６３５からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸＡＰポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号９０１１６〜９５６３５からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＲＦＸＡＮＫの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９５６３６〜１０２３１８からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＲＦＸＡＮＫゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＲＦＸＡＮＫゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸＡＰ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９５６３６〜１０２３１８からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号９５６３６〜１０２３１８からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号９５６３５〜１０２３１８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＲＦＸＡＮＫポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号９５６３６〜１０２３１８からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＮＹＦ−Ａの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＮＦＹ−Ａ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１０２３１９〜１２１７９６からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＮＦＹ−Ａ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＮＦＹ−Ａゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＮＦＹ−Ａゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ａ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１０２３１９〜１２１７９６からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１０２３１９〜１２１７９６からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ａ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１０２３１９〜１２１７９６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ａポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号１０２３１９〜１２１７９６からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＮＦＹ−Ｂの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＮＦＹ−Ｂ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１２１７９７〜１３５１１２からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＮＦＹ−Ｂ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＮＦＹ−Ｂゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＮＦＹ−Ｂゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ｂ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１２１７９７〜１３５１１２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１２１７９７〜１３５１１２からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ｂ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１２１７９７〜１３５１１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ｂポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号１２１７９７〜１３５１１２からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＮＦＹ−Ｃの発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＮＦＹ−Ｃ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１３５１１３〜１７６６０１からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＮＦＹ−Ｃ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＮＦＹ−Ｃゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＮＦＹ−Ｃゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ｃ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１３５１１３〜１７６６０１からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１３５１１３〜１７６６０１からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＮＦＹ−Ｃ遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１３５１１３〜１７６６０１からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＮＦＹ−Ｃポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号１３５１１３〜１７６６０１からなる群より選択される方法を提供する。
特定の態様では、本明細書に開示される発明は、１つまたはそれを超えるＩＲＦ−１の発現をターゲティングおよびモジュレートする（例えば、低減または排除する）ことによって、ＭＨＣ−Ｉ遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、低減または排除する）。いくつかの態様では、モジュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＩＲＦ−１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１７６６０２〜１８２８１３からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＩＲＦ−１遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＩＲＦ−１ゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＩＲＦ−１ゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＩＲＦ−１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１７６６０２〜１８２８１３からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１７６６０２〜１８２８１３からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＩＲＦ−１遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１７６６０２〜１８２８１３からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＩＲＦ−１ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号１７６６０２〜１８２８１３からなる群より選択される方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＴＡＰ１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現を低減または排除するように編集されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１８２８１４〜１８８３７１からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって欠失され得る。
本発明は、ＴＡＰ１遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、および１つまたはそれを超えるさらなる標的ポリヌクレオチド配列を変更するようにこのような細胞のゲノムを編集することを企図する。１つまたはそれを超える本明細書に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアおよびＣａｓタンパク質を使用したＴＡＰ１ゲノム配列の切断は、選択されたｇＲＮＡまたはｇＲＮＡペアの数およびそれらの標的に応じて、標的ＴＡＰ１ゲノム配列の部分的または完全な欠失をもたらし得ることを認識すべきである。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＴＡＰ１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１８２８１４〜１８８３７１からなる群より選択される配列を有するリボ核酸のペアとを接触させることによって欠失されている。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および１〜２つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該１〜２つのリボ核酸の少なくとも１つが配列番号１８２８１４〜１８８３７１からなる群より選択される、方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、各細胞が、ＴＡＰ１遺伝子が、該細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号１８２８１４〜１８８３７１からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることによって、該細胞におけるＭＨＣクラスＩ分子表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されているゲノム改変を含む改変ゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、細胞における標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列を変更するための方法であって、該ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列と、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列に関連する（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのリボ核酸とを接触させることを含み、ここで、該リボ核酸がＣａｓタンパク質を該標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに向けさせてそれにハイブリダイズし、ここで、該標的ＴＡＰ１ポリヌクレオチド配列が切断され、ここで、該少なくとも１つのリボ核酸が配列番号１８２８１４〜１８８３７１からなる群より選択される方法を提供する。
