DE3208057A1

DE3208057A1 - Ss-1,3-glucan mit hohem molekulargewicht und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3208057A1
Application number: DE19823208057
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Hirata; Kazuo Kyoto Nakajima; Akira Obayashi; Takuma Tokyo Sasaki; Tokomo Uji Shiomy; Osamu Uji Tanabe; Tsutomu Kyoto Taniguchi; Hiroyuki Otsu Uchida
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1982-09-16
Also published as: IT1150622B; FR2501232B1; AU549553B2; GB2094324A; ES510184A0; IT8219987A0; DE3208057C2; AU8114882A; GB2094324B; CA1183530A; CH660026A5; KR870001814B1; US4454289A; FR2501232A1; KR830009224A; ES8302776A1

Description

ß-1-, 3-Glucan mit hohem Molekulargewicht: und Verfahren

zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft Polysaccharide mit einer antikarzinogenen Aktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere befaßt sich die' Erfindung mit einem neuen ß-1,3-Glucan mit einer ausgezeichneten antikarzinogenen Aktivität und einem Verfahren zur Herstellung desselben aus einem Extrakt von Myzein, und/oder Fruchtkörpem eines Stammes, der in der Lage·ist, ein antikarzinogenes PoIysaccharid zu erzeugen und zu dem Genus Pseudoplectania/ der Stamm Sarcomateae, der Familie Sarcomataceae, der Unterordnung Saxcoscyphineae, der Ordnung Pezizales, . der Klasse Discomycetes der Unterteilung Ascomycotinia gehört, oder aus einem Kulturmedium,in dem dieser'Stamm bebrütet worden ist. .

Das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan ist ein neues Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht und setzt sich aus sich wiederholenden Glucopyranoseeinheiten der folgenden Formel (I) . . ·

3)ß-D-Glu⁶(1-3)ß-D-Glu(l -

3) ß -D-GIu(I

zusammen, worin "GIu" für einen Glucopyranoserest steht.

Das ß-1,3-Glucan gemäß vorliegender Erfindung besitzt eine starke antikarzinogene Aktivität nicht nur gegenüber allogenen, sondern auch gegenüber syngenen Tumoren, gegenüber welchen bisher keine derartige Aktivität im Zusammenhang mit herkömmlichen ß-1,3-Glucanen bekannt geworden ist. Darüber hinaus zeigt dieses ß-1,3-Glucan

32080S7

auch eine starke 'antikarzinogene Aktivität gegenüber dem allogenen Tumor "Sarcoma-i 80" in C3'H/He-Mäusen, die bekanntlich eine niedrige Immunreaktion zeigen.

Es sind einige Untersuchungen bekannt, die sich mit der chemischen Struktur von antikarzinogenem ß-1 ,3-Glucan befassen.

(1) Schizophyllan · .

Das ß-1 ,3-Glucan, das aus Schi zophy Hum commune (Fries.) (Journal, of the Agricultural Chemical Society of Japan 44, 337-342',-1970; ibid 45, 162-168, 1971) hergestellt wird. Seine chemische Struktur fels wiederholende Einheiten) wird wie folgt vorgeschlagen:

β-D-GIu

3)P-D-GIu⁰(1-3)β-D-GIu(1-3)β-D-GIu(I

(II)

(2) Das ß-1,3-Glucan, das aus dem Genus Auricularia ■ der Klasse Basidiomycetes gewonnen-wird (JP-PS 63012/ 1979). Seine chemische Struktur (als wiederholende Einheiten) wird wie folgt vorgeschlagen:

β-D-GIu¹' β-D-GIu¹
3)ß^D-Glu^b.(l-3)ß-D-Glu^b(l-3)ßrD-Glu(l

• (in)

(3) Lentinan

Das ß-1,3-Glucan, das aus Lentinus edodes (Berk.) Singer, (Nature 222, 687-688/ 1969; Carbohydr. Research 47, 99-104, 1976; "Gan to i-fenekizokyo"' ed.. von Goro Chihara (veröffentlicht von der Kodan-sha, Tokyo, Japan) 1980) erzeugt wird. Seine chemische Struktur wird wie folgt vorgeschlagen: .

β-D-GIu · β-D-GIu¹

I₆ ι ^(iv)

3)ß-D-Glu (l-3)ß-D-Glu(l-3)ß-D-Glu⁶(l-3)ß-D-Glu(l-3)ß-D-Glu(l

Diese bekannten ß-1,3-Glucane sowie das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan stimmen insofern überein, als sie eine ß-(1,3)-verknüpfte lineare Kette von D-Glucopyranoseeinheiten und ß-(1,6)-verknüpften D-Glucopyranoseseitenkette(n) besitzen. Wie jedoch aus einem Vergleich der Formel (I) mit den Forueln (II), (III) und (IV) hervorgeht, unterscheidet sich das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan von den bekannten β~1,3-Glucanen bezüglich des Verhältnisses der Anzahl der ß-1,3-Verknüpfungen sowie der Anzahl der ß-1,6-Verzweigungsverknüpfungen. Daher ist das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan eine neue Substanz, die sich in ihrer chemischen Struktur von den bekannten ß-1,3-Glucanen unterscheidet.

