FR2501232A1 - Polysaccharides doues d'activite anti-carcinogene et leur procede de production - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A TRAIT AU DOMAINE DE LA CHIMIE MEDICALE. ELLE CONCERNE UN B-1,3-GLUCANE NOUVEAU DE HAUT POIDS MOLECULAIRE COMPOSE DE MOTIFS REPETES DE GLUCOPYRANNOSE REPRESENTES CHACUN PAR LA FORMULE: (CF DESSIN DANS BOPI) ELLE CONCERNE EGALEMENT LA PRODUCTION DE CE COMPOSE A PARTIR D'UNE SOUCHE DE PSEUDOPLECTANIA NIGRELLA (PERS.) FUCKEL K-1426 (FERM-P 5803, ATCC 20609). LE B-1,3-GLUCANE DE L'INVENTION EST UN POLYSACCHARIDE DOUE D'ACTIVITE ANTICARCINOGENE.

Description

i La présente invention concerne des polysaccharides doués d'activité

anticarcinogène, ainsi qu'un procédé

permettant de les obtenir.

L'invention a plus particulièrement trait à un -1,3-glucane nouveau doué d'une excellente activité anticarcinogène et à un procédé de production de ce composé

à partir d'un extrait du mycélium et/ou des fructifica-

tions d'une souche qui est capable de produire un poly-

saccharide anticarcinogène et qui appartient au genre Pseudoplectania, tribu des Sarcomateae, famille des Sarcomataceae sous-ordre des Sarcoscyphineae, ordre des Pezizales, classe des' Discomycetes de la subdivision des Ascomycotinia, ou d'un milieu de culture dans lequel ladite

souche a été incubée.

Le P-1,3-glucane de l'invention est un poly-

saccharide nouveau de haut poids moléculaire qui est composé de motifs glucopyrannose répétés ae la fornle (I) suivante: O-D-GluX (I)

16

3)-D-Glu (1-3)g-D-Glu(l 3)0-D-Glu(l +

o "Glu" représente le résidu de glucopyrannose.

Le -1,3-glucane de la présente invention déploie une grande activité anticarcinogène non seulement contre une tumeur allogénique, mais aussi contre une tumeur syngénique contre laquelle aucune activité de ce genre n'a été rapportée en relation avec des -l,3-glucanes classiques. En outre, ce P -1,3-glucane déploie aussi

une forte activité anticarcinogène contre la tumeur allo-

génique "Sarcome-180" chez des souris C3H/He, qui sont

connues pour leur faible réponse immunitaire.

On connaissait jusqu'ici quelques travaux de

recherche dans lesquels la structure chimique du 9-1,3-

glucane anticarcinogène avait été commentée. On les men-

tionne ci-après: (1) Schizophyllane: Il s'agit du f-l,3-glucane qui est élaboré par Schizophyllum commune (Fries.) (Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 44, 337-342, 1970; ibid.45,

162-168, 1971). Sa structure chimique (comme motif récur-

rent) proposée dans cette publication est la suivante: P-D-Glu1( 3)p-DGlu6(1-3)p-D-Glu(1-3)p-D-Glu(l (2) Il s'agit du -1,3-glucane qui est élaboré par le

genre Auricularia appartenant à la classe des Basidiomycetes.

(brevet japonais N 63012/1979). Sa structure chimique (comme motif récurrent) proposée dans ledit brevet est la suivante: P--D-Glu P-D-Glu 16 '6 i) 3)p-D-Glu (1-3)P-D-Glu (1-3)p-D--Glu(l (3) Lentinane: Il s'agit du P-1,3-glucane qui est élaboré par Lentinus edodes (Berk.) Singer. (Nature 222, 687-688, 1969; Carbohydr. Research 47, 99-104, 1976; "Gan to

Menekizokyo" édité par Goro Chihara (publié par Kodan-

sha, Tokyo, Japon), 1980. Sa structure chimique proposée dans ces publications est la suivante: P-D-Glul p--Glul

16 16

3)p-D-Glu (-3)p-D-l(1-3)p-D-Glu (1-3)p-D-Glu(1-3)p-D-Glu(l Ces p-1,3glucanes connus et le P-1,3-glucane de la présente invention ont pour point commun de posséder une chaîne linéaire de motifs D-glucopyrannose en liaison

1--(1,3) et une ou plusieurs chaînes latérales de D-gluco-

pyrannose- en liaison P-(1,6). Toutefois, comme il ressort

de la comparaison de la formule (I) avec les formules -

(II), (III) et (IV), le P-1,3-glucane de l'invention diffère des P-1,3glucanes connus dans le rapport du

nombre de liaisons t-1,3 au nombre de liaisons ramifiées P-1,6.