特定の実施形態では、ＨＬＡ遺伝子における保存領域をターゲティングすることによって、すべてのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の同時欠失を可能にするｇＲＮＡは、ＨＬＡ Ｒａｚｏｒとして同定される。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系の一部である。代替的な態様では、ｇＲＮＡは、ＴＡＬＥＮ系の一部である。一態様では、ＨＬＡにおける同定された保存領域をターゲティングするＨＬＡ Ｒａｚｏｒは、図２１Ａに表されている。他の態様では、同定された保存領域をターゲティングする複数のＨＬＡ Ｒａｚｏｒが利用される。ＨＬＡにおける保存領域を標的とする任意のガイドは、ＨＬＡ Ｒａｚｏｒとして作用し得ることが一般に理解される。
ノックイン
特定の実施形態では、免疫特権のある万能性ドナー幹細胞株を作るために、寛容原性因子は、ゲノム編集幹細胞株に挿入または再挿入され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される万能性幹細胞は、１つまたはそれを超える寛容原性因子を発現するようにさらに改変されている。例示的な寛容原性因子としては、限定されないが、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５の１つまたはそれを超えるものが挙げられる。
本発明者らは、免疫拒絶を能動的に阻害するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集系を使用して、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）への寛容原性因子（例えば、以下の表２に示されている寛容原性因子）の挿入を促進した。図１１Ａ〜１１Ｃで明らかなように、本発明者らは、セーフハーバー遺伝子座から寛容原性因子（例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇ）を発現させることに成功した。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｇを発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇを発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＨＬＡ−Ｇの挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号１８８３７２〜１８９８５８からなる群より選択される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｃを発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｃを発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＨＬＡ−Ｃの挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号３２７８〜５１８３からなる群より選択される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｅを発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｅを発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＨＬＡ−Ｅの挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号１８９８５９〜１９３１８３からなる群より選択される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＰＤ−Ｌ１を発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＰＤ−Ｌ１を発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＰＤ−Ｌ１の挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号１９３１８４〜２００７８３からなる群より選択される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＣＤ−４７を発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ−４７を発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＣＤ−４７の挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号２００７８４〜２３１８８５からなる群より選択される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団であって、ＨＬＡ−Ｆを発現するように幹細胞ゲノムが改変されているゲノムを含む幹細胞（例えば、低免疫原性幹細胞）またはその集団を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｆを発現するように幹細胞ゲノムを変更するための方法を提供する。特定の態様では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、幹細胞株へのＨＬＡ−Ｆの挿入を促進するために利用され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアは、配列番号６８８８０８〜３９９７５４からなる群より選択される。
他の標的改変
いくつかの実施形態では、万能性Ｔ細胞などの万能性細胞において、それらの機能を改善し、および／またはそれらを特定の治療アプローチに合わせるために、さらなる標的が改変および／または欠失され得る。
いくつかの態様では、細胞傷害性Ｔ細胞に関わる共刺激分子／受容体をコードする遺伝子は、ゲノム編集によって欠失され得る（表３）。共刺激分子／受容体の欠失は、自己免疫を防止するために行われ得る。他の態様では、共阻害分子／受容体をコードする遺伝子は、ゲノム編集によって欠失され得る（表４）。共阻害分子／受容体の欠失は、がん細胞によるＴ細胞阻害を防止するために行われ得、Ｔ細胞ベースのがん免疫療法において有用であり得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＯＸ４０遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変する（例えば、欠失させる）ように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＯＸ４０配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２３１８８６〜２３４２１０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変（立てば、欠失）され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＧＩＴＲ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＧＩＴＲ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２３４２１１〜２３６４４５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、４−１ＢＢ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的４−１ＢＢ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２３４２１１〜２３６４４５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２８遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２８配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２５２８０７〜２７４１８１からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、Ｂ７−１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的Ｂ７−１配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２７４１８２〜２９５５２９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、Ｂ７−２遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的Ｂ７−２配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号２９５５３０〜３２４１７７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＩＣＯＳ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＩＣＯＳ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３２４１７８〜３３９９７４からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２７遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２７配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３３９９７５〜３４４２６６からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＨＶＥＭ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＨＶＥＭ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３４４２６７〜３５０７２２からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＳＬＡＭ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＳＬＡＭ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