Ferner besitzt das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan eine starke antikärzinogene Aktivität -gegenüber nicht nur allogenen Tumoren» sondern auch gegenüber syngenen Tumoren. Es sind bisher keine ß-1,3-Glucane bekannt geworden, die eine starke antikarzinogene Aktivität gegenüber syngenen Tumoren zeigen. Darüber hinaus zeigt das-

— ο —

erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan auch eine starke antikarzinogene Aktivität gegenüber dem allogenen Tumor ¹¹ Sarcoma-180" in C3H/He-Mäusen, die bekanntlich eine geringe Immunreaktion zeigen. Daher ist das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan wirksamer als die bekannten ß-1,3-Glucane als immunotherapeutische Krebsmittel.

Die chemische Struktur und die Eigenschaften des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucans sind wie folgt: .

(1) Chemische Struktur:

Die chemische Struktur (als wiederholende Einheiten) dieses ß-1,3-Glucans geht aus der Formel (I) hervor, die durch folgende Experimente bestätigt worden ist:

(A) Die Behandlung dieses Polysaccharids mit Exo-ß-1,3-glucanase, die auf den Mikroorganismus Basidiomycetes

QM 806 zurückgeht; liefert D^Glucose und Gentiobiose, wobei ihre molaren Verhältnisse von 1:0,8 durch Bestimmung mit Bio-gel P-2-Gelpermeationschromatographie ermittelt worden sind.

(B) Die Methylierungsbehandlung dieses Polysaccharids nach der Hakomori-Methode und die anschließende Hydrolyse liefert 2,3,4,6-Tetra-O-methyl-D-glucose, 2,4,6-Tri-O-methyl-D-glucose sowie 2,4-Di-O-methyl-D-glucose, identifiziert durch Papierchromatographie, Gaschromatographie und Massenspektrömetrie, wobei ihr molares Verhältnis 0,8:1:0,8 beträgt.

(C) Die Perjodatoxidation (unter Einsatz von 0,05m Per-

jodat) dieses Polysaccharids verbraucht 0,667 Mol Perjodat pro Anhydroglucoseeinheit bei gleichzeitiger Freisetzung von 0,344 Mol Ameisensäure.

(D) Eine Behandlung durch Smith-Abbau des vorstehend

oxidierten Produktes liefert Glycerin und Glucose in einem Molverhältnis von 1:2,1«

(E) Eine Behandlung durch milde Hydrolyse (mit 0,03m 0 Schwefelsäure) des vorstehend oxidierten und anschließend reduzierten Produktes liefert Glycerin und ein wasserunlösliches Material, während die Methylierung und anschließende Hydrolyse dieses wasserunlöslichen Materials nur 2,4,6-Tri-O-methyl-D-glucose ergibt.

20

(F) Eine Behandlung durch milde Hydrolyse (mit 0,03m

Schwefelsäure) dieses Polysaccharids ergibt D-GIucose und ein in Wasser unlösliches Material. Andererseits ergibt eine Behandlung dieses wasserunlöslichen Materials mit Exo-ß-1,3-glucanase, wie vorstehend beschrieben, nur D-Glucose.

30

Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid ein ß-1 ,3-Glucan ist, .das sich wiederholende Glucopyranoseeinheiten der Formel (I)

ß-D-Glu^J

3)P-D-GIu(I

(D

autweist, wobei eine lineare Kette von ß-(1 ,3)-verknüpf-

ten D-Glucopyranoseeinheiten mit ß-(1,6)-verknüpften und verzweigten D-Glucopyranoseeinheiten vorliegt (jeder Verzweigung ist eine einfache D-Glucopyranoseeinheit), und zwar in einem Verhältnis von 9:4.

(2) Elementaranalyse:

C : 43,88 % H : ' 6,18 %

. . '

(3) Molekulargewicht:

■ Mehr als 2,5 χ 10⁵ (Gelfiltrationsmethode)

15 (4) Schmelzpunkt:

Die Substanz zeigt.keinen scharfen Schmelzpunkt und verkohlt bei starkem Erhitzen.

(5) Spezifische Drehung: ²⁰

+35° (0.5N NaOH, C = 0.5 1°)

(6) Intrinsikviskosität:

C^) =' 20 - 25 25 .

Die Intrinsikviskosität wird durch die folgende Formel definiert:

Viskosität der Lösung (OyTm NaCl 30⁰C) Viskosität des Lösungsmittels ■"·.."

g, Zahl der Substanz in TOO ml Lösung

(7) UV-Spektrum: · · .