Ainsi, le P-1,3-glucane de l'invention est un composé

nouveau qui diffère par sa structure chimique des P-1,3-

glucanes connus. En outre, le p-1,3-glucane de l'invention déploie une forte activité anticarcinogène non seulement contre une tumeur allogénique,mais aussi contre une tumeur syngénique. Jusqu'ici, aucun p-1, 3-glucane qui déploie une forte activité anticarcinogène contre une tumeur syngénique n'avait été rapporté. De plus, le P-1,3-glucane

de l'invention déploie aussi une forte activité anticar-

cinogène contre la tumeur allogénique "Sarcome-180" chez des souris C3H/He, qui sont connues pour leur faible réponse immunitaire. Par conséquent, on s'attend à ce que le P-1,3-glucane de l'invention soit plus efficace que

les p-1,3-glucanes connus en tant que médicament immuno-

thérapeutique contre le cancer.

La structure chimique et les propriétés du W-1,3-

glucane de l'invention sont les suivantes: (1) Structure chimique: La structure chimique (comme motif récurrent) de ce M-1,3-glucane correspond à la formule (I), qui a été confirmée par les expériences suivantes: (A) Un traitement de ce polysaccharide avec l'exo- p-1,3-glucanase dérivée du micro-organisme Basidiomycetes QM 806 donne du D-glucose et du gentiobiose et leur rapport molaire est égal

à 1:0,8 lorsqu'il est déterminé par chromato-

graphie sur gel "Bio-gel P-2".

(B) Un traitement par méthylation de ce poly-

saccharide par le procédé de Hakomori suivi

d'une hydrolyse donne du 2,3,4,6-tétra-O-

méthyl-D-glucose, du 2,4,6-tri-O-méthyl-D-

glucose et du 2,4-di-O-méthyl-D-glucose identifiés par chromatographie sur papier, chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse et leur proportion molaire respective est de

0,8:1:0,8.

(C) L'oxydation par un periodate (periodate 0,05M) de ce polysaccharide consomme 0,667 mole de periodate par motif d'anhydroglucose avec libération concomitante de 0,344 mole d'acide formique. (D) Un traitement par dégradation de Smith du produit oxydé ci-dessus donne du glycérol et

du glucose dans un rapport molaire de 1:2,1.

(E) Un traitement par hydrolyse dans des condi-

tions douces (avec de l'acide sulfurique 0,03M) du produit oxydé cidessus qui est réduit ensuite donne du glycérol et une matière insoluble dans l'eau, et une méthylation suivie d'une hydrolyse de cette matière insoluble dans l'eau donne

uniquement du 2,4,6-tri-O-méthyl-D-glucose.

(F) Un traitement par hydrolyse dans des conditions douces (avec de l'acide sulfurique 0,03M) de ce polysaccharide donne du D-glucose et une matière insoluble dans l'eau. Par ailleurs, un traitement de cette matière insoluble dans l'eau avec l'exo-P-1,3-glucanase décrite ci-dessus

donne uniquement du D-glucose.

Il ressort de ces résultats que le polysaccharide de la présente invention est un P-1,3-glucane qui comporte des motifs glucopyrannose récurrents comme représenté par la formule p-D-Glu

16

33)-D-Glu (l-3)p-D-Glu(l 3)p-D-Glu(l o il y a une chaîne linéaire de motifs D-glucopyrannose liés en p-(1,3) avec des motifs D-glucopyranose ramifiés et liés en P-(1,6) (chaque ramification étant un simple

motif D-glucopyrannose). dans le rapport de 9:4.

(2) Analyse élémentaire:

C: 43,88 %

H: 6,18 %

(3) Poids moléculaire: Plus de 2,5 x 105 (méthode de filtration sur gel) (4) Point de fusion: Cette substance n'a pas de point de fusion bien défini et elle est carbonisée lorsqu'on la chauffe forte- ment. (5) Rotation spécifique: 2725 = +35 (NaOH 0,5N, C = 0,5 %) (6) Viscosité intrinsèque:

_ 7 = 20 - 25

La viscosité intrinsèque est définie par la formule suivante: _ = lim ns 5p/C c -.o ?sp =<( T - no) 0 = q: Viscosité de la solution (NaCl 0,1M, 30 C)

fo0: Viscosité du solvant.

c: nombre de grammes de substance dans 100 ml

de solution.