３５０７２３〜３５３５９０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２２６遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２２６配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３５３５９１〜４１６８４０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＰＤ１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＰＤ１配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および米国特許出願第１５／０８３，０２１号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）における１９６〜５３１および４０４７〜９１０１の番号付けされたの配列からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＴＬＡ４遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＴＬＡ４配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および米国特許出願第１５／０８３，０２１号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）における１〜１９５および７９７〜４０４６の番号付けされたの配列からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＬＡＧ３遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＬＡＧ３配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４１６８４１〜４２１１９５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＴＩＧＩＴ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＴＩＧＩＴ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４２１１９６〜４３２０３９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＴＩＭ３遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＴＩＭ３配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４３２０４０〜４４７６１０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ１６０遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ１６０配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４４７６１１〜４５９２９４からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＢＴＬＡ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＢＴＬＡ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４５９２９５〜４８２４５４からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２４４遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２４４配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４８２４５５〜５０４１６９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２４４遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２４４配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号４８２４５５〜５０４１６９からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ３０遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ３０配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号６９９７５５〜７３１９９３からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＴＬＴ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＴＬＴ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号７３１９９４〜７３９９５７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＶＩＳＴＡ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＶＩＳＴＡ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号７３９９５８〜７５７５１５からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、Ｂ７−Ｈ３遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標Ｂ７−Ｈ３配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号７５７５１６〜７７７８８８からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＰＤ−Ｌ２遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＰＤ−Ｌ２配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号７７７８８９〜８１７９７６からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの実施形態では、自己免疫を防止するために、リンパ球接着が遮断される。特定の態様では、標的遺伝子は、リンパ球接着を遮断するようにゲノム編集することによって編集され得る（表５）。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＬＦＡ−１遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＬＦＡ−１配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５０４１７０〜５２６６７０からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ２遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ２配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５２６６７１〜５３６７０４からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＣＤ５８遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＣＤ５８配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５３６７０５〜５７０９６７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子は、ゲノム編集によって欠失され得る。Ｔ細胞受容体遺伝子の欠失は、Ｔ細胞療法における自己免疫攻撃を防止するために行われ得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座（ＴＣＲＡ）またはそのホモログ、オルソログもしくはバリアントである（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１３３、ＩＭＤ７、ＴＣＲＤ、ＴＲＡ＠、ＴＲＡＣとしても公知であり、本明細書ではＴＣＲａ、ＴＣＲＡ、ＴＣＲアルファなどと称される）。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座（ＴＣＲＢ）またはそのホモログ、オルソログもしくはバリアントである（Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９５７、ＴＣＲＢ；ＴＲＢ＠としても公知であり、本明細書ではＴＣＲｂ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲベータなどと称される）。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体遺伝子は、米国特許出願第１５／０８３，０２１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２４５５４号（これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているゲノム編集によって改変される。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＴＲＡＣ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＴＲＡＣ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および米国特許出願第１５／０８３，０２１号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）における５３２〜６０９および９１０２〜９７９７の番号付けされたの配列からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＴＲＢＣ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＴＲＢＣ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および米国特許出願第１５／０８３，０２１号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）における６１０〜７６５および９７９８〜１０５７３の番号付けされたの配列からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
いくつかの実施形態では、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能に関与する遺伝子は、ゲノム編集によって欠失され得る（表６）。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能に関与する遺伝子の欠失は、Ｔ細胞療法において寛容を破壊するために行われ得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＦＯＸＰ３遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変する（例えば、欠失させる）ように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＦＯＸＰ３配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５７０９６８〜５８４０６８からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変（例えば、欠失）され得る。