Endabsorption " · :

(8) Infrarotspektrum:

Die Substanz zeigt eine Bande bei 890 cm" ,.die auf das Vorliegen der ß-glycosidisehen Verknüpfung hindeutet. . . ·. . '

(9) Löslichkeit:

Diese Substanz ist in Wasser,- 0,5n NaOH sowie Dimethylsulfoxid löslich, jedoch unlöslich in Petrolether, Ether, Aceton, Benzol, Ethanol und Methanol etc. ·

(10) Farbreaktion: "

Diese Substanz zeigt eine positive Reaktion"mit Molish-Reagens und Anthron-Reagens, jedoch eine negative Reaktion gegenüber Jod-Stärkereagens, Bial-. reagens, Carbasol-H₂S0.-Reagens, Ninhydrinreägens sowie Elson-Morgän-Reagens.

(11) pH der Lösung: ' Neutral ' .

(12) Aussehen:

Weißes Pulver . ·

(13) Zuckerkomponente:

Diese Substanz setzt sich nur aus D-Glucose zusammen (be-

stätigt durch Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie , Gas/Flüssigkeits-Chromatographie sowie Glucoseoxidasemethode).

Wie vorstehend erwähnt, ist das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan ein neues ß-1,3-Glucari mit der Struktur der Formel (I) und den physikalisch-chemischen Eigenschaften (2) - (13) ·.

Das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan zeigt eine antikarzinogene Aktivität. Die antikarzinogene Aktivität des neuen ß-1,3-Glucans (erhalten gemäß Beispiel 3) wurde,·sofern nicht in den einzelnen nachfolgenden Versuchsmethoden etwas anderes angegeben ist, nach herkömmlichen Methoden 0 bestätigt und untersucht.

Versuch (1)

Die antikarzinogene Aktivität des ß-1,3-Glucans gemäß vorliegender-.Erfindung gegenüber Sarcoma-180 in ICR-Mäusen wurde untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

	- 11 -	3208057
	Tabelle I
Dosierung,	Inhibierungs	Vollständiges
mg/kg/Tag	verhältnis (%-)	Zurückgehen
. 0,2	■ 85,0	. · 3/5 ·
2,0	. 100,0	"■· -5/5
20,0	83,3	3/5
Tumorzellen:	" Sarcoma-180
Transplantierte Zellenzahl: 4 χ	10⁶/Maus

Tiermaterial: Behandlung:

Untersuchung:

ICR f . ■

Intraperitoneale Verabreichung beginnend i Tag nach der Transplantation und anschließende fünfmalige Verabreichung pro Tag (Vergleich: Kochsalzlösung)

Das Tumorgewicht des festen Typs wird 4 Wochen nach der Transplantation gemessen.

Inhibierungsverhältnis =£(C - T) /Cj χ 100

C: Durchschnittsgewicht der aus der Vergleichsgruppe entfernten Tumore.

T: Durchschnittsgewicht der aus der mit 8-1,3-Glucan behandelten Gruppe entfernten Tumore

Versuch (2)

Die antikarzinogene Aktivität des erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucans gegenüber Sarcoma-180 in C3H/He-Mäusen, Ehlrich-Karzinom in ICR-Mäusen und Meth-A Fibrosarcom in BALB/c-Mäusen wurde untersucht.

Die Ergebnisse gehen aus den Tabelle Ii,. III und IV hervor.

10

15

20

Dosierung, mg/kg/Tag 2,0

10,0 '·

50,0

Tumorzellen: Transplan tier· Tiermaterial: Behandlung:

Tabelle	II	Vollständiges
Inhibierungs-		Zurückgehen
verhältnis (%)		0/5
44,2-		2/5
82,5		• 2/5
80,3
Sarcoma-180		⁶/Maus
eilenzahl: 4 χ	10

Untersuchung:

C3H/He- -f

Intraperitoneale Verabreichung beginnend T Tag nach der Transplantation und anschließende zehnmalige Verabreichung pro Tag.(Vergleich: Kochsalzlösung)

Das Tumorgewicht des festen Typs wird 5 Wochen nach der Transplantation gemessen.

Inhibierungsverhältnis
'=. /f(C - T) /C] χ 100
C:-Durchschnittsgewicht der aus der Ver-

. gleichsgruppe entfernten Tumore. T: Durchschnittsgewicht der aus der mit ß-1,3-Glucan behandelten Gruppe entfernten Tumore.

	- 13 -■	...... . , . ..
	Tabelle III	• 3208057
	Inhibierungs-
Dosierung,	verhältnis (%)	Vollständiges
mg/kg/Tag	80,3	Zurückgehen
0,06 ·	100,0	1/5.
0,60	92,4 .· .	5/5
6,00	Ehlrich-Karzinom	• 4/5
Tumorzellen:	.Zellenzahl: 4x1
Transplantierte	ICR £	O⁶/Maus
Tiermaterial:	Intraperitoneale
Behandlung:	Verabreichung begin-

nend 1 Tag nach·der Transplantation und anschließende achtmalige Verabreichung pro Tag (Vergleich: Kochsalzlösung)

Untersuchung:

Inhibierungsverhältnis
= /"(C - T) /C/ χ 100

C: Durchschnittsgewicht der aus der Vergleichsgruppe entfernten Tumore.