(7) Spectre ultraviolet:

Absorption terminale.

(8) Spectre infrarouge: Cette substance présente une bande à 890 cm 1,

ce qui indique la présence de la liaison P-glycosidique.

(9) Solubilité: Cette substance est soluble dans l'eau, dans NaOH 0,5N et dans le diméthylsulfoxydemais insoluble dans l'éther de pétrole, l'éther, l'acétone, le benzène, l'éthanol et le méthanol, etc. (10) Réaction colorée: Cette substance montre une réaction positive au réactif de Molish et au réactif à l'anthrone,mais elle montre une réaction négative au réactif à l'iode et à l'amidon, au réactif de Bial, au réactif Carbasol-H2SO4,

au réactif à la ninhydrine et au réactif d'Elson-Morgan.

(11) pH de la solution: Neutre (12) Aspect: Poudre blanche (13) Composant sucre: Cette substance est uniquement composée de

D-glucose (confirmé par chromatographie sur papier, chro-

matographie sur couche mince, chromatographie en phases

gazeuse et liquide et par la méthode à la g!tcoseooxydase).

Comme décrit ci-dessus, le P-1,3-glucane de la présente invention est un D-1,3-glucane nouveau dont la structure correspond à la formule (I) et qui possède les

propriétés physico-chimiques (2) - (13).

Le P-1,3-glucane de la présente invention est

doué d'activité anticarcinogène. L'activité anticarci-

nogène du P-1,3-glucane nouveau (tel qu'obtenu dans l'exemple 3) a étéconfirmée et déterminée par des méthodes classiques sauf spécification contraire précisée dans

chaque mode opératoire expérimental, comme indiqué ci-

après.

Expérience (1) L'activité anticarcinogène du P-1,3-glucane de la présente invention contre le sarcome-180 chez des souris ICR a été déterminée. Les résultats sont reproduits sur le tableau I.

TABLEAU I

Dose mg/kg/jour 0,2 2,0 ,0 Cellule tumorale: Nombre de cellules transplantées Souche animale: Traitement taux d'inhibition (%) ,0 ,0 83,3 Régression complète 3/5 /5 3/5 sarcome-180 4 x 106/souris ICR $ Administration intrapéritonéale à

compter du lendemain de la transplanta-

tion et administration subséquente fois tous les 2 jours (témoin:

solution de sel).

Détermination: Le poids de tumeurs de type solide a été

mesuré quatre semaines après la trans-

plantation. Taux d'inhibition: / (C - T)/C/7 x 100 C: Poids moyen de tumeurs prélevées sur

le groupe témoin.

T: Poids moyen de tumeurs prélevées sur

le groupe traité au P-1,3-glucane.

Expérience (2) L'activité anticarcinogène du P-1,3-glucane de la présente invention contre le sarcome-180 chez des souris C3H/He, contre le carcinome d'Ehrlich chez des souris ICR et contre le fibrosarcome Meth-A chez des

souris BALB/c a été déterminée.

Les résultats sont reproduits sur les tableaux,

II, III et IV.

TABLEAU II

Dose mg/kg/jour 2,0 ,0 ,0 Cellule tumorale Nombre de cellule transplantées Souche animale Traitement Détermination Taux d'inhibition (%) 44,2 82,5 ,3 sarcome-180 Régression complète 0/5 2/5 2/5 4 x 106/souris C3H/He $ Administration intrapéritonéale a

compter du lendemain de la transplan-

tation et administration subséquente dix fois tous les deux jours (témoin:

solution de sel).

Le poids de tumeurs de type solide a

été mesuré cinq semaines après la trans-

plantation. Taux d'inhibition = / _(C - T)/C_7 x 100 : Poids moyen de tumeurs prélevées sur

le groupe témoin.

T: Poids moyen de tumeurs prélevées

sur le groupe traité au P-1,3-

glucane.