いくつかの態様では、本開示は、幹細胞またはその集団であって、ＨＥＬＩＯＳ遺伝子が、連続した一続きのゲノムＤＮＡを改変するように編集されているゲノムを含む幹細胞またはその集団を提供する。特定の態様では、本開示は、細胞における標的ＨＥＬＩＯＳ配列を変更するための方法を提供する。連続した一続きのゲノムＤＮＡは、細胞またはその集団と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号６８３０３３〜６８８８０７からなる群より選択される少なくとも１つのリボ核酸またはリボ核酸の少なくとも１つのペアとを接触させることによって改変され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の多重化能力はまた、特定の疾患または状態を処置するためのそれらの適用可能性を改善する１つまたはそれを超えるゲノム変更を有する疾患特異的万能性ドナー細胞株の作製を可能にする。対処され得る潜在的な疾患のリストは、表７に見出され得る。
本明細書に開示される発明は、それらの適用において、本記載に示されているかまたは例証されているような詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は他の実施形態を包含し、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で用いられる表現および専門用語は説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないことを理解すべきである。
特定の実施形態にしたがって、本発明の特定の組成物、方法およびアッセイを詳細に記載したが、以下の実施例は例証のためのものに過ぎず、本発明の方法および組成物はそれらに限定されるものではない。
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本明細書で使用される場合、明細書および請求項において、それとは反対に明らかに示さない限り、複数の参照対象を含むと理解すべきである。群の１つまたはそれを超えるメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示さない限り、または他の点で状況から明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、またはすべてが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある場合、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、群メンバーの複数、またはすべてが所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。さらに、本発明は、すべてのバリエーション、組み合わせ、および並べ替えを包含することを理解すべきであり、ここでは一覧表示した請求項の１つまたはそれよりも多くからの１つまたはそれを超える限度、要素、条項、記述用語などが、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、同じ基本請求項（または、関連性があれば、任意の他の請求項）応じて別の請求項に導入される。要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示される場合、要素の各部分群がまた開示されており、任意の要素を群から除去し得ることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、またはこのような要素、特徴などから本質的になることを理解すべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書で多くの言葉で具体的に記載してきたわけではない。特定の除外が明細書において記載されているかいないかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様を明示的に請求項から除外し得ることも理解すべきである。本発明の背景を記載するため、およびその実施に関するさらなる詳細を提供するための、本明細書で言及される刊行物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞株
本発明者らは、様々な細胞株において様々な遺伝子を標的とした。利用した様々な細胞株としては、ＨｕＥＳ８、ＨｕＥＳ９、ＢＪ−ＲｉＰＳＣ、Ｔｈｐ１、ジャーカット、一次Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図２７）が挙げられる。ＨｕＥＳ８およびＨｕＥＳ９はヒトＥＳ細胞株である。ＢＪ−ＲｉＰＳＣはｉＰＳＣ株である。
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃのノックアウト
ＨＬＡのノックアウトターゲティングを調査した。最初に、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃノックアウト戦略を調査した。２つのショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の上流およびＨＬＡ−Ｃの下流に設計することにより、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子の切除を可能にした（図１４Ａ）。ｓｇＲＮＡ＃１およびｓｇＲＮＡ＃２は、ＨＬＡ−Ｂ上流領域を標的とし、ｓｇＲＮＡ＃３およびｓｇＲＮＡ＃４は、ＨＬＡ−Ｃ下流領域を標的とする。
ＰＣＲスクリーニングを実施し、クローン１Ｄがホモ接合ノックアウトクローンであることを確認した。ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの欠失の成功に関するＰＣＲ検証戦略を示す概略図を図１３Ｂに示す。５４５ｂｐおよび４７２ｂｐの予測アンプリコンサイズを有する、各切断部位に隣接する野生型（ＷＴ）プライマーの２つのペアを設計した。ＫＯプライマーを用いて生成された約６８０ｂｐのＰＣＲバンドの存在、および２つの異なるセットのＷＴプライマーを使用した場合のバンドの非存在によって、クローン１Ｄは、ホモ接合ノックアウトクローンとして同定された（図１４Ｂ）。加えて、示されている標的としたＨｕＥＳ８クローンから、ゲノムＤＮＡを単離した。クローン１ＤのＰＣＲ産物の配列決定の結果により、ＨｕＥＳ９におけるＨＬＡ−Ｂ遺伝子およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子の欠失の成功が実証された（図１４Ｃ）。
さらに、ＨＬＡ−Ｂ特異的プライマーおよびＨＬＡ−Ｃ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、クローン１ＤにおけるＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＣのｍＲＮＡ発現が排除されたことが実証された（図１４Ｄ）。ＧＡＰＤＨ、ＴＯＰ１およびＨＰＲＴ１を内部対照として使用した。ＨＬＡ−Ｂプライマーを用いて増幅されたＷＴおよびクローン１ＤのＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、ＢＬＡＳＴを使用してそれぞれＨＬＡ−Ｂ ｍＲＮＡおよびＨＬＡ−Ａ ｍＲＮＡとして同定した（図１４Ｅ）。これらの結果により、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の非存在下では、ＨＬＡ−Ｂ特異的プライマーは、ＨｕＥＳ８クローン１ＤにおけるＨＬＡ−Ａ ｍＲＮＡを増幅することが実証された。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒセットによって評価した場合、ＨｕＥＳ８クローン１Ｄは正常核型を示す（図１４Ｆ）。
二重ｓｇＲＮＡアプローチを使用したＨＬＡ−Ａノックアウト戦略を実証する概略図を図１４Ｇに提供する。概略図は、ＨＬＡ−Ａの上流および下流に結合するように設計された２つのｓｇＲＮＡ（＃５および＃６）の位置を示す。ＴＩＤＥを使用して２９３Ｔ細胞において、ｓｇＲＮＡ＃５および＃６のオンターゲット切断効率を決定した（図１４Ｈ）。
ＰＣＲスクリーニングにより、クローン４Ｅは、ヘテロ接合ＨＬＡ−Ａノックアウトクローンであることが確認された（図１４Ｉ）。ＰＣＲスクリーニング戦略により、ＨｕＥＳ８におけるＨＬＡ−Ａの欠失が確認された。１つのプライマーが切断部位の上流にアニーリングし、１つのプライマーが切断部位の下流にアニーリングするＫＯプライマーを設計した。ＨＬＡ−Ａ欠失により、得られたアンプリコンは、２％アガロースゲル上で２２０ｂｐとして観察された。５８９ｂｐおよび５７１ｂｐの予測アンプリコンサイズを有する、各切断部位に隣接するＷＴプライマーの２つのペアを設計した。クローン４Ｅは、ゲノムＤＮＡから増幅されたＫＯプライマーおよびＷＴプライマーを用いて生成されたバンドの存在によって、ヘテロ接合クローンとして同定された（図１４Ｉ）。ＫＯプライマーを使用してクローン４ＥのゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の配列決定により、ＨｕＥＳ８におけるＨＬＡ−Ａの欠失の成功が実証された（図１４Ｊ）。
転写調節因子のノックアウト
図３Ａ〜３Ｂに示されているように、特定の態様では、本明細書に開示される発明は、抗原提示の転写調節因子（例えば、ＣＩＩＴＡおよび／またはＮＬＲＣ５）を標的とする。本発明者らは、抗原提示のこのような転写調節因子の発現のターゲティングおよび／またはモジュレーティングが、３つの古典的ＭＨＣ−Ｉａ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ）の発現を効率的にモジュレートし（例えば、低減または排除し）、それにより、細胞補充療法に有用な低免疫原性万能性幹細胞株を産生するための手段を提供することを発見した。図４において明らかなように、本発明者らは、ＦＡＣＳによって評価した場合、このようなゲノム編集細胞が、ＷＴ ＨｕＥＳ９細胞と比べて低減したＭＨＣ−Ｉ発現を特徴とすることを実証した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの発現をモジュレートした幹細胞では、ＭＨＣ−Ｉ表面発現の低減または排除が観察された。特に、図４は、幹細胞における低い基底ＭＨＣ−Ｉ発現がＩＦＮ−γによって増加され得ることを明らかにし、ＩＦＮ−γ処理ＮＬＲＣ５−／−幹細胞では、ＭＨＣ−Ｉ表面発現の約５０％の低減が観察されたこと、およびＢ２Ｍ−／−幹細胞では、ＭＨＣ−Ｉ表面発現の完全喪失が観察されたことを証明している。
ＣＩＩＴＡの発現をモジュレートした後、ＭＨＣ−ＩＩ発現についても同様の結果が観察された。本発明者らは、ゲノム編集ＣＩＩＴＡ−／−幹細胞株をマクロファージ（これは、抗原提示細胞である）に分化させた。図５Ｃに表されているように、ＣＩＩＴＡ欠損幹細胞由来マクロファージはＭＨＣ−ＩＩ発現を欠いており、予想される表現型を明確に示している。特に、ＣＩＩＴＡ遺伝子の第１のコードエクソンをターゲティングすることによって（図１０Ａ〜１０Ｂ）、上記結果は、ＭＨＣ−ＩＩ発現が効率的に抑止され得ることを証明している。