T: Durchschnittsgewicht der aus der mit ß-1,3-Glucan behandelten Gruppe entfernten Tumore. .

Tabelle IV

Dosierung,	Inhibierungs	Vollständiges
mg/kg/Tag	verhältnis (%)	Zurückgehen
0,2	84,2	3/5
2,0	■ 100,0	: ■ · s/s
20,0	53,8	2/5

Tumorzellen:

Meth-A-Fibrosarkom

Transplantierte Zellenzahl: 1 χ 10 /Maus Tiermaterial:
Behandlung:

Untersuchung:

BALB/c *f

Intraperitoneale Verabreichung beginnend 1 Tag nach der Transplanatation und anschließende zehnmalige Verabreichung pro Tag (Vergleich: Kochsalzlösung)

Das Tumorgewicht des festen Typs wird

5 Wochen nach der Transplantation gemessen.

Inhibierungsverhältnis:

= /"(C - T) /Qj x 100

C: Durchschnittsgewicht der aus der Vergleichsgruppe entfernten Tumore

T: Durchschnittsgewicht der aus der mit ß-1,3-Glucan behandelten Gruppe entfernten Tumore.

Versuch (3) .'

Die antikarzinogene Aktivität des. erfindungsgemäßen ß-1,3-Glucans gegenüber .Ehlrich-Asc.itestumor in ICR-Mäusen wurde •untersucht.

Das Ergebnis geht aus Tabelle V hervor.

	Tabelle V	Anzahl der über
Dosierung,	Durchschnittliche Uber-	lebenden pro Grup
mg/kg/Tag	lebensrate (Tage)	pe
		••0/5
Vergleich	13.,3	0/5
0,24	• 15,2	0/5
1,20	23,2	3/5
6,10	>31,4

Tumorzelle: Ehlrich-Äseitestumor Zahl der transplantierten Zellen: 5 χ 10 /Maus Tiermaterial:· ICR -f

Behandlung: Intraperitoneale Verabreichung beginnend 1 Tag nach der Transplantation und" an

schließende zehnmalige Verabreichung pro Tag (Vergleich: Kochsalzlösung)

Untersuchung: Die Anzahl der überlebenden Mäuse und die

Überlebenszeit "(Tage) einer jeden .Gruppe

• werden 7 Wochen nach der Transplantation

• gemessen;

Wie aus den vorstehenden Versuchen (1) bis (3) hervorgeht, bestitzt das erfindungsgemäße· ß-1,3-Glucan eine starke antikarzinogene Aktivität nicht nur gegenüber dem allogenen Tumor "Sarcoma-180" in ICR-Mäusen, sondern auch gegenüber dem syngenen Tumor "Meth-A Fibrosarcoma" in BALB/c-Mäusen. Es ist darauf hinzuweisen, daß bisher von keiner derartig starken antikarzinogenen Aktivität von ß-1,3-Glucarten gegenüber dem syngenen Tumor "Meth-A Fibrosarcoma" in BALB/c-Mäusen berichtet worden ist. Darüber hinaus besitzt das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan auch eine starke antikarzinogene Aktivität gegenüber dem allogenen Tumor "Sarcoma-180" in C3H/He-Mäusen, die bekanntlich eine niedrige Immunreaktion zeigen.

Das erfindungsgemäße ß-1,3-Glucan zeigt weder eine direkte Cytotoxizität in vitro noch Nebenwirkungen, wie sie in üblicher Weise beim Einsatz bekannter Mittel festgestellt werden, beispielsweise eine Abnahme der Zahl der Leucocyten, eine Anämie der Leber oder andere Organe, einen Schwund der Milz, einen Verlust des Körpergewichts oder einen Appetitverlust. Die akute Toxizität (LE>₅q) dieses

ß-1,3-Glucans in Mäusen beträgt mehr als 1000 mg/kg bei einer intraperitonealen Injektion.

Das neue erf indungs gemäße Poly saccharic! oder ß-1,3-Glucan kann aus einem Extrakt von Myzeln und/oder Fruchtkörpern eines Stammes, der ein antikarzinoges ß-1,3-Glucan zu erzeugen vermag und dem Genus. Pseudoplectania, dem Geschlecht Sarcomateae, der Familie Sarcomataceae, Der Unterordnung Sarcoscyphineae, der Ordnung Pezizales, der Klasse· Discomycetes der Unterteilung der Ascomycotinia gehört, oder aus'.einem Kulturmedium, in dem ein derartiger Stamm bebrütet worden ist, erhalten werden.

Erfindungsgemäß kann jeder Stamm einer Spezies verwendet werden, die zu dem vorstehend beschriebenen Genus gehört und in der Lage ist, ein antikarzinoges Polysaccharid zu erzeugen.