TABLEAU III

Dose mg/kg/jour 0,06 0,60 6,00 Cellule tumorale Nombre de cellule transplantées Souche animale Traitement Détermination Détermination Taux d'inhibition (%) ,3 ,0 92,4 Carcinome de Ehrlich Régression complète 1/5 /5 4/5 : 4 x 106/souris

: ICR $

: Administration par voie intrapéritornéale

à partir du lendemain de la transplan-

tation et administration subséquente huit foi.s tous les deux jours (témoin:

solution de sel).

: Le poids de tumeurs de type solide a

été mesuré cinq semaines après la trans-

plantation. Taux d'inhibition = /(C - T)/C_7 x 100 : Poids moyen de tumeurs prélevées

sur le groupe témoin.

: Poids moyen de tumeurs prélevées

sur le groupe traité au -1,3-

glucane.

TABLEAU IV

Dose -

mg/kg/jour 0,2 2,0 ,0 Cellule tumorale: Nombre de cellules transplantées Souche animale: Traitement Taux d'inhibition (%) 84,2 ,0 53,8 Fibrosarcome Meth-A Régression complète 3/5 /5 2/5 1 x 105/souris BALB/c $ Administration intratumorale à partir du lendemain de la transplantation et 250 12k2 Détermination administration subséquente dix fois, un jour sur deux (témoin: solution de sel) Le poids de tumeurs de type solide a été mesuré cinq semaines après la transplantation. Taux d'inhibition = / (C T)/C_7 x 100 : Poids moyen de tumeurs prélevées sur

le groupe témoin.

: Poids moyen de tumeurs prélevées sur

le groupe traité au A-1,3-glucane.

Expérience (3) L'activité anticarcinogène du >-1,3-glucane de l'invention contre la tumeur i'ascite d'Ehrlich chez

des souris ICR a été déterminée.

Le résultat est reproduit sur le tableau V.

TABLEAU V

Dose mg/kg/jour témoin 0,24 1,20 6,10 Cellule tumorale: ce r _ A _a r1 1.1 D 4j J I Survie moyenne Nombre de survivants (jours) par groupe

13,3 0/5

,2 0/5

23,2 0/5

> 31,4 3/5

Tumeur d'ascite d'Ehrlich transplantées:5 x 10 /souris Souche animale: ICR $ Traitement:Administration intrapéritonéale à

compter du lendemain de la transplanta-

tion et administration subséquente dix fois chaque jour (témoin: solution

de sel).

Détermination: Les nombres de souris survivantes et les nombres de jours de survie de chaque groupe ont été déterminés sept semaines

après la transplantation.

Comme le font apparaître les expériences (1) -

(3) ci-dessus, le P-1,3-glucane de l'invention déploie I une forte activité anticarcinogène non seulement contre la tumeur allogénique "sarcome-180" chez des souris ICR mais aussi contre la tumeur syngénique "fibrosarcome Meth-A" chez des souris BALB/c. Il y a lieu de remarquer que jusqu'à présent, il n'a pas été question d'un tel

P-1,3-glucane qui déploie une forte activité anticarci-

nogène contre la tumeur syngénique "fibrosarcome Meth-A" chez des souris BALB/c. En outre, le P-1,3-glucane de

l'invention déploie également une forte activité anti-

carcinogène contre la tumeur allogénique "sarcome-180" chez des souris C3H/Fe qui sont connues pour leur faible

réponse immunitaire.

Le P-1,3-glucane de la présente invention n'a

pas de cytotoxicité directe in vitro ni d'effets secon-

daires comme on en observe habituellement en relation avec l'utilisation d'agents classiques, comme la réduction du nombre de leucocytes, l'anémie du foie et d'autres organes, l'atrophie de la rate, la perte de poids corporel et la perte d'appétit. La toxicité aiguë (DL50) de ce

5

P -1,3-glucane chez la souris est de plus de 1000 mg/kg

dans le cas de l'injection intrapéritonéale.

Le polysaccharide nouveau ou P-1,3-glucane de l'invention peut être obtenu à partir d'un extrait de mycélium et/ou de fructifications d'une souche qui est capable de produire un 1-1,3-glucane anticarcinogène et

qui appartient au genre Pseudoplectania, de la tribu.

des Sarcomateae, famille des Sarcomataceae, sous-ordre des Sarcoscyphineae, ordre de Pezizales, classe des Discomycetes de la subdivision des Ascomycotinia, ou à partir d'un milieu de culture dans lequel ladite souche

a été incubée.