次に、ヒト免疫系を用いて免疫不全マウスモデルを再構成することによって調製したヒト化マウスモデルにおいて、ゲノム編集細胞におけるＨＬＡ発現の低減の機能的結果を評価した（図６）。以下の表１に示されるように、遺伝子型および全コロニーにかかわらず、すべての場合に形成された同程度の数の奇形腫を屠殺しなければならなかった。同様に、奇形腫形成の失敗率の差異も観察されなかった。本発明者らは、奇形腫サンプルの全体的な形態をより厳密に精査したところ、ＭＨＣ−Ｉ発現のレベルと相関する明確な表現型を同定した。表面上のＭＨＣ−ＩはＮＬＲＣ５では低減、にＢ２Ｍでは欠如。図７は、得られた奇形腫型の定量を示す。さらに、図８Ａ〜図８Ｃは、野生型細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を実証しており、野生型奇形腫の免疫拒絶およびヒト化マウスモデルにおけるゲノム編集細胞の生着の改善を示唆している。
したがって、上記結果は、ＨｕＥＳ９およびＢＪ ＲｉＰＳＣにおけるＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍのターゲティングの成功を実証しており、ゲノム編集細胞が、ＨＬＡ発現の低減を特徴とする様々な異なる細胞型に分化し得ることをさらに証明している。
本発明者らは、ＴＡＬＥＮ系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の両方を使用して、ＨＬＡ発現の転写調節因子（すなわち、ＭＨＣエンハンセオソーム）のターゲティングを促進した。ＢＪ−ＲＩＰＳＣおよびＨｕＥＳ９におけるＴＡＬＥＮ誘導性ＣＩＩＴＡ変異およびＮＬＲＣ５変異を図１５Ａ〜Ｄに示す。加えて、ＣＲＩＳＰＲを利用してＮＬＲＣ５およびＣＩＩＴＡを標的として、ＭＨＣクラスＩ発現の低減およびＭＨＣクラスＩＩ発現の完全喪失をそれぞれ達成することもできる。
Ｔｈｐ１細胞において、ＣＲＩＳＰＲを使用してＮＬＲＣ５を標的としたところ、ＮＬＲＣ５−／−Ｔｈｐ１細胞ではＭＨＣ−Ｉ発現が低減していたことが実証された（図１６Ａ）。ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２ＭをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系および／またはＴＡＬＥＮ系の例を図１６Ｂに提供する。ＮＬＲＣ５ ＣＲＩＳＰＲまたはＢ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲを用いてターゲティングした後、ＨｕＥＳ９におけるＭＨＣクラスＩ発現の低減が示された。例えば、ＩＦＮγ処理ＮＬＲＣ５−／−細胞では、約５０％の低減が示され、Ｂ２Ｍ−／−細胞では、ＭＨＣ−Ｉ表面発現の完全喪失が示された（図１６Ｃ）。
２成分（例えば、二重ベクター）系を使用して、Ｔｈｐ−１のレンチウイルス形質導入を行った（図１６Ｄ）。２成分系は、Ｌｅｎｔｉ−Ｃａｓ９−ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎおよびＬｅｎｔｉ−Ｇｕｉｄｅ−ｐｕｒｏを含んでいた。Ｔｈｐ−１のレンチウイルス形質導入に使用した異なるＣＲＩＳＰＲの例を図１６Ｅに提供する。ＮＬＲＣ５およびＣＩＩＴＡをコードするレンチウイルスをＴｈｐ−１に形質導入した。Ｂ２Ｍ ＣＲＩＳＰＲを陽性対照として使用した。すべての細胞を５０Ｕ ＩＦＮγでＯＮ刺激して、ＨＬＡ発現を増強した（ＨＬＡ−Ａ２は１：２００であり、ＨＬＡ−ＤＲは１：１００であった）。ＣＩＩＴＡおよびＮＬＲＣ５は、それぞれＭＨＣ−ＩＩおよびＭＨＣ−Ｉに対して独立に作用することが実証された（図１６Ｆ）。ＣＲＩＳＰＲ形質導入の１０日後、Ｔｈｐ１細胞を５０Ｕ ＩＦＮγですべてＯＮ刺激したところ（ＨＬＡ−Ａ２は１：２００であり、ＨＬＡ−ＤＲは１：１００である）、ＩＲＦ１のターゲティングは、ＭＨＣ−ＩＩ発現の喪失をもたらすことが実証された（図１６Ｇ）。
本発明者らはさらに、ヒト多能性幹細胞（ＨｕＥＳ９）およびＴｈｐ−１細胞において、ＩＲＦ１のターゲティングおよびその結果として起こるＭＨＣクラスＩ発現の低減を調査した。ＩＲＦ１遺伝子座をターゲティングするための二重ＣＲＩＳＰＲ戦略を実証する概略図を図１７Ａに提供する。異なるＩＲＦ１ガイドの組み合わせの試験を行い（図１７Ｂ）、ＩＲＦ１の標的とした欠失のための「二重ガイド戦略」を示した（図１７Ｃ）。ＩＲＦ１の標的とした欠失のための二重ガイド戦略を適用した後、ＩＲＦ１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失の配列確認を提供し（図１７Ｄ）、続いて、ＩＲＦ１で標的としたＨｕＥＳ９細胞をスクリーニングした（図１７Ｅ）。ＰＣＲバンドの存在は、二重ＣＲＩＳＰＲ戦略を使用したターゲティングの成功を示唆している。
次いで、本発明者らは、ＩＲＦ１クローンを再確認（図１７Ｆ）および遺伝子型決定した（図１７Ｇ）。配列決定により、クローン１２（図１７Ｈ）、クローン１７（図１７Ｉ）およびクローン２１（図１７Ｊ）におけるＩＲＦ１ ＣＲＩＳＰＲ誘導性欠失が確認された。４８時間のＩＦＮγ処理後、ＩＲＦ１−／−ＨｕＥＳ９クローンは、ＭＨＣクラスＩ誘導の障害を示した（図１７Ｋ）。
本発明者らはまた、さらなるエンハンセオソーム成分のターゲティングを調査した。２９３Ｔ細胞におけるさらなるエンハンセオソーム成分をターゲティングすることによるＭＨＣ−Ｉ発現に対する影響を調査したが、これらのさらなるエンハンセオソーム成分のターゲティングは、それを実際に発現する細胞（例えば、Ｔｈｐ１細胞または他のＡＰＣ）におけるＭＨＣ−ＩＩレベルにも影響を与えると予想される。例えば、本発明者らは、二重ガイド戦略を使用して、２９３Ｔ細胞におけるＲＦＸ５（図１８Ａ）、ＲＦＸ−ＡＮＫ（図１８Ｃ）およびＲＦＫ−ＡＰ（図１８Ｇ）のＣＲＩＳＰＲターゲティングを調査した。ターゲティングの結果により、ＲＦＸ５（図１８Ｂ、図１８Ｅ〜１８Ｆ）、ＲＦＫ−ＡＮＫ（図１８Ｄ、図１８Ｅ〜Ｆ）およびＲＦＫ−ＡＰ（図１８Ｈ）のＭＨＣクラスＩ発現の低減が実証された。本発明者らはまた、２９３Ｔ細胞におけるＮＦＹ−Ａ（図１９Ａ）、ＮＦＹ−Ｂ（図１９Ｄ）およびＮＦＹ−Ｃ（図１９Ｂ）のＣＲＩＳＰＲ二重ガイドターゲティングを調査した。ターゲティングの結果により、ＮＦＹ−Ａ（図１９Ｃ）、ＮＦＹ−Ｂ（図１９Ｅ）およびＮＦＹ−Ｃ（図１９Ｃ）のＭＨＣクラスＩ発現の低減が実証された。
ＭＨＣクラスＩの表面輸送の遮断
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５９６２１号（これは、参照により本明細書に組み込まれ、図３２〜４０に示されている）では、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲを利用したＢ２Ｍのターゲティングの成功を以前に記載した。ＭＨＣクラスＩ分子の表面発現が低減または排除され、それにより、ＭＨＣ−Ｉ分子の表面輸送が遮断されることがさらに実証されている。例えば、Ｂ２Ｍ−／−ジャーカットＣａｓ９ Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ表面発現の喪失が、ジャーカットＣａｓ９ Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ表面発現と比較して示された（図３１）。
加えて、本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送は抑制され得るが、ＥＲ−常在性ペプチド輸送体であるＴＡＰ１遺伝子を破壊することを実証した。例えば、ＩＦＮγで４８時間処理した後、ＴＡＰ１ ＣＲＩＳＰＲ発現は、ジャーカット細胞（図２０Ａ）およびジャーカットＴ細胞（図２０Ｂ）におけるＭＨＣ−Ｉ表面発現を低減する。ジャーカット（Ｃａｓ９）Ｔ細胞におけるＨＬＡ表面発現を排除し得ることがさらに実証された（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。ジャーカットＴ細胞は、急性Ｔ細胞白血病を有する１４歳の少年の末梢血から樹立した。
ＨＬＡ Ｒａｚｏｒ
本発明者らは、ＨＬＡ遺伝子における保存領域をターゲティングすることによって、すべてのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の同時欠失を可能にするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを調査した。ＭＨＣクラスＩ遺伝子における同じ保存領域を標的とするＴＡＬＥＮペアのガイドも同定した。保存領域を標的とする任意のガイドは、ＨＬＡ Ｒａｚｏｒとして同定または分類され得る。ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮＳによる、すべてのＨＬＡに見出される保存配列のターゲティングを図２１Ａで実証した。２つの紫色の囲み枠は、ｐａｎ−ＨＬＡ ＴＡＬＥＮペアの結合部位を示す。青色の矢印は、試験したｐａｎ−ＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲペアを示し、ＰＡＭは、青色で囲まれている。トランスフェクションの７２時間後の２９３Ｔ細胞およびＨｕＥＳ９細胞におけるｐａｎ−ＨＬＡ−ＴＡＬＥＮの発現を図２１Ｂに示した。図２１Ｃで実証されているように、ＨＬＡ−Ｒａｚｏｒ ＣＲＩＳＰＲは、２９３Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を弱める。また、Ｃａｓ９−ＧＦＰを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。図２１Ｄは、ＨＬＡの２つの異なる保存領域をターゲティングする２つの異なるＨＬＡ Ｒａｚｏｒの活性の比較を提供する。
ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇのノックイン
本発明者は、免疫拒絶を能動的に阻害するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＡＡＶＳ１遺伝子座への寛容原性因子（例えば、表２に示されている寛容原性因子）の挿入を促進した。図１１Ａ〜１１Ｃで明らかなように、ＡＡＶＳ１遺伝子座から寛容原性因子（例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇ）を発現させることに成功した。
ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇノックイン戦略の概略図を図２２Ａに示す。クローンスクリーニングのための野生型（ＷＴ）およびノックイン（ＫＩ）プライマーを設計した。ＷＴプライマーを有するアンプリコンは４８８ｂｐと予測され、ＫＩプライマーを有するアンプリコンは４０３ｂｐおよび９１５ｂｐと予測される。ノックインドナープラスミドの設計（図２２Ｂ）は、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−ＧのリーディングフレームがＴ２Ａによって連結され、それらの発現がＣＡＧＧＳプロモーターによって駆動されることを示す。ＳＡ−２Ａ遺伝子トラップエレメントの後に、ピューロマイシンを薬物耐性マーカーとして使用した。
ドナープラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇの発現をＦＡＣＳ分析によって調査した。図２２Ｃは、２９３Ｔ細胞における異所性ＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−Ｇ発現を示す。ＡＰＣ結合体化ＰＤ−Ｌ１抗体およびＦＩＴＣ結合体化ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用した。加えて、ＪＥＧ−３細胞における異所性ＨＬＡ−Ｇの発現を図２２Ｄに示す。ドナープラスミドをＨＬＡ−Ｇ−／−ＪＥＧ−３細胞株にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に、異所性ＨＬＡ−Ｇ発現をＦＡＣＳ分析によって調査した。ＰＥ結合体化ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＭＥＭ／Ｇ９）を使用して、表面ＨＬＡ−Ｇ表面発現を検出した。