Bei der Durchführung der nachfolgend näher erläuterten · Ausführungsform der Erfindung wird ein Stamm von Pseudoplectania nigrella (Pers.) Fuckel K-1426 verwendet, der durch Züchten eines Fruchtkörpers (Gewebe) · einer Fungusspezies erhalten worden ist, die· in einer Vorstadt von Sapporo iri der Kokkaido Prefecture in Japan im Mai 1969 gesammelt worden ist.

Die Identifizierung dieser Spezies erfolgte nach dem Buch "Transactions of The Mycological·Society of Japan"' 21 , 149 - 179, 1.980.
. . Die charakteristischen Eigenschaften dieses Stammes sind wie folgt: . .

Dieser Organismus wurde in dem Moos eines Nadelwaldes gesammelt, wobei sein Körper die typischen Eigenschaften des Genus Pseudoplectania aufweist. Er ist schwarz gefärbt und sein Hut besitzt einen Durchmesser von ungefahr 1 cm, wobei er keinen Stengen aufweist. Die Aussenseite dieses Fruchtkörpers ist mit samtähnlichen Haaren bedeckt, wobei sein ectel excipulum aus t. angularis " besteht und eine Tiefe von 100 bis 1-50 μπι besitzt. Das Markgewebe besteht aus t. intricata und besitzt eine Tiefe von 250 bis 400 um. Es sind dunkelbraune lange und verzweigte Haare auf der äußeren Seite des ectel excipulum vorhanden, die miteinander verzahnt sind, wobei die Tiefe ungefähr 150 μπι beträgt. Der Askus besteht aus verhärteten Zellgewebe, besitzt eine zylindrische Form und eine Abmessung von 220 bis 230 χ 12 - 15 μΐη. Die Askoppre ist nahezu von globaler Form und besitzt einen Durchmesser von 11 bis 14'um. Das. Myzel ist fadenartig und besitzt einen Durchmesser von 2 bis 3-.μια. Die obere Seite seines Fadens ist leicht ausgedehnt.

Aus diesen Eigenschaften sowie unter Zuhilfenahme des vorstehend zitierten Buches wurde dieser Stamm als Pseudoplectania nigrella (Pres.) Fuckel identifiziert. Dieser Stamm wurde in dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 5803 sowie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnuramer ATCC 20609 hinterlegt. ■ ·

Erfindungsgemäß kann jeder Stamm einer Spezies verwendet werden, die zu dem Genius Pseudoplectania-der Klasse Discomycetes gehört und ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid kann aus einem Extrakt von Myzeln und/oder Fruchtkörpern eines Stammes., der zu dem Genus Pseüdoplectania der Klasse Discomycetes gehört, oder .aus einem Kulturmedium, in dem der Stamm bebrütet worden ist, erhalten werden.

Es ist jedoch nicht einfach, derartige Fruchtkörper in einer ausreichend großen Menge in der Natur zu sammeln. Daher ist es vorteilhaft, das gezüchtete Myzel zu verwenden. Das erfindungsgemäß einzusetzende Myzel kann nach jeder herkömmlichen Züchtungsmethode erhalten werden, beispielsweise aus einer festen Kultur oder einer flüssigen Kultur. Im Falle einer festen Kultur werden beispielsweise Agar, Gelatine, Stärke, Sägemehl, Malz, Reiskieie, Sojabohnenmehl oder andere herkömmliche feste Kulturmedien oder eine Kombination davon verwendet. Im Falle einer flüssigen Kultur kann man ein flüssiges Kulturmedium verwenden, das verschiedene Nährmittel enthält, wie sie zum. Züchten von Mikroorganismen bekannt 0 sind. Das flüssige Kulturmedium kann- eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Maltose, Lactose, Rohrzucker, Stärke, öl, Melassen, etc., eine Stickstoffquelle (organisches oder anorganisches' Stickstoff-enthaltendes Material), wie Pepton, Hefeextrakt, Maisflüssigkeit, Ammoniumsalze, Harnstoff etc., sowie ein oder mehrere organische oder anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze etc. , enthalten. Gegebenenfalls kann man andere Materialien, die für das Wachstum notwendig sind, wie Vitamine, zusetzen.

Diese Materialien für feste und flüssige Medien sind auf dem Gebiet der Pilzzüchtung bekannt, so daß keine .weiteren Erläuterungen erforderlich sind.

Das Züchten in flüssiger Kultur kann in jeder herkömmlichen Weise durchgeführt werden, beispielsweise als
statische Kultur,.als Schüttelkultur oder als Submerskultur. Aus wirtschaftlichen Erwägungen sowie im Hinblick auf die Einfachheit der Handhabung wird eine flüssige Kultur unter Belüftung und Rühren einer festen
Kultur vorgezogen. ·

Zur Durchführung der Züchtung in flüssiger Kultur können

folgende Bedingungen eingehalten werden:

Anfangs-pH 2-9

Inkubationstemperatur 15 - 35°C

Inkubationsperiode 3 - 30 Tage

Im Falle einer Submerskultur wird das Medium mit 0,1 bis 2,0 1/l/min unter Rühren mit 30 bis 500 Upm belüftet.

