ES2941411T3

ES2941411T3 - Polinucleótidos que codifican interleucina-12 (IL12) y usos de los mismos

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Publication number: ES2941411T3
Application number: ES17726458T
Authority: ES
Inventors: Joshua Frederick; Susannah Hewitt; Ailin Bai; Stephen Hoge; Vladimir Presnyak; Iain Mcfadyen; Kerry Benenato; Ellalahewage Sathyajith Kumarasinghe
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2023-05-22
Anticipated expiration: 2037-05-18
Also published as: WO2017201350A1; EP3458083A1; HUE061077T2; EP4186518A1; KR20190008890A; DK3458083T5; DK3458083T3; AU2017268397A1; MX2022008602A; US20240024422A1; MX2018013509A; JP7246930B2; FI3458083T3; RS63912B1; JP2023072056A; KR102469450B1; RU2018144292A; US11000573B2; PL3458083T3; JP2019516710A

Abstract

La presente descripción se refiere a polinucleótidos que comprenden un marco de lectura abierto de nucleósidos enlazados que codifican interleucina-12 humana (IL12), fragmentos funcionales de los mismos y proteínas de fusión que comprenden IL12. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto tiene una secuencia optimizada. En realizaciones particulares, la descripción proporciona polinucleótidos de secuencia optimizada que comprenden nucleótidos que codifican la secuencia polipeptídica de IL12 humana, o secuencias que tienen una alta identidad de secuencia con esos polinucleótidos de secuencia optimizada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótidos que codifican interleucina-12 (IL12) y usos de los mismos

Antecedentes

La interleucina-12 (IL12) es una citocina proinflamatoria que desempeña una función importante en la inmunidad innata y adaptiva. Gately, MK et al., Annu Rev Immunol. 16: 495-521 (1998). La IL12 funciona principalmente como una proteína heterodimérica de 70 kDa que consiste en dos subunidades p35 y p40 unidas por disulfuro. Los homodímeros p40 de IL12 existen, pero aparte de funcionar como un antagonista que se une al receptor de IL12, no parecen mediar una respuesta biológica. Ib. La forma precursora de la subunidad p40 de IL12 (NM_002187; P29460; también denominada IL12B, factor estimulador de células citolíticas naturales 2, factor de maduración de linfocitos citotóxicos 2) es de 328 aminoácidos en longitud, mientras que su forma madura es de 306 aminoácidos de largo. La forma precursora de la subunidad p35 de IL12 (Nm_000882; P29459; también denominada IL12A, factor estimulador de células citolíticas naturales 1, factor de maduración de linfocitos citotóxicos 1) es de 219 aminoácidos en longitud y la forma madura es de 197 aminoácidos de largo. Ib. Los genes para las subunidades p35 y p40 de IL12 residen en diferentes cromosomas y son regulados independientemente entre sí. Gately, ^mK et al., Annu Rev Immunol. 16: 495-521 (1998). Muchas células inmunitarias diferentes (p. ej., células dendríticas, macrófagos, monocitos, neutrófilos y células B) producen IL12 tras estímulos antigénicos. El heterodímero IL12 activo se forma después de la síntesis de la proteína. Ib.

Debido a su habilidad para activar tanto las células NK como las células T citotóxicas, la proteína IL12 se ha estudiado como un agente terapéutico anticanceroso prometedor desde 1994. Véase, Nastala, C. L. et al., J Immunol 153: 1697-1706 (1994). Pero a pesar de las altas expectativas, los estudios clínicos anteriores no produjeron resultados satisfactorios. Lasek W. et al., Cáncer Immunol Immunother 63: 419-435, 424 (2014). La administración repetida de IL12, en la mayoría de los pacientes, condujo a una respuesta adaptiva y una disminución progresiva de los niveles de interferón gamma (IFN-^y) inducidos por IL12 en la sangre. Ib. Por otra parte, mientras que se reconoció que la actividad anticancerosa inducida por IL12 es mediada en gran medida por la secreción secundaria de IFNy, la inducción concomitante de IFN-y junto con otras citocinas (p. ej., TNF-a) o quimiocinas (IP-10 o MIG) por IL12 causaba toxicidad grave. Ib.

Además de la retroalimentación negativa y toxicidad, la eficacia marginal de la terapia con IL12 en ámbitos clínicos puede ser causada por el fuerte ambiente inmunosupresor en seres humanos. Ib. Para minimizar la toxicidad de IFN-^yy mejorar la eficacia de IL12, los científicos ensayaron diferentes procedimientos, tales como diferentes protocolos de dosis y tiempos para la terapia de IL12. Véase Sacco, S. et al., Blood 90: 4473-4479 (1997); Leonard, J. P. et al., Blood 90: 2541-2548 (1997); Coughlin, C. M. et al., Cancer Res. 57: 2460-2467 (1997); Asselin-Paturel, C. et al., Cancer 91: 113-122 (2001); y Saudemont, A. et al., Leukemia 16: 1637-1644 (2002). No obstante, estos procedimientos no han tenido impacto significativo en la supervivencia del paciente. Kang, W. K., et al., Human Gene Therapy 12: 671-684 (2001).

Actualmente, están en marcha una serie de ensayos clínicos de IL12. Aunque estos múltiples ensayos clínicos han estado en marcha durante casi 20 años desde el primer ensayo clínico humano de IL12 en 1996, todavía no está disponible un producto de IL12 aprobado por la FDA. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica de un procedimiento terapéutico mejorado para utilizar IL12 para tratar tumores.

El documento WO 2015/095249 A1 se refiere a polipéptidos de IL12 monocatenarios y ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos de IL12 monocatenarios. También se describen métodos de uso de los polipéptidos de IL12 monocatenarios para potenciar la función del sistema inmunitario.

Según Charoensit et al., 2010. Cancer Gene Ther. 17(7):512-22, los resultados descritos en el mismo sugieren que la inyección intravenosa de complejos de liposoma catiónico de ácido todo trans-retinoico/DNA plasmático de IL12 es un método eficaz para el tratamiento de la metástasis pulmonar en ratones.

Suzuki et al., 2010. J Control Release. 142(2):245-50 estudiaron el papel de los liposomas de burbuja y ultrasonidos en la terapia génica del cáncer usando DNA de plásmido de cordón de IL12.

El documento WO 2013/053775 A1 se refiere a un medicamento combinado que comprende un vector de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de IL12 y un ligando CTLA-4 no agonista o un ligando PD-1 no agonista para el tratamiento de enfermedades neoplásicas malignas.

El documento WO 2010/126766 A1 se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un factor nuclear del promotor de células T activado asociado operativamente con una secuencia de nucleótidos que codifica IL12 para usar en el tratamiento o la prevención del cáncer.

El documento WO 2001/52874 A2 describe el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor.

Chen et al., 2016. Mol Ther Methods Clin Dev. 3: 16023 proporciona una revisión del desarrollo clínico de nanopartículas para la administración de genes.

Anwer et al., 2010. Gene Ther. 17(3):360-9 describe un ensayo de fase I para evaluar la seguridad y tolerabilidad del plásmido de IL12 humana formulado con un lipopolímero sintético, es decir, polietilenglicolpolietilenimina-colesterol.

Breve sumario

La presente invención proporciona una composición para usar en un método para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite, en donde (a) la composición comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL-12, en donde el mRNA comprende un marco de lectura abierto ("ORF") que codifica un polipéptido de la subunidad p40 de interleucina 12 ("IL12B") y un polipéptido de la subunidad p35 de interleucina 12 ("IL12A"), (b) el mRNA se formula como una nanopartícula de lípido que comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, un esterol y un lípido modificado con PEG, y (c) el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicha composición por vía intratumoral.

Además, la presente invención proporciona una composición para usar en un método de (i) activación de las células T en un sujeto que lo necesite, (ii) aumento de la relación de células T efectoras a supresoras en un tumor de un sujeto que lo necesite, (iii) aumento del número de células citolíticas naturales (NK) activadas en un sujeto que lo necesite, y/o (vi) aumento de las células dendríticas de presentación cruzada en un tumor de un sujeto que lo necesite, en donde (a) la composición comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL-12, en donde el mRNA comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A, (b) el mRNA se formula como una nanopartícula de lípido que comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, un esterol y un lípido modificado con PEG, y (c) el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicha composición por vía intratumoral.

La presente invención también proporciona una nanopartícula de lípido que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12 humano, en donde el mRNA comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B humano unido operativamente a un polipéptido de IL12A humano, y la nanopartícula de lípido comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, un esterol y un lípido modificado con PEG.

Otros aspectos de la invención se proporcionan en las reivindicaciones.

La presente descripción proporciona agentes terapéuticos de mRNA para el tratamiento del cáncer. Los agentes terapéuticos de mRNA de la descripción son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer ya que la tecnología proporciona el suministro intracelular de mRNA que codifica polipéptidos inmunomoduladores (por ejemplo, polipéptidos inmunoestimuladores, tales como IL-12, y similares, útiles en inmuno-oncología (“IO”)), seguido por la síntesis nueva de proteínas funcionales dentro de células objetivo, p. ej., dentro de células objetivo en tumores. La descripción presenta mRNA terapéuticos que tienen nucleótidos modificados para (1) minimizar la activación inmunitaria indeseada (p. ej., la respuesta inmunitaria innata asociada con la introducción in vivo de ácidos nucleicos extraños) y (2) optimizar la eficiencia de traducción del mRNA a la proteína. Aspectos de ejemplo de la descripción presentan mRNA terapéuticos que tienen una combinación de modificaciones de nucleótidos para reducir la respuesta inmunitaria innata y la optimización de secuencia, en particular, dentro del marco de lectura abierto (ORF) de mRNA terapéuticos que codifican polipéptidos inmunomoduladores (p. ej., polipéptidos inmunoestimuladores tales como IL-12) para aumentar la expresión de proteína.

En otros aspectos, la tecnología terapéutica de mRNA de la descripción presenta el suministro de polipéptidos de mRNA que codifica(n) polipéptidos inmunomoduladores (p. ej., inmunoestimuladores) a través de un sistema de suministro de nanopartículas de lípidos (LNP). En casos de ejemplo, la tecnología terapéutica de mRNA de la descripción presenta el suministro de polipéptidos inmunomoduladores que codifican mRNA en tumores a través de un sistema de suministro de nanopartículas de lípidos (LNP). La descripción también presenta LNP basadas en lípidos ionizables novedosos que tienen propiedades mejoradas cuando se combinan con los mRNA que codifican polipéptidos inmunomoduladores (p. ej., inmunoestimuladores) y se administran in vivo, por ejemplo, la captación celular, transporte intracelular y/o liberación endosomal o escape endosomal. Las formulaciones de LNP de la descripción también demuestran inmunogenicidad reducida asociada con la administración in vivo de las LNP.

Ciertos aspectos de la presente descripción se dirigen a un método para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un marco de lectura abierto (“ORF”) que codifica un polipéptido de la subunidad p40 de interleucina 12 (“IL12B”) y un polipéptido de la subunidad p35 de interleucina 12 (“ IL12A”). En algunos casos, el método además comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control. En algunos casos, el polipéptido inhibidor de punto de control inhibe PD1, PD-L1, CTLA-4, o una combinación de los mismos. En algunos casos, el polipéptido inhibidor de punto de control comprende un anticuerpo. En algunos casos, la administración de la composición activa las células T en el sujeto.

Otro aspecto de la presente descripción se dirige a un método para activar células T en un sujeto que lo necesite que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A. En algunos casos, la activación de células T comprende la inducción de proliferación de células T. En algunos casos, la activación de células T comprende la inducción de infiltración de células T en el tumor o el incremento del número de células T de infiltración de tumor. En algunos casos, la activación de células T comprende inducir una respuesta de células T de memoria. En algunos casos, las células T activadas comprenden células T CD4+, células T CD8+ o ambas. En algunos casos, la administración de la composición sola o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control incrementa una relación de células T efectoras a supresoras en el tumor. En algunos casos, la administración de la composición además incrementa el número de células NK activadas en el sujeto. En algunos casos, la administración de la composición incrementa las células dendríticas de presentación cruzada en el tumor del sujeto. En algunos casos, la administración de la composición reduce el tamaño de un tumor distante o inhibe el crecimiento de un tumor distante en el sujeto.

Otro aspecto de la presente descripción se dirige a un método para incrementar una relación de células T efectoras a supresoras en un tumor de un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A. En algunos casos, la relación de células T efectoras a supresoras es una relación de células T CD8+: células T reguladoras (Treg).

Otro aspecto de la presente descripción se dirige a un método para incrementar el número de células citolíticas naturales (NK) activadas en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A.

Otro aspecto de la presente descripción se dirige a un método para incrementar la células dendríticas de presentación cruzada en un tumor de un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A. En algunos casos, las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+.

Otro aspecto de la presente descripción se dirige a una nanopartícula de lípido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12 humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B humano operativamente unido a un polipéptido de IL12A humano.

En algunos casos, el polipéptido de IL12B y el polipéptido de IL12A se fusionan directamente o por un ácido nucleico que codifica un enlazador. En algunos casos, el polipéptido de IL12B comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a los aminoácidos 23 a 328 de la SEQ ID NO: 48, en donde la secuencia de aminoácido tiene actividad de IL12B. En algunos casos, el polipéptido de IL12A comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a los aminoácidos 336 a 532 de SEQ ID NO: 48, en donde la secuencia de aminoácidos tiene actividad de IL12A. En algunos casos, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. En algunos casos, el péptido señal es un péptido señal de IL12B.

En algunos casos, la composición comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B operativamente unido a través de un enlazador a un polipéptido de IL12^a. En algunos casos, la composición comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un péptido señal de IL12B, un polipéptido de IL12B, un enlazador y un polipéptido de IL12A. En algunos casos, el enlazador comprende un enlazador Gly/Ser.

En algunos casos, el polipéptido de IL12 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a la SEQ ID NO: 48. El polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 a 44, 236 y 237. En algunos casos, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 236 o 237.

En algunos casos, el polinucleótido comprende un ORF que comprende al menos un nucleósido químicamente modificado. En algunos casos, el al menos un nucleósido químicamente modificado se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos. En algunos casos, los nucleósidos químicamente modificados en el ORF se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, el polinucleótido comprende un sitio de unión de miRNA. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA es un sitio de unión de miR-122. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA es un sitio de unión de miR-122-3p o miR-122-5p. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100% idéntica a aacgccauua ucacacuaaa ua (SEQ ID NO: 51), en donde el sitio de unión de miRNA se une a miR-122. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100% idéntica a uggaguguga caaugguguu ug (SEQ ID NO: 53), en donde el sitio de unión de miRNA se une a miR-122. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100% idéntica a caaacaccau ugucacacuc ca (SEQ ID NO: 54), en donde el sitio de unión de miRNA se une a miR-122.

En algunos casos, el polinucleótido comprende una región no traducida 5' (UTR). En algunos casos, la 5' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia listada en la Tabla 3. En algunos casos, el polinucleótido comprende una región no traducida 3' (UTR). En algunos casos, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia listada en la Tabla 4A o 4B. En algunos casos, el polinucleótido comprende un sitio de unión de miRNA dentro de la 3' UTR. En algunos casos, el polinucleótido comprende una secuencia espaciadora de nucleótidos fusionada al sitio de unión de miRNA. En algunos casos, el polinucleótido comprende una estructura de caperuza 5' terminal. En algunos casos, el polinucleótido comprende una cola de poli A 3'. En algunos casos, el polinucleótido comprende un ORF optimizado en codones. En algunos casos, el polinucleótido es un polinucleótido transcrito in vitro (IVT). En algunos casos, el polinucleótido es circular.

En ciertos aspectos, el polinucleótido se formula con un agente de suministro. En algunos casos, el agente de suministro comprende un lipidoide, un liposoma, un lipoplexo, una nanopartícula de lípido, un compuesto polimérico, un péptido, una proteína, una célula, una imitación de nanopartícula, un nanotubo o un conjugado. En algunos casos, el agente de suministro es una nanopartícula de lípido. En algunos casos, el agente de suministro comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R”M'R'; R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)ⁿQ, -(CH²)ⁿCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH²)ⁿN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)²y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R⁶se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C²-³y H;

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²- un grupo arilo, y un grupo heteroarilo; R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C²-³y H; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-18, -R*YR”, -YR” y H; cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^3-14y alquenilo C^3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-12y alquenilo C²-¹²; cada Y es independientemente un carbociclo C^3-6; cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y con la condición de que cuando R⁴es -(CH²)ⁿQ, -(CH²)ⁿCHQR, -CHQR, o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros cuando n es 1 o 2. En algunos casos, el compuesto es de Fórmula (IA):

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; M ⁱes un enlace o M'; R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)ⁿQ, en el cual n es 1, 2, 3, 4, o 5 y Q es OH, -HC(S)N(R)²o -HC(O)N(R)²; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo, y un grupo heteroarilo; y R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14.

En algunos casos el compuesto es de Fórmula (II):

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5;

M¹es un enlace o M'; R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)ⁿQ, en el cual n es 2, 3 o 4 y Q es OH, -HC(S)N(R)²o -HC(O)N(R)²; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14.

En algunos casos, el compuesto se selecciona del Compuesto 1 al Compuesto 147, y sales y estereoisómeros de los mismos. En algunos casos, el agente de suministro comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C⁵³⁰, alquenilo C⁵²⁰, -R*YR”, -R” y R”M'R'; R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C¹¹⁴, alquenilo C²¹⁴, R*YR”, YR” y R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo; R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C³⁶, (CH²)ⁿQ, -(CH²)ⁿCHQR, CHQR, CQ(R)², y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -(CH²)ⁿN(R)², -(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -N(R)R^s, -O(CH²)ⁿOR, -N(R)C(=NR^g)N(R)², -N(R)C(=CHR^g)N(R)², -OC(O)N(R)², -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)²R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)², -N(OR)C(S)N(R)², -N(OR)C(=NR^g)N(R)², -N(OR)C(=CHR⁹)N(R)², -C(=NR^g)N(R)², -c (=n R⁹)R, -C(O)N(R)Or y -C(R)N(R)²C(o )o R, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R⁶se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; R⁸se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C^3-6y heterociclo; R⁹se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO², alquilo C^1-6, -OR, -S(O)²R, -S(O)²N(R)², alquenilo C^2-6, carbociclo C^3-6y heterociclo; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹¹⁸, alquenilo C²¹⁸, R*YR”, Y^r” y H; cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C³¹⁴y alquenilo C³¹⁴; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹¹²y alquenilo C²¹²; cada Y es independientemente un carbociclo C³⁶; cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y con la condición de que cuando R⁴es -(CH²)ⁿQ, -(CH²)ⁿCHQR, -CHQR, o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6, o 7 miembros cuando n es 1 o 2.

En algunos casos, el agente de suministro además comprende un fosfolípido. En algunos casos, el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en 1,2 dilinoleoil sn glicero 3 fosfocolina (DLPC), 1,2 dimiristoil sn glicero fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil sn glicero 3 fosfocolina (DOPC), 1,2 dipalmitoil sn glicero 3 fosfocolina (DPPC), 1.2 diestearoil sn glicero 3 fosfocolina (DSPC), 1,2 diundecanoil sn glicero fosfocolina (DUPC), 1 palmitoil 2 oleoil sn glicero 3 fosfocolina (POPC), 1,2 di O octadecenil sn glicero 3 fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1 oleoil 2 colesterilhemisuccinoil sn glicero 3 fosfocolina (OChemsPC), 1 hexadecil sn glicero 3 fosfocolina (C16 Lyso PC), 1,2 dilinolenoil sn glicero 3 fosfocolina, 1,2 di araquidonoil sn glicero 3 fosfocolina, 1,2 didocosahexaenoil sn glicero 3 fosfocolina, 1,2 di oleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (DOPE), 1,2 difitanoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (ME 16:0 PE), 1,2 diestearoil sn glicero 3 fosfoetanolamina, 1,2 dilinoleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina, 1,2 dilinolenoil sn glicero 3 fosfoetanolamina, 1,2 di araquidonoil sn glicero 3 fosfoetanolamina, 1,2 didocosahexaenoil sn glicero 3 fosfoetanolamina, sal de sodio de 1,2 di oleoil sn glicero 3 fosfo rac (1 glicerol) (DOPG), esfingomielina y mezclas de los mismos. En algunos casos, el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en 1 miristoil 2 palmitoil sn glicero 3 fosfocolina (14:0-16:0 PC, MPPC), 1 miristoil 2 estearoil sn glicero 3 fosfocolina (14:0-18:0 PC, MSPC), 1 palmitoil 2 acetil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-02:0 PC), 1 palmitoil 2 miristoil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-14:0 PC, PMPC), 1 palmitoil 2 estearoil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-18:0 PC, PSPC), 1 palmitoil 2 oleoil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-18: 1 PC, POPC), 1 palmitoil 2 linoleoil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-18:2 PC, PLPC), 1 palmitoil 2 araquidonoil sn glicero 3 fosfocolina (16:0-20:4 PC), 1 palmitoil 2 docosahexaenoil sn glicero 3 fosfocolina (14:0-22:6 PC), 1 estearoil 2 miristoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-14:0 PC, SMPC), 1 estearoil 2 palmitoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-16:0 PC, SPPC), 1 estearoil 2 oleoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-18: 1 PC, SOPC), 1 estearoil 2 linoleoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-18:2 PC), 1 estearoil 2 araquidonoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-20:4 PC), 1 estearoil 2 docosahexaenoil sn glicero 3 fosfocolina (18:0-22:6 PC), 1 oleoil 2 miristoil sn glicero 3 fosfocolina (18:1-14:0 PC, OMPC), 1 oleoil 2 palmitoil sn glicero 3 fosfocolina (18:1-16:0 PC, OPPC), 1 oleoil 2 estearoil sn glicero 3 fosfocolina (18:1-18:0 Pc , OSPC), 1 palmitoil 2 oleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (16:0-18:1 PE, POPE), 1 palmitoil 2 linoleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (16:0-18:2 PE), 1 palmitoil 2 araquidonoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (16:0-20:4 PE), 1 palmitoil 2 docosahexaenoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (16:0-22:6 PE), 1 estearoil 2 oleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (18:0-18:1 PE), 1 estearoil 2 linoleoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (18:0-18:2 PE), 1 estearoil 2 araquidonoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (18:0-20:4 PE), 1 estearoil 2 docosahexaenoil sn glicero 3 fosfoetanolamina (18:0-22:6 PE), 1 oleoil 2 colesterilhemisuccinoil sn glicero 3 fosfocolina (OChemsPC) y cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, el agente de suministro además comprende un lípido estructural. En algunos casos, el agente de suministro además comprende un PEG lípido. En algunos casos, el agente de suministro además comprende un lípido ionizable seleccionado del grupo que consiste en 3 (didodecilamino) N1,N1,4 tridodecil 1 piperazinetanamina (KL10), N1 [2 (didodecilamino)etil] N1,N4,N4 tridodecil 1,4 piperazindietanamina (KL22), 14,25 ditridecil 15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25), 1,2 dilinoleiloxi N,N dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2 dilinoleil 4 dimetilaminometil [1,3] dioxolano (DLin-K-DMA), heptatriaconta 6,9,28,31 tetraen 19 il 4 (dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA), 2,2 dilinoleil 4 (2 dimetilaminoetil) [1,3] dioxolano (DLin-KC2-DMA), 1.2 dioleiloxi N,N dimetilaminopropano (^dO^dMA), 2 ({8 [(3p) colest 5 en 3 iloxi]octil}oxi) N,N dimetil 3 [(9Z,12Z) octadeca 9,12 dien 1 iloxi]propan 1 amina (Octil-cLinDMA), (2R) 2 ({8 [(3p) colest 5 en 3 iloxi]octil}oxi) N,N dimetil 3 [(9Z,12Z) octadeca 9, 12 dien 1 iloxi]propan 1 amina (Octil-CLinDMA (2R)) y (2S) 2 ({8 [(3p) colest 5 en 3 iloxi]octil}oxi) N,N dimetil 3 [(9Z,12Z) octadeca 9,12 dien 1 iloxi]propan 1 amina (Octil-CLinDMA (2S)).

En algunos casos, el agente de suministro además comprende un compuesto de amina cuaternaria. En algunos casos, el compuesto de amina cuaternaria se selecciona del grupo que consiste en 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTlM), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), bromuro de N-(1,2-dioleoiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC),

1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLePC), 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-dilinoleoil-3-trimetilamonio-propano (DLTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSePC), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-etilfosfocolina (DPePC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMePC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOePC), 1,2-di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfocolina (14:1 EPC), 1 -palmitoil-2-oleoilsn-glicero-3-etilfosfocolina (16:0-18:1 EPC) y cualquier combinación de los mismos.

En ciertos aspectos, la composición se formula para el suministro in vivo. En algunos aspectos, la composición se formula para suministro intramuscular, subcutáneo, intratumoral o intradérmico.

En ciertos aspectos, la administración trata un cáncer. En algunos casos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer corticosuprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, metástasis ósea, tumores del cerebro, cáncer del cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando de adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer del timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento de cáncer, y cualquier combinación de los mismos.

En ciertos aspectos, la composición se administra por un dispositivo que comprende una bomba, parche, depósito de fármaco, dispositivo de aguja corta, dispositivo de una sola aguja, dispositivo de múltiples agujas, dispositivo de micro-aguja, dispositivo de inyección por chorro, dispositivo de suministro de polvo/partículas balísticas, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía RF, corriente eléctrica o cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, la cantidad efectiva está entre aproximadamente 0.10 mg/kg a aproximadamente 1,000 mg/kg.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La FIG. 1 muestra (1) la secuencia de aminoácidos de IL12B de tipo natural, (2) el ácido nucleico de tipo natural que codifica la wtIL12B, (3) la secuencia de aminoácidos de IL12A de tipo natural, (4) el ácido nucleico de tipo natural que codifica la wtIL12A, (5) la secuencia de aminoácidos del péptido señal de IL12B de tipo natural y (6) el ácido nucleico de tipo natural que codifica el péptido señal de wtIL12B.

FIGS. 2A-2B. La FIG. 2A es una gráfica que representa la AUC más alta y Cmáx para niveles plasmáticos de IL12 observados después de la administración intravenosa de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) comparado con la proteína recombinante IL12 correspondiente. La FIG. 2B es una gráfica que representa la AUC más alta y Cmáx para niveles plasmáticos de IFNy observados después de la administración intravenosa de mRNA de IL12 administrado en nanopartícula de lípido (LNP) comparado con la proteína recombinante IL12.

La FIG. 3 es una gráfica que representa la eficacia robusta de una sola dosis intravenosa (IV) de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4) y 0.05 mg/kg (Grupo 5) (indicado por las líneas con los triángulos invertidos) comparado con los Grupos 1 (PBS), 2 (proteína IL12), 7 y 8 (controles NST-FIX, 0.1 mg/kg y 0.05 mg/kg, respectivamente).

Las FIGS. 4A-4F son gráficas que representan el volumen de tumor medio y el número de respuestas completas (CR) observada después de la administración de una sola dosis intravenosa (IV) de: mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4) (FIG. 4F) y 0.05 mg/kg (Grupo 5) (FIG. 4E), PBS (Grupo 1) (FIG. 4A), proteína IL12 (Grupo 2) (FIG. 4D), controles NST-FIX, 0.1 mg/kg y 0.05 mg/kg (Grupos 7 y 8, respectivamente) (FIG. 4C y FIG. 4^b, respectivamente). Las respuestas completas (CR) se muestran en las FIGS. 4E y 4F únicamente. La FIG. 4E muestra que 6 de 8 CR se observaron en el Grupo 5 (mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en una dosis de 0.05 mg/kg). La FIG. 4F muestra que 5 de 9 CR se observaron en el Grupo 4 (mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en una dosis de 0.1 mg/kg). Aparte de los grupos de mRNA de IL12, en todos los demás grupos no se observó ninguna CR.

La FIG. 5 es una gráfica que representa el beneficio de supervivencia el día 47 postimplantación de tumor de una sola dosis intravenosa (IV) de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en una dosis de 0.05 mg/kg (Grupo 5) y una dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4) comparado con una sola dosis IV de proteína IL12 en 1 |ig (~0.05 mg/kg) (Grupo 2), NST-FIX en 0.1 mg/kg (Grupo 7) o 0.05 mg/kg (Grupo 8) o PBS (Grupo 1).

Las FIGS. 6A-6B son gráficas que muestran la eficacia antitumoral in vivo de una sola dosis intratumoral de mRNA de IL12 (4 |ig) en una nanopartícula de lípido (LNP) administrada a ratones que llevan tumores de adenocarcinoma (MC38). La FIG. 6a muestra las medias del volumen del tumor (mm3) hasta el día 24, empezando el día 10 postimplantación. El Grupo 1 (círculos) representa ratones (n = 7) que recibieron 4 |ig de LNP de mRNA de IL12 el día 10 postimplantación; el Grupo 2 (cuadros) representa ratones (n = 7) que recibieron 4 |ig del mRNA de control que codifica el factor IX no traducido (NST-FIX LNP); y el Grupo 3 (triángulos) representa otro grupo de control de ratones (n = 7) que recibieron PBS. La FIG. 6B muestra los volúmenes de tumor individuales (mm3) para cada grupo de ratones, hasta el día 47, empezando el día 10 postimplantación. Las respuestas completas (CR) se lograron en 3 de 7 (44%) animales que recibieron 4 |ig de LNP de mRNA de IL12 (círculos).

Las FIGS. 7A-7B son gráficas que muestran la eficacia antitumoral in vivo de una dosis intratumoral de mRNA de IL12 (5 |ig) en nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3 administrado a ratones que llevan tumores de linfoma de células B A20. La FIG. 7A muestra el volumen de tumor individual (mm3) para ratones (n=12) que recibieron 5 |ig del mRNA de control no traducido (NST). La FIG. 7B muestra los volúmenes de tumor individuales para ratones (n=12) que recibieron 5 |ig de mRNA de IL12 (miRless). Las respuestas completas (CR) se lograron en 5 de 12 animales que recibieron mRNA de IL12.

La FIG. 7C es una gráfica que muestra la eficacia antitumoral in vivo comparable del mRNA de IL12 (5 |ig) que contiene un sitio de unión de miR122 (FIG. 7C) en un modelo de tumor de linfoma de células B (A20). Ambos mRNA de IL12 (con el sitio de unión de miR122 y sin el sitio de unión (es decir, miRless)) se formularon en una nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3. Los mRNA de IL12 se administraron a ratones que llevan tumores de linfoma de células B A20. Las respuestas completas (CR) se lograron en 6 de 12 ratones en el grupo de IL12 miR122 (FIG. 7C).

Las FIGS. 8A-8B son gráficas que muestran la eficacia antitumoral in vivo de una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3 administrada a ratones que llevan tumores de linfoma de células B A20. Las respuestas completas (CR) se lograron en 4 de 12 ratones en el grupo de IL12 miRless (0.5 |ig) (FIG. 8A) y 3 de 12 ratones en el grupo de IL12 miR122 (0.5 |ig) (FIG. 8B).

La FIG. 8C es una gráfica que muestra la eficacia antitumoral in vivo aumentada en un modelo de tumor de linfoma de células B (A20) al administrar múltiples dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3 a ratones que llevan tumores A20. Las respuestas completas (CR) se lograron en 5 de 12 ratones a los que se administró dosis semanales de 0.5 |ig de IL12 miR122 durante siete (7) días x 6.

La FIG. 8D es una gráfica que muestra que la eficacia antitumoral in vivo de dosis intratumorales semanales de 0.5 |ig de mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) (es decir, Compuesto 18) administradas a ratones que llevan tumores de linfoma de células B A20 es similar a la eficacia antitumoral in vivo de 0.5 |ig de mRNA de IL12 en LNP basada en MC3. La FIG. 14 muestra los volúmenes de tumor individuales para 12 ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 en la LNP basada en Compuesto 18 durante 7 días x 6. Las respuestas completas (CR) también se lograron en 5 de 12 animales.

Las FIGS. 8E-8F son gráficas que muestran el crecimiento de tumor en ratones que llevan tumores A20 que recibieron dosis semanales (7 días x 6) de 0.5 |ig de mRNA de control negativo no traducido (NST) en nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3 (FIG. 8E) y 0.5 |ig de mRNA de control negativo no traducido (NST) en LNP basada en Compuesto 18 (FIG. 8^f).

Las FIGS. 9A-9B son gráficas que muestran los niveles dependientes de dosis de IL12 en el plasma (FIG. 9A) y el tumor (FIG. 9B) a las 6 horas y 24 horas después de la administración intratumoral de las dosis indicadas de mRNA de IL12 en LNP basadas en MC3 a ratones que llevan tumores A20. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST, (iii) 2.5 |ig de NST, (iv) 5 |ig de NST, (v) 0.5 |ig de IL12, (vi) 2.5 |ig de IL12, (vii) 5 |ig de IL12, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 y (x) 5 |ig de IL12 miR122.

Las FIGS. 9C-9D son gráficas que muestran niveles elevados de IL12 en el plasma y el tumor después de la administración de dosis indicadas de mRNA de IL12 en LNP basadas en Compuesto 18 comparado con el mRNA de IL12 en LNP basadas en MC3. La FIG. 9C muestra los niveles de IL12 del plasma a las 6 horas y 24 horas; la FIG. 9D muestra los niveles de IL12 en el tumor a las 6 horas y 24 horas. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (v) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (vi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (vii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (viii) 5 |ig de IL12 miR122, (ix) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (x) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 9E-9F son gráficas que muestran niveles incrementados de IFN^ya las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9E) y en el tumor (FIG. 9F) después de la administración de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores A20. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 5 |ig de NST en MC3, (v) 0.5 |ig de IL12 en MC3, (vi) 2.5 |ig de IL12 en MC3, (vii) 5 |ig de IL12 en MC3, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (x) 5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (xi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xiii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (xiv) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 9G-9H son gráficas que muestran niveles incrementados de IP10 a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9G) y en el tumor (FIG. 9H) después de la administración de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores A20. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 5 |ig de NST en MC3, (v) 0.5 |ig de IL12 en MC3, (vi) 2.5 |ig de IL12 en MC3, (vii) 5 |ig de IL12 en MC3, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (x) 5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (xi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xiii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (xiv) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 9I-9J son gráficas que muestran niveles disminuidos de IL6 a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9I) y en el tumor (FIG. 9J) después de la administración de mRNA de IL12. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 5 |ig de NST en MC3, (v) 0.5 |ig de IL12 en MC3, (vi) 2.5 |ig de IL12 en MC3, (vii) 5 |ig de IL12 en MC3, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (x) 5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (xi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xiii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (xiv) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 9K-9L son gráficas que muestran niveles disminuidos de G-CSF a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9K) y en el tumor (FIG. 9L) después de la administración de mRNA de IL12. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 5 |ig de NST en MC3, (v) 0.5 |ig de IL12 en MC3, (vi) 2.5 |ig de IL12 en MC3, (vii) 5 |ig de IL12 en MC3, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (x) 5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (xi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xiii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (xiv) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 9M-9N son gráficas que muestran niveles disminuidos de GROa a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9M) y en el tumor (FIG. 9N) después de la administración de mRNA de IL12. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) PBS, (ii) 0.5 |ig de NST en MC3, (iii) 2.5 |ig de NST en MC3, (iv) 5 |ig de NST en MC3, (v) 0.5 |ig de IL12 en MC3, (vi) 2.5 |ig de IL12 en MC3, (vii) 5 |ig de IL12 en MC3, (viii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (ix) 2.5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (x) 5 |ig de IL12 miR122 en MC3, (xi) 0.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xii) 2.5 |ig de NST en el Compuesto 18, (xiii) 0.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18 y (xiv) 2.5 |ig de IL12 miR122 en el Compuesto 18.

Las FIGS. 10A-10B son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta el día 35 después de inducción de enfermedad con el tumor A20 después del tratamiento con mRNA de IL12_miR122 (FIG. 10B) comparado con mRNA de control negativo (FIG. 10A).

Las FIGS. 10C-10D son gráficas que muestran mediciones de peso corporal de los ratones hasta el día 35 después de inducción de enfermedad con tumor A20 después del tratamiento con mRNA de IL12_miR122 (FⁱG. 10D) comparado con mRNA de control negativo (FIG. 10C).

La FIG. 11A es una gráfica que representa la bioluminiscencia (BL) como un sustituto para la carga de tumor el día 22 después de inducción de enfermedad con una línea de células de cáncer de colon MC38 habilitada con luciferasa en ratones. De izquierda a derecha, a los ratones se les administró ningún tratamiento, 2 |ig de mIL12_miRless, 2 |ig de mIL12_miR122, 2 |ig de NST_OX40L_122, 4 |ig de mIL12_miRless, 4 |ig de mIL12_miR122, 4 |ig de NST_OX40L_122 y 1 |ig de rm IL12.

La FIG. 11B es una curva de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con LNP que llevan mRNA de IL12 comparado con los controles negativos NST-OX40L. La gráfica muestra la supervivencia hasta el día 150 postimplantación del tumor A20.

La FIG. 12A muestra las mediciones de uracilo (U) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hlL12AB_020). La FIG. 12B muestra las mediciones de guanina (G) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG. ¹²C muestra las mediciones de citosina (C) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG.

12D muestra las mediciones de guanina más citosina (G/C) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020).

La FIG. 13A muestra las mediciones de uracilo (U) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG. 13B muestra las mediciones de guanina (G) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG. 13C muestra las mediciones de citosina (C) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG.

13D muestra las mediciones de guanina más citosina (G/C) correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040).

La FIG. 14A muestra las mediciones de uracilo (U) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG. 14B muestra las mediciones de guanina (G) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG. 14C muestra las mediciones de citosina (C) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG.

14D muestra las mediciones de guanina más citosina (G/C) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020).

La FIG. 15A muestra las mediciones de uracilo (U) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG. 15B muestra las mediciones de guanina (G) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG. 15C muestra las mediciones de citosina (C) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG.

15D muestra las mediciones de guanina más citosina (G/C) correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La columna marcada “Contenido de G/C (%)” corresponde a % G/C^tl.

La FIG. 16A muestra una comparación entre la desviación de composición de G/C para las posiciones de codón 1, 2, 3 correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_001 a hIL12AB_020). La FIG. 16B muestra una comparación entre la desviación de composición de G/C para posiciones de codón 1, 2, 3 correspondientes a IL12B de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12B optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040). La FIG. 16C muestra una comparación entre la desviación de composición de G/C para posiciones de codón 1, 2, 3 correspondientes a IL12^ade tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_0-1 a hIL12AB_020). La FIG. 16D muestra una comparación entre la desviación de composición G/C para posiciones de codón 1, 2, 3 correspondientes a IL12A de tipo natural y 20 polinucleótidos de IL12A optimizados en secuencia (hIL12AB_021 a hIL12AB_040).

La FIG. 17A es una gráfica que muestra los niveles dependientes de la dosis de IL12 en el plasma a las 24 horas después de la administración intratumoral de las dosis indicadas de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) ningún tratamiento, (ii) 5 |ig de NST, (iii) 0.05 |ig de IL12 miR122, (iv) 0.5 |ig de IL12 miR122, (v) 5 |ig de IL12 miR122, (vi) 5 |ig de NST, (vii) 0.5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis), (viii) 2.5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis) y (ix) 5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis).

La FIG. 17B es una gráfica que muestra los niveles incrementados de IFN^yen el plasma a las 24 horas después de la administración intratumoral de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores. De izquierda a derecha, a los ratones se les proporcionó (i) ningún tratamiento, (ii) 5 |ig de NST, (iii) 0.05 |ig de IL12 miR122, (iv) 0.5 |ig de IL12 miR122, (v) 5 |ig de IL12 miR122, (vi) 5 |ig de NST, (vii) 0.5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis), (viii) 2.5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis) y (ix) 5 |ig de IL12 miR122 (4 dosis).

Las FIGS. 18A-18B son gráficas que muestran niveles incrementados de IL12 en el plasma (FIG. 18A) e IFNy en el plasma (FIG. 18B) durante el transcurso de 200 horas después de la administración intraperitoneal de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38. A los ratones se les proporcionó (i) ningún tratamiento, (ii) 2 |ig de IL12 miRless, (iii) 2 |ig de IL12 miR122, (iv) 4 |ig de IL12 miRless, (v) 4 |ig de miR122, (vi) 1 |ig de proteína IL12, (vii) 2 |ig de NST_OX40L_122 o (viii) 4 |ig de NST_OX40L_122.

Las FIGS. 19A-19B son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta el día 90 después de inducción de enfermedad con el tumor A20 después del tratamiento con 0.5 |ig de mRNA de IL12_miR122 en una nanopartícula de lípido (LNP) basada en Compuesto 18 (FIG. 19B) comparado con el mRNA de control negativo (FIG. 19A).

Las FIGS. 19C-19D son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta el día 60 después de inducción de enfermedad con el tumor A20 en ratones que no han recibido tratamiento previo (FIG. 19C) o en ratones con respuesta completa previamente tratados con mRNA de IL12_miR122 y re-estimulados (FIG. 19D).

Las FIGS. 20A-20D son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 80 días después de una sola dosis intratumoral de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38-S. A los ratones se les proporcionó 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 20A), 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 20B), 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 20C) o NST (FIG. 20D).

Las FIGS. 21A-21F son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 80 días después de una sola dosis o múltiples dosis de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38-S. A los ratones se les proporcionó una sola dosis de 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21A), una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21B), una sola dosis de 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21C), dos dosis de 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21D), dos dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21E), dos dosis de 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 21F).

La FIG. 22 es una curva de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con las LNP que llevan mRNA de IL12 comparado con los controles negativos de NST-FIX. La gráfica muestra la supervivencia hasta el día 80 postimplantación del tumor MC38-S.

Las FIGS. 23A-23D son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 75 días después de una sola dosis de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38-R. A los ratones se les proporcionó 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23A), 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23B), 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23C) o NST (FIG. 23D).

Las FIGS. 23E-23J son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 75 días después de una sola dosis o múltiples dosis de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38-R. A los ratones se les proporcionó una sola dosis de 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23E), una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23F), una sola dosis de 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23G), múltiples dosis de 0.05 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23H), múltiples dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23I) o múltiples dosis de 5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 23J).

La FIG. 24 es una curva de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con las LNP que llevan mRNA de ⁱL12 comparado con los controles negativos de NST-OX40L. La gráfica muestra la supervivencia hasta el día 80 postimplantación del tumor MC38-R.

La FIG. 25 es una gráfica que muestra el agotamiento de células T CD8+ durante el transcurso de 28 días.

Las FIGS. 26A-26E son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 90 días después del agotamiento de células T CD8+ y la administración subsecuente de una sola dosis de mRNA de IL12 a ratones que llevan tumores MC38-R. A los ratones se les proporcionó un control de anticuerpo para el agotamiento de células T CD8+ y luego 0.5 |ig de mRNA de control negativo (FIG. 26A), un control de anticuerpo para el agotamiento de células T CD8+ y luego 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 26B), el clon 24.3 de anticuerpo de agotamiento de células T CD8+ y luego 0.5 |ig de mRNA de control negativo (FIG. 26C), o el clon 24.3 de anticuerpo de agotamiento de células T CD8+ y luego 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 26D). La FIG. 26E es una curva de Kaplan-Meier que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con mRNA de IL12 con ausencia de agotamiento de células T CD8+ comparado con ratones tratados con mRNA de IL12 después del agotamiento de células T CD8+. La gráfica muestra la supervivencia hasta el día 90 postimplantación del tumor MC38-R.

Las FIGS. 27A-27B son gráficas que muestran el porcentaje de células mieloides CD11b+ con tinción positiva para la expresión de PDL1 en ^mC38-R (FIG. 27A) y B16F10-AP3 (FIG. 27B) en los tumores 24 horas o 72 horas después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis intratumorales diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 28A-28B son gráficas que muestran células T CD8+ en tumores como una proporción del infiltrado inmunitario (células CD45+) (paneles izquierdo) y por mg de tumor (paneles derecho) en tumores MC38-R (FIG. 28A) y B16F10-AP3 (FIG. 28B) 7 días después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 29A-29B son gráficas que muestran la relación de células T CD8+ a células Treg en los tumores MC38-R (FIG. 29A) y B16F10-AP3 (FIG. 29B) 7 días después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 30A-30B son gráficas que muestran el porcentaje de células T CD8+ con tinción positiva para el marcador de activación temprano CD69 en los tumores MC38-R (FIG. 30A) y B16F10-AP3 (FIG. 30B) 24 horas después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 31A-31B son gráficas que muestran el porcentaje de células NK con tinción positiva para el marcador de activación temprano CD69 en los tumores MC38-R (FIG. 31A) y B16F10-AP3 (FlG. 31B) 24 horas o 72 horas después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 32A-32B son gráficas que muestran el número de células dendríticas clásicas CD103+ por mg de tumores MC38-R (FIG. 32A) y B16F10-AP3 (FIG. 32B) 7 días después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La FIG. 32C es una gráfica que muestra el porcentaje de células dendríticas clásicas CD8+ con tinción positiva para CD86 en el ganglio linfático (LN) de drenaje del tumor de un tumor B16F10-AP3 24 horas, 72 horas o 7 días después de ningún tratamiento, tratamiento con un control negativo de NST o dos dosis diferentes de mRNA de IL12. La significación estadística se indica por asteriscos.

Las FIGS. 33A-33B son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 55 días después de la administración del anticuerpo anti-PD-L1 a ratones que llevan tumores MC38-R. A los ratones se les proporcionó un control de anticuerpo (FIG. 33A) o un anticuerpo anti-PD-L1 (clon 80) (FIG. 33B). Las FIGS.

33C-33G son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales en ratones que llevan tumores MC38-R hasta 90 días después de la administración de mRNA de IL12 solo o en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1. A los ratones se les proporcionó (i) una sola dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA de IL12 como una monoterapia (FIG. 33C), (ii) una sola dosis iTu de 5.0 |ig de IL12 miR122 como una monoterapia (FIG. 33D), (iii) una sola dosis iTu de 0.5 |ig de IL12 miR122 en combinación con múltiples dosis intraperitoneales de anticuerpo anti-PD-L1 (FIG. 33E), (iv) una sola dosis iTu de 5.0 |ig de mRNA de IL12 en combinación con múltiples dosis intraperitoneales de anticuerpo anti-PD-L1 (FIG. 33F); o (v) múltiples dosis intraperitoneales de anticuerpo anti-PD-L1 (FIG. 33G).

Las FIGS. 34A-34C son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 75 días. Los ratones que llevan tumores MC38-R se trataron 10 días postimplante con un anticuerpo anti-PD-L1 solo (FIG. 34A), 0.5 |ig de mRNA de IL12 solo (FIG. 34B), o tanto un anticuerpo anti-PD-L1 como 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG.

34C). El anticuerpo anti-PD-L1 se administró en 6 dosis. Las líneas de trazos verticales indican los días de dosis.

Las FIGS. 35A-35D son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales hasta 70 días. Los ratones que llevan tumores B16F10-AP3 se trataron 10 días postimplante con un control negativo (FIG. 35A), un anticuerpo anti-PD-L1 solo (FIG. 35B), una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 solo (FIG. 35C) o tanto con un anticuerpo anti-PD-L1 como con 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIG. 35D). El anticuerpo anti-PD-L1 se administró en 6 dosis. Las líneas de trazos verticales indican los días de dosis.

La FIG. 36A es un dibujo de un ratón con implante bilateral de células de tumor. Las FIGS. 36B-36G son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales en ratones MC38-S con implante bilateral hasta 60 días en tumores tratados (FIG. 36B, 36D y 36F) y distantes (FIG. 36C, 36E y 36G) después del tratamiento con un control negativo (mRNA de NST más el control de anticuerpo de isotipo) (FIGS. 36B-36C), 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIGS. 36D-36E), o 5 |ig de mRNA de IL12 (FIGS. 36F-36G). Las líneas de trazos verticales indican los días de dosis.

Las FIGS. 37A-37F son gráficas que muestran volúmenes de tumor individuales en ratones MC38-S con implante bilateral hasta 60 días después del tratamiento con mRNA no activo (mRNA de NST) (FIGS. 37A-37B), 0.5 |ig de mRNA de IL12 (FIGS. 37C-37D) o 5 |ig de mRNA de IL12 (FIGS. 37E-37F), combinado con ya sea un anticuerpo de control de isotipo (FIGS. 37A, 37C o 37E) o un anticuerpo anti-PD-L1 (FIGS. 37B, 37D o 37F). Las líneas de trazos verticales indican los días de dosis.

La FIG. 38 es una gráfica que muestra la expresión de IL-12 humana in vitro e in vivo mediante construcciones de mRNA de IL-12 de tipo natural y optimizados en codones.

Descripción detallada

La presente descripción proporciona un nuevo procedimiento para tratar el cáncer que implica la prevención o tratamiento de la enfermedad con sustancias (p. ej., mRNA que codifican IL12) que estimulan la respuesta inmunitaria, es decir, inmunoterapia.

