ES2964588T3

ES2964588T3 - Composiciones enriquecidas estereoquímicamente para la administración de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2964588T3
Application number: ES15811080T
Authority: ES
Inventors: Frank Derosa; Shrirang Karve; Michael Heartlein
Original assignee: Translate Bio Inc
Current assignee: Translate Bio Inc
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2024-04-08
Anticipated expiration: 2035-06-24
Also published as: KR20220049613A; AU2021201357A1; CA2952824A1; AU2023201655A1; US10138213B2; US20150376144A1; MA40241A; US11104652B2; KR20170021281A; AU2015279968A1; KR102511554B1; KR20230041838A; EP3160959A1; PE20171238A1; JP2017520563A; EP3160959A4; IL249615A0; SG11201610670WA; EA201692309A1; MX2017000143A

Abstract

Se proporciona, en parte, una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmula I, cada una de las cuales es un compuesto de fórmula (I): una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un solvato del mismo o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. la composición caracterizada porque una cantidad mayor que una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmula I en la composición: son entidades químicas de fórmula Ia, en la que la primera cantidad umbral es 50%; o son entidades químicas de fórmula Ib1, en la que la primera cantidad umbral es 25%; o son entidades químicas de fórmula Ib2, en donde la primera cantidad umbral es 25%, en donde las entidades químicas de fórmula Ia, Ib1 y Ib2 se describen en el presente documento, y métodos para usar dichas composiciones, por ejemplo, para la administración de un polinucleótido. en vivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones enriquecidas estereoquímicamente para la administración de ácidos nucleicosANTECEDENTES

Administración de ácidos nucleicos usando lípidos se ha explorado extensamente para el tratamiento de varias enfermedades. Sigue habiendo una gran necesidad de lípidos y/o composiciones lipídicas que pueden administrar ácidos nucleicos, tal como ARN de interferencia corto (ARNic) y ARN mensajero (ARNm) con alta eficiencia y baja toxicidad.

Megan Cavanaugh Terpetal.,lnternational Journal of Pharmaceutics, Elsevier, Ámsterdam, vol. 430, núm. 1, páginas 328-334 describe “el efecto de la estructura estereoquímica de DOTAP sobre la eficacia de la transfección”.

El documento US 2013/158021 A1 describe “compuestos y composiciones caracterizadas... por la conjugación de varios grupos, tal como grupos lipófilos, a un grupo amino o amida de un aminoácido, un péptido lineal o cíclico, un polipéptido cíclico lineal o un isómero estructural del mismo”.

Dong Y.et al.,PNAS, vol. 111, núm. 1, páginas 3955-3960 describe “nanopartículas de lipopéptidos como transportadores de ARNic potentes y selectivos con un amplio índice terapéutico”.

SUMARIO

Entre otras cosas, la presente invención proporciona composiciones que comprenden lípidos enriquecidos estereoquímicamente para la administración de ARNm. La invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que las composiciones que comprenden lípidos enriquecidos estereoquímicamente de la fórmulaI, a continuación, son altamente eficaces y tienen una toxicidad inesperadamente baja en la administración de ARNm y la producción de proteína codificadain vivo:

Los presentes inventores descubrieron que, cuando se utilizan para la administración de ARNm, las composiciones enriquecidas estereoquímicamente deItienen una toxicidad sorprendentemente baja en comparación con las composiciones no enriquecidas estereoquímicamente, o menos enriquecidas estereoquímicamente, del mismo lípido, como se evidencia, por ejemplo, por los niveles de expresión de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) dramáticamente más bajos. Consulte la Tabla 1.

En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI, cada una de las cuales es un compuesto de fórmulaI:

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

caracterizándose la composición porque más de o igual a una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición:

son entidades químicas de fórmulal.a:

donde la primer cantidad umbral es 50%.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína, encapsulado dentro de un liposoma, en el que dicho liposoma comprende una composición lipídica catiónica de la presente invención, para usar en un método de suministro de ARN mensajero (ARNm)in vivo,comprendiendo dicho método la administración a un sujeto en necesidad de la administración de dicha composición de manera que la administración de la composición dé como resultado la expresión de la proteína codificada por el ARNmin vivo.

En formas de realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI, cada una de las cuales es un compuesto de fórmulaI:

caracterizándose la composición en que más de o igual a una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición:

son entidades químicas de fórmulal.a:

donde la primera cantidad umbral es 50%.

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.b.1:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.b.2:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.c:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.d:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.e:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.f:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.g:

Las entidades químicas de fórmula I pueden ser entidades químicas de fórmula l.h:

En algunas formas de realización, la primera cantidad umbral es 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunas formas de realización, la primera cantidad umbral es 70%. En algunas formas de realización, la primera cantidad umbral es 80%. En algunas formas de realización, la primera cantidad umbral es 95%.

En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición es una entidad química de fórmulal.a.i:

En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmula l.a en la composición es una entidad química de fórmulal.a.ii:

Una entidad química de fórmula I puede ser una entidad química de fórmulal.b.1.i:

(esdecir. R4 ss cKK<£72)>

Una entidad química de fórmula I puede ser una entidad química de fórmulal.b.1.ii:

Una entidad química de fórmula I puede ser una entidad química de fórmulal.b.2.i:

Una entidad química de fórmula I puede ser una entidad química de fórmulal.b.2.ii:

En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 50%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es del 70%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es del 80%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es del 95%.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmula I tiene la estructura de fórmula l.a.i, l.a.ii, l.b.1.i, l.b.1.ii, l.b.2.i o l.b.2.ii.

En algunas formas de realización, más de o igual a la tercera cantidad umbral de la cantidad total de la composición es una entidad química de fórmulal.a.iol.a.ii.En algunas formas de realización, más de o igual a la tercera cantidad umbral de la cantidad total de la composición es una entidad química de fórmulal.a.i. En algunas formas de realización, más de o igual a la tercera cantidad umbral de la cantidad total de la composición es una entidad química de fórmulal.a.ii.

En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% (p/p). En algunas formas de realización, La tercera cantidad umbral es 50% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 70% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 80% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 85% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 95% (p/p).

En algunas formas de realización, una composición proporcionada comprende además uno o más ARNm para la administración y expresión del ARNm de la proteína codificadain vivo.

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína, encapsulado dentro de un liposoma, en el que dicho liposoma comprende una composición lipídica catiónica de la presente invención, para usar en métodos para administración y expresión altamente eficientes de ARNm y proteína codificadain vivo.En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína, encapsulado dentro de un liposoma, en el que dicho liposoma comprende una composición lipídica catiónica de la presente invención, para usar en un método de administración de ARNmin vivo,que comprende administrar a un sujeto que necesita la administración de dicha composición. En algunas formas de realización, debido a su baja toxicidad, una composición proporcionada permite más ARNm administrado, un nivel de expresión de proteína más alto y/o menor frecuencia de administración, proporcionando así una terapia de ARNm más potente, más segura y más fácil de patentar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 representa los resultados de la producción de proteína ASS1 humanain vivoen hígado de ratón de tipo salvaje tras el tratamiento con nanopartículas lipídicas que incluyen compuestos de fórmula l.

DEFINICIONES

Para que la presente invención sea más fácilmente comprendida, ciertos términos se definen en primer lugar abajo. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo la memoria descriptiva. Las publicaciones y otros materiales de referencia referenciados en este documento describen los antecedentes de la invención y proporcionan un detalle adicional sobre su práctica.

Aminoácido:Tal como se utiliza en este documento, el término “aminoácido”, en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede ser incorporado en una cadena polipeptídica. En algunas formas de realización, un aminoácido tiene la estructura general H<e>N-C(H)(R)-COHO. En algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido que se produce de manera natural. En algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido d; en algunas formas de realización, un aminoácido es un aminoácido I. “Aminoácido estándar” se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos estándar I que se encuentran comúnmente en los péptidos que se producen de manera natural. “Aminoácido no estándar” se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en este documento, “aminoácido sintético” abarca aminoácidos químicamente modificados, incluyendo, pero sin limitarse a, sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxilo y/o aminoterminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar negativamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o más modificaciones postraduccionales, como la asociación con una o más entidades químicas (p. ej., grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, restos formilo, grupos isoprenoide, grupos sulfato, restos polietilenglicol, restos lipídicos, restos carbohidrato, restos biotina, etc.). El término “aminoácido” es usado indistintamente con “ residuo de aminoácido” y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoácido de un péptido. Va a ser evidente del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido.

Animal:Tal como se utiliza en este documento, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del Reino animal. En algunas formas de realización, “animal” se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas formas de realización, “animal” se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas formas de realización, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado bovino, un primate y/o un cerdo). En algunas formas de realización, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas formas de realización, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor de:Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” o “alrededor de”, cuando se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas formas de realización, el término “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un rango de valores que se ubica dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo del contexto (excepto cuando dicho número supere el 100% de un valor posible).

Entidad química:Tal como se utiliza en este documento, el término “entidad química” incluye un compuesto, sal o solvato del mismo, o cualquier combinación de compuestos, sales o solvatos de los mismos.

Administración:Como se usa en el presente documento, el término “administración” abarca la administración tanto local como sistémica. Por ejemplo, la administración de ARNm abarca situaciones en las que se administra un ARNm a un tejido diana y la proteína codificada se expresa y retiene dentro del tejido diana (también denominada “distribución local” o “administración local”), y situaciones en las que un ARNm se administra a un tejido diana y la proteína codificada se expresa y secreta al sistema circulatorio del paciente (p. ej., suero) y se distribuye sistemáticamente y es absorbida por otros tejidos (también denominada “distribución sistémica” o “administración sistémica”).

Expresión:Tal como se utiliza en este documento, “expresión” de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a la traducción de un ARNm en un polipéptido, ensamblar múltiples polipéptidos (p. ej., cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo) en una proteína intacta (p. ej., anticuerpo) y/o modificación post-traduccional de un polipéptido o proteína completamente ensamblada (por ejemplo, anticuerpo). En esta solicitud, los términos “expresión” y “producción”, y su equivalente gramatical, se utilizan indistintamente.

Funcional:Tal como se utiliza en este documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza.

Vida media:Tal como se utiliza en este documento, el término “vida media” es el tiempo necesario para que una cantidad tal como la concentración o actividad de ácido nucleico o proteína caiga a la mitad de su valor tal como se ha medido al comienzo de un período de tiempo.

Mejorar, aumentaroreducir.Tal como se utiliza en este documento, los términos “mejorar”, “aumentar” o “reducir”, o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como la medición en el mismo individual previamente a la iniciación del tratamiento descrito en este documento, o una medición en un sujeto de control (o múltiples sujetos de control) en ausencia del tratamiento descrito en este documento. Un “sujeto de control” es un sujeto afligido con la misma forma de enfermedad que el sujeto a ser tratado, el cual tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto bajo tratamiento.

In vitro:Como se usa en este documento, el término"in vitro"se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo:Como se usa en este documento, el término"in vivo"se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, como un humano y un animal no humano. En el contexto de sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemasin vitro).

Aislado:Tal como se utiliza en este documento, el término “aislado” se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% de los otros componentes con los que estaban inicialmente asociados. En algunas formas de realización, los agentes aislados presentan aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% de pureza. Como se usa en este documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. Tal como se utiliza en este documento, el cálculo del porcentaje de pureza de las sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (p. ej., tampón, disolvente, agua, etc.).

Distribuciónoadministración local:Como se usa en este documento, los términos “distribución local”, “administración local”, o equivalente gramatical, se refieren a la administración o distribución específica de tejido. Por lo general, la distribución o administración local requiere que una proteína (p. ej., una enzima) codificada por ARNm se traduzca y exprese intracelularmente o con secreción limitada que evite que entre en el sistema circulatorio del paciente.

ARN mensajero (ARNm):Tal como se utiliza en este documento, el término “ARN mensajero (ARNm)” se refiere a un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido. El ARNm, como se usa en el presente documento, abarca tanto el ARN modificado como el no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes. El ARNm se puede purificar a partir de fuentes naturales, producir utilizando sistemas de expresión recombinantes y, opcionalmente, purificarse, sintetizarse químicamente, etc. En su caso, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, el ARNm puede comprender análogos de nucleósido tales como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la dirección 5’ a 3’ a menos que se indique lo contrario. En algunas formas de realización, un ARNm es o comprende nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodoruridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (p. ej., bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (p. ej., 2’-fluororribosa, ribosa, 2’-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (p. ej., enlaces fosforotioato y 5’-N-fosforamidito).

En algunas formas de realización, el ARNm comprende uno o más residuos de nucleótidos no estándar. Los residuos de nucleótidos no estándar pueden incluir, por ejemplo, 5-metilcitidina (“5mC”), pseudouridina y/o 2-tiouridina (“2sU”). Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. núm. 8.278.036 o el documento WO2011012316 para una discusión de tal residuos y su incorporación a ARNm. El ARNm puede ser ARN, el cual es definido como ARN en el que el 25% de residuos U son 2-tiouridina y el 25% de los residuos C son 5-metilcitidina. Se divulgan enseñanzas para el uso de ARN en la Publicación de Patente de EE. UU. US20120195936 y la Publicación Internacional WO2011012316. La presencia de residuos de nucleótidos no estándar puede hacer que un ARNm sea más estable y/o menos inmunogénico que un ARNm de control con la misma secuencia pero que contiene solo residuos estándar. En formas de realización adicionales, el ARNm puede comprender uno o más residuos de nucleótidos no estándar elegidos entre isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina citosina, así como combinaciones de estas modificaciones y otras modificaciones de nucleobase. Ciertas formas de realización pueden incluir además modificaciones adicionales al anillo de furanosa o nucleobase. Las modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, modificaciones o sustituciones de azúcar (p. ej., una o más de una modificación 2’-O-alquilo, un ácido nucleico bloqueado (LNA)). En algunas formas de realización, los ARN pueden formar complejos o hibridarse con polinucleótidos y/o polinucleótidos peptídicos (PNA) adicionales. En las formas de realización en las que la modificación de azúcar es una modificación de 2’-O-alquilo, dicha modificación puede incluir, pero no está limitada a, una modificación 2’-desoxi-2’-fluoro, una modificación 2’-O-metilo, una modificación 2’-O-metoxietilo y una modificación 2’-desoxi. En determinadas formas de realización, cualquiera de estas modificaciones puede estar presente en el 0-100% de los nucleótidos, por ejemplo, más del 0%, 1 %, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o 100% de los nucleótidos constituyentes individualmente o en combinación.