Conformément à la présente invention, on peut utiliser toute souche d'espèces appartenant au genre

mentionné ci-dessus et capable de produire un polysaccha-

ride anticarcinogène.

Toutefois, dans les formes de réalisation de l'invention dont il sera question dans ce qui suit, on a utilisé une souche de Pseudoplectania nigrella (Pers.)

Fuckel K-1426 qui a été obtenue par culture d'une fructi-

fication (tissu) d'une espèce de champignon recueillie dans un faubourg de Sapporo, Préfecture d'Hokkaido, Japon,

en mai 1969.

L'identification de cette espèce a été effectuée d'après "Transactions of The Mycological Society of Japan"

21, 149 - 179, 1980.

Les caractéristiques de cette souche sont les suivantes: Cet organisme a été recueilli dans la mousse

d'une forêt de conifères et son corps présente les caracté-

ristiques propres au genre Pseudoplectania. Il a donc une couleur noire, son chapeau a un diamètre d'environ 1 cm et il n'a pas de stipe. L'extérieur de ce corps fructifère est recouvert de poils veloutés et son excipulum externe est composé de t.angularis et a une profondeur de 100 à 150 gm. Le tissu de la médulle est composé de t.intricata et il a une épaisseur de 250 à 400 gm. Il existe de longs poils ramifiés de couleur brun foncé à

la face extérieure de l'excipulum externe, qui est en-

chevêtré et dont l'épaisseur est d'environ 150 gm. L'asque

est composée de sclérenchyme:e et elle a une forme cylin-

drique, mesurant 220 - 300 x 12 - 15 Dm. L'ascospore a une forme quasi globuleuse et son diamètre mesure 11-14 gm. Le mycélium est filamenteux et a un diamètre de 2 - 3 Am. L'extrémité supérieure de son filament est

légèrement dilatée.

D'après ces caractéristiques et en se référant à l'ouvrage précité, on a identifié cette souche à Pseudoplectania nigrella (Pers.) Fuckel. Cette souche a été déposée auprès du Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japon, sous le n FERM-P 5803, ainsi qu'auprès de l'American

Type Culture Collection sous le n ATCC 20609.

Conformément à l'invention, on peut utiliser toute souche d'espèces appartenant au genre Pseudoplectania de la classe des Discomycetes, qui est capable de produire

un polysaccharide anticarcinogène.

Le polysaccharide de la présente invention peut être obtenu à partir d'un extrait de mycélium et/ou de corps fructifères d'une souche qui appartient au genre Pseudoplectania de la classe des Discomycetes ou à partir d'un milieu de culture dans lequel ladite souche a été incubée. Toutefois, il n'est pas facile de recueillir ces corps fructifères en une cuantité suffisamment grande

dans la nature. Par conséquent, il est avantageux d'utili-

ser le mycélium cultivé. Lé mycélium devant être utilisé dans la présente invention peut être obtenu par un procédé classique de culture, par exemple par culture solide ou

par culture liquide. Dans la culture solide, on peut uti-

liser par exemple de la gélose, de la gélatine, de l'amidon, de la sciure de bois, du malt, du son de riz, de la

farine de soja, et un autre milieu de culture solide classi-

que, ou un mélange de ces milieux. Dans la culture liquide, on peut utiliser-un milieu de culture liquide renfermant diverses substances nutritives qui sont bien connues dans le domaine de la culture de microorganismes. Ainsi, le milieu de culture liquide peut contenir une source de carbone telle que du glucose, du maltose, du lactose, du saccharose, de l'amidon, une huile, des mélasses, etc.,

une source d'azote (source d'azote organique et inorgani-

que) telle que de la peptone, un. extrait de levure, un extrait soluble de mals, des sels d'ammonium, de l'urée, etc., et un ou plusieurs sels organiques et inorganiques tels que des phosphates, des sels de magnésium, etc. Le

cas échéant, on peut aussi ajouter d'autres matières né-

cessaires à la croissance, telles que des vitamines.

Ces matières pour milieux solides et liquides

sont bien connues dans le domaine de la culture de champi-

gnons, et il n'est pas nécessaire de donner plus de

détails à leur sujet.

La culture liquide peut être conduite de toute manière classique, par exemple culture statique, culture agitée par secousses ou culture submergée. D'un double point de vue économique et pratique, une culture liquide avec aération et agitation est plus avantageuse qu'une

culture solide.