En un aspecto, la descripción se refiere a métodos para tratar el cáncer utilizando un polinucleótido que codifica IL12. Un polipéptido de IL12 como se describe en el presente documento comprende IL12A, IL12B o tanto IL12A como IL12B. En otro aspecto, la descripción proporciona métodos para tratar el cáncer utilizando un procedimiento de combinación que presenta mRNA que codifican IL12 y un agente anticanceroso, p. ej., un inhibidor de punto de control inmunitario, p. ej., el anticuerpo anti-PD-1, el anticuerpo anti-PD-L1 y/o anticuerpo anti-CTLA-4. Sin estar limitado por ninguna teoría, se cree que el cebado de una respuesta inmunitaria anticancerosa es posible administrando, p. ej., por vía intratumoral, mRNA que codifican IL12 en la estimulación de, por ejemplo, células T y/o células citolíticas naturales. Por lo tanto, un mRNA que codifica IL12 se cree que proporciona una primera señal de estimulación al sistema inmunitario, por ejemplo, dentro del ambiente del tumor, p. ej., mediante inyección intratumoral del mRNA. La IL12 también puede estimular la producción de interferón-gamma (IFN-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) de células T y células citolíticas naturales (NK). Como se describe en el presente documento, la IL12, ya sea directamente o indirectamente a través del IFN-^y, también puede incrementar la expresión de PD-L1 en células tumorales, lo que puede deteriorar la inmunidad del tumor local. Por lo tanto, en algunos aspectos, la descripción proporciona un método para tratar un tumor que comprende administrar un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo anti-PD-LI para bloquear la interacción entre PD-L1 y su receptor, es decir, PD-1. En otros aspectos, la descripción incluye un método para tratar un tumor que comprende administrar un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4. En aspectos adicionales, la descripción proporciona un método para tratar un tumor que comprende administrar un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA-4. Algunos aspectos de la descripción también incluyen agentes adicionales, p. ej., OX40L, un polinucleótido que codifica OX40L, o mRNA que codifica un OX40L. En otros aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 o el anticuerpo anti-PD-L1 se pueden administrar en la forma de un polinucleótido. De manera similar, el anticuerpo anti-CTLA-4 se puede administrar en la forma de un polinucleótido. Aspectos ejemplares presentan el tratamiento con mRNA encapsulados en nanopartícula de lípido (LNP). Aspectos ejemplares presentan la administración intratumoral de mRNA en LNP basada en lípido catiónico.

1. Métodos para tratar el cáncer

Ciertos aspectos de la presente descripción se dirigen a métodos para reducir o disminuir el tamaño, masa y/o volumen de un tumor o prevenir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A descrito en el presente documento, o un vector o una célula hospedante que comprende el polinucleótido, o un polipéptido de IL12B y/o IL12A codificado por el polinucleótido. En ciertos casos, el polinucleótido codifica un polipéptido de IL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y uno de IL12A. En algunos casos, los métodos para reducir el tamaño (que incluyen masa y/o volumen) de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite comprenden administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de IL-12. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de IL12B. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de IL12A. En ciertos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A.

En algunos casos, los métodos además comprenden administrar un segundo agente. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control. En algunos casos, el inhibidor de punto de control es cualquier inhibidor de punto de control conocido en la técnica o descrito en el presente documento. En algunos casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-1. En otros casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-LI. En otros casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-CTLA-4. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica OX40L. En algunos casos, el inhibidor de punto de control se selecciona de un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, o un polinucleótido que codifica OX40L o cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento. En ciertas casos, la composición que comprende un inhibidor de punto de control comprende más de un inhibidor de punto de control. En un caso particular, el método comprende administrar (i) un mRNA, que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A descrito en el presente documento y (ii) un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-PD-1, un anti-CTLA-4 anticuerpo, un polinucleótido que codifica OX40L, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, los métodos reducen el tamaño de un tumor en un sujeto en comparación con el tamaño del tumor antes de la administración. En ciertos casos, el tamaño del tumor se reduce en al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100%. En ciertos casos, el sujeto presenta una respuesta parcial. En ciertos casos, el sujeto presenta una respuesta completa.

En algunos casos, los métodos de la presente descripción inhiben, detienen o retardan el crecimiento del tumor en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, el crecimiento del tumor se inhibe, detiene o retarda durante al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses o al menos aproximadamente 36 meses. En otros casos, el crecimiento del tumor se inhibe indefinidamente.

En otros casos, la presente descripción proporciona métodos para promover un efecto antitumoral (p. ej., inducir la proliferación de células T, inducir la infiltración de células T en un tumor, inducir una respuesta de células T de memoria, incrementar el número de células NK, etc.) administrando el polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 solo o el polinucleótido en combinación con cualquiera de los agentes descritos en el presente documento.

En un caso, la presente descripción proporciona un método para activar células T en un sujeto que lo necesite, inducir la proliferación de células T en un sujeto que lo necesite, inducir la infiltración de células T en un tumor de un sujeto que lo necesite y/o inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una composición descrita en el presente documento, p. ej., un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12, solo o en combinación con la composición que comprende un segundo agente, p. ej., un polipéptido inhibidor de punto de control o un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, o un polinucleótido que codifica OX40L o cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento. En ciertos casos, la administración intratumoral del polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 solo o en combinación con un segundo agente puede incrementar la eficacia del efecto antitumoral (p. ej., infiltración de células T en un tumor) comparado con otras vías de administración.

En algunos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido que codifica una IL12, solo o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, activa las células T en el sujeto. La activación de células T se puede caracterizar de cualquier manera conocida en la técnica. En algunos casos, las células T activadas expresan CD4. En algunos casos, las células T activadas expresan CD8. En ciertos casos, las células T activadas expresan CD4 y CD8. En ciertos casos, las células T activadas comprenden células T CD4+, células T CD8+ o tanto células T CD4+ como células T CD8+.

En un caso, las células T activadas en el sujeto reducen el tamaño de un tumor o inhiben el crecimiento de un tumor en el sujeto. La activación de las células T se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como la medición de proliferación de células T; medición de producción de citocinas con ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) o ensayos de inmunoabsorción de puntos ligados a enzimas (ELISPOT); o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de células T (p. ej., CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como citometría de flujo.

En algunos casos, la activación de células T comprende inducir la proliferación de células T. En algunos casos, la proliferación de células T se incrementa en al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces, en comparación con el nivel de proliferación de células T antes de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA).

En un caso, la proliferación de células T en el sujeto se dirige a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la proliferación de células T en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La proliferación de células T se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como el recuento celular, tinción de viabilidad, ensayos de densidad óptica, o detección de marcadores de superficie celular asociados con la activación de células T (p. ej., CD69, CD40L, CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154 y CD134) con técnicas tales como citometría de flujo.

En algunos casos, la activación de células T comprende la inducción de la infiltración de células T del tumor. En algunos casos, la infiltración de células T en el tumor se incrementa en al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces, en comparación con el nivel de infiltración de células T del tumor antes de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA).

En algunos casos, la activación de células T comprende incrementar el número de células T de infiltración del tumor. En ciertos casos, el número de células T de infiltración del tumor en el tumor se incrementa en al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces, en comparación con el número de células T de infiltración del tumor con respecto al tumor antes de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA).

En un caso, la infiltración de células T en un tumor del sujeto se dirige a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la infiltración de células T en un tumor del sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La infiltración de células T en un tumor se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como el seccionamiento de tejido y la tinción para marcadores celulares, la medición de producción de citocinas locales en el sitio del tumor, o la detección de marcadores de superficie de células T con técnicas tales como la citometría de flujo.

En algunos casos, la activación de las células T comprende inducir una respuesta de células T de memoria en un sujeto que lo necesite. En ciertos casos, la respuesta de células T de memoria se incrementa en al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces, en comparación con la respuesta de células T de memoria antes de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA).

En un caso, la respuesta de células T de memoria en el sujeto se dirige a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, la respuesta de células T de memoria en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Una respuesta de células T de memoria se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como la medición de marcadores de células T asociados con células T de memoria, la medición de producción de citocinas locales relacionadas con la respuesta inmunitaria de memoria, o la detección de marcadores de superficie de células T de memoria con técnicas tales como citometría de flujo.

En algunos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido que codifica una IL12, sola o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, incrementa una relación de células T efectoras a supresoras en el tumor. En ciertos casos, la relación de células T efectoras a supresoras se caracteriza por la relación de (i) células T CD8+, CD4+ o CD8+/CD4+ a (ii) células Treg en un sujeto. En ciertos casos, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras se correlaciona con un incremento en el número de células T CD8+. En algunos casos, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras se correlaciona con un incremento en el número de células T CD4+. En algunos casos, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras se correlaciona con un incremento del número de células T CD8+/CD4+. En algunos casos, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras se correlaciona con una disminución en el número de células Treg.

En algunos casos, la relación de células T efectoras a supresoras, p. ej., la relación de células T CD8+ a células Treg, después de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA) (solo o en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CTLA-4 o un polinucleótido que codifica OX40L) es al menos aproximadamente 1.5:1, al menos aproximadamente 2:1, al menos aproximadamente 2.5:1, al menos aproximadamente 3:1, al menos aproximadamente 3.5:1, al menos aproximadamente 3.5:1, al menos aproximadamente 4:1, al menos aproximadamente 4.5:1, al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 9:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 30:1, al menos aproximadamente 35:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 45:1, al menos aproximadamente 50:1, al menos aproximadamente 60:1, al menos aproximadamente 70:1, al menos aproximadamente 80:1, al menos aproximadamente 90:1, al menos aproximadamente 100:1 , al menos aproximadamente 110:1 , al menos aproximadamente 120:1, al menos aproximadamente 130:1 , al menos aproximadamente 140:1 , al menos aproximadamente 150:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 250:1 o al menos aproximadamente 500:1.

En algunos casos, la relación de células T efectoras a supresoras, p. ej., la relación de células T CD8+ a células Treg, después de la administración del polinucleótido que codifica IL12 (p. ej., mRNA) (solo o en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CTLA-4 o un polinucleótido que codifica OX40L) es al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2.5, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 3.5, al menos aproximadamente 3.5, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 4.5, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 110, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250 o al menos aproximadamente 500.

En un caso, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras en el tumor se dirige a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, el incremento en la relación de células T efectoras a supresoras en el tumor reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. La relación de células T efectoras a supresoras en el tumor se puede medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como la medición de la relación de células T CD8+, CD4+ o CD8+/CD4+ a células Treg, utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica que incluyen IHC y/o citometría de flujo.

En ciertos casos, las células T activadas por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, las células T activadas por los presentes métodos son células Th¹. En otros casos, las células T activadas por los presentes métodos son células Th². En otros casos, las células T activadas por la presente descripción son células T citotóxicas.

En algunos casos, las células T de infiltración por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, las células T de infiltración por los presentes métodos son células Th¹. En otros casos, las células T de infiltración por los presentes métodos son células Th². En otros casos, las células T de infiltración por la presente descripción son células T citotóxicas.

En algunos casos, las células T de memoria por los presentes métodos son células CD4+, células CD8+, células CD62+ (L-selectina+), células CD69+, células CD40L+, células CD137+, células CD25+, células CD71+, células CD26+, células CD27+, células CD28+, células CD30+, células CD45+, células CD45RA+, células CD45RO+, células CD11b+, células CD154+, células CD134+, células CXCR3+, células CCR4+, células CCR6+, células CCR7+, células CXCR5+, células Crth2+, células T gamma delta, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, las células T de memoria por los presentes métodos son células Th¹. En otros casos, las células T de memoria por los presentes métodos son células Th². En otros casos, las células T de memoria por la presente descripción son células T citotóxicas.

En ciertos casos, la descripción incluye un método para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa, una respuesta inmunitaria innata, o tanto una respuesta inmunitaria adaptativa como innata contra el tumor que comprende administrar un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12 solo o en combinación con un segundo agente, p. ej., un inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, un polinucleótido que codifica OX40L y/o cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento.

La presente descripción además proporciona un método para incrementar el número de células citolíticas naturales (NK) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar un polinucleótido que comprende un mRNA que codifica IL12 solo o en combinación con un segundo agente, p. ej., un inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, un polinucleótido que codifica OX40L, y/o cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento. En un aspecto, el incremento del número de células NK en el sujeto se dirige a una respuesta inmunitaria antitumoral en el sujeto. En otro aspecto, el incremento del número de células NK en el sujeto reduce o disminuye el tamaño de un tumor o inhibe el crecimiento de un tumor en el sujeto. Los incrementos en el número de células NK en un sujeto se pueden medir utilizando aplicaciones en la técnica tales como la detección de marcadores de superficie de células NK (p. ej., CD335/NKp46; CD336/NKp44; CD337/NPp30) o marcadores de células NK intracelulares (p. ej., perforina; granzimas; granulisina).

En algunos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica una IL12, sola o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, incrementa el número de células NK activadas en el sujeto en comparación con el número de células NK activadas antes de la administración. En algunos casos, el número de células NK activadas se incrementa en al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 45 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces o al menos aproximadamente 100 veces. En algunos casos, el incremento en las células NK activadas se mantiene durante al menos aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 8 días, al menos aproximadamente 9 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 11 días, al menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 16 días, al menos aproximadamente 17 días, al menos aproximadamente 18 días, al menos aproximadamente 19 días, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 21 días o al menos aproximadamente 28 días.

En algunos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica una IL12, sola o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, incrementa el número de células dendríticas de presentación cruzada en el tumor del sujeto en comparación con el número de células dendríticas de presentación cruzada en el tumor antes de la administración. En algunos casos, el número de células dendríticas de presentación cruzada en el tumor se incrementa en al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 45 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces o al menos aproximadamente 100 veces.

En algunos casos, el incremento en células dendríticas de presentación cruzada en el tumor se mantiene durante al menos aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 8 días, al menos aproximadamente 9 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 11 días, al menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 16 días, al menos aproximadamente 17 días, al menos aproximadamente 18 días, al menos aproximadamente 19 días, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 21 días o al menos aproximadamente 28 días.

En ciertos casos, la presente descripción también se dirige a un método para incrementar la expresión de IFN^yen un sujeto que tiene tumor que comprende administrar un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12 solo o en combinación con un segundo agente, p. ej., un inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, un polinucleótido que codifica OX40L y/o cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento.

Otros casos también incluyen un método para incrementar la expresión de IFNy, TNFa, IL-10, IL-13, IL-15/15R, IL-27, MIP-1 p, MIP-1a, ^mC^p-1, MCP-3, M-CSF, IL-4, IL-5 o cualquier combinación de los mismos en un sujeto que tiene tumor que comprende administrar un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12 solo o en combinación con otro agente descrito en el presente documento. En otros casos más, los métodos de la presente descripción pueden incluir métodos para inducir la expresión de GM-CSF, IL-18, IL-3, RANTES, IL-6 o cualquier combinación de los mismos.

El polinucleótido que codifica IL12 se puede formular como una composición farmacéutica que es adecuada para la administración ya sea directa o indirectamente a tumores. El término “tumor” se utiliza en el presente documento en un sentido amplio y se refiere a cualquier crecimiento nuevo anormal de tejido que no posee función fisiológica y surge de la proliferación celular normalmente rápida no controlada. El término “tumor” como se utiliza en el presente documento, se refiere tanto a tumores benignos como tumores malignos.

Ciertos aspectos de la descripción proporcionan métodos para administrar por vía intratumoral una sola dosis de administración de un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12 solo o en combinación con cualquiera de los agentes descritos en el presente documento. En tales casos, un mRNA que codifica IL12 se puede administrar únicamente una vez mientras que el otro agente se puede administrar de forma regular, siguiendo su pauta posológica normal. En ciertos casos, un inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, se administra antes de la administración de un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12. En algunos casos, el polinucleótido se formula en una nanopartícula de lípido, p. ej., Compuesto 18, descrito en el presente documento. Sin estar limitado por ninguna teoría, en algunos aspectos, el suministro intratumoral de un polinucleótido que codifica IL12 y/o la formulación de nanopartículas de lípido descrita en el presente documento permite la administración de dosis individual que es suficiente para la dosis para activar la eficacia antitumoral y tratar el tumor. Dada la toxicidad potencial del IFN^yinducido por IL-12, esta pauta de dosis única del polinucleótido descrito puede ser beneficiosa para los sujetos que necesiten el tratamiento.

En ciertos casos, el método comprende administrar una sola dosis de un polinucleótido que codifica IL12 en combinación con un segundo agente, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-LI y/o un anticuerpo CTLA-4, que se puede proporcionar también en una sola administración o múltiples administraciones siguiendo su pauta normal (p. ej., aprobada). En otros casos, el método comprende no más de dos administraciones de un polinucleótido que codifica IL12, no más de tres administraciones de un polinucleótido que codifica IL12, no más de cuatro administraciones de un polinucleótido que codifica IL12, o no más de cinco administraciones de un polinucleótido que codifica IL12, opcionalmente en combinación con un inhibidor de punto de control, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-LI y/o un anticuerpo anti-CTLA-4, o un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40L.

En otros casos, los presentes métodos pueden dar como resultado efectos abscopales, p. ej., un tratamiento de tumor donde el tratamiento localizado de un tumor, p. ej., suministro intratumoral, mediante un polinucleótido, p. ej., mRNA, que codifica IL12 produce no solo una contracción del tumor tratado, sino también una contracción de tumores fuera del alcance del tratamiento localizado (“tumor distante”).

En algunos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12, solo o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, reduce el tamaño de un tumor distante. En ciertos casos, la administración es intratumoral a un primer tumor, y la administración reduce el tamaño de un segundo tumor distante. En algunos casos, el tamaño del tumor distante se reduce en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20% al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100%.

En ciertos casos, la administración de las composiciones descritas en el presente documento, p. ej., un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12, solo o en combinación con una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, inhibe el crecimiento de un tumor distante. En ciertos casos, la administración es intratumoral a un primer tumor, y la administración inhibe el crecimiento de un segundo tumor distante. En algunos casos, el crecimiento del tumor distante se inhibe durante al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 21 días, al menos aproximadamente 28 días, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 4 años o al menos aproximadamente 5 años.

El suministro del polinucleótido que codifica IL12 a un tumor utilizando composiciones farmacéuticas para administración intratumoral descritas en el presente documento pueden:

(i) incrementar la retención del polinucleótido en el tumor;

(ii) incrementar los niveles de polipéptido expresado en el tumor comparado con los niveles de polipéptido expresado en el tejido peritumoral;

(iii) disminuir la fuga del polinucleótido o producto expresado al tejido fuera del objetivo (p. ej., tejido peritumoral, o a ubicaciones distantes, p. ej., tejido del hígado); o

(iv) cualquier combinación de los mismos,

en donde el incremento o disminución observado para una cierta propiedad es en relación con una composición de referencia correspondiente (p. ej., composición en la cual los compuestos de la fórmula (I) no están presentes o se han sustituido por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3).

En un caso, una disminución en la fuga se puede cuantificar como disminución en la relación de la expresión del polipéptido en el tumor a la expresión del polipéptido en tejidos no tumorales, tales como el tejido peritumoral u otro tejido u órgano, p. ej., tejido del hígado.

El suministro de un polinucleótido que codifica IL12 a un tumor implica administrar una composición farmacéutica descrita en el presente documento, p. ej., en forma de nanopartícula, que incluye el polinucleótido que codifica IL12 a un sujeto, donde la administración de la composición farmacéutica implica poner en contacto el tumor con la composición.

En el caso de que el polinucleótido que codifica IL12 sea un mRNA, tras el contacto de una célula en el tumor con la composición farmacéutica, un mRNA traducible se puede traducir en la célula para producir un polipéptido de interés. Sin embargo, los mRNA que son sustancialmente no traducibles también se pueden suministrar a los tumores. Los mRNA substancialmente no traducibles pueden ser útiles como vacunas y/o pueden secuestrar componentes de traducción de una célula para reducir la expresión de otra especie en la célula.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden incrementar el suministro específico. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “suministro específico” significa el suministro de más (p. ej., al menos 1.5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o los polipéptidos tanto de IL12B como IL12A mediante la composición farmacéutica descrita en el presente documento (p. ej., en forma de nanopartícula) a un tejido objetivo de interés (p. ej., un tumor) comparado con un tejido fuera del objetivo (p. ej., hígado de mamífero).

El nivel de suministro de una nanopartícula a un tejido particular se puede medir, por ejemplo, comparando

(i) la cantidad de proteína expresada a partir de un polinucleótido que codifica IL12 en un tejido con el peso del tejido;

(ii) comparando la cantidad del polinucleótido en un tejido con el peso del tejido; o

(iii) comparando la cantidad de proteína expresada a partir de un polinucleótido que codifica IL12 en un tejido con la cantidad de proteína total en el tejido.

El suministro específico a un tumor o una clase particular de células en el tumor implica que se suministra una proporción más alta de composición farmacéutica que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como de IL12A al destino objetivo (p. ej., tejido objetivo) con respecto a otros destinos fuera del objetivo tras la administración de una composición farmacéutica a un sujeto.

La presente descripción también proporciona métodos para suministrar por vía intratumoral un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A cuando se administra una composición farmacéutica que comprende los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., en forma de nanopartículas) a un tumor. La administración intratumoral puede mostrar una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) retención mayor del polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A en el tumor;

(ii) niveles mayores de polipéptido expresado en el tumor comparado con los niveles de polipéptido expresado en el tejido peritumoral;

(iii) fuga menor del polinucleótido o producto expresado al tejido fuera del objetivo (p. ej., tejido peritumoral o a ubicaciones distantes, p. ej., tejido del hígado); y,

(iv) cualquier combinación de las mismas,

en donde el incremento o disminución observado para una cierta propiedad es en relación con una composición de referencia correspondiente (p. ej., composición en la cual los compuestos de fórmula (I) no están presentes o se han sustituido por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3).

En algunos casos, otra propiedad en el suministro producida como un resultado de utilizar las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento es una reducción en la respuesta inmunitaria con respecto a la respuesta inmunitaria observada cuando se utilizan otros componentes de lípidos para suministrar el mismo agente terapéutico o polinucleótido que codifica un agente terapéutico.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona un método para incrementar la retención de un agente terapéutico (p. ej., un polinucleótido o un polipéptido administrado como parte de la composición farmacéutica o un polipéptido expresado como resultado de la administración) en un tejido de tumor en un sujeto, que comprende administrar por vía intratumoral al tejido de tumor una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la retención del agente terapéutico en el tejido de tumor se incrementa comparado con la retención del agente terapéutico en el tejido de tumor después de administrar una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

También se proporciona un método para incrementar la retención de un polinucleótido en un tejido de tumor en un sujeto, que comprende administrar por vía intratumoral al tejido de tumor una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la retención del polinucleótido en el tejido de tumor se incrementa comparado con la retención del polinucleótido en el tejido de tumor después de administrar una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

También se proporciona un método para incrementar la retención de un polipéptido expresado en un tejido de tumor en un sujeto, que comprende administrar al tejido de tumor una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido expresado, y en donde la retención del polipéptido expresado en el tejido de tumor se incrementa comparado con la retención del polipéptido en el tejido de tumor después de administrar una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

La presente descripción también proporciona un método para disminuir la pérdida de expresión de un polinucleótido administrado por vía intratumoral a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar el polinucleótido por vía intratumoral al tejido de tumor como una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde el nivel de expresión del polipéptido en el tejido no tumoral disminuye comparado con el nivel de expresión del polipéptido en el tejido no tumoral después de la administración de una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

También se proporciona un método para disminuir la pérdida de expresión de un agente terapéutico (p. ej., un polipéptido administrado como parte de la composición farmacéutica) administrado por vía intratumoral a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar el agente terapéutico por vía intratumoral al tejido de tumor como una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la cantidad de agente terapéutico en el tejido no tumoral disminuye comparado con la cantidad de agente terapéutico en el tejido no tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

También se proporciona un método para disminuir la pérdida de expresión de un polipéptido expresado en un tumor en un sujeto, que comprende administrar al tejido de tumor una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido expresado, y en donde la cantidad de polipéptido expresado en el tejido no tumoral disminuye comparado con la cantidad del polipéptido expresado en el tejido no tumoral después de administrar una composición de referencia correspondiente (p. ej., MC3).

En algunos casos, el tejido no tumoral es tejido peritumoral. En otros casos, el tejido no tumoral es tejido del hígado.

La presente descripción también proporciona un método para reducir o prevenir la respuesta inmunitaria causada por la administración intratumoral de una composición farmacéutica, p. ej., una composición farmacéutica que comprende lípidos conocidos en la técnica, al reemplazar uno o todos los lípidos en tal composición con un compuesto de Fórmula (I). Por ejemplo, la respuesta inmunitaria causada por la administración de un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A en una composición farmacéutica que comprende MC3 (u otros lípidos conocidos en la técnica) se puede prevenir (evitar) o mejorar al reemplazar MC3 con un compuesto de Fórmula (I), p. ej., el Compuesto 18.

En algunos casos, la respuesta inmunitaria observada después de administrar un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A en una composición farmacéutica descrita en el presente documento no se eleva comparada con la respuesta inmunitaria observada cuando el agente terapéutico o un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A se administra en solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otra solución tampón fisiológica (p. ej., solución de Ringer, solución de Tyrode, solución salina equilibrada de Hank, etc.).

En algunos casos, la respuesta inmunitaria observada después de administrar un agente terapéutico o un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como de IL12A en una composición farmacéutica descrita en el presente documento no se eleva comparada con la respuesta inmunitaria observada cuando se administra PBS u otra solución tampón fisiológica sola.

En algunos casos, no se observa respuesta inmunitaria cuando una composición farmacéutica descrita en el presente documento se administra por vía intratumoral a un sujeto.

Por consiguiente, la presente descripción también proporciona un método para suministrar un agente terapéutico o un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar por vía intratumoral al sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento, en donde la respuesta inmunitaria producida por la administración de la composición farmacéutica no se eleva comparada con la respuesta inmunitaria producida por la administración intratumoral de

(i) PBS sola, u otra solución tampón fisiológica (p. ej., solución de Ringer, solución de Tyrode, solución salina equilibrada de Hank, etc.);

(ii) el agente terapéutico o polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como de IL12A en PBS u otra solución tampón fisiológica; o

(iii) una composición de referencia correspondiente, es decir, la misma composición farmacéutica en la cual el compuesto de Fórmula (I) se sustituye por otro aminolípido ionizable, p. ej., MC3.

En ciertos casos, la administración trata un cáncer.

El polinucleótido (p. ej., mRNA) de la presente descripción se puede administrar por cualquier vía disponible, que incluye, pero no limitada a la administración intratumoral, enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica (en la propia piel), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraperitoneal (en el peritoneo), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardiaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (a través del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extra-amniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (aspiración), sublingual, sublabial, enema, colirios (en la conjuntiva) o en gotas para oídos. En otros casos, el mRNA de la presente descripción se administra por vía parenteral (p. ej., incluye inyección subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión), vía intraventricular, oral, por aerosol de inhalación, vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por la vía de un depósito implantado. En casos particulares, el polinucleótido, composición o polipéptido se administran por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, por vía intratumoral, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intradérmica, intralesional, intracraneal, intraventricular, oral, por aerosol de inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por la vía de un depósito implantado. En un caso particular, el polinucleótido (p. ej., mRNA) de la presente descripción se administra por vía intratumoral.

En algunos casos, el polinucleótido se suministra mediante un dispositivo que comprende una bomba, parche, depósito de fármaco, dispositivo de aguja corta, dispositivo de una sola aguja, dispositivo de múltiples agujas, dispositivo de microaguja, dispositivo de inyección por chorro, dispositivo de suministro de polvo/partícula balística, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía RF, corriente eléctrica o cualquier combinación de los mismos.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren al trasplante de células que contienen polinucleótidos a un sujeto mamífero. La administración de células a sujetos mamíferos es conocida para los expertos en la técnica, e incluye, pero no se limita a, implantación local (p. ej., administración tópica o subcutánea), suministro a órgano o inyección sistémica (p. ej., inyección intravenosa o inhalación) y la formulación de células en vehículos farmacéuticamente aceptables.

En algunos casos, el polinucleótido, p. ej., mRNA, se administra en una cantidad entre aproximadamente 0.10 |ig/kg y aproximadamente 1000 mg/kg.

En algunos casos, la administración del polinucleótido, composición o formulación farmacéutica de la descripción da como resultado la expresión de IL12 en células del sujeto. En algunos casos, la administración del polinucleótido, composición o formulación farmacéutica de la descripción da como resultado un incremento de actividad de IL12 en el sujeto. Por ejemplo, en algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción se utilizan en métodos para administrar una composición o formulación que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y polipéptidos tanto de IL12B como IL12A a un sujeto, en donde el método da como resultado un incremento en la actividad de IL12 en al menos algunas células de un sujeto.

En algunos casos, la administración de una composición o formulación que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y polipéptidos tanto de IL12B como IL12A a un sujeto da como resultado un incremento de actividad de IL12 en las células del sujeto a un nivel de al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o hasta 100% o más del nivel de actividad esperado en un sujeto normal.

Otros casos de la descripción también proporcionan un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesite que comprende administrar (p. ej., por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) un polinucleótido que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y polipéptidos tanto de IL12B como IL12A con uno o más agentes anticancerosos al sujeto.

En algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., mRNA) que codifican un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y polipéptidos tanto de IL12B como IL12A de la presente descripción se pueden utilizar para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de tumor en un sujeto que lo necesite.

En algunos casos, el tumor se asocia con una enfermedad, trastorno y/o afección. En un caso particular, la enfermedad, trastorno y/o afección es un cáncer. De esta manera, en un aspecto, la administración del polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y polipéptidos tanto de IL12B como IL12A trata un cáncer.

Un “cáncer” se refiere a un grupo amplio de varias enfermedades caracterizadas por el crecimiento no controlado de células anormales en el cuerpo. La división celular no regulada y el crecimiento dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden tejidos próximos y también pueden metastatizar a partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o corriente sanguínea. Un “cáncer” o “tejido de cáncer” puede incluir un tumor en varias etapas. En ciertos casos, el cáncer o tumor está en la etapa 0, tal que, p. ej., el cáncer o tumor está muy temprano en el desarrollo y no ha metastatizado. En algunos casos, el cáncer o el tumor está en la etapa I, tal que, p. ej., el cáncer o tumor es relativamente pequeño en tamaño, no se ha dispersado en el tejido próximo, y no ha metastatizado. En otros casos, el cáncer o tumor está en la etapa II o etapa III, tal que, p. ej., el cáncer o tumor es más grande que en la etapa 0 o etapa I, y ha crecido en los tejidos próximos pero no ha metastatizado, excepto potencialmente a los ganglios linfáticos. En otros casos, el cáncer o tumor está en la etapa IV, tal que, p. ej., el cáncer o tumor ha metastatizado. La etapa IV también se puede denominar cáncer avanzado o metastático.

En algunos aspectos, el cáncer puede incluir, pero no está limitado a cáncer corticosuprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, metástasis ósea, tumores del cerebro, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y de seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando de adulto, cáncer de piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer, y cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el tumor es un tumor sólido. Un “tumor sólido” incluye, pero no está limitado a, sarcoma, melanoma, carcinoma u otro cáncer de tumor sólido. “Sarcoma” se refiere a un tumor que está compuesto por una sustancia similar al tejido conectivo embrionario y está compuesto generalmente de células estrechamente empaquetadas insertadas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero no están limitados a, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma de parte blanda alveolar, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma de cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma de endometrio, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de célula de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma de mesenquimoma maligno, sarcoma parostal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocístico, sarcoma sinovial o sarcoma telangiectásico.

El término “melanoma” se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma acra-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma metastásico, melanoma nodular, melanoma subungueal o melanoma de dispersión superficial.

El término “carcinoma” se refiere a un nuevo crecimiento maligno constituido de células epiteliales que tienden a infiltrar en los tejidos circundantes y dan origen a metástasis. Los carcinomas de ejemplo incluyen, p. ej., carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma cístico adenoide, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, carcinoma de comedo, carcinoma de cuerpo, carcinoma cribriforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de conducto, carcinoma durum, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoides, carcinoma exofístico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma bulbar, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidernoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodo, carcinoma nasafaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células de prickle, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma Schneideriano, carcinoma escirroso, carcinoma de escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidales, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cadena, carcinoma telangiectaticum, carcinoma telangiectodes, carcinoma de células de transición, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso o carcinoma viflosum.

Los cánceres adicionales que se pueden tratar incluyen, p. ej., leucemia, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón microcíticos, tumores de cerebro primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones de piel premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides papilar, neuroblastoma, cáncer neuroendocrino, cáncer esofágico, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer corticosuprarrenal, cáncer de próstata, cáncer de Müllerian, cáncer ovárico, cáncer peritoneal, cáncer de trompa de Falopio o carcinoma seroso papilar uterino.

2. Terapia de Combinación

La descripción además incluye un polinucleótido que comprende un ORF (p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A o usos de los mismos como una terapia de combinación, es decir, con cualquier otro agente anticanceroso en combinación. En ciertos casos, el polinucleótido codifica un polipéptido de ⁱL-12, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A o usos del mismo como una terapia de combinación, es decir, con cualquier otro agente anticanceroso en combinación.

En ciertos casos, la descripción se dirige a un polinucleótido que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A en combinación con uno o más agentes anticanceroso o usos del polinucleótido en combinación con uno o más agentes anticancerosos para el sujeto. En un caso, la terapia de combinación puede ser una combinación del polinucleótido que codifica IL12 y una o más terapias convencionales. En otro caso, los métodos de la descripción incluyen dos agentes anticancerosos adicionales, tres agentes adicionales, cuatro agentes adicionales, etc. Los agentes anticancerosos adicionales pueden ser una proteína, p. ej., un anticuerpo, o un polinucleótido, p. ej., mRNA. En algunos casos, el uno o más agentes anticancerosos son un mRNA. En ciertos casos, el uno o más agentes anticancerosos son un mRNA que codifica un antígeno de tumor. En otros casos, el uno o más agentes anticancerosos no son un antígeno de tumor o un mRNA que codifica un antígeno de tumor. En otros casos, el uno o más agentes anticancerosos son una proteína, p. ej., un anticuerpo.

En algunos casos, el uno o más agentes anticancerosos son un agente aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE. UU. En otros casos, el uno o más agentes anticancerosos son un agente pre aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE. UU.

Un experto en la técnica también apreciaría que aspectos alternativos de la presente descripción incluyen una terapia de combinación de IL12 y cualquiera de otros agentes, p. ej., un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un anticuerpo anti-CTLA-4 u OX40L como polinucleótidos y/o proteínas. Por ejemplo, la presente descripción abarca la terapia de combinación de (i) un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 y una proteína que comprende un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1; (iii) un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 y una segunda proteína que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 o (iv) un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica IL12 y una segunda proteína que comprende OX40L. En otros casos, la IL12 también se puede administrar como una proteína.

En otros casos, los agentes adicionales se pueden formular junto con el polinucleótido que codifica IL12, p. ej., mRNA, o por separado. Por otra parte, incluso cuando se formulan por separado, los agentes adicionales se pueden administrar simultáneamente con el polinucleótido que codifica IL12 o secuencialmente. En un caso, el polinucleótido que codifica IL12 se administra antes del segundo agente. En otro caso, el polinucleótido que codifica IL12 se administra después del segundo agente.

En ciertos casos, los agentes adicionales, p. ej., cualquier anticuerpo descrito en el presente documento o un polinucleótido que codifica OX40L, también se administran por vía intratumoral. En otros casos, los segundos agentes, p. ej., cualquier anticuerpo descrito en el presente documento o un polinucleótido que codifica OX40L, se administran por diferentes vías, p. ej., intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, etc.

En algunos aspectos, el sujeto para los presentes métodos o composiciones se ha tratado con uno o más tratamientos de referencia. En otros aspectos, el sujeto para los presentes métodos o composiciones no ha respondido a uno o más tratamientos de referencia o tratamientos anticancerosos. En un aspecto, el sujeto se ha tratado previamente con una proteína IL12 o una terapia génica de DNA de IL12. En otro aspecto, el sujeto se trata con un antagonista anti-PD-1 o un antagonista anti-CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 antes del polinucleótido de la presente descripción y/o un anticuerpo monoclonal que se une a CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con una terapia de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y/o anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 antes del polinucleótido de los presentes métodos o composiciones.

En años recientes, la introducción de inhibidores de punto de control inmunitario para propósitos terapéuticos ha revolucionado el tratamiento del cáncer. Son de interés las terapias que presentan combinaciones de inhibidores de punto de control con otras moléculas coestimuladoras o inhibidoras.

La regulación de células T, es decir, activación o inhibición es mediada por señales coestimuladoras o coinhibidoras. Esta interacción se ejerce mediante la interacción de ligando/receptor. Las células T albergan un gran número tanto de receptores de activación, tales como OX40, como receptores inhibidores (es decir, puntos de control inmunitarios) tales como el receptor de muerte programada 1 (PD-1) o la proteína asociada a linfocito T citotóxico 4 (CT^lA-4) (Mellman et al. 2011 Nature.; 480:480-489). La activación de estos puntos de control inmunitarios da como resultado la desactivación de células T y el que las células tumorales se apoderen de estas rutas contribuye a su escape inmunitario exitoso.

En algunos casos, los métodos para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de iL-12. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un marco de lectura abierta (“ORF”) que codifica un polipéptido de IL12B. En algunos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de IL12A. En ciertos casos, el uno o más polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A.

En algunos casos, los métodos además comprenden administrar un segundo agente. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control. En algunos casos, el inhibidor de punto de control es cualquier inhibidor de punto de control conocido en la técnica o descrito en el presente documento. En algunos casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-1. En otros casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-PD-L1. En otros casos, el inhibidor de punto de control es un anticuerpo anti-CTLA-4. En algunos casos, el segundo agente comprende una cantidad efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que comprende un ORF que codifica OX40L. En algunos casos, el inhibidor de punto de control se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-CTLA-4, un polinucleótido que codifica OX40L y cualquiera de otros agentes descritos en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, la composición que comprende un inhibidor de punto de control comprende más de un inhibidor de punto de control. En un caso particular, el método comprende administrar (i) un mRNA, que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A descrito en el presente documento y (ii) un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CTLA-4, un polinucleótido que codifica OX40L, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, el inhibidor de punto de control comprende un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CTLA-4 o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a c TlA-4, un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, o una combinación de los mismos. En un caso, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CTLA4 o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA4. En otro caso, el anticuerpo es un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En otro caso, el anticuerpo es un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

Los inhibidores de punto de control inmunitarios tales como pembrolizumab o nivolumab, que se dirigen a la interacción entre el receptor de muerte programada 1 /ligando de muerte programada 1 (PD-1/PDL-1) y PDL-2, se han aprobado recientemente para el tratamiento de varios tumores malignos y actualmente están siendo investigados en ensayos clínicos para cánceres que incluyen melanoma, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). Los datos disponibles de estos ensayos indican actividad sustancial acompañada por un perfil de seguridad y toxicidad favorable en estas poblaciones de pacientes.

Por ejemplo, los inhibidores de punto de control se han probado en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma. En particular, los ensayos clínicos de fase III han puesto de manifiesto que las terapias tales como ipilimumab y pembrolizumab, que se dirigen a los puntos de control inmunitarios CTLA-4 y PD-1, respectivamente, han elevado la supervivencia a tres años de pacientes con melanoma a ~70% y la supervivencia total (>5 años) a ~30%.

Del mismo modo, los inhibidores de punto de control se han probado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. En estudios preclínicos, se ha mostrado que 45-80% de tumores HNSCC expresan el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) (Zandberg et al. (2014) Oral Oncol. 50:627-632). Actualmente hay docenas de ensayos clínicos que evalúan la eficacia y seguridad de los inhibidores de punto de control inmunitario como monoterapia o en regímenes de combinación en HNSCC. Por ejemplo, los ensayos clínicos con inhibidores de PD 1, PD-L1 y CTLA-4 se están probando en HNSCC. Los datos de que el anticuerpo contra PD-1 pembrolizumab podría ser efectivo en pacientes con HNSCC metastásicos/recurrentes (R/M) se generaron en el ensayo de fase I/II Keynote-012 de fase 1b (Cheng. ASCO 2015, presentación oral). Más recientemente, se presentaron los datos del ensayo clínico de fase III CheckMate-141 aleatorizado (Gillison. AACR 2016, presentación oral). Este estudio investigó la eficacia del anticuerpo monoclonal contra PD-1 nivolumab dado cada 2 semanas en pacientes con HNSCC R/M refractarios al platino. El estudio se detuvo tempranamente debido a la superioridad del brazo de nivolumab del estudio.

En un aspecto, el sujeto se ha tratado previamente con un antagonista de PD-1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con una terapia de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 antes del polinucleótido de los presentes métodos o composiciones. En otros aspectos, la terapia de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 comprende nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal que se une a PD-L1 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con una terapia de anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 antes del polinucleótido de los presentes métodos o composiciones. En otros aspectos, la terapia de anticuerpo monoclonal anti-PD-LI comprende durvalumab, avelumab, MEDI473, BMS-936559, aezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos, el sujeto se ha tratado con un antagonista de CTLA-4 antes del tratamiento con las composiciones de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado previamente con un anticuerpo monoclonal que se une a CTLA-4 antes de las composiciones de la presente descripción. En otro aspecto, el sujeto se ha tratado con un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 antes del polinucleótido de la presente descripción. En otros aspectos, la terapia de anticuerpo anti-CTLA-4 comprende ipilimumab o tremelimumab.

En algunos aspectos, la descripción se dirige a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto (p. ej., por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el polinucleótido (p. ej., RNA, p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 en combinación con un antagonista de PD-L1, p. ej., un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-LI, p. ej., un anticuerpo monoclonal antip D-LI comprende Durvalumab, Avelumab, MEDI473, BMS-936559, Atezolizumab, o cualquier combinación de los mismos.

En ciertos casos, el anticuerpo anti-PD-LI útil para la descripción es MSB0010718C (también llamado Avelumab; Véase el documento US 2014/0341917) o BMS-936559 (anteriormente 12A4 o MDX-1105) (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 7,943,743; WO 2013/173223). En otros casos, el anticuerpo anti-PD-LI es atezolizumab (también conocido como TECENTRIQ®). En otros casos, el anticuerpo anti-PD-LI es MPDL3280A (también conocido como atezolizumab, TECENTRIQ® y RG7446) (véase, p. ej., Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(supl.):3000. Abstract; Patente de EE. UU. N° 8,217,149), MEDI4736 (también llamado Durvalumab; Khleif (2013) En: Proceedings from the European Cancer Congress 2013; 27 de Septiembre-1 de Octubre de 2013; Ámsterdam, Países Bajos.

En algunos aspectos, la descripción se dirige a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto (p. ej., por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el polinucleótido (p. ej., RNA, p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12, en combinación con un antagonista de PD-1, p. ej., un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1.

En un caso, el anticuerpo anti-PD-1 (o una porción de unión al antígeno del mismo) útil para la descripción es pembrolizumab. El pembrolizumab (también conocido como “KEYTRUDA®”, lambrolizumab y MK-3475) es un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado dirigido contra el receptor de superficie celular humano PD-1 (muerte programada-1 o muerte celular programada-1). El pembrolizumab se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 8,900,587; véase también http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789 (último acceso: 14 de diciembre de 2014). El pembrolizumab se ha aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma de recaída o refractario y NSCLC avanzado.

En otro caso, el anticuerpo anti-PD-1 útil para la descripción es nivolumab. Nivolumab (también conocido como “OPDIVO®”; anteriormente designado 5C4, BMS-936558, MDX-1106 o ONO-4538) es un anticuerpo inhibidor de punto de control inmunitario para PD-1 de IgG4 completamente humana (S228P) que selectivamente previene la interacción con ligandos de PD-1 (PD-L1 y PD-L2), para de esta manera bloquear la regulación por disminución de las funciones de células T antitumorales (Patente de EE. UU. N° 8,008,449; Wang et al., 2014 Cancer Immunol Res. 2(9):846-56). Nivolumab ha mostrado actividad en una variedad de tumores sólidos avanzados que incluyen carcinoma de células renales (adenocarcinoma renal o hipernefroma), melanoma y cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (Topalian et al., 2012a; Topalian et al., 2014; Drake et al., 2013; w O 2013/173223.

En otros casos, el anticuerpo anti-PD-1 es MEDI0680 (anteriormente AMP-514) que es un anticuerpo monoclonal contra el receptor PD-1. MEDI0680 se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 8,609,089B2 o en http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047 (último acceso el 14 de diciembre de 2014) .

En ciertos casos, el anticuerpo anti-PD-1 es BGB-A317, que es un anticuerpo monoclonal humanizado. BGB-A317 se describe en la Publicación de EE. UU. N° 2015/0079109.

En ciertos casos, un antagonista de PD-1 es AMP-224, que es una proteína de fusión Fc B7-DC. AMP-224 se discute en la Publicación de EE. UU. N° 2013/0017199 o en http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=700595 (último acceso el 8 de Julio de 2015) .

En otros casos, la descripción incluye un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto (p. ej., por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el polinucleótido (p. ej., RNA, p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 junto con un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 comprende Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab o cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos, la descripción se dirige a un método para tratar el cáncer y/o un método de inmunoterapia en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto (p. ej., por vía intratumoral, intraperitoneal o intravenosa) el polinucleótido (p. ej., RNA, p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 en combinación con un antagonista de CTLA-4, p. ej., un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 comprende Ipilimumab o Tremelimumab, o cualquier combinación de los mismos.

Un anticuerpo anti-CTLA-4 clínico ejemplar es el mAb 10D1 humano (ahora conocido como ipilimumab y comercializado como YERVOY®) como se describe en la patente de EE. UU. N° 6,984,720. Otro anticuerpo anti-CTLA-4 útil por los presentes métodos es tremelimumab (también conocido como CP-675,206). El tremelimumab es el anticuerpo anti-CTLA-4 monoclonal IgG2 humano. Tremelimumab se describe en el documento WO/2012/122444, Publicación de EE. UU. N° 2012/263677 o Publicación WO N° 2007/113648 A2.

En un caso, un primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica IL12 y un segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L se administran en combinación. En otro caso, el primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica IL12 y el segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor PD-1, o un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor de PD-L1.

En un caso, un primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 y un segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor PD-1 o de PD-L1 o un polinucleótido que codifica el mismo.

En otro caso, un primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 y un segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un CTLA-4 o un polinucleótido que codifica el mismo.

En otro caso más, un primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 y un segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L se administran en combinación con un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor PD-1 o de PD-L1 y un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4 (o polinucleótidos del mismo).

En algunos casos, las composiciones descritas en el presente documento comprenden (i) un primer polinucleótido (p. ej., un primer mRNA) que codifica IL12 y (ii) un segundo polinucleótido (p. ej., un segundo mRNA) que codifica un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4 en una sola formulación.

En algunos casos, las composiciones descritas en el presente documento comprenden un polinucleótido que codifica IL12 y un polinucleótido que codifica una proteína OX40L en una sola formulación.

El OX40L humano se identificó primero en la superficie de linfocitos humanos infectados con el virus de leucemia de células T humanas tipo I (HTLV-I) por Tanaka et al., International Journal of Cáncer (1985), 36(5):549-55). OX40L es el ligando para OX40 (CD134). OX40L también se ha designado CD252 (cúmulo de diferenciación 252), superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), miembro 4, glicoproteína activada transcripcionalmente por tax 1, TXGP1 o gp34. OX40L humano es de 183 aminoácidos de longitud y contiene tres dominios: un dominio citoplásmico de los aminoácidos 1 - 23; un dominio transmembrana de los aminoácidos 24 - 50 y un dominio extracelular de los aminoácidos 51 - 183.

En algunos casos, un polinucleótido que codifica OX40L que se puede combinar con el polinucleótido que codifica IL12 comprende un mRNA que codifica un polipéptido de OX40L de mamífero. En algunos casos, el polipéptido de OX40L de mamífero es un polipéptido de OX40L murino. En algunos casos, el polipéptido de OX40L de mamífero es un polipéptido de OX40L humano. En algunos casos, el polipéptido de OX40L comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 1.

En algunos casos, cada polinucleótido de la descripción comprende un mRNA, es decir, un mRNA que codifica un polipéptido de IL12 y un mRNA que codifica un polipéptido de OX40L. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de IL12 codifica un polipéptido de IL12 de mamífero. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de OX40L codifica un polipéptido de OX40L de mamífero. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de IL12 codifica un polipéptido de IL12 murino. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de OX40L codifica un polipéptido de OX40L murino. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de IL12 codifica un polipéptido de IL12 humano. En algunos casos, el mRNA que codifica un polipéptido de OX40L codifica un polipéptido de OX40L humano.

En algunos casos, el polipéptido de IL12 comprende una secuencia de aminoácidos humana expuesta en la Tabla 4. En otros casos, el polipéptido de OX40L comprende una secuencia de aminoácidos humana expuesta en la Tabla 1.

En algunos casos, el polipéptido de OX40L comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos listada en la Tabla 1 o una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos listada en la Tabla 1, en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de unirse a un receptor OX40.

En algunos casos, el polipéptido de OX40L codificado por un polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos listada en la Tabla b1 con una o más sustituciones conservadoras, en donde las sustituciones conservadoras no afectan significativamente a la actividad de unión del polipéptido de OX40L a su receptor, es decir, el polipéptido de OX40L se une al receptor OX40 después de las sustituciones.