Ácido nucleico:Tal como se utiliza en este documento, el término “ácido nucleico”, en su más amplio sentido, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que está incorporado o puede incorporarse a una cadena polinucleotídica. En algunas formas de realización, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que está incorporado o puede incorporarse a una cadena polinucleotídica a través de un enlace fosfodiéster. En algunas formas de realización, “ácido nucleico” se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (p. ej., nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas formas de realización, “ácido nucleico” se refiere a una cadena polinucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas formas de realización, “ácido nucleico” abarca ARN, así como ADN monocatenario y/o bicatenario y/o ADNc.

Paciente:Tal como se utiliza en este documento, el término “paciente” o “sujeto” se refiere a cualquier organismo al que se puede administrar una composición proporcionada, por ejemplo, con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas formas de realización, un paciente es un ser humano. Un humano incluye formas pre- y posnatales.

Farmacéuticamente aceptable:El término “farmacéuticamente aceptable”, tal como se utiliza en este documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación riesgo/beneficio razonable.

Polímero:Como se usa en este documento, un “polímero” se refiere a un compuesto compuesto por al menos 3 (p. ej., al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, etc.) unidades estructurales unidas covalentemente de repetición.

Sal:Como se usa en este documento, el término “sal” o “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin indebida toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y son proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Bergeet al.,describe sales farmacéuticamente aceptables en detalle enJ. Pharmaceutical Sciences(1977) 66:1 -19. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas, farmacéuticamente aceptables, son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos como el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos como el ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o utilizando otros métodos utilizados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metal alcalino, de metal alcalinotérreo, de amonio y de N+(alquilo C1-4)4. Las sales de metal alcalino o alcalinotérreo representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales formadas a partir de la cuaternización de una amina usando un electrófilo apropiado, por ejemplo, un haluro de alquilo, para formar una sal de amino alquilada cuaternizada.

Distribuciónoadministración sistémica:Como se usa en este documento, los términos “distribución sistémica”, “administración sistémica”, o equivalente gramático, se refieren a un mecanismo o enfoque de administración o distribución que afectan a todo el cuerpo o a un organismo entero. Normalmente, la distribución o administración sistémica se logra a través del sistema de circulación del cuerpo, por ejemplo, el torrente sanguíneo. En comparación con la definición de “distribución o administración local”.

Sujeto:Tal como se utiliza en este documento, el término “sujeto” se refiere a un humano o cualquier animal no humano (p. ej., ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado bovino, cerdo, oveja, caballo o primate). Un ser humano incluye formas pre- y posnatales. En muchas formas de realización, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un ser humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término “sujeto” se usa en este documento de manera intercambiable con “individuo” o “paciente”. Un sujeto puede estar afligido con o ser susceptible a una enfermedad o trastorno pero puede o no mostrar síntomas de la enfermedad o trastorno.

Sustancialmente:Tal como se utiliza en este documento, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de exhibir extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Una persona con conocimientos ordinarios en las artes biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos casi nunca, si alguna vez, llegan a completarse y/o avanzan completamente o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente” es usado en este documento para capturar la potencial falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Tejidos diana:Como se usa en este documento, el término “tejidos diana” se refiere a cualquier tejido que se ve afectado por una enfermedad que ha de ser tratada. En algunas formas de realización, los tejidos diana incluyen aquellos tejidos que muestran patología, síntoma o característica asociada con la enfermedad.

Cantidad terapéuticamente efectiva:Como se usa en este documento, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando es administrada a un sujeto que sufre o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o condición, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición del síntoma/de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o condición. Será apreciado por los expertos en la materia que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra normalmente a través de un régimen de dosificación que comprende al menos una dosis unitaria.

Tratar:Tal como se utiliza en este documento, el término “tratar”, “tratamiento” o “tratado” se refiere a cualquier método utilizado para parcial o completamente aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición particular. El tratamiento puede ser administrado a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o presenta solo signos tempranos de la enfermedad con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar la patología asociada con la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones lipídicas y su uso en métodos para administrar ARNmin vivousando composiciones lipídicas estereoquímicamente enriquecidas.

Composiciones lipídicas

Como se usa en el presente documento, una “entidad química” de una fórmula es un compuesto de la fórmula, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un solvato del mismo o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En formas de realización, la composición se caracterizada porque más de o igual a una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a. En algunas formas de realización, la composición se caracteriza porque más de una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a. En formas de realización, la composición se caracteriza porque una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a. En algunas formas de realización, una primera cantidad umbral es 50%. En algunas formas de realización, una primera cantidad umbral es 70%. En algunas formas de realización, una primera cantidad umbral es 80%. En algunas formas de realización, una primera cantidad umbral es 90%. En algunas formas de realización, una primera cantidad umbral es 95%.

En formas de realización, más de una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de una primera fórmula seleccionada de fórmulasl.a.. En formas de realización, una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de una primera fórmula seleccionada de fórmulasl.a. En algunas formas de realización, más de una segunda cantidad umbral de la cantidad total de las entidades químicas de la primera fórmula en la composición son entidades químicas del mismo estereoisómero de la primera fórmula. En algunas formas de realización, una segunda cantidad umbral de la cantidad total de las entidades químicas de la primera fórmula en la composición son entidades químicas del mismo estereoisómero de la primera fórmula.

En formas de realización, una primera fórmula es la fórmulal.a. En algunas formas de realización, más de o igual a la primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a, y más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de las entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas del mismo estereoisómero de fórmulal.a.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.i:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.ii:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.iii:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulaI.a.vi:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.v:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.vii:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.viii:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.ix:

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulal.atiene la estructura de fórmulal.a.x:

En algunas formas de realización, más de o igual a la segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.i.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.ii.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.iii.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.iv.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.v.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulaI.a.vi.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.vii.En algunas formas de realización, más de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.viii.En algunas formas de realización, mayores o iguales a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.a.en la composición son entidades químicas de fórmulal.a.ix.

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de fórmulal.b.l.i(es decir,R4-SS-cKK-E12).

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de fórmulal.b.1.ii(es decir,S4-SS-cKK-E12).

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de la fórmulal.b.1.iii:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de fórmulal.b.1.iv:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de fórmula I.b.1.v:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.1que tiene la estructura de fórmulal.b.l.vi:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.2que tiene la estructura de fórmulaI.b.2.i(es decir,R4-RR-cKK-E12).

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.2que tiene la estructura de fórmulaI.b.2.ii(es decir,S4-RR-cKK-E12).

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.2que tiene la estructura de fórmulal.b.2.iii:

Una entidad química de fórmulaIpuede ser un estereoisómero de fórmulal.b.2que tiene la estructura de fórmulal.b.2.iv:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulal.b.2que tiene la estructura de fórmulaI.b.2.v:

Una entidad química de fórmula I puede ser un estereoisómero de fórmulaI.b.2que tiene la estructura de fórmulaI.b.2.vi:

En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 50%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 70%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es del 80%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 85%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 90%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 95%.

En formas de realización, una composición proporcionada se caracteriza porque más de o igual a una tercera cantidad umbral de la cantidad total de productos químicos entidades de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulaI.a.En formas de realización, una composición proporcionada se caracteriza porque más de o igual a una tercera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulaI.a.

En algunas formas de realización, una composición proporcionada se caracteriza porque más de o igual a una tercera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulaI.a.i, I.a.ii, I.a.iii, I.a.iv, I.a.v, I.a.vi, I.a.vii, I.a.viii y I.a.ix.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.i, I.a.ii, I.a.iii, I.a.iv, I.a.v, I.a.vi, I.a.vii, I.a.viiioI.a.ix.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.i.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.ii.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.iii.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de la fórmulaI.a.iv.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de la fórmulaI.a.v.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.vi.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.vii.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulaI.a.viiiiEn algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.a.ix.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.1.i, l.b.1.ii, l.b.l.iii, l.b.l.iv, l.b.l.vol.b.1.vi.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.1.i.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.l.ii.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.1.iii.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.1.iv.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de la fórmulal.b.1.v.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.1.vi.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.i, l.b.2.ii, l.b.2.iii, l.b.2.iv, l.b.2.v o l.b.2.vi.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.i.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.ii.

En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.iii.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.iv.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de la fórmulal.b.2.v.En algunas formas de realización, un estereoisómero de fórmulaItiene la estructura de fórmulal.b.2.vi.

En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 50% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 70% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 80% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 85% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 90% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es del 95% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 96% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 97% (p/p). en algunas formas de realización, La tercera cantidad umbral es 98% (p/p). En algunas formas de realización, la tercera cantidad umbral es 99% (p/p).

En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI, siendo cada una de ellas un compuesto de fórmulaI:

la composición caracterizada porque más de una tercera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.i:

en donde la tercera cantidad umbral es 50%.

la composición caracterizada porque más de una tercera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulaIen la composición son entidades químicas de fórmulal.a.ii:

donde la tercera cantidad umbral es 50%.

En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 50%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 70%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es del 80%. En algunas formas de realización, la segunda cantidad umbral es 95%.

Liposomas para la adm inistración de agentes, ta lcomoARNm

Entre otras cosas, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto lipídico descrito en el presente documento para la administración de agentes terapéuticos. En algunas formas de realización, una composición proporcionada es una nanopartícula basada en lípidos, como un liposoma. Como se usa en este documento, el término “liposoma” se refiere a cualquier vesícula de nanopartículas lipídicas lamelares, multilamelares o sólidas. Por lo general, un liposoma tal como se utiliza en este documento puede formarse mezclando uno o más lípidos o mezclando uno o más lípidos y polímero(s). Por lo tanto, el término “liposoma”, como se usa en el presente documento, abarca nanopartículas basadas tanto en lípidos como en polímeros. En particular, un liposoma según la presente invención incorpora un compuesto lipídico descrito en el presente documento como componente lipídico catiónico. Como ejemplo no limitativo, un liposoma de acuerdo con la presente invención incluye una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulal. Un liposoma adecuado también puede contener segundos o adicionales lípidos catiónicos, lípidos auxiliares (p. ej., lípidos no catiónicos y/o lípidos basados en colesterol), lípidos modificados con PEG y/o polímeros.

En algunas formas de realización, el/los lípido(s) catiónico(s) (p. ej., la composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI) constituye(n) aproximadamente el 30-50% (p. ej., aproximadamente el 30-45%, aproximadamente el 30-40%, aproximadamente el 35-50%, aproximadamente el 35-45% o aproximadamente el 35-40%) del liposoma por relación molar. En algunas formas de realización, el lípido catiónico (por ejemplo, la composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI) constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45% o aproximadamente el 50% del liposoma por relación molar. En algunas formas de realización, el liposoma comprende un segundo lípido o lípidos catiónicos adicionales.

Segundosoadicionales lípidos catiónicos

En algunas formas de realización, los liposomas pueden comprender un segundo o adicional lípido catiónico. Como se utiliza en este documento, la frase “lípidos catiónicos” se refiere a cualquiera de un número de especies de lípidos que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. En la literatura se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos particularmente adecuados para usar en las composiciones y las composiciones para usar en los métodos de la invención incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 (y en particular, C12-200 descritos en el párrafo [00225]), WO 2012/170930 y WO 2013063468. En ciertas formas de realización, las composiciones y su uso en los métodos de la invención emplean nanopartículas lipídicas que comprenden un lípido catiónico ionizable descrito en la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US2013/034602, presentada el 29 de marzo de 2013, Publ. núm. WO 2013/149140, tal como, por ejemplo, (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-(9z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1 -amina (HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-4,15,18-trien-1 -amina (HGT5001) y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)tetracosa-5,15,18-trien-1 -amina (HGT5002).

En algunas formas de realización, se usa el segundo o adicional lípido catiónico cloruro de N-[1 -(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio o “DOTMA”. (Feigneret al.(Proc. Nat’I Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de EE.<u>U. núm.

4.897.355). DOTMA se puede formular solo o puede ser combinado con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o “DOPE” u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal o una nanopartícula lipídica, y dichos liposomas se pueden usar para mejorar el suministro de ácidos nucleicos a las células diana. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxiespermilglicinadioctadecilamida o “DOGS”, 2,3-dioleiloxi-N- [2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o “DOSPA” (Behret al..Proc. Nat’I Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente de EE. UU. núm. 5.171.678; Patente de EE. UU. núm. 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano o “DODAP”, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o “DOTAP”. Los lípidos catiónicos ejemplares adicionales también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DSDMA”, 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DODMA”, 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DLinDMA”, 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o “DLenDMA”, cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o “DODAC”, bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio o “DDAB”, bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio o “DMRIE”, 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-I-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o “CLinDMA”, 2-[5’-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3’-oxapentoxi)-3-dimetil-I-(cis,cis-9’,I-2’-octadecadienoxi)propano o “CpLinDMA”, N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o “DMOBA”, 1,2-N,N’- dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DOcarbDAP”, 2,3-dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o “DLinDAP”, 1,2-N,N’ dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DLincarbDAP”, 1,2-dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o “DLinCDAP”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o “DLin- -DMA”, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o “DLin-K-XTC2-DMA”, y 2-(2,2-di((9Z,12z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (Véase el documento WO 2010/042877; Sempleet al..,Nature Biotech., 28: 172-176 (2010)), o mezclas de los mismos (Heyes, J.,et al.,J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV.,et al., Nat. Biotechnol.23(8): 1003-1007 (2005); Publicación PCT WO2005/121348A1). En algunas formas de realización, uno o más de los lípidos catiónicos comprenden al menos uno de un resto imidazol, dialquilamino o guanidinio.