ＰＣＲスクリーニングを実施して、クローン１ＧがＰＤ−Ｌ１／ＨＬＡ−Ｇのヘテロ接合ＫＩクローンであったことを確認した（図２２Ｅ）。ＷＴプライマーおよびＫＩ特異的プライマーの両方を使用して標的としたＨｕＥＳ８のゲノムＤＮＡから増幅されたバンドの存在によって、クローン１Ｇは、ヘテロ接合ＫＩクローンとして同定された。ＡＰＣ結合体化ＰＤ−Ｌ１抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって、ＨｕＥＳ８ ＫＩクローン１Ｇにおいて、ＰＤ−Ｌ１の発現を検証した（図２２Ｆ）。
ＣＤ−４７のノックイン
加えて、ＣＤ４７ノックイン戦略も調査した。ヒトＣＤ４７を、ＣＡＧプロモーターによって駆動される発現プラスミド（これは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰも含有していた）にクローニングした。２９３Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４７（ヒト「ドント・イート・ミー」シグナル）（これは、マクロファージによる細胞の貪食を防止する）を既に発現する。ＣＤ４７特異的抗体を使用したＦＡＣＳによって検出した場合、２９３Ｔ細胞およびヒト多能性幹細胞（ＨｕＥＳ９）の両方において、発現は、ＣＤ４７の過剰発現によって増加され得る（図２３）。ＣＤ４７の過剰発現は、マクロファージ貪食から細胞を保護することによって、幹細胞由来移植物の生着を支援する。
万能性ドナー細胞において改変すべきさらなる標的
万能性ドナー細胞を特定の用途に合わせるために、それらにおいてさらなる標的を改変し得る。例えば、万能性ドナー細胞を万能性ＣＡＲ Ｔ細胞としての使用に合わせるために、それらにおいてさらなる標的を改変し得る。一例では、本発明者らは、ＨｕＥＳ９におけるＴＲＡＣおよびＴＲＢＣを欠失させて、ＴＣＲ発現を破壊した（図２４）。二重ガイドＲＮＡアプローチを使用して、欠失をＨｕＥＳ９細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座およびＴＲＢＣ遺伝子座に導入した。ＴＣＲＡ野生型バンドは２４９ｂｐであり、欠失後には２０９ｂｐである。ＴＣＲＢ野生型バンドは１６２ｂｐであり、欠失後には１４０ｂｐである。本発明者らはさらに、ＨｕＥＳ９ Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−におけるＴＣＲＡを標的として、Ｂ２Ｍ−／−、ＣＩＩＴＡ−／−およびＴＣＲ−／−のトリプルノックアウト幹細胞株（これは、Ｔ細胞に分化すると、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩを欠き、ＴＣＲ表面発現を示さない）を創製した。
別の例では、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１を標的とした（図２５Ａ）。Ｃｄ２７４／Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＣＲＩＳＰＲは、がん免疫療法において寛容を破壊するのに非常に有用であったことが判明した。ＪＥＧ−３（絨毛癌細胞株）を含む複数の細胞型において、および２つのメラノーマ細胞株（５０１およびＭａｌＭｅ）において、ＰＤ−Ｌ１ノックアウトが実証された（図２５Ｂ〜２５Ｄ）。標的としたＢ７−Ｈ１コロニーのスクリーニングを行ったところ、ＪＥＧ−３細胞におけるＣＲＩＳＰＲ切断効率が８．３％であったことが判明した（図２５Ｂ）。加えて、５０１メラノーマノックアウトクローンの再確認を図２５Ｃに示した。ＭａｌＭｅメラノーマノックアウトクローンの再確認を図２５Ｄに示した。
共阻害因子／共刺激受容体またはそれらのリガンドのターゲティング
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲを利用して、複数の標的を調査した。Ｔ細胞上の共刺激／阻害分子およびそれらの受容体の説明図を図２６Ａに提供する。調査した各標的について、示されている４つのＣＲＩＳＰＲをクローニングし、２９３Ｔ細胞におけるオンターゲット活性について試験した。両ＣＲＩＳＰＲの切断が起こった場合のＰＣＲバンドの予想サイズは、個々の各ゲル画像の下に示されている（図２６Ｂ〜２６Ｐ）。ＴＩＧＩＴ（図２６Ｂ）、ＴＩＭ３（図２６Ｃ）、ＨＶＥＭ（図２６Ｄ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４（図２６Ｅ）、ＣＤ２８（図２６Ｆ）、ＯＸ４０（図２６Ｇ）、Ｂ７１（図２６Ｈ）、ＣＤ２２６（図２６Ｉ）、ＣＤ２（図２６Ｊ）、ＬＡＧ３（図２６Ｋ）、ＢＴＬＡ（図２６Ｌ）、ＩＣＯＳ（図２６Ｍ）、ＣＤ２７（図２６Ｎ）、ＳＴ２（図２６Ｏ）およびＧＩＴＲ（図２６Ｐ）について、２９３Ｔ細胞における二重ガイドターゲティングが実証された。
Ｂ７−Ｈ３のＣＲＩＳＰＲターゲティングをＪＥＧ−３細胞において調査した（図３０Ａ〜３０Ｄ）。図３０Ｂは、ＪＥＧ−３細胞における標的としたＢ７−Ｈ３コロニーのスクリーニングを示しており、ＣＲＩＳＰＲ切断効率が１５／８０、すなわち約１８．７％であることを示す。配列決定によるＢ７−Ｈ３ノックアウトの確認を実施し（図３０Ｃ）、標的としたＪｅｇ３クローンにおけるＢ７−Ｈ３表面発現の喪失を図３０Ｄに提供した。
改変胚性幹細胞の分化
改変胚性幹細胞は、ＨＬＡ発現が低減または欠如した様々な異なる細胞型に分化し得る（図２８Ａ）。このような細胞型の例としては、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、低免疫原性心筋細胞、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、肝細胞、β細胞（例えば、膵臓β細胞）または神経前駆細胞（ＮＰＣ）が挙げられる。
最初に、図２８Ｂにおいて、本発明者らは、ＮＬＲＣ５−／−ヒトＥＳ細胞におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を実証した。幹細胞では、低い基底ＭＨＣ−Ｉ発現が見られたが、発現は、ＩＦＮγ刺激によって増加され得る。ＩＦＮγ処理ＮＬＲＣ５−／−細胞では、約５０％低減している。
次いで、本発明者らは、様々な分化細胞型におけるＭＨＣ−Ｉ発現を調査した。例えば、図２８Ｃは、ＮＬＲＣ５−／−ヒト間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。図２８Ｃに含まれるグラフは、ＨｕＥＳ９細胞およびＭＰＣ細胞におけるＭＨＣ−Ｉ発現の差異を実証する。図２８Ｄは、幹細胞由来ＮＬＲＣ５−／−内皮細胞（ＥＣ）におけるＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示す。ＥＣに関する同様の分化効率を図２８Ｅに示し、Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＥＣにおけるＨＬＡ発現の喪失を図２８Ｆに示した。次に、ＮＬＲＣ５−／−肝細胞様細胞（ＨＬＣ）におけるＭＨＣクラスＩ発現の低減を提供した（図２８Ｇ）。ＨＬＣは、ＢＪ−ＲＩＰＳＣから生じた。
図２８Ｈでは、ＣＩＩＴＡの変異は、ｈＥＳＣ由来マクロファージにおけるＭＨＣクラスＩＩ発現を抑止することが示されている。加えて、神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、胚性幹細胞から分化する（図２８Ｉ）。Ｂ２Ｍ−／−ＣＩＩＴＡ−／−ＨｕＥＳ９細胞は、分化の結果としてネスチン＋神経ロゼットを形成することが示された（図中の白色の矢印）。最後に、本発明者らは、β細胞分化に利用するために、改変胚性幹細胞をスピン培養に適合させた（図２８Ｊ）。
インビボデータ
最後に、本発明者らは、「低免疫原性」ＤＫＯ細胞株を作製した（図２９Ａ）。調査した細胞株は、ＷＴ ＨｕＥＳ９細胞、ＮＬＲＣ５−／−Ｃ２ＴＡ−／−ＨｕＥＳ９細胞およびＢ２Ｍ−／−Ｃ２ＴＡ−／−ＨｕＥＳ９細胞であった。異なる細胞株が、異なるレベルのＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ発現を示した（図２９Ａ）。例えば、ＷＴ ＨｕＥＳ９細胞は、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩの発現を示した。ＮＬＲＣ５−／−Ｃ２ＴＡ−／−ＨｕＥＳ９細胞は、ＭＨＣ−Ｉ発現の低減を示し、ＭＨＣ−ＩＩ発現を示さなかった。Ｂ２Ｍ−／−Ｃ２ＴＡ−／−ＨｕＥＳ９細胞は、ＭＨＣ−Ｉ発現およびＭＨＣ−ＩＩ発現を示さなかった。次いで、これらの細胞株をヒト化マウスにおいて調査したところ、ヒト化マウスにおけるゲノム編集幹細胞の生着の改善が示された（図２９Ｂ）。

Claims (112)

  1. 野生型幹細胞と比べて、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現を含む、幹細胞。
  2. 野生型幹細胞と比べて、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現を含む、幹細胞であって、低免疫原性幹細胞が前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失されたＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子をさらに含む、幹細胞。
  3. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現が、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現低減を含む、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  4. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現が、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現阻害を含む、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  5. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現が、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現の妨害を含む、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  6. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失された前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を含む、請求項１に記載の幹細胞。
  7. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子が、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍからなる群より選択される、請求項６に記載の幹細胞。
  8. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＮＬＲＣ５を含む、請求項６に記載の幹細胞。
  9. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＣＩＩＴＡを含む、請求項６に記載の幹細胞。
  10. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＢ２Ｍを含む、請求項６に記載の幹細胞。