En otros casos, una secuencia de nucleótidos (es decir, mRNA) que codifica un polipéptido de OX40L comprende una secuencia al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100% idéntica a una secuencia de ácido nucleico listada en la Tabla 1. Un experto en la técnica sabría que si una secuencia está escrita en forma de DNA (que contiene timidina) en la presente solicitud, la secuencia de RNA correspondiente contendría uridina en lugar de timidina.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) útil para los métodos y composiciones comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L. En otros casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio citoplásmico de OX40L. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio transmembrana de OX40L. En ciertos casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y uno transmembrana de OX40L. En otros casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L y un dominio citoplásmico de OX40L. En todavía otros casos, el polinucleótido (p. ej., mRNA) comprende un marco de lectura abierto que codifica un dominio extracelular de OX40L, uno transmembrana de OX40L y un dominio citoplásmico de OX40L.

La Tabla 1 presenta, p. ej., secuencias precursoras y maduras para OX40L, así como construcciones que comprenden las secuencias de OX40L. Además, una construcción que comprende un polinucleótido que codifica OX40L y que además comprende componentes tales como 3' UTR y 5' UTR se consideraría un polinucleótido que codifica OX40L. Un experto en la técnica entendería que además de las secuencias señal nativas y secuencias de propéptido descritas en la Tabla 1 (secuencias presentes en el precursor y ausentes en la forma correspondiente madura) y el péptido señal no nativo descrito en la Tabla 1, se pueden utilizar otras secuencias señal. Por consiguiente, las referencias a un polipéptido o polinucleótido de OX40L de acuerdo con la Tabla 1 abarca variantes en las cuales un péptido señal alternativo (o secuencia de codificación) conocida en la técnica se ha unido al polipéptido de OX40L (o polinucleótido). También se entiende que las referencias a las secuencias descritas en la Tabla 1 por toda la solicitud son igualmente aplicables y abarcan variantes ortólogas y funcionales (por ejemplo variantes polimórficas) e isoformas de esas secuencias conocidas en la técnica en el momento en que se presentó la solicitud.

Tabla 1: Secuencias de Poli é tido Polinucleótido de OX40L

3. Interleucina-12 (IL12)

La IL12 (también mostrada como IL-12) es una citocina pleiotrópica, cuyas acciones crean una interconexión entre la inmunidad innata y adaptativa. La IL12 funciona principalmente como una proteína heterodímera de 70 kDa que consiste en dos subunidades p35 y p40 unidas por disulfuro. La forma precursora de la subunidad p40 de IL12 (NM_002187; P29460; también denominada IL12B, factor estimulador de células citolíticas naturales 2, factor de maduración de linfocitos citotóxicos 2) es de 328 aminoácidos en longitud, mientras que su forma madura es de 306 aminoácidos de largo. La forma precursora de la subunidad p35 de IL12 (N^m_000882; P29459; también denominada IL12A, factor estimulador de células citolíticas naturales 1, factor de maduración de linfocitos citotóxicos 1) es de 219 aminoácidos en longitud y la forma madura es de 197 aminoácidos de largo. Ib. Los genes para las subunidades p35 y p40 de IL12 residen en diferentes cromosomas y están regulados independientemente entre sí. Gately, MK et al., Annu Rev Immunol. 16: 495-521 (1998). Muchas células inmunitarias diferentes (p. ej., células dendríticas, macrófagos, monocitos, neutrófilos y células B) producen IL12 tras estímulos antigénicos. El heterodímero IL12 activo se forma después de la síntesis de la proteína. Ib.

La IL12 está compuesta de un haz de cuatro hélices alfa. Es una citocina heterodímera codificada por dos genes separados, IL12A (p35) e IL12B (p40). El heterodímero activo (denominado “p70”) y un homodímero de p40 se forman después de la síntesis de la proteína.

Por lo tanto, en algunos casos, el polipéptido de IL12 de la presente descripción comprende una sola cadena de polipéptido que comprende la IL12B e IL12A fusionadas directamente o por un enlazador. En algunos casos, el polipéptido de IL12 de la presente descripción comprende dos polipéptidos, el primer polipéptido que comprende IL12B y el segundo polipéptido que comprende IL12A. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un polipéptido de IL12A y un polipéptido de IL12B, en donde los polipéptidos de IL12A e IL12B están en la misma cadena o diferentes cadenas. En algunos casos, el polipéptido de IL12A o IL12B de la descripción es una variante, un péptido o un polipéptido que contiene una sustitución, e inserción y/o una adición, una eliminación y/o una modificación covalente con respecto a la secuencia de IL12A o IL12B de tipo natural. En algunos casos, se pueden añadir marcadores de secuencia (tales como marcadores de epítopo, p. ej., un marcador V5) o aminoácidos, a las secuencias codificadas por los polinucleótidos de la descripción (p. ej., en los extremos N-terminal o C-terminal), p. ej., para localización. En algunos casos, restos de aminoácidos ubicados en el carboxi, amino terminal o regiones internas de un polipéptido de la descripción opcionalmente se pueden eliminar para proporcionar fragmentos.

En algunos casos, el polipéptido de IL12A y/o IL12B codificado por un polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una variante de sustitución de una secuencia de IL12A y/o IL12B, que puede comprender una, dos, tres o más de tres sustituciones. En algunos casos, la variante de sustitución puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otros casos, la variante es una variante de inserción. En otros casos, la variante es una variante de eliminación.

En otros casos, el polipéptido de IL12A y/o IL12B codificado por el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende un enlazador que fusiona los polipéptidos de IL12A e IL12B. Ejemplos no limitantes de enlazadores se describen en otra parte en el presente documento.

Algunos aspectos de la presente descripción se dirigen a una nanopartícula de lípido que comprende un polinucleótido (p. ej., mRNA) que codifica un polipéptido de IL12 humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B humano operativamente unido a un polipéptido de IL12A humano. En algunos casos, el polipéptido de IL12B está operativamente unido al polipéptido de IL12A por un enlazador peptídico. En algunos casos, el polipéptido de IL12B se encuentra en el extremo 5' del polipéptido de IL12A o el enlazador peptídico. En otros casos, el polipéptido de IL12A se encuentra en el extremo 5' del polipéptido de IL12B o el enlazador peptídico.

Como reconocen los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína IL12, dominios de proteína funcionales, variantes y proteínas homólogas (ortólogas) también se considera que están dentro del alcance de los polipéptidos de IL12 de la descripción. Ejemplos no limitantes de polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la descripción se muestran en las FIGs . 1 a 2. Por ejemplo, la Tabla 2 muestra la correlación de la numeración de aminoácidos en las SEQ ID NO, la numeración de nucleótidos en las SEQ ID NO, y la 5' UTR, el péptido señal de IL12B, los péptidos de IL12A e IL12B maduros y el enlazador.

Tabla 2. Dominios de IL12

4. Polinucleótidos y marcos de lectura abiertos (ORF)

En ciertos aspectos, la descripción proporciona polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que comprenden una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF, p. ej., mRNA) que codifica uno o más polipéptidos de iL12. En ciertos casos, los polinucleótidos codifican un polipéptido de IL-12, en donde los polinucleótidos comprenden un solo ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción codifica una sola cadena de polipéptido de IL12 que comprende un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A, que se fusionan directamente o por un enlazador, en donde el polipéptido de IL12B se selecciona del grupo que consiste en:

(i) el polipéptido de IL12B de longitud completa (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que IL12B de tipo natural);

(ii) un fragmento funcional del polipéptido de IL12B de longitud completa (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., eliminación de carboxi, amino terminal o regiones internas) más corta que una IL12B de tipo natural; pero que todavía retiene la actividad enzimática de IL12B);

(iii) una variante de la misma (p. ej., proteínas de IL12B de longitud completa o truncadas en las cuales uno o más aminoácidos se han reemplazado, p. ej., variantes que retienen toda o la mayoría de la actividad de IL12B del polipéptido con respecto al polipéptido de IL12B de tipo natural (tal como, p. ej., V33I, V298F, o cualquiera de otras variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica); y

(iv) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12B de longitud completa de tipo natural, un fragmento funcional o una variante de la misma y (ii) una proteína heteróloga; y/o

en donde el polipéptido de IL12A se selecciona del grupo que consiste en:

(v) el polipéptido de IL12A de longitud completa (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que IL12A de tipo natural);

(vi) un fragmento funcional del polipéptido de IL12A de longitud completa (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., eliminación de carboxi, amino terminal o regiones internas) más corta que una IL12A de tipo natural; pero que todavía retiene la actividad enzimática de IL12A);

(vii) una variante de la misma (p. ej., proteínas de IL12A de longitud completa o truncadas en las cuales uno o más aminoácidos se han reemplazado, p. ej., variantes que retienen toda o la mayoría de la actividad de IL12A del polipéptido con respecto al polipéptido de wtIL12A (tales como variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica) y

(viii) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12A de longitud completa de tipo natural, un fragmento funcional o variante de la misma y (ii) una proteína heteróloga.

En otros casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción codifica dos cadenas de polipéptido, la primera cadena que comprende un polipéptido de IL12B y la segunda cadena que comprende un polipéptido de IL12A, en donde el polipéptido de IL12B se selecciona del grupo que consiste en:

(i) el polipéptido de IL12B maduro (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que IL12B de tipo natural) con o sin un péptido señal;

(ii) un fragmento funcional de cualquiera de los polipéptidos de IL12B maduros (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., eliminación de carboxi, amino terminal o regiones internas) más corta que una IL12B de tipo natural; pero que todavía retiene la actividad enzimática de IL12B);

(iii) una variante de la misma (p. ej., proteínas de IL12B de longitud completa, maduras o truncadas en las cuales uno o más aminoácidos se han reemplazado, p. ej., variantes que retienen toda o la mayoría de la actividad de IL12B del polipéptido con respecto al polipéptido de IL12B de tipo natural (tal como, p. ej., V33I, V298F, o cualquiera de otras variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica); y

(iv) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12B madura de tipo natural, un fragmento funcional o una variante de la misma, con o sin un péptido señal y (ii) una proteína heteróloga; y/o

en donde la IL12A se selecciona del grupo que consiste en:

(v) el polipéptido de IL12A maduro (p. ej., que tiene la misma o esencialmente la misma longitud que IL12A de tipo natural) con o sin un péptido señal;

(vi) un fragmento funcional de cualquier polipéptido de IL12A de tipo natural (p. ej., una secuencia truncada (p. ej., eliminación de carboxi, amino terminal o regiones internas) más corta que una IL12A de tipo natural; pero que todavía retiene la actividad enzimática de IL12A);

(vii) una variante de la misma (p. ej., proteínas IL12A de longitud completa, maduras o truncadas en las cuales uno o más aminoácidos se han reemplazado, p. ej., variantes que retienen toda o la mayoría de la actividad de IL12A del polipéptido con respecto a una isoterma de referencia) (tales como variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica) y

(viii) una proteína de fusión que comprende (i) una IL12A madura de tipo natural, un fragmento funcional o una variante de la misma, con o sin un péptido señal y (ii) una proteína heteróloga.

En ciertos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción codifica un polipéptido de IL12 de mamífero, tal como un polipéptido de IL12 humano, un fragmento funcional o una variante del mismo.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción incrementa los niveles de expresión de proteína de IL12B y/o IL12A y/o los niveles de actividad enzimática de IL12 detectables en las células cuando se introducen en esas células, p. ej., en al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%, comparado con los niveles de expresión de la proteína IL12B y/o IL12A y/o niveles de actividad enzimática de IL12 detectables en las células antes de la administración del polinucleótido de la descripción. Los niveles de expresión de la proteína IL12B y/o IL12A y/o la actividad enzimática de IL12 se pueden medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En algunos casos, el polinucleótido se introduce en las células in vitro. En algunos casos, el polinucleótido se introduce en las células in vivo.

En algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica una IL12B y/o IL12A humana de tipo natural, (véase la FIG. 1).

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada en codones, en donde el marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia de ácido nucleico optimizada en codones deriva de una secuencia de IL12A y/o IL12B de tipo natural.

En algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica IL¹²B y/o IL12A que tiene la secuencia de longitud completa de IL12B y/o IL12A humana (es decir, que incluye la metionina iniciadora y los péptidos señal). En la IL12B y/o IL12A humana madura, la metionina iniciadora y/o péptidos señal se pueden eliminar para producir una “ IL12B madura” y/o “ IL12A madura” que comprende los restos de aminoácido de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. La SEQ ID NO: 1 corresponde a los aminoácidos 23 a 328 de SEQ ID NO: 48 y la SEQ ID NO: 3 corresponde a los aminoácidos 336 a 532 de SEQ ID NO: 48, respectivamente. Las enseñanzas de la presente descripción dirigidas a la secuencia completa de IL12B y/o IL12a humana también son aplicables a la forma madura de IL12B y/o IL12A humana que carecen de la metionina iniciadora y/o el péptido señal. De esta manera, en algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica IL12B y/o IL12A que tiene la secuencia madura de IL12B y/o IL12A humana. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL12B y/o IL12A que está optimizada en secuencia.

En algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante. En algunos casos, los polinucleótidos de la descripción comprenden un ^oR^fque codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A que comprende al menos una mutación puntual, al menos dos mutaciones puntuales, al menos tres mutaciones, al menos cuatro mutaciones, al menos cinco mutaciones, al menos seis mutaciones, al menos siete mutaciones, al menos ocho mutaciones, al menos nueve mutaciones o al menos diez mutaciones en la secuencia de IL12B y/o IL12A y retiene la actividad enzimática de IL12B y/o IL12A. En algunos casos, el polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante tiene una actividad de IL12B y/o IL12A que es al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100% de la actividad de IL12B y/o IL12A de la correspondiente IL12B y/o IL12A de tipo natural (es decir, la misma IL12B y/o IL12A pero sin la(s) mutación(es)). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción que comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante está optimizado en secuencia.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ^oR^f) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A con mutaciones que no alteran la actividad enzimática de IL12B y/o IL12A. Tales polipéptidos de IL12b y/o IL12A mutantes pueden denominarse como de función neutra. En algunos casos, el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante que comprende una o más mutaciones puntuales de función neutra.

En algunos casos, el polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante tiene actividad enzimática de IL12B y/o IL12A más alta que la IL12B y/o IL12A de tipo natural correspondiente. En algunos casos, el polipéptido de IL12B y/o IL12A mutante tiene una actividad de IL12B y/o IL12A que es al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100% más alta que la actividad de la IL12B y/o IL12A de tipo natural correspondiente

(es decir, la misma IL12B y/o IL12A pero sin la(s) mutación(es)).

En algunos casos, los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un fragmento de IL12B y/o IL12A funcional, p. ej., donde uno o más fragmentos corresponden a una subsecuencia de polipéptido de un polipéptido de IL12B y/o IL12A de tipo natural y retienen la actividad enzimática de IL12B y/o IL12A. En algunos casos, el fragmento de IL12B y/o IL12A tiene una actividad de IL12B y/o IL12A que es al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100% de la actividad de IL12 de la IL12B y/o IL12A de longitud completa correspondiente. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción que comprende un ORF que codifica un fragmento de IL12B y/o IL12A funcional está optimizado en secuencia.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un fragmento de IL12B y/o IL12A que tiene actividad enzimática de IL12B y/o IL12A más alta que la IL12B y/o IL12A de longitud completa correspondiente. De esta manera, en algunos casos, el fragmento de IL12B y/o IL12A tiene una actividad de IL12B y/o IL12A que es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100% más alta que la actividad de IL12B y/o IL12A de la IL12B y/o IL12A de longitud completa correspondiente.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un fragmento de IL12B y/o IL12A que es al menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% más corto que la IL12B y/o IL12A de tipo natural.

En otros casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, que tiene:

(i) al menos aproximadamente 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_007, hIL12AB_010 o hIL12AB_012;

(ii) al menos aproximadamente 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_018 o hIL12AB_019;

(iii) al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_008;

(iv) al menos aproximadamente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o

100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_005, hIL12AB_013, o hIL12AB_017 o nucleótidos 70-987 de hIL12AB_004;

(v) al menos aproximadamente 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_001 o hIL12AB_009;

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005;

(vii) al menos aproximadamente 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_022 o hIL12AB 038;

(viii) al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_024, hIL12AB_031, hIL12AB_032 o hIL12AB_036;

(ix) al menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_021, hIL12AB_023, hIL12AB_025, hIL12AB_026, hIL12AB_027, hIL12AB_029, hIL12AB_030, hIL12AB_034, hIL12AB_039 o hIL12AB_040;

(x) al menos aproximadamente 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_016, hIL12AB_035 o hIL12AB_037;

(xi) al menos aproximadamente 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_011, hIL12AB_028 o hIL12AB_033;

(xii) al menos aproximadamente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_015;

(xiii) al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_020; o

(xiv) 100% de identidad de secuencia a los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_006.

En otros casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12A, que tiene:

(i) al menos aproximadamente 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006 1596 de hIL12AB_010;

(ii) al menos aproximadamente 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_019;

(iii) al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_013;

(iv) al menos aproximadamente 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_007 o hIL12AB_014;

(v) al menos aproximadamente 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_002, hIL12AB_008;

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005;

(vii) al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_001 o hIL12AB_009 o nucleótidos 1009-1589 de hIL12AB_004;

(viii) al menos aproximadamente 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_17;

(ix) al menos aproximadamente 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_029 o hIL12AB_027;

(x) al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_039 o hIL12AB_040;

(xi) al menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_036, hIL12AB_034, hIL12AB_016, hIL12AB_023, hIL12AB_030, hIL12AB_031, hIL12AB_025 o hIL12AB_035;

(xii) al menos aproximadamente 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_021, hIL12AB_024, hIL12AB_032, hIL12AB_033, hIL12AB_037 o hIL12AB_022;

(xiii) al menos aproximadamente 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_020, hIL12AB_026 o hIL12AB_038;

(xiv) al menos aproximadamente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_015, hIL12AB_011 o hIL12AB_028; o

(xv) aproximadamente 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_003. En ciertos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende un solo ORF que codifica IL12B e IL12A, en donde el ORF comprende una secuencia que tiene:

(ii) al menos aproximadamente 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_018 o hIL12AB_019; (iii) al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_008;

(iv) al menos aproximadamente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_005, hIL12AB_013, o hIL12AB_017 o nucleótidos 70-987 de hIL12AB_004;

(v) al menos aproximadamente 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_001 o hIL12AB 009;

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005; (vii) al menos aproximadamente 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_022 o hIL12AB 038;

(viii) al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_024, hIL12AB_031, hIL12AB_032 o hIL12AB_036; (ix) al menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_021, hIL12AB_023, hIL12AB_025, hIL12AB_026, hIL12AB_027, hIL12AB_029, hIL12AB_030, hIL12AB_034, hIL12AB_039 o hIL12AB_040;

(xiv) aproximadamente 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_006; y una secuencia que tiene:

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005; (vii) al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_001, o hIL12AB_009 o nucleótidos 1009-1599 de hIL12AB_004;

(xiv) al menos aproximadamente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_015, hIL12AB_011, o hIL12AB_028; o

(xv) aproximadamente 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_003. En ciertos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende un primer ORF que codifica IL12B y un segundo ORF que codifica IL12A o, en donde el primer ORF comprende una secuencia que tiene:

(iv) al menos aproximadamente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_005, hIL12AB_013 o hIL12AB_017 o nucleótidos 70-987 de hIL12AB_004;

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005; (vii) al menos aproximadamente 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_022 o hIL12AB_038;

(xi) al menos aproximadamente 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_011, hIL12AB_028 o hIL12AB_033;

(xiv) aproximadamente 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 67-984 de hIL12AB_006; y/o en donde el segundo ORF comprende una secuencia que tiene:

(v) al menos aproximadamente 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_002, hIL12AB_008;

(vi) al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_012 o hIL12AB_005; (vii) al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_001 o hIL12AB_009 o nucleótidos 1009-1599 de hIL12AB_004;

(xii) al menos aproximadamente 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_021, hIL12AB_024, hIL12AB_032, hIL12AB_033 o hIL12AB_022;

(xv) aproximadamente 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1006-1596 de hIL12AB_003.

En algunos casos, la secuencia de polinucleótido comprende un ORF que comprende la secuencia expuesta como hIL12AB_002 (SEQ ID NO: 6) o una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con hIL12AB_002 (SEQ ID NO: 6).

En un caso, la primera secuencia de nucleótidos (p. ej., primer ORF) que codifica el polipéptido de IL12B y la segunda secuencia de nucleótidos (p. ej., segundo ORF) que codifica el polipéptido de IL12A se fusionan directamente o por un enlazador. En otro caso, la primera secuencia de nucleótidos (p. ej., primer ORF) que codifica el polipéptido de IL12B y la segunda secuencia de nucleótidos (p. ej., segundo ORF) que codifica el polipéptido de IL12A no se fusionan entre sí.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de fusión de IL12B-IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional, o variante de la misma), en donde la secuencia de nucleótidos tiene al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a 44. Véase la Tabla 4.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de fusión de IL12B-IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma), en donde la secuencia de nucleótidos tiene de 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 70% a 95%, 80% a 95%, 70% a 85%, 75% a 90%, 80% a 95%, 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95% o 95% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 a 44. Véase la Tabla 4.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende de aproximadamente 900 a aproximadamente 100000 nucleótidos (p. ej., de 900 a 1000, de 900 a 1100, de 900 a 1200, de 900 a 1300, de 900 a 1400, de 900 a 1500, de 1000 a 1100, de 1000 a 1100, de 1000 a 1200, de 1000 a 1300, de 1000 a 1400, de 1000 a 1500, de 1083 a 1200, de 1083 a 1400, de 1083 a 1600, de 1083 a 1800, de 1083 a 2000, de 1083 a 3000, de 1083 a 5000, de 1083 a 7000, de 1083 a 10000, de 1083 a 25000, de 1083 a 50000, de 1083 a 70000 o de 1083 a 100000).

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de fusión de IL12B-IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma), en donde la longitud de la secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) es al menos de 500 nucleótidos en longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 500, 600, 700, 80, 900, 1000, 1050, 1083, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60 000, 70000, 80000, 90000 o hasta e incluyendo 100000 nucleótidos).

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma) además comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que no es codificante, p. ej., un sitio de unión de miRNA.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL¹²B y/o IL12A que es de una sola cadena o de doble cadena.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción que comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma) es DNA o RNA. En algunos casos, el polinucleótido de la descripción es RNA. En algunos casos, el polinucleótido de la descripción es, o funciona como, un RNA mensajero (mRNA). En algunos casos, el mRNA comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica al menos un polipéptido de IL12B y/o IL12A, y es capaz de ser traducido para producir el polipéptido de IL12B y/o IL12A codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma), en donde el polinucleótido comprende al menos una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo. En algunos casos, el polinucleótido además comprende un sitio de unión de miRNA, p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miR-122. En algunos casos, el polinucleótido descrito en el presente documento se formula con un agente de suministro, p. ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 o cualquiera de los Compuestos 1-232.

Los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción también pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican características adicionales que facilitan el tráfico de los polipéptidos codificados a sitios terapéuticamente relevantes. Una característica de tal clase que ayuda en el tráfico de proteínas es la secuencia señal o secuencia de direccionamiento. Los péptidos codificados por estas secuencias señal son conocidos por una variedad de nombres, que incluyen péptidos de direccionamiento, péptidos de tránsito y péptidos señal. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un péptido señal operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A descrito en el presente documento.

En algunos casos, la “secuencia señal” o “péptido señal” es un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, que es de aproximadamente 9 a 200 nucleótidos (3-70 aminoácidos) en longitud que, opcionalmente, se incorpora en el 5' (o extremo N) de la región de codificación o el polipéptido, respectivamente. La adición de estas secuencias da como resultado el tráfico del polipéptido codificado a un sitio deseado, tal como el retículo endoplásmico o las mitocondrias a través de una o más rutas de direccionamiento. Algunos péptidos señal son escindidos de la proteína, por ejemplo por una peptidasa señal después de que las proteínas sean transportadas al sitio deseado.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, en donde la secuencia de nucleótidos además comprende una secuencia de ácido nucleico 5' que codifica un péptido señal nativo. En otro caso, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, en donde la secuencia de nucleótidos carece de la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal nativo.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, en donde la secuencia de nucleótidos además comprende una secuencia de ácido nucleico 5' que codifica un péptido señal heterólogo.

En algunos casos, el polinucleótido además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal que se encuentra en el extremo 5' del primer ORF.

En algunos casos, el primer ORF comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal.

En algunos casos, el péptido señal es un péptido señal de IL12B humana.

En algunos casos, el péptido señal comprende una secuencia al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 22 de SEQ ID NO: 48.

Basándose en las secuencias de RNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de DNA correspondiente (p. ej., conversión de uracilo a timina). Del mismo modo, basándose en las secuencias de DNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de RNA correspondiente (p. ej., conversión de timina a uracilo).

5. Proteínas quiméricas

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) puede comprender más de una secuencia de ácido nucleico (p. ej., más de un ORF) que codifica uno o más polipéptidos de interés. En algunos casos, los polinucleótidos de la descripción comprenden un solo ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, un fragmento funcional o una variante del mismo. Sin embargo, en algunos casos, el polinucleótido de la descripción puede comprender más de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B (un primer polipéptido de interés), un fragmento funcional o una variante del mismo, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A (un segundo polipéptido de interés), un fragmento funcional, o una variante del mismo, y una tercera secuencia de nucleótidos que expresa un tercer polipéptido de interés (p. ej., un polipéptido heterólogo a IL12). En un caso, el tercer polipéptido de interés se puede fusionar al polipéptido de IL12B directamente o mediante un enlazador. En otro caso, el tercer polipéptido de interés se puede fusionar al polipéptido de IL12A directamente o mediante un enlazador. En otros casos, el tercer polipéptido de interés se puede fusionar tanto al polipéptido de IL12B como al polipéptido de IL12A directamente o mediante un enlazador. En casos adicionales, el polinucleótido de la descripción puede comprender más de tres secuencias de nucleótidos, por ejemplo, una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B (un primer polipéptido de interés), un fragmento funcional, o una variante del mismo, una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A (un segundo polipéptido de interés), un fragmento funcional, o una variante del mismo, una tercera secuencia de nucleótidos que expresa un tercer polipéptido de interés, y una cuarta secuencia de nucleótidos que expresa un cuarto polipéptido de interés. En otros casos, el tercer polipéptido de interés se fusiona con el polipéptido de IL12A directamente o mediante un enlazador, y el cuarto polipéptido de interés se fusiona con el polipéptido de IL12B directamente o mediante un enlazador. En algunos casos, dos o más polipéptidos de interés se pueden fusionar genéticamente, es decir, dos o más polipéptidos pueden ser codificados por la misma secuencia de nucleótidos. En algunos casos, el polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un enlazador (p. ej., un enlazador peptídico G⁴S u otro enlazador conocido en la técnica) entre dos o más polipéptidos de interés.

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) puede comprender, dos, tres, cuatro o más secuencias de nucleótidos, expresando cada una un polipéptido de interés.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) puede comprender una primera secuencia de ácido nucleico (p. ej., un primer ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como de IL12A y una segunda secuencia de ácido nucleico (p. ej., un segundo o Rf ) que codifica un segundo polipéptido de interés.

6. Enlazador

En un aspecto, la IL12B y/o IL12A se pueden fusionar directamente o mediante un enlazador. En otros casos, la IL12B y/o IL12A se puede fusionar directamente o mediante un enlazador a un polipéptido heterólogo. Los enlazadores adecuados para fusionar la IL12B a IL12A o IL12B y/o IL12A a un polipéptido heterólogo pueden ser un resto de polipéptido (o péptido) o un resto no de polipéptido.

Algunos aspectos de la presente descripción se dirigen a una nanopartícula de lípido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12 humano, en donde el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B humano operativamente unido a un polipéptido de IL12A humano. En algunos casos, el polipéptido de IL12B está operativamente unido al polipéptido de IL12A por un enlazador peptídico. En algunos casos, el polipéptido de IL12B se encuentra en el extremo 5' del polipéptido de IL12A o el enlazador peptídico. En otros casos, el polipéptido de IL12A se encuentra en el extremo 5' del polipéptido de IL12B o el enlazador peptídico.

En algunos casos, el enlazador es un enlazador peptídico, que incluye de un aminoácido a aproximadamente 200 aminoácidos. En algunos casos, el enlazador comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40 aminoácidos.

En algunos casos, el enlazador puede ser enlazador de GS (Gly/Ser), por ejemplo, que comprende (GnS)m, en donde n es un número entero de 1 a 20 y m es un número entero de 1 a 20. En algunos casos, el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m (SEQ ID NO: 203), en donde n es 1, 23, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 y m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20. En algunos casos, el enlazador de GS puede comprender (GGGGS)o (SEQ ID NO: 204), en donde o es un número entero de 1 a 5. En algunos casos, el enlazador de GS puede comprender GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 205), GGSGGGGG (SEQ ID NO: 206) o GSGSGSGS (SEQ ID NO: 207). En ciertos casos, el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m, en donde n es 6 y m es 1.

En algunos casos, el enlazador adecuado para la descripción puede ser un enlazador rico en Gly, por ejemplo que comprende (Gly)p (SEQ ID NO: 208), en donde p es un número entero de 1 a 40. En algunos casos, un enlazador rico en Gly puede comprender GGGGG, GGGGGG, GGGGGGG o GGGGGGGG.

En algunos casos, el enlazador adecuado para la descripción puede comprender (EAAAK)q (SEQ ID NO: 209), en donde q es un número entero de 1 a 5. En un caso, el enlazador adecuado para la descripción puede comprender (EAAAK)3.

Los enlazadores ejemplares adicionales incluyen, pero no están limitados a, GGGGSLVPRGSGGGGS (SEQ ID NO: 210), GSGSGS (SEQ ID NO: 211), GGGGSLVPRGSGGGG (SEQ ID NO: 212), GGSGGHMGSGG (SEQ ID NO: 213), GGSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 214), GGSGG (SEQ ID NO: 215), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 216), GGGSEGGGSEGGGSEGGG (SEQ ID NO: 217), AAGAATAA (SEQ ID NO: 218), GGSSG (SEQ ID NO: 219), GSGGGTGGGSG (SEQ ID NO: 220), GSGSGSGSGGSG (SEQ ID NO: 221), GSGGSGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 222) y GSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 223).

Los nucleótidos que codifican los enlazadores se pueden construir para fusionar las secuencias de nucleótidos de la presente descripción. Basándose en las secuencias de RNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de DNA correspondiente (p. ej., conversión de uracilo a timina). Del mismo modo, basándose en las secuencias de DNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de RNA correspondiente (p. ej., conversión de timina a uracilo).

7. Optimización de secuencia de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción se optimiza en secuencia. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica otro polipéptido de interés, un 5'-UTR, un 3'-UTR, un miRNA, una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador, o cualquier combinación de los mismos que se optimiza en secuencia.

Una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia, p. ej., una secuencia de mRNA optimizada en codones que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, es una secuencia que comprende al menos una sustitución de nucleobase sinónima con respecto a una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de nucleótidos de tipo natural que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A).

Una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia puede ser parcial o completamente diferente en secuencia de la secuencia de referencia. Por ejemplo, una secuencia de referencia que codifica poliserina uniformemente codificada por los codones TCT se puede optimizar en secuencia teniendo 100% de sus nucleobases sustituidas (para cada codón, T en la posición 1 reemplazado por A, C en la posición 2 reemplazado por G y T en la posición 3 reemplazado por C) para producir una secuencia que codifica poliserina que sería uniformemente codificada por los codones AGC. El porcentaje de identidad de secuencia obtenido de una alineación de emparejamiento global entre la secuencia de ácido nucleico de poliserina de referencia y la secuencia de ácido nucleico de poliserina optimizada en secuencia sería 0%. Sin embargo, los productos de proteína de ambas secuencias serían 100% idénticos.

Algunos métodos de optimización de secuencias (también algunas veces denominada optimización de codones) son conocidos en la técnica (y discutidos en más detalle a continuación) y pueden ser útiles para lograr uno o más resultados deseados. Estos resultados pueden incluir, p. ej., frecuencias de codones de emparejamiento en ciertas objetivos de tejidos y/u organismos hospedantes para asegurar el plegado apropiado; contenido de G/C de desviación para incrementar la estabilidad de mRNA o reducir estructuras secundarias; minimizar codones de repetición en tándem o recorridos de bases que pueden deteriorar la construcción génica o expresión; adaptación de regiones de control transcripcionales y traduccionales; inserción o eliminación de secuencias de tráfico de proteínas; eliminación/adición de sitios de modificación postraduccional en una proteína codificada (p. ej., sitios de glicosilación); adición, eliminación o barajado de dominios de proteínas; inserción o eliminación de sitios de restricción; modificación de sitios de unión a ribosomas y sitios de degradación de mRNA; ajuste de velocidades de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen apropiadamente; y/o reducción o eliminación de estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido. Las herramientas de optimización de secuencia, algoritmos y servicios son conocidos en la técnica, ejemplos no limitantes incluyen servicios de GeneArt (Life Tecnologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o métodos patentados.

Las opciones de codones para cada aminoácido se dan en la Tabla 3.

Tabla 3. O ciones de Codones

En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, un fragmento funcional o una variante del mismo, en donde el polipéptido de IL12B y/o IL12A, fragmento funcional, o una variante del mismo codificado por la secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia tiene propiedades mejoradas (p. ej., comparado a un polipéptido de IL12B y/o IL12A, fragmento funcional o una variante del mismo codificado por una secuencia de nucleótidos de referencia que no está optimizada en secuencia), p. ej., propiedades mejoradas relacionadas con la eficacia de expresión después de la administración in vivo. Tales propiedades incluyen, pero no están limitadas a, mejora de la estabilidad del ácido nucleico (p. ej., estabilidad de mRNA), incremento de la eficacia de traducción en el tejido objetivo, reducción del número de proteínas truncadas expresadas, mejora del plegamiento o prevención del mal plegamiento de las proteínas expresadas, reducción de toxicidad de los productos expresados, reducción de muerte celular causada por los productos expresados, incremento y/o disminución de la agregación de proteínas.

En algunos casos, la secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia se optimiza en codones para la expresión en sujetos humanos, que tienen características estructurales y/o químicas que evitan uno o más de los problemas en la técnica, por ejemplo, características que son útiles para optimizar la formulación y suministro de agentes terapéuticos basados en ácido nucleico mientras que retiene la integridad estructural y funcional; superar un umbral de expresión; mejorar las velocidades de expresión; la semivida y/o concentraciones de proteína; optimizar la localización de proteínas; y evitar bio-respuestas perjudiciales tales como la respuesta inmunitaria y/o rutas de degradación.

En algunos casos, los polinucleótidos de la descripción comprenden una secuencia de nucleótidos (p. ej., una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de interés adicional, una 5'-UTR, una 3'-UTR, un microRNA, una secuencia de ácido nucleico que codifica un enlazador, o cualquier combinación de los mismos), que se optimiza en secuencia de acuerdo con un método que comprende:

(i) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (p. ej., un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A) por un codón alternativo para incrementar o disminuir el contenido de uridina para generar una secuencia modificada en uridina;

(ii) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (p. ej., un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A) por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos;

(iii) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (p. ej., un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A) por un codón alternativo para incrementar el contenido de G/C; o

(iv) una combinación de los mismos.

En algunos casos, la secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A) tiene al menos una propiedad mejorada con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia.

En algunos casos, el método de optimización de secuencia es multiparamétrico y comprende uno, dos, tres, cuatro o más métodos descritos en el presente documento y/u otros métodos de optimización conocidos en la técnica.

Las características, que se pueden considerar beneficiosas en algunos casos de la descripción, pueden ser codificadas por o dentro de regiones del polinucleótido y tales regiones pueden estar secuencia arriba (5') respecto a, secuencia abajo (3') respecto a, o dentro de la región que codifica el polipéptido de IL12B y/o IL12A. Estas regiones se pueden incorporar en el polinucleótido antes y/o después de la optimización de secuencia de la región de codificación de proteína o el marco de lectura abierto (ORF). Ejemplos de tales características incluyen, pero no están limitadas a, regiones no traducidas (UTR), secuencias de microRNA, secuencias de Kozak, secuencias oligo(dT), cola de poli-A y marcadores detectables y se pueden incluir múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento de XbaI.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una 5' UTR, una 3' UTR y/o un sitio de unión de miRNA. En algunos casos, el polinucleótido comprende dos o más 5' UTR y/o 3' UTR, que pueden ser las mismas o diferentes secuencias. En algunos casos, el polinucleótido comprende dos o más sitios de unión de miRNA, que pueden ser las mismas o diferentes secuencias. Cualquier porción de la 5' UTR, 3' UTR y/o sitio de unión de miRNA, incluyendo ninguno, se puede optimizar en secuencia y puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de secuencia.

En algunos casos, después de la optimización, el polinucleótido se reconstituye y se transforma en un vector tal como, pero no limitado a, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, el polinucleótido optimizado se puede reconstituir y transformar en E. coli químicamente competente, levadura, neurospora, maíz, drosophila, etc., donde se producen estructuras de cromosoma o similares a plásmido de alto número de copias por los métodos descritos en el presente documento.

8. Secuencias de nucleótidos optimizadas en secuencia que codifican polipéptidos de IL12

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A descrito en el presente documento. En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, en donde el ORF se ha optimizado en secuencia.

Las secuencias de nucleótidos optimizadas en secuencia de ejemplo que codifican IL12B y/o IL12A humana se muestran en las Tablas 4A-4d . En algunos casos, las secuencias de IL12B y/o IL12A optimizadas en secuencia en la Tabla 4A-4D, fragmentos y variantes de las mismas, se utilizan para la práctica de los métodos descritos en el presente documento. En algunos casos, las secuencias de IL12B y/o IL12A optimizadas en secuencia en la Tabla 4A-4D, fragmentos y variantes de las mismas se combinan con o son alternativas a las secuencias de tipo natural descritas en la Figura 1. Basándose en las secuencias de RNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de DNA correspondiente (p. ej., conversión de uracilo a timina). Del mismo modo, basándose en las secuencias de DNA proporcionadas, un experto en la técnica entendería la secuencia de RNA correspondiente (p. ej., conversión de timina a uracilo).

Tabla 4A: Secuencias de marcos de lectura abiertos optimizadas en secuencia para IL12 humana

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4D. n i RF mRNA

Las secuencias de nucleótidos optimizadas en secuencia descritas en el presente documento son distintas de las secuencias de ácido nucleico de tipo natural correspondientes y de otras secuencias de nucleótidos optimizadas en secuencia conocidas, p. ej., estos ácidos nucleicos optimizados en secuencia tienen características de composición únicas.

En algunos casos, el porcentaje de las nucleobases uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A), un fragmento funcional o una variante de la misma se modifica (p. ej., se reduce) con respecto al porcentaje de nucleobases uracilo o timina en la secuencia de nucleótidos de tipo natural de referencia. Tal secuencia se denomina una secuencia modificada en uracilo o modificada en timina. El porcentaje de contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos se puede determinar dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia entre el número total de nucleótidos y multiplicando por 100. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia tiene un menor contenido de uracilo o timina que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo natural de referencia. En algunos casos, el contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia de la descripción es mayor que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo natural de referencia y todavía mantiene efectos beneficiosos, p. ej., expresión incrementada y/o respuesta del receptor similar a Toll (TLR) reducida cuando se compara con la secuencia de tipo natural de referencia.

En algunos casos, las secuencias optimizadas de la presente descripción contienen intervalos únicos de uracilos o timina (si es DNA) en la secuencia. El contenido de uracilo o timina de las secuencias optimizadas se puede expresar de varias maneras, p. ej., contenido de uracilo o timina de las secuencias optimizadas con respecto al mínimo teórico (% U^{t m}o % T^{t m}) con respecto al tipo natural (% U^{w t}o % T^{w t}) y con respecto al contenido de nucleótidos totales (% U^{t l}o % T^{t l}). Para el DNA se reconoce que está presente la timina en lugar de uracilo, y se sustituiría T donde aparece U. De esta manera, todas las descripciones relacionadas con, p. ej., % U^{t m}, % U^{w t}o % U^{t l}, con respecto al RNA son igualmente aplicables a % T^{t m}, % T^{w t}o % T^{t l}con respecto al DNA.

El contenido de uracilo o timina con respecto al mínimo teórico de uracilo o timina, se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia entre el número total de uracilos o timinas en una secuencia de nucleótidos hipotética en la cual todos los codones en la secuencia hipotética se reemplazan por codones sinónimos que tienen el contenido de uracilo o timina más bajo posible y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en el presente documento como % U^{t m}o % T^{t m}.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está por debajo de 196%, por debajo de 195%, por debajo de 190%, por debajo de 185%, por debajo de 180%, por debajo de 175%, por debajo de 170%, por debajo de 165%, por debajo de 160%, por debajo de 155%, por debajo de 150%, por debajo de 145%, por debajo de 140%, por debajo de 139%, por debajo de 138%, por debajo de 137%, por debajo de 136%, por debajo de 135%, por debajo de 134%, por debajo de 133%, por debajo de 132%, por debajo de 131%, por debajo de 130%, por debajo de 129%, por debajo de 128%, por debajo de 127%, por debajo de 126%, por debajo de 125%, por debajo de 124%, por debajo de 123%, por debajo de 122%, por debajo de 121%, por debajo de 120%, por debajo de 119%, por debajo de 118%, por debajo de 117%, por debajo de 116% o por debajo de 115%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está por debajo de 196% y por encima de 100%, por encima de 101%, por encima de 102%, por encima de 103%, por encima de 104%, por encima de 105%, por encima de 106%, por encima de 107%, por encima de 108%, por encima de 109%, por encima de 110%, por encima de 111%, por encima de 112%, por encima de 113%, por encima de 114%, por encima de

5%, por encima de 116%, por encima d encima de 118%, por encima de 119%, por encima de

0%, por encima de 121%, por encima d encima de 123%, por encima de 124%, por encima de 125%, por encima de 126%, por encima d encima de 128%, por encima de 129%, o por encima de 130%, por encima de 135%, por encima de 130%, por encima de 131% o por encima de 132%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está entre 132% y 150%, entre 133% y 150%, entre 134% y 150%, entre 135% y 150%, entre 136%

y 150%, entre 137% y 150%, entre 138% y 150%, entre 139% y 150%, entre 140% y 150%, entre 132% y

151%, entre 132% y 152%, entre 132% y 153%, entre 132% y 154%, entre 132% y 155%, entre 132% y 156%,

entre 132% y 157%, entre 132% y 158%, entre 132% y 159%, entre 132% y 160%, entre 133% y 151%, entre

134% y 152%, entre 135% y 153%, entre 136% y 154%, entre 137% y 155%, entre 138% y 156%, entre 138%

y 157%, entre 139% y 158%, entre 140% y 159% o entre 141% y 160%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está entre aproximadamente 133% y aproximadamente 152%, p. ej., entre 132.32% y 150.51%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está por debajo de 198%, por debajo de 195%, por debajo de 190%, por debajo de 185%, por

debajo de 180%, por debajo de 175%, por debajo de 170%, por debajo de 165%, por debajo de 160%, por

debajo de 155%, por debajo de 150%, por debajo de 145%, por debajo de 140%, por debajo de 139%, por

debajo de 138%, por debajo de 137%, por debajo de 136%, por debajo de 135%, por debajo de 134%, por

debajo de 133%, por debajo de 132%, por debajo de 131%, por debajo de 130%, por debajo de 129%, por

debajo de 128%, por debajo de 127%, por debajo de 126%, por debajo de 125%, por debajo de 124%, por

debajo de 123%, por debajo de 122%, por debajo de 121%, por debajo de 120%, por debajo de 119%, por

debajo de 118%, por debajo de 117%, por debajo de 116% o por debajo de 115%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está por debajo de 198% y por encima de 100%, por encima de 101%, por encima de 102%, por

encima de 103%, por encima de 104%, por encima de 105%, por encima de 106%, por encima de 107%, por

encima de 108%, por encima de 109%, por encima de 110%, por encima de 111%, por encima de 112%, por

encima de 113%, por encima de 114%, por encima de 115%, por encima de 116%, por encima de 117%, por

encima de 118%, por encima de 119%, por encima de 120%, por encima de 121%, por encima de 122%%, por

encima de 123%, por encima de 124% o por encima de 125%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre 125% y 143%, entre 126% y 143%, entre 127% y 143%, entre 128% y 143%, entre 129%

y 143%, entre 130% y 143%, entre 131% y 132%, entre 133% y 134%, entre 135% y 143%, entre 125% y

144%, entre 125% y 145%, entre 125% y 146%, entre 125% y 147%, entre 125% y 148%, entre 125% y 149%,

entre 125% y 150%, entre 125% y 151%, entre 125% y 152%, entre 125% y 153%, entre 125% y 154%, entre

125% y 155%, entre 126% y 144%, entre 127% y 145%, entre 128% y 146%, entre 129% y 147%, entre 130%

y 148%, entre 131% y 149%, entre 132% y 150% o entre 133% y 151%.

En algunos casos, el % U^{t m}de una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre aproximadamente 124% y aproximadamente 145%, p. ej., entre 125% y 144.42%.

Una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A de la descripción también se puede describir de acuerdo con su

contenido de uracilo o timina con respecto al contenido de uracilo o timina en la secuencia de ácido nucleico

de tipo natural correspondiente (% U^{w t}o % T^{w t}).

Las frases “contenido de uracilo o timina con respecto al contenido de uracilo o timina en la secuencia de ácido

nucleico de tipo natural” se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de uracilos o timinas en

un ácido nucleico optimizado en secuencia entre el número total de uracilos o timinas en la secuencia de ácido

nucleico de tipo natural correspondiente y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en el presente documento como % U^{w t}o % T^{w t}.

En algunos casos, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido

de IL12B de la descripción está por encima de 50%, por encima de 55%, por encima de 60%, por encima de

65%, por encima de 70%%, por encima de 75%, por encima de 80%, por encima de 85%, por encima de 90%

o por encima de 95%.

de IL12B de la descripción está entre 55% y ⁸⁸%, entre 56% y 87%, entre 57% y ⁸⁶%, entre 58% y 85%, entre

59% y 84%, entre 60% y 83%, entre 61% y 82%, entre 62% y 81%, entre 63% y 80%, entre 64% y 79%, entre

65% y 78% o entre 65% y 77%.

En algunos casos, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está entre ⁶⁶% y 78%, entre ⁶⁶% y 77%, entre 67% y 77%, entre 67% y ⁷⁶% o entre 65% y 77%.

En un caso particular, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está entre aproximadamente ⁶⁶% y aproximadamente 77%, p. ej., entre 67% y 76%.

En algunos casos, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está por encima de 50%, por encima de 55%, por encima de 60%, por encima de 65%, por encima de 70%, por encima de 75%, por encima de 80%, por encima de 85%, por encima de 90% o por encima de 95%.

En algunos casos, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre 50% y 85%, entre 51% y 84%, entre 52% y 83%, entre 53% y 82%, entre 54% y 81%, entre 55% y 80%, entre 56% y 79%, entre 57% y 78%, entre 58% y 77%, entre 59% y 76%, entre 60% y 75%, entre 61% y 74% o entre 62% y 73%.

En algunos casos, el % U^{w t}o % T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre 61% y 74%, entre 61% y 73%, entre 61% y 72%, entre 61% y 73%, entre 62% y 73%, entre 62% y 72%, entre 62% y 74% o entre 63% y 72%.

En un caso particular, el %U^{w t}o %T^{w t}de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre aproximadamente 62% y aproximadamente 73%, p. ej., entre 63% y 72%.

El contenido de uracilo o timina de IL12B de tipo natural con respecto al contenido de nucleótidos totales (%) es aproximadamente 21%. En algunos casos, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B con respecto al contenido de nucleótidos totales (%) (% U^{t l}o % T^{t l}) es menor que 21%. En algunos casos, el % U^{t l}o % T^{t l}es menor que 20%, menor que 19%, menor que 18%, menor que 17%, menor que 16%, menor que 15%, menor que 14%, menor que 13%, menor que 12%, menor que 11% o menor que 10%. En algunos casos, el % U^{t l}o % T^{t l}es no menor que 10%, 9%, ⁸%, 7%, ⁶%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%.

En algunos casos, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción con respecto al contenido de nucleótidos totales (% U^{t l}o % T^{t l}) está entre 10% y 20%, entre 11% y 20%, entre 11.5% y 19.5%, entre 12% y 19%, entre 12% y 18%, entre 13% y 18%, entre 13% y 17%, entre 13% y 16%, entre 13% y 16%, entre 14% y 16%, entre 14% y 17% o entre 13% y 17%.

En un caso particular, el contenido de uracilo o timina (% U^{t l}o % T^{t l}) de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción está entre aproximadamente 13% y aproximadamente 17%, p. ej., entre 14% y 16%.

El contenido de uracilo o timina de IL12A de tipo natural con respecto al contenido de nucleótidos totales (%) es aproximadamente 26%. En algunos casos, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A con respecto al contenido de nucleótidos totales (%) (%U^{t l}o %T^{t l}) es menor que 25%. En algunos casos, el % U^{t l}o % T^{t l}es menor que 25%, menor que 24%, menor que 23%, menor que ²²%, menor que ²¹%, menor que ²⁰%, menor que 19%, menor que 18%, menor que 17%, menor que 16%, menor que 15%, menor que 14%, menor que 13%, menor que ¹²%, menor que ¹¹% o menor que 10%. En algunos casos, el % U^{t l}o % T^{t l}no es menor que 10%, 9%, ⁸%, 7%, ⁶%, 5%, 4%, 3%, ²% o ¹%.