En algunas formas de realización, el segundo o adicional lípido catiónico puede ser elegido de XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano), MC3 ((4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo, ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1 ,N16-diundecil-4,7,10,13tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamoniopropano), HGT4003 (documento WO 2012/170889), ICE (documento<w>O 2011/068810), HGT5000 (publicación de patente internacional W<o>/2013/149140) o HGT5001 (cis o trans) (documento WO/2013/149140), lipidoides de aminoalcohol tales como los descritos en el documento WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamoniopropano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamoniopropano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, l. “Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids” J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C.et al.“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Lave, K.T.et al.“Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869).

Lípidos no catiónicos/auxiliares

En algunas formas de realización, los liposomas proporcionados contienen uno o más lípidos no catiónicos (“auxiliares”). Como se usa en este documento, la frase “lípido no catiónico” se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Como se usa en este documento, la frase “lípido aniónico” se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que tienen una carga negativa neta en una H seleccionada, como el pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-I-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, l-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), o una mezcla de los mismos.

En algunas formas de realización, tales lípidos no catiónicos se pueden usar solos, pero se usan preferiblemente en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. En algunas formas de realización, el lípido no catiónico puede comprender una proporción molar de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 10% a aproximadamente 70% del lípido total presente en un liposoma. En algunas formas de realización, un lípido no catiónico es un lípido neutro, es decir, un lípido que no lleva carga neta en las condiciones en las que se formula y/o administra la composición. En algunas formas de realización, el porcentaje de lípido no catiónico en un liposoma puede ser superior al 5%, superior al 10%, superior al 20%, superior al 30% o superior al 40%.

Lípidosabase de colesterol

En algunas formas de realización, los liposomas proporcionados comprenden uno o más lípidos basados en colesterol. Por ejemplo, los lípidos catiónicos basados en colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao,et al.Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolfet al.,BioTechniques 23, 139 (1997), Patente de Estados Unidos núm. 5.744.335) o ICE. En algunas formas de realización, el lípido basado en colesterol puede comprender una proporción molar de aproximadamente 2% a aproximadamente 30%, o aproximadamente 5% a aproximadamente 20% del lípido total presente en un liposoma. En algunas formas de realización, el porcentaje de lípido a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser superior al 5%, 10%, superior al 20%, superior al 30% o superior al 40%.

Lípidos PEGilados

En algunas formas de realización, los liposomas proporcionados comprenden uno o más lípidos PEGilados. Por ejemplo, el uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo N-octanoil-esfingosina-I-[succinil(metoxipolietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramida) es también contemplado por la presente invención en combinación con uno o más de los lípidos catiónicos y, en algunas formas de realización, otros lípidos juntos que comprenden el liposoma. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de longitud C<6>-C<20>. En algunas formas de realización, un lípido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o PEG-2K. La adición de dichos componentes puede evitar la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida en circulación y aumentar la entrega de la composición de lípido-ácido nucleico a la célula diana (Klibanovet al.(1990) FEBS Letters, 268 (1): 235 237), o pueden seleccionarse para intercambiarse rápidamente fuera de la formulaciónin vivo(véase la Patente de EE. UU. núm. 5.885.613).

En algunas formas de realización, los lípidos intercambiables particularmente útiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (p. ej., C<14>o C<18>). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos derivatizados de la presente invención pueden comprender una proporción molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 4% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 2% del lípido total presente en el liposoma.

De acuerdo con varias formas de realización, la selección de segundos o adicionales lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que componen la nanopartícula lipídica, así como como la proporción molar relativa de tales lípidos entre sí, está basada en las características del/de los lípido(s) seleccionado(s), la naturaleza de las células diana previstas, las características del ARNm a administrar. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena de alquilo, así como el tamaño, carga, pH, pKa, fusogenicidad y toxicidad del/de los lípido(s) seleccionado(s). Por lo tanto, las relaciones molares pueden ajustarse en consecuencia. En algunas formas de realización, el porcentaje de lípido modificado con PEG en un liposoma puede ser superior al 1 %, superior al 2%, superior al 5%, superior a 10%, o superior al 15%.

Polímeros

En algunas formas de realización, un liposoma adecuado según la presente invención incluye además un polímero, en combinación con uno o más lípidos catiónicos como se describe y, en algunas formas de realización, otros portadores que incluyen varios lípidos descritos en este documento. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los vehículos de administración liposómicos, tal como se usan en el presente documento, también abarcan nanopartículas que contienen polímeros. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquilcianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactida-poliglicolida, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas, protamina, protamina PEGilada, PLL, PLL PEGilada y polietilenimina (PEI). Cuando está presente PEI, puede ser PEI ramificada de un peso que varía de 10 a 40 kDA, por ejemplo, PEI ramificada de 25 kDa (Sigma n.° 408727).

Agentes terapéuticos

La presente invención puede ser usada para administrar cualesquiera agentes terapéuticos. Específicamente, cualquier agente terapéutico que se vaya a administrar a un sujeto puede administrarse utilizando los complejos, picopartículas, nanopartículas, micropartículas, micelas o liposomas descritos en el presente documento. El agente puede ser una molécula orgánica (p. ej., un agente terapéutico, un fármaco), una molécula inorgánica, un ácido nucleico, una proteína, un aminoácido, un péptido, un polipéptido, un polinucleótido, un agente dirigido, una molécula orgánica o inorgánica marcada isotópicamente, una vacuna, un agente inmunológico, etc. En ciertas formas de realización de la presente invención, el agente a administrar puede ser una mezcla de agentes.

En ciertas formas de realización, los agentes terapéuticos son moléculas orgánicas con actividad farmacéutica, por ejemplo, un fármaco. En ciertas formas de realización, el fármaco es un antibiótico, un agente antiviral, un anestésico, un agente esteroideo, un agente antiinflamatorio, un agente antineoplásico, un agente anticancerígeno, antígeno, vacuna, anticuerpo, descongestionante, antihipertensivo, sedante, agente anticonceptivo, agente progestacional, anticolinérgico, analgésico, antidepresivo, antipsicótico, agente bloqueante I3-adrenérgico, diurético, agente activo cardiovascular, agente vasoactivo, agente antiinflamatorio no esteroideo, agente nutricional, etc.

Los agentes de diagnóstico incluyen gases; metales; agentes de formación de imágenes comercialmente disponibles utilizados en tomografía por emisión de positrones (TEP), tomografía asistida por computadora (TAC), tomografía computarizada por emisión de fotón único, rayos X, fluoroscopia y formación de imágenes por resonancia magnética (IRM); y agentes de contraste. Los ejemplos de materiales adecuados para usar como agentes de contraste en IRM incluyen quelatos de gadolinio, así como hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo. Los ejemplos de materiales útiles para formación de imágenes por rayos X y TAC incluyen materiales a base de yodo.

Los agentes terapéuticos y profilácticos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, suplementos nutricionales y vacunas. Las vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados, organismos y virus inactivados, organismos y virus muertos, organismos o virus modificados genéticamente y extractos de células.

Polinucleótidos

La presente invención se puede utilizar para administrar cualquier polinucleótido. En ciertas formas de realización, el polinucleótido es un ARN de interferencia (ARNi). Se discute el fenómeno del ARNi en mayor que detalle, por ejemplo, en las siguientes referencias: Elbashiret al.,2001,Genes Dev.,15:188; Fireet al.,1998,Nature,391:806; Tabaraet al.,1999, Cell, 99:123; Hammondet al., Nature,2000, 404:293; Zamoreet al.,2000, Cell, 101:25; Chakraborty, 2007,Curr. Durg Targets,8:469; y Morris y Rossi, 2006,Gene Ther.,13:553. En ciertas formas de realización, el polinucleótido es un ARNdc (ARN de doble cadena). En ciertas formas de realización, el polinucleótido es un ARNic (ARN de interferencia corta). En ciertas formas de realización, el polinucleótido es un ARNhc (ARN de horquilla corta). En ciertas formas de realización, el polinucleótido es un miARN (microARN). Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente de aproximadamente 21 - 23 nucleótidos de longitud que ayudan a regular la expresión génica, particularmente durante el desarrollo. Véase, por ejemplo, Bartel, 2004, Cell, 116:281; Novina y Sharp, 2004,Nature,430:161; y la publicación de patente estadounidense 2005/0059005; también revisado en Wang y Li, 2007,Front. Biosci.,12:3975; y Zhao, 2007,Trends Biochem. Sci.,32:189. En determinadas formas de realización, el polinucleótido es un ARN antisentido.

En ciertas formas de realización, el polinucleótido puede proporcionarse como un agente antisentido o ARN de interferencia (ARNi). Véase, por ejemplo, Fireet al., Nature391:806-811, 1998. La terapia antisentido pretende incluir, por ejemplo, la administración o provisiónin situde oligonucleótidos monocatenarios o bicatenarios o sus derivados que se hibridan específicamente, por ejemplo, se unen, en condiciones celulares, con ARNm celular y/o ADN genómico, o mutantes de los mismos, para inhibir la expresión de la proteína codificada, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. Véase, por ejemplo, Crooke “Molecular mechanisms of action of antisense drugs”Biochim. Biophys. Acta1489(1 ):31 -44, 1999; Crooke “Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs”Antisense Nucleic Acid Drug Dev.10(2):123-126, discusión 127, 2000; Methods in Enzymology, volúmenes 313-314, 1999. La unión puede ser por complementariedad de pares de bases convencional o, por ejemplo, en el caso de unión a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice (es decir, formación de triple hélice). Véase, p. ej., Chanetal., J. Mol. Med.75(4):267-282, 1997.

En algunas formas de realización, ARNdc, ARNic, ARNhc, miARN, ARN antisentido y/o el ARNi pueden ser diseñados y/o predichos usando uno o más de un gran número de algoritmos disponible. Para dar solo algunos ejemplos, los siguientes recursos se pueden utilizar para diseñar y/o predecir polinucleótidos: algoritmos que se encuentran en Alnylum Online, Dharmacon Online, OligoEngine Online, Molecula Online, Ambion Online, BioPredsi Online, RNAi Web Online, Chang Bioscience Online, lnvitrogen Online, LentiWeb Online GenScript Online, Protocol Online; Reynoldset al.,2004,Nat. Biotechnol.,22:326; Naitoet al.,2006,Nucleic Acids Res.,34:W448; Liet al.,2007, RNA, 13:1765; Yiuet al.,2005,Bioinformatics,21:144; y Jiaet al.,2006, BMC Bioinformatics, 7: 271.

Los polinucleótidos puede ser de cualquier tamaño o secuencia, y pueden ser de cadena única o doble. En ciertas formas de realización, el polinucleótido es mayor de 100 pares de bases de longitud. En ciertas formas de realización, el polinucleótido es mayor de 10.000 pares de bases de longitud y puede ser mayor de 10.000 pares de bases de longitud. El polinucleótido puede proporcionarse por cualquier medio conocido en la técnica. En determinadas formas de realización, el polinucleótido se ha diseñado utilizando técnicas recombinantes. Véase, p. ej., Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999);Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989). El polinucleótido también puede obtenerse de fuentes naturales y purificarse de componentes contaminantes encontrados normalmente en la naturaleza. El polinucleótido puede también ser químicamente sintetizado en un laboratorio. En ciertas formas de realización, el polinucleótido se sintetiza usando química de fase sólida estándar.

El polinucleótido puede modificarse por medios químicos o biológicos. En ciertas formas de realización, estas modificaciones conducen a una mayor estabilidad del polinucleótido. Las modificaciones incluyen metilación, fosforilación, ocupación de extremos, etc.

ARNm

La presente invención puede utilizarse para administrar cualquier ARNm. El ARNm es normalmente considerado como el tipo de ARN que lleva la información del ADN al ribosoma. La existencia de ARNm suele ser muy breve e incluye procesamiento y traducción, seguida de degradación. Normalmente, en organismos eucarióticos, el procesamiento de ARNm comprende la adición de una “caperuza” en el extremo N-terminal (5’), y una “cola” en el extremo C-terminal (3’). Una caperuza típica es una caperuza de 7-metilguanosina, que es una guanosina que se une a través de un enlace de 5’-5’-trifosfato con el primer nucleótido transcrito. La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La cola es normalmente un evento de poliadenilación por el que se añade un resto poliadenililo al extremo 3’ de la molécula de ARNm. La presencia de esta “cola” sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasa. El ARN mensajero normalmente se traduce por los ribosomas en una serie de aminoácidos que forman una proteína.

Cualquier ARNm capaz de traducirse en uno o más péptidos (p. ej., proteínas) o fragmentos de péptidos se contempla dentro del alcance de la presente invención. En algunas formas de realización, un ARNm codifica uno o más péptidos que se producen de manera natural. En algunas formas de realización, un ARNm codifica uno o más péptidos modificados o no naturales.