Dans la conduite de la culture liquide, on peut utiliser les conditions suivantes pH initial 2 - 9 Température d'incubation 15 - 350C Durée d'incubation 3 - 30 jours Dans le cas de la culture submergée, le milieu est soumis à une aération à une vitesse de 0,1 - 2,0 1/l/min,

la vitesse d'agitation étant de 30 - 500 tr/min.

Le mycélium obtenu par culture solide ou liquide est recueilli d'une manière classique et utilisé comme

matière de départ dans la présente invention.

Par exemple, dans le cas de la culture liquide, on peut recueillir le mycélium en soumettant le milieu de culture liquide résultant à une opération classique de séparation'telle que centrifugation, filtration, etc. Le filtrat obtenu par cette opération de séparation est appelé bouillon filtré, que l'on peut aussi utiliser comme

matière de départ dans la présente invention.

Conformément à l'invention, les corps fructifères et/ou le mycélium recueillis de la manière mentionnée

ci-dessus sont soumis à une extraction à l'aide d'un sol-

vant aqueux. Dans ce cas, les corps fructifères et/ou le mycélium tels quels peuvent être soumis directement à l'extraction. Le cas échéant, avant cette extraction, les corps fructifères et/ou le mycélium peuvent être soumis à un traitement préalable tel qu'un lavage à l'eau, un séchage à l'air, un broyage (pulvérisation) ou une

extraction à l'aide d'un solvant non polaire.

Le solvant aqueux devant être utilisé pour l'extraction consiste en eau ou un mélange d'eau et d'au moins une matière soluble dans l'eau telle qu'un acide,

une base, un sel ou un solvant organique.

Dans la conduite de l'extraction, les corps

fructifères ou le mycélium ayant ou non subi un pré-

traitement sont mélangés avec le solvant aqueux. La tempé-

rature du solvant n'est pas déterminante si elle est

maintenue à une valeur n'excédant pas 120'C. Des tempéra-

tures préférables peuvent être choisies d'un point de vue économique. L'extraction est conduite pendant une période

suffisante pour effectuer l'extraction désirée. Générale-

ment, à une température élevée, la durée d'extraction peut être plus courte. Dans la plage de tesiéatures préférée

indiquée ci-dessus, l'extraction est conduite avantageu-

sement pendant une période allant de 30 minutes à 10 heures.

L'extraction est de préférence conduite sous agitation dans un récipient qui peut êtrz en verre, à garniture de verre, émaillé ou en acier inoxvdable. La quantité de solvant peut aussi varier dans ur:e large plage,mais elle représente généralement 10 à 100 fois le poids {sur base

sèche) des corps fructifères et/ou du mycélium. L'utilisa-

tion de corps fructifères ou de mycélium pulvérisés est préférable pour l'extraction. Après cette dernière, le mycélium ou les corps fructifères et autres matières solides sont éliminés de l'extrait liquide par tous moyens

pratiques, par exemple filtration ou centrifugation.

L'extrait liquide est concentré, par exemple, par évapora-

tion sous vide ou par une opération similaire en vue d'un traitement subséquent. Généralement, l 'extrait aqueux est concentré dans une proportion allant du tiers au

dixième de son volume initial.

L'extrait obtenu comme décrit ci-dessus est en-

suite soumis à une purification comme expliqué ci-après, permettant la précipitation et l'isolement du polysaccharide recherché. L'expression "extrait liquide" utilisée dans le présent mémoire désigne un filtrat ou une liqueur de centrifugation résultant de l'élimination du mycélium et/ou des corps fructifères et d'autres matières solides de l'extrait. Le bouillon filtré peut aussi être soumis,: et

il l'est de préférence, à la purification indiquée ci-

après, permettant la précipitation et l'isolement du polysaccharide recherché. L'expression "bouillon filtré"

utilisée dans le présent mémoire désigne un f iltrat conte-

nant l'ingrédient actif, c'est-à-dire le polysaccharide, et obtenu par élimination du mycélium et d'autres matières solides du bouillon de culture, c'est-à-dire du milieu de culture dans lequel la souche a été incubée par culture liquide de la manière indiquée ci-dessus. Le bouillon filtré est concentré, par exemple, par évaporation sous

vide ou d'une façon similaire en vue d'un traitement subsé-

quent. Généralement, le bouillon filtré est concentré entre le tiers et le dixième de son volume initial. Le

bouillon filtré concentré est ensuite soumis à une purifi-

cation.