Die beim Züchten in fester oder flüssiger Kultur gewachsenen Myzeln werden in herkömmlicher Weise gesammelt
und als Ausgangsmaterial zur Durchführung der Erfindung
verwendet. ·

Im Falle einer flüssigen Kultur können die Myzeln in der Weise gesammelt werden, daß das anfallende flussige KuI-turmedium in herkömmlicher Weise, beispielsweise durch

Zentrifugieren, Filtration etc., getrennt wird. Das durch diese Trennmethode erhaltene Filtrat wird als filtrierte Brühe bezeichnet und kann ebenfalls als Ausgangsmaterial zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden.

■ ·

Erfindungsgemäß werden die Fruchtkörper und/oder Myzeln, die in der vorstehend beschriebenen Weise gesammelt worden sind, mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert.
In diesem Falle können Fruchtkörper und/oder Myzeln als

solche"direkt der Extraktion unterzogen werden. Gegebenen-

falls können vor einer derartigen Extraktion die Fruchtkörper und/oder Myzeln einer Vorbehandlung unterzogen werden, beispielsweise einem Waschen mit Wasser, einer Lufttrocknung, einem Zerstoßen (Pulverisation) oder einer Extraktion mit einem nichtpolaren Lösungsmittel.

Das wäßrige Lösungsmittel, das für die Extraktion eingesetzt wird, besteht aus Wasser oder einer Mischung aus Wasser und wenigstens einem wasserlöslichen Material, wie einer Säure, einer Base, einem Salz oder einem organischen Lösungsmittel.

Zur Durchführung der Extraktion werden die vorbehandelten oder nichtvorbehandelten Fruchtkörper oder Myzeln mit dem wäßrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des Lösungsmittels ist nicht· kritisch, sofern sie nicht höher als 120⁰C gehalten wird. Bevorzugte Temperaturen lassen sich nach wirtschaftlichen Erwägungen auswählen. Die Extraktion wird während einer Zeitspanne durchgeführt, die dazu ausreicht, die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen ist bei einer höheren Temperatur die Extraktionszeit kürzer. Innerhalb des vorstehend angegebenen bevorzugten Temperaturbereichs wird die Extraktion vorzugsweise während einer Zeitspanne von 30 min bis 10h durchgeführt. Die Extraktion wird vorzugsweise unter Rühren in einem Gefäß ausgeführt, das aus Glas oder einem mit Glas ausgekleideten, emaillierten oder Gefäß ' aus rostfreiem Stahl bestehen kann. Die Lösungsmittelmenge kann..innerhalb ,eines breiten Bereiches variieren, liegt jedoch im .allgemeinen zwischen dem 10- und 100-fachen des Gewichts (bezogen auf Trockenbasis)· der Fruchtkörper und/oder der Myzeln. Die Verwendung von pulverisierten Fruchtkörpern oder Myzeln wird für die Extraktion bevorzugt. Nach der Extraktion werden die Myzeln oder Fruchtkörper sowie andere feste Materialien

aus dem flüssigen Extrakt nach irgendeiner herkömmlichen Weise entfernt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren. Der' flüssige Extrakt wird für eine weitere Behandlung, beispielsweise durch. Väkuumverdampfen.oder dgl. konzentriert. Im allgemeinen wird der wäßrige. Extrakt auf ein Drittel bis ein Zehntel des Anfangsvolu-^ mens konzentriert.

Der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Extrakt wird dann der nachfolgend näher beschriebenen Reinigung unterzogen, was eine Ausfällung und Gewinnung des gesuchten Polysaccharids bedingt. Der Begriff "flüssiger Extrakt" bedeutet ein Filtrat oder Zentrifugat, das bei der Entfernung der Myzeln und/oder Fruchtkörper sowie anderer fester Materialien aus dem Extrakt anfällt.

Die filtrierte Brühe kann ferner vorzugsweise für.die nachfolgend näher erläuterte Reinigung verwendet werden, die eine Ausfällung und Gewinnung des gesuchten PoIysaccharids bedingt. Unter dem Begriff "filtrierte Brühe" ist ein Filtrat zu verstehen, das den Wirkstoff, und zwar das Polysaccharid, enthält und durch Entfernen von Myzeln oder anderen festen Materialien.von der .Kulturbrühe erhalten worden ist, d. h. von dem kulturmedium, in dem der Stamm in flüssiger Kultur in der vorstehend beschriebenen Weise bebrütet worden ist. Die filtrierte Brühe wird beispielsweise durch Vakuumeindampfen oder dgl. für eine weitere Behandlung konzentriert. Im allgemeinen wird die filtrierte Brühe auf 1/3 bis 1/10 des Anfangsvolumens konzentriert. Die konzentrierte filtrierte Brühe wird dann einer Reinigung unterzogen.