En algunas formas de realización un ARNm codifica una proteína intracelular. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína citosólica. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína asociada con el citoesqueleto de actina. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína asociada con la membrana plasmática. En algunas formas de realización específicas, un ARNm codifica una proteína transmembrana. En algunas formas de realización específicas, un ARNm codifica una proteína de canal iónico. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína perinuclear. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína nuclear. En algunas formas de realización específicas, un ARNm codifica un factor de transcripción. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína chaperona. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una enzima intracelular (p. ej., ARNm que codifica una enzima asociada con el ciclo de la urea o trastornos metabólicos de almacenamiento lisosomal). En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína involucrada en el metabolismo celular, reparación, transcripción y/o traducción del ADN. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína extracelular. En algunas formas de realización, un ARNm codifica una proteína asociada con la matriz extracelular. En algunas formas de realización un ARNm codifica una proteína secretada. En formas de realización específicas, se puede usar un ARNm usado en la composición y las composiciones para usar en los métodos de la invención para expresar proteínas funcionales o enzimas que se excretan o secretan por una o más células diana al líquido extracelular circundante (p. ej., neurotransmisores y/u hormonas que codifican ARNm).

Síntesis de ARNm

Los ARNm de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm según la presente invención se pueden sintetizar mediante transcripciónin vitro(IVT). Brevemente, la IVT se realiza normalmente con un molde de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un conjunto de ribonucleótido trifosfatos, un sistema tampón que puede incluir TDT e iones magnesio, y una ARN polimerasa adecuada (por ejemplo, ARN polimerasa T3, T7 o SP6), ADNsa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán según la aplicación específica.

En algunas formas de realización, para el preparación de ARNm de acuerdo con la invención, un molde de ADN se transcribein vitro.Un molde de ADN adecuado normalmente tiene un promotor, por ejemplo, un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripciónin vitro,seguido de la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm deseado y una señal de terminación.

La(s) secuencia(s) deseada(s) de ARNm según la invención se pueden determinar e incorporar a un molde de ADN usando métodos estándar. Por ejemplo, partiendo de una secuencia de aminoácidos deseada (p. ej., una secuencia de enzima), se lleva a cabo una traducción inversa virtual basada en el código genético degenerado. A continuación, se pueden usar algoritmos de optimización para la selección de codones adecuados. Normalmente, el contenido de G/C puede ser optimizado para lograr el contenido más alto posible de G/C por un lado, teniendo en cuenta lo mejor posible la frecuencia de los ARNt según el uso de codón por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y mostrarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). Una estructura secundaria puede también ser analizada para calcular propiedades estabilizadoras y desestabilizadoras o, respectivamente, regiones del ARN.

ARNm modificado

En algunas formas de realización, ARNm según la presente invención puede sintetizarse como ARNm no modificado o modificado. Por lo general, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones de ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Un ARNm modificado según la invención puede incluir así, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de base. En algunas formas de realización, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleótidos que se producen de manera natural y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos de nucleótidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, como, p. ej. 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, N6-isopenteniladenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metilinosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidrouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometiI-2-tiouracilo, 5’-metoxicarboniImetiluracilo, 5-metoxiuracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1 -metilpseudouracilo, queosina, BD-mannosil-queosina, wybutosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida para un experto en la materia, por ejemplo, de la Patente de EE. UU. núm. 4.373.071, Patente de EE. UU. núm. 4.401.796, Patente de EE. UU. núm. 4.415.732, Patente de EE. UU. núm. 4.458.066, Patente de EE. UU. núm. 4.500.707, Patente de EE. UU. núm. 4.668.777, Patente de EE. UU. núm. 4.973.679, Patente de EE. UU. núm. 5.047.524, Patente de EE. UU. núm.

5.132.418, Patente de EE. UU. núm. 5.153.319, Patente de EE. UU. núm. 5.262.530 y 5.700.642.

En algunas formas de realización, los ARNm (p. ej., ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de la estructura principal del ARN. Normalmente, una modificación de la estructura principal es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Las modificaciones de la estructura principal a modo de ejemplo incluyen normalmente, pero no se limitan a modificaciones del grupo que consiste en metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (p. ej., citidina 5’-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidina con carga positiva, etc., que significa reemplazar el enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

En algunas formas de realización, los ARNm (p. ej., ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de azúcar. Una modificación de azúcar típica es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene, incluyendo, pero sin limitarse a, las modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste en 2’-desoxi-2’-fluorooligorribonucleótido (2’-fluoro-2’-desoxicitidina 5’-trifosfato, 2’-fluoro-2’-desoxiuridina 5’-trifosfato), 2’-desoxi-2’-desamina-oligorribonucleótido (2’-amino-2’-desoxicitidina 5’-trifosfato, 2’-amino-2’-desoxiuridina 5’-trifosfato), 2’-O-alquiloligorribonucleótido, 2’-desoxi-2’-C-alquiloligorribonucleótido (2’-O-metilcitidina 5’-trifosfato, 2’-metiluridina 5’-trifosfato), 2’-C-alquiloligorribonucleótido e isómeros de los mismos (2’-aracitidina 5’-trifosfato, 2’-arauridina 5’-trifosfato) o azidotrifosfatos (2’-azido-2’-desoxicitidina 5’-trifosfato, 2’-azido-2’-desoxiuridina 5’-trifosfato).

En algunos componentes, los ARNm (p. ej., ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de base). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de base se denomina también nucleótido modificado por base. Los ejemplos de tales nucleótidos modificados por base incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribósido 5’-trifosfato, 2-aminoadenosina 5’-trifosfato, 2-tiocitidina 5’-trifosfato, 2-tiouridina 5’-trifosfato, 4-tiouridina 5’-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5’-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5’-trifosfato, 5-bromocitidina 5’-trifosfato, 5-bromouridina 5’-trifosfato, 5-yodocitidina 5’-trifosfato, 5-yodouridina 5’-trifosfato, 5-metilcitidina 5’-trifosfato, 5-metiluridina 5’-trifosfato, 6-azacitidina 5’-trifosfato, 6-azauridina 5’-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5’-trifosfato, 7-desazaadenosina 5’-trifosfato, 7-desazaguanosina 5’-trifosfato, 8-azaadenosina 5’-trifosfato, 8-azidoadenosina 5’-trifosfato, bencimidazol ribósido 5’-trifosfato, Nl-metiladenosina 5’-trifosfato, N1-metilguanosina 5’-trifosfato, N6-metiladenosina 5’-trifosfato, O6-metilguanosina 5’-trifosfato, pseudouridina 5’-trifosfato, puromicina 5’-trifosfato o xantosina 5’-trifosfato.

Estructura de caperuza

Normalmente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una “caperuza” en el extremo N-terminal (5’) y una “cola” en el extremo de C-terminal (3’). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una “cola” sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasa.

De este modo, en algunas formas de realización, los ARNm (p. ej., ARNm que codifican enzimas) incluyen una estructura de caperuza 5’. Una caperuza 5’ es normalmente agregada de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5’, dejando dos fosfatos terminales; guanosina trifosfato (GTP) luego se agrega a los fosfatos terminales a través de una guanilil transferasa, la cual produce un enlace de 5’5’5-trifosfato; y el 7-nitrógeno de guanina, luego se metila por una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G(5’)ppp (5’(A,G(5’)ppp(5’)A y G(5’)ppp(5’)G.

En algunas formas de realización, las estructuras de caperuza que se producen de manera natural comprenden una 7-metil guanosina que está unida a través de un puente trifosfato al extremo 5’ del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado una caperuza de dinucleótido de m<7>G(5’)ppp(5’)N, donde N es cualquier nucleósido.In vivo,la caperuza se agrega enzimáticamente. La caperuza se agrega en el núcleo y es catalizada por la enzima guanilil transferasa. La adición de la caperuza al extremo terminal 5’ del ARN ocurre inmediatamente después del inicio de la transcripción. El nucleósido terminal es normalmente una guanosina y está en la orientación inversa a todos los demás nucleótidos, es decir, G(5’)ppp(5’)GpNpNp.

Una caperuza común para ARNm producido por la transcripciónin vitroes m<7>G(5’)ppp(5’)G, que se ha utilizado como caperuza de dinucleótido en la transcripción con ARN polimerasa T7 o SP6in vitropara obtener ARN que tienen una estructura de caperuza en sus extremos terminales 5’. El método predominante para la síntesisin vitrode ARNm ocupado emplea un dinucleótido preformado de la forma m<7>G(5’)ppp(5’)G (“m<7>GpppG”) como iniciador de la transcripción.

Hasta la fecha, una forma habitual de una caperuza de dinucleótido sintética utilizada en experimentos de traducciónin vitroes el análogo de caperuza anti-inversa (“ARCA”) o ARCA modificado, que es generalmente un análogo de caperuza modificado en el que se reemplaza el grupo OH 2’ o 3’ por -OCH<3>.

Los análogos de caperuza adicionales incluyen, pero no están limitados a, estructuras químicas seleccionadas del grupo que consiste en m<7>GpppG, m<7>GpppA, m<7>GpppC; análogos de caperuza no metilados (p. ej., GpppG); análogo de caperuza dimetilado (p. ej., m<27>GpppG), análogo de caperuza trimetilado (p. ej., m<2’27>GpppG), análogos de caperuza simétricos dimetilados (p.ej., m<7>Gpppm<7>G) o análogos de caperuza anti-inversa (p.ej., ARCA; m<7-2O m e>GpppG, m<72 d>GpppG, m<73 O m e>GpppG, m<73 d>GpppG y sus derivados de tetrafosfato) (véase, por ejemplo, Jemielity, J.et al., "Novel ‘anti-reverse’ cap analogs with superior translationalproperties",RNA, 9: 1108-1122 (2003)).

En algunas formas de realización, una caperuza adecuada es un guanilato de 7-metilo (“m<7>G”) unido a través de un puente trifosfato al extremo 5’ del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado m<7>G(5’)ppp(5’)N, donde N es cualquier nucleósido. Una forma de realización preferida de una caperuza m<7>G utilizada en formas de realización de la invención es m<7>G(5’)ppp(5’)G.

En algunas formas de realización, la caperuza es una estructura Cap0, Las estructuras Cap0 carecen de un residuo 2’-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2. En algunas formas de realización, la caperuza es una estructura Cap1. Las estructuras Cap1 tienen un residuo 2’-O-metilo en la base 2. En algunas formas de realización, la caperuza es una estructura Cap2. Las estructuras Cap2 tienen un residuo de 2’-O-metilo unido a ambas bases 2 y 3.

Se conocen en la técnica una variedad de análogos de caperuza m<7>G, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos incluyen el m<7>GpppG descrito anteriormente, así como los análogos de caperuza ARCA 3’-OCH<3>y 2’-OCH<3>(Jemielity, J.et a l,RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Análogos de caperuza adicionales para usar en las formas de realización de la invención incluyen análogos de dinucleósido tetrafosfato N7-bencilado (descritos en Grudzien, E.et a l,RNA, 10: 1479-1487 (2004)), análogos de caperuza de fosforotioato (descritos en GrudzienNogalska, E.,et al.,RNA, 13: 1745-1755 (2007)) y análogos de caperuza (incluidos los análogos de caperuza biotinilados) descritos en las Patentes de EE. UU. núm. 8.093.367 y 8.304.529.

Estructura de cola

Normalmente, la presencia de una “cola” sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasa. Se cree que la cola de poli A estabiliza a los mensajeros naturales y el ARN sentido sintético. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, se puede añadir una cola de poli A larga a una molécula de ARNm, lo que hace que el ARN sea más estable. Las colas de poli A se pueden agregar usando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, las colas de poli A largas pueden ser añadidas a ARN sintético o transcritoin vitrousando poli A polimerasa (Yokoe,et al. Nature Biotechnology.1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas poli A largas. Además, las colas de poli A se pueden agregar por transcripción directamente de los productos de PCR. La poli A también se puede ligar al extremo 3’ de un ARN sentido con ARN ligasa (véase, por ejemplo,MolecularCloning A Laboratory Manual,2a ed., editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)).

En algunas formas de realización, los ARNm (p. ej., ARNm que codifican enzimas) incluyen una estructura de cola de 3’ poli(A). Normalmente, la longitud de la cola de poli A puede ser de al menos alrededor de 10, 50, 100, 200, 300, 400 al menos 500 nucleótidos. En algunas formas de realización, una cola de poli A en el extremo terminal 3’ del ARNm normalmente incluye aproximadamente 10 a 300 nucleótidos de adenosina (p. ej., aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 20 a 70 de nucleótidos de adenosina, o aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas formas de realización, los ARNm incluyen una estructura de cola de 3’ poli(C). Una cola de poli C adecuada en el extremo terminal 3’ del ARNm normalmente incluye de 10 a 200 nucleótidos de citosina (p. ej., de 10 a 150 nucleótidos de citosina, de 10 a 100 nucleótidos de citosina, de 20 a 70 nucleótidos de citosina, de 20 a 60 nucleótidos de citosina, o aproximadamente 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola de poli C puede añadirse a la cola de poli A o puede sustituir a la cola poli-A

En algunas formas de realización, la longitud de la cola de poli A o poli C es ajustada para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm sentido modificado de la invención y, por lo tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm sentido, la longitud de la cola de poli A puede ser ajustada para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y, por lo tanto, controlar el curso temporal de la expresión de polinucleótidos y/o la producción de polipéptidos en una célula diana.

Región no traducida en 5 'y 3 ’

En algunas formas de realización, los ARNm incluyen una región no traducida en 5’ y/o 3’. En algunas formas de realización, una región no traducida en 5’ incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o la traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas formas de realización, una región no traducida en 5’ puede ser de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.