En algunos casos, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción con respecto al contenido de nucleótidos totales (% U^{t l}o % T^{t l}) está entre 10% y 25%, entre 11% y 25%, entre 12% y 25%, entre 13% y 25%, entre 14% y 25%, entre 15% y 25%, entre 16% y 25%, entre 10% y 24%, entre 10% y 23%, entre 11% y 22%, entre 11% y 21%, entre 11% y 20%, entre 11% y 19%, entre 11% y 18%, entre 12% y 24%, entre 12% y 23%, entre 13% y 22%, entre 14% y 21%, entre 13% y 20%, entre 15% y 19%, entre 15% y 20%, entre 16% y 19%, entre 16% y 18% o entre 13% y 17%.

En un caso particular, el contenido de uracilo o timina (% U^{t l}o % T^{t l}) de una secuencia modificada en uracilo o timina que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción está entre aproximadamente 15% y aproximadamente 19%, p. ej., entre 16% y 18%. En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción tiene un número reducido de uracilos consecutivos con respecto a la secuencia de ácido nucleico de tipo natural correspondiente. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas pueden estar codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluye una agrupación de cuatro uracilos. Tal subsecuencia se puede sustituir, p. ej., con CUGCUC, que elimina la agrupación de uracilo.

La fenilalanina puede ser codificada por UUC o UUU. De esta manera, incluso si las fenilalaninas codificadas por UUU se reemplazan por UUC, el codón sinónimo todavía contiene un par de uracilos (UU). Por consiguiente, el número de fenilalaninas en una secuencia establece un número mínimo de pares de uracilos (UU) que no se pueden eliminar sin alterar el número de fenilalaninas en el polipéptido codificado.

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A de la descripción tiene un número reducido de tripletes de uracilo (UUU) con respecto a la secuencia de ácido nucleico de tipo natural. En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A de la descripción contiene 4, 3, 2, 1 o ningún tripletes de uracilo (UUU).

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A tiene un número reducido de pares de uracilos (UU) con respecto al número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo natural. En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A de la descripción tiene un número de pares de uracilos (UU) correspondiente al número mínimo posible de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo natural.

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 pares de uracilos (UU) menos que el número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo natural. En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción tiene entre 7 y 13, entre ⁸y 14, entre 9 y 15, entre 10 y 16, entre 11 y 7, entre 12 y 18 pares de uracilos (UU).

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B de la descripción tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pares de uracilos (UU) menos que el número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo natural. En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A de la descripción tiene entre 7 y 13, entre ⁸y 14, entre 9 y 15, entre 10 y 16, entre 11 y 7, entre 12 y 18 pares de uracilos (UU).

La frase “pares de uracilos (UU) con respecto a los pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo natural” se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de pares de uracilos (UU) en una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia entre el número total de pares de uracilos (UU) en la secuencia de nucleótidos de tipo natural correspondiente y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en el presente documento como % UUwt.

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A o IL12B de la descripción tiene un % UUwt menor que 90%, menor que 85%, menor que 80%, menor que 75%, menor que 70%, menor que 65%, menor que 60%, menor que 65%, menor que 60%, menor que 55%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30% o menor que 20%.

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B tiene un % UUwt entre 24% y 59%. En un caso particular, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción tiene un % UUwt entre 29% y 55%.

En algunos casos, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A tiene un % UUwt entre 14% y 57%. En un caso particular, una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción tiene un % UUwt entre 19% y 52%.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B descritos en el presente documento. En algunos casos, la secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B comprende al menos una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo. En algunos casos, al menos 95% de una nucleobase (p. ej., uracilo) en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción son nucleobases modificadas. En algunos casos, al menos 95% de uracilo en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B es 5-metoxiuracilo. En algunos casos, el polinucleótido que comprende la secuencia modificada en uracilo además comprende un sitio de unión de miRNA, p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miR-122. En algunos casos, el polinucleótido que comprende una secuencia modificada en uracilo se formula con un agente de suministro, p.

ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 o cualquiera de los Compuestos 1-232.

En algunos casos, el “contenido de guanina del ORF optimizado en secuencia que codifica IL12B y/o IL12A con respecto al contenido de guanina máximo teórico de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de IL12B y/o IL12A“ abreviado como % G^tmxes al menos 69%, al menos 70%, al menos 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100%. En algunos casos, el % Gtmx está entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, entre aproximadamente 71% y aproximadamente 79%, entre aproximadamente 71% y aproximadamente 78% o entre aproximadamente 71% y aproximadamente 77%.

En algunos casos, el “contenido de citosina del ORF con respecto al contenido de citosina máximo teórico de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de IL12B y/o IL12A” abreviado como % Ctmx es al menos 59%, al menos 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100%. En algunos casos, el % CTMX está entre aproximadamente 60% y aproximadamente 80%, entre aproximadamente 62% y aproximadamente 80%, entre aproximadamente 63% y aproximadamente 79% o entre aproximadamente 68 % y aproximadamente 76%.

En algunos casos, el “contenido de guanina y citosina (G/C) del ORF con respecto al contenido de G/C máximo teórico en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de IL12B y/o IL12A” abreviado como % G/Ctmx es al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 100%. El % G/Ctmx está entre aproximadamente 80% y aproximadamente 100%, entre aproximadamente 85% y aproximadamente 99%, entre aproximadamente 90% y aproximadamente 97% o entre aproximadamente 91% y aproximadamente 96%.

En algunos casos, el “contenido de G/C en el ORF con respecto al contenido de G/C en el ORF de tipo natural correspondiente”, abreviado como % G/C^wtes al menos 102%, al menos 103%, al menos 104%, al menos 105%, al menos 106%, al menos 107%, al menos 110%, al menos 115% o al menos 120%.

En algunos casos, el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF es al menos 20%, al menos 21%, al menos 22%, al menos 23%, al menos 24%, al menos 25%, al menos 26%, al menos 27%, al menos 28%, al menos 29% o al menos 30% más alto que el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF de tipo natural correspondiente.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de IL12B y/o IL12A, en donde el ORF se ha optimizado en secuencia, y en donde cada uno de % U^tl, % U^wt, % UTM, % G^tl, % G^wt, % G^tmx, % C^tl, % C^wt, % C^tmx, % G/C^tl, % G/C^wto % G/C^tmx, solo o en una combinación de los mismos está en un intervalo entre (i) un máximo correspondiente al valor máximo del parámetro (MÁX.) más aproximadamente 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, ⁶, 6.5, 7, 7.5, ⁸, 8.5, 9, 9.5 o 10 desviaciones estándar (DESV. EST.) y (ii) un mínimo correspondiente al valor mínimo del parámetro (MÍN.) menos 0.5, ¹, 1.5, ², 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, ⁶, 6.5, 7, 7.5, ⁸, 8.5, 9, 9.5 o ¹⁰desviaciones estándar (De SV. EST.).

9. Métodos para la optimización de secuencia

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos, p. ej., un ORF, que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma) se optimiza en secuencia. Una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (la secuencia de nucleótidos también se denomina “ácido nucleico” en el presente documento) comprende al menos una modificación de codón con respecto a una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B). De esta manera, en un ácido nucleico optimizado en secuencia, al menos un codón es diferente de un codón correspondiente a una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural).

En general, los ácidos nucleicos optimizados en secuencia se generan por al menos una etapa que comprende sustituir codones en una secuencia de referencia por codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido). Tales sustituciones se pueden efectuar, por ejemplo, aplicando un mapa de sustitución de codones (es decir, una tabla que proporciona los codones que codificarán cada aminoácido en la secuencia optimizada en codones), o aplicando un conjunto de reglas (p. ej., si la glicina está junto a aminoácido neutro, la glicina sería codificada por un cierto codón, pero si está junto a un aminoácido polar, sería codificada por otro codón). Además de las sustituciones de codones (es decir, “optimización de codones”) los métodos de optimización de secuencia descritos en el presente documento comprenden etapas de optimización adicionales que no se dirigen estrictamente a la optimización de codones tales como la eliminación de motivos perjudiciales (sustitución de motivo desestabilizante). Las composiciones y formulaciones que comprenden estos ácidos nucleicos optimizados en secuencia (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para facilitar la expresión in vivo de la IL12 funcionalmente activa.

La expresión recombinante de moléculas grandes en cultivos celulares puede ser una tarea problemática con numerosas limitaciones (p. ej., pobres niveles de expresión de proteína, traducción detenida que da como resultado productos de expresión truncados, mal plegamiento de la proteína, etc.). Estas limitaciones se pueden reducir o evitar administrando los polinucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que codifican una IL12 funcionalmente activa o composiciones o formulaciones que comprenden la misma a un paciente que padece cáncer, de tal manera que la síntesis y suministro del polipéptido de IL12 para tratar el cáncer tiene lugar de forma endógena.

El cambio de un sistema de expresión in vitro (p. ej., cultivo celular) a la expresión in vivo requiere el rediseño de la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente terapéutico. El rediseño de una secuencia génica que ocurre naturalmente eligiendo diferentes codones sin alterar necesariamente la secuencia de aminoácidos codificada frecuentemente puede conducir a incrementos notables en los niveles de expresión de proteína (Gustafsson et al., 2004, Journal/Trends Biotechnol 22, 346-53). Las variables tales como el índice de adaptación de codones (CAI), estructuras secundarias de mRNA, secuencias cis-reguladoras, contenido de GC y muchas otras variables similares se ha mostrado que se correlacionan un poco con los niveles de expresión de proteína (Villalobos et al., 2006, “Journal/BMC Bioinformatics 7, 285). Sin embargo, debido a la degeneración del código genético, hay numerosas secuencias de ácido nucleico diferentes que pueden codificar todas el mismo agente terapéutico. Cada aminoácido es codificado por hasta seis codones sinónimos; y la elección entre estos codones influye en la expresión génica. Además, el uso de codones (es decir, la frecuencia con la cual diferentes organismos utilizan codones para expresar una secuencia de polipéptido) difiere entre los organismos (por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpos terapéuticos humanos o humanizados frecuentemente tiene lugar en cultivos de células de hámster).

En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser optimizada en secuencia aplicando un mapa de codones. La persona experta apreciará que las bases T en los mapas de codones descritos a continuación están presentes en el DNA, mientras que las bases T serían reemplazadas por bases U en los RNA correspondientes. Por ejemplo, un ácido nucleico optimizado en secuencia descrito en el presente documento en forma de DNA, p. ej., un vector o una plantilla de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U basado en su mRNA transcrito correspondiente. En este sentido, ambas secuencias de DNA optimizadas en secuencia (que comprenden T) y sus secuencias de RNA correspondientes (que comprenden U) se consideran ácido nucleico optimizado en secuencia de la presente descripción. Una experto también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes al reemplazar una o más bases con bases no naturales. De esta manera, p. ej., un codón TTC (mapa de DNA) correspondería a un codón UUC (mapa de RNA) que a su vez puede corresponder al codón ' ' C (mapa de RNA en el cual U se ha reemplazado con pseudouridina).

En un caso, una secuencia de referencia que codifica IL12A, IL12B, o tanto IL12A como IL12B se puede optimizar al reemplazar todos los codones que codifican un cierto aminoácido con únicamente uno de los codones alternativos proporcionados en un mapa de codones. Por ejemplo, todas las valinas en la secuencia optimizada serían codificadas por GTG o GTC o GTT.

Los polinucleótidos optimizados en secuencia de la descripción se pueden generar utilizando uno o más métodos de optimización de codones, o una combinación de los mismos. Los métodos de optimización de secuencia que se pueden utilizar para optimizar en secuencia las secuencias de ácido nucleico se describen en detalle en el presente documento. Esta lista de métodos no es exhaustiva o limitante.

Se apreciará que los principios y reglas de diseño descritas para cada uno de los métodos de optimización de secuencia discutidos a continuación se pueden combinar en muchas maneras diferentes, por ejemplo la optimización de secuencia de alto contenido de G/C para algunas regiones o la optimización de secuencia de contenido de uridina para otras regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia, así como las mutaciones de nucleótidos dirigidas para minimizar la estructura secundaria por toda la secuencia o para eliminar motivos perjudiciales.

La elección de las combinaciones potenciales de los métodos de optimización de secuencia puede depender, por ejemplo, de la química específica utilizada para producir un polinucleótido sintético. Tal elección también puede depender de las características de la proteína codificada por el ácido nucleico optimizado en secuencia, p. ej., una secuencia completa, un fragmento funcional, o una proteína de fusión que comprende IL12, etc. En algunos casos, tal elección puede depender del tejido o célula específica objetivo del ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., un mRNA sintético terapéutico).

Los mecanismos para combinar los métodos de optimización de secuencia o reglas de diseño derivadas de la aplicación y el análisis de los métodos de optimización pueden ser ya sea simples o complejos. Por ejemplo, la combinación puede ser:

(i) Secuencial; Cada método de optimización de secuencia o conjunto de reglas de diseño se aplica a una subsecuencia diferente de la secuencia total, por ejemplo reducción de uridina en las posiciones de codones ¹a 30 y luego selección de los codones de alta frecuencia para el resto de la secuencia;

(ii) Jerárquica; Varios métodos de optimización de secuencia o conjuntos de reglas de diseño se combinan en una forma determinista, jerárquica. Por ejemplo, el uso de los codones más ricos en GC, rompiendo uniones (que son comunes) al elegir los más frecuentes de esos codones.

(iii) Multifactorial/multiparamétrico; El aprendizaje automático u otras técnicas de modelización se utilizan para diseñar una sola secuencia que mejor satisface múltiples requisitos que solapan y posiblemente contradictorios. Este procedimiento requeriría el uso de un ordenador aplicando una serie de técnicas matemáticas, por ejemplo algoritmos genéticos.

Finalmente, cada uno de estos procedimientos puede dar como resultado un conjunto de reglas específicas que en muchos casos se pueden resumir en una sola tabla de codones, es decir, una lista clasificada de codones para cada aminoácido en la proteína objetivo (es decir, un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) con una regla específica o conjunto de reglas que indican cómo seleccionar un codón específico para cada posición de aminoácido.

a. Optimización del contenido de uridina

La presencia de altas concentraciones locales de uridina en una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales en la traducción, p. ej., traducción lenta o terminada prematuramente, especialmente cuando se usan análogos de uridina modificados en la producción de mRNA sintéticos. Además, el alto contenido de uridina también puede reducir la semivida in vivo de los mRNA sintéticos debido a la activación de TLR.

Por consiguiente, una secuencia de ácido nucleico se puede optimizar en secuencia utilizando un método que comprende al menos una etapa de optimización del contenido de uridina. Tal etapa comprende, p. ej., sustituir al menos un codón en el ácido nucleico de referencia por un codón alternativo para generar una secuencia modificada en uridina, en donde la secuencia modificada en uridina tiene al menos una de las siguientes propiedades:

(i) incremento o disminución en el contenido de uridina global;

(ii) incremento o disminución en el contenido de uridina local (es decir, los cambios en el contenido de uridina se limitan a subsecuencias específicas);

(iii) cambios en distribución de uridina sin alterar el contenido de uridina global;

(iv) cambios en la agrupación de uridinas (p. ej., número de agrupaciones, ubicación de agrupaciones o distancia entre las agrupaciones); o

(v) combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el procedimiento de optimización de secuencia comprende optimizar el contenido de uridina global, es decir, optimizar el porcentaje de nucleobases uridina en el ácido nucleico optimizado en secuencia con respecto al porcentaje de nucleobases de uridina en la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, 30% de nucleobases pueden ser uridinas en la secuencia de referencia y 10% de nucleobases pueden ser uridinas en el ácido nucleico optimizado en secuencia.

En algunos casos, el procedimiento de optimización de secuencia comprende reducir el contenido de uridina local en regiones específicas de una secuencia de ácido nucleico de referencia, es decir, reducir el porcentaje de nucleobases uridina en una subsecuencia del ácido nucleico optimizado en secuencia con respecto al porcentaje de nucleobases uridina en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de referencia puede tener una región del extremo 5' (p. ej., 30 codones) con un contenido de uridina local de 30%, y el contenido de uridina en la misma región se podría reducir a ¹⁰% en el ácido nucleico optimizado en secuencia.

En casos específicas, se pueden reemplazar codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia para reducir o modificar, por ejemplo, el número, tamaño, ubicación o distribución de agrupaciones de uridina que podrían tener efectos perjudiciales en la traducción de la proteína. Aunque como una regla general es deseable reducir el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia, en ciertos casos el contenido de uridina, y en particular el contenido de uridina local, de algunas subsecuencias de la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede incrementar.

La reducción del contenido de uridina para evitar efectos adversos en la traducción se puede hacer en combinación con otros métodos de optimización descritos aquí para lograr otros objetivos de diseño. Por ejemplo, la optimización del contenido de uridina se puede combinar con el diseño en rampa, puesto que utilizando los codones más raros para la mayoría de aminoácidos se reducirá, con unas pocas excepciones, el contenido de U.

En algunos casos, la secuencia modificada en uridina se diseña para inducir una respuesta del receptor similar a Toll (TLR) inferior cuando se compara con la secuencia de ácido nucleico de referencia. Varios TLR reconocen y responden a ácidos nucleicos. El RNA de doble cadena (ds), un constituyente viral frecuente, se ha mostrado que activa TLR3. Véase Alexopoulou et al. (2001) Nature, 413 :732-738 y Wang et al. (2004) Nat. Med., 10: 1366-1373. El RNA de una sola cadena (ss) activa T^lR7. Véase Diebold et al. (2004) Science 303 : 1529-1531. Los oligonucleótidos de RNA, p. ej. RNA con enlaces internucleótidos de fosforotioato, son ligandos de TLR⁸humano. Véase Heil et al. (2004) Science 303: 1526-1529. El DNA que contiene motivos CpG no metilados, característico del DNA bacteriano y viral, activa TLR9. Véase Hemmi et al. (2000) Nature, 408: 740 745.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “respuesta de TLR” se define como el reconocimiento del RNA de una sola cadena por un receptor TLR7, y en algunos casos abarca la degradación del RNA y/o respuestas fisiológicas causadas por el reconocimiento del RNA monocatenario por el receptor. Los métodos para determinar y cuantificar la unión de un RNA a un TLR7 son conocidos en la técnica. De manera similar, los métodos para determinar si un RNA ha activado una respuesta fisiológica mediada por TLR7 (p. ej., secreción de citocina) son bien conocidos en la técnica. En algunos casos, una respuesta de TLR puede ser mediada por TLR3, TLR⁸o TLR9 en lugar de TLR7.

La supresión de la respuesta mediada por TLR7 se puede realizar mediante la modificación de nucleósidos. El RNA experimenta más de cien modificaciones de nucleósidos diferentes en la naturaleza (véase la Base de Datos de Modificación de RNA, disponible en mods.rna.albany.edu). El rRNA humano, por ejemplo, tiene diez veces más pseudouridina ( ^ ) y 25 veces más nucleósidos 2'-O-metilados que el rRNA bacteriano. El mRNA bacteriano no contiene modificaciones de nucleósido, mientras que los mRNA de mamíferos tienen nucleósidos modificados tal como 5-metilcitidina (m5C), N⁶-metiladenosina (m⁶A), inosina y muchos nucleósidos 2'-O-metilados además de N7-metilguanosina (m7G).

El uracilo y la ribosa, las dos características que definen el RNA, son ambas necesarias y suficientes para la estimulación de TLR7, y el RNA de una sola cadena corto (ssRNA) actúa como agonistas de TLR7 en una manera independiente de secuencia siempre que contenga varias uridinas muy cercanas. Véase Diebold et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36:3256-3267. Por consiguiente, uno o más de los métodos de optimización descritos en el presente documento comprenden la reducción del contenido de uridina (localmente y/o localmente) y/o la reducción o modificación de la agrupación de uridinas para reducir o suprimir una respuesta mediada por TLR7.

En algunos casos, la respuesta de TLR (p. ej., una respuesta mediada por TLR7) causada por la secuencia modificada en uridina es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, o al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% menor que la respuesta de TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, la respuesta de TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia es al menos aproximadamente ¹vez, al menos aproximadamente ^1.1veces, al menos aproximadamente ^1.2veces, al menos aproximadamente 1.3 veces, al menos aproximadamente 1.4 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 1.6 veces, al menos aproximadamente 1.7 veces, al menos aproximadamente 1.8 veces, al menos aproximadamente 1.9 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente ⁶veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente ⁸veces, al menos aproximadamente 9 veces o al menos aproximadamente 10 veces más alta que la respuesta de TLR causada por la secuencia modificada en uridina.

En algunos casos, el contenido de uridina (contenido de uridina global promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es más alto que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunos casos, la secuencia modificada en uridina contiene al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% más uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En otros casos, el contenido de uridina (contenido de uridina global promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es menor que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunos casos, la secuencia modificada en uridina contiene al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% menos uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, el contenido de uridina (contenido de uridina global promedio) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en uridina es menor que 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22% 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, ⁸%, 7%, ⁶%, 5 %, 4%, 3%, 2% o 1% de las nucleobases totales en la secuencia modificada en uridina. En algunos casos, el contenido de uridina de la secuencia modificada en uridina está entre aproximadamente 10% y aproximadamente 20%. En algunos casos particulares, el contenido de uridina de la secuencia modificada en uridina está entre aproximadamente ¹²% y aproximadamente 16%.

En algunos casos, el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede medir utilizando una ventana de deslizamiento. En algunos casos, la longitud de la ventana de deslizamiento es de 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunos casos, la ventana de deslizamiento está por encima de 40 nucleobases en longitud. En algunos casos, la ventana de deslizamiento es de 20 nucleobases en longitud. Basado en el contenido de uridina medido con una ventana de deslizamiento, es posible generar un histograma que representa el contenido de uridina a lo largo de la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia y los ácidos nucleicos optimizados en secuencia.

En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para reducir o eliminar picos en el histograma que están por encima o por debajo de un cierto valor de porcentaje. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para eliminar picos en la representación de ventana de deslizamiento que están por encima de 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% o 30% de uridina. En otro caso, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar de modo que ninguno de los picos esté por encima de 30% de uridina en el ácido nucleico optimizado en secuencia, medido utilizando una ventana de deslizamiento de 20 nucleobases. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar de modo que no más o no menos que un número predeterminado de picos en la secuencia de ácido nucleico optimizado en secuencia, medido utilizando una ventana de deslizamiento de ²⁰nucleobases, esté por encima o por debajo de un cierto valor umbral. Por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar de modo que ninguno de los picos o no más de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9 o 10 picos en el ácido nucleico optimizado en secuencia esté por encima de 10%, 15%, 20%, 25% o 30% de uridina. En otro caso, el ácido nucleico optimizado en secuencia contiene entre 0 picos y 2 picos con contenido de uridina de 30% o más alto.

En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser optimizada en secuencia para reducir la incidencia de uridinas consecutivas. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas podrían ser codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluiría una agrupación de cuatro uridinas. Tal subsecuencia podría ser sustituida por CUGCUC, que efectivamente eliminaría la agrupación de uridina. Por consiguiente, una secuencia de ácido nucleico de referencia se puede optimizar en secuencia reduciendo o eliminando pares de uridinas (UU), tripletes de uridinas (UUU) o cuadrupletes de uridinas (UUUU). Las combinaciones de orden más alto de U no se consideran combinaciones de las combinaciones de orden más bajo. De esta manera, por ejemplo, UUUU se considera estrictamente un cuadruplete, no dos pares de U consecutivos; o UUUUUU se considera un sextuplete, no tres pares de U consecutivos, o dos tripletes de U consecutivos, etc.

En algunos casos, todos los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) se pueden eliminar de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otros casos, los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) se pueden reducir por debajo de un cierto umbral, p. ej., no más de 1,2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 apariciones en el ácido nucleico optimizado en secuencia. En un caso particular, el ácido nucleico optimizado en secuencia contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3, 2 o 1 pares de uridinas. En otro caso particular, el ácido nucleico optimizado en secuencia no contiene pares y/o tripletes de uridinas.

Los codones de fenilalanina, es decir, UUC o UUU, comprenden un par o tripletes de uridinas y por lo tanto la optimización en secuencia para reducir el contenido de uridina puede como máximo reducir el triplete de U de fenilalanina a un par de U de fenilalanina. En algunos casos, la aparición de pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) se refiere únicamente a pares o tripletes de U que no son de fenilalanina. Por consiguiente, en algunos casos, los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) que no son de fenilalanina se pueden reducir por debajo de un cierto umbral, p. ej., no más de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 apariciones en el ácido nucleico optimizado en secuencia. En un caso particular, el ácido nucleico optimizado en secuencia contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3, 2 o 1 o no contiene pares y/o tripletes de uridinas que no son de fenilalanina. En otro caso particular, el ácido nucleico optimizado en secuencia no contiene pares y/o tripletes de uridinas que no son de fenilalanina.

En algunos casos, la reducción en las combinaciones de uridinas (p. ej., pares, tripletes, cuadrupletes) en el ácido nucleico optimizado en secuencia se puede expresar como una reducción en porcentaje con respecto a las combinaciones de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia puede contener aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de pares de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia puede contener aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de tripletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia puede contener aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de cuadrupletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia puede contener aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de pares de uridinas que no son de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia puede contener aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de tripletes de uridinas que no son de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, el contenido de uridina en la secuencia optimizada en secuencia se puede expresar con respecto al contenido mínimo teórico de uridina en la secuencia. La expresión “contenido mínimo teórico de uridina” se define como el contenido de uridina de una secuencia de ácido nucleico como un porcentaje de la longitud de secuencia después de que todos los codones en la secuencia se han reemplazado con un codón sinónimo con el contenido de uridina más bajo. En algunos casos, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en secuencia es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural). En algunos aspectos, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en secuencia es aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, aproximadamente 150%, aproximadamente 155%, aproximadamente 160%, aproximadamente 165%, aproximadamente 170%, aproximadamente 175%, aproximadamente 180%, aproximadamente 185%, aproximadamente 190%, aproximadamente 195% o aproximadamente 200% del contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural).

En algunos casos, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en secuencia es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural).

La secuencia de ácido nucleico de referencia (p. ej., una secuencia de tipo natural) puede comprender agrupaciones de uridina que debido a su número, tamaño, ubicación, distribución o combinaciones de los mismos tienen efectos negativos en la traducción. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “agrupación de uridina” se refiere a una subsecuencia en una secuencia de ácido nucleico de referencia o secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia que contiene un contenido de uridina (usualmente descrito como un porcentaje) que está por encima de un cierto umbral. De esta manera, en ciertos casos, si una subsecuencia comprende más de aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% de contenido de uridina, tal subsecuencia sería considerada una agrupación de uridina.

Los efectos negativos de las agrupaciones de uridina pueden ser, por ejemplo, inducir una respuesta de TLR7.

De esta manera, en algunas implementaciones de los métodos de optimización de secuencia de ácido nucleico descritos en el presente documento es deseable reducir el número de agrupaciones, tamaño de agrupaciones, ubicación de agrupaciones (p. ej., cercanas al extremo 5' y/o 3' de una secuencia de ácido nucleico), la distancia entre agrupaciones, o distribución de agrupaciones de uridina (p. ej., un cierto patrón de agrupaciones a lo largo de una secuencia de ácido nucleico, distribución de agrupaciones con respecto a elementos de estructura secundarios en el producto expresado, o distribución de agrupaciones con respecto a la estructura secundaria de un mRNA).

En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos una agrupación de uridinas, en donde dicha agrupación de uridinas es una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia en donde el porcentaje de nucleobases uridina totales en dicha subsecuencia está por encima de un umbral predeterminado. En algunos casos, la longitud de la subsecuencia es al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 100 nucleobases. En algunos casos, la subsecuencia es más larga que 100 nucleobases. En algunos casos, el umbral es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% de contenido de uridina. En algunos casos, el umbral está por encima de 25%.

Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que comprende A, D, G, S y R podría ser codificada por la secuencia de ácido nucleico GCU, GAU, GGU, AGU, CGU. Aunque tal secuencia no contiene ningún par, triplete o cuadruplete de uridinas, un tercio de las nucleobases sería uridinas. Tal agrupación de uridinas podría ser eliminada usando codones alternativos, por ejemplo usando GCC, GAC, GGC, AGC y CGC, que no contendrían uridinas.

En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos una agrupación de uridinas, en donde dicha agrupación de uridinas es una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia en donde el porcentaje de nucleobases uridina de dicha subsecuencia se mide utilizando una ventana de deslizamiento que está por encima de un umbral predeterminado. En algunos casos, la longitud de la ventana de deslizamiento es 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunos casos, la ventana de deslizamiento está por encima de 40 nucleobases en longitud. En algunos casos, el umbral es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, ⁶%, 7%, ⁸%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% de contenido de uridina. En algunos casos, el umbral está por encima de 25%.

En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos dos agrupaciones de uridinas. En algunos casos, la secuencia modificada en uridina contiene menos agrupaciones ricas en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, la secuencia modificada en uridina contiene más agrupaciones ricas en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, la secuencia modificada en uridina contiene agrupaciones ricas en uridina que son más cortas en longitud que las agrupaciones ricas en uridina correspondientes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otros casos, la secuencia modificada en uridina contiene agrupaciones ricas en uridina que son más largas en longitud que la agrupación rica en uridina correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia.

Véase, Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kormann et al. (2010) Nature Biotechnology 29:154-157; o Sahin et al. (2014) Nature Reviews Drug Discovery | AOP, publicado en línea el 19 Septiembre de 2014m doi:10.1038/nrd4278.

b. Contenido de guanina/citosina (G/C)

Una secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser optimizada en secuencia utilizando los métodos que comprende alterar el contenido de guanina/citosina (G/C) (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Tal optimización puede comprender la alteración (p. ej., incremento o disminución) del contenido de G/C total (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia; la introducción de cambios locales en el contenido de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia (p. ej., incremento o disminución de G/C en regiones seleccionadas o subsecuencias en la secuencia de ácido nucleico de referencia); alteración de la frecuencia, tamaño y distribución de agrupaciones de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia, o combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B comprende un incremento total en el contenido de G/C (absoluto o relativo) con respecto al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, el incremento total en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es al

menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto al contenido G/C (absoluto o relativo)

de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B comprende una disminución total en el contenido de G/C (absoluto o relativo) con respecto al contenido de G/C de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, la disminución total en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto al contenido de G/C (absoluto o

relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12b comprende un incremento local en el contenido de guanina/citosina (G/C) (absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia modificada en G/C) con respecto al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente

en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, el incremento local en el contenido de G/C

(absoluto o relativo) es al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico

de referencia.

En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B comprende una disminución local en el contenido de guanina/citosina (G/C) (absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia modificada en G/C) con respecto al contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente

en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, la disminución local en el contenido de G/C

de referencia.

En algunos casos, el contenido de G/C (absoluto o relativo) se incrementa o se disminuye en una subsecuencia

que es de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o

¹⁰⁰nucleobases en longitud.

que es de al menos aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230,

240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540,

550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleobases en longitud.

que es de al menos aproximadamente 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100,

2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900 o 10000 nucleobases en longitud.

Los incrementos o disminuciones en el contenido de G y C (absoluto o relativo) descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo reemplazando codones sinónimos con bajo contenido de G/C con codones sinónimos que tienen contenido de G/C más alto, o viceversa. Por ejemplo, L tiene ⁶codones sinónimos: dos de ellos tienen 2 G/C (CUC, CUG), 3 tienen una sola G/C (UUG, CUU, CUA) y uno no tiene G/C (UUA). De esta manera si el ácido nucleico de referencia tiene un codón CUC en una cierta posición, el contenido de G/C en esa posición se podría reducir reemplazando CUC con cualquiera de los codones que tienen una sola G/C o el codón sin G/C.

Véase, las Publicaciones de EE. UU. N° US20140228558, US20050032730 A1; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46.

c. Frecuencia de Codones - Sesgo en el uso de codones

Numerosos métodos de optimización de codones conocidos en la técnica se basan en la sustitución de codones en una secuencia de ácido nucleico de referencia por codones que tienen más altas frecuencias. De esta manera, en algunos casos, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B descritos en el presente documento se puede optimizar en secuencia utilizando métodos que comprenden el uso de modificaciones en la frecuencia de uso de uno o más codones con respecto a otros codones sinónimos en el ácido nucleico optimizado en secuencia con respecto a la frecuencia de uso en la secuencia no optimizada en codones.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “frecuencia de codón” se refiere al sesgo en el uso de codones, es decir, las diferencias en la frecuencia de aparición de codones sinónimos en el DNA/RNA codificante. Generalmente se reconoce que las preferencias de codón reflejan un equilibrio entre sesgos mutacionales y la selección natural para la optimización de la traducción. Los codones óptimos ayudan a lograr velocidades de traducción más rápidas y alta precisión. Como resultado de estos factores, la selección de traducción se espera que sea más fuerte en genes altamente expresados. En el campo de la bioinformática y biología computacional, se han propuesto y utilizado muchos métodos estadísticos para analizar el sesgo en el uso de codones. Véase, p. ej., Comeron y Aguadé (1998) J. Mol. Evol. 47: 268-74. Métodos tales como la “frecuencia de codones óptimos” (Fop) (Ikemura (1981) J. Mol. Biol. 151 (3): 389-409), la adaptación relativa de codones (RCA) (Fox y Eril (2010) DNA Res. 17 (3): 185-96) o el “Índice de adaptación de codones (CAI) (Sharp y Li (1987) Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95) se utilizan para predecir niveles de expresión génica, mientras que métodos tales como el “número efectivo de codones” (Nc) y la entropía de Shannon de la teoría de la información se utilizan para medir la uniformidad en el uso de codones. Los métodos estadísticos multivariables, tales como el análisis de correspondencia y el análisis de componente principal, se utilizan ampliamente para analizar variaciones en el uso de codones entre los genes (Suzuki et al. (2008) DNA Res.

15 (⁶): 357-65; Sandhu et al., In Silico Biol. 2008;8(2): 187-92).

La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B descritos en el presente documento (p. ej., una secuencia de ácido nucleico de tipo natural, una secuencia de ácido nucleico mutante, una secuencia de ácido nucleico quimérica, etc., que puede ser, por ejemplo un mRNA) se puede optimizar en codones utilizando métodos que comprenden sustituir al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta o más baja en el conjunto de codones sinónimos; en donde el ácido nucleico optimizado en secuencia resultante tiene al menos una propiedad optimizada con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.

En algunos casos, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99% o 100% de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 75% de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica IL12 se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón mayor tiene la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otros casos, todos los codones alternativos que tienen una frecuencia de codón mayor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunos casos, todos los codones alternativos que tienen una frecuencia de codón menor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos específicos, al menos un codón alternativo tiene la segunda más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta frecuencia en el conjunto de codones sinónimos. En algunos casos específicos, al menos un codón alternativo tiene la segunda más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja frecuencia en el conjunto de codones sinónimos.

La optimización basada en la frecuencia de codón se puede aplicar globalmente, como se describe antes, o localmente a la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B. En algunos casos, cuando se aplica localmente, las regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia se pueden modificar basándose en la frecuencia de codón, sustituyendo todo o un cierto porcentaje de codones en una cierta subsecuencia por codones que tienen frecuencias más altas o más bajas en sus conjuntos de codones sinónimos respectivos. De esta manera, en algunos casos, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99% o 100% de los codones en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 75% de los codones en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón más alta que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y que tiene una frecuencia de codón mayor, tiene la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otros casos, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una menor frecuencia de codón tienen la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y que tiene una menor frecuencia de codón, tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunos casos, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una frecuencia de codón mayor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B puede comprender una subsecuencia que tiene una frecuencia de codón total más alta o más baja que la frecuencia de codón total en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia en una ubicación específica, por ejemplo en el extremo 5' o extremo 3' del ácido nucleico optimizado en secuencia, o dentro de una distancia predeterminada de esa región (p. ej., al menos 1,2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 codones del extremo 5' o extremo 3' del ácido nucleico optimizado en secuencia).

En algunos casos, un ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B puede comprender más de una subsecuencia que tiene una frecuencia de codón total más alta o más baja que la frecuencia de codón total en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Una experto entendería que las subsecuencias con frecuencias de codones totales más altas o más bajas globales se pueden organizar en innumerables patrones, dependiendo de si la frecuencia de codón total es más alta o más baja, la longitud de la subsecuencia, la distancia entre las subsecuencias, la ubicación de las subsecuencias, etc.

Véase, las Patentes de EE. UU. N° US5082767, US8126653, US7561973, US8401798; las Publicaciones de EE. UU. N° 20080046192, US 20080076161; la Publicación Internacional N° WO2000018778; Welch et al. (2009) PLoS ONE 4(9): e7002; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46; Chung et al. (2012) BMC Systems Biology ⁶: 134.

d. Sustitución de motivos desestabilizantes

Hay una variedad de motivos que pueden afectar a la optimización de secuencia, que caen en varias categorías no exclusivas, por ejemplo:

(i) Motivos basados en secuencia primaria: Motivos definidos por una simple disposición de nucleótidos.

(ii) Motivos estructurales: Motivos codificados por una disposición de nucleótidos que tiende a formar una cierta estructura secundaria.

(iii) Motivos locales: Motivos codificados en una subsecuencia contigua.

(iv) Motivos distribuidos: Motivos codificados en dos o más subsecuencias inconexas.

(v) Motivos ventajosos: Motivos que mejoran la estructura o función de nucleótidos.

(vi) Motivos desventajosos: Motivos con efectos perjudiciales en la estructura o función de nucleótidos.

Hay muchos motivos que encajan en la categoría de motivos desventajosos. Algunos ejemplos incluyen, por ejemplo, motivos de enzimas de restricción, que tienden a ser relativamente cortos, secuencias exactas tales como los motivos de sitios de restricción para Xba1 (TCTAGA (SEQ ID NO: 224)), EcoRI (GAATTC (SEQ ID NO: 225)), EcoRII (CCWGG (SEQ ID NO: 226), en donde W significa A o T, según los códigos de ambigüedad de IUPAC) o HindIII (AAGCTT (SEQ ID NO: 227)); sitios de enzima, que tienden a ser más largos y basados en secuencia consenso no exacta, tal como en la RNA polimerasa T7 (GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD (SEQ ID NO: 228), en donde n significa cualquier nucleótido, R significa A o G, W significa A o T, D significa A o G o T pero no C); motivos estructurales, tales como repeticiones de GGGG (SEQ ID NO: 229) (Kim et al. (1991) Nature 351 (6324):331-2); u otros motivos tales como repeticiones de tripletes CUG (Querido et al. (2014) J. Cell Sci. 124: 1703-1714).

Por consiguiente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B descritos en el presente documento se pueden optimizar en secuencia utilizando métodos que comprenden la sustitución de al menos un motivo desestabilizante en una secuencia de ácido nucleico de referencia, y la eliminación de tal motivo desventajoso o reemplazo con un motivo ventajoso.

En algunos casos, el procedimiento de optimización comprende identificar motivos ventajosos y/o desventajosos en la secuencia de ácido nucleico de referencia, en donde tales motivos son, p. ej., subsecuencias específicas que pueden causar una pérdida de estabilidad en la secuencia de ácido nucleico de referencia antes o durante el procedimiento de optimización. Por ejemplo, la sustitución de bases específicas durante la optimización puede generar una subsecuencia (motivo) reconocido por una enzima de restricción. Por consiguiente, durante el procedimiento de optimización la aparición de motivos desventajosos se puede vigilar comparando la secuencia optimizada en secuencia con una biblioteca de motivos conocidos que son desventajosos. Luego, la identificación de motivos desventajosos se podría usar como un filtro a posteriori, es decir, para determinar si una cierta modificación que potencialmente podría ser introducida en la secuencia de ácido nucleico de referencia debe ser realmente implementada o no.

En algunos casos, la identificación de motivos desventajosos se puede utilizar antes de la aplicación de los métodos de optimización de secuencia descritos en el presente documento, es decir, la identificación de motivos en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y su sustitución por secuencias de ácido nucleico alternativas se pueden utilizar como una etapa de pre-procesamiento, por ejemplo, antes de la reducción de uridina.

En otros casos, la identificación de motivos desventajosos y su eliminación se utiliza como una técnica de optimización de secuencia adicional integrada en un método de optimización de ácido nucleico multiparamétrico que comprende dos o más de los métodos de optimización de secuencia descritos en el presente documento. Cuando se utiliza de este forma, un motivo desventajoso identificado durante el procedimiento de optimización sería eliminado, por ejemplo, sustituyendo el número más bajo posible de nucleobases con el fin de preservar tan estrechamente como sea posible el(los) principio(s) de diseño original (p. ej., baja U, alta frecuencia, etc.).

Véase, p. ej., las Publicaciones de EE. UU. N° US20140228558, US20050032730 o US20140228558.

e. Optimización del conjunto de codones limitada

En algunos casos particulares, la optimización de secuencia de una secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se puede llevar a cabo utilizando un conjunto de codones limitado, p. ej., un conjunto de codones en donde se utiliza menos que el número nativo de codones para codificar los ²⁰aminoácidos naturales, un subconjunto de los ²⁰aminoácidos naturales, o un conjunto expandido de aminoácidos que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales.

El código genético es muy similar entre todos los organismos y se puede expresar en una tabla simple con 64 entradas que codificarían los ²⁰aminoácidos convencionales implicados en la traducción de proteína más los codones de inicio y de detención. El código genético es degenerado, es decir, en general, más de un codón determina cada aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido leucina está determinado por los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA o CUG, mientras que el aminoácido serina está determinado por los codones UCA, UCG, UCC, UCU, AGU o AGC (diferencia en la primera, segunda o tercera posición). Los códigos genéticos nativos comprenden 62 codones que codifican aminoácidos que se encuentran de forma natural. De esta manera, en algunos casos de los métodos descritos en el presente documento los conjuntos de codones optimizados (códigos genéticos) que comprenden menos de 62 codones para codificar ²⁰aminoácidos pueden comprender 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 codones.

En algunos casos, el conjunto de codones limitado comprende menos de 20 codones. Por ejemplo, si una proteína contiene menos de ²⁰tipos de aminoácidos, tal proteína podría ser codificada por un conjunto de codones con menos de 20 codones. Por consiguiente, en algunos casos, un conjunto de codones optimizado comprende tantos codones como tipos diferentes de aminoácidos están presentes en la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunos casos, el conjunto de codones optimizado comprende 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3, 2 o incluso 1 codón.

En algunos casos, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr y Val, es decir, aminoácidos que son codificados de forma natural por más de un codón, es codificado con menos codones que el número de codones sinónimos que se encuentran de forma natural. Por ejemplo, en algunos casos, la Ala puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 3, 2 o 1 codones; la Cys puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; el Asp puede ser codificado en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; el Glu puede ser codificado en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; la Phe puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; la Gly puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 3 codones, 2 codones o 1 codón; la His puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por ¹codón; la Ile puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 2 codones o 1 codón; la Lys puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; la Leu puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; la Asn puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; la Pro puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 3 codones, 2 codones o 1 codón; la Gln puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 1 codón; la Arg puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; la Ser se puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; el Thr puede ser codificado en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 3 codones, 2 codones o 1 codón; la Val puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por 3 codones, 2 codones o 1 codón; y la Tyr puede ser codificada en el ácido nucleico optimizado en secuencia por ¹codón.

En algunos casos, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr y Val, es decir, aminoácidos que son codificados de forma natural por más de un codón, es codificado por un solo codón en el conjunto limitado de codones.

En algunos casos específicos, el ácido nucleico optimizado en secuencia es un DNA y el conjunto de codones limitado consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de 20 aminoácidos. En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia es un DNA y el conjunto de codones limitado comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GCT, GCC, GCA y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG; al menos un codón seleccionado de AAT o ACC; al menos un codón seleccionado de GAT o GAC; al menos un codón seleccionado de TGT o TGC; al menos un codón seleccionado de CAA o CAG; al menos un codón seleccionado de GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGT, GGC, GGA y GGG; ala menos un codón seleccionado de CAT o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ATT, ATC, y ATA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TTA, TTG, c Tt , CTC, CTA y CTG; al menos un codón seleccionado de AAA o AAG; un codón ATG; al menos un codón seleccionado de TTT o TTC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCT, CCC, CCA y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TCT, TCC, TCA, TCG, AGT y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACT, ACC, ACA y ACG; un codón TGG; al menos un codón seleccionado de TAT o TAC; y al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GTT, GTC, GTA y GTG.

En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia es un RNA (p. ej., un mRNA) y el conjunto de codones limitado consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de los 20 aminoácidos. En algunos casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia es un RNA y el conjunto de codones limitado comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GCU, GCC, GCA y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG; al menos un codón seleccionado de AAU o ACC; al menos un codón seleccionado de GAU o GAC; al menos un codón seleccionado de UGU o UGC; al menos un codón seleccionado de CAA o CAG; al menos un codón seleccionado de GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGU, GGC, GGA y GGG; al menos un codón seleccionado de CAU o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en AUU, AUC, y AUA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UUA, UUG, CUU, CUC, CUA y CUG; al menos un codón seleccionado de AAA o AAG; un codón AUG; al menos un codón seleccionado de ^uU^uo UUC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCU, CCC, CCA y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UCU, UCC, UCA, UCG, AGU y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACU, ACC, ACA y ACG; un codón UGG; al menos un codón seleccionado de UAU o UAC; y al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GUU, GUC, GUA y GUG.

En algunos casos específicos, el conjunto de codones limitado se ha optimizado para la expresión in vivo de un ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., un mRNA sintético) después de la administración a un cierto tejido o célula.

En algunos casos, el conjunto de codones optimizado (p. ej., un conjunto de 20 codones que codifica 20 aminoácidos) cumple al menos una de las siguientes propiedades:

(i) el conjunto de codones optimizado tiene un contenido de G/C promedio más alto que el conjunto de codones original o nativo; o

(ii) el conjunto de codones optimizado tiene un contenido de U promedio más bajo que el conjunto de codones original o nativo; o

(iii) el conjunto de codones optimizado está compuesto de codones con la frecuencia más alta; o

(iv) el conjunto de codones optimizado está compuesto de codones con la frecuencia más baja; o

(v) una combinación de los mismos.

En algunos casos específicos, al menos un codón en el conjunto de codones optimizado tiene la segunda más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta frecuencia en el conjunto de codones sinónimos. En algunos casos específicos, al menos un codón en el codón optimizado tiene la segunda más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja frecuencia en el conjunto de codones sinónimos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “conjunto de codones nativo” se refiere a un conjunto de codones utilizado de forma nativa por el organismo fuente para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “conjunto de codones original” se refiere al conjunto de codones utilizado para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia antes del comienzo de la optimización de secuencia, o a un conjunto de codones utilizado para codificar una variante optimizada de la secuencia de ácido nucleico de referencia en el comienzo de una nueva iteración de optimización cuando la optimización de secuencia se aplica de forma iterativa o recursiva.

En algunos casos, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de codones en el conjunto de codones son aquellos con la más alta frecuencia. En otros casos, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de codones en el conjunto de codones son aquellos con la frecuencia más baja.

En algunos casos, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de codones en el conjunto de codones son aquellos con el contenido de uridina más alto. En algunos casos, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de codones en el conjunto de codones son aquellos con el contenido de uridina más bajo.

En algunos casos, el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones es 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% más alto que el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunos casos, el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones es 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% menor que el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.

En algunos casos, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% más alto que el contenido de uracilo promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunos casos, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% más bajo que el contenido de uracilo promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.

Véase también la Publicación de Solicitud de EE. UU. N° 2011/0082055 y la Publicación Internacional N° WO2000018778.

10. Caracterización de ácidos nucleicos optimizados en secuencia

En algunos casos de la descripción, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que comprende un ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., un ORF) descrito en el presente documento que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se puede ensayar para determinar si al menos una propiedad de la secuencia de ácido nucleico (p. ej., estabilidad cuando se expone a nucleasas) o propiedad de expresión se ha mejorado con respecto al ácido nucleico no optimizado en secuencia.

Como se utiliza en el presente documento, “propiedad de expresión” se refiere a una propiedad de una secuencia de ácido nucleico ya sea in vivo (p. ej., eficacia de traducción de un mRNA sintético después de la administración a un sujeto que lo necesite) o in vitro (p. ej., eficacia de traducción de un mRNA sintético ensayado en un sistema de modelo in vitro). Las propiedades de expresión incluyen pero no están limitadas a la cantidad de proteína producida por un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B después de la administración, y la cantidad de proteína soluble o de otra manera funcional producida. En algunos casos, los ácidos nucleicos optimizados en secuencia descritos en el presente documento se pueden evaluar según la viabilidad de las células que expresan una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B descritos en el presente documento.

En un caso particular, una pluralidad de ácidos nucleicos optimizados en secuencia descritos en el presente documento (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que contiene sustituciones de codones con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia no optimizada se puede caracterizar funcionalmente para medir una propiedad de interés, por ejemplo, una propiedad de expresión en un sistema de modelo in vitro, o in vivo en un tejido o célula objetivo.

a. Optimización de las propiedades intrínsecas de la secuencia de ácido nucleico

En algunos casos de la descripción, la propiedad deseada del polinucleótido es una propiedad intrínseca de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) se puede optimizar en secuencia para la estabilidad in vivo o in vitro. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos se puede optimizar en secuencia para la expresión en un tejido o célula objetivo particular. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en secuencia para incrementar su vida en el plasma previniendo su degradación por endo y exonucleasas.