Der flüssige Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt gereinigt werden, der flüssige. Extrakt und die filtrierte Brühe' können jedoch auch vereinigt werden, so daß die Mischung der Reinigung unterzogen wird.

Die Reinigung kann nach den folgenden Methoden durchgeführt werden. · ·

(A)- Ausfällen .der gewünschten Substanz durch Zugabe eines höherpolaren Lösungsmittels (wie eines niederen Alkohols· und Ketons, beispielsweise Methanol, Ethanol/ Propanol, Butanol', Aceton etc.) oder Aussalzen (durch Zugabe von wasserlöslichen anorganischen Salzen, wie Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid etc.). 10

(B) Entfernen von Säuren, Ionen und Substanzen mit niederem Molekulargewicht durch Dialyse, Umkehrosmose,

Gelfiltration (unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamidgel, wie Sephadex, Biogel etc.), lonenaustauscherbehandlung (durch Verwendung von beispielsweise verschiedenen im Handel erhältlichen Anionen- und Kationenaustauscherharzen, wie Amberlite, Dowex, Duolite, etc.), Ultrafiltration oder eine Kombination davon, wobei eine im wesentlichen reine Lösunq erhalten wird, aus der die 0 gewünschte Wirksubstanz gewonnen wird.

(C) Behandlung zur Entfernung von freien Proteinen, beispielsweise durch Anwendung der Sevag-Methode, der Trifluortrichlormethan-Methode, einer Proteasebehandlung etc.

Diese Methoden sind bekannt. Gegebenenfalls können zwei oder mehrere dieser Methoden kombiniert werden. Im allgemeinen wird jedoch der flüssige Extrakt oder die filtrierte Brühe nach der Konzentration einer Methode unterzogen, die-aus., einer Ionenaustauscherharzbehandlung, Dialyse, Umkehrosmose, Gelfiltration, Ultrafiltration oder einer Kombination davon besteht, um eine Entfärbung, Entsäuerung sowie Entfernung von Substanzen mit niederem

Molekulargewicht zu bewirken. Aus einer derartigen gereinigten Lösung kann die gesuchte Wirksubstanz nach einer geeigneten Methode, beispielsweise durch Gefriertrocknen, gewonnen werden. Gegebenenfalls können die vorstehend angegebenen Methoden wiederholt werden, um ein angestrebtes Ausmaß der Reinigung zu erzielen*

Die auf diese Weise erhaltene Substanz besitzt folgende charakteristische, nachfolgend näher erläuterte Eigenschaften. " ■ -■■·'"■

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele unter teilweiser Bezugnahme auf die beigefügten Figur 1 näher erläutert, die ein Infrarotspektrum des erfindungsgemäßen Polysaccharids zeigt.·

Beispiel Ί

Ein Stamm (FERM-P 5803, .ATCC 20609) von Pseudopleetania nigrella (Pers.) Fucke.l K--1-426 wird in folgendem Kulturmedium bebrütet:.

Glucose ' 20 g

Maisflüssigkeit 5g

Sojabohnenmehl · . · 1g

Hefeextrakt ' Tg'

Kaliumphosphat.(primäres) Ig

Magnesiumsulfat (7H₂O) 0,5 g

Wasser . 1 Liter

An-fangs-pH . ' 5,6 '

Die Bebrütung erfolgt in der Weise, daß 100 ml des vorstehend, beschriebenen Kulturmediums zu jeweils 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben werden. Die Kolben werden mit

Baumwolle verschlossen und 20 min bei 12O⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden sie in herkömmlicher Weise mit dem Stamm beimpft, der getrennt in einem · Schrägkulturmedium, das 2 % Glucose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar enthält, gezüchtet worden ist. Nach 10 tägiger Bebrütung bei 27⁰C werden die Kolbeninhalte für die anschließende Bebrütung verwendet. 20 1 des vorstehend beschriebenen Kulturmediums werden in Fermentationsgefäßen aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 30 1 bei 120⁰C 20 min sterilisiert und . anschließend abgekühlt. Dann werden die Kolbeninhalte in dem Kulturmedium in den Fermentationsgefäßen beimpft. Das Medium wird unter Rühren (200 Upm) 12 Tage bei 27°C aerob bebrütet, wobei die Belüftungsrate 0,5 1/l/min beträgt. Die dabei erhaltene Kulturbrühe wird zur Gewinnung von 130 g Myzein (trocken) und 17 1 filtrierter Brühe filtriert. Der Begriff "filtrierte Brühe" bedeutet ein Filtrat,· das den Wirkstoff enthält, und zwar das Polysaccharid, und· durch Entfernung von Myzeln und anderen festen Materialien von der Kulturbrühe entfernt worden ist, d. h; dem Kulturmedium, in dem der Stamm in flüs- , siger Kultur in der beschriebenen Weise bebrütet worden ist.

