KR920000486B1

KR920000486B1 - 항종양성 다당류의 정제방법

Info

Publication number: KR920000486B1
Application number: KR1019880003424A
Authority: KR
Inventors: 오광근; 박내헌; 이재흥; 이해주
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1988-03-29
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1992-01-14
Also published as: KR890014582A

Abstract

내용 없음.

Description

항종양성 다당류의 정제방법

제1도는 본 발명에 따라 정제한 항종양성 다당류의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 한국산 담자균강(Basidiomycetes), 코리오루스(Coriolus)속에 속하는 변종 진균을 심부배양하여 얻은 균사체로부터 항종양성 물질을 추출한후 새로이 할로우화이버시스템(Hollow Fiber System)을 도입하여 항종양성 물질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

근래에 담자균류에서 추출, 정제한 다당류가 우수한 항암작용 및 기타 약리 활성을 갖는 유효성분이라는 사실에 관심이 집중되고 있으며, 이 물질을 산업적으로 생산하는 방법에 대한 필요성이 증대되고 있다.

일반적으로 담자균류 균사체로부터 얻어지는 단백질 결합 다당류중 항암활성을 나타내는 분획은 분자량 5,000-10,000이상의 고분자 물질로서 저분자량 물질은 항암효과도 없고 쓴맛과 불쾌한 향기를 갖고 있기 때문에 항암성 다당류의 제조시에는 이 저분자물질을 제거하는 것이 매우 중요하며 이러한 목적으로 기존의 셀루로즈관을 이용한 투석 방법 및 막을 이용한 한외여과 또는, 역삼투압법이 주로 사용되어 왔으나 상기한 방법들은 조작이 불편하고 장시간이 소요되며 연속적으로 비항암성 저분자물질과 염을 제거하는 효율이 극히 낮아 산업적으로 이용할때 많은 결점이 있었다.

따라서 본 발명자들은 한국산 구름버섯의 변종인 코리오루스 베르시콜로(Fr). 쿠엘[corilous Versicolor(Fr.) Quel]의 균사체로부터 항종양성 물질을 추출한 후 정제함에 있어서 산업적으로 이용할 수 있는 효율적인 연속처리 방법을 연구하던 중, 할로우 화이버 시스템(Hollow Fiber system)을 도입하면 투석공정이 간단해질 뿐만 아니라 단시간내에 고품질의 항암성 다당류를 연속적으로 생성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서 추출 및 정제공정의 출발물질은 국내 특허공고 제84-505호에 기재된 것과 같이 분리개발되어 한국과학기술원에 820225-01310호로 기탁되어 있는 균주를 인공배양하여 얻은 균사체로 하였다.

본 발명을 좀더 상세히, 발효가 완료된 배양액을 약알칼리성에서 염화칼슘 등의 염을 첨가하여 점도를 낮춘후 여과 또는 원심분리하여 얻은 균사체를 열풍건조하여 항암성 다당류의 추출정제용 건조 균사체로 사용한다.

건조된 균사체를 수용성 알칼리로 추출한후 원심분리하여 추출액을 얻으며 이 공정을 수회 반복하여 얻은 추출액을 정제한다.

상기와 같이하여 얻어진 추출액을 농축하고 에탄올을 가하여 침전시킨 후 일야 냉장 방치하여 침전을 완결시킨 다음, 침전물을 분리하여 증류수에 용해시켜서 할로우 화이버 시스템을 이용하여 투석여과한다.

할로우 화이버 시스템은 상온에서 4 내지 6시간내에 원하는 부피의 다당류 용액을 처리하여 저분자물질을 제거할 수 있으며 필요에 따라 카트리지 갯수와 종류 및 할로우 화이버 시스템의 크기 등을 선택하여 사용할 수 있는 장점이 있고 단시간내에 연속적으로 고품질의 항암성분을 얻을 수 있다.

이 장치의 투석여과 수행능력은 일정한 부피를 가진 시료액의 투석여과가 완료되는데 소요된 시간으로 나타내며 투셕여과의 완료시점은 카트리지 외부로 방출되는 투석여과 완료액을 분석시 저분자 물질이 더 이상 나오지 않는 때로 한다.