En otros casos, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en secuencia para incrementar su resistencia a la hidrólisis en solución, por ejemplo, para alargar el tiempo que el ácido nucleico optimizado en secuencia o una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico optimizado en secuencia se puede almacenar en condiciones acuosas con degradación mínima.

En otros casos, el ácido nucleico optimizado en secuencia se puede optimizar para incrementar su resistencia a la hidrólisis en condiciones de almacenamiento en seco, por ejemplo, para alargar el tiempo que el ácido nucleico optimizado en secuencia se puede almacenar después de la liofilización con degradación mínima.

b. Secuencia de ácidos nucleicos optimizada para la expresión de proteína

En algunos casos de la descripción, la propiedad deseada del polinucleótido es el nivel de expresión de un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B codificados por una secuencia de optimizada en secuencia descrita en el presente documento. Los niveles de expresión de proteínas se pueden medir utilizando uno o más sistemas de expresión. En algunos casos, la expresión se puede medir en sistemas de cultivo celular, p. ej., células CHO o células HEK293. En algunos casos, la expresión se puede medir utilizando sistemas de expresión in vitro preparados a partir de extractos de células vivas, p. ej., lisados de reticulocitos de conejo, o sistemas de expresión in vitro preparados mediante el ensamblaje de componentes individuales purificados. En otros casos, la expresión de proteína se mide en un sistema in vivo, p. ej., ratón, conejo, mono, etc.

En algunos casos, puede ser deseable la expresión de proteína en forma de solución. Por consiguiente, en algunos casos, una secuencia de referencia se puede optimizar en secuencia para producir una secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia que tiene niveles optimizados de proteínas expresadas en forma soluble. Los niveles de expresión de proteína y otras propiedades tales como solubilidad, niveles de agregación y la presencia de productos de truncamiento (es decir, fragmentos debido a la proteólisis, hidrólisis o traducción defectuosa) se puede medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando electroforesis (p. ej., PAGE nativa o SDS-PAGE) o métodos cromatográficos (p. ej., HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño, etc.).

c. Optimización del tejido objetivo o viabilidad de las células objetivo

En algunos casos, la expresión de proteínas terapéuticas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales en el tejido o célula objetivo, reduciendo el rendimiento de proteína, o reduciendo la calidad del producto expresado (p. ej., debido a la presencia de fragmentos de proteína o precipitación de la proteína expresada en cuerpos de inclusión) o causando toxicidad.

Por consiguiente, en algunos casos de la descripción, la optimización de secuencia de una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, p. ej., una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, se puede utilizar para incrementar la viabilidad de células objetivo que expresan la proteína codificada por el ácido nucleico optimizado en secuencia.

La expresión de proteínas heterólogas también puede ser perjudicial para las células transfectadas con una secuencia de ácido nucleico para trasplante autólogo o heterólogo. Por consiguiente, en algunos casos de la presente descripción la optimización en secuencia de una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento se puede utilizar para incrementar la viabilidad de células objetivo que expresan la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia. Los cambios en la viabilidad de células o tejidos, toxicidad y otra reacción fisiológica se puede medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

d. Reducción de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria

En algunos casos, la administración de un ácido nucleico optimizado en secuencia que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B o un fragmento funcional del mismo puede activar una respuesta inmunitaria, que podría ser causada por (i) el agente terapéutico (p. ej., un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B), o (ii) el producto de expresión de tal agente terapéutico (p. ej., el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión IL12A e IL12B codificados por el mRNA) o (iv) una combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunos casos de la presente descripción, la optimización en secuencia de la secuencia de ácido nucleico (p. ej., un mRNA) descrita en el presente documento se puede utilizar para disminuir una respuesta inmunitaria o inflamatoria activada por la administración de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión IL12A e IL12B o por el producto de expresión de IL12A, IL12B y/o fusión de IL12A e IL12B codificadas por tal ácido nucleico.

En algunos aspectos, una respuesta inflamatoria se puede medir detectando niveles incrementados de una o más citocinas inflamatorias utilizando métodos conocidos en la técnica, p. ej., ELISA. La expresión “citocina inflamatoria” se refiere a citocinas que se elevan en una respuesta inflamatoria. Ejemplos de citocinas inflamatorias incluyen interleucina^-6(IL-⁶), ligando de CXCL1 (quimiocina (motivo C-X-C) 1; también conocido como GROa, interferón-Y (IFNy), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína inducida por interferón y 10 (IP-10) o factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). La expresión citocinas inflamatorias incluye también otras citocinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, p. ej., interleucina^-1(TL-1), interleucina^-8(TL-⁸), interleucina-13 (11-13), interferón a (IFN-a), etc.

11. Secuencias de nucleótidos modificadas que codifican polipéptidos de IL12

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) de la descripción comprende una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo. En algunos casos, el mRNA es una secuencia modificada en uracilo que comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12b e IL12A, en donde el mRNA comprende una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo.

En ciertos aspectos de la descripción, cuando la base 5-metoxiuracilo se conecta a un azúcar de ribosa, como es en los polinucleótidos, el nucleósido o nucleótido modificado resultante se denomina 5-metoxiuridina. En algunos casos, el uracilo en el polinucleótido es al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o aproximadamente 100% 5-metoxiuracilo. En un caso, el uracilo en el polinucleótido es al menos 95% 5-metoxiuracilo. En otro caso, el uracilo en el polinucleótido es 100% 5-metoxiuracilo.

En casos donde el uracilo en el polinucleótido es al menos 95% 5-metoxiuracilo, el contenido de uracilo total se puede ajustar tal que un mRNA proporciona niveles de expresión de proteína adecuados mientras que induce poca o nada de respuesta inmunitaria. En algunos casos, el contenido de uracilo del ORF (% U^{t m}) está entre aproximadamente 105% y aproximadamente 145%, aproximadamente 105% y aproximadamente 140%, aproximadamente 110% y aproximadamente 140%, aproximadamente 110% y aproximadamente 145%, aproximadamente 115% y aproximadamente 135%, aproximadamente 105% y aproximadamente 135%, aproximadamente 110% y aproximadamente 135%, aproximadamente 115% y aproximadamente 145% o aproximadamente 115% y aproximadamente 140%. En otros casos, el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente 117% y aproximadamente 134% o entre 118% y 132% del % U^{t m}. En algunos casos, el % U^{t m}es aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, o aproximadamente 150%. En este contexto, el término “uracilo” puede referirse a 5-metoxiuracilo y/o uracilo que se encuentra de forma natural.

En algunos casos, el contenido de uracilo en el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción es menor que aproximadamente 50%, aproximadamente 40%, aproximadamente 30% o aproximadamente 20% del contenido total de nucleobases en el ORF. En algunos casos, el contenido de uracilo en el ORF está entre aproximadamente 15% y aproximadamente 25% del contenido total de nucleobases en el ORF. En otros casos, el contenido de uracilo en el ORF está entre aproximadamente 20% y aproximadamente 30% del contenido total de nucleobases en el ORF. En un caso, el contenido de uracilo en el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B es menor que aproximadamente 20% del contenido total de nucleobases en el marco de lectura abierto. En este contexto, el término “uracilo” puede referirse a 5-metoxiuracilo y/o uracilo que se encuentra de forma natural.

En casos adicionales, el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B que tienen 5-metoxiuracilo y el contenido de uracilo ajustado, ha incrementado el contenido de citosina (C), guanina (G) o guanina/citosina (G/C) (absoluto o relativo). En algunos casos, el incremento total en el contenido de C, G o G/C (absoluto o relativo) del ORF es al menos aproximadamente ²%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 4%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente ⁶%, al menos aproximadamente 7%, al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto al contenido de G/C (absoluto o relativo) del ORF de tipo natural. En algunos casos, el contenido de G, C o de G/C en el ORF es menor que aproximadamente 100%, menor que aproximadamente 90%, menor que aproximadamente 85% o menor que aproximadamente 80% del contenido máximo teórico de G, C o G/C de la secuencia de nucleótidos de tipo natural correspondiente que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B (% G^{t m x}; % C^{t m x}o % G/C^{t m x}). En otros casos, el contenido de G, C o G/C en el ORF está entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, entre aproximadamente 71% y aproximadamente 79%, entre aproximadamente 71% y aproximadamente 78% o entre aproximadamente 71% y aproximadamente 77% del % G^{t m x}; % C^{t m x}o % G/C^{t m x}. En algunos casos, los incrementos en el contenido de G y/o C (absoluto o relativo) descrito en el presente documento se puede llevar a cabo reemplazando codones sinónimos con bajo contenido de G, C o G/C con codones sinónimos que tienen contenido más alto de G, C o G/C. En otros casos, el incremento en el contenido de G y/o C (absoluto o relativo) se lleva a cabo reemplazando un codón que termina con U con un codón sinónimo que termine con G o C.

En casos adicionales, el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción comprende 5-metoxiuracilo y tiene un contenido de uracilo ajustado que contiene menos pares de uracilos (UU) y/o tripletes de uracilos (^uU^u) y/o cuadrupletes de uracilos (UUUU) que la secuencia de nucleótidos de tipo natural correspondiente que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B. En algunos casos, el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL¹²A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción no contiene pares de uracilos y/o tripletes de uracilos y/o cuadrupletes de uracilos. En algunos casos, los pares de uracilos y/o tripletes de uracilos y/o cuadrupletes de uracilos se reducen por debajo de un cierto umbral, p. ej., no más de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 apariciones en el ORF del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B. En un caso particular, el ORF del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción contienen menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, ⁸, 7, ⁶, 5, 4, 3, 2 o 1 pares y/o tripletes de uracilos que no son de fenilalanina. En otro caso, el ORF del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B no contiene pares y/o tripletes de uracilos que no son de fenilalanina.

En casos adicionales, el ORF del mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción comprende 5-metoxiuracilo y tiene un contenido de uracilo ajustado que contiene menos agrupaciones ricas en uracilo que la secuencia de nucleótidos de tipo natural correspondiente que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B. En algunos casos, el o Rf del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B de la descripción contiene agrupaciones ricas en uracilo que son más cortas en longitud que las agrupaciones ricas en uracilo correspondientes en la secuencia de nucleótidos de tipo natural correspondiente que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B.

En casos adicionales, se emplean codones de menor frecuencia alternativos. Al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, menos aproximadamente 99% o 100% de los codones en el ORF del mRNA que comprende 5-metoxiuracilo que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos. El ORF también tiene contenido de uracilo ajustado, como se describe antes. En algunos casos, al menos un codón en el ORF del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.

En algunos casos, el ORF del mRNA que comprende 5-metoxiuracilo que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, de contenido de uracilo ajustado, presenta niveles de expresión de ⁱL¹²cuando se administra a una célula de mamífero que son más altos que los niveles de expresión de IL12 del mRNA de tipo natural correspondiente. En otros casos, los niveles de expresión de IL12 cuando se administran a una célula de mamífero se incrementan con respecto a un mRNA correspondiente que contiene al menos 95% de 5-metoxiuracilo y que tiene un contenido de uracilo de aproximadamente 160%, aproximadamente 170%, aproximadamente 180%, aproximadamente 190% o aproximadamente 200% del mínimo teórico. En otros casos más, los niveles de expresión de IL12 cuando se administra a una célula de mamífero se incrementan con respecto a un mRNA correspondiente, en donde al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100% de uracilos son 1-metilpseudouracilo o pseudouracilos. En algunos casos, la célula de mamífero es una célula de ratón, una célula de rata o una célula de conejo. En otros casos, la célula de mamífero es una célula de mono o una célula de ser humano. En algunos casos, la célula de ser humano es una célula HeLa, una célula de fibroblasto BJ, o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). En algunos casos, la IL12 se expresa cuando el mRNA se administra a una célula de mamífero in vivo. En algunos casos, el mRNA se administra a ratones, conejos, ratas, monos o seres humanos. En un caso, los ratones son ratones nulos. En algunos casos, el mRNA se administra a ratones en una cantidad de aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg o aproximadamente 0.15 mg/kg. En algunos casos, el mRNA se administra por vía intravenosa o intramuscular. En otros casos, el polipéptido de IL12 se expresa cuando el mRNA se administra a una célula de mamífero in vitro. En algunos casos, la expresión se incrementa en al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1500 veces o al menos aproximadamente 3000 veces. En otros casos, la expresión se incrementa en al menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o aproximadamente ¹⁰⁰%.

En algunos casos, el ORF del mRNA que comprende 5-metoxiuracilo que codifica el polipéptido de IL12A, el polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, de contenido de uracilo ajustado, presenta estabilidad incrementada. En algunos casos, el mRNA presenta estabilidad incrementada en una célula con respecto a la estabilidad de un mRNA de tipo natural correspondiente en las mismas condiciones. En algunos casos, el mRNA presenta estabilidad incrementada que incluye resistencia a nucleasas, estabilidad térmica y/o estabilización incrementada de la estructura secundaria. En algunos casos, la estabilidad incrementada, presentada por el mRNA se mide determinando la semivida del mRNA (p. ej., en un plasma, célula o muestra de tejido) y/o determinando el área bajo la curva (AUC) de la expresión de proteína por el mRNA a lo largo del tiempo (p. ej., in vitro o in vivo). Un mRNA se identifica como que tiene estabilidad incrementada si la semivida y/o la a Uc es mayor que la semivida y/o la AUC de un mRNA de tipo natural correspondiente en las mismas condiciones.

En algunos casos, el mRNA de la presente descripción induce una respuesta inmunitaria detectablemente inferior (p. ej., innata o adquirida) con respecto a la respuesta inmunitaria inducida por un mRNA de tipo natural correspondiente en las mismas condiciones. En otros casos, el mRNA de la presente descripción induce una respuesta inmunitaria detectablemente inferior (p. ej., innata o adquirida) con respecto a la respuesta inmunitaria inducida por un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B pero no comprende 5-metoxiuracilo en las mismas condiciones, o con respecto a la respuesta inmunitaria inducida por un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y que comprende 5-metoxiuracilo pero que no tiene contenido de uracilo ajustado en las mismas condiciones. La respuesta inmunitaria innata se puede poner de manifiesto mediante la expresión incrementada de citocinas proinflamatorias, activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc.), muerte celular y/o terminación o reducción en la traducción de proteína. En algunos casos, una reducción en la respuesta inmunitaria innata se puede medir mediante el nivel de expresión o actividad de interferones Tipo 1 (p. ej., IFN-a, IFN-p, IFN-^k, ⁱFⁿ-⁸, IFN-^e, IFN-^t, IFN-^u> e IFN-Z) o la expresión de genes regulados por interferón tales como los receptores similares a toll (p. ej., TLR7 y TLR⁸) y/o mediante la muerte celular disminuida después de una o más administraciones del mRNA de la descripción en una célula.

En algunos casos, la expresión de interferones de Tipo 1 por una célula de mamífero en respuesta al mRNA de la presente descripción se reduce en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ⁸⁰%, 90%, 95%, 99%, 99.9% o más de 99.9% con respecto a un mRNA de tipo natural correspondiente, a un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, pero no comprende 5-metoxiuracilo, o a un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y que comprende 5-metoxiuracilo pero que no tiene contenido de uracilo ajustado. En algunos casos, el interferón es FN-p. En algunos casos, la frecuencia de muerte celular causada por la administración de mRNA de la presente descripción a una célula de mamífero es 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o por encima de 95% menor que la frecuencia de muerte celular observada con un mRNA de tipo natural correspondiente, un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B pero no comprende 5-metoxiuracilo, o un mRNA que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B y que comprende 5-metoxiuracilo pero que no tiene el contenido de uracilo ajustado. En algunos casos, la célula de mamífero es una célula de fibroblasto BJ. En otros casos, la célula de mamífero es un esplenocito. En algunos casos, la célula de mamífero es la de un ratón o una rata. En otros casos, la célula de mamífero es la de un ser humano. En un caso, el mRNA de la presente descripción no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula de mamífero en la cual se introduce el mRNA.

En algunos casos, el polinucleótido es un mRNA que comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B, en donde el uracilo en el mRNA es al menos aproximadamente 95% 5-metoxiuracilo, en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente 115% y aproximadamente 135% del contenido mínimo teórico de uracilo en el ORF de tipo natural correspondiente, y en donde el contenido de uracilo en el ORF que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B es menor que aproximadamente 30% del contenido total de nucleobases en el ORF. En algunos casos, el ORF que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B además se modifica para incrementar el contenido de G/C del ORF (absoluto o relativo) en al menos aproximadamente 40%, comparado con el ORF de tipo natural correspondiente. En todavía algunos casos, el ORF que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B contiene menos de 20 pares y/o tripletes de uracilos que no son de fenilalanina. En algunos casos, al menos un codón en el ORF del mRNA que codifica el polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B además se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos. En algunos casos, la expresión del polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B codificados por un mRNA que comprende un ORF en donde el uracilo en el mRNA es al menos aproximadamente 95% 5-metoxiuracilo, y en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente 115% y aproximadamente 135% del contenido de uracilo mínimo teórico en el ORF de tipo natural correspondiente, se incrementa en al menos aproximadamente 10 veces cuando se compara con la expresión del polipéptido de IL12A, polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B a partir del mRNA de tipo natural correspondiente. En algunos casos, el mRNA comprende un ORF abierto en donde el uracilo en el mRNA es al menos aproximadamente 95% 5-metoxiuracilo, y en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente 115% y aproximadamente 135% del contenido de uracilo mínimo teórico del ORF de tipo natural correspondiente, y en donde el mRNA no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula de mamífero en la cual se introduce el mRNA.

12. Métodos para modificar polinucleótidos

La descripción incluye polinucleótidos modificados que comprenden un polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B). Los polinucleótidos modificados se pueden modificar químicamente y/o modificar estructuralmente. Cuando los polinucleótidos de la presente descripción se modifican química y/o estructuralmente los polinucleótidos se pueden denominar “polinucleótidos modificados”.

La presente descripción proporciona nucleósidos y nucleótidos modificados de un polinucleótido (p. ej., polinucleótidos RNA, tales como polinucleótidos mRNA) que codifican un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B. Un “nucleósido” se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (p. ej., una pentosa o ribosa) o un derivado de la misma en combinación con una base orgánica (p. ej., una purina o pirimidina) o derivado de la misma (también denominada en el presente documento “nucleobase”). Un “nucleótido” se refiere a un nucleósido que incluye un grupo de fosfato. Los nucleótidos modificados se pueden sintetizar por cualquier método útil, tal como, por ejemplo, químico, enzimático o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos modificados o no naturales. Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos unidos. Tales regiones pueden tener enlaces de cadena principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces de fosfodiéster estándar, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.

Los polinucleótidos modificados descritos en el presente documento pueden comprender varias modificaciones distintas. En algunos casos, los polinucleótidos modificados contienen uno, dos o más (opcionalmente diferentes) modificaciones de nucleósido o nucleótido. En algunos casos, un polinucleótido modificado, introducido en una célula puede presentar una o más propiedades deseables, p. ej., expresión de proteína mejorada, inmunogenicidad reducida o degradación reducida en la célula, comparado con un polinucleótido no modificado.

a. Modificaciones estructurales

En algunos casos, un polinucleótido de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) se modifica estructuralmente. Como se utiliza en el presente documento una modificación “estructural” es una en la cual dos o más nucleósidos unidos se insertan, se eliminan, se duplican, se invierten o se aleatorizan en un polinucleótido sin modificación química significativa para los nucleótidos por sí mismos. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de una naturaleza química y por consiguiente son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido “ATCG (SEQ ID NO: 230)” se puede modificar químicamente a “AT-5meC-G”. El mismo polinucleótido se puede modificar estructuralmente de “ATCG (SEQ ID NO: 230)” a “ATCCCG (SEQ ID NO: 231)”. Aquí, se ha insertado el dinucleótido “CC”, dando como resultado una modificación estructural al polinucleótido.

b. Modificaciones químicas

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) se modifican químicamente. Como se utiliza en el presente documento en referencia a un polinucleótido, los términos “modificación química” o, según sea apropiado “químicamente modificado” se refiere a la modificación con respecto a adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) ribo- o desoxirribonucleósidos en una o más de su posición, patrón, porcentaje o población, que incluye, pero no limitado, a su nucleobase, azúcar, cadena principal o cualquier combinación de los mismos. Generalmente, en el presente documento, estos términos no pretenden referirse a las modificaciones de ribonucleótidos en motivos caperuza 5'-terminales de mRNA que ocurren naturalmente.

En algunos casos, los polinucleótidos de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por la titulación descendente de la misma modificación de partida en todo o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todo o cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como donde todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, p. ej., 5-metoxiuridina. En otros casos, los polinucleótidos pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido a lo largo del polinucleótido completo (tales como todas las uridinas y/o todas las citidinas, etc., se modifican de la misma manera).

El emparejamiento de bases de nucleótidos modificado abarca no únicamente los pares de bases adenosinatimina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina estándar, sino también pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases no estándar o modificadas, en donde la disposición de los donadores de enlace de hidrógeno y los aceptores de enlace de hidrógeno permite la formación de enlace de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar o entre dos estructuras de bases no estándar complementarias. Un ejemplo de tal emparejamiento de base no estándar es el emparejamiento de bases entre el nucleótido modificado inosina y adenina, citosina o uracilo. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador se puede incorporar en los polinucleótidos de la presente descripción.

El experto apreciará que, excepto donde se menciona de otra manera, las secuencias de polinucleótidos expuestas en la presente solicitud citarán “T” en una secuencia de DNA representativa pero donde la secuencia representa RNA, las “T” serían sustituidas por “U”.

Las modificaciones de polinucleótidos (p. ej., polinucleótidos de RNA, tales como polinucleótidos de mRNA) que son útiles en la composición de la presente descripción incluyen, pero no están limitados a los siguientes: 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina; N⁶- glicinilcarbamoiladenosina; N⁶-isopenteniladenosina; N⁶-metiladenosina; N⁶-treonilcarbamoiladenosina; 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); Isopenteniladenosina; N⁶-(cishidroxiisopentenil)-adenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N⁶,N⁶-dimetiladenosina; N⁶-acetiladenosina; N⁶-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N⁶-metil-N⁶-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-desazaadenosina; Nl-metil-adenosina; N⁶,N⁶-(dimetil)adenina; N⁶-cis-hidroxi-isopentenil-adenosina; a-tioadenosina; 2-(amino)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(metiltio)-N6-(isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; ²-(aminoalquil)adenina; ²-(aminopropil)-adenina; ²-(halo)adenina; ²-(halo)adenina; ²-(propil)adenina; ²'-Amino-2'-desoxi-ATP; 2'-Azido-2'-desoxi-ATP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-aazidoadenosina TP; ⁶-(alquil)adenina; ⁶-(metil)adenina; ⁶-(alquil)adenina; ⁶-(metil)adenina; 7-(desaza)adenina; ⁸-(alquenil)adenina; ⁸-(alquinil)adenina; ⁸-(amino)adenina; ⁸-(tioalquil)adenina; ⁸-(alquenil)adenina; ⁸-(alquil)adenina; ⁸-(alquinil)adenina; ⁸-(amino)adenina; ⁸-(halo)adenina; ⁸-(hidroxil)adenina; ⁸-(tioalquil)adenina; ⁸-(tiol)adenina; ⁸-azido-adenosina; aza-adenina; desaza-adenina; N⁶-(metil)adenina; N⁶-(isopentil)adenina; 7-desaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-Desazaadenosina TP; 2'-Fluoro-N⁶-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-a-Etiniladenosina TP; 2-aminoadenina; 2-Aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-Trifluorometiladenosina TP; 2 Azidoadenosina TP; 2'-b-Etiniladenosina TP; 2-Bromoadenosina TP; 2'-b-Trifluorometiladenosina TP; 2-Cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxiadenosina TP; 2'-Deoxi-2'-b-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-byodoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxiadenosina TP; 2-Fluoroadenosina TP; 2-Yodoadenosina TP; 2-Mercaptoadenosina TP; 2-metoxi-adenina; 2-metiltio-adenina; 2-Trifluorometiladenosina TP; 3-Desaza-3-bromoadenosina TP; 3-Desaza-3-cloroadenosina TP; 3-Desaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Desaza-3-yodoadenosina TP; 3-Desazaadenosina TP; 4'-Azidoadenosina TP; 4'-adenosina carbocíclica TP; 4'-Etiniladenosina TP; 5'-Homo-adenosina TP; ⁸-Aza-ATP; ⁸-bromo-adenosina TP; ⁸-Trifluorometiladenosina TP; 9-Desazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-desaza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-adenina, 7-desaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; Lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-Dimetil-2'-OMe-Citidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; Pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-Amino-2'-desoxi-CTP; 2'-Azido-2'-desoxi-CTP; 2'-Desoxi-2'-a-aminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidocitidina TP; 3-(desaza)-5-(aza)citosina; 3-(metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(desaza)-5-(aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5-(halo)citosina; 5-(metil)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)-citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)-citosina; 5-bromocitidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil-citosina; ⁶-(azo)citosina; ⁶-aza-citidina; azacitosina; desazacitosina; N4-(acetil)citosina; 1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4-tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; Zebularina; (E)-5-(2-Bromo-vinil)citidina TP; hidrocloruro de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'-Fluoro-N4-Bz-citidina TP; 2'-Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-Trifluorometilcitidina TP; 2'-b-Etinilcitidina TP; 2'-b-Trifluorometilcitidina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-atiometoxicitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-bbromocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxicitidina TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-Etinilcitidina TP; 4'-Azidocitidina TP; 4'-citidina carbocíclica TP; 4'-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-Cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-Amino-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-Aminoalil-CTP; 5-Cianocitidina TP; 5-Etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; 5'-Homo-citidina TP; 5-Metoxicitidina TP; 5-Trifluorometil-Citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-Benzoil-citidina TP; Pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wiosina; 1,2'-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-deazaguanosina; 7-ciano-7-desazaguanosina; Arcaeosina; Metilwiosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; ⁶-tioguanosina; 7-desaza-guanosina; ⁸-oxo-guanosina; Nl-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2-(propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2'-Amino-2'-desoxi-GTP; 2'-Azido-2'-desoxi-GTP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidoguanosina TP; ⁶-(metil)guanina; ⁶-(alquil)guanina; ⁶-(metil)guanina; ⁶-metil-guanosina; 7-(alquil)guanina; 7-(desaza)guanina; 7-(metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(desaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 -(alquil)guanina; ⁸-(alquinil)guanina; ⁸-(halo)guanina; ⁸(tioalquil)guanina; ⁸-(alquenil)guanina; ⁸-(alquil)guanina; ⁸-(alquinil)guanina; ⁸-(amino)guanina; ⁸-(halo)guanina; ⁸-(hidroxil)guanina; ⁸-(tioalquil)guanina; ⁸-(tiol)guanina; azaguanina; desazaguanina; N-(metil)guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; ⁶-metoxi-guanosina; 6-tio-7-desaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-desaza-guanosina; 6-tio-7-metilguanosina; 7-desaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxo-guanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'-Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina TP; 2'-a-Etinilguanosina TP; 2'-a-Trifluorometilguanosina TP; 2'-b-Etinilguanosina TP; 2'-b-Trifluorometilguanosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-atiometoxiguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-bbromoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-byodoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxiguanosina TP; 4'-Azidoguanosina TP; 4'-guanosina carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; ⁸-bromoguanosina TP; 9-Desazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; Inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; Epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; Manosilqueuosina; Queuosina; aliamino-timidina; azatimidina; desazatimidina; desoxi-timidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-carboximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taurinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; Dihidrouridina; Pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpseduouridina; 1-metil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; ²-tio-²'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-Metil-pseudo-Uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidro-uridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; éster metílico de 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilamino-metiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5 Carbamoil-metiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metiluridina), 5-metoxiuridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-Metildihidrouridina; ácido 5-Oxiacético-Uridina TP; ácido 5-Oxiacético-éster metílico-Uridina TP; N1-metil-pseudo-uridina; ácido uridina 5-oxiacético; éster metílico de ácido uridina 5-oxiacético; 3-(3-Amino-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2-tiouridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2'-O-metiluridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil-uracilo; a-tio-uridina; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1-(aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1-(aminoalquilaminocarboniletilenil)-4-(tio)pseudouracilo; 1-(aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1-(aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1-(aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1-(aminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1-(aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 2(tio)-pseudouracilo 1-sustituido; 2,4-(ditio)pseudouracilo 1 -sustituido; 4-(tio)pseudouracilo 1 -sustituido; pseudouracilo 1 -sustituido; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina TP; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-Metil-pseudo-UTP; 2-(tio)pseudouracilo; 2'-desoxiuridina; 2'-fluorouridina; 2-(tio)uracilo; 2,4-(ditio)psuedouracilo; 2'-metil, ²'-amino, ²'-azido, ²'-fluoro-guanosina; ²'-Amino-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-desoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-desoxiuridina; 2'-fluorouridina; 2'-Desoxi-2'-a-aminouridina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(aminoalquil)uracilo; 5-(dimetil-aminoalquil)uracilo; 5-(guanidinio-alquil)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)uracilo; 5-(metil)-2,4-(ditio)uracilo; 5-(metil)-4-(tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2-(tio)uracilo; 5-(metilaminometilo)-2,4-(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5-(alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinio-alquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5-(metoxi)-uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)uracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)uracilo; 5-(metil)-4-(tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4-(ditio)-pseudouracilo; 5-(metil)-4-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoaliluridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; ⁶-(azo)uracilo; ⁶-(azo)uracilo; ⁶-aza-uridina; alilaminouracilo; azauracilo; desaza-uracilo; N3-(metil)uracilo; ácido Pseudo-UTP-1-2-etanoico; Pseudouracilo; 4-Tiopseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-desaza-pseudouridina; 1-propinil-uridina; 1-taurinometil-¹-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; ¹-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tio-pseudouridina; ²-tio-¹-metil-1-desaza-pseudouridina; 2-tio-1-metil-pseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tio-dihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1 -metilpseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-aza-uridina; Dihidropseudouridina; (±)1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)-pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina T^p; (E)-5-(2-Bromovinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromovinil)uridina TP; 1-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetilbencil)-pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-Trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)-pseudo-UTP; 1-(2-Amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-Hidroxietil)-pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-(3-Aminopropil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseudouridina TP; 1-(4-Amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Yodobencil)-pseudouridina TP; 1-(4-Metanosulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxi-bencil)pseudo-UTp; 1-(4-Metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Metilbencil)-pseudouridina TP; 1-(4-Metil-bencil)pseudo-uTP; 1-(4-Nitrobencil)pseudouridina TP; 1 -(4-Nitrobencil)pseudo-UTP; 1(4-Nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-propionil}pseudouridina TP; 1-Acetilpseudouridina TP; 1-Alquil-6-(1-propinil)-pseudo-uTP; 1-Alquil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-alil-pseudo-UTP; 1-Alquil-⁶-etinil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-Alilpseudouridina TP; 1-Aminometil-pseudo-UTP; 1-Benzoilpseudouridina TP; 1-Benciloximetilpseudouridina TP; 1-Bencilpseudo-UTP; 1-Biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-Biotinilpseudouridina TP; 1-Butil-pseudo-UTP; 1-Cianometilpseudouridina TP; 1-Ciclobutilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclobutil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptilmetilpseudo-UTP; 1-Cicloheptil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1 -Ciclooctil-pseudo-UTP; 1 -Ciclopentilmetil-pseudo-UTP; 1 -Ciclopentil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-UTP; 1-Hexil-pseudo-UTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-Hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-Metanosulfonilmetil-pseudouridina TP; 1-Metoximetilpseudouridina TP; 1-Metil-6-(2,2,2-Trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(fenil sustituido)pseudo-UTP; 1-Metil-6-amino-pseudo-UTP; 1 Metil-⁶-azido-pseudo-UTP; 1-Metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-cloro-pseudo-UTP; 1-Metil-6-ciano-pseudo-UTP; 1-Metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-⁶-etilcarboxilato-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fluoro-pseudo-uTP; 1 -Metil-⁶-formilpseudo-UTP; ¹-Metil-⁶-hidroxiamino-pseudo-UTP; ¹-Metil-⁶-hidroxi-pseudo-uTP; ¹-Metil-⁶-yodo-pseudo-UTP; 1- Metil-6-isopropil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1 -Metil-⁶-fenil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometoxipseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentil-pseudo-UTP; 1-Fenil-pseudo-UTP; 1-Pivaloilpseudouridina TP; 1-Propargilpseudouridina TP; 1-Propil-pseudo-UTP; 1-propinilpseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-Butil-pseudo-UTP; 1-Tiometoximetilpseudouridina TP; 1-Tiomorfolinometil-pseudouridina TP; 1-Trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-Trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-desoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-desoxi-UTP; 2'-OMe-5- Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'-a-Trifluorometiluridina TP; 2'-b-Etiniluridina TP; 2'-b-Trifluorometiluridina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-Desoxi-2'-atiometoxiuridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-Desoxi-2'-bbromouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-Alquil-pseudo-UTP; 4'-Azidouridina TP; 4'-uridina carbocíclica TP; 4'-Etiniluridina TP; 5-(1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-Furanil)uridina TP; 5-Cianouridina TP; 5-Dimetilaminouridina TP; 5'-Homo-uridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-desoxiuridina TP; 5-Feniletiniluridina TP; 5-Trideuterometil-⁶-deuterouridina TP; 5-Trifluorometil-Uridina TP; 5-Vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-Morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-Tiomorfolino)-pseudo-UTP; ⁶-(Fenil sustituido)-pseudo-UTP; ⁶- Amino-pseudo-UTP; ⁶-Azido-pseudo-UTP; ⁶-Bromo-pseudo-UTP; ⁶-Butil-pseudo-UTP; ⁶-Cloro-pseudo-UTP; ⁶-Ciano-pseudo-UTP; ⁶-Dimetilamino-pseudo-UTP; ⁶-Etoxi-pseudo-UTP; ⁶-Etilcarboxilato-pseudo-UTP; ⁶-Etil-pseudo-UTP; ⁶-Fluoro-pseudo-UTP; ⁶-Formil-pseudo-UTP; ⁶-Hidroxiamino-pseudo-UTP; ⁶-Hidroxipseudo-UTP; ⁶-Yodo-pseudo-UTP; ⁶-iso-Propil-pseudo-UTP; ⁶-Metoxi-pseudo-UTP; ⁶-Metilamino-pseudo-UTP; ⁶-Metil-pseudo-UTP; ⁶-Fenil-pseudo-UTP; ⁶-Fenil-pseudo-UTP; ⁶-Propil-pseudo-UTP; ⁶-terc-Butilpseudo-UTP; ⁶-Trifluorometoxi-pseudo-UTP; ⁶-Trifluorometil-pseudo-UTP; Alfa-tio-pseudo-UTP; ácido 1-(4-metilbencenosulfónico) de Pseudouridina TP; ácido 1-(4-metilbenzoico) de Pseudouridina TP; ácido 1-[3-(2-etoxi)]propiónico de Pseudouridina TP; ácido 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico de Pseudouridina TP; ácido 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoxi)-etoxi}-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico de Pseudouridina TP; ácido 1-[3-{2-(2-[2-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico de Pseudouridina TP; ácido 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}]propiónico de Pseudouridina TP; ácido 1-metilfosfónico de Pseudouridina TP; éster dietílico de ácido 1-metilfosfónico de Pseudouridina TP; ácido Pseudo-UTP-N1-3-propiónico; ácido Pseudo-UTP-N1-4-butanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-5-pentanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-6-hexanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-7-heptanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoico; ácido Pseudo-UTP-NI-p-benzoico; Wibutosina; Hidroxiwibutosina; Isowiosina; Peroxiwibutosina; hidroxiwibutosina submodificada; 4-demetilwiosina; 2,6-(diamino)purina; 1-(aza)-2- (tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo: 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno; 2-(amino)purina; 2,4,5-(trimetil)fenil; 2'-metil, 2'-amino, 2'-azido, 2'-fluro-citidina; ²'-metil, ²'-amino, ²'-azido, ²'-fluro-adenina; ²'-metil, ²'-amino, ²'-azido, ²'-fluro-uridina; ²'-amino-²'-desoxiribosa; 2-amino-6-Cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'-fluoro-2'-desoxirribosa; bases 2'-fluoro-modificadas; 2'-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxo-piridopirimidina-3-ilo; 2- piridinona; 3- nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)-isocarboestirililo; 3-(metil)isocarboestirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5-nitroindol; pirimidinas 5-sustituidas; 5-(metil)isocarboestirililo; 5-nitroindol; ⁶-(aza)pirimidina; ⁶-(azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; ⁶-cloro-purina; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-ilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinio-alquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(propinil)isocarboestirililo; 7-(propinil)isocarboestirililo, propinil-7-(aza)indolilo; 7-desaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 9-(metil)-imidizopiridinilo; Aminoindolilo; Antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; bisorto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Difluorotolilo; Hipoxantina; Imidizopiridinilo; Inosinilo; Isocarboestirililo; Isoguanisina; purinas N2-sustituidas; N6-metil-2-aminopurina; purinas N⁶-sustituidas; derivado N-alquilado; Naftalenilo; Nitrobencimidazolilo; Nitroimidazolilo; Nitroindazolilo; Nitropirazolilo; Nubularina; purinas O⁶-sustituidas; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; orto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-⁶-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; para-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pentacenilo; Fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; Pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3- ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pirrolopirimidinilo; Pirrolopirizinilo; Estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; Tetracenilo; Tubercidina; Xantina; Xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-desaza-2-aminopurina; piridin-4-ona ribonucleósido; 2-Amino-ribósido-TP; Formicina A TP; Formicina B TP; Pirrolosina TP; 2'-OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-ara-citidina TP; 2'-OH-ara-uridina TP; 2'-OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)-uridina TP; y N6-(19-Amino-pentaoxanonadecil)adenosina TP.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de RNA, tal como polinucleótido de mRNA) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas en lo anterior.

En algunos casos, el mRNA comprende al menos un nucleósido químicamente modificado. En algunos casos, el al menos un nucleósido químicamente modificado se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina (Y), Nl-metilpseudouridina (m1^), 2-tiouridina (s2U), 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desazapseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil-uridina, 1-metilpseudouridina (m1^), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), a-tio-guanosina, a-tio-adenosina, 5-ciano-uridina, 4'-tio-uridina 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N⁶-metiladenosina (m⁶A) y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m11), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desazaguanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQI), 7-metilguanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), ⁸-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 2,8-dimetiladenosina, 2-geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-selenouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)-5,6-dihidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 3-metilpseudoundina, éster metílico de ácido 5-(carboxihidroximetil)-2'-O-metiluridina, 5-aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5-aminometiluridina, 5-carbamoilhidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5-cianometiluridina, 5-hidroxicitidina, 5-metilaminometil-2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-desmetilwiosina, 7-aminocarboxipropil-wiosina, éster metílico de ácido 7-aminocarboxipropilwiosina, ⁸-metiladenosina, N4,N4-dimetilcitidina, N⁶-formiladenosina, N⁶-hidroximetiladenosina, agmatidina, N⁶-treonilcarbamoiladenosina cíclica, glutamil-queuosina, hidroxiwibutosina submodificada metilada, N4,N4,2'-O-trimetilcitidina, 5-metilaminometil-2-tiouridina geranilada, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina geranilada, Qbase, preQObase, preQIbase y dos o más combinaciones de los mismos. En algunos casos, el al menos un nucleósido químicamente modificado se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de RNA, tal como polinucleótido de mRNA) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas en lo anterior. En un caso particular, el al menos un nucleósido químicamente modificado es Nl-metilpseudouridina.

(i) Modificaciones de base

En algunos casos, la modificación química está en nucleobases en los polinucleótidos p. ej., polinucleótido de RNA, tal como polinucleótido de mRNA).

En algunos casos, un polinucleótido como se describe en el presente documento comprende al menos una nucleobase químicamente modificada.

En algunos casos, la al menos una nucleobase químicamente modificada se selecciona del grupo que consiste en pseudouracilo (^y), Nl-metilpseudouracilo (m1^), 2-tiouracilo (s2U), 4'-tiouracilo, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouracilo, 2-tio-1-metil-pseudouracilo, 2-tio-5-aza-uracilo, 2-tio-dihidropseudouracilo, 2-tiodihidrouracilo, 2-tio-pseudouracilo, 4-metoxi-2-tio-pseudouracilo, 4-metoxi-pseudouracilo, 4-tio-1 -metilpseudouracilo, 4-tio-pseudouracilo, 5-aza-uracilo, dihidropseudouracilo, 5-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2'-O-metil-uracilo, 1-metil-pseudouracilo (m1^), 5-metoxi-uracilo (mo5U), 5-metil-citosina (m5C), a-tio-guanina, atio-adenina, 5-ciano-uracilo, 4'-tiouracilo, 7-desaza-adenina, 1-metil-adenina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N⁶-metil-adenina (m⁶A) y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m11), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanina, 7-ciano-7-desaza-guanina (preQO), 7-aminometil-7-desaza-guanina (preQI), 7-metil-guanina (m7G), 1-metil-guanina (m1G), ⁸-oxo-guanina, 7-metil-8-oxo-guanina y dos o más combinaciones de los mismos.

En algunos casos, las nucleobases en un polinucleótido como se describe en el presente documento se modifican químicamente en al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 99%, o 100%.

En algunos casos, las nucleobases químicamente modificadas se seleccionan del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina, guanina, y cualquier combinación de las mismas.

En algunos casos, los uracilos en un polinucleótido descrito en el presente documento se modifican químicamente en al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 99%, o 100%.

En algunos casos, las adeninas en un polinucleótido descrito en el presente documento se modifican químicamente en al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 99%, o 100%.

En algunos casos, las citosinas en un polinucleótido descrito en el presente documento se modifican químicamente en al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 99%, o 100%.

En algunos casos, las guaninas en un polinucleótido descrito en el presente documento se modifican químicamente en al menos aproximadamente ¹⁰%, al menos aproximadamente ²⁰%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos 95%, al menos 99%, o 100%.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas.

En algunos casos, las nucleobases modificadas en el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) se seleccionan del grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina ( ^{it i} 1^y), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (^y) a-tio-guanosina y a-tio-adenosina. En algunos casos, el polinucleótido incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas en lo anterior.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende pseudouridina (y y 5-metil-citidina (m5c). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 1-metil-pseudouridina ( ^{it i} 1^y). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 1 metil-pseudouridina ( ^{it i} 1y ) y 5-metilcitidina (m5C). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 2-tiouridina (^s2U). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como el polinucleótido mRNA) comprende metoxi-uridina (mo5U). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 2'-O-metil uridina. En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 2'-O-metil-uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido r Na , tal como polinucleótido mRNA) comprende N⁶-metil-adenosina (m⁶A). En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende N⁶-metil-adenosina (m⁶A) y 5-metil-citidina (m5C).

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) se modifica uniformemente (p. ej., completamente modificado, modificado a lo largo de la secuencia completa) para una modificación particular. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser modificado uniformemente con 5-metil-citidina (m5C), que significa que todos los restos de citosina en la secuencia de mRNA se reemplazan con 5-metilcitidina (m5C). De manera similar, un polinucleótido se puede modificar uniformemente para cualquier tipo de resto de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un resto modificado tal como cualquiera de los expuestos en lo anterior.

En algunos casos, los nucleósidos químicamente modificados en el marco de lectura abierto se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina y cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p. ej., 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina (^s2C), 2-tio-5-metil-citidina.

En algunos casos, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tiene una uridina modificada incluyen 5-cianouridina o 4'-tiouridina.

En algunos casos, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una adenina modificada incluyen 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metiladenina (m2A), N⁶-metil-adenina (m⁶A) y 2,6-Diaminopurina.

En algunos casos, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-desazaguanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), ⁸-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxoguanosina.

En algunos casos, los nucleótidos de nucleobase modificada en el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) son 5-metoxiuridina.

En algunos casos, al menos 95% de un tipo de nucleobases (p. ej., uracilo) en un polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) son nucleobases modificadas. En algunos casos, al menos 95% de uracilo en un polinucleótido de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B) es 5-metoxiuracilo.

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) comprende 5-metoxiuridina (5mo5U) y 5-metil-citidina (m5C).

En algunos casos, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido RNA, tal como polinucleótido mRNA) se modifica uniformemente (p. ej., completamente modificado, modificado a lo largo de la secuencia completa) para una modificación particular. Por ejemplo, un polinucleótido se puede modificar uniformemente con 5-metoxiuridina, que significa que sustancialmente todos los restos de uridina en la secuencia de mRNA se reemplazan con 5-metoxiuridina. De manera similar, un polinucleótido se puede modificar uniformemente para cualquier tipo de resto de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un resto modificado tal como cualquiera de los expuestos en lo anterior.

En algunos casos, la nucleobase modificada es una citosina modificada.

En algunos casos, una nucleobase modificada es un uracilo modificado. Las nucleobases y nucleósidos de ejemplo que tienen un uracilo modificado incluyen 5-metoxiuracilo.

En algunos casos, una nucleobase modificada es una adenina modificada.

En algunos casos, una nucleobase modificada es una guanina modificada.

En algunos casos, las nucleobases, azúcar, cadena principal o cualquier combinación de los mismos en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se modifican químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%.

En algunos casos, los nucleósidos de uridina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se modifican químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%.

En algunos casos, los nucleósidos de adenosina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se modifican químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%.

En algunos casos, los nucleósidos de citidina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se modifican químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%.

En algunos casos, los nucleósidos de guanosina en el marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B se modifican químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%.

En algunos casos, los polinucleótidos pueden incluir cualquier enlazador útil entre los nucleósidos, que incluyen enlazadores de polipéptido de subunidades y heterólogos como se describe en otra parte en el presente documento. Tales enlazadores, incluyen modificaciones de cadena principal, que son útiles en la composición de la presente descripción que incluyen, pero no están limitados a lo siguiente: 3'-alquileno-fosfonatos, 3'-amino-fosforamidato, cadenas principales que contienen alqueno, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfosfotriésteres, boranofosfatos, -CH²-ON(CH3)-CH²-, -CH²-N(CH3)-N(CH3)-CH²-, -CH²-NH-CH²-, fosfonatos quirales, fosforotioatos quirales, cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo, metileno (metilimino), cadenas principales de metilen-formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino, enlaces de morfolino, -N(CH3)-CH2-CH2-, oligonucleósidos con enlace de internucleósido de heteroátomos, fosfinatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, enlaces de internucleósido de fosforotioatos, fosforotioatos, fosfotriésteres, PNA, cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfamato, cadenas principales de sulfóxido de sulfuro y sulfona, cadenas principales de sulfonato y sulfonamida, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y tionofosforamidatos.

(ii) Modificaciones de azúcar

Los nucleósidos y nucleótidos modificados (p. ej., moléculas de unidades estructurales) que se pueden incorporar en un polinucleótido (p. ej., RNA o mRNA, como se describe en el presente documento) se pueden modificar en el azúcar del ácido ribonucleico. Por ejemplo, el grupo 2'-hidroxilo (OH) se puede modificar o reemplazar con una serie de diferentes sustituyentes. Las sustituciones de ejemplo en la posición 2' incluyen, pero no están limitadas a, H, halógeno, alquilo C^1-6opcionalmente sustituido; alcoxi C^1-6opcionalmente sustituido; ariloxi C^6-10opcionalmente sustituido; cicloalquilo C^3-8opcionalmente sustituido; cicloalcoxi C^3-8opcionalmente sustituido; ariloxi C^6-10opcionalmente sustituido; aril(C^6-10)-alcoxi(C^1-6) opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C^1-12opcionalmente sustituido; un azúcar (p. ej., ribosa, pentosa o cualquiera descrito en el presente documento); un polietilenglicol (PEG), -O(CH²CH²O)nCH²CH²OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (p. ej., de 0 a 4, de 0 a 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16 y de 4 a 20); ácidos nucleicos “bloqueados” (LNA) en los que el 2'-hidroxilo está conectado por un puente de alquileno C^1-6o heteroalquileno C^1-6al carbono 4' del mismo azúcar de ribosa, donde los puentes de ejemplo incluyen puentes de metileno, propileno, éter o amino; aminoalquilo, como se define en el presente documento; aminoalcoxi, como se define en el presente documento; amino como se define en el presente documento; y aminoácido, como se define en el presente documento.

Generalmente, el RNA incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene un oxígeno. Los nucleótidos modificados no limitantes, de ejemplo incluyen el reemplazo del oxígeno en la ribosa (p. ej., con S, Se o alquileno, tal como metileno o etileno); adición de un doble enlace (p. ej., para reemplazar ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como para anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino que también tiene una cadena principal de fosforamidato); formas multicíclicas (p. ej., triciclo; y formas “no bloqueadas”, tal como ácido nucleico glicólico (GNA) (p. ej., R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces de fosfodiéster), ácido nucleico de treosa (TNA, donde la ribosa se reemplaza con aL-treofuranosilo-(3’^ 2 ’)) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces de 2-amino-etil-glicina reemplazan la ribosa y la cadena principal de fosfodiéster). El grupo azúcar también puede contener uno o más carbonos que poseen la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. De esta manera, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, p. ej., arabinosa, como el azúcar. Tales modificaciones de azúcar se enseñan en las Publicaciones de Patentes Internacionales N° WO2013052523 y WO2014093924.