Beispiel 2 .

130 g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Myzeln werden mit 1 1 Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit der filtrierten Brühe vereinigt wird. Die gewaschenen Myzeln werden mit 15 1 Wasser vermischt und die Mischung auf 12O⁰C 30 min lang in einem verschlossenen Gefäß erhitzt. Dann wird die Mischung auf Zimmertemperatur ab-

■ - 25 -

kühlen gelassen und anschließend filtriert. Diese Methode wird zweimal wiederholt/ wobei man 43 1 Extrakt erhält. Der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Extrakt wird auf 1/10 des Anfangsvolumens konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wird mit gleichen Volumina■ Ethanol zur Ausfällung des Polysaccharide, das abgetrennt wird, versetzt. Dann wird dieser Niederschlag in Wasser aufgelöst und dialysiert. Das Dialysat wird einer Ionenaustauscherchromatographie, unter Einsatz von DEAE-Sephadex unterzogen und die nicht-adsorbierte Fraktion der DEAE-Sephadex-Ionenaustauscherchromatographie außerdem mit SP-Sephadexionenaustauscherchromatographiematerial behandelt. Die nicht-adsorbierte Fraktion der SPSS ephadexiönenaustauscherchromatographie wird erneut dialysiert und dann zur Gewinnung von 8,6 g einer weißen pulverförmigen Substanz gefriergetrocknet. Die Substanz wird als das ß-1,3-Glucan mit den sich wiederholenden Einheiten der Formel (I) anhand der weiter oben beschriebenen Versuche (A) - (E) identifiziert. Das durchschnittliehe Molekulargewicht dieses ß-1,3-Glucans beträgt ungefähr 1.x 10 (Gelfiltrationsmethode.).

Beispiel 3

Die 17 1 der filtrierten Brühe, die gemäß Beispiel 1 erhalten worden sind, werden nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode behandelt, wobei 13,2 g einer weißen pulverförmigen Substanz erhalten werden. Die Substanz wird als das ß-1,3-Glucan identifiziert, das die sich wiederholenden Einheiten der Formel (I) aufweist, und zwar durch Anwendung der Versuche (A) - (E). Das durchschnitt-

liehe Molekulargewicht dieses ß-1/3-Glucans beträgt ungefähr 1 χ 10 (Gelfiltrationsmethode).

Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus Fig. 1 hervor.

Claims

DEUI¹JBiK' SCHÖN ·

PAMKTAIfWiMK BtTHOPKAN PATENT ATTOHNKYS

DR. WOLFGANG MÜLLEH-BORi (PATENTANWALTVON 1927-197S) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.- CH EM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.

T 1499

Takara Shuzo Co., Ltd., 609 Takenaka-cho, Fushimi-ku, Kyoto, Japan

ß-1,3-Glucan mit hohem Molekulargewicht und
Verfahren zu seiner Herstellung

Patentansprüche

ß-1,3-Glucan mit hohem Molekulargewicht aus sich wiederholenden Glucopyranoseeinheiten, wobei jede Einheit der Formel _N

1 ■

β-D-GIu^J

3)ß-D-Glu^D(l-3)ß-D-Glu(l -r

3)ß-D-Glu(l

entspricht.

2. Glucan nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß e.s aus einem Extrakt von Myzeln und/oder Fruchtkörpern eines Stammes, der antikarzinoges ß-1,3-Glucan zu erzeugen vermag und zu dem Genus Pseudoplectania der Klasse 'Discomycetes gehört, oder von einem Kulturmedium isoliert worden ist, in'dem der Stamm bebrütet worden ist. :

3. Glucan nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm aus Pseudoplectania nigrella (Persl)'Fuckel K-1426 (FERM-P 5803, ATCC 20609) besteht.

4. Verfahren zur Herstellung, eines ß-1., 3-Glucans mit hohem.Molekulargewicht aus sich wiederholenden Glucopyranoseeinheiten, wobei jede Sinheit der Formel

β-D-GIu¹

3)ß-D-Glu°(l-3)ß-D-Glu(l

3)ß-D-Glu(l

■·■■·.

•entspricht, dadurch gekennzeichnet, daß eine filtrierte • Brühe aus einem Kulturmedium.oder ein flüssiger Extrakt ' aus Fruchtkörpern oder Myzeln eines· Stammes gebildet wird, der ß-1,3-Glucan zu erzeugen vermag und zu dem Genus Pseudoplectania der Klasse Discomycetes gehört, gebildet wird und das ß-1,3-Glucan aus der gefilterten Brühe oder dem flüssigen Extrakt in gereinigter Form gewonnen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ■ der eingesetzte Stamm aus Pseudoplectania nigrella (Pers.) Fuckel K-1426 (FERM-P 5803, ATCC 20.609) besteht.