  11. 野生型幹細胞と比べて、１つまたはそれを超える寛容原性因子のモジュレートされた発現をさらに含む、請求項１に記載の幹細胞。
  12. 前記寛容原性因子の前記モジュレートされた発現が、前記寛容原性因子の発現の増加を含む、請求項１１に記載の幹細胞。
  13. 前記寛容原性因子が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている、請求項１１に記載の幹細胞。
  14. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項１１に記載の幹細胞。
  15. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項１１に記載の幹細胞。
  16. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項１１に記載の幹細胞。
  17. 胚性幹細胞である、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  18. 多能性幹細胞である、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  19. 低免疫原性である、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  20. ヒト幹細胞である、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  21. ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの１つまたはそれよりも多くを発現しない、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  22. ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くを発現しない、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  23. 野生型幹細胞と比べて、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くにおいて発現が低減している、請求項１〜２に記載の幹細胞。
  24. 野生型ヒト幹細胞と比べて、１つまたはそれを超える寛容原性因子のモジュレートされた発現を含む、幹細胞。
  25. 前記寛容原性因子のモジュレートされた発現が、前記寛容原性因子の発現の増加を含む、請求項２４に記載の幹細胞。
  26. 前記寛容原性因子が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている、請求項２４に記載の幹細胞。
  27. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項２６に記載の幹細胞。
  28. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項２４に記載の幹細胞。
  29. 胚性幹細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
  30. 多能性幹細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
  31. 低免疫原性である、請求項２４に記載の幹細胞。
  32. ヒト幹細胞である、請求項２４に記載の幹細胞。
  33. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項２４に記載の幹細胞。
  34. 野生型幹細胞と比べて、１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原のモジュレートされた発現をさらに含む、請求項２４に記載の幹細胞。
  35. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の前記モジュレートされた発現が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失されたＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を含む、請求項３４に記載の幹細胞。
  36. 前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失されたＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子をさらに含む、請求項２４に記載の幹細胞。
  37. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子が、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍからなる群より選択される、請求項３５〜３６に記載の幹細胞。
  38. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＮＬＲＣ５を含む、請求項３５〜３６に記載の幹細胞。
  39. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＣＩＩＴＡを含む、請求項３５〜３６に記載の幹細胞。
  40. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＢ２Ｍを含む、請求項３５〜３６に記載の幹細胞。
  41. ＮＬＲＣ５を発現しない、ヒト幹細胞。
  42. ＮＬＲＣ５−／−ノックアウト幹細胞である、請求項４１に記載の細胞。
  43. ＣＩＩＴＡを発現しない、ヒト幹細胞。
  44. ＣＩＩＴＡ−／−ノックアウト幹細胞である、請求項４３に記載の細胞。
  45. Ｂ２Ｍを発現しない、ヒト幹細胞。
  46. Ｂ２Ｍ−／−ノックアウト幹細胞である、請求項４５に記載の細胞。
  47. ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの１つまたはそれよりも多くを発現しない、ヒト幹細胞。
  48. ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くを発現しない、ヒト幹細胞。
  49. １つまたはそれを超える寛容原性因子を発現する、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  50. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項４９に記載の細胞。
  51. 前記寛容原性因子が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている、請求項４９に記載の細胞。
  52. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項５１に記載の細胞。
  53. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項５１に記載の細胞。
  54. 胚性幹細胞である、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  55. 多能性幹細胞である、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  56. 低免疫原性である、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  57. 野生型ヒト幹細胞と比べてＭＨＣ−Ｉの発現が低減している、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  58. 野生型ヒト幹細胞と比べてＭＨＣ−ＩＩの発現が低減している、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  59. 野生型ヒト幹細胞と比べてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くにおいて発現が低減している、請求項４１〜４８に記載の細胞。
  60. 細胞補充療法のために請求項４１〜４８に記載の細胞を使用する、方法。
  61. 前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている１つまたはそれを超える寛容原性因子を含むヒト幹細胞。
  62. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項６１に記載の細胞。
  63. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項６１に記載の細胞。
  64. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項６１に記載の細胞。
  65. ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍの１つまたはそれよりも多くを発現しない、請求項６１に記載の細胞。
  66. ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くを発現しない、請求項６１に記載の細胞。
  67. 野生型ヒト幹細胞と比べて、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの１つまたはそれよりも多くにおいて発現が低減している、請求項６１に記載の細胞。
  68. 低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、幹細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートし、それにより、前記低免疫原性幹細胞を調製することを含む、方法。
  69. 幹細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートする方法であって、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させ、それにより、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることを含む、方法。
  70. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現を前記モジュレートすることが、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現を低減することを含む、請求項６８〜６９に記載の方法。
  71. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることが、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現を阻害することを含む、請求項６８〜６９に記載の方法。
  72. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることが、前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現を妨害することを含む、請求項６８〜６９に記載の方法。
  73. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることが、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることを含む、請求項６８に記載の方法。