(iii) Combinaciones de modificaciones

Los polinucleótidos de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12A, un polipéptido de IL12B, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B o un fragmento funcional o variante del mismo) pueden incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase, y/o el enlace internucleósido. Estas combinaciones pueden incluir una cualquiera o más modificaciones descritas en el presente documento.

Se proporcionan a continuación ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados en la Tabla 5. Las combinaciones de nucleótidos modificados se pueden utilizar para formar los polinucleótidos de la descripción. A menos de que sea mencionado de otra manera, los nucleótidos modificados pueden sustituir completamente a los nucleótidos naturales de los polinucleótidos de la descripción. Como un ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede ser sustituido por un nucleósido modificado descrito en el presente documento. En otro ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede ser parcialmente sustituido o reemplazado (p. ej., aproximadamente 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99.9%) por al menos uno de los nucleósidos modificados descritos en el presente documento. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador se puede incorporar en los polinucleótidos de la descripción y tales modificaciones se enseñan en la Publicaciones de Patentes Internacionales WO2013052523 y WO2014093924, y Publicaciones de EE. UU. N° US20130115272 y US20150307542.

Tabla 5. Combinaciones

13. Regiones no traducidas (UTR)

Las regiones no traducidas (UTR) son secciones de ácido nucleico de un polinudeótido antes de un codón de inicio (5'UTR) y después de un codón de detención (3'UTR) que no son traducidas. En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (RNA), p. ej. un r Na mensajero (mRNA)) de la descripción que comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12A e IL12B además comprende u Tr (p. ej., una 5'UTR o fragmento funcional de la misma, una 3'UTR o fragmento funcional de la misma, o una combinación de las mismas).

Una UTR puede ser homóloga o heteróloga para la región de codificación en un polinucleótido. En algunos casos, la UTR es homóloga para el ORF que codifica el polipéptido de IL12. En algunos casos, la UTR es heteróloga para el ORF que codifica el polipéptido de IL12. En algunos casos, el polinucleótido comprende dos o más 5'UTR o fragmentos funcionales de las mismas, cada una de las cuales tiene las mismas o diferentes secuencias de nucleótidos. En algunos casos, el polinucleótido comprende dos o más 3'UTR o fragmentos funcionales de las mismas, cada una de las cuales tiene las mismas o diferentes secuencias de nucleótidos.

En algunos casos, la 5'UTR o fragmento funcional de la misma, 3'UTR o fragmento funcional de la misma, o cualquier combinación de las mismas se optimiza en secuencia.

En algunos casos, la 5'UTR o fragmento funcional de la misma, 3'UTR o fragmento funcional de la misma, o cualquier combinación de las mismas comprende al menos una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo.

Las UTR pueden tener características que proporciona una función reguladora, p. ej., estabilidad incrementada o disminuida, localización y/o eficiencia de traducción. Un polinucleótido que comprende una UTR se puede administrar a una célula, tejido u organismo, y se pueden medir una o más características reguladoras utilizando métodos de rutina. En algunos casos, un fragmento funcional de una 5'UTR o 3'UTR comprende una o más características reguladoras de una 5' o 3' UTR de longitud completa, respectivamente.

Las 5'UTR naturales llevan características que desempeñan funciones en la iniciación de traducción. Albergan firmas como la secuencias Kozak que se sabe comúnmente que están implicadas en el proceso mediante el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG (SEQ ID NO: 232), donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases secuencia arriba del codón de inicio (AUG), que es seguido por otra “G”. También se sabe que las 5'UTR forman estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de alargamiento.

Al modificar genéticamente las características típicamente encontradas en genes abundantemente expresados de órganos objetivo específicos, se puede aumentar la estabilidad y producción de proteínas de un polinucleótido. Por ejemplo, la introducción de 5'UTR de mRNA expresado en el hígado, tal como albúmina, amiloide A de suero, apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfa fetoproteína, eritropoyetina o Factor VIII, puede aumentar la expresión de polinucleótidos en líneas de células hepáticas o el hígado. Del mismo modo, el uso de 5'UTR de otro mRNA específico de tejido para mejorar la expresión en ese tejido es posible para el músculo (p. ej., MyoD, Miosina, Mioglobina, Miogenina, Herculina), para células endoteliales (p. ej., Tie-1, CD36), para células mieloides (p. ej., C/EBP, AML1, G-CSF, GM-Cs F, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), para leucocitos (p. ej., CD45, CD18), para tejido adiposo (p. ej., CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) y para células epiteliales del pulmón (p. ej., SP-A/B/C/D).

En algunos casos, las UTR se seleccionan de una familia de transcritos cuyas proteínas comparten una función, estructura, característica o propiedad común. Por ejemplo, un polipéptido codificado puede pertenecer a una familia de proteínas (es decir, que comparten al menos una función, estructura, característica, localización, origen o patrón de expresión) que se expresan en una célula particular, tejido o en algún momento durante el desarrollo. Las UTR de cualquiera de los genes o mRNA se pueden intercambiar por cualquier otra UTR de la misma o diferente familia de proteínas para crear un nuevo polinucleótido.

En algunos casos, la 5'UTR y la 3'UTR pueden ser heterólogas. En algunos casos, la 5'UTR se puede derivar de una especie diferente que la 3'UTR. En algunos casos, la 3'UTR se puede derivar de una especie diferente que la 5'UTR.

La Solicitud de Patente Internacional de titularidad conjunta N° PCT/US2014/021522 (Publicación N° WO/2014/164253) proporciona un listado de UTR ejemplares que se pueden utilizar en el polinucleótido de la presente descripción como regiones flanqueadoras a un ORF.

Las UTR de ejemplo de la solicitud incluyen, pero no están limitadas a, una o más 5'UTR y/o 3'UTR derivadas de la secuencia de ácido nucleico de: una globina, tal como una a- o p-globina (p. ej., una globina de Xenopus, ratón, conejo o humana); una señal de inicio de la traducción de Kozak fuerte; un CYBA (p. ej., el polipéptido a de citocromo b-245 humano); una albúmina (p. ej., albúmina 7 humana); una HSD17B4 (hidroxiesteroide (17-p) deshidrogenasa); un virus (p. ej., un virus de grabado del tabaco (TEV), un virus de encefalitis equina venezolana (VEEV), un virus del Dengue, un citomegalovirus (CMV) (p. ej., CMV inmediato temprano 1 (IE1)), un virus de hepatitis (p. ej., virus de hepatitis B), un virus sindbis, o un virus del enanismo amarillo de la cebada PAV); una proteína de choque térmico (p. ej., hsp70); un factor de inicio de la traducción (p. ej., elF4G); un transportador de glucosa (p. ej., hGLUTl (transportador de glucosa humana 1)); una actina (p. ej., actina a o p humana); una GAPDH; una tubulina; una histona; una enzima del ciclo del ácido cítrico; una topoisomerasa (p. ej., una 5'UTR de un gen TOP que carece del motivo 5' TOP (el tracto de oligopirimidina)); una proteína ribosomal grande 32 (L32); una proteína ribosomal (p. ej., proteína ribosomal humana o de ratón, tal como, por ejemplo rps9); una ATP sintasa (p. ej., ATP5A1 o la subunidad p de H+-ATP sintasa mitocondrial); una hormona del crecimiento e (p. ej., bovina (bGH) o humana (hGH)); un factor de elongación (p. ej., factor de elongación 1 a l (EEF1A1)); un superóxido de manganeso dismutasa (MnSOD); un factor potenciador de miocito 2A (MEF2A); una p-F1-ATPasa, una creatina quinasa, una mioglobina, un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF); un colágeno (p. ej., colágeno tipo I, alfa 2 (Col1A2), colágeno tipo I, alfa 1 (Coll A1), colágeno tipo VI, alfa 2 (Col6A2), colágeno tipo VI, alfa 1 (Col6A1)); una riboforina (p. ej., riboforina I (RPNI)); una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (p. ej., LRP1); un factor de citocinas similar a cardiotrofina (p. ej., Nnt1); calreticulina (Calr); una procolágeno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 1 (Plod1); y una nucleobindina (p. ej., Nucb1).

Otras 5' y 3' UTR de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, las descritas en Karikó et al., Mol. Ther. 2008 16(11): 1833-1840; Karikó et al., Mol. Ther. 2012 20(5):948-953; Karikó et al., Nucleic Acids Res. 2011 39(21):e142; Strong et al., Gene Therapy 19974:624-627; Hansson et al., J. Biol. Chem. 2015 290(9):5661-5672; Yu et al., Vaccine 200725(10):1701-1711; Cafri et al., Mol. Ther. 201523(8):1391-1400; Andries et al., Mol. Pharm. 2012 9(8):2136-2145; Crowley et al., Gene Ther. 30 de junio de 2015, doi:10.1038/gt.2015.68; Ramunas et al., FASEB J. 201529(5):1930-1939; Wang et al., Curr. Gene Ther. 201515(4):428-435; Holtkamp et al., Blood 2006 108(13):4009-4017; Kormann et al., Nat. Biotechnol. 2011 29(2):154-157; Poleganov et al., Hum. Gen. Ther. 201526(11):751-766; Warren et al., Cell Stem Cell 2010 7(5):618-630; Mandal y Rossi, Nat. Protoc. 2013 8(3):568-582; Holcik y Liebhaber, PNAS 1997 94(6):2410-2414; Ferizi et al., Lab Chip. 2015 15(17):3561 -3571; Thess et al., Mol. Ther. 2015 23(9):1456-1464; Boros et al., PLoS One 2015 10(6):e0131141; Boros et al., J. Photochem. Photobiol. B. 2013 129:93-99; Andries et al., J. Control. Release 2015217:337-344; Zinckgraf et al., Vaccine 200321(15): 1640-9; Garneau et al., J. Virol. 2008 82(2):880-892; Holden y Harris, Virology 2004329(1):119-133; Chiu et al., J. Virol. 200579(13):8303-8315; Wang et al., EMBO J. 1997 16(13):4107-4116; Al-Zoghaibi et al., Gene 2007 391(1-2):130-9; Vivinus et al., Eur. J. Biochem. 2001 268(7):1908-1917; Gan y Rhoads, J. Biol. Chem. 1996 271(2):623-626; Boado et al., J. Neurochem. 1996 67(4):1335-1343; Knirsch y Clerch, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 272(1):164-168; Chung et al., Biochemistry 199837(46):16298-16306; Izquierdo y Cuevza, Biochem. J. 2000346 Pt 3:849-855; Dwyer et al., J. Neurochem. 1996 66(2):449-458; Black et al., Mol. Cell. Biol. 1997 17(5):2756-2763; Izquierdo y Cuevza, Mol. Cell. Biol. 1997 17(9):5255-5268; documentos US8278036; US8748089; US8835108; US9012219; US2010/0129877; US2011/0065103; US2011/0086904; US2012/0195936; US2014/020675; US2013/0195967; US2014/029490; US2014/0206753; WO2007/036366; WO2011/015347; WO2012/072096; WO2013/143555; WO2014/071963; WO2013/185067; WO2013/182623; WO2014/089486; WO2013/185069; WO2014/144196; WO2014/152659; 2014/152673; WO2014/152940; WO2014/152774; WO2014/153052; WO2014/152966, WO2014/152513; WO2015/101414; WO2015/101415; WO2015/062738; y WO2015/024667.

En algunos casos, la 5'UTR se selecciona del grupo que consiste en una 5'UTR de p-globina, una 5'UTR que contiene una señal de inicio de traducción Kozak fuerte; una 5'UTR de polipéptido a de citocromo b-245 (CYBA); una 5'UTR de hidroxiesteroide (17-p) deshidrogenasa (HSD17B4); una 5'UTR de virus de grabado del tabaco (TEV); una 5'UTR de virus de encefalitis equina venezolana (TEEV); un marco de lectura abierto proximal 5' del RNA de virus de la rubeola (RV) que codifica proteínas no estructurales; una 5'UTR de virus del Dengue (DEN); una 5'UTR de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70); una 5'UTR de eIF4G; una 5'UTR de GLUT1; fragmentos funcionales de las mismas y cualquier combinación de las mismas.

En algunos casos, la 3'UTR se selecciona del grupo que consiste en una 3'UTR de p-globina; una 3'UTR de CYBA; una 3'UTR de albúmina; una 3'UTR de hormona del crecimiento (GH); un 3'UTR de VEEV; una 3'UTR de virus de la hepatitis B (HBV); una 3'UTR de a-globina; una 3'UTR de DEN; una 3'UTR de virus del enanismo amarillo de la cebada PAV (bYd V-PAV); una 3'UTR de factor de elongación 1 a l de (EEF1A1); una 3'UTR de superóxido de manganeso dismutasa (MnSOD); una 3'UTR de una subunidad p de H(+)-ATP sintasa mitocondrial (p-mRNA); una 3'UTR de GLUT1; una 3'UTR de MEF2A; una 3'UTR de p-F1-ATPasa; fragmentos funcionales de las mismas y combinaciones de las mimas.

Otras UTR de ejemplo incluyen, pero no están limitadas, a una o más de las UTR, que incluyen cualquier combinación de UTR, descritas en el documento WO2014/164253. Se muestra en la Tabla 21 de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/775,509 y en la Tabla 22 de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/829,372, un listado de sitios de inicio y de detención para las 5'UTR y 3'UTR. En la Tabla 21, cada 5'UTR (5'-UTR-005 a 5'-UTR 68511) se identifica por su sitio de inicio y detención con respecto a su transcrito nativo o de tipo natural (homólogo) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos ENSEMBL).

Las UTR de tipo natural derivadas de cualquier gen o mRNA se pueden incorporar en los polinucleótidos de la descripción. En algunos casos, una UTR se puede alterar con respecto a una UTR de tipo natural o nativa para producir una UTR variante, p. ej., al cambiar la orientación o ubicación de la UTR con respecto al ORF; o mediante la inclusión de nucleótidos adicionales, eliminación de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. En algunos casos, se pueden utilizar variantes de 5' o 3' UTR, por ejemplo, mutantes de UTR de tipo natural, o variantes en donde uno o más nucleótidos se añaden a o se eliminan de un extremo de la UTR.

Adicionalmente, se pueden utilizar una o más UTR sintéticas en combinación con una o más UTR no sintéticas. Véase, p. ej., Mandal y Rossi, Nat. Protoc. 2013 8(3):568-82, y las secuencias disponibles en www.addgene.org/Denick_Rossi/, último acceso el 16 de abril de 2016. Las UTR o porciones de las mismas se pueden poner en la misma orientación que el transcrito del cual se seleccionaron o se pueden alterar en orientación o ubicación. Por consiguiente, una 5' y/o 3' UTR se puede invertir, acortar, alargar o combinar con una o más de otras 5' UTR o 3' UTR.

En algunos casos, el polinucleótido comprende múltiples UTR, p. ej., una doble, una triple o una cuádruple 5'UTR o 3'UTR. Por ejemplo, una doble UTR comprende dos copias de la misma UTR ya sea en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede utilizar una doble 3'UTR de beta-globina (ver el documento US2010/0129877).

En ciertos casos, los polinucleótidos de la descripción comprenden una 5'UTR y/o una 3'UTR seleccionada de cualquiera de las UTR descritas en el presente documento. En algunos casos, la 5'UTR comprende:

5'UTR-001 (UTR secuencia arriba)

(GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 135);

5'UTR-002 (UTR secuencia arriba)

(GGGAGATCAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 136);

5'UTR-003 (UTR secuencia arriba)

(G G A A T A A A A G I C T C A A C A C A A C A T A T A C A A A A C A A A C G A A T C T C A A G C A A T C A A G C A T T C T A C T T C T A T T G C A G C A A T T T A A A T C A T T T C T T T T A A A G C A A A A G C A A T T T T C T G A A A A T T T T C A C C A T T T A C G A A C G A T A G C A A C )(S E Q ID N O . 137); 5'UTR-004 (UTR secuencia arriba) (GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC) (SEQ ID NO. 138);

5'UTR-005 (UTR secuencia arriba) (GGGAGATCAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 139);

5'UTR-006 (UTR secuencia arriba)

(G G A A T A A A A G T C T C A A C A C A A C A T A T A C A A A A C A A A C G A A T C T C A A G C A A T C A A G C A T T C T A C T T C T A T T GC A G C A A T T T A A A T C A T T TC T T T T A A A G C A A A A G C A A T T T T C T G A A A A T T T T C A C C A T T T A C G A A C G A T A G C A A C ) (SEQ ID N O . 140); 5'UTR-007 (UTR secuencia arriba) (GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC) (SEQ ID NO. 141);

5'UTR-008 (UTR secuencia arriba) (GGGAATTAACAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 142);

5'UTR-009 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATTAGACAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 143);

5'UTR-010, Secuencia arriba (GGGAAATAAGAGAGTAAAGAACAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 144);

5'UTR-011 (UTR secuencia arriba) (GGGAAAAAAGAGAGAAAAGAAGACTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 145);

5'UTR-012 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGATATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 146);

5'UTR-013 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATAAGAGACAAAACAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 147);

5'UTR-014 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATTAGAGAGTAAAGAACAGTAAGTAGAATTAAAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 148);

5'UTR-15 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATAAGAGAGAATAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 149);

5'UTR-016 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAAATTAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 150);

5'UTR-017 (UTR secuencia arriba) (GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATTTAAGAGCCACC) (SEQ ID NO. 151); 'UTR-018 (UTR secuencia arriba)

(T C A A G C T T T T G G A C C C T C G T A C A G A A G C T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A A A T A A G A G A G A A A A G A A G A G T A A G A A G A A A T A T A A G A G C C A C C ) (S E Q ID N O 152),

42-3p 5'UTR-001 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

( T G A T A A T A G T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O 153);

42-3p 5'UTR-002 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A GC C TC G G T G G C T CC A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (SEQ ID N O . 154);

42-3p 5'UTR-003 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O 155); 42-3p 5'UTR-004 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A CC CC C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O . 156);

42-3p 5'UTR-005 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O . 157);

42-3p 5'UTR-006 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O 158); o 42-3p 5'UTR-007 (UTR secuencia arriba que incluye miR142-3p)

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C CC A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T T C C A T A A A G T A G G A A A C A C T A C A C T G A G T G G G C G G C ) (SEQ ID N O . 159) En algunos casos, la 3'UTR comprende:

3'UTR-001 (UTR de Creatina Quinasa)

(G C G C C T G C C C A C C T G C C A C C G A C T G C T G G A A C C C A G C C A G T G G G A G G G C C T G G C C C A C C A G A G T C C T G C T C C C T C A C T C C T C G C C C C G C C C C C T G T C C C A G A G T C C C A C C T G G G G G C T C T C T C C A C C C T T C T C A G A G T T C C A G T T T C A A C C A G A G T T C C A A C C A A T G G G C T C C A T C C T C T G G A T T C T G G C C A A T G A A A T A T C T C C C T G G C A G G G T C C T C T T C T T T T C C C A G A G C T C C A C C C C A A C C A G G A G C T C T A G T T A A T G G A G A G C T C C C A G C A C A C T C G G A G C T T G T G C T T T G T C T C C A C G C A A A G C G A T A A A T A A A A G C A T T G G T G G C C T T T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G T C T A G A ) (SEQ ID N O . 160);

3'UTR-002 (UTR de Mioglobina)

(G C C C C T G C C G C T C C C A C C C C C A C C C A T C T G G G C C C C G G G T T C A A G A G A G A G C G G G G T C T G A T C T C G T G T A G C C A T A T A G A G T T T G C T T C T G A G T G T C T G C T T T G T T T A G T A G A G G T G G G C A G G A G G A G C T G A G G G G C T G G G G C T G G G G T G T T G A A G T T G G C T T T G C A T G C C C A G C G A T G C G C C T C C C T G T G G G A T G T C A T C A C C C T G G G A A C C G G G A G T G G C C C T T G G C T C A C T G T G T T C T G C A T G G T T T G G A T C T G A A T T A A T T G T C C T T T C T T C T A A A T C C C A A C C G A A C T T C T T C C A A C C T C C A A A C T G G C T G T A A C C C C A A A T C C A A G C C A T T A A C T A C A C C T G A C A G T A G C A A T T G T C T G A T T A A T C A C T G G C C C C T T G A A G A C A G C A G A A T G T C C C T T T G C A A T G A G G A G G A G A T C T G G G C T G G G C G G G C C A G C T G G G G A A G C A T T T G A C T A T C T G G A A C T T G T G T G T G C C T C C T C A G G T A T G G C A G T G A C T C A C C T G G T T T T A A T A A A A C A A C C T G C A A C A T C T C A T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G T C T A G A ) (SEQ ID N O . 161); 3'UTR-003 (UTR de a-actina)

( A C A C A C T C C A C C T C C A G C A C G C G A C T T C T C A G G A C G A C G A A T C T T C T C A A T G G G G G G G C G G C T G A G C T C C A G C C A C C C C G C A G T C A C T T T C T T T G T A A C A A C T T C C G T T G C T G C C A T C G T A A A C T G A C A C A G T G T T T A T A A C G T G T A C A T A C A T T A A C T T A T T A C C T C A T T T T G T T A T T T T T C G A A A C A A A G C C C T G T G G A A G A A A A T G G A A A A C T T G A A G A A G C A T T A A A G T C A T T C T G T T A A G C T G C G T A A A T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G T C T A G A ) (S E Q ID N O . 162);

3'UTR-004 (UTR de Albúmina)

(C A T C A C A T T T A A A A G C A T C T C A G C C T A C C A T G A G A A T A A G A G A A A G A A A A T G A A G A T C A A A A G C T T A T T C A T C T G T T T T T C T T T T T C G T T G G T G T A A A G C C A A C A C C C T G T C T A A A A A A C A T A A A T T T C T T T A A T C A T T T T G C C T C T T T T C T C T G T G C T T C A A T T A A T A A A A A A T G G A A A G A A T C T A A T A G A G T G G T A C A G C A C T G T T A T T T T T C A A A G A T G T G T T G C T A T C C T G A A A A T T C T G T A G G T T C T G T G G A A G T T C C A G T G T T C T C T C T T A T T C C A C T T C G G T A G A G G A T T T C T A G T T T C T T G T G G G C T A A T T A A A T A A A T C A T T A A T A C T C T T C T A A T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G T C T A G A ) (S E Q ID N O 163);

'UTR-005 (UTR de a-globina)

(G C T G C C T T C T G C G G G G C T T G C C T T C T G G C C A T G C C C T T C T T C T C T C C C T T G C A C C T G T A C C T C T T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G G C G G C C G C T C G A G C A T G C A T C T A G A ) (S E Q ID N O 164);

'UTR-006 (UTR de G-CSF)

(G C C A A G C C C T C C C C A T C C C A T G T A T T T A T C T C T A T T T A A T A T T T A T G T C T A T T T A A G C C T C A T A T T T A A A G A C A G G G A A G A G C A G A A C G G A G C C C C A G G C C T C T G T G T C C T T C C C T G C A T T T C T G A G T T T C A T T C T C C T G C C T G T A G C A G T G A G A A A A A G C T C C T G T C C T C C C A T C C C C T G G A C T G G G A G G T A G A T A G G T A A A T A C C A A G T A T T T A T T A C T A T G A C T G C T C C C C A G C C C T G G C T C T G C A A T G G G C A C T G G G A T G A G C C G C T G T G A G C C C C T G G T C C T G A G G G T C C C C A C C T G G G A C C C T T G A G A G T A T C A G G T C T C C C A C G T G G G A G A C A A G A A A T C C C T G T T T A A T A T T T A A A C A G C A G T G T T C C C C A T C T G G G T C C T T G C A C C C C T C A C T C T G G C C T C A G C C G A C T G C A C A G C G G C C C C T G C A T C C C C T T G G C T G T G A G G C C C C T G G A C A A G C A G A G G T G G C C A G A G C T G G G A G G C A T G G C C C T G G G G T C C C A C G A A T T T G C T G G G G A A T C T C G T T T T T C T T C T T A A G A C T T T T G G G A C A T G G T T T G A C T C C C G A A C A T C A C C G A C G C G T C T C C T G T T T T T C T G G G T G G C C T C G G G A C A C C T G C C C T G C C C C C A C G A G G G T C A G G A C T G T G A C T C T T T T T A G G G C C A G G C A G G T G C C T G G A C A T T T G C C T T G C T G G A C G G G G A C T G G G G A T G T G G G A G G G A G C A G A C A G G A G G A A T C A T G T C A G G C C T G T G T G T G A A A G G A A G C T C C A C T G T C A C C C T C C A C C T C T T C A C C C C C C A C T C A C C A G T G T C C C C T C C A C T G T C A C A T T G T A A C T G A A C T T C A G G A T A A T A A A G T G T T T G C C T C C A T G G T C T T T G A A T A A A G C C T G A G T A G G A A G G C G G C C G C T C G A G C A T G C A T C T A G A ) (SEQ ID N O . 165);

'UTR-007 (Col1a2; UTR de colágeno, tipo I, alfa 2)

( A C T C A A T C T A A A T T A A A A A A G A A A G A A A T T T G A A A A A A C T T T C T C T T T G C C A T T T C T T C T T C T T C T T T T T T A A C T G A A A G C T G A A T C C T T C C A T T T C T T C T G C A C A T C T A C T T G C T T A A A T T G T G G G C A A A A G A G A A A A A G A A G G A T T G A T C A G A G C A T T G T G C A A T A C A G T T T C A T T A A C T C C T T C C C C C G C T C C C C C A A A A A T T T G A A T T T T T T T T T C A A C A C T C T T A C A C C T G T T A T G G A A A A T G T C A A C C T T T G T A A G A A A A

C C A A A A T A A A A A T T G A A A A A T A A A A A C C A T A A A C A T T T G C A C C A C T T G T G G C T T T T G A A T A T C T T CC A C A G A G G G A A G T T T A A A A C C C A A A C T T CC A A A G G T T T A A A C T A C C T C A A A A C A C T T T C C C A T G A G T G T G A T C C A C A T T G T T A G G T G C T G A C C T A G A C A G A G A T G A A C T G A G G T C C T T G T T T T G T T T T G T T C A T A A T A C A A A G G T G C T A A T T A A T A G T A T T T C A G A T A C T T G A A G A A T G T T G A T G G T G C T A G A A G A A T T T G A G A A G A A A T A C TC C T G T A T T G A G T T G T A T C G T G T G G T G T A T T T T T T A A A A A A T T T G A T T T A G C A T T C A T A T T T T C C A T C T T A T T C C C A A T T A A A A G T A T G C A G A T T A T T T G C C C A A A T C T T C T T C A G A T T C A G C A T T T G T T C T T T G C C A G T C T C A T T T T C A T C T T C T T C C A T G G T T CC A C A G A A G C T T T G T T T C T T G G G C A A G C A G A A A A A T T A A A T T G T A C C T A T T T T G T A T A T G T G A G A T G T T T A A A T A A A T T G T G A A A A A A A T G A A A T A A A G C A T G T T T G G T T T T C C A A A A G A A C A T A T ) (SEQ ID N O . 166);

'UTR-008 (Col6a2; UTR de colágeno, tipo VI, alfa 2)

(C G C C G C C G C C C G G G C C C C G C A G T C G A G G G T C G T G A G C C C A C C C C G T C C A T G G T G C T A A G C G G G C C C G G G T C C C A C A C G G C C A G C A C C G C T G C T C A C T C G G A C G A C G C C C T G G G C C T G C A C C T C T C C A G C T C C T C C C A C G G G G T C C C C G T A G C C C C G G C C C C C G C C C A G C C C C A G G T C T C C C C A G G C C C T C C G C A G G C T G C C C G G C C T C C C T C C C C C T G C A G C C A T C C C A A G G C T C C T G A C C T A C C T G G C C C C T G A G C T C T G G A G C A A G C C C T G A C C C A A T A A A G G C T T T G A A C C C A T ) (S E Q ID N O 167);

'UTR-009 (RPN1; UTR de riboforina I)

(G G G G C T A G A G C C C T C T C C G C A C A G C G T G G A G A C G G G G C A A G G A G G G G G G T T A T T A G G A T T G G T G G T T T T G T T T T G C T T T G T T T A A A G C C G T G G G A A A A T G G C A C A A C T T T A C C T C T G T G G G A G A T G C A A C A C T G A G A G C C A A G G G G T G G G A G T T G G G A T A A T T T T T A T A T A A A A G A A G T T T T T C C A C T T T G A A T T G C T A A A A G T G G C A T T T T T C C T A T G T G C A G T C A C T C C T C T C A T T T C T A A A A T A G G G A C G T G G C C A G G C A C G G T G G C T C A T G C C T G T A A T C C C A G C A C T T T G G G A G G C C G A G G C A G G C G G C T C A C G A G G T C A G G A G A T C G A G A C T A T C C T G G C T A A C A C G G T A A A A C C C T G T C T C T A C T A A A A G T A C A A A A A A T T A G C T G G G C G T G G T G G T G G G C A C C T G T A G T C CC A G C T A C T C G G G A G G C T G A G G C A G G A G A A A G G C A T G A A T C C A A G A G G C A G A G C T T G C A G T G A G C T G A G A T C A C G C C A T T G C A C T C C A G C C T G G G C A A C A G T G T T A A G A C T C T G T C T C A A A T A T A A A T A A A T A A A T A A A T A A A T A A A T A A A T A A A T A A A A A T A A A G C G A G A T G T T G C C C T C A A A ) (SEQ ID N O 168);

'UTR-010 (LRP1; UTR de proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad) (G G C C C T G C C C C G T C G G A C T G C C C C C A G A A A G C C T C C T G C C C C C T G C C A G T G A A G T C C T T C A G T G A G C C C C T C C C C A G C C A G C C C T T C C C T G G C C C C G C C G G A T G T A T A A A T G T A A A A A T G A A G G A A T T A C A T T T T A T A T G T G A G C G A G C A A G C C G G C A A G C G A G C A C A G T A T T A T T T C T C C A T C C C C T C C C T G C C T G C T C C T T G G C A C C C C C A T G C T G C C T T C A G G G A G A C A G G C A G G G A G G G C T T G G G G C T G C A C C T C C T A C C C T C C C A C C A G A A C G C A C C C C A C T G G G A G A G C T G G T G G T G C A G C C T T C C C C T C C C T G T A T A A G A C A C T T T G C C A A G G C T C T C C C C T C T C G C C C C A T C C C T G C T T G C C C G C T C C C A C A G C T T C C T G A G G G C T A A T T C T G G G A A G G G A G A G T T C T T T G C T G C C C C T G T C T G G A A G A C G T G G C T C T G G G T G A G G T A G G C G G G A A A G G A T G G A G T G T T T T A G T T C T T G G G G G A G G C C A C C C C A A A C C C C A G C C C C A A C T C C A G G G G C A C C T A T G A G A T G G C C A T G C T C A A C C C C C C T C C C A G A C A G G C C C T C C C T G T C T C C A G G G C C C C C A C C G A G G T T C C C A G G G C T G G A G A C T T C C T C T G G T A A A C A T T C C T C C A G C C T C C C C T C C C C T G G G G A C G C C A A G G A G G T G G G C C A C A C C C A G G A A G G G A A A G C G G G C A G C C C C G T T T T G G G G A C G T G A A C G T T T T A A T A A T T T T T G C T G A A T T C C T T T A C A A C T A A A T A A C A C A G A T A T T G T T A T A A A T A A A A T T G T ) (SEQ ID N O 169);

'UTR-011 (Nnt1; UTR de factor de citocina similar a cardiotrofina 1)

(A T A T T A A G G A T C A A G C T G T T A G C T A A T A A T G C C A C C T C T G C A G T T T T G G G A A C A G G C A A A T A A A G T A T C A G T A T A C A T G G T G A T G T A C A T C T G T A G C A A A G C T C T T G G A G A A A A T G A A G A C T G A A G A A A G C A A A G C A A A A A C T G T A T A G A G A G A T T T T T C A A A A G C A G T A A T C C C T C A A T T T T A A A A A A G G A T T G A A A A T T C T A A A T G

t c t t t c t g t g c a t a t t t t t t g t g t t a g g a a t c a a a a g t a t t t t a t a a a a g g a g A A A G A A C A G C C T C A T T T T A G A T G T A G T C C T G T T G G A T T T T T T A T G C C T C C T C A G T A A C C A G A A A T G T T T T A A A A A A C T A A G T G T T T A G G A T T T C A A G A C A A C A T T A T A C A T G G C T C T G A A A T A T C T G A C A C A A T G T A A A C A T T G C A G G C A C C T G C A T T T T A T G T T T T T T T T T T C A A C A A A T G T G A C T A A T T T G A A A C T T T T A T G A A C T T C T G A G C T G T CC C C T T G C A A T T C A A C C G C A G T T T G A A T T A A T C A T A T O A A A T C A G T T T T A A T T T T T T A A A T T G T A C T T C A G A G T C T A T A T T T C A A G G G C A C A T T T T C T C A C T A C T A T T T T A A T A C A T T A A A G G A C T A A A T A A T C T T T C A G A G A T G C T G G A A A C A A A T C A T T T G C T T T A T A T G T T T C A T T A G A A T A C C A A T G A A A C A T A C A A C T T G A A A A T T A G T A A T A G T A T T T T T G A A G A T C C C A T T T C T A A T T G G A G A T C T C T T T A A T T T C G A T C A A C T T A T A A T G T G T A G T A C T A T A T T A A G T G C A C T T G A G T G G A A T T C A A C A T T T G A C T A A T A A A A T G A G T T C A T C A T G T T G G C A A G T G A T G T G G C A A T T A T C T C T G G T G A C A A A A G A G T A A A A T C A A A T A T T T C T G C C T G T T A C A A A T A T C A A G G A A O A C C T G C T A C T A T G A A A T A G A T G A C A T T A A T C T G T C T T C A C T G T T T A T A A T A C G G A T G G A T T T T T T T T C A A A T C A G T G T G T G T T T T G A G G T C T T A T G T A A T T G A T G A C A T T T G A G A O A A A T G G T G G C T T T T T T T A G C T A C C T C T T T G T T C A T T T A A G C A C C A G T A A A G A T C A T G T C T T T T T A T A G A A G T G T A G A T T T T C T T T G T G A C T T T G C T A T C G T G C C T A A A G C T C T A A A T A T A G G T G A A T G T G T G A T G A A T A C T C A G A T T A T T T G T C T C T C T A T A T A A T T A G T T T G G T A C T A A G T T T C T C A A A 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T A T T C T T T G C T A T T T G C C A A T C C T T T G T C A T C A A T T G T G T T A A A T G A A T T G A A A A T T C A T G C C C T G T T C A T T T T A T T T T A C T T T A T T G G T T A G G A T A T T T A A A G G A T T T T T G T A T A T A T A A T T T C T T A A A T T A A T A T T C C A A A A G G T T A G T G G A C T T A G A T T A T A A A T T A T G G C A A A A A T C T A A A A A C A A C A A A A A T G A T T T T T A T A C A T T C T A T T T C A T T A T T C C T C T T T T T C C A A T A A G T C A T A C A A T T G G T A G A T A T G A C T T A T T T T A T T T T T G T A T T A T T C A C T A T A T C T T T A T G A T A T T T A A G T A T A A A T A A T T A A A A A A A T T T A T T G T A C C T T A T A G T C T G T C A C C A A A A A A A A A A A A T T A T C T G T A G G T A G T G A A A T G C T A A T G T T G A T T T G T C T T T A A G G G C T T G T T A A C T A T C C T T T A T T T T C T C A T T T G T C T T A A A T T A G G A G T T T G T G T T T A A A T T A C T C A T C T A A G C A A A A A A T G T A T A T A A A T C C C A 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A T A A T T A A A A A A A A A A A G A A A A C A G A A G C T A T T T A T A A A G A A G T T A T T T G C T G A A A T A A A T G T G A T C T T T C CC A T T A A A A A A A T A A A G A A A T T T T G G G G T A A A A A A A C A C A A T A T A T T G T A T T C T T G A A A A A T T C T A A G A G A G T G G A T G T G A A G T G T T C TC A C C A C A A A A G T G A T A A C T A A T T G A G G T A A T GC A C A T A T T A A T T A G A A A G A T T T T G T C A T T C C A C A A T G T A T A T A T A C T T A A A A A T A T G T T A T A C A C A A T A A A T A C A T A C A T T A A A A A A T A A G T A A A T G T A ) (SEQ ID N O . 170);

'UTR-012 (Col6a1; UTR de colágeno, tipo VI, alfa 1)

(C C C A C C C T G C A C G C C G G C A C C A A A C C C T G T C C T C C C A C C C C T C C C C A C T C A T C A C T A A A C A G A G T A A A A T G T G A T G C G A A T T T T C C C G A C C A A C C T G A T T C G C T A G A T T t t T T T T A A G G A A A A G C T T G G A A A G C C A G G A C A C A A C G C T G C T G C C T G C T T T G T G C A G G G T C C T C C G G G G C T C A G C C C T G A G T T G G C A T C A C C T G C G C A G G G C C C T C T G G G G C T C A G C C C T G A G C T A G T G T C A C C T G C A C A G G G C C C T C T G A G G C T C A G C C C T G A G C T G G C G T C A C C T G T G C A G G G C C C T C T G G G G C T C A G C C C T G A G C T G G C C T C A C C T G G G T T C C C C A C C C C G G G C T C T C C T G C C C T G C C C T C C T G C C C G C C C T C C C T C C T G C C T G C G C A G C T C C T T C C C T A G G C A C C T C T G T G C T G C A T C C C A C C A G C C T G A G C A A G A C G C C C T C T C G G G G C C T G T G C C G C A C T A G C C T C C C T C T C C T C T G T C C C C A T A G C T G G T T T T T C C C A C C A A T C C T C A C C T A A C A G T T A C T T T A C A A T T A A A C T C A A A G C A A G C T C T T C T C C T C A G C T T G G G G C A G C C A T T G G C C T C T G T C T C G T T T T G G G A A A C C A A G G T C A G G A G G C C G T T G C A G A C A T A A A T C T C G G C G A C T C G G C C C C G T C T C C T G A G G G T C C T G C T G G T G A C C G G C C T G G A C C T T G G C C C T A C A G C C C T G G A G G C C G C T G C T G A C C A G C A C T G A C C C C G A C C T C A G A G A G T A C T C G C A G G G G C G C T G G C T G C A C T C A A G A C C C T C G A G A T T A A C G G T G C T A A C C C C G T C T G C T C C T C C C T C C C G C A G A G A C T G G G G C C T G G A C T G G A C A T G A G A G C C C C T T G G T G C C A C A G A G G G C T G T G T C T T A C T A G A A A C A A C G C A A A C C T C T C C T T C C T C A G A A T A G T G A T G T G T T C G A C G T T T T A T C A A A G G C C C C C T T T C T A T G T T C A T G T T A G T T T T G C T C C T T C T G T G T T T T T T T C T G A A C C A T A T C C A T G T T G C T G A C T T T T C C A A A T A A A G G T T T T C A C T C C T C T C ) (S E Q ID N O . 171);

'UTR-013 (Calr; UTR de calreticulina)

(A G A G G C C T G C C T C C A G G G C T G G A C T G A G G C C T G A G C G C T C C T G C C G C A G A G C T G G C C G C G C C A A A T A A T G T C T C T G T G A G A C T C G A G A A C T T T C A T T T T T T T C C A G G C T G G T T C G G A T T T G G G G T G G A T T T T G G T T T T G T T C C C C T C C T C C A C T C T C C C C C A C C C C C T C C C C G C C C T T T T T T T T T T T T T T T T T T A A A C T G G T A T T T T A T C T T T G A T T C T C C T T C A G C C C T C A C C C C T G G T T C T C A T C T T T C T T G A T C A A C A T C T T T T C T T G C C T C T G T C C C C T T C T C T C A T C T C T T A G C T C C C C T C C A A C C T G G G G G G C A G T G G T G T G G A G A A G C C A C A G G C C T G A G A T T T C A T C T G C T C T C C T T C C T G G A G C C C A G A G G A G G G C A G C A G A A G G G G G T G G T G T C T C C A A C C C C C C A G C A C T G A G G A A G A A C G G G G C T C T T C T C A T T T C A C C C C T C C C T T T C T C C C C T G C C C C C A G G A C T G G G C C A C T T C T G G G T G G G G C A G T G G G T C C C A G A T T G G C T C A C A C T G A G A A T G T A A G A A C T A C A A A C A A A A T T T C T A T T A A A T T A A A T T T T G T G T C T C C ) (S E Q ID N O .

172);

'UTR-014 (C o lla l; UTR de colágeno, tipo I, alfa 1)

(C T C C C T C C A T C C C A A C C T G G C T C C C T C C C A C C C A A C C A A C T T T C C C C C C A A C C C G G A A A C A G A C A A G C A A C C C A A A C T G A A C C C C C T C A A A A G C C A A A A A A T G G G A G A C A A T T T C A C A T G G A C T T T G G A A A A T A T T T T T T T C C T T T G C A T T C A T C T C T C A A A C T T A G T T T T T A T C T T T G A C C A A C C G A A C A T G A C C A A A A A C C A A A A G T G C A T T C A A C C T T A C C A A A A A A A A A A A A A A A A A A A G A A T A A A T A A A T A A C T T T T T A A A A A A G G A A G C T T G G T C C A C T T G C T T G A A G A C C C A T G C G G G G G T A A G T C C C T T T C T G C C C G T T G G G C T T A T G A A A C C C C A A T G C T G C C C T T T C T G C T C C T T T C T C C A C A C C C C C C T T G G G G C C T C C C C T C C A C T C C T T C C C A A A T C T G T C T C C C C A G A A G A C A C A G G A A A C A A T G T A T T G T C T G C C C A G C A A T C A A A G G C A A T G C T C A A A C A C C C A A G T G G C C C C C A C C C T C A G C C C G C T C C T G C C C G C C C A G C A C C C C C A G G C C C T G G G G G A C C T G G G G T T C T C A G A C T G C C A A A G A A G C C T T G C C A T C T G G C G C T C C C A T G G C T C T T G C A A C A T C T C C C C T T C G T T T T T G A G G G G G T C A T G C C G G G G G A G C C A C C A G C C C C T C A C T G G G T T C G G A G G A G A G T C A G G A A G G G C C A C G A C A A A G C A G A A A C A T C G G A T T T G G G G A A C G C G T G TC A A T C C C T T G T G C C G C A G G G C T G G G C G G G A G A G A C T G T T C T G T T C C T T G T G T A A C T G T G T T G C T G A A A G A C T A C C T C G T T C T T G T C T T G A T G T G T C A C C G G G G C A A C T G C C T G G G G G C G G G G A T G G G G G C A G G G T G G A A G C G G C T C C C C A T T T T A T A C C A A A G G T G C T A C A T C T A T G T G A T G G G T G G G G T G G G G A G G G A A T C A C T G G T G C T A T A G A A A T T G A G A T G C C C C C C C A G G C C A G C A A A T G T T C C T T T T T G T T C A A A G T C T A T T T T T A T T C C T T G A T A T T T T T C T T T T T T T T T T T T T T T T T T T G T G G A T G G G G A C T T G T G A A T T T T T C T A A A G G T G C T A T T T A A C A T G G G A G G A G A G C G T G T G C G G C T C C A G C C C A G C C C G C T G C T C A C T T T C C A C C C T C T C T C C A C C T G C C T C T G G C T T C T C A G G C C T C T G C T C T C C G A C C T C T C T C C T C T G A A A C C C T C C T C C A C A G C T G C A G C C C A T C C T C C C G G C T C C C T C C T A G T C T G T C C T G C G T C C T C T G T C C C C G G G T T T C A G A G A C A A C T T C C C A A A G C A C A A A G C A G T T T T T C C C C C T A G G G G T G G G A G G A A G C A A A A G A C T C T G T A C C T A T T T T G T A T G T G T A T A A T A A T T T G A G A T G T T T T T A A T T A T T T T G A T T G C T G G A A T A A A G C A T G T G G A A A T G A C C C A A A C A T A A T C C G C A G T G G C C T C C T A A T T T C C T T C T T T G G A G T T G G G G G A G G G G T A G A C A T G G G G A A G G G G C T T T G G G G T G A T G G G C T T G C C T T C C A T T C C T G C C C T T T C C C T C C C C A C T A T T C T C T T C T A G A T C C C T C C A T A A C C C C A C T C C C C T T T C T C T C A C C C T T C T T A T A C C G C A A A C C T T T C T A C T T C C T C T T T C A T T T T C T A T T C T T G C A A T T T C C T T G C A C C T T T T C C A A A T C C T C T T C T C C C C T G C A A T A C C A T A C A G G C A A T C C A C G T G C A C A A C A C A C A C A C A C A C T C T T C A C A T C T G G G G T T G T C C A A A C C T C A T A C C C A C T C C C C T T C A A G C C C A T C C A C T C T C C A C C C C C T G G A T G C C C T G C A C T T G G T G G C G G T G G G A T G C T C A T G G A T A C T G G G A G G G T G A G G G G A G T G G A A C C C G T G A G G A G G A C C T G G G G G C C T C T C C T T G A A C T G A C A T G A A G G G T C A T C T G G C C T C T G C T C C C T T C T C A C C C A C G C T G A C C T C C T G C C G A A G G A G C A A C G C A A C A G G A G A G G G G T C T G C T G A G C C T G G C G A G G G T C T G G G A G G G A C C A G G A G G A A G G C G T G C T C C C T G C T C G C T G T C C T G G C C C T G G G G G A G T G A G G G A G A C A G A C A C C T G G G A G A G C T G T G G G G A A G G C A C T C G C A C C G T G C T C T T G G G A A G G A A G G A G A C C T G G C C C T G C T C A C C A C G G A C T G G G T G C C T C G A C C T C C T G A A T C C C C A G A A C A C A A C C C C C C T G G G C T G G G G T G G T C T G G G G A A C C A T C G T G C C C C C G C C T C C C G C C T A C T C C T T T T T A A G C T T ) (S E Q ID N O . 173);

'UTR-015 (Plod 1; UTR de procolágeno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 1)

(T T G G C C A G G C C T G A C C C T C T T G G A C C T T T C T T C T T T G C C G A C A A C C A C T G C C C A G C A G C C T C T G G G A C C T C G G G G T C C C A G G G A A C C C A G T C C A G C C T C C T G G C T G T T G A C T T C C C A T T G C T C T T G G A G C C A C C A A T C A A A G A G A T T C A A A G A G A T T C C T G C A G G C C A G A G G C G G A A C A C A C C T T T A T G G C T G G G G C T C T C C G T G G T G T T C T G G A C C C A G C C C C T G G A G A C A C C A T T C A C T T T T A C T G C T T T G T A G T G A C T C G T G C T C T C C A A C C T G T C T T C C T G A A A A A C C A A G G C C C C C T T C C C C C A C C T C T T C C A T G G G G T G A G A C T T G A G C A G A A C A G G G G C T T C C C C A A G T T G C C C A G A A A G A C T G T C T G G G T G A G A A G C C A T G G C C A G A G C T TC TC C C A G G C A C A G G T G T T G C A C C A G G G A C T T C T G C T T C A A G T T T T G G G G T A A A G A C A C C T G G A T C A G A C T C C A A G G G C T G C C C T G A G T C T G G G A C T T C T G C C T C C A T G G C T G G T C A T G A G A G C A A A C C G T A G T C C C C T G G A G A C A G C G A C T C C A G A G A A C C T C T T G G G A G A C A G A A G A G G C A T C T G T G C A C A G C T C G A T C T T C T A C T T G C C T G T G G G G A G G G G A G T G A C A G G T C C A C A C A C C A C A C T G G G T C A C C C T G T C C T G G A T G C C T C T G A A G A G A G G G A C A G A C C G T C A G A A A C T G G A G A G T T T C T A T T A A A G G T C A T T T A A A C C A ) (SEQ ID N O . 174);

'UTR-016 (Nucbl; UTR de nucleobindina 1)

(T C C T C C G G G A C C C C A G C C C T C A G G A T T C C T G A T G C T C C A A G G C G A C T G A T G G G C G C T G G A T G A A G T G G C A C A G T C A G C T T C C C T G G G G G C T G G T G T C A T G T T G G G C T C C T G G G G C G G G G G C A C G G C C T G G C A T T T C A C G C A T T G C T G C C A C C C C A G G T C C A C C T G T C T C C A C T T T C A C A G C C T C C A A G T C T G T G G C T C T T C C C T T C T G T C C T C C G A G G G G C T T G C C T T C T C T C G T G T C C A G T G A G G T G C T C A G T G A T C G G C T T A A C T T A G A G A A G C C C G C C C C C T C C C C T T C T C C G T C T G T C C C A A G A G G G T C T G C T C T G A G C C T G C G T T C C T A G G T G G C T C G G C C T C A G C T G C C T G G G T T G T G G C C G C C C T A G C A T C C T G T A T G C C C A C A G C T A C T G G A A T C C C C G C T G C T G C T C C G G G C C A A G C T T C T G G T T G A T T A A T G A G G G C A T G G G G T G G T C C C T C A A G A C C T T C C C C T A C C T T T T G T G G A A C C A G T G A T G C C T C A A A G A C A G T G T C C C C T C C A C A G C T G G G T G C C A G G G G C A G G G G A T C C T C A G T A T A G C C G G T G A A C CC T G A T A C C A G G A G C C T G G G C C T C C C T G A A C C C C T G G C T T C C A G C C A T C T C A T C G C C A G C C T C C T C C T G G A C C T C T T G G C C C C C A G C C C C T T C C C C A C A C A G C C C C A G A A G G G T C C C A G A G C T G A C C C C A C T C C A G G A C C T A G G C C C A G C C C C T C A G C C T C A T C T G G A G C C C C T G A A G A C C A G T C C C A C C C A C C T T T C T G G C C T C A T C T G A C A C T G C T C C G C A T C C T G C T G T G T G T C C T G T T C C A T G T T C C G G T T C C A T C C A A A T A C A C T T T C T G G A A C A A A ) (S E Q ID N O . 175);

'UTR-017 (a-globina)

(G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O . 176);

o

3'UTR-018

(T G A T A A T A G G C T G G A G C C T C G G T G G C C A T G C T T C T T G C C C C T T G G G C C T C C C C

C C A G C C C C T C C T C C C C T T C C T G C A C C C G T A C C C C C G T G G T C T T T G A A T A A A G T

C T G A G T G G G C G G C ) (S E Q ID N O . 177).