투석여과가 완료되면 액을 농축하고 동결건조하여 분말상의 정제품을 얻는다. 상술한 방법으로 얻은 항종양성 다당류는 특이한 냄새는 있으나 맛은 없으며 피리딘, 클로로포름, 벤젠, n-헥산에 거의 녹지 않는 특성이 있다.

이 항종양성 물질을 정색반응 시켰을때 표 1에 기재된 바와같이 다당류, 펩타이드결합, α-아미노산등이 확인되었으며 이는 본 물질이 펩타이드 결합성 질소함유 다당류임을 보여준다.

[표 1]

본 물질에 염산을 가하여 질소충진하에 110℃에서 24시간 가수분해 시킨후 아미노산을 분석하면 아스파라긴산, 글루탐산 등의 산성아미노산과 바린, 로이신 등의 중성아미노산이 많고 라이신, 아르기닌 등의 염기성 아미노산은 적다.

또 이물질에 염화수소-메탄올을 가하고 100℃에서 16시간동안 메타놀리시스(methanolysis)를 행하고 얻어진 메타놀리시스 화물을 건조피리딘에 용해시켜 헥사메틸디실란과 트리메틸 클로로실란을 가해 트리메틸실릴화(trimethyl Silylation)하여 가스크로마토그래피 시험을 하면 글루코즈, 만노즈, 퓨코즈, 크실로즈, 갈락토즈를 함유하는 것을 알 수 있다.

이와같이 제조한 항종양물질은 쥐의 복강내에 투여하거나 경구투여 했을 때 항암작용을 갖는다. 즉, 종양세포를 마우스에 이식한 육종-180에 대해 상술한 항종양 물질을 복강내 투여하여 항암실험을 하였을때 78-95%의 종양저지율을 나타냈으며 경구투여했을때 65-85%의 저지율을 나타내었다.

[실시예 1]

국내 특허공보 제84-505호의 균주(한국과학기술원 기탁, 20225-01310를 배양한 배양액 5ℓ에 증류수 5ℓ를 가하여 희석시키고 5N 수산화나트륨을 가해 액성을 약알칼리성으로 하였다. 이 용액에 염화칼슘을 1.25%(W/V)로 첨가하고 상온에서 2시간 동안 교반하여 점도를 감소시켰다.

이와같이 전처리한 배양액을 원심분리하여 배양여액 성분을 제거한 균사체를 50℃에서 열풍건조하여 건조균사체를 얻었다. 건조균사체 150g을 취하여 0.1N 수산화나트륨용액 2.5ℓ에 용해한 후 삼구플라스크에 넣고 교반하면서 95-100℃로 3시간동안 추출한 다음, 냉각하고 2N염산으로 중화하여 흡인여과 함으로써 추출액과 잔사를 얻었다. 잔사를 0.2N 및 0.3N 수산화나트륨용액으로 상술한 방법으로 2회 반죽 추출하여 총 7.5ℓ의 추출액을 얻고 농축하여 750ml로 하여 3배 부피의 에탄올을 가하여 침전시킨후 일야 냉장 방치하여 침전을 완결시킨 다음 침전액을 여과하여 침전물을 분리하고 50℃ 건조기에서 24시간 건조하여 건조분말상의 침전물을 얻었다.

이 물질을 증류수에 용해시켜 1%농도로 하고 아미콘사의 H1P10-20 카트리지를 부착한 아미콘 CH 2 PR 할로우 화이버 시스템을 사용하여 상온에서 22Psi의 카트리지 내압하에 투석여과한후 농축하고 동결건조하여 항종양성 다당류 45g을 얻었다.

[실시예 2]

[항종양성 다당류의 확인 시험 및 성분 분석]

실시예 1에서 얻은 항종양성 물질 0.1g을 10ml의 증류수에 용해하여 pH를 측정한 결과 6.5-7.0이었으며, 메탄올, 에탄올, 피리딘, 클로로포름, 벤젠, n-헥산에 불용성이었다.

몇가지 정색반응의 결과는 표 1에 기재된 바와 같으며, 브롬화 칼륨 정제방법에 따라 측정된 본 물질의 적외선 흡수 스펙트럼은 제1도에 나타낸 바와같다.

안트론법의 공정을 행한 후 분광 광도계로 함량을 측정한 결과 60-80%이었고 가스크로마토그래피에 의해 구성당류를 분석하면 글루코즈, 만노즈, 퓨코즈, 크실로즈, 갈락토즈 등을 함유함을 알수 있었다.