L'extrait liquide et le bouillon filtré peuvent

* être soumis séparément à la purification, ou bien l'ex-

trait liquide et le bouillon filtré peuvent être mélangés

de manière à soumettre le mélange à la purification.

La purification peut être conduite selon l'un

des procédés suivants.

(A) Précipitation de la substance désirée par l'addition d'un solvant organique fortement polaire (tel que des alcools et des cétones inférieurs, par exemple méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, etc.) ou relargage

(par l'addition de sels inorganiques hydro-

solubles tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, etc.) (B) Elimination d'acides, d'ions et de substances de bas poids moléculaire par dialyse, osmose inverse, filtration sur gel (par l'utilisation d'un gel de dextrane ou de polyacrylamide tel que 'Séphadex", "Bio-Gel", etc.), traitement avec une résine d'échange ionique (en utilisant par exemple diverses résines d'échange anionique et cationique du commerce telles que "Amberlite", "Dowex", "Duolite", etc.), ultrafiltration et, conjointement, plusieurs de ces possibilités, pour produire une solution essentiellement pure dans laquelle la substance active désirée est recueillie. (C) Traitement en vue d'éliminer des protéines libres, par exemple par le procédé "Sevag",

procédé au trifluorotrichlorométhane, traite-

ment par une protéase, etc. Ces opérations sont bien connues dans la pratique. Le cas échéant, deux ou plusieurs d'entre elles

peuvent être utilisées conjointement. Toutefois, en géné-

ral, l'extrait liquide ou le bouillon filtré, après con-

centration, est soumis à une opération choisie entre un i0 traitement sur une résine d'échange ionique, une dialyse,

une osmose inverse, une filtration sur gel, une ultra-

filtration et l'utilisation conjointe de plusieurs de

ces possibilités pour effectuer la décoloration, la désa-

cidificatian et l'élimination des substances de bas poids moléculaire. La substance active désirée peut être isolée de cette solution purifiée par une opération convenable telle qu'une lyophilisation. Le cas échéant, l'opération ou les opérations mentionnées ci-dessus peuvent être

répétées en vue d'obtenir un degré désiré de purification.

La substance ainsi obtenue présente les caracté-

ristiques qui ont été exposées dans ce qui précède.

D'autres détails de l'invention ressortent des exemples suivants qui se réfèrent en partie à la figure unique du dessin annexé représentant un spectre infrarouge

du polysaccharide conforme à l'invention.

EXEMPLE 1

On fait incuber une souche (FERM-P 5803, ATCC 20609) de Pseudoplectania nigrella (Pers.) Fuckel K-1426 dans le milieu de culture suivant Glucose 20 g Extrait soluble de mais 5 g Farine de soja 1 g Extrait de levure 1 g Phosphate de potassium (primaire) 1 g Sulfate de magnésium (7H20) 0,5 g Eau 1 litre pH initial 5,6

250 12?2

On conduit l'incubation en chargeant 100 ml du milieu de culture cidessus dans des fioles d'Erlenmeyer de 500 ml. On bouche les fioles avec du coton, on les

stérilise pendant 20 minutes à 1200C. Après refroidisse-

ment, on les inocule d'une manière classique avec ladite souche qui a été cultivée séparément dans un milieu de culture incliné contenant 2 % de glucose, 0,5 % de Ebios" et 1,5 % de gélose. Après 10 jours d'incubation à270C, on utilise le contenu des fioles pour l'incubation subséquente. Vingt litres du milieu de culture liquide

décrit ci-dessus dans un appareil de fermentation à réci-

pient en acier inoxydable de 30 litres ont été stérilisés à 1200C pendant 20 minutes et refroidis. Ensuite, le

milieu de culture se trouvant dans ledit appareil de fer-

mentation a été inoculé avec le contenu des fioles, obtenu comme indiqué ci-dessus. Le milieu a été soumis à une incubation aérobie sous agitation (200 tr/min) pendant

12 jours à 270C et à une vitesse d'aération de 0,5 1/l/min.

Le bouillon cultivé ainsi obtenu a été filtré en donnant

130 g de mycélium (sec) et 17 litres de bouillon filtré.