En algunos casos, la secuencia 5'UTR y/o 3'UTR de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias 5'UTR que comprenden cualquiera de las secuencias 5'UTR descritas en el presente documento y/o secuencias 3'UTR comprenden cualquiera de las secuencias 3'UTR descritas en el presente documento y cualquier combinación de las mismas.

En algunos casos, la secuencia 3' UTR comprende uno o más sitios de unión de miRNA, p. ej., sitios de unión de miR-122, o cualquiera de otras secuencias de nucleótidos heterólogas en las mismas, sin alterar la función de la 3' UTR. Algunos ejemplos de las secuencias 3' UTR que comprenden un sitio de unión de miRNA se listan en la Tabla 6. En algunos casos, la secuencia 3' UTR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 238 240. En ciertos casos, la secuencia 3' UTR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 238. En ciertos casos, la secuencia 3' UTR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 239. En ciertos casos, la secuencia 3' UTR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la SEQ ID NO: 240.

T l . ’ TR m l n ii ni n miRNA

Los polinucleótidos de la descripción pueden comprender combinaciones de características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una 5' UTR que comprende una señal de inicio de traducción de Kozak fuerte y/o una 3' UTR que comprende una secuencia oligo(dT) para la adición al molde de una cola de poli-A. Una 5' UTR puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido de las mismas y/o diferentes u Tr (véase, p. ej., el documento US2010/0293625).

También está dentro del alcance de la presente descripción tener UTR con patrones. Como se utiliza en el presente documento “las UTR con patrones” incluyen un patrón de repetición o alternante, tal como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de los mismos repetidos una vez, dos veces o más de 3 veces. En estos patrones, cada letra A, B o C representan una secuencia de ácido nucleico de UTR diferente.

Se pueden utilizar otras secuencias no UTR como regiones o subregiones dentro de los polinucleótidos de la descripción. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones en los polinucleótidos de la descripción. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteína así como los niveles de expresión de polinucleótido. En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) en lugar de o además de una UTR (véase, p. ej., Yakubov et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010 394(1):189-193). En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende secuencias 5' y/o 3' asociadas con los extremos 5' y/o 3' del RNA genómico del virus de la rubeola (RV), respectivamente, o derivados de eliminación de los mismos, que incluyen el marco de lectura abierto proximal 5' del RNA de RV que codifica proteínas no estructurales (véase p. ej., Pogue et al., J. Virol. 67(12):7106-7117). Las secuencias de cápside virales también se pueden utilizar como un potenciador de la traducción, p. ej., la porción 5' de una secuencia de cápside, (p. ej., los RNA de cápside del virus del bosque semliki y del virus sindbis como se describe en Sjoberg et al., Biotechnology (NY) 1994 12(11):1127-1131, y Frolov y Schlesinger J. Virol. 199670(2):1182-1190). En algunos casos, el polinucleótido comprende un IRES en lugar de una secuencia 5'UTR. En algunos casos, el polinucleótido comprende un ORF y una secuencia de cápside viral. En algunos casos, el polinucleótido comprende una 5'^uT^rsintética en combinación con una 3'UTR no sintética.

En algunos casos, la UTR también puede incluir al menos un polinucleótido potenciador de la traducción, elemento potenciador de la traducción o elementos potenciadores de la traducción (colectivamente, “TEE” que se refiere a secuencias de ácido nucleico que incrementan la cantidad de polipéptido o proteína producida a partir de un polinucleótido. Como un ejemplo no limitante, los TEE pueden incluir los descritos en el documento US2009/0226470. Como un ejemplo no limitante, los TEE se pueden situar entre el promotor de transcripción y el codón de inicio. En algunos casos, la 5'UTR comprende un TEE.

En un aspecto, un TEE es un elemento conservado en una UTR que puede promover la actividad de traducción de un ácido nucleico tal como, pero no limitado a una traducción dependiente de caperuza o independiente de caperuza. La conservación de estas secuencias se ha mostrado a través de 14 especies que incluyen seres humanos. Véase, p. ej., Panek et al., “An evolutionary conserved pattern of 18S rRNA sequence complementarity to mRNA 5'UTR and its implications for eukaryotic gene translation regulation”, Nucleic Acids Research 2013, doi:10.1093/nar/gkt548.

En un ejemplo no limitante, el TEE comprende la secuencia de TEE en el 5'-líder de la proteína de homeodominio Gtx. Véase Chappell et al., PNAS 2004 101:9590-9594.

En otro ejemplo no limitante, el TEE comprende un TEE que tiene una o más de las secuencias de SEQ ID NO: 1-35 en los documentos US2009/0226470, US2013/0177581 y WO2009/075886; SEQ ID NO: 1-5 y 7-645 en los documentos WO2012/009644; y SEQ ID NO: 1 WO1999/024595, US6310197 y US6849405.

En algunos casos, el TEE es un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES), HCV-IRES o un elemento IRES tal como, pero no limitado a los descritos en: los documentos US7468275, US2007/0048776, US2011/0124100, WO2007/025008 y WO2001/055369. Los elementos IRES pueden incluir, pero no están limitados a las secuencias Gtx (p. ej., Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) como describen Chappell et al., PNAS 2004 101:9590-9594, Zhou et al., PNAS 2005 102:6273-6278, US2007/0048776, US2011/0124100 y WO2007/025008.

“Polinucleótido potenciador de la traducción” o “secuencia de polinucleótido potenciadora de la traducción” se refiere a un polinucleótido que incluye uno o más de los TEE proporcionados en el presente documento y/o conocidos en la técnica (véase, p. ej., los documentos US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, US2009/0226470, US2007/0048776, US2011/0124100, US2009/0093049, US2013/0177581, WO2009/075886, WO2007/025008, WO2012/009644, WO2001/055371, WO1999/024595, EP2610341A1 y EP2610340A1) o sus variantes, homólogos o derivados funcionales. En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una o múltiples copias de un TEE. El TEE en un polinucleótido potenciador de la traducción se puede organizar en uno o más segmentos de secuencia. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los TEE proporcionados en el presente documento, estando presente cada TEE en una o más copias. Cuando están presentes múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción, pueden ser homogéneos o heterogéneos. De esta manera, los múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción pueden albergar idénticos o diferentes tipos del TEE proporcionado en el presente documento, idéntico o diferente número de copias de cada uno de los TEE y/o idéntica o diferente organización del TEE dentro de cada segmento de secuencia. En un caso, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia de polinucleótido potenciadora de la traducción.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción comprende al menos un TEE o porción del mismo que se describe en los documentos en: WO1999/024595, WO2012/009644,WO2009/075886, WO2007/025008, WO1999/024595, WO2001/055371, EP2610341A1, EP2610340A1, US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, US2009/0226470, US2011/0124100, US2007/0048776, US2009/0093049 o US2013/0177581.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción comprende un TEE que es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntico a un TEE descrito en los documentos: US2009/0226470, US2007/0048776, US2013/0177581, US2011/0124100, WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886, WO2007/025008, EP2610341A1, EP2610340A1, US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, Chappell et al., PNAS 2004 101:9590-9594, Zhou et al., PNAS 2005 102:6273-6278, y Tabla 1 complementaria y Tabla 2 complementaria de Wellensiek et al., "Genome-wide profiling of human cap-independent translationenhancing elements," Nature Methods 2013, DOI:10.1038/NMETH.2522.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción comprende un TEE que se selecciona de un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos o un fragmento de 5-10 nucleótidos (que incluye un fragmento de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos) de una secuencia TEE descrita en los documentos: US2009/0226470, US2007/0048776, US2013/0177581, US2011/0124100, WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886, WO2007/025008, EP2610341A1, EP2610340A1, US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, Chappell et al., PNAS 2004 101:9590-9594, Zhou et al., PNAS 2005 102:6273-6278, y Tabla 1 complementaria y Tabla 2 complementaria de Wellensiek et al., "Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements," Nature Methods 2013, DOI:10.1038/NMETH.2522.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción comprende un TEE que es un elemento regulador de la transcripción descrito en cualquiera de los documentos US7456273, US7183395, US2009/0093049 y WO2001/055371. Los elementos reguladores de la transcripción se pueden identificar por métodos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitados a, los métodos descritos en los documentos US7456273, US7183395, US2009/0093049 y WO2001/055371.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR que comprende al menos un TEE descrito en el presente documento se puede incorporar en una secuencia monocistrónica tal como, pero no limitada, a un sistema de vector o un vector de ácido nucleico. Como ejemplos no limitantes, los sistemas de vector y vectores de ácido nucleico pueden incluir los descritos en los documentos US7456273, US7183395, US2007/0048776, US2009/0093049, US2011/0124100, WO2007/025008 y WO2001/055371.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción comprende un TEE o porción del mismo descrito en el presente documento. En algunos casos, los TEE en la 3'UTR pueden ser los mismos y/o diferentes del TEE ubicado en la 5'UTR.

En algunos casos, una 5'UTR y/o 3'UTR de un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias de TEE. En un caso, la 5'UTR de un polinucleótido de la descripción puede incluir 1-60, 1-55, 1-50, 1-45, 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1 20, 1-15, 1-10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 secuencias de TEE. Las secuencias de TEE en la 5'UTR del polinucleótido de la descripción pueden ser iguales o diferentes secuencias de TEE. Una combinación de diferentes secuencias de TEE en la 5'UTR del polinucleótido de la descripción puede incluir combinaciones en las que se incorporan más de una copia de cualquiera de las diferentes secuencias de TEE. Las secuencias TEE pueden estar en un patrón tal como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de los mismos repetidos una, dos, tres o más de tres veces. En estos patrones, cada letra A, B o C representa una secuencia diferente de nucleótidos de TEE.

En algunos casos, el TEE se puede identificar por los métodos descritos en los documentos US2007/0048776, US2011/0124100, WO2007/025008, WO2012/009644.

En algunos casos, la 5'UTR y/o 3'UTR comprenden un espaciador para separar dos secuencias de TEE. Como un ejemplo no limitante, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitante, la 5'UTR y/o 3'UTR comprende un módulo espaciador de secuencias de TEE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o más de 10 veces en la 5'UTR y/o 3'UTR, respectivamente. En algunos casos, la 5'UTR y/o 3'UTR comprende un módulo espaciador de secuencias de TEE repetido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces.

En algunos casos, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción del polinucleótido de la descripción, p. ej., secuencias de miR descritas en el presente documento (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). Como un ejemplo no limitante, cada espaciador utilizado para separar dos secuencias de TEE puede incluir una secuencia de miR o componente de una secuencia miR diferente (p. ej., una secuencia de semilla de miR).

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción comprende un miR y/o secuencia de TEE. En algunos casos, la incorporación de una secuencia de miR y/o una secuencia de TEE en un polinucleótido de la descripción puede cambiar la forma de la región de tallo-bucle, que puede incrementar y/o disminuir la traducción. Véase, p. ej., Kedde et al., Nature Cell Biology 2010 12(10):1014-20.

14. Sitios de unión de microRNA (miRNA)

Las secuencias de sensor incluyen, por ejemplo, sitios de unión de microRNA (miRNA), sitios de unión de factor de transcripción, secuencias y/o motivos de mRNA estructurados, sitios de unión artificiales genéticamente modificados para actuar como pseudo-receptores para moléculas de unión a ácido nucleico endógeno, y combinaciones de los mismos. Ejemplos no limitantes de secuencias de sensor se describen en la Publicación de EE. UU. 2014/0200261.

En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (RNA), p. ej., un RNA mensajero (mRNA)) de la descripción que comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A además comprende una secuencia de sensor. En algunos casos, la secuencia de sensor es un sitio de unión de miRNA.

Un miRNA es un RNA no codificante largo de 19-25 nucleótidos que se une a un polinucleótido y regula por disminución la expresión génica ya sea al reducir la estabilidad o al inhibir la traducción del polinucleótido. Una secuencia de miRNA comprende una región de “semilla”, es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-8 del miRNA maduro. Una semilla de miRNA puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 del miRNA maduro. En algunos casos, una semilla de miRNA puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-8 del miRNA maduro), en donde el sitio complementario de semilla en el sitio de unión del miRNA correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miRNA. En algunos casos, una semilla de miRNA puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-7 del miRNA maduro), en donde el sitio complementario de semilla en el sitio de unión del miRNA correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miRNA. Véase, p. ej., Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 6 de julio de 2007;27(1):91-105. Se puede llevar a cabo el perfilado del miRNA de las células o tejidos objetivo para determinar la presencia o ausencia de miRNA en las células o tejidos. En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (RNA), p. ej., un RNA mensajero (mRNA)) de la descripción comprende una o más secuencias objetivo de microRNA, secuencias de microRNA o semillas de microRNA. Tales secuencias pueden corresponder a cualquier microRNA conocido tal como los enseñados en la Publicación de EE. UU. US2005/0261218 y la Publicación de EE. UU. US2005/0059005.

Como se utiliza en el presente documento, el término “sitio de unión de microRNA (miRNA o miR)” se refiere a una secuencia dentro de un polinucleótido, p. ej., dentro de un DNA o dentro de un transcrito de RNA, incluyendo en la 5'UTR y/o 3'UTR, que tiene suficiente complementariedad con toda o una región de un miRNA para interaccionar con, asociarse con o unirse al miRNA. En algunos casos, un polinucleótido de la descripción que comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A además comprende un sitio de unión de miRNA. En casos de ejemplo, una 5'UTR y/o 3'UTR del polinucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (RNA), p. ej., un RNA mensajero (mRNA)) comprende un sitio de unión de miRNA.

Un sitio de unión de miRNA que tiene suficiente complementariedad con un miRNA se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la regulación mediada por miRNA de un polinucleótido, p. ej., la represión traduccional o degradación mediada por miRNA del polinucleótido. En aspectos de ejemplo de la descripción, un sitio de unión de miRNA que tiene suficiente complementariedad con el miRNA se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la degradación mediada por miRNA del polinucleótido, p. ej., la escisión mediada por el complejo de silenciamiento (RISC) inducido por RNA guiado por miRNA. El sitio de unión de miRNA puede tener complementariedad con, por ejemplo, una secuencia de miRNA de 19-25 nucleótidos, con una secuencia de miRNA de 19-23 nucleótidos o con una secuencia de miRNA de 22 nucleótidos. Un sitio de unión de miRNA puede ser complementario únicamente con una porción de un miRNA, p. ej., con una parte de menos de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos de la longitud completa de una secuencia de miRNA de origen natural. La complementariedad entera o completa (p. ej., complementariedad entera o complementariedad completa a lo largo de toda o una parte significativa de la longitud de un miRNA de origen natural) se prefiere cuando la regulación deseada es la degradación de mRNA.

En algunos casos, un sitio de unión de miRNA incluye una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia de semilla de miRNA. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de semilla de miRNA. En algunos casos, un sitio de unión de miRNA incluye una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia de miRNA. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de miRNA. En algunos casos, un sitio de unión de miRNA tiene complementariedad completa con una secuencia de miRNA pero para 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótido, adiciones terminales y/o truncamientos.

En algunos casos, el sitio de unión de miRNA es de la misma longitud que el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA es uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce nucleótido(s) más corto que el miRNA correspondiente en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En otros casos más, el sitio de unión de microRNA es dos nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. Los sitios de unión de miRNA que son más cortos que los miRNA correspondientes todavía son capaces de degradar el mRNA que incorpora uno o más de los sitios de unión de miRNA o impedir la traducción del mRNA.

En algunos casos, el sitio de unión de miRNA se une al miRNA maduro correspondiente que es parte de un RISC activo que contiene Dicer. En otro caso, la unión del sitio de unión de miRNA al miRNA correspondiente en RISC degrada el mRNA que contiene el sitio de unión de miRNA o impide la traducción del mRNA. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA tiene suficiente complementariedad con el miRNA de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA escinde el polinucleótido que comprende el sitio de unión de miRNA. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene complementariedad imperfecta de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA induce inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión de miRNA. En otro caso, el sitio de unión de miRNA tiene complementariedad imperfecta de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA reprime la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión de miRNA.

En algunos casos, el sitio de unión de miRNA tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce discordancias con el miRNA correspondiente.

En algunos casos, el sitio de unión de miRNA tiene al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios con al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte o al menos aproximadamente veintiún, respectivamente, nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente.

Al modificar genéticamente uno o más sitios de unión de miRNA en un polinucleótido de la descripción, el polinucleótido puede ser dirigido para la degradación o traducción reducida, con la condición de que el miRNA en cuestión esté disponible. Esto puede reducir los efectos fuera del objetivo tras el suministro del polinucleótido. Por ejemplo, si un polinucleótido de la descripción no está destinado a ser suministrado a un tejido o célula pero acaba ahí, entonces un miRNA abundante del tejido o célula puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o múltiples sitios de unión de miRNA se modifican genéticamente en la 5'UTR y/o 3'UTR del polinucleótido.

A la inversa, los sitios de unión de miRNA se pueden eliminar de las secuencias de polinucleótido en las que se encuentran de forma natural con el fin de incrementar la expresión de proteína en tejidos específicos. Por ejemplo, un sitio de unión para un miRNA específico se puede eliminar de un polinucleótido para mejorar la expresión de proteína en tejidos o células que contienen el miRNA.

En un caso, un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un sitio de unión de miRNA en la 5'UTR y/o 3'UTR con el fin de dirigir los agentes terapéuticos de mRNA citotóxicos o citoprotectores a células específicas tales como, pero no limitadas a, células normales y/o cancerosas. En otro caso, un polinucleótido de la descripción puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o más sitios de unión de miRNA en la 5'-UTR y/o 3'-UTR con el fin de dirigir los agentes terapéuticos de mRNA citotóxicos o citoprotectores a células específicas tales como, pero no limitadas a células normales y/o cancerosas.

La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede realizar a través de la introducción o eliminación de uno o más sitios de unión de miRNA. La decisión de si eliminar o insertar un sitio de unión de miRNA se puede hacer basándose en los patrones de expresión del miRNA y/o sus perfiles en las enfermedades. Se ha descrito la identificación de los miRNA, sitios de unión de miRNA y sus patrones de expresión y función en biología (p.

ej., Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404-413 (20 de dic. de 2011. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al. Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner y Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 y todas las referencias en las mismas).

Los miRNA y sitios de unión de miRNA pueden corresponder a cualquier secuencia conocida, que incluye ejemplos no limitantes descritos en las Publicaciones de EE. UU. N° 2014/0200261, 2005/0261218 y 2005/0059005.

Ejemplos de tejidos donde se sabe que los miRNA regulan el mRNA, y de esta manera la expresión de proteína, incluyen, pero no están limitados a (miR-122) de hígado, (miR-133, miR-206, miR-208) de músculo, (miR-17-92, miR-126) de células endoteliales, (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27) de células mieloides, (let-7, miR-30c) de tejido adiposo, (miR-1d, miR-149) de corazón, (miR-192, miR-194, miR-204) de riñón y (let-7, miR-133, miR-126) de células epiteliales de pulmón.

Algunos microRNA, p. ej., miR-122, son abundantes en el tejido normal pero están presentes en niveles mucho menores en tejidos de cáncer o de tumor. De esta manera la modificación genética de secuencias objetivo de microRNA (es decir, sitio de unión de microRNA) en los polinucleótidos que codifican un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12b e IL12A (p. ej., en una región similar a 3'UTR u otra región) puede dirigir efectivamente a la molécula para la degradación o traducción reducida en el tejido normal (donde el microRNA es abundante) mientras que proporciona altos niveles de traducción en el tejido de cáncer o de tumor (donde el microRNA está presente en niveles mucho menores). Esto proporciona un procedimiento que se dirige al tumor para los métodos y composiciones de la descripción.

Ejemplos adicionales de los sitios de unión de miRNA que pueden ser útiles para la presente descripción incluyen miRNA específicos de células inmunitarias que incluyen, pero no limitados a, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsalet-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184, hsa-let-7f-1-3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b- 3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR- 21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR- 24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR- 29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p,, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR- 345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p, , miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Además, los miRNA novedosos se pueden identificar en células inmunitarias mediante la hibridación en micromatrices y análisis de micrótomo (p. ej., Jima DD et al. Blood, 2010, 116:el 18-el27; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288).

Los miRNA que se sabe que se expresan en el hígado incluyen, pero no están limitados a, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p, y miR-939-5p. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico del hígado se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el hígado. Los sitios de unión de miRNA específicos del hígado se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el pulmón incluyen, pero no están limitados a, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p miR-381-3p, y miR-381-5p. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico de pulmón se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el pulmón. Los sitios de unión de miRNA específicos del pulmón se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con los sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el corazón incluyen, pero no están limitados a, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR744-5p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Los sitios de unión de miRNA de cualquier microRNA específico del corazón se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el corazón. Los sitios de unión de miRNA específicos del corazón se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con los sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el sistema nervioso incluyen, pero no están limitados a, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p,miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p,miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p, y miR-9-5p. Los miRNA enriquecidos en el sistema nervioso además incluyen los específicamente expresados en neuronas, que incluyen, pero no están limitados a, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922 y los específicamente expresados en células gliales, que incluyen, pero no limitados a, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p y miR-657. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico del CNS se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el sistema nervioso. Los sitios de unión de miRNA específicos del sistema nervioso se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con los sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el páncreas incluyen, pero no están limitados a, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p y miR-944. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico de páncreas se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el páncreas. Los sitios de unión de miRNA específicos del páncreas se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el riñón incluyen, pero no están limitados a miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p y miR-562. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico de riñón se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el riñón. Los sitios de unión de miRNA específicos del riñón se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA que se sabe que se expresan en el músculo incluyen, pero no están limitados a, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p y miR-25-5p. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico del músculo se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en el músculo. Los sitios de unión de miRNA específicos del músculo se pueden modificar genéticamente solos o además en combinación con sitios de unión de miRNA de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polinucleótido de la descripción.

Los miRNA también se expresan diferencialmente en diferentes tipos de células, tales como, pero no limitadas a, células endoteliales, células epiteliales y adipocitos.

Los miRNA que se sabe que se expresan en células endoteliales incluyen, pero no se limitan a, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a- 3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b- 2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR- 222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR- 424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Muchos miRNA novedosos se descubren en células endoteliales del análisis de secuenciación profunda (p. ej., Voellenkle C et al., RNA, 2012, 18, 472-484). Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico de células endoteliales se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en las células endoteliales.

Los miRNA que se sabe que se expresan en células epiteliales incluyen, pero no están limitados a let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 y miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p específicos en células epiteliales ciliadas respiratorias, familia let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126 específicos en células epiteliales de pulmón, miR-382-3p, miR-382-5p específicos en células epiteliales renales y miR-762 específico en células epiteliales corneales. Los sitios de unión de miRNA de cualquier miRNA específico de células epiteliales se pueden introducir o eliminar de un polinucleótido de la descripción para regular la expresión del polinucleótido en las células epiteliales.

Además, un grupo grande de miRNA está enriquecido en células madre embrionarias, que controlan la autorenovación de células madre así como el desarrollo y/o diferenciación de varios linajes de células, tales como células neurales, células cardíacas, células hematopoyéticas, células de la piel, células osteogénicas y células del músculo (p. ej., Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA y Ventura A, Semin Cáncer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; GoffLA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res, 2008,18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev. 2012, 21(11), 2049-2057). Los miRNA abundantes en las células madre embrionarias incluyen, pero no están limitados a, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a- 2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-5481, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941,miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Muchos miRNA novedosos predichos se descubrieron mediante la secuenciación profunda en células madre embrionarias humanas (p. ej., Morin RD et al., Genome Res, 2008, 18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496-2505).

En un caso, los sitios de unión de los miRNA específicos de células madre embrionarias se pueden incluir en o eliminar de la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción para modular el desarrollo y/o diferenciación de células madre embrionarias, para inhibir la senescencia de las células madre en una afección degenerativa (p. ej., enfermedades degenerativas), o para estimular la senescencia y apoptosis de células madre en una afección patológica (p. ej., células madre de cáncer).

Muchos estudios de expresión de miRNA se llevan a cabo para perfilar la expresión diferencial de los miRNA en varias células/tejidos de cáncer y otras enfermedades. Algunos miRNA son sobreexpresados anormalmente en ciertas células de cáncer y otros son subexpresados. Por ejemplo, los miRNA se expresan diferencialmente en células de cáncer (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO2011/157294); células madre de cáncer (US2012/0053224); cánceres y enfermedades pancreáticas (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); asma e inflamación (US8415096); cáncer de próstata (US2013/0053264); carcinoma hepatocelular (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); células de cáncer de pulmón (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); linfoma de células T cutáneas (WO2013/011378); células de cáncer colorrectal (WO2011/0281756, WO2011/076142); ganglios linfáticos positivos para cáncer (WO2009/100430, US2009/0263803); carcinoma nasofaríngeo (EP2112235); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (US2012/0264626, US2013/0053263); cáncer de tiroides (WO2013/066678); células de cáncer ovárico (US2012/0309645, WO2011/095623); células de cáncer de mama (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), leucemia y linfoma (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563).

Como un ejemplo no limitante, los sitios de unión de miRNA para los miRNA que son sobreexpresados en ciertas células de cáncer y/o de tumor se pueden eliminar de la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción, restableciendo la expresión suprimida por los miRNA sobreexpresados en células de cáncer, para de esta manera mejorar la función biológica correspondiente, por ejemplo, estimulación y/o represión de la transcripción, detención del ciclo celular, apoptosis y muerte celular. Las células y tejidos normales, en donde la expresión de los miRNA no es regulada por aumento, permanecerán no afectados.

El miRNA también puede regular procesos biológicos complejos tales como angiogénesis (p. ej., miR-132) (Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polinucleótidos de la descripción, los sitios de unión de miRNA que están implicados en tales procesos se pueden eliminar o introducir, con el fin de adaptar la expresión de los polinucleótidos a tipos de células biológicamente relevantes o procesos biológicamente relevantes. En este contexto, los polinucleótidos de la descripción se definen como polinucleótidos auxotróficos.

En algunos casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., el sitio de unión de miR-122) es completamente complementario de miRNA (p. ej., miR-122), para de esta manera degradar el mRNA fusionado al sitio de unión del miRNA. En otros casos, el sitio de unión de miRNA no es completamente complementario al miRNA correspondiente. En ciertos casos, el sitio de unión de miRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es de la misma longitud que el miRNA correspondiente (p. ej., miR-122). En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es un nucleótido más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122, que tiene 22 nts) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En otros casos más, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es dos nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En todavía otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es tres nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En algunos casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es cuatro nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es cinco nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En algunos casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es seis nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es siete nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es ocho nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es nueve nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es diez nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es once nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. En otros casos, el sitio de unión de microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) es doce nucleótidos más corto que el microRNA correspondiente (p. ej., miR-122) en el extremo 5' o el extremo 3'. Los sitios de unión de miRNA que son más cortos que los miRNA correspondientes son todavía capaces de degradar el mRNA que incorpora uno o más de los sitios de unión de miRNA o impedir la traducción del mRNA.

En algunos casos, el sitio de unión del microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) tiene suficiente complementariedad con el miRNA (p. ej., miR-122) de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA (p. ej., miR-122) escinde el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microRNA. En otros casos, el sitio de unión del microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) tiene complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA (p. ej., miR-122) induce inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión del microRNA. En otro caso, el sitio de unión del microRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) tiene complementariedad imperfecta de modo que un complejo RISC que comprende el miRNA (p. ej., miR-122) reprime la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión del microRNA. En un caso, el sitio de unión del miRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) tiene una discordancia con el miRNA correspondiente (p. ej., miR-122). En otro caso, el sitio de unión de miRNA tiene dos discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene tres discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene cuatro discordancias con el miRNA correspondiente. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA tiene cinco discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene seis discordancias con el miRNA correspondiente. En ciertos casos, el sitio de unión de miRNA tiene siete discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene ocho discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene nueve discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene diez discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene once discordancias con el miRNA correspondiente. En otros casos, el sitio de unión de miRNA tiene doce discordancias con el miRNA correspondiente.

En ciertos casos, el sitio de unión de miRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) tiene al menos aproximadamente diez nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente diez nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente (p. ej., miR-122), al menos aproximadamente once nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente once nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente doce nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente doce nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente trece nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente trece nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, o al menos aproximadamente catorce nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente catorce nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente. En algunos casos, los sitios de unión de miRNA tienen al menos aproximadamente quince nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente quince nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente dieciséis nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente diecisiete nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente dieciocho nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente diecinueve nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, al menos aproximadamente veinte nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente veinte nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios de al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos del miRNA correspondiente.

En algunos casos, los polinucleótidos comprenden un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A y al menos un sitio de unión de miR-122, al menos dos sitios de unión de miR-122, al menos tres sitios de unión de miR-122, al menos cuatro sitios de unión de miR-122, o al menos cinco sitios de unión miR-122. En un aspecto, el sitio de unión de miRNA se une a miR-122 o es complementario de miR-122. En otro aspecto, el sitio de unión de miRNA se une a miR-122-3p o miR-122-5p. En un aspecto particular, el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 52 o 54, en donde el sitio de unión de miRNA se une a miR-122. En otro aspecto particular, el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 54, en donde el sitio de unión de miRNA se une a miR-122. Estas secuencias se muestran a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7. miR-122 sitios de unión de miR-122

En algunos casos, se inserta un sitio de unión de miRNA (p. ej., sitio de unión de miR-122) en el polinucleótido de la descripción en cualquier posición del polinucleótido (p. ej., 3' UTR); el sitio de inserción en el polinucleótido puede ser en cualquier parte en el polinucleótido siempre que la inserción del sitio de unión de miRNA en el polinucleótido no interfiera con la traducción del polipéptido de IL12B funcional, polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A en la ausencia del miRNA correspondiente (p. ej., miR-122); y en la presencia de miRNA (p. ej., miR-122), la inserción del sitio de unión de miRNA en el polinucleótido y la unión del sitio de unión de miRNA al miRNA correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del polinucleótido. En un caso, un sitio de unión de miRNA se inserta en una 3'UTR del polinucleótido.

En ciertos casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en al menos aproximadamente 30 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención de un mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. En otros casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos o al menos aproximadamente 100 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención del polinucleótido, p. ej., mRNA que codifica el polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. En otros casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, aproximadamente 45 nucleótidos a aproximadamente 65 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención del polinucleótido, p. ej., mRNA que codifica el polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA se inserta secuencia abajo del codón de detención en la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL12 como se describe en el presente documento. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA se inserta secuencia abajo del codón de detención en la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de membrana como se describe en el presente documento. En algunos casos, el sitio de unión de miRNA se inserta secuencia abajo del codón de detención en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en el polinucleótido de la descripción en cualquier posición del polinucleótido (p. ej., la 5'UTR y/o 3'UTR). En algunos casos, la 5'UTR comprende un sitio de unión de miRNA. En algunos casos, la 3'UTR comprende un sitio de unión de miRNA. En algunos casos, la 5'UTR y la 3'UTR comprenden un sitio de unión de miRNA. El sitio de inserción en el polinucleótido puede ser en cualquier parte en el polinucleótido siempre que la inserción del sitio de unión de miRNA en el polinucleótido no interfiera con la traducción de un polipéptido funcional en la ausencia del miRNA correspondiente; y en la presencia del miRNA, la inserción del sitio de unión de miRNA en el polinucleótido y la unión del sitio de unión de miRNA al miRNA correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o impedir la traducción del polinucleótido.

En algunos casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en al menos aproximadamente 30 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención de un ORF en un polinucleótido de la descripción que comprende el ORF. En algunos casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos o al menos aproximadamente 100 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención de un ORF en un polinucleótido de la descripción. En algunos casos, un sitio de unión de miRNA se inserta en aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, aproximadamente 45 nucleótidos a aproximadamente 65 nucleótidos secuencia abajo del codón de detención de un ORF en un polinucleótido de la descripción.

La regulación del gen por el miRNA puede estar influida por la secuencia que rodea al miRNA tal como, pero no limitado a, la especie de la secuencia circundante, el tipo de secuencia (p. ej., heteróloga, homóloga, exógena, endógena o artificial), elementos reguladores en la secuencia circundante y/o elementos estructurales en la secuencia circundante. El miRNA puede estar influido por la 5'UTR y/o 3'UTR. Como un ejemplo no limitante, una 3'UTR no humana puede incrementar el efecto regulador de la secuencia de miRNA en la expresión de un polipéptido de interés comparado con una 3'UTR humana del mismo tipo de secuencia.

En un caso, otros elementos reguladores y/o elementos estructurales de la 5'UTR pueden influir en la regulación del gen mediada por miRNA. Un ejemplo de un elemento regulador y/o elemento estructural es un IRES estructurado (Sitio interno de entrada al ribosoma) en la 5'UTR, que es necesario para la unión de factores de elongación de la traducción para iniciar la traducción de la proteína. La unión de EIF4A2 a este elemento secundariamente estructurado en la 5'-UTR es necesario para la expresión del gen mediada por miRNA (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85). Los polinucleótidos de la descripción además pueden incluir estas 5'u Tr estructuradas con el fin de aumentar la regulación del gen mediada por microRNA.

Al menos un sitio de unión de miRNA se puede modificar genéticamente en la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. En este contexto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, o más sitios de unión de miRNA se pueden modificar genéticamente en una 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. Por ejemplo, de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 2 o 1 sitios de unión de miRNA se pueden modificar genéticamente en la 3'UTR de un polinucleótido de la descripción. En un caso, los sitios de unión de miRNA incorporados en un polinucleótido de la descripción pueden ser los mismos o pueden ser diferentes sitios de miRNA. Una combinación de diferentes sitios de unión de miRNA incorporados en un polinucleótido de la descripción pueden incluir combinaciones en las cuales se incorporan más de una copia de cualquiera de los sitios de miRNA diferentes. En otro caso, los sitios de unión de miRNA incorporados en un polinucleótido de la descripción pueden dirigirse a los mismos o diferentes tejidos en el cuerpo. Como un ejemplo no limitante, mediante la introducción de los sitios de unión de miRNA específicos de tejido, tipo de célula o enfermedad en la 3'-UTR de un polinucleótido de la descripción, se puede reducir el grado de expresión en tipos de células específicas (p. ej., hepatocitos, células mieloides, células endoteliales, células de cáncer, etc.).

En un caso, un sitio de unión de miRNA se puede modificar genéticamente cerca del extremo 5' de la 3'UTR, aproximadamente a la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR y/o cerca del extremo 3' de la 3'UTR en un polinucleótido de la descripción. Como un ejemplo no limitante, un sitio de unión de miRNA se puede modificar genéticamente cerca del extremo 5' terminal de la 3'UTR y aproximadamente a la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' terminal de la 3'UTR. Como otro ejemplo no limitante, un sitio de unión de miRNA se puede modificar genéticamente cerca del extremo 3' de la 3'UTR y aproximadamente a la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'UTR. Como otro ejemplo más no limitante, un sitio de unión de miRNA se puede modificar genéticamente cerca del extremo 5' de la 3'UTR y cerca del extremo 3' de la 3'UTR.

En otro caso, una 3'UTR puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de unión de miRNA. Los sitios de unión de miRNA pueden ser complementarios de un miRNA, secuencia de semilla de miRNA y/o secuencias de miRNA que flanquean la secuencia de semilla.

En un caso, un polinucleótido de la descripción se puede modificar genéticamente para incluir más de un sitio de miRNA expresado en diferentes tejidos o diferentes tipos de células de un sujeto. Como un ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción se puede modificar genéticamente para incluir miR-192 y miR-122 para regular la expresión del polinucleótido en el hígado y riñones de un sujeto. En otro caso, un polinucleótido de la descripción se puede modificar genéticamente para incluir más de un sitio de miRNA para el mismo tejido.

En algunos casos, la ventana terapéutica y/o expresión diferencial asociada con el polipéptido codificado por un polinucleótido de la descripción se puede alterar con un sitio de unión de miRNA. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido que proporciona una señal de muerte se puede diseñar para ser más altamente expresado en células de cáncer en virtud de la firma del miRNA de esas células. Donde una célula de cáncer expresa un nivel inferior de un miRNA particular, el polinucleótido que codifica el sitio de unión para ese miRNA (o esos miRNA) sería más altamente expresado. Por consiguiente, el polipéptido que proporciona una señal de muerte activa o induce la muerte celular en la célula de cáncer. Las células no cancerosas próximas, que albergan una expresión más alta del mismo miRNA, serían menos afectadas por la señal de muerte codificada ya que el polinucleótido sería expresado en un nivel inferior debido a los efectos de la unión del miRNA al sitio de unión o “sensor” codificado en la 3'UTR. A la inversa, la supervivencia de la célula o señales citoprotectoras se pueden suministrar a tejidos que contienen células de cáncer y no cancerosas donde un miRNA tiene una expresión más alta en las células de cáncer, siendo el resultado una señal de supervivencia inferior a la célula de cáncer y una señal de supervivencia más grande a la célula normal. Se pueden diseñar y administrar múltiples polinucleótidos que tienen diferentes señales basado en el uso de los sitios de unión de miRNA como se describe en el presente documento.

En algunos casos, la expresión de un polinucleótido de la descripción se puede controlar incorporando al menos una secuencia de sensor en el polinucleótido y formulando el polinucleótido para la administración. Como un ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción se puede dirigir a un tejido o célula incorporando un sitio de unión a miRNA y formulando el polinucleótido en una nanopartícula de lípido que comprende un lípido catiónico, que incluye cualquiera de los lípidos descritos en el presente documento.

Un polinucleótido de la descripción se puede modificar genéticamente para una expresión más dirigida en tejidos, tipos de células o condiciones biológicas específicas basado en los patrones de expresión de los miRNA en los diferentes tejidos, tipos de células o condiciones biológicas. Mediante la introducción de sitios de unión de miRNA específicos del tejido, un polinucleótido de la descripción se puede diseñar para la expresión de proteína óptima en un tejido o célula, o en el contexto de una condición biológica.

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción se puede diseñar para incorporar sitios de unión de miRNA que tienen ya sea 100% de identidad con secuencias de semilla de miRNA conocidas o tienen menos de 100% de identidad con secuencias de semilla de miRNA. En algunos casos, un polinucleótido de la descripción se puede diseñar para incorporar sitios de unión de miRNA que tienen al menos: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con secuencias de semilla de miRNA conocidas. La secuencia de semilla de miRNA puede ser parcialmente mutada para disminuir la afinidad de unión del miRNA y como tal dar como resultado la modulación por disminución reducida del polinucleótido. En esencia, el grado de concordancia o discordancia entre el sitio de unión de miRNA y la semilla de miRNA puede actuar como un reóstato para adecuar con más precisión la capacidad del miRNA para modular la expresión de proteína. Además, la mutación en la región no de semilla de un sitio de unión de miRNA también puede tener impacto en la capacidad de un miRNA para modular la expresión de proteína.

En un caso, una secuencia de miRNA se puede incorporar en el bucle de un tallo-bucle.

En otro caso, una secuencia de semilla de miRNA se puede incorporar en el bucle de un tallo-bucle y un sitio de unión de miRNA se puede incorporar en el tallo 5' o 3' del tallo-bucle.

En un caso, un elemento potenciador de la traducción (TEE) se puede incorporar en el extremo 5' del tallo de un tallo-bucle y una semilla de miRNA se puede incorporar en el tallo del tallo-bucle. En otro caso, un TEE se puede incorporar en el extremo 5' del tallo de un tallo-bucle, una semilla de miRNA se puede incorporar en el tallo del tallo-bucle y un sitio de unión de miRNA se puede incorporar en el extremo 3' del tallo o la secuencia después del tallo-bucle. La semilla de miRNA y el sitio de unión de miRNA pueden ser para las mismas y/o diferentes secuencias de miRNA.

En un caso, la incorporación de una secuencia de miRNA y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región de tallo-bucle lo cual puede incrementar y/o disminuir la traducción (véase, p. ej., Kedde et al., “A Pumilioinduced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility”. Nature Cell Biology.

2010 ).

En un caso, la 5'-UTR de un polinucleótido de la descripción puede comprenden al menos una secuencia de miRNA. La secuencia de miRNA puede ser, pero no está limitada, a una secuencia de 19 o 22 nucleótidos y/o una secuencia de miRNA sin la semilla.

En un caso, la secuencia de miRNA en la 5'UTR se puede utilizar para estabilizar un polinucleótido de la descripción descrito en el presente documento.

En otro caso, una secuencia de miRNA en la 5'UTR de un polinucleótido de la descripción se puede utilizar para disminuir la accesibilidad del sitio de iniciación de traducción tal como, pero no limitado a un codón de inicio. Véase, p. ej., Matsuda et al., PLoS One. 2010 11(5):e15057, que utiliza oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos de unión de exón (EJC) alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) con el fin de disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG). Matsuda mostró que la alteración de la secuencia alrededor del codón de inicio con un LNA o EJC afectaba a la eficiencia, longitud y estabilidad estructural de un polinucleótido. Un polinucleótido de la descripción puede comprender una secuencia de miRNA, en lugar de la secuencia de LNA o EJC descrita por Matsuda et al., cerca del sitio de iniciación de traducción con el fin de disminuir la accesibilidad al sitio de iniciación de traducción. El sitio de iniciación de traducción puede estar antes de, después o dentro de la secuencia de miRNA. Como un ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de traducción se puede ubicar dentro de una secuencia de miRNA tal como la secuencia de semilla o sitio de unión. Como otro ejemplo no limitante, el sitio de iniciación de traducción se puede ubicar dentro de una secuencia de miR-122 tal como la secuencia de semilla o el sitio de unión de mir-122.

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un miRNA con el fin de amortiguar la expresión del polipéptido codificado en un tejido o célula de interés. Como un ejemplo no limitante, un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos sitio de unión de miR-122 con el fin de amortiguar la expresión de un polipéptido codificado de interés en el hígado. Como otro ejemplo no limitante un polinucleótido de la descripción puede incluir al menos un sitio de unión de miR-142-3p, secuencia de semilla de miR-142-3p, sitio de unión de miR-142-3p sin la semilla, sitio de unión de miR-142-5p, secuencia de semilla de miR-142-5p, sitio de unión de miR-142-5p sin la semilla, sitio de unión de miR-146, secuencia de semilla de miR-146 y/o sitio de unión de miR-146 sin la secuencia de semilla.

En algunos casos, un polinucleótido de la descripción puede comprender al menos un sitio de unión de miRNA en la 3'UTR con el fin de degradar selectivamente los agentes terapéuticos de mRNA en las células inmunitarias para atenuar las reacciones inmunogénicas indeseadas causadas por el suministro del agente terapéutico. Como un ejemplo no limitante, el sitio de unión de miRNA puede hacer a un polinucleótido de la descripción más inestable en células presentadoras de antígeno. Ejemplos no limitantes de estos miRNA incluyen mir-122-5p o mir-122-3p.

En un caso, un polinucleótido de la descripción comprende al menos una secuencia de miRNA en una región del polinucleótido que puede interaccionar con una proteína de unión de RNA.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que comprende (i) una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A (p. ej., la secuencia de tipo natural, fragmento funcional o variante de la misma) y (ii) un sitio de unión de miRNA (p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miR-122).

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción comprende una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A descritos en el presente documento y un sitio de unión de miRNA descrito en el presente documento, p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miR-122. En algunos casos, la secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12^b, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A comprende al menos una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo. En algunos casos, al menos 95% de un tipo de nucleobase (p. ej., uracilo) en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12a y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A de la descripción son nucleobases modificadas. En algunos casos, al menos 95% de uracilo en una secuencia modificada en uracilo que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A es 5-metoxiuridina. En algunos casos, el polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A descritos en el presente documento y un sitio de unión de miRNA se formula con un agente de suministro, p. ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 o cualquiera de los Compuestos 1-232.

15. 3'UTR y los elementos ricos en AU

En ciertos casos, un polinucleótido de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A de la descripción) además comprende una 3'UTR.

La 3'-UTR es la sección del mRNA que sigue inmediatamente al codón de terminación de la traducción y frecuentemente contiene regiones reguladoras que influyen post-transcripcionalmente en la expresión génica. Las regiones reguladoras dentro de la 3'-UTR pueden influir en la poliadenilación, eficiencia de traducción, localización y estabilidad del mRNA. En un caso, la 3'-UTR útil para la descripción comprende un sitio de unión para proteínas reguladoras o microRNA. En algunos casos, la 3'-UTR tiene una región silenciadora, que se une a proteínas represoras e inhibe la expresión del mRNA. En otros casos, la 3'-UTR comprende un elemento rico en AU. La proteína se une a los ARE para afectar a la estabilidad o velocidad de degradación de los transcritos de una manera localizada o afectar a la iniciación de traducción. En otros casos, la 3'-UTR comprende la secuencia AAUAAA que dirige la adición de varios cientos de restos de adenina llamado la cola de poli(A) al extremo del transcrito de mRNA.

Las 3'UTR naturales o de tipo natural se sabe que tienen tramos de adenosinas y uridinas insertadas en ellas. Estas firmas ricas en AU son particularmente prevalentes en genes con altas velocidades de renovación. Basado en sus características de secuencia y propiedades funcionales, los elementos ricos en AU (ARE) se pueden separar en tres clases (Chen et al., 1995): los ARE de Clase I contienen varias copias dispersadas de un motivo AUUUA dentro de las regiones ricas en U. C-Myc y MyoD contienen ARE de Clase I. Los ARE de clase II poseen dos o más nonámeros UUAUUUA(U/A)(U/A) que solapan. Las moléculas que contienen este tipo de ARE incluyen GM-CSF y TNF-a. Los ARE de Clase III están peor definidos. Estas regiones ricas en U no contienen un motivo AUUUA. c-Jun y Miogenina son dos ejemplos bien estudiados de esta clase. La mayoría de proteínas que se unen a los ARE se sabe que desestabilizan el mensajero, mientras que los miembros de la familia ELAV, más en particular HuR, se ha documentado que aumentan la estabilidad de mRNA. HuR se une a los ARE de las tres clases. La modificación genética de los sitios de unión específicos de HuR en la 3' UTR de moléculas de ácido nucleico conducirá a la unión de HuR y de esta manera, a la estabilización del mensaje in vivo.

La introducción, eliminación o modificación de elementos ricos en AU (ARE) de 3'UTR se puede utilizar para modular la estabilidad de los polinucleótidos de la descripción. Cuando se modifican genéticamente polinucleótidos específicos, se puede introducir una o más copias de un ARE para hacer los polinucleótidos de la descripción menos estables y de esta manera reducir la traducción y disminuir la producción de la proteína resultante. Del mismo modo, los ARE se pueden identificar y eliminar o mutar para incrementar la estabilidad intracelular y de esta manera incrementar la traducción y producción de la proteína resultante. Los experimentos de transfección se pueden llevar a cabo en líneas celulares relevantes, utilizando polinucleótidos de la descripción y la producción de proteínas se puede ensayar en varios puntos de tiempo de la posttransfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes moléculas de modificación genética con ARE y utilizar un kit de ELISA para la proteína relevante y ensayar la proteína producida a las 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas y 7 días de post-transfección.

En ciertos casos, la 3'UTR útil para los polinucleótidos de la descripción comprende una 3'UTR seleccionada de aquellas mostradas en esta solicitud.

En ciertos casos, la secuencia de 3'UTR útil para la descripción comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias de 3'UTR listadas en el presente documento y cualquier combinación de las mismas.

16. Regiones que tienen una caperuza 5'

La descripción también incluye un polinucleótido que comprende tanto una caperuza 5' como un polinucleótido de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A).

La estructura de caperuza 5' de un mRNA natural está implicada en la exportación nuclear, aumentando la estabilidad del mRNA y se une a la proteína de unión a caperuza de mRNA (CBP), que es responsable de la estabilidad del mRNA en la célula y la competencia de traducción a través de la asociación de CBP con la proteína de unión a poli(A) para formar las especies de mRNA cíclicas maduras. La caperuza además ayuda a la eliminación de los intrones próximos a 5' durante el empalme del mRNA.

Las moléculas de mRNA endógenas se pueden terminar en caperuza en el extremo 5' generando una unión 5'-ppp-5'-trifosfato entre un resto de caperuza de guanosina terminal y el nucleótido de sentido directo transcrito 5'-terminal de la molécula de mRNA. Esta caperuza de 5'-guanilato luego se puede metilar para generar un resto de N7-metil-guanilato. Los azúcares de ribosa de los nucleótidos transcritos terminales y/o anteterminales del extremo 5' del mRNA opcionalmente pueden ser 2'-O-metilados. La eliminación de la caperuza de 5' mediante hidrólisis y escisión de la estructura de caperuza de guanilato puede dirigir una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de mRNA, a la degradación.