로우리-폴린 방법의 공정을 행한 후 분광 광도계로 흡광도를 측정하여 단백질의 함량을 계산하여 18-35%이었고 아미노산 자동분석기에 의해 분석된 아미노산의 종류를 보면 아스파라긴산, 글루탐산 등의 산성아미노산과 바린, 로이신 등의 중성 아미노산이 많고 염기성 아미노산인 라이신, 아르기닌등은 적었다.

[실시예 3]

[항암 실험]

마우스 복강내에 육종-180세포현탁액 0.1ml(1×10⁷cell/ml)를 이식하여 일주일간 계대배양하였다. 이 마우스를 해부하여 복수액중의 육종-180세포를 분리해 낸후, 그 세포액 0.1ml(1×10⁷cell/ml)씩을 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 주사하여 고형암을 유발시켰다.

암을 이식한 후 일군에는 생리식염수에 용해시킨 항종양 물질을 20mg/kg의 농도로 복강투여하였고 다른 군에는 250mg/kg의 농도로 경구투여 하였다. 두개의 군 모두 1일째부터 격일 간격으로 1회씩 10번 투여하였다. 상술한 방법과 같은 방법으로 생리식염수만을 복강투여 및 경구투여하여 비투여 대조군으로 하였다. 투여종료후 5일째에 마우스를 모두 치사시키고 고형종양을 적출해 내어 종양의 무게를 측정하였다.

항종양능을 나타내는 종양의 저지백분율을 다음과 같은 식에 의해 구하였다.

Cw=비투여 대조군의 평균종양 무게

Tw=항종양성 물질 투여군의 평균종양 무게

위와같은 실험을 하였을때 암 억제율은 복강내 투여의 경우 78-95%를 나타내었고 경구투여의 경우 65-85%를 나타내었다.

[실시예 4]

실시예 1에서 얻은 분말상의 침전물질을 증류수로 녹여 표 2와 같이 여러 농도에 따라 2000ml로 만든후 25℃에서 22Psi의 카트리지 내압하에서 투석여과하고 농축 및 동결건조함으로써 각각 분말상을 수득한 후 평량하였다.

이 물질을 실시예 3과 같은 방법으로 마우스의 복강에 투여하여 암억제율을 계산하였다.

실험결과는 표 2와 같다.

[표 2]

본 실험결과로부터 용액의 농도가 0.5-1.5%일때 가장 높은 수율로 뛰어난 항암효과를 가진 정제물을 얻을수 있음을 알수 있다.

[실시예 5]

실시예 1에서 얻은 분말상의 침전물질 11.2g을 증류수에 용해하여 1%용액 14ℓ를 만든다음 2000ml 취하여 25℃로 표 3과 같은 여러 가지의 카트리지 내압으로 투석 여과한후 농축하였다. 농축액을 동결 건조하여 각각의 분말상 정제물을 수득한후 평량하고 실시예 3과 같은 방법으로 항암실험하여 암 억제율을 계산하였다.

실험결과는 다음 표 3과 같다.

[표 3]

본 실험의 결과로 볼때 카트리지로 들어가는 용액의 공급압력을 10-15Psi로 유지하면서 용액의 출구를 제한함으로 인한 카트리지의 내압증가분을 7-12Psi로 하여 카트리지의 내압을 총 22Psi로 해줄때 가장 단시간에 투석여과가 완료되었고 따라서 수율로 높았으며 좋은 항암활성을 갖는 정제물을 수득할 수 있음을 알았다.

Claims

한국산 구름버섯의 변종인 코리오루스 베르시 콜로(Fr.) 쿠엘[Coriolus Versicolor(Fr.) Quel] 균사체로부터 추출한 질소함유 다당류 용액을 할로우 화이버 시스템을 사용하여 투석여과 함으로써 비항암성저분자 물질과 염을 제거함을 특징으로 하는 항종양성 다당류의 정제방법.
제1항에 있어서, 투석여과시 용액농도를 0.5-1.5%, 할로우 화이버 시스템의 용액공급압력을 10-15Psi, 할로우 화이버 시스템의 출구밸브 제한에 의한 증가압력을 7-12Psi로 하여 행함을 특징으로 하는 방법.