En algunas formas de realización, una región no traducida en 3’ incluye una o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas formas de realización, una región no traducida en 3’ puede ser de entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.

Las secuencias UTR en 3’ y/o 5’ a modo de ejemplo pueden derivarse de moléculas de ARNm que son estables (p. ej., globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm sentido. Por ejemplo, una secuencia UTR en 5’ puede incluir una secuencia parcial de un gen inmediato temprano 1 (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a la nucleasa y/o mejorar la vida media del polinucleótido. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humana (hGH) o un fragmento de la misma en el extremo 3’ o la región no traducida del polinucleótido (p. ej., ARNm) para estabilizar aún más el polinucleótido. Generalmente, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (p. ej., la vida media) del polinucleótido en relación con sus equivalentes no modificados e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de tales polinucleótidos a la digestión con nucleasasin vivo.

De acuerdo con varias formas de realización, ARNm de cualquier tamaño puede ser encapsulado por los liposomas proporcionados. En algunas formas de realización, los liposomas proporcionados pueden encapsular ARNm de más de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb o 5 kb de longitud.

Liposomas

Los liposomas para usar en composiciones proporcionadas pueden ser preparados por varias técnicas que son actualmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, vesículas multilamelares (MLV) se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales, como depositar un lípido seleccionado en la pared interior de un recipiente o contenedor adecuado disolviendo el lípido en un disolvente apropiado, y entonces evaporando el disolvente para dejar una película delgada en el interior del recipiente o por secado por rociado. A continuación, se puede añadir una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de MLV. A continuación, se pueden formar vesículas unilamelares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, las vesículas unilamelares pueden formarse mediante técnicas de eliminación de detergente.

En ciertas formas de realización, las composiciones proporcionadas comprenden un liposoma donde un agente, como un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, está asociado tanto en la superficie del liposoma como encapsulado dentro del mismo liposoma. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los liposomas catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los liposomas catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.

En algunas formas de realización, las composiciones y las composiciones para usar en los métodos de la invención comprenden ARNm encapsulado en un liposoma. En algunas formas de realización, una o más especies de ARNm pueden encapsularse en el mismo liposoma. En algunas formas de realización, la una o más especies de ARNm pueden encapsularse en diferentes liposomas. En algunas formas de realización, el ARNm se encapsula en uno o más liposomas, que difieren en su composición lipídica, relación molar de componentes lipídicos, tamaño, carga (potencial Zeta), ligandos de dirección y/o combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, uno o más liposomas pueden tener una composición diferente de lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos modificados con PEG y/o combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización el uno o más liposomas pueden tener una relación molar diferente de lípidos catiónicos, lípidos neutros, colesterol y lípido modificado con PEG utilizados para crear el liposoma.

El proceso de incorporación de un agente terapéutico deseado, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm), en un liposoma es frecuentemente denominado “cargar”. Los métodos de ejemplo se describen en Lasic,et al.,FEBS Lett., 312: 255-258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados al liposoma pueden estar ubicados total o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporación de un ácido nucleico en los liposomas también se denomina en este documento “encapsulación”, en la que el ácido nucleico está completamente contenido dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, suele ser proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o sustancias químicas que degradan ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que causan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, un vehículo de administración adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar la administración de ARNm a la célula o tejido diana.

Tamaño de liposoma

Los liposomas adecuados de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar en varios tamaños. En algunas formas de realización, los liposomas proporcionados pueden hacerse más pequeños que los liposomas que encapsulan el ARNm previamente conocidos. En algunas formas de realización, la disminución del tamaño de los liposomas se asocia con una administración más eficiente de ARNm. La selección de un tamaño de liposoma adecuado puede tener en cuenta el sitio de la célula o tejido diana y, hasta cierto punto, la aplicación para la que se realiza el liposoma.

En algunas formas de realización, un tamaño de liposoma adecuado es seleccionado para facilitar la distribución sistémica del anticuerpo codificado por el ARNm. En algunas formas de realización, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, para seleccionar como diana los hepatocitos, un liposoma puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean más pequeñas que las fenestraciones de la capa endotelial que reviste los sinusoides hepáticos en el hígado; en tales casos, el liposoma podría penetrar fácilmente en tales fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana.

Alternativamente o además, un liposoma puede ser dimensionado de tal manera que las dimensiones del liposoma sean de un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, un liposoma puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar así la distribución de los liposomas a los hepatocitos.

En algunas formas de realización, un liposoma adecuado tiene un tamaño de o menor de alrededor de 500 nm, 450 nm, 400 nm, 350 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 125 nm, 110 nm, 100 nm, 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm o 50 nm. En algunas formas de realización, un liposoma adecuado tiene un tamaño no mayor que aproximadamente 250 nm (p. ej., no mayor que aproximadamente 225 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm). En algunas formas de realización, un liposoma adecuado tiene un tamaño que oscila entre aproximadamente 10 y 250 nm (p. ej., entre aproximadamente 10 y 225 nm, 10 - 200 nm, 10 - 175 nm, 10 - 150 nm, 10 - 125 nm, 10 - 100 nm, 10 - 75 nm, o 10 - 50 nm). En algunas formas de realización, un liposoma adecuado tiene un tamaño que oscila entre aproximadamente 100 y 250 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 100 y 225 nm, 100 - 200 nm, 100 - 175 nm, 100 - 150 nm). En algunas formas de realización, un liposoma adecuado tiene un tamaño que oscila entre aproximadamente 10 y 100 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 10 y 90 nm, 10 - 80 nm, 10 - 70 nm, 10 - 60 nm o 10 - 50 nm).

Una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica están disponibles para el dimensionamiento de una población de liposomas. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de EE. UU. núm.

4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas ya sea mediante sonicación con baño o con sonda, produce una reducción progresiva del tamaño hasta un ULV pequeño de menos de aproximadamente 0,05 micrómetros de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en energía de cizalladura para fragmentar liposomas grandes en liposomas más pequeños. En un procedimiento típico de homogeneización, las MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, normalmente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrómetros. El tamaño de los liposomas puede ser determinado por dispersión de luz cuasi-eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield,Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,10:421-150 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Ciclos de sonicación intermitentes se pueden alternar con la evaluación QELS para guiar la síntesis eficiente de liposomas.

Composiciones farmacéuticas

Para facilitar la administración de un agente, tal como un ácido nucleico p. ej., ARNm, y/o la expresión de ARNmin vivo,los vehículos de administración tales como liposomas pueden formularse en combinación con uno o más ácidos nucleicos, transportadores, ligandos dirigidos o reactivos estabilizadores adicionales, o en composiciones farmacológicas donde se mezcla con excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, última edición.

Los agentes encapsulados en liposomas proporcionados, como un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm y las composiciones que los contienen, pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta la condición clínica del sujeto, el sitio y el método de administración, la programación de la administración, la edad del sujeto, el sexo, el peso corporal y otros factores relevantes para los médicos con experiencia ordinaria en la técnica. La “cantidad efectiva” para los fines en el presente documento puede determinarse por consideraciones pertinentes tales como las conocidas por aquellos con conocimientos ordinarios en investigación clínica experimental, técnicas farmacológicas, clínicas y médicas. En algunas formas de realización, la cantidad administrada es efectiva para lograr al menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionen como medidas apropiadas de progreso de la enfermedad, regresión o mejora por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y régimen de dosificación adecuado es uno que causa una producción de proteína al menos transitoria (p. ej., enzima).

Las rutas de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, vaginal, transmucosa, pulmonar, incluyendo intratraqueal o inhalada, o intestinal; administración parenteral, incluyendo las inyecciones intradérmicas, transdérmicas (tópicas), intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como la administración intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal y/o intranasal.

Alternativamente o además, los agentes encapsulados en liposomas, tal como un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm y composiciones de la invención pueden ser administrados de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, a través de la inyección de la composición farmacéutica directamente en un tejido seleccionado como diana, preferiblemente en una formulación de liberación sostenida. La administración local puede verse afectada de varias maneras, según el tejido al que vaya dirigida. Por ejemplo, los aerosoles que contienen composiciones de la presente invención se pueden inhalar (para administración nasal, traqueal o bronquial); composiciones de la presente invención pueden ser inyectadas en el sitio de lesión, manifestación de enfermedad, o dolor, por ejemplo; composiciones se pueden proporcionar en pastillas para aplicación oral, traqueal o esofágica; se puede suministrar en forma de líquido, comprimido o cápsula para administración al estómago o a los intestinos, se puede suministrar en forma de supositorio para aplicación rectal o vaginal; o incluso puede administrarse en el ojo mediante el uso de cremas, gotas o incluso inyección. Las formulaciones que contienen composiciones proporcionadas complejadas con moléculas o ligandos terapéuticos pueden incluso ser quirúrgicamente administrados, por ejemplo en asociación con un polímero u otra estructura o sustancia que puede permitir que las composiciones se difundan desde el sitio de implantación a las células circundantes. Alternativamente, se pueden aplicar quirúrgicamente sin el uso de polímeros o soportes.

En algunas formas de realización, los liposomas y/o las composiciones proporcionados se formulan de manera que sean adecuados para la liberación prolongada del agente, por ejemplo, el ARNm contenido en los mismos. Tales composiciones de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en una forma de realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En una forma de realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez por semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, un mes sí un mes no, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y liposomas que se formulan para la administración de depósito (p. ej., por vía intramuscular, subcutánea, intravítrea) para administrar o liberar un ARNm durante períodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones realizadas en el ARNm para mejorar la estabilidad.

También se contemplan en este documento composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden uno o más de los liposomas revelados en el presente documento y composiciones para usar en métodos como se revela, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US2012/041663, presentada el 8 de junio de 2012, Publ. núm. WO 2012/170889. Por ejemplo, composiciones farmacéuticas liofilizadas de acuerdo con la invención pueden reconstituirse antes de la administración o pueden reconstituirsein vivo.Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada se puede formular en una forma de dosificación adecuada (p. ej., una forma de dosificación intradérmica tal como un disco, varilla o membrana) y administrarse de manera que la forma de dosificación se rehidrate con el tiempoin vivopor los fluidos corporales del individuo.

Los liposomas y las composiciones proporcionados pueden administrarse a cualquier tejido deseado. En algunas formas de realización, el agente, por ejemplo, el ARNm administrado por los liposomas o las composiciones proporcionados se expresa en el tejido en el que se administraron los liposomas y/o las composiciones. En algunas formas de realización, el ARNm administrado se expresa en un tejido diferente del tejido en el que se extrajeron los liposomas y/o las composiciones administradas. Los tejidos a modo de ejemplo en los que el ARNm administrado puede administrarse y/o expresarse incluyen, pero no se limitan a, hígado, riñón, corazón, bazo, suero, cerebro, músculo esquelético, ganglios linfáticos, piel y/o líquido cefalorraquídeo.

De acuerdo con varias formas de realización, el momento de la expresión de los agentes administrados, por ejemplo, ARNm, puede ser sintonizado para adaptarse a una necesidad médica particular. En algunas formas de realización, la expresión de la proteína codificada por el ARNm administrado es detectable 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 y/o 72 horas en suero o tejidos diana después de una única administración de liposomas o composiciones proporcionados. En algunas formas de realización, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y/o 7 días en suero o tejidos diana después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados. En algunas formas de realización, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y/o 4 semanas en suero o tejidos diana después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados. En algunas formas de realización, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable después de un mes o más después de una única administración de liposomas o composiciones proporcionados.

EJEMPLOS

Ejemplo 1-Síntesis de compuestos racémicos de fórmula I

Esquema I. Ruta sintética a compuestos racemicos de Formula I

El compuesto racémico10se preparó a partir del derivado de lisina protegido1, Boc-Lys(Z)-OSu, mediante la escisión del carbamato de alfa-amino-terc-butilo con ácido trifluoroacético y la dimerización de la amina libre resultante para formar 3,6-dioxopiperazina2. La hidrogenación de2sobre paladio catalítico produce la diamina primaria3, que se trata con cuatro equivalentes de epóxido4y trietilamina para formar la 3,6-dioxopiperazina racémica10de fórmula l.

Dibencilo(((2S,5S)-3,6-dioxopiperazina-2,5-diilo)bis(butano-4,1-diil))dicarbamato2: A Boc-Lys(Z)-OSu1(50 g) enfriado con un baño de hielo se le añadió lentamente TFA (60 mL). La mezcla resultante se agitó por 20 min. El baño de hielo se retiró y la agitación fue continuada por 1 h. El TFA se retiró por evaporación giratoria. El residuo aceitoso se disolvió en DMF (80 mL) y se añadió lentamente a piridina agitada (anhidra, 2,5 L). La espectrometría de masas indicó finalización de reacción después de 1 hora. La piridina se retiró por evaporación giratoria y el residuo se diluyó con EtOAc (2 L). Después de 20 min de agitación, la mezcla se filtró para dar2como un sólido blanquecino (20 g después de secar al vacío durante la noche. Rendimiento: 73%).

(3S,6S)-3,6-bis(4-aminobutil)piperazina-2,5-diona-2HOAc 3:Al compuesto2en una mezcla de AcOH (550 mL) y DCM (550 mL) se le añadió Pd/C (10%, húmedo. 10 g). Esta mezcla se agitó bajo un globo de H<2>durante 4 h cuando la espectrometría de masa indicó la finalización de la reacción. La mezcla de reacción fue lavada con nitrógeno durante 10 minutos y filtrada a través de Celite. El Celite fue enjuagado con MeOH (3 X 250 mL). El filtrado combinado fue evaporado y el residuo fue agitado con EtOAc (1,0 L) durante 30 min. La filtración dio3como un sólido blanco (16,37 g después del vacío durante el secado al vacío durante la noche. Rendimiento: 114%. 1H RMN muestra un producto limpio pero con extra HOAc en la muestra).