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) incorporan un motivo de caperuza.

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) comprenden una estructura de caperuza no hidrolizable que previene la eliminación de la caperuza y de esta manera incrementa la semivida del mRNA. Debido a que la hidrólisis de la estructura de caperuza requiere la escisión de uniones 5'-ppp-5'-fosforodiéster, se pueden utilizar nucleótidos modificados durante la reacción de formación de caperuza. Por ejemplo, una enzima de formación de caperuza de Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) se puede utilizar con nucleótidos de a-tio-guanosina de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear un enlace de fosforotioato en 5'-ppp-5'-caperuza. Se pueden utilizar nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metilfosfonato y seleno-fosfato.

Las modificaciones adicionales incluyen, pero no están limitadas a, 2'-O-metilación de los azúcares de ribosa de los nucleótidos 5'-terminales y/o 5'-anteterminales del polinucleótido (como se menciona en lo anterior) en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. Se pueden utilizar múltiples estructuras de 5'-caperuza distintas para generar la 5'-caperuza de una molécula de ácido nucleico, tal como un polinucleótido que funciona como una molécula de mRNA. Análogos de caperuza, que en el presente documento también se denominan análogos de caperuza sintéticos, caperuzas químicas, análogos de caperuza químicos o análogos de caperuza estructurales o funcionales, difieren de las 5'-caperuzas naturales (es decir, endógenas, de tipo natural o fisiológicas) en su estructura química, mientras que retienen la función de caperuza. Los análogos de caperuza pueden ser químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente sintetizados y/o unirse a los polinucleótidos de la descripción.

Por ejemplo, el análogo de caperuza anti-inversa (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, en donde una guanina contiene un grupo N7-metilo así como un el grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que se puede designar de forma equivalente 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, queda unido al nucleótido 5'-terminal del polinucleótido con caperuza. La guanina N7- y 3'-O-metilada proporciona el motivo terminal del polinucleótido con caperuza.

Otro caperuza de ejemplo es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).

En algunos casos, la caperuza es un análogo de caperuza de dinucleótido. Como un ejemplo no limitante, el análogo de caperuza de dinucleótido se puede modificar en diferentes posiciones de fosfato con un grupo de boranofosfato o un grupo de fosforoselenoato tal como los análogos de caperuza de dinucleótido descritos en la Patente de EE. UU. N° US 8,519,110.

En otro caso, la caperuza es un análogo de caperuza que es una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento. Ejemplos no limitantes de una forma de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de caperuza incluyen un N7-(4-clorofenoxietil)-G(5')ppp(5')G y un análogo de caperuza N7-(4-clorofenoxietil)-m3' OG(5')ppp(5')G (Véase, p. ej., los diversos análogos de caperuza y los métodos de síntesis de análogos de caperuza descritos en Kore et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574). En otro caso, un análogo de caperuza de la presente descripción es un análogo 4-cloro/bromofenoxietilo.

Aunque los análogos de caperuza permiten la formación de caperuza concomitante de un polinucleótido o una región del mismo, en una reacción de transcripción in vitro, hasta 20% de transcritos pueden permanecer sin caperuza. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de caperuza respecto de las estructuras 5'-caperuza endógenas de ácidos nucleicos producidos por la maquinaria de transcripción celular, endógena, puede conducir a la competencia de traducción reducida y estabilidad celular reducida.

Los polinucleótidos de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) también se pueden terminar en caperuza en la post-fabricación (ya sea IVT o síntesis química) utilizando enzimas, con el fin de generar estructuras de 5'-caperuza más auténticas. Como se utiliza en el presente documento, la frase “más auténtica” se refiere a una característica que estrechamente se asemeja a o imita, ya sea estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo natural. Es decir, una característica “más auténtica” es más representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo natural, natural o fisiológica comparado con las características o análogos sintéticos, etc., de la técnica anterior, o que se supera la característica endógena, de tipo natural, natural o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Ejemplos no limitantes de estructuras de caperuza 5' más auténticas de la presente descripción son aquellas, que entre otras cosas, tienen unión aumentada de proteínas de unión a caperuza, semivida incrementada, susceptibilidad reducida a 5' endonucleasas y/o eliminación de caperuza 5' reducida, comparado con las estructuras 5'-caperuza sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de 5'-caperuza de tipo natural, natural o fisiológica). Por ejemplo, la enzima de formación de caperuza de virus de vaccinia y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace de 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-terminal de un polinucleótido y un nucleótido caperuza de guanina en donde la guanina de caperuza contiene una N7 metilación y el nucleótido 5'-terminal del mRNA contiene un 2'-O-metilo. Tal estructura se llama la estructura Cap1. Esta caperuza da como resultado una competencia de traducción y estabilidad celular más altas y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, comparado, p. ej., con otras estructuras de análogo de 5'-caperuza conocidas en la técnica. Las estructuras de caperuza incluyen, pero no están limitadas a, 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1), y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (caperuza 2).

Como un ejemplo no limitante, la terminación con caperuza de los polinucleótidos quiméricos post-fabricación puede ser más eficiente ya que casi 100% de los polinucleótidos quiméricos pueden terminarse con caperuza. Esto está en contraste con ~80% cuando un análogo de caperuza se une a un polinucleótido quimérico en el transcurso de una reacción de transcripción in vitro.

De acuerdo con la presente descripción, las caperuzas 5' terminales pueden incluir caperuzas endógenas o análogos de caperuza. De acuerdo con la presente descripción, un caperuza 5' terminal puede comprender un análogo de guanina. Los análogos de guanina útiles incluyen, pero no están limitados a inosina, N1-metilguanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.

En ciertos casos, la estructura de caperuza 5' terminal es una CapO, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2- amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, caperuza de 5' metilG o un análogo de los mismos.

17. Colas de Poli-A

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A además comprende una cola de poli-A. En casos adicionales, los grupos terminales en la cola de poli-A se pueden incorporar para estabilización. En otros casos, una cola de poli-A comprende colas de des-3'-hidroxilo.

Durante el procesamiento de RNA, se puede añadir una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola de poli-A) a un polinucleótido tal como una molécula de mRNA con el fin de incrementar la estabilidad. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se puede escindir para liberar un 3' hidroxilo. Luego la poli-A polimerasa añade una cadena de nucleótidos de adenina al RNA. El proceso, llamado poliadenilación, añade una cola de poli-A que puede ser de entre, por ejemplo, aproximadamente 80 a aproximadamente 250 restos de largo, incluyendo aproximadamente 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 restos de largo.

Las colas de PoliA también se pueden añadir después de que la construcción se exporta del núcleo.

De acuerdo con la presente descripción, los grupos terminales en la cola de poli A se pueden incorporar para la estabilización. Los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir colas de des-3'-hidroxilo. También pueden incluir motivos estructurales o modificaciones de 2'-O-metilo como enseñan Junjie Li et al. (Current Biology, Vol. 15, 1501-1507, 23 de Agosto de 2005).

Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden diseñar para codificar transcritos con estructuras de cola de poliA alternativas que incluyen mRNA de histona. Según Norbury, “La uridilación terminal también se ha detectado en mRNA de histona dependientes de replicación humana. El recambio de estos mRNA se cree que es importante para la prevención de la acumulación de histona potencialmente tóxica después de completarse o de la inhibición de la replicación de DNA cromosómico. Estos mRNA se distinguen por su carencia de una cola de 3' poli(A), cuya función es asumida en su lugar por una estructura de tallo-bucle estable y su proteína de unión a tallo-bucle cognada (SLBP); esta última lleva a cabo las mismas funciones que las de PABP en mRNA poliadenilados” (Norbury, “Cytoplasmic RNA: a case of the tail wagging the dog”, Nature Reviews Molecular Cell Biology; AOP, publicado en línea el 29 de Agosto de 2013; doi:10.1038/nrm3645).

Las longitudes de cola de poli-A únicas proporcionan ciertas ventajas a los polinucleótidos de la presente descripción. Generalmente, la longitud de una cola de poli-A, cuando está presente, es mayor que 30 nucleótidos en longitud. En otro caso, la cola de poli-A es mayor que 35 nucleótidos en longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500 y 3000 nucleótidos).

En algunos casos, el polinucleótido o región del mismo incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2000, de 1500 a 2500, de 1500 a 3000, de 2000 a 3000, de 2000 a 2500 y de 2500 a 3000).

En algunos casos, la cola de poli-A se diseña con respecto a la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región particular del polinucleótido. Este diseño se puede basar en la longitud de una región de codificación, la longitud de una característica o región particular o basar en la longitud del producto final expresado de los polinucleótidos.

En este contexto, la cola de poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% mayor en longitud que el polinucleótido o característica del mismo. La cola de poli-A también se puede diseñar como una fracción de los polinucleótidos a la cual pertenece. En este contexto, la cola de poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la longitud total de la construcción, una región de la construcción o la longitud total de la construcción menos la cola de poli-A. Además, los sitios de unión genéticamente modificados y la conjugación de polinucleótidos para la proteína de unión a Poli-A pueden aumentar la expresión.

Adicionalmente, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir entre si a través de la PABP (proteína de unión a Poli-A) a través del extremo 3' utilizando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola de poli-A. Los experimentos de transfección se pueden llevar a cabo en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y el día 7 posttransfección.

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción se diseñan para incluir una región de poli A-cuartete-G. El cuartete-G es una disposición unida a hidrógeno cíclica de cuatro nucleótidos de guanina que se pueden formar por secuencias ricas en G tanto en DNA como en RNA. En este caso, el cuartete-G se incorpora al final de la cola de poli-A. El polinucleótido resultante se ensaya para determinar la estabilidad, producción de proteína y otros parámetros que incluyen la semivida en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el poliA-cuartete-G da como resultado la producción de proteínas de un mRNA equivalente a al menos 75% de la observada utilizando únicamente una cola de poli-A de 120 nucleótidos.

18. Región de codón de inicio

La descripción también incluye un polinucleótido que comprende tanto una región de codón de inicio como el polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A). En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción pueden tener regiones que son análogas o funcionan como una región de codón de inicio.

En algunos casos, la traducción de un polinucleótido se puede iniciar en un codón que no es el codón de inicio AUG. La traducción del polinucleótido se puede iniciar en un codón de inicio alternativo tal como, pero no limitado a ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG (véase Touriol et al. Biology of the Cell 95 (2003) 169-178 y Matsuda y Mauro PLoS ONE, 20105:11).

Como ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitante, la traducción del polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo CTG o CUG. Como todavía otro ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo GTG o GUG.

Los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción tal como, pero no limitado a, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo, se sabe que afectan a la eficiencia de traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido. (Véase, p. ej., Matsuda y Mauro PLoS ONE, 20105:11). El enmascaramiento de cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción se puede utilizar para alterar la posición de la iniciación de traducción, eficiencia de traducción, longitud y/o estructura de un polinucleótido.

En algunos casos, un agente de enmascaramiento se puede utilizar cerca del codón de inicio o codón de inicio alternativo con el fin de enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de iniciación de la traducción en el codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo. Ejemplos no limitantes de agentes de enmascaramiento incluyen los ácidos nucleicos bloqueados antisentido (LNA) en polinucleótidos y complejos de unión de exón (EJC) (Véase, p. ej., Matsuda y Mauro, que describen agentes de enmascaramiento polinucleótidos de LNA y EJC (PLoS ONE, 20105:11).

En otro caso, un agente de enmascaramiento se puede utilizar para enmascarar un codón de inicio de un polinucleótido con el fin de incrementar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio alternativo. En algunos casos, un agente de enmascarado se puede utilizar para enmascarar un primer codón de inicio o codón de inicio alternativo con el fin de incrementar la oportunidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio o codón de inicio alternativo secuencia abajo del codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo.

En algunos casos, un codón de inicio o codón de inicio alternativo se puede ubicar dentro de un complemento perfecto para un elemento de unión de miR. El complemento perfecto de un sitio de unión de miR puede ayudar a controlar la traducción, longitud y/o estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como un ejemplo no limitante, el codón de inicio o codón de inicio alternativo se pueden ubicar en la parte intermedia de un complemento perfecto para un sitio de unión de miRNA. El codón de inicio o codón de inicio alternativo se puede ubicar después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido, decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.

En otro caso, el codón de inicio de un polinucleótido se puede eliminar de la secuencia de polinucleótido con el fin de que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no es el codón de inicio. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón después del codón de inicio eliminado o en un codón de inicio secuencia abajo o un codón de inicio alternativo. En un ejemplo no limitante, el codón de inicio ATG o AUG se elimina como los 3 primeros nucleótidos de la secuencia de polinucleótido con el fin de tener la iniciación de la traducción en un codón de inicio secuencia abajo o codón de inicio alternativo. La secuencia de polinucleótido donde el codón de inicio se eliminó además puede comprender al menos un agente de enmascaramiento para el codón de inicio secuencia abajo y/o codón de inicio alternativo con el fin de controlar o intentar controlar la iniciación de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.

19. Región de codón de detención

La descripción también incluye un polinucleótido que comprende tanto una región de codón de detención como el polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A). En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir al menos dos codones de detención antes de la región no traducida 3' (UTR). El codón de detención se puede seleccionar de TGA, TAA y TAG en el caso de DNA, o de UGA, UAA y UAG en el caso de RNA. En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción incluyen el codón de detención TGA en el caso de DNA o el codón de detención UGA en el caso de RNA, y un codón de detención adicional. En un caso adicional, el codón de detención adicional puede ser TAA o UAA. En otros casos, los polinucleótidos de la presente descripción incluyen tres codones de detención, cuatro codones de detención o más consecutivos.

20. Inserciones y sustituciones.

La descripción también incluye un polinucleótido de la presente descripción que además comprende inserciones y/o sustituciones.

En algunos casos, la 5'UTR del polinucleótido se puede reemplazar por la inserción de al menos una región y/o cadena de nucleósidos de la misma base. La región y/o cadena de nucleótidos pueden incluir, pero no está limitado a, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos y los nucleótidos pueden ser naturales y/o no naturales. Como un ejemplo no limitante, el grupo de nucleótidos puede incluir 5-8 adeninas, citosinas, timinas, una cadena de cualquiera de otros nucleótidos descritos en el presente documento y/o combinaciones de los mismos.

En algunos casos, la 5'UTR de los polinucleótidos se puede reemplazar por la inserción de al menos dos regiones y/o cadenas de nucleótidos de dos bases diferentes tales como, pero no limitadas a, adenina, citosina, timina, cualquiera de los otros nucleótidos descritos en el presente documento y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la 5'UTR se puede reemplazar insertando 5-8 bases de adenina seguido por la inserción de 5-8 bases de citosina. En otro ejemplo, la 5'UTR se puede reemplazar insertando 5-8 bases de citosina seguido por la inserción de 5-8 bases de adenina.

En algunos casos, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción que puede ser reconocido por una RNA polimerasa. Como un ejemplo no limitante, al menos una sustitución y/o inserción puede ocurrir secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción al sustituir al menos un ácido nucleico en la región precisamente secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción (tal como, pero no limitado a de 1 a 6). Los cambios en la región de nucleótidos precisamente secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción pueden afectar a las velocidades de iniciación, incrementar los valores de constantes de reacción de trifosfato de nucleótido aparentes (NTP), e incrementar la disociación de transcritos cortos del complejo de transcripción subsanando la transcripción inicial (Brieba et al. Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). La modificación, sustitución y/o inserción de al menos un nucleósido puede causar una mutación silenciosa de la secuencia o puede causar una mutación en la secuencia de aminoácidos.

En algunos casos, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 o al menos 13 bases de guanina secuencia abajo del sitio de inicio de transcripción.

En algunos casos, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases de guanina en la región precisamente secuencia abajo del sitio de inicio de transcripción. Como un ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden ser sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 nucleótidos de adenina (SEQ ID NO: 233). En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden ser sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 bases de citosina (SEQ ID NO: 234). En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden ser sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 timinas y/o cualquiera de los nucleótidos descritos en el presente documento (SEQ ID NO: 235).

En algunos casos, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción secuencia arriba del codón de inicio. Para el propósito de claridad, un experto en la técnica apreciaría que el codón de inicio es el primer codón de la región de codificación de proteína, mientras que el sitio de inicio de la transcripción es el sitio donde comienza la transcripción. El polinucleótido puede incluir, pero no está limitado a, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 sustituciones y/o inserciones de bases de nucleótidos. Las bases de nucleótidos se pueden insertar o sustituir en 1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ubicaciones secuencia arriba del codón de inicio. Los nucleótidos insertados y/o sustituidos pueden ser la misma base (p. ej., todos A o todos C o todos T o todos G), dos bases diferentes (p. ej., A y C, A y T o C y T), tres bases diferentes (p. ej., A, C y T o A, C y T) o al menos cuatro bases diferentes.

Como un ejemplo no limitante, la base de guanina secuencia arriba de la región de codificación en el polinucleótido se puede sustituir por adenina, citosina, timina o cualquiera de los nucleótidos descritos en el presente documento. En otro ejemplo no limitante la sustitución de bases de guanina en el polinucleótido se puede diseñar para dejar una base de guanina en la región secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción y antes del codón de inicio (véase Esvelt et al. Nature (2011) 472(7344):499-503). Como un ejemplo no limitante, al menos 5 nucleótidos se pueden insertar en 1 ubicación secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción pero secuencia arriba del codón de inicio y los al menos 5 nucleótidos pueden ser el mismo tipo de base.

21. Polinucleótido que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12

En ciertos casos, un polinucleótido de la presente descripción, por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de mRNA que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A, comprende del extremo 5' a 3':

(i) un caperuza 5' proporcionada en lo anterior;

(ii) una 5' UTR, tal como las secuencias proporcionadas en lo anterior;

(iii) un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A, p. ej., una secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia que codifica IL12 descrita en el presente documento;

(iv) al menos un codón de detención;

(v) una 3' UTR, tal como las secuencias proporcionadas en lo anterior; y

(vi) una cola de poli-A proporcionada en lo anterior.

En algunos casos, el polinucleótido además comprende un sitio de unión de miRNA, p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miRNA-142. En algunos casos, la 5'UTR comprende el sitio de unión de miRNA.

En algunos casos, un polinucleótido de la presente descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptido al menos 70%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de proteína de una IL12 de tipo natural (p. ej., isoforma 1,2, 3 o 4).

22. Métodos para preparar polinucleótidos

La presente descripción también proporciona métodos para preparar un polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) o un complemento del mismo.

En algunos aspectos, un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) descrito en el presente documento y que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A, se puede construir utilizando la transcripción in vitro. En otros aspectos, un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) descrito en el presente documento, y que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A, se puede construir mediante síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótidos.

En otros aspectos, un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) descrito en el presente documento y que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A se prepara utilizando una célula hospedante. En ciertos aspectos, un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) descrito en el presente documento, y que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12a se prepara por una o más combinaciones de IVT, síntesis química, expresión en célula hospedante o cualquiera de otros métodos conocidos en la técnica. En otros casos, una célula hospedante es una célula eucariota, p. ej., células de mamíferos in vitro.

Los nucleósidos que se encuentran de forma natural, nucleósidos que no se encuentran de forma natural o combinaciones de los mismos, pueden reemplazar de manera natural totalmente o parcialmente los nucleósidos que se encuentran presentes en la secuencia de nucleótidos candidata y se pueden incorporar en una secuencia de nucleótidos optimizada en secuencia (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. Los polinucleótidos resultantes, p. ej., los mRNA, luego se pueden examinar para determinar su capacidad para producir proteína y/o producir un resultado terapéutico.

a. Transcripción in vitro/Síntesis enzimática

Los polinucleótidos de la presente descripción descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se pueden transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un amortiguador de transcripción, trifosfatos de nucleótidos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP se pueden seleccionar de, pero no están limitados a, aquellos descritos en el presente documento que incluyen NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa se puede seleccionar de, pero no está limitada a RNA polimerasa T7, RNA polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero no limitadas a, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos descritos en el presente documento. Véase la Publicación de EE. UU. N° US20130259923.

Cualquier número de RNA polimerasas o variantes se puede utilizar en la síntesis de los polinucleótidos de la presente descripción. Las RNA polimerasas se pueden modificar al insertar o eliminar aminoácidos de la secuencia de RNA polimerasa. Como un ejemplo no limitante, la RNA polimerasa se puede modificar para presentar una capacidad incrementada para incorporar un trifosfato de nucleótido 2'-modificado comparado con una RNA polimerasa no modificada (véase la Publicación Internacional WO2008078180 y la Patente de EE. UU. 8,101,385).

Las variantes se pueden obtener al evolucionar una RNA polimerasa, al optimizar la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la RNA polimerasa y/o al utilizar otros métodos conocidos en la técnica. Como un ejemplo no limitante, las variantes de RNA polimerasa T7 se pueden evolucionar utilizando el sistema de evolución dirigida continua expuesto por Esvelt et al. (Nature 472:499-503 (2011)) donde los clones de RNA polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación tal como, pero no limitada a, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de RNA polimerasa T7 pueden codificar al menos la mutación como se describe en las Publicaciones de EE. UU. N° 20100120024 y 20070117112. Las variantes de RNA polimerasa también pueden incluir, pero no están limitadas a variantes de sustitución, sustitución de aminoácido conservadora, variantes de inserción, variantes de eliminación y/o derivados covalentes.

En un aspecto, el polinucleótido se puede diseñar para ser reconocido por las RNA polimerasas de tipo natural o variantes. Al hacerlo de esta manera, el polinucleótido se puede modificar para contener sitios o regiones de cambios de secuencia del polinucleótido de tipo natural o quimérico parental.

Las reacciones de síntesis de polinucleótidos o ácido nucleicos se pueden llevar a cabo mediante métodos enzimáticos utilizando polimerasas. Las polimerasas catalizan la creación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos en un polinucleótido o cadena de ácido nucleico. Las DNA polimerasas actualmente conocidas se pueden dividir en diferentes familias basado en la comparación de secuencias de aminoácidos y el análisis de la estructura cristalina. La DNA polimerasa I (pol I) o la familia de polimerasa A, que incluye los fragmentos de Klenow de E. coli, DNA polimerasa I de Bacillus, DNA polimerasas de Thermus aquaticus (Taq) y las RNA y DNA polimerasas T7, esta entre lo mejor estudiado de estas familias. Otra familia grande es la ^dN^apolimerasa a (pol a) o familia de polimerasa B, que incluye todas las DNA polimerasas replicantes eucarióticas y polimerasas de los fagos T4 y RB69. Aunque emplean mecanismo catalítico similar, estas familias de polimerasas difieren en la especificidad de sustrato, eficiencia de incorporación de análogo de sustrato, grado y velocidad para la extensión de cebador, modo de síntesis de DNA, actividad de exonucleasa y sensibilidad contra inhibidores.

Las DNA polimerasas también se seleccionan basándose en las condiciones de reacción óptimas que requieren, tales como la temperatura de reacción, pH y concentraciones de plantilla y cebador. Algunas veces se emplea una combinación de más de una DNA polimerasas para lograr el tamaño de fragmento de DNA deseado y la eficiencia de síntesis. Por ejemplo, Cheng et al. incrementan el pH, añaden glicerol y sulfóxido de dimetilo, disminuyen los tiempos de desnaturalización, incrementan los tiempos de extensión y utilizan una DNA polimerasa termoestable secundaria que posee una actividad de exonucleasa 3' a 5' para amplificar eficazmente objetivos largos de insertos clonados y DNA genómico humano. (Cheng et al., PNAS 91:5695-5699 (1994)). Las RNA polimerasas del bacteriófago T3, T7 y SP6 se han utilizado ampliamente para preparar los RNA para estudios bioquímicos y biofísicos. Las RNA polimerasas, enzimas de terminación de caperuza y polimerasas poli-A se describen en la Publicación Internacional en tramitación con la presente N° WO2014028429.

En un aspecto, la RNA polimerasa que se puede utilizar en la síntesis de los polinucleótidos de la presente descripción es una RNA polimerasa Syn5. (Véase Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013, doi:10.1093/nar/gkt1193). La RNA polimerasa Syn5 se caracterizó recientemente de Syn5 de cianófago marino por Zhu et al. donde también identificaron la secuencia de promotor (véase Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013). Zhu et al. encontraron que la RNA polimerasa Syn5 catalizaba la síntesis de RNA a lo largo de un intervalo más amplio de temperaturas y salinidad comparado con la RNA polimerasa T7. Adicionalmente, el requisito para el nucleótido de iniciación en el promotor se encontró que era menos restrictivo para la RNA polimerasa Syn5 comparado con la RNA polimerasa T7 haciendo a la RNA polimerasa Syn5 prometedora para la síntesis de RNA.

En un aspecto, la RNA polimerasa Syn5 se puede utilizar en la síntesis de los polinucleótidos descritos en el presente documento. Como un ejemplo no limitante, una RNA polimerasa Syn5 se puede utilizar en la síntesis del polinucleótido que requiere un extremo 3' preciso.

En un aspecto, un promotor de Syn5 se puede utilizar en la síntesis de los polinucleótidos. Como un ejemplo no limitante, el promotor de Syn5 puede ser 5'-ATTGGGCACCCGTA^aG^gG-3' (SEQ ID NO: 47) como describen Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).

En un aspecto, una RNA polimerasa Syn5a se puede utilizar en la síntesis de polinucleótidos que comprenden al menos modificación química descrita en el presente documento y/o conocida en la técnica (véase, p. ej., la incorporación de pseudo-UTP y 5Me-CTP descrito en Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013).

En un aspecto, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden sintetizar utilizando una RNA polimerasa Syn5 que se ha purificado utilizando el procedimiento de purificación modificado y mejorado descrito por Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).

Varias herramientas en ingeniería genética se basan en la amplificación enzimática de un gen objetivo que actúa como una plantilla. Para el estudio de secuencias de genes individuales o regiones específicas de interés y otras necesidades de investigación, es necesario generar múltiples copias de un gen objetivo a partir de una muestra pequeña de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Tales métodos se pueden aplicar en la fabricación de los polinucleótidos de la descripción.

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) tiene amplias aplicaciones en la amplificación rápida de un gen objetivo, así como el mapeo y secuenciación del genoma. Los componentes claves para sintetizar DNA comprenden moléculas de DNA objetivo como una plantilla, cebadores complementarios de los extremos de las cadenas de DNA objetivo, desoxinucleósido trifosfatos (dNTP) como unidades estructurales, y una DNA polimerasa. A medida que la PCR progresa a través de las etapas de desnaturalización, reasociación y extensión, las moléculas de DNA recién producidas pueden actuar como una plantilla para el siguiente ciclo de replicación, logrando exponencialmente la amplificación del DNA objetivo. La PCR requiere un ciclo de calentamiento y enfriamiento para desnaturalización y reasociación. Variaciones de la PCR básica incluyen la PCR asimétrica (Innis et al., PNAS 85: 9436-9440 (1988)), PCR inversa (Ochman et al., Genetics 120(3): 621 623, (1988)), PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (Freeman et al., BioTechniques 26(1): 112-22, 124-5 (1999)). En RT-PCR, un RNA de una sola cadena es el objetivo deseado y se convierte en un DNA de doble cadena primero mediante transcriptasa inversa.

Se ha desarrollado una variedad de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro isotérmicas como alternativas o complementos de la PCR. Por ejemplo, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) se basa en la capacidad de una enzima de restricción para formar una muesca (Walker et al., PNAS 89: 392-396 (1992)). Una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción se inserta en una secuencia de cebador reasociada. Los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa y dNTP para formar un dúplex. Únicamente una hebra del dúplex es escindida por la enzima de restricción. Cada cadena de una sola hebra luego está disponible como una plantilla para la síntesis subsecuente. La SDA no requiere el ciclo de control de temperatura complicado de la PCR.

La amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), también llamada amplificación mediada por transcripción (TMA), también es un método de amplificación isotérmico que utiliza una combinación de DNA polimerasa, transcriptasa inversa, RNAsa H y RNA polimerasa T7. (Compton, Nature 350:91-92 (1991)). Un RNA objetivo se utiliza como una plantilla y una transcriptasa inversa sintetiza la hebra de DNA complementaria. La RNAsa H hidroliza la plantilla de RNA, haciendo sitio para que una DNA polimerasa sintetice una hebra de DNA complementaria de la primera hebra de DNA que es complementaria del objetivo de RNA, formando un dúplex de DNA. La RNA polimerasa T7 continuamente genera hebras de RNA complementarias de este dúplex de DNA. Estas hebras de RNA actúan como plantillas para nuevos ciclos de síntesis de DNA, dando como resultado la amplificación del gen objetivo.

La amplificación por círculo rodante (RCA) amplifica un polinucleótido circular de una sola hebra e implica numerosas rondas de síntesis enzimática isotérmica donde la DNA polimerasa 029 extiende un cebador progresando continuamente alrededor del círculo del polinucleótido para replicar su secuencia una y otra vez. Por lo tanto, se logra una copia lineal de la plantilla circular. Un cebador luego se puede reasociar con esta copia lineal y se puede sintetizar su cadena complementaria. Véase Lizardi et al., Nature Genetics 19:225-232 (1998). Un DNA circular de una sola hebra también puede servir como una plantilla para la síntesis de RNA en presencia de una RNA polimerasa. (Daubendiek et al., JACS 117:7818-7819 (1995)). Una amplificación rápida inversa de los extremos de cDNA (RACE) RCA se describe por Polidoros et al. Un RNA mensajero (mRNA) es transcrito de manera inversa en cDNA, seguido por el tratamiento con RNAsa H para separar el cDNA. El cDNA luego se circulariza mediante CircLigasa en un DNA circular. La amplificación del DNA circular resultante se logra con RCA. (Polidoros et al., BioTechniques 41:35-42 (2006)).

Cualquiera de los métodos anteriores se puede utilizar en la fabricación de una o más regiones de los polinucleótidos de la presente descripción.

El ensamblaje de polinucleótidos o ácidos nucleicos mediante una ligasa también se utiliza ampliamente. Las DNA o RNA ligasas promueven la ligación intermolecular de los extremos 5' y 3' de cadenas de polinucleótido a través de la formación de un enlace de fosfodiéster. La reacción en cadena de ligasa (LCR) es una técnica de diagnóstico prometedora basada en el principio de que dos sondas de polinucleótido adyacentes hibridan con una hebra de un gen objetivo y se acoplan entre sí mediante una ligasa. Si no está presente un gen objetivo, o si hay un emparejamiento erróneo en el gen objetivo, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), las sondas no pueden reaccionar con ligasa. (Wiedmann et al., PCR Methods and Application, vol.3 (4), s51-s64 (1994)). La LCR se puede combinar con varias técnicas de amplificación para incrementar la sensibilidad de detección o para incrementar la cantidad de productos si se utiliza en la síntesis de polinucleótidos y ácidos nucleicos.

Varios kits de preparación de bibliotecas para ácidos nucleicos están ahora comercialmente disponibles. Incluyen enzimas y amortiguadores para convertir una pequeña cantidad de muestras de ácido nucleico en una biblioteca indexada para aplicaciones corriente abajo. Por ejemplo, los fragmentos de DNA se pueden poner en un Kit de Prep. de Biblioteca de DNA NEBEXT® ULTRATM de NEWENGLAND BIOLABS® para la preparación de extremo, ligación, selección de tamaño, limpieza, amplificación por PCR y limpieza final.

Sigue adelante el desarrollo continuo para mejorar las técnicas de amplificación. Por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 8,367,328 de Asada et al., enseña la utilización de un potenciador de reacción para incrementar la eficiencia de reacciones de síntesis de DNA mediante DNA polimerasas. El potenciador de reacción comprende una sustancia ácida o complejos catiónicos de una sustancia ácida. La Patente de EE. UU. N° 7,384,739 de Kitabayashi et al., enseña una sustancia que suministra ion carboxilato que promueve la síntesis de DNA enzimática, en donde la sustancia que suministra iones carboxilato se selecciona de ácido oxálico, ácido malónico, ésteres de ácido oxálico, ésteres de ácido malónico, sales de ácido malónico, y ésteres de ácido maleico. La Patente de EE. UU. N° 7,378,262 de Sobek et al., describe una composición de enzima para incrementar la fidelidad de las amplificaciones de DNA. La composición comprende una enzima con actividad de exonucleasa 3' pero no actividad de polimerasa y otra enzima que es una polimerasa. Ambas enzimas son termoestables y se modifican reversiblemente para ser inactivas en temperaturas inferiores.

La Patente de EE. UU. N° 7,550,264 de Getts et al. enseña múltiples rondas de síntesis de moléculas de RNA de sentido directo que se realizan al unir colas de oligodesoxinucleótidos en el extremo 3' de moléculas de cDNA y al iniciar la transcripción de RNA utilizando RNA polimerasa. La Publicación de Patente de EE. UU. N° 2013/0183718 de Rohayem enseña la síntesis de RNA mediante RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRp) que presentan una actividad de RNA polimerasa en plantillas de DNA de una sola hebra. Los oligonucleótidos con nucleótidos no estándar se pueden sintetizar con polimerización enzimática poniendo en contacto una plantilla que comprende nucleótidos no estándar con una mezcla de nucleótidos que son complementarios de los nucleótidos de la plantilla como se describe en la Patente de EE. UU. N° 6,617,106 de Benner.

b. Síntesis química

Se pueden aplicar métodos convencionales para sintetizar una secuencia de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido aislado de interés, tal como un polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A). Por ejemplo, se puede sintetizar un solo oligómero de DNA o RNA que contiene una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica el polipéptido aislado particular. En otros aspectos, varios oligonucleótidos pequeños que codifican partes del polipéptido deseado se pueden sintetizar y luego ligar. En algunos aspectos, los oligonucleótidos individuales típicamente contienen segmentos protuberantes 5' o 3' para el ensamblaje complementario.

Un polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) se puede sintetizar químicamente utilizando métodos de síntesis química y sustituciones de nucleobases potenciales conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N° WO2014093924, WO2013052523; WO2013039857, WO2012135805, WO2013151671; las Publicaciones de EE. UU. N° US20130115272; o las Patentes de EE. UU. N° US8999380 o US8710200.

c. Purificación de polinucleótidos que codifican IL12

La purificación de los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) puede incluir, pero no está limitada a, depuración del polinucleótido, aseguramiento de la calidad y control de calidad. La depuración se puede realizar por métodos conocidos en la técnica tales como, pero no limitados a perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas de poli-T, sondas de captura de oligo-T LNATM (EXIQON® Inc., Vedbaek, Dinamarca) o métodos de purificación basados en HPLC tales como, pero no limitados a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC).

El término “purificado” cuando se utiliza en relación con un polinucleótido tal como un “polinucleótido purificado” se refiere a uno que se separa de al menos un contaminante. Como se utiliza en el presente documento, un “contaminante” es cualquier sustancia que hace a otro inadecuada, impura o inferior. De esta manera, un polinucleótido purificado (p. ej., DNA y RNA) está presente en una forma o entorno diferente del cual se encuentra en la naturaleza, o una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un método de tratamiento o purificación.

En algunos casos, la purificación de un polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) elimina las impurezas que pueden reducir o eliminar una respuesta inmunitaria indeseada, p. ej., reducir la actividad de citocinas.

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12b , un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se purifica antes de la administración utilizando la cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) o (LCMS)).

En algunos casos, el polinucleótido de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) purificado utilizando la cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC, HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) o (LCMS)) presenta expresión incrementada de la proteína IL12 codificada comparada con el nivel de expresión obtenido con el mismo polinucleótido de la presente descripción purificado mediante un método de purificación diferente.

En algunos casos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (p. ej., HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) o (LCMS)) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A que comprende una o más de las mutaciones puntuales conocidas en la técnica.

En algunos casos, el uso del polinucleótido purificado por RP-HPLC incrementa los niveles de expresión de proteína IL12 en las células cuando se introduce en esas células, p. ej., en 10-100%, es decir, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto a los niveles de expresión de proteína iL12 en las células antes de que el polinucleótido purificado por RP-HPLC se introduzca en las células, o después de que un polinucleótido no purificado por RP-HPLC se introduzca en las células.

En algunos casos, el uso del polinucleótido purificado por RP-HPLC incrementa los niveles de expresión de proteína IL12 funcional en las células cuando se introduce en esas células, p. ej., en 10-100%, es decir, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto a los niveles de expresión funcional de la proteína IL12 en las células antes de que el polinucleótido purificado por RP-HPLC se introduzca en las células, o después de que un polinucleótido no purificado por RP-HPLC se introduzca en las células.

En algunos casos, el uso del polinucleótido purificado por RP-HPLC incrementa la actividad de IL12 detectable en las células cuando se introducen en esas células, p. ej., en 10-100%, es decir, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 100% con respecto a los niveles de actividad de IL12 funcional en las células antes de que el polinucleótido purificado por RP-HPLC se introduzca en las células, o después de que un polinucleótido no purificado por RP-HPLC se introduzca en las células.

En algunos casos, el polinucleótido purificado es al menos aproximadamente 80% puro, al menos aproximadamente 85% puro, al menos aproximadamente 90% puro, al menos aproximadamente 95% puro, al menos aproximadamente 96% puro, al menos aproximadamente 97% puro, al menos aproximadamente 98% puro, al menos aproximadamente 99% puro o aproximadamente 100% puro.

Un aseguramiento de calidad y/o verificación de control de calidad se puede llevar a cabo utilizando métodos tales como, pero no limitados a, electroforesis en gel, absorbencia de UV o HPLC analítica. En otro caso, el polinucleótido se puede secuenciar por métodos que incluyen, pero no limitados a PCR de transcriptasa inversa.

d. Cuantificación de polinucleótidos expresados que codifican IL12

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) sus productos de expresión, así como productos de degradación y metabolitos se pueden cuantificar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente descripción se pueden cuantificar en exosomas o cuando se obtienen de uno o más fluidos corporales. Como se utiliza en el presente documento, “fluidos corporales” incluyen sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (CSF), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche de seno, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostético, líquido de cowper o líquido pre-eyaculatorio, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido quístico, líquido pleural y peritoneal, fluido pericérdico, linfa, quimo, quilo, bilis, fluido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción de la mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, líquidos de lavado de cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, fluido de cavidad de blastocele y sangre de cordón umbilical. Alternativamente, los exosomas se pueden recuperar de un órgano seleccionado del grupo que consiste en pulmón, corazón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovarios, testículos, piel, colon, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado y placenta.

En el método de cuantificación de exosomas, se obtiene una muestra de no més de 2 ml del sujeto y los exosomas aislados mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación de gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificación de afinidad, separación microfluídica o combinaciones de los mismos. En el análisis, el nivel o concentración de un polinucleótido puede ser un nivel de expresión, presencia, ausencia, truncamiento o alteración de la construcción administrada. Es ventajoso correlacionar el nivel con uno o más fenotipos clínicos o con un ensayo para un biomarcador de enfermedad humana.

El ensayo se puede realizar utilizando sondas específicas de la construcción, citometría, qRT-PCR, PCR en tiempo real, PCR, citometría de flujo, electroforesis, espectrometría de masas o combinaciones de los mismos, mientras que los exosomas se pueden aislar utilizando métodos inmunohistoquímicos tales como los métodos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Los exosomas también se pueden aislar mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación de gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación microfluídica o combinaciones de los mismos.

Estos métodos proporcionan al investigador la capacidad de vigilar, en tiempo real, el nivel de polinucleótidos que queda o suministrado. Esto es posible debido a que los polinucleótidos de la presente descripción difieren de las formas endógenas debido a las modificaciones estructurales o químicas.

En algunos casos, el polinucleótido se puede cuantificar utilizando métodos tales como, pero no limitados a, espectroscopía visible ultravioleta (UV/Vis). Un ejemplo no limitante de un espectrómetro de UV/Vis es un espectrómetro NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). El polinucleótido cuantificado se puede analizar con el fin de determinar si el polinucleótido puede ser de tamaño apropiado, verificar que no ha ocurrido degradación del polinucleótido. La degradación del polinucleótido se puede verificar por métodos tales como, pero no limitado a, electroforesis en gel de agarosa, métodos de purificación basados en HPLC tales como, pero no limitados a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), electroforesis capilar (CE) y electroforesis en gel capilar (CGE).

23. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

La presente descripción proporciona composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en lo anterior. En algunos casos, la composición o formulación además comprende un agente de suministro.

En algunos casos, la composición o formulación puede contener un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia descrita en el presente documento que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. En algunos casos, la composición o formulación puede contener un polinucleótido (p. ej., un RNA, p. ej., un mRNA) que comprende un polinucleótido (p. ej., un ORF) que tiene identidad de secuencia significativa con una secuencia de ácido nucleico optimizada en secuencia descrita en el presente documento que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A. En algunos casos, el polinucleótido además comprende un sitio de unión de miRNA, p. ej., un sitio de unión de miRNA que se une a miR-122.

Las composiciones o formulaciones farmacéuticas opcionalmente pueden comprender una o más sustancias activas adicionales, p. ej., sustancias terapéutica y/o profilácticamente activas. Las composiciones o formulaciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser estériles y/o libres de pirógenos. Las consideraciones generales en la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005. En algunos casos, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes humanos o sujetos. Para los propósitos de la presente descripción, la frase “ingrediente activo” generalmente se refiere a polinucleótidos que se suministran como se describe en el presente documento.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado en lo sucesivo en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes adicionales y, luego, si es necesario y/o deseable, dividir, conformar y/o envasar el producto en una unidad de una sola o múltiples dosis deseada.

Una composición o formulación farmacéutica de acuerdo con la presente descripción se puede preparar, envasar y/o vender a granel, como una sola dosis unitaria y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se utiliza en el presente documento, una “dosis unitaria” se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis tal como, por ejemplo, de una mitad a un tercio de dicha dosis.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualesquiera ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o afección del sujeto que es tratando y además dependiendo de la ruta mediante la cual se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1% y 99% (p/p) del ingrediente activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1% y 100%, p. ej., entre 0.5 y 50%, entre 1 y 30%, entre 5 y 80% o al menos 80% (p/p) de ingrediente activo.

En algunos casos, las composiciones y formulaciones descritas en el presente documento pueden contener al menos un polinucleótido de la descripción. Como un ejemplo no limitante, la composición o formulación puede contener 1,2, 3, 4 o 5 polinucleótidos de la descripción. En algunos casos, las composiciones o formulaciones descritas en el presente documento pueden comprender más de un tipo de polinucleótido. En algunos casos, la composición o formulación puede comprender un polinucleótido en forma lineal y circular. En otro caso, la composición o formulación puede comprender un polinucleótido circular y un polinucleótido de IVT. En todavía otro caso, la composición o formulación puede comprender un polinucleótido de IVT, un polinucleótido quimérico y un polinucleótido circular.

Aunque las descripciones de composiciones y formulaciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones y formulaciones farmacéuticas que son adecuadas para administración a seres humanos, el experto en la técnica entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para la administración a cualquier otro animal, p. ej., a animales no humanos, p. ej., mamíferos no humanos. La modificación de composiciones o formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración a seres humanos con el fin de volver las composiciones adecuadas para la administración a varios animales es bien entendida, y el farmacólogo veterinario experto puede diseñar y/o realizar tal modificación con experimentación simplemente ordinaria, si hay alguna. Los sujetos a los cuales la administración de las composiciones o formulaciones farmacéuticas se contempla incluyen, pero no están limitados a, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, que incluyen mamíferos comercialmente relevantes tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, que incluyen aves comercialmente relevantes tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.

La presente descripción proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A). Los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular utilizando uno o más excipientes para: (1) incrementar la estabilidad; (2) incrementar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (p. ej., de una formulación de depósito del polinucleótido); (4) alterar la biodistribución (p. ej., dirigir el polinucleótido a tipos de tejidos o células específicos); (5) incrementar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada in vivo. En algunos casos, la formulación farmacéutica además comprende un agente de suministro (p. ej., un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 y cualquiera de los Compuestos 1-232).

Un excipiente farmacéuticamente aceptable, como se utiliza en el presente documento, incluye, pero no está limitado a, todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, diluyentes, agentes de granulación y/o dispersión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes, lubricantes o aceite, agentes colorantes, edulcorantes o saborizantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes antimicrobianos o antifúngicos, agentes reguladores de osmolalidad, agentes reguladores de pH, amortiguadores, quelantes, crioprotectores y/o agentes de carga, según sea adecuado para la forma farmacéutica particular deseada. Varios excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición son conocidas en la técnica (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

Los diluyentes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a carbonato de calcio o de sodio, fosfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes de granulación y/o dispersantes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, almidones, almidones pregelatinizados o almidón microcristalino, ácido algínico, goma guar, agar, poli(vinilpirrolidona), (povidona), poli(vinilpirrolidona) reticulada, (crospovidona), celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica reticulada (croscarmelosa), silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, emulsionantes naturales (p. ej., goma arábiga, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, condrux, colesterol, xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, grasa de lana, colesterol, cera y lecitina), ésteres de ácido graso de sorbitán (p. ej., monooleato de sorbitán polioxietilénico [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monooleato de glicerilo, ésteres polioxietilénicos, ésteres de ácido graso y polietilenglicol (p. ej., CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (p. ej., éter laurílico de polioxietilénico [BRIJ®30]), PLUORIn C®F 68, POLOXAMER®188, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes aglutinantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, almidón, gelatina, azúcares (p. ej., sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melazas, lactosa, lactitol, manitol), aminoácidos (p. ej., glicina), gomas naturales y sintéticas (p. ej., goma arábiga, alginato de sodio), etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etc. y combinaciones de los mismos.

La oxidación es una ruta de degradación potencial para el mRNA, especialmente para formulaciones de mRNA líquidas. Con el fin de prevenir la oxidación, se pueden añadir antioxidantes a las formulaciones. Los antioxidantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, m-cresol, metionina, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de sodio o de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.

Los agentes quelantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), monohidrato de ácido cítrico, edetato de disodio, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sodio, ácido tartárico, edetato de trisodio, etc., y combinaciones de los mismos.

Agentes antimicrobianos o antifúngicos de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio o de sodio, sorbato de potasio o de sodio, propionato de sodio, ácido sórbico, etc., y combinaciones de los mismos.

Los conservantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido ascórbico, hidroxianisol butilado, etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), etc., y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el pH de las soluciones de polinucleótidos se mantiene entre pH 5 y pH 8 para mejorar la estabilidad. Los amortiguadores de ejemplo para controlar el pH pueden incluir, pero no están limitados a, fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, histidina (o histidina-HCl), malato de sodio, carbonato de sodio, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes lubricantes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, lauril sulfato de sodio o de magnesio, etc., y combinaciones los mismos.

La composición o formulación farmacéutica descrita aquí puede contener un crioprotector para estabilizar un polinucleótido descrito en el presente documento durante la congelación. Los crioprotectores de ejemplo incluyen, pero no están limitados a, manitol, sacarosa, trehalosa, lactosa, glicerol, dextrosa, etc., y combinaciones de los mismos.

La composición o formulación farmacéutica descrita aquí puede contener un agente de carga en formulaciones de polinucleótido liofilizadas para producir una torta “farmacéuticamente elegante”, estabilizar los polinucleótidos liofilizados durante el almacenamiento a largo plazo (p. ej., 36 meses). Los agentes de carga de ejemplo de la presente descripción pueden incluir, pero no están limitados a sacarosa, trehalosa, manitol, glicina, lactosa, rafinosa y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, la composición o formulación farmacéutica además comprende un agente de suministro. El agente de suministro de la presente descripción puede incluir, sin limitación, liposomas, nanopartículas de lípido, lipidoides, polímeros, lipoplexos, microvesículas, exosomas, péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótidos, hialuronidasa, imitaciones de nanopartícula, nanotubos, conjugados y combinaciones de los mismos.

24. Agentes de suministro

a. Compuesto de Lípido

La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas con propiedades ventajosas. En particular, la presente solicitud proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A; y

(b) un agente de suministro.

En algunos casos, el agente de suministro para la presente descripción comprende uno cualquiera o más compuestos descritos en la Solicitud Internacional N° PCT/US2016/052352, presentada el 16 de septiembre de 2016, y publicada como WO 2017/ 049245.

En algunos casos, el agente de suministro comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)

Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-30, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R”M'R';

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en a carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=Rg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)², -C(=NRg)N(R)², -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C^3-6;

R⁹se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO², alquilo C^1-6, -OR, -S(O)²R, -S(O)²N(R)², alquenilo C²-6, carbociclo y heterociclo C^3-6;

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-18, alquenilo C^2-18, -R*YR”, -YR” y H;

cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^3-14y alquenilo C^3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-12y alquenilo C^2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C^3-6;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7.

8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros del mismo.

En algunos casos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R”M'R';

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)², y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)²y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos, en donde los grupos alquilo y alquenilo pueden ser lineales o ramificados.

En algunos casos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales cuando R⁴es -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2.

En otros casos, otro subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluyen aquellos en los cuales

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-30, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R”M'R';

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR", -YR" y -R*OR", o R²y R³, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH²)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)², -N(R)C(=CHRg)N(R)², -OC(O)N(R)², -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C (O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)², -N(OR)C(=CHRg)N(R)², -C(=NRg) N(R)², -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino y alquilo C^1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

cad a R 5 se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru po que co n s is te