  74. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子が、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍからなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＮＬＲＣ５を含む、請求項７３に記載の方法。
  76. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＣＩＩＴＡを含む、請求項７３に記載の方法。
  77. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＢ２Ｍを含む、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記幹細胞による１つまたはそれを超える寛容原性因子の発現をモジュレートすることをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
  79. 前記寛容原性因子の発現をモジュレートすることが、前記寛容原性因子の発現を増加させることを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記寛容原性因子が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項７８に記載の方法。
  82. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項７８に記載の方法。
  83. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
  84. 低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、前記幹細胞によって１つまたはそれを超える寛容原性因子の発現をモジュレートし、それにより、前記低免疫原性幹細胞を調製することを含む、方法。
  85. 前記寛容原性因子の発現をモジュレートすることが、前記寛容原性因子の発現を増加させることを含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記寛容原性因子が、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入されている、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記セーフハーバー遺伝子座がＡＡＶＳ１遺伝子座を含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記寛容原性因子が免疫拒絶を阻害する、請求項８４に記載の方法。
  89. 前記寛容原性因子は、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃ１阻害因子およびＩＬ−３５からなる群より選択される、請求項８４に記載の方法。
  90. 前記細胞による１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
  91. 前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−Ｉヒト白血球抗原およびＭＨＣ−ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートすることが、前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることを含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの１つまたはそれを超える転写調節因子をコードする１つまたはそれを超える遺伝子を欠失させることをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
  93. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子が、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡおよびＢ２Ｍからなる群より選択される、請求項９１〜９２に記載の方法。
  94. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＮＬＲＣ５を含む、請求項９１〜９２に記載の方法。
  95. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＣＩＩＴＡを含む、請求項９１〜９２に記載の方法。
  96. ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの前記転写調節因子がＢ２Ｍを含む、請求項９１〜９２に記載の方法。
  97. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＮＬＲＣ５遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  98. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  99. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、Ｂ２Ｍ遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  100. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、
    （ａ）ＮＬＲＣ５遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第１のゲノム改変；
    （ｂ）ＣＩＩＴＡ遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第２のゲノム改変；ならびに／または
    （ｃ）Ｂ２Ｍ遺伝子が、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸とを接触させることによって、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されている第３のゲノム改変
    を含む低免疫原性幹細胞。
  101. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＮＬＲＣ５遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  102. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  103. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、Ｂ２Ｍ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変を含む、低免疫原性幹細胞。
  104. 改変ゲノムを含む低免疫原性幹細胞であって、
    （ａ）ＮＬＲＣ５遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第１のゲノム改変；
    （ｂ）ＣＩＩＴＡ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第２のゲノム改変；ならびに／または
    （ｃ）Ｂ２Ｍ遺伝子が、第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡを欠失させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように編集されており、ここで、前記第１の連続した一続きのゲノムＤＮＡが、前記細胞と、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させることによって欠失されている第３のゲノム改変を含む
    低免疫原性幹細胞。
  105. 幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＮＬＲＣ５遺伝子を編集することを含む、低免疫原性幹細胞を産生するための方法。
  106. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集することを含む、方法。
  107. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記Ｂ２Ｍ遺伝子を編集することを含む、方法。
  108. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、
    （ａ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第１のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＮＬＲＣ５遺伝子を編集すること；
    （ｂ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第２のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集すること；ならびに／または
    （ｃ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有するリボ核酸の第３のペアとを接触させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記Ｂ２Ｍ遺伝子を編集すること
    を含む、方法。
  109. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＮＬＲＣ５遺伝子を編集することを含む、方法。
  110. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集することを含む、方法。
  111. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記Ｂ２Ｍ遺伝子を編集することを含む、方法。
  112. 低免疫原性幹細胞を産生するための方法であって、
    （ａ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号３６３５３〜８１２３９からなる群より選択される配列を有する第１のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＮＬＲＣ５表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＮＬＲＣ５遺伝子を編集すること；
    （ｂ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号５１８４〜３６３５２からなる群より選択される配列を有する第２のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＣＩＩＴＡ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を編集すること；ならびに／または
    （ｃ）幹細胞と、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、および配列番号８１２４０〜８５６４４からなる群より選択される配列を有する第３のリボ核酸とを接触させ、それにより、前記細胞におけるＢ２Ｍ表面発現および／または活性を低減または排除するように前記Ｂ２Ｍ遺伝子を編集すること
    を含む、方法。

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