3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona 10:A una mezcla de3(15,87 g, 42,2 mmol) y4(57 mL, 261 mmol) en EtOH (75 mL) agitado en un matraz a presión de 500 mL a temperatura ambiente se añadió Et3N (23 mL, 165 mmol). El matraz se lavó con nitrógeno durante 5 min y se selló. La mezcla (suspensión sólida y líquida) se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, luego se calentó hasta 150-155°C (temperatura del baño de aceite) y se agitó durante 5 h. Se obtuvo una solución transparente después de que la temperatura alcanzara los 150°C. Después de enfriarse hasta temperatura ambiente, la solución de reacción se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna flash 9 veces con 0-30% de MeOH/DCM como eluyente y 2 veces con 0-30% de MeOH/EtOAc como eluyente. El uso de DCM al 50% de 75:22:3 DCM/MeOH/NH4OH (ac.) como eluyente condujo a la coelución del producto con un producto secundario menos polar. El producto secundario corrió muy de cerca con el producto en TLC con 30% de MeOH/DCM como disolventes de desarrollo. Estaba bien separado de producto en TLC con 30% de MeOH/EtOAc como disolventes de desarrollo. Las fracciones de producto puro de las purificaciones en columna se agruparon y evaporaron. El residuo oleoso se disolvió en Et<2>O y se evaporó. El secado al vacío durante la noche eliminó todos los disolventes y dio el compuesto racémico10como un gel de color amarillo claro (9,85 g, rendimiento: 24%). HPLC con detección ELSD mostró dos picos de tamaño similar con la misma masa de producto. Análisis elemental: (calc.): C, 72,63; H, 12,17; N, 5,64; (obs.): C, 72,25; H, 12,37; N, 5,68. Espec. de masa: 993,8m/z.

En otra ejecución con 7,15 g de3y 25,6 mL de4el producto bruto se purificó dos veces con 0-30% de MeOH/EtOAc como eluyente para dar dos lotes de producto: el lote de 1,55 g de fracciones tempranas y el lote de 7,38 g de fracciones tardías. Ambos lotes eran puros por 1H RMN. HPLC con detección de ELSD mostró dos picos de tamaño similar con la misma masa de producto para el lote de 7,38 g, pero solo un único pico de producto para el lote de 1,55 g.

Ejemplo 2-Síntesis de compuestos quirates de Fórmula l.b.1 (es decir, compuesto 10).

Esquema 2.Ruta sintética a compuestos quirales de Formula l.b.1 (es decir, compuesto 10)

El compuesto quiral10se sintetizó mediante N-alquilación del derivado de lisina protegido5con dos equivalentes del epóxido4para formar diol6. La hidrogenación de diol6sobre paladio catalítico forma alfa-aminoácido7, que es dividido en dos porciones. La primera parte de alfa-aminoácido7tiene su grupo alfa amino protegido como el carbamato de terc-butilo, tras el tratamiento con anhídrido de Boc, para formar ácido carboxílico8. La segunda porción de alfa-aminoácido7tiene su ácido libre convertido al éster metílico para formar amina9. El ácido carboxílico8y la amina9se acoplan para dar un intermedio de amida a través de reactivos de acoplamiento de péptidos como HATU y dietanolamina en un disolvente aprótico como DMF, el grupo carbamato de terc-butilo del intermedio de amida se escinde con ácido trifluoroacético en diclorometano, y el producto de éster amino resultante es ciclado para dar la piperazina-2,5-diona10. La estereoquímica en todos los centros quirales se conserva a través de esta ruta.

Los compuestos quirales 12-15, a continuación, se preparan a través de rutas sintéticas descritas utilizando los respectivos materiales de partida de epóxido quiral.

Síntesis del compuesto 3.1:A una suspensión de Mg (60 g, 2,5 mol) en EÍ<2>Ü anhidro (1000 mL) se añadió un cristal de yodo, seguido de la adición de 1-bromononano (25 mL). Se inició la reacción y la solución comenzó a reflujo después de calentar el matraz de reacción con un baño de agua. El 1-bromononano restante (360 mL, 2,0 mol total) se añadió a través de un embudo adicional en 1,5 horas para mantener el reflujo. Después de la adición, la solución de reacción se calentó a reflujo con un baño de agua durante 30 minutos adicionales y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Esta solución de éter de3.1se usó directamente en la siguiente reacción.

Síntesis del compuesto 4.1:A una suspensión de Cul (39 g, 0,2 mol) en THF anhidro (1000 mL) agitado con un agitador mecánico a -78°C en un matraz de tres bocas de 5 L se añadió R-epiclorhidrina (185 g, 2,0 mol) (embudo adicional). Después de la adición, la solución de éter anterior de3.1se añadió a través de una cánula en 1 h. La mezcla se agitó a -78°C durante 3,5 horas, entonces se extinguió con NH<4>CI acuoso saturado (1500 mL). La fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con Et<2>Ü (2000 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó (sobre MgSÜ<4>) y se evaporó a vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna flash (2,5 kg de SiÜ<2>, eluido con 0 - 10% de EtOAc en hexanos) para dar 292 g de4.1(rendimiento: 66%) como un aceite de color amarillo claro.

Síntesis del compuesto 5.1:A una solución de4.1(292 g, 1,33 mol) en MeOH (600 mL) y THF (600 mL) se añadió NaOH acuoso (1,5 M, 1000 mL) a través de un embudo adicional a 0°C Después de la adición, la mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2,5 horas, TLC mostró un producto principal, una cantidad muy pequeña de material de partida (EtOAc:hexanos = 1:9, Rf = 0,6). El THF y el MeOH se eliminaron por evaporación rotatoria al vacío. El residuo acuoso se extrajo con Et<2>O (600 mL X 3). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO<4>y se evaporó. El residuo oleoso amarillo se purificó por columna (SiO<2>, 2,5 kg, eluido con 0-10% de EtOAc en hexanos) para proporcionar 205 g (84%) de5.1puro.

Síntesis del compuesto 7.1:Método A: A una solución de6.1(75 g, 0,25 mol) en una mezcla de DCM (1000 mL) y MeOH (71 mL) que se estaba agitando a temperatura ambiente se añadió Na<2>CO<3>acuoso (2,0 M, 135 mL). La fase orgánica fue separada y la fase acuosa se extrajo con DCM (250 mL X 2). La fase orgánica combinada se secó sobre Na<2>SO<4>y se evaporó al vacío. El residuo se disolvió en MeOH (375 mL), luego se añadió compuesto5.1(185 g, 1,0 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 días cuando MS y TLC mostraron principalmente el producto deseado. Después de la concentración, el producto bruto se purificó por cromatografía en columna flash (2,0 kg de SiO<2>, eluido con 0 - 60% de EtOAc en hexanos) para dar7.1(131 g, 82%) como un aceite viscoso pálido.

Método B:A una suspensión de8.1(50 g, 0,2 mol) en MeOH (600 mL) se añadió DIPEA (45 mL), luego se añadió el compuesto5.1(150 g, 0,813 mol, 4,0 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Se eliminaron los solventes, el residuo se purificó por columna (1,0 kg de SiO<2>, eluido con 0-30% de MeOH en EtOAc) para dar9.1como un sólido ceroso (83 g, 67%). A una solución de9.1(81 g, 0,13 mol) en DMF (1000 mL) agitada a 0°C se añadió HATU (50,1 g, 0,13 mol), seguido por DIPEA (92 mL, 0,52 moles). La mezcla se agitó a 0°C durante 40 min y luego se añadió MeOH (53,2 mL, 10,0 equiv). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Entonces se diluyó con agua (5000 mL) y se extrajo con EtOAc (500 mL X 4). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera (600 mi x 3), se secó sobre MgSO<4>anhidro y se evaporó a vacío. El producto bruto fue purificado por columna (1,0 kg de SiO<2>, eluido con 0-80% de EtOAc en hexanos) para dar7.1(69 g, 55% para 2 pasos) como un aceite viscoso pálido.

Síntesis del compuesto 10.1:A una solución de7.1(69 g, 0,11 mol) en DCM (200 mL) se añadió TFA (200 mL), la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, la detección por MS mostró solo el producto deseado. Todos los solventes se evaporaron al vacío para dar 115 g de un producto similar a aceite de color marrón10.1, que se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.

Síntesis del compuesto 12.1:A una suspensión de11.1, se añadieron Boc-D-lisina (75 g, 0,305 mol) en MeOH (900 mL), DIPEA (68 mL) y5.1(196 g, 1,06 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Se eliminaron los volátiles y se purificó el producto bruto por columna (2,5 kg de SiO<2>, eluido con 0-40% de MeOH en EtOAc) para dar 118 g (63%) del compuesto puro12.1.

Síntesis del compuesto 13.1:A una solución de12.1(67,5 g, 0,11 mol) en DMF (600 mL, calentar hasta 50°C durante 30 minutos para obtener una solución homogénea) que fue enfriada con un baño de hielo se añadieron HATU (50 g, 0,12 mol) y DIPEA (95 mL, 0,55 mol). La mezcla resultante se agitó a 0°C durante 45 min, luego se añadió compuesto10.1(115 g, obtenido anteriormente) en DMF (400 mL) usando un embudo adicional. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió éter (1000 mL), seguido de agua (1000 mL). La fase orgánica se separó; la acuosa se extrajo con éter (250 mL X 2). La fase orgánica combinada se lavó con agua, se secó sobre MgSO<4>anhidro, se filtró y se concentró. El residuo fue purificado por columna (1,0 kg de SiO<2>, eluido con 0-20% de MeOH en EtOAc) para dar 94,2 g (76%) del compuesto13.1.

Síntesis del compuesto de fórmula l.a.i (es decir, R4-SR-cKK-E12):A una solución de13.1(94 g, 0,084 mol) en DCM (300 mL) fue añadido TFA (300 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La detección por MS mostró una reacción completa. Los disolventes se evaporaron al vacío. El residuo fue disuelto en DCM (500 mL) y lavado con Na<2>CO<3>acuoso (1,0 M, 500 mL). El lavado acuoso se volvió a extraer con DCM (100 mL). La fase orgánica combinada se secó sobre NaSO<4>anhidro y se evaporó. El residuo se disolvió en MeOH (1500 mL) y se enfrió con un baño de hielo. Se añadió NH<4>OH acuoso (28%, 80 mL) a través de un embudo adicional. La mezcla de reacción se dejó calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Los volátiles se evaporaron al vacío. El producto bruto se purificó por columna (1,0 kg de SiO<2>, eluido con disolventes: NH<4>OH al 1%, MeOH al 4-9%, EtOAc al 95-90%) para dar 34 g deR4-SR-cKK-E12puro y 22 g deR4-SR-cKK-12impuro. ElR4-SR-cKK-E12impuro fue re-purificado por columna para dar 12 g deR4-SR-cKK-E12puro. Así se obtuvo un total de 46 g (55%) deR4-SR-cKK-E12puro (sólido gomoso).

Ejemplo 4-El compuesto de fórmula l.a .ii (es decir, S4-SR-cKK-E12)

Esquema 5:Síntesis del compuesto de Formula l.a.u (es decir, S4-SR-cKK-E12)

Síntesis del compuesto 3.1:A una suspensión de Mg (30 g, 1,25 mol) en EÍ<2>Ü anhidro (600 mL) se le añadió un cristal de yodo, seguido de la adición de 1-bromononano (30 mL). Se inició la reacción y la solución comenzó a reflujo después de calentar el matraz de reacción con un baño de agua. El 1-bromononano restante (161 mL, 2,0 mol total) se añadió a través de un embudo adicional en 1,5 horas para mantener el reflujo. Después de la adición, la solución de reacción se calentó a reflujo con un baño de agua durante 30 min adicionales y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Esta solución de éter de3.1se usó directamente en la siguiente reacción.

Síntesis del compuesto 4.2:A una suspensión de Cul (19 g, 0,1 mol) en THF anhidro (1000 mL) que se agitaba con un agitador mecánico a -78°C en un matraz de tres bocas de 5 L se le añadió S-epiclorhidrina (92 g, 1,0 mol) usando un embudo adicional. Después de la adición, la solución de éter anterior de3.2se añadió a través de una cánula en 1 h. La mezcla se agitó a -78°C durante 3,5 horas, entonces se extinguió con NH<4>CI acuoso saturado (400 mL). La fase orgánica fue separada. La fase acuosa se extrajo con Et<2>Ü (1000 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó (sobre MgSÜ<4>) y se evaporó a vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna flash (2,5 kg de SiÜ<2>, eluido con 0 - 10% de EtOAc en hexanos) para dar 111,6 g de4.2(rendimiento: 66%) como un aceite de color amarillo claro.

Síntesis del compuesto 5.2:A una solución de4.2(111,3 g, 0,506 mol) en MeOH (230 mL) y THF (230 mL) se añadió NaOH acuoso (1,5 M, 395 mL) usando un embudo adicional a 0°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas, la TLC mostró un producto principal y una cantidad muy pequeña de material de partida (EtOAc:Hexanos = 1:9, Rf = 0,6). THF y MeOH fueron eliminados por evaporación rotatoria al vacío. El residuo acuoso se extrajo con Et<2>O (200 mL X 3). La fase orgánica combinada fue lavada con salmuera, se secó sobre MgSO<4>y se evaporó. El residuo oleoso amarillo se purificó por columna (SiO<2>, 1,0 kg, eluido con 0-10% de EtOAc en hexanos) para proporcionar 81 g (87%) de5.2puro.