L'expression "bouillon filtré" utilisée dans le présent mémoire désigne un filtrat contenant l'ingrédient actif, c'est-à-dire le polysaccharide et obtenu par élimination du mycélium et d'autres matières solides du bouillon cultivé, c'est-à-dire le milieu de culture dans lequel la souche a été incubée par culture liquide de la manière

indiquée ci-dessus.

EXEMPLE 2

Le mycélium (130 g) obtenu dans l'exemple 1 a été lavé avec 1 litre d'eau et la liqueur de lavage a été rassemblée avec le bouillon filtré. Le mycélium lavé a été mélangé avec 15 litres d'eau et le mélange a été

chauffé à 120WC pendant 30 minutes dans un récipient fermé.

On a ensuite laissé le mélange refroidir à la température ambiante,puis on l'a filtré. Ce mode opératoire a été

répété deux fois et on a obtenu 43 litres d'extrait.

L'extrait obtenu ci-dessus a été concentré au dixième de son volume initial. L'extrait concentré a été additionné d'un volume égal d'éthanol pour précipiter le polysaccharide qui a été séparé. Ensuite, ce précipité a été dissous dans l'eau et la solution a été dialysée. Le dialysat a été

traité par chromatographie d'échange ionique sur "DEAE-

sephadex" et la fraction non adsorbée de la chromatogra- phie d'échange ionique sur "DEAE-sephadex" a été traitée également par chromatographie d'échange ionique sur

"SP-sephadex". La fraction non adsorbée de la chromatogra-

phie d'échange ionique sur "SrSsephadax"obtenue ci-dessus a été dialysée à nouveau puis lyophilisée en donnant r 8,6 g de poudre blanche. Cette substance a été identifiée au P-1,3-glucane portant les motifs répétés de la formule

(I), par les Expériences (A) - (E) décrites ci-dessus.

Le poids moléculaire moyen de ce -1,3-glucane était

d'environ 1 x 106 (méthode de filtration sur gel).

EXEMPLE 3

Les 17 litres du bouillon filtré obtenu dans l'exemple-1 ont été traités de la même manière que dans l'exemple 2 en donnant 13,2 g d'une substance en poudre blanche. Cette substance a été identifiée au P-1,3-glucane

portant les motifs répétés de formule (1) par les Expé-

riences (A) - (E) décrites ci-dessus. Le poids moléculaire moyen de ce 11,3-glucane était d'environ 1 x 10 (méthode

de filtration sur gel).

Le spectre infrarouge de cette substance est

représenté sur la figure unique du dessin annexé.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. P-1,3-glucane de haut poids moléculaire, caractérisé en ce qu'il est composé de motifs répétés de 3'lucopyrannose représentés chacun par la formule: O r -D-Glul T 3)-D-G1u6(l-3)p-D-G1u(î 3)3-ID-.Glu(l T

2. P-1,3glucane de haut poids moléculaire suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est isolé d'un extrait de mycélium et/ou de corps fructifères d'une souche qui est capable de produire un P-1,3-glucane anticarcinogène et qui appartient au genre Pseudoplectania de la classe des Discomycetes, ou d'un milieu de culture

dans lequel ladite souche a été incubée.

3. P-1,3-glucane de haut poids moléculaire sui-

vant la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche est Pseudoplectania nigrella (Pers.) Fuckel K-1426

(FERM-P 5803, ATCC 20609).

4. Procédé de production d'un P-1,3-glucane de haut poids moléculaire composé de motifs répétés de glucoprannose, chaque motif étant représenté par la formule: p-D-Glu 3)p-D-Glu (1-3)P-D-Glu(1 3)p-D-Glu(l caractérisé en ce qu'il consiste à former un bouillon filtré à partir d'un milieu de culture ou d'un extrait liquide de corps fructifères ou de mycélium d'une souche capable de produire le P-1,3-glucane et appartenant au genre Pseudoplectania de la classe des Discomycetes, et à recueillir le P-1,3glucane du bouillon filtré ou

de l'extrait liquide sous une forme purifiée.

5. Procédé suivant la revendication 4, caracté-

risé en ce que la souche est Pseudoplectania nigrella

(Pers.) Fuckel K-1426 (FERM-P 5803, ATCC 20609).

6. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle est constituée par ou en ce qu'elle contient un

P-1,3-glucane suivant l'une quelconque des revendications

1 à 3.