Síntesis del compuesto7.2: A una solución de6.1(13 g, 0,044 mol) en una mezcla de DCM (100 mL) y MeOH (10 mL) que se estaba agitando a temperatura ambiente se le añadió Na<2>CO<3>acuoso (2,0 M, 25 mL). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con DCM (250 mL X 2). La fase orgánica combinada se secó sobre Na<2>SO<4>y se evaporó al vacío. El residuo se disolvió en MeOH (60 mL), luego se añadió compuesto5.2(32 g, 0,174 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 días cuando MS y TLC mostraron principalmente deseado producto. Después de la concentración, el producto bruto fue purificado por cromatografía en columna flash (600 g de SiO<2>, eluido con 0-60% de EtOAc en hexanos) para dar7.2(23 g, 85%) como un aceite viscoso pálido.

Síntesis del compuesto 8.2:A una solución de7.2(23 g, 0,0366 mol) en DCM (60 mL) se añadió TFA (60 mL), la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, la detección por MS mostró solo producto deseado. Todos los solventes se evaporaron al vacío para dar 40 g de un producto similar a aceite de color marrón8.2, que se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.

Síntesis del compuesto 10.2:A una suspensión de11.1, Boc-D-lisina (14 g, 0,057 mol) en MeOH (900 mL) fueron añadidos TEA (11,6 mL) y5.2(42 g, 0,228 mol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Los volátiles fueron eliminados y el producto bruto fue purificado por columna (1,0 kg de SiO<2>, eluido con 0-40% de MeOH en EtOAc) para dar 24 g (70%) del compuesto puro10.2.

Síntesis del compuesto 11.2:A una solución de10.2(9,1 g, 14,82 mmol) en DMF (120 mL) que se enfriaba con un baño de hielo se añadieron HATU (8,4 g, 22,23 mol) y DIPEA (25 mL, 148,2 mmol). La mezcla se agitó a 0°C durante 45 min, luego se añadió el compuesto8.2en DMF (80 mL) utilizando un embudo adicional. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La detección de MS no mostró material de partida. Se añadió éter (1000 mL), seguido de agua (1000 mL). La fase orgánica se separó, la acuosa se extrajo con éter (200 mL X 2). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con MgSO<4>anhidro, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por columna (330 g de SiO<2>, eluido con 0-20% de MeOH en EtOAc) para dar 10,6 g del compuesto deseado11.2.

Síntesis del compuesto de Fórmula l.a .ii (es decir, S4-SR-cKK-E12):A una solución de11,2(10,6 g, 0,084 mol) en DCM (30 mL) se le añadió TFA (30 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La detección por MS mostró una reacción completa. Los disolventes se evaporaron al vacío. El residuo se disolvió en DCM (150 mL) y se lavó con Na<2>CO<3>acuoso (1,0 M, 200 mL). El lavado acuoso se volvió a extraer con DCM (100 mL). La fase orgánica combinada se secó sobre NaSO<4>anhidro y se evaporó. El residuo se disolvió en MeOH (200 mL) y se enfrió con un baño de hielo. Se añadió NH<4>OH acuoso (28%, 10 mL) usando un embudo adicional. La mezcla de reacción se dejó calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Los volátiles se evaporaron al vacío. El producto bruto se purificó por columna (600 g de SiO<2>, eluido con disolventes: 1% de NH4OH, 4-9% de MeOH, 95-90% de EtOAc) para dar 5,1 g deS4-SR-cKK-E12puro.

Ejemplo 5-El compuesto de Fórmula l.b . l. i (es decir, R4-SS-cKK-E12)

Síntesis del compuesto 3.3 (N2-(terc-butoxicarbonil)-Ns,Ns-bis((R)-2-hidroxidodecil)-L-lisina):Una mezcla de R-epóxido (5.1, 46 g, 250 mmol), Boc-L-lisina8.1(15 g, 61 mmol) y diisopropiletilamina (11 mL) en metanol (80 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 3 d. Los volátiles se eliminaron y el residuo amarillo aceitoso se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (330 g) eluyendo con EtOAc/MeOH (100/0 a 70/30, 20 min) para dar el producto3.3como un sólido blanco (9,7 g, 26%).

Síntesis del compuesto de Fórmula l.b .l.i. (es decir, R4-SS-cKK-E12; ((3S,6S)-3,6-bis(4-(bis((S)-2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona)):A una solución de3.3(7,4 g, 12 mmol) y NHS (1,38 g, 12 mmol) en DCM (280 mL) se añadió DCC (2,97 g, 14,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. El solvente entonces se eliminó y el residuo (producto bruto4.3) se disolvió en TFA (30 mL). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente temperatura durante 1 h. Entonces se eliminó TFA y se añadió DCM (30 mL) al residuo, y se evaporaron conjuntamente para eliminar el TFA residual. El producto bruto5.3se disolvió en DCM (30 ml) y se añadió a piridina anhidra (480 ml) a 0°C bajo N<2>. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, se eliminó la piridina y el residuo se diluyó con éter dietílico (300 mL). El sólido blanco formado se eliminó por filtración. El filtrado se lavó con Na<2>CO<3>acuoso (1 M, 150 mL) y salmuera (150 mL), se secó sobre Na<2>SO<4>y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna cinco veces (una columna de 330 g seguida por cuatro columnas de 80 g) eluyendo con NH<4>OH al 3%/MeOH al 7%/EtOAc al 90% para dar 1,05 g deR4-SS-cKK-E12puro como goma pálida. 1,0 gramos deR4-SS-cKK-E12.

Ejemplo 6-El compuesto de Fórmula l.b . l. i i (es decir, S4-SS-cKK-E12)

Esquema 7:Síntesis de compuesto de Fórmula l.b . l. i i (es decir, S4-SS-cKK-E12)

Síntesis del compuesto 3 (N2-(terc-butoxicarbonil)-N56 *105,N6-bis((S)-2-hidroxidodecil)-L-lisina):Una mezcla de S-epóxido (5.2, 46 g, 250 mmol), Boc-L-lisina8.1(15 g, 61 mmol) y diisopropiletilamina (11 mL) en metanol (80 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 8 d. Se eliminaron los volátiles y el residuo oleoso amarillo se purificó por cromatografía en gel de sílice (330 g) eluyendo con EtOAc/MeOH (100/0 a 70/30, 20 min) para dar el producto3.4como un sólido blanco (22 g, 59%).

Síntesis del compuesto de Fórmula l.b . l. i i (es decir, S4-SS-cKK-E12; ((3S,6S)-3,6-bis(4-(bis((S)-2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona):A una solución de3.4(24,5 g, 40 mmol) y NHS (4,6 g, 40 mmol) en DCM (280 mL) se añadió DCC (9,9 g, 48 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El solvente entonces se eliminó y el residuo (producto bruto4.4) se disolvió en TFA (100 mL) a 0°C. Se permitió que la mezcla resultante se calentase hasta temperatura ambiente y se agitó durante 45 min. Entonces se eliminó TFA y se añadió DCM (120 mL) al residuo, y entonces se evaporaron conjuntamente para eliminar el TFA residual. El5.4bruto fue disuelto en piridina anhidra (1,6 L) a 0°C bajo N<2>, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, la piridina se eliminó mediante rotavapor y el residuo se diluyó con éter dietílico (1 L). El sólido blanco formado se eliminó por filtración y se lavó con éter dietílico (200 mL). El filtrado se lavó con Na2CO3 acuoso (1 M, 500 mL) y salmuera (500 mL), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (330 g) eluyendo con 0-50% de (NH<4>OH al 3%/MeOH al 7%/EtOAc al 90%)/EtOAc para dar 6,8 g deS4-SS-cKK-E12puro por TLC y 7,1 g deS4-SS-cKK-E12ligeramente impuro. Los 6,8 g (6,8 mmol) deS4-SS-cKK-E12puro según TLC se disolvieron en 120 mL de acetato de etilo. se añadió Boc20 (0,22 g, 1,0 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminó el solvente y se purificó el residuo por cromatografía en columna en gel de sílice (120 g) eluyendo con 0-50% de (NH<4>OH al 3%/MeOH al 7%/EtOAc al 90%)/EtOAc para dar 5,7 g (84%) de producto puroS4-SS-cKK-E12que estaba libre de un producto secundario de amina.

Ejemplo 7-El compuesto de fórmula l.b.2.i (es decir, R4-RR-cKK-E12)

Es uema 8:Síntesis del com uesto de Formula l.b.2.i es decir, R4-RR-cKK-E12

Síntesis del compuesto 3.1:A magnesio (60 g) suspendido en EÍ<2>Ü anhidro (0,9 L) se añadió 1-bromononano2.1(20 mL), seguido de la adición de una cantidad catalítica de yodo (50 mg). La mezcla resultante se calentó con un baño de agua caliente hasta que comenzó la reacción de Mg con2.1. Se retiró el baño y se añadió el 1-bromononano restante (379,1 mL) para mantener un reflujo suave. Después de la adición de2.1, se mantuvo el reflujo en un baño de agua caliente durante otros 30 min. La solución Grignard resultante de3.1se enfrió y se usó directamente en el siguiente paso.

Síntesis del compuesto 4.1:A Cul (38,1 g) suspendido en THF (1,5 L) a -78°C se añadió R-(-)-epiclorhidrina (156,8 mL). A continuación, se añadió la solución de Grignard de3.1anterior a través de una cánula mientras la temperatura de reacción se mantenía a <-65°C. La mezcla de reacción resultante se agitó a -78°C durante 3 horas adicionales. A continuación, se añadió cuidadosamente solución acuosa saturada de cloruro de amonio (0,8 L), seguido por adición de agua (1,0 L). La mezcla resultante se agitó y se dejó calentar hasta temperatura ambiente. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtaO (0,5 L x 2). Se combinó la fase orgánica con los extractos Et<2>Ü y la solución resultante se lavó con salmuera (0,5 L x 2), y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Los solventes se evaporaron al vacío y el residuo resultante se purificó en columna de gel de sílice (de hexanos a 20% de EtOAc/hexanos) para proporcionar4.1(243,5 g, 55%) como un aceite amarillo.

Síntesis del compuesto 5.1:A una solución de 4,1 (243,49 g) en 1:2,6 MeOH-THF (3,6 L) agitado a 0°C se añadió lentamente una solución acuosa de NaOH (1,5 M, 0,89 L, 1,33 moles). La mezcla resultante se dejó calentar y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El análisis por TLC mostró la desaparición completa de4.1. Los solventes orgánicos fueron evaporados, y la fase acuosa se extrajo con Et<2>O (1 L 500 mL x 2). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (600 mL) y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Los solventes se evaporaron al vacío para dar un residuo que se purificó en columna de gel de sílice (de hexanos a 10% de EtOAc/hexanos) para dar el epóxido5.1(193,7 g, 95%) como un aceite amarillo claro.

Síntesis del compuesto 12.1:Una mezcla de N-Boc-D-lisina11.1(49,2 g, 0,2 mol) y el epóxido5.1(147,2 g, 0,8 mol) en MeOH (1,04 L) se agitó a temperatura ambiente. Se añadió DIPEA (51,9 g, 0,4 mol). A continuación, la mezcla resultante se agitó durante 8 días, y luego se concentró a sequedad. El residuo fue purificado en columna de gel de sílice (2 kg, MeOH/DCM, 0 a 10%) para dar 49,2 g de12.1principalmente puro (MZ-550-180) y 58,3 g de12.1impuro, el cual fue purificado por una segunda columna (1,5 kg, MeOH/EtOAc, 10 a 40%) para dar 41,4 g de12.1principalmente puro. Los dos lotes en su mayoría puros se combinaron y se agitaron con EtOAc (0,5 L) durante 3 h. La mezcla se filtró para dar 41,4 g de12.1puro como un sólido blanco. El filtrado se concentró a sequedad. El residuo se agitó con EtOAc (0,1 L) durante 1 h y se filtró para dar 10,6 g de puro12.1. El filtrado se concentró a sequedad y el residuo se purificó en una columna de gel de sílice (330 g, MeOH/EtOAc, 10 a 40%) para dar un tercer lote de 26,9 g de12.1puro. Se obtuvo un total de 78,9 g de12.1puro. Rendimiento: 64%

Preparación del compuesto de Fórmula l.b.2.i (es decir, R4-RR-cKK-E12):Lote 1: A una solución de12.1(6,14 g, 10 mmol) y W-hidroxisuccimida (1,15 g, 10 mmol) en DCM (70 mL) se añadió DCC (2,47 g, 12 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Los volátiles se evaporaron bajo vacío para dar un residuo (éster de NHS6.5), el cual se disolvió en TFA (25 mL) y se agitó durante 0,5 h. El TFA se agitó bajo vacío, y el residuo (compuesto7.5) se enfrió hasta 0°C. Se añadió piridina (anhidra, 400 mL), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La piridina se retiró bajo vacío, y el residuo se suspendió en Et<2>O (300 mL). El sólido se retiró por filtración. El filtrado se lavó con solución acuosa de Na2CO31 M (150 mL) y salmuera (150 mL), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró a sequedad. El residuo fue separado por cromatografía en columna (80 g, 7:3 MeOH-NH3-H2O (4 x con EtOAc)/EtOAc, 0 a 50%) para darR4-RR-cKK-E12como un sólido gomoso (2,22 g). Múltiple precipitaciones y trituraciones de EtOAc dieronR4-RR-cKK-E12puro (0,46 g) como una goma.

Ejemplo 8-El compuesto de Fórmula l.b.2.ii (es decir, S4-RR-cKK-E12)

Esquem

Síntesis del compuesto 3.1:A magnesio (60 g) suspendido en Et<2>Ü anhidro (0,9 L) se añadió 1 -bromononano2.1(20 mL), seguido de la adición de una cantidad catalítica de yodo (50 mg). La mezcla resultante se calentó con un baño de agua caliente hasta que comenzó la reacción de Mg con2.1. Se retiró el baño y se añadió el 1-bromononano restante (379,1 mL) para mantener un reflujo suave. Después de la adición de2.1se mantuvo el reflujo por un baño de agua caliente durante otros 30 min. La solución de Grignard resultante de3.1se enfrió y se usó directamente en el siguiente paso.

Síntesis del compuesto 4.2:A Cul (38,1 g) suspendido en THF (1,5 L) a -782C se añadió S-(-)-epiclorhidrina (156,8 mL). A continuación, la solución de Grignard de3.1anterior se agregó a través de una cánula mientras la temperatura de reacción se mantuvo a <-65°C. La mezcla de reacción resultante se agitó a -78°C durante 3 horas adicionales. A continuación, la solución acuosa saturada de cloruro de amonio (0,8 L) se añadió con cuidado, seguido por adición de agua (1,0 L). La mezcla resultante se agitó y se dejó calentar hasta temperatura ambiente. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con Et<2>Ü (0,5 L x 2). La fase orgánica fue combinada con los extractos de Et<2>Ü y la solución resultante se lavó con salmuera (0,5 L x 2), y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Los disolventes se evaporaron al vacío y el residuo se purificó en una columna de gel de sílice (de hexanos a 20% de EtOAc/hexanos) para proporcionar4.2(250,8 g, 57%) como un aceite amarillo claro.

Síntesis del compuesto 5.2:A una solución de4.2(250,8 g) en 1:2,6 MeOH-THF (3,9 L) agitada a 0°C se añadió lentamente solución acuosa de NaOH (1,5 M, 1,36 mol, 0,90 L). La mezcla resultante se dejó calentar y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. El análisis por TLC mostró la desaparición completa de4.2. Los solventes orgánicos se evaporaron y se extrajo la fase acuosa con Et<2>O (1 L 500 mL x 2). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (600 mL) y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Los disolventes se evaporaron al vacío para dar un residuo que se purificó en columna de gel de sílice (de hexanos a 10% de EtOAc/hexanos) para proporcionar5.2(195,4 g, 93%) como un aceite amarillo claro.

Una mezcla de W-Boc-D-lisina11.1(49,2 g, 0,2 mol) y el epóxido5.2(147,2 g, 0,8 mol) en MeOH (1,04 L) se agitó a temperatura ambiente. Se añadió DIPEA (51,9 g, 0,4 mol). A continuación, la mezcla resultante se agitó durante 8 días y luego se concentró hasta sequedad. El residuo resultante se purificó en columna de gel de sílice (2 kg, MeOH/EtOAc, 10 a 30%) para dar10.2(79,9 g, 65%) como un sólido blanco.

Preparación del compuesto de Fórmula l.b.2.ii (es decir, S4-RR-cKK-E12)A una solución de10.2(61,4 g, 100 mmol) y N-hidroxisuccimida (11,5 g, 100 mmol) en DCM (800 mL) se añadió DCC (24,7 g, 120 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Los volátiles se evaporaron al vacío para dar un residuo (éster de NHS6.6), que se disolvió en TFA (25 mL) y se agitó durante 40 min. Se eliminó TFA al vacío, y el residuo (compuesto7.6) se enfrió hasta 02C. Se añadió piridina (anhidra, 3,5 L) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 19 h. La piridina se eliminó al vacío y el residuo se suspendió en Et<2>O (3,0 L). El sólido se eliminó por filtración. El filtrado se lavó con solución acuosa de Na2CO3 1 M (1,0 L) y salmuera (1,0 L), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna (4 x columna de gel de sílice de 330 g eluyendo con (MeOH al 7%/NH3-H2O al 3%/EtOAc al 90%))/EtOAc, 0 a 50%) para proporcionarS4-RR-cKK-E12como un sólido gomoso (15,9 g, 16%)

Ejemplo 9-Formulaciones

Las formulaciones descritas en este documento consistían en una mezcla de lípidos de múltiples componentes de proporciones variables empleando uno o más lípidos catiónicos, lípidos auxiliares y lípidos PEGilados diseñados para encapsular varios materiales basados en ácidos nucleicos. El lípido catiónico utilizado en todas partes es el compuesto de fórmula I (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona). Los lípidos auxiliares pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados pueden incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de longitud C<6>-C<20>.

Material de ARN mensajero

ARN mensajero de factor humano IX (FIX), de luciferasa de luciérnaga optimizada por codón (FFL) y de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana optimizado por codón se sintetizó mediante transcripciónin vitroa partir de un molde de ADN plasmídico que codificaba el gen, seguido de la adición de una estructura de caperuza 5’ (Cap 1) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J. Gen. Virology2005, 86, 1239-1249) y una cola de poli(A) en 3’ de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud determinada por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas en 5’ y 3’ presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica (véase más adelante).

ARNm de argininosuccinato sintetasa (ASS1) humana optimizado por codón:

X AU GAGC AGC AAGGGC AGCGU GGIJ GCU GGCCUAC AGCGGCGGCCU GGAC ACC AGC UGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCA AC AUCGGCC AGAAGGAGGACUU CGAGGAGGCCCGC AAGAAGGCCCU GAAGCU GGG CGCC AAG AAG G U GUU C AU CGAGGAC GU GAGCCGCGAGUU CGU GGAGGAGUU C AU CUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACC AGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGG GCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGC AAGGGC AACGACCAGGUGCGCUU CGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGC AUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCA AGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGA

GAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAG GCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCC CGAC AU CCU GGAGAU CGAGUU C AAGAAGGGCGU GCCCGU GAAGGU GACC AACGU GAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAG GUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCG GCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGC CCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAG GGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCG AGU GCGAGUU CGU GCGCC ACU GC AUCGCC AAGAGCC AGGAGCGCGU GGAGGGC A A GGU GC AGGU GAGCGU GCU GAAGGGCC AGGU GUAC AUCCU GGGCCGCGAGAGCCCC CU GAGC CU GUAC AACGAGGAGCU GGU GAGC AU GAACGU GC AGGGCGA CUACGAG CCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACC ACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGAY

ecuencas en y

X =

GGAC AG AU CGCCU GGAGACGCC AU CC ACGCU GUUUU GACCU CC AU AG AAG AC ACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG U GCC AAG AG U GACIJ C ACCGU CCUU GAC ACG

Y =

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC

ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC

Protocolo de formulación

Alícuotas de 50 mg/mL de soluciones etanólicas de uno o más compuestos de fórmula I, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K se mezclaron y diluyeron con etanol hasta 3 mL de volumen final. Por separado, una solución acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCI 150 mM, pH 4,5) de ARNm de ASS1 se preparó a partir de un stock de 1 mg/mL. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en 20% de etanol. La suspensión resultante de nanopartículas se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó en 2-8°C. Concentración final = 0,64 mg/mL de ARNm de ASS1 (encapsulado). Z<ave>= 78 nm (DV<(50)>= 46 nm; DV<(90)>= 96 nm).

Ejemplo 10-Análisis de proteína de ASS1 producida a través de nanopartículas cargadas con ARNm de ASS1 administradas por vía intravenosa:

Protocolo de inyección

Todos los estudios fueron realizados usando ratones macho CD-1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Se introdujeron muestras mediante una sola inyección de bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente de 1,0 mg/kg (o como se especifique lo contrario) de ARNm de ASS1 encapsulado. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con solución salina en los momentos designados.

Aislamiento de tejidos de órganos para análisis

Se recogieron el hígado, el bazo, el riñón y el corazón de cada ratón, se repartieron en partes separadas y se almacenaron o bien en formalina tamponada neutra al 10% o bien se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80°C para el análisis.

Aislamiento de plasma para análisis

Todos los animales fueron sacrificados mediante asfixia por CO<2>en momentos designados después de la administración de la dosis (± 5%) seguido de toracotomía y extracción de sangre cardiaca terminal. La sangre completa (volumen máximo obtenible) se recolectará mediante punción cardíaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, y se dejará que se coagule a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugará a 22°C ± 5°C a 9300 g durante 10 minutos y se extraerá el suero. Para las recolecciones de sangre provisionales, se recolectarán aproximadamente 40-50 pL de sangre total a través de una punción en la vena facial o corte de cola. Muestras recolectadas de animales sin tratamiento se utilizaron como niveles de referencia de ASS1 para la comparación con los animales de estudio.

Análisis de ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA)

ELISA de ASS1 humana:Se siguieron los procedimientos ELISA estándar empleando 2D1-2E12 lgG anti-ASS1 de ratón como anticuerpo de captura con #3285 lgG anti-ASS1 de conejo como anticuerpo secundario (de detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se usó lgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución de sustrato de 3,3’,5,5’ tetrametilbencidina (TMB). La reacción se extinguió utilizando H<2>SO<4>2 N después de 20 minutos. La detección se monitorizó mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device SpectraMax. Órganos y suero de ratón no tratados y proteína ASS1 humana fueron utilizados como controles negativos y positivos, respectivamente.

Ejemplo 11-Producción de proteína ASS1 humana in vivo

La producción de proteína de ASS1 humana a través de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de hASS1 optimizado por codón, que comprendían compuestos de fórmula I, se ensayó en ratones CD-1 como una única inyección de bolo intravenosa, como se describió anteriormente. La FIG. 1 representa la cantidad de proteína ASS1 humana detectada a través de ELISA al tratar ratones con nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de ASS1 humana, con diversos compuestos racémicos y quirales de fórmula I, en dosis de 1,0 mg/kg. Los ratones fueron sacrificados veinticuatro horas después de la inyección y se extrajeron órganos, tales como hígados.

Ejemplo 12-Estudios de toxicidad

Se midieron los niveles de expresión de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) para varios compuestos racémicos y quirales de fórmula l. Los niveles de expresión aumentados de AST y/o ALT causados generalmente por agentes que provocan toxicidad hepática. Los compuestos quirales de fórmula I generalmente produjeron niveles de expresión de ALT y/o AST más bajos, es decir, se correlaciona con problemas de menor toxicidad hepática, en comparación con composiciones estereoquímicamente no enriquecidas, o estereoquímicamente menos enriquecidas, del mismo lípido. Véanse las Tablas 1 y 2 a continuación.

Tabla 1.

Tabla 2.

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Una composición que comprende una o más entidades químicas de fórmulaI, cada una de las cuales es un compuesto de fórmulaI:

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un solvato del mismo, o un solvato de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, la composicióncaracterizada porquemás de o igual a una primera cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmula I en la composición: son entidades químicas de fórmulal.a:

donde la primera cantidad umbral es 50%. 2. - La composición según la reivindicación 1, donde la primera cantidad umbral es (A) 70%; o (B) 80%; o (C) 95%. 3. - La composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2,caracterizada porquemás de o igual a una segunda cantidad umbral de la cantidad total de entidades químicas de fórmulal.aen la composición es una entidad química de (i) fórmulal.a.i:

donde la segunda cantidad umbral es 50%; o (ii) fórmulal.a.ii:

donde la segunda cantidad umbral es 50%. 4. - La composición según la reivindicación 3, donde la segunda cantidad umbral es (a) 70%; o (b) 80%; o (c) 90%; o (d) 95%. 5. - La composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2,caracterizada porquemás de o igual a una tercera cantidad umbral de la cantidad total de la composición son entidades químicas de fórmulal.a, donde la tercera cantidad umbral es 85% (p/p). 6. - La composición según la reivindicación 5, donde la tercera cantidad umbral es (a) 90%; o (b) 95%; o (c) 98%. 7. - La composición según la reivindicación 6, donde la tercera cantidad umbral es 98% y (i) donde más de o igual al 90% (p/p) de la cantidad total de la composición es una entidad química de fórmulal.a.i:

o (ii) donde más de o igual al 90% (p/p) de la cantidad total de la composición es una entidad química de fórmulaI.a.ii:

8. - Una composición que comprende un ARNm que codifica una proteína, encapsulado dentro de un liposoma, en el que dicho liposoma comprende una composición lipídica catiónica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en un método de administración de ARN mensajero (ARNm)in vivo,comprendiendo dicho método la administración a un sujeto que necesita la administración de dicha composición de manera que la administración de la composición da como resultado la expresión de la proteína codificada por el ARNmin vivo. 9. - La composición para uso según la reivindicación 8, donde el liposoma comprende además uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos basados en colesterol y/o uno o más lípidos modificados con PEG, opcionalmente donde el uno o más lípidos no catiónicos se seleccionan de DSPC (1,2-diestearoil sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1 ’-rac-glicerol)). 10. - La composición para usar según la reivindicación 9, en la que uno o más lípidos basados en colesterol son colesterol y/o colesterol PEGilado. 11. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en la que uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de longitud C<6>-C<20>. 12. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que el liposoma tiene un tamaño inferior a aproximadamente 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm. 13. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en la que el ARNm tiene una longitud de o mayor de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb o 5 kb. 14. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en donde (a) la proteína codificada por el ARNm es una proteína citosólica; o (b) la proteína codificada por el ARNm es una proteína secretada; o (c) la proteína codificada por el ARNm es una enzima. 15. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en la que el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados; opcionalmente donde uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metilpseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodoruridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina. 16. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, en la que el ARNm no está modificado. 17. - La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-16, en la que dicha composición es para el uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende una etapa de administrar un ARNm que codifica una proteína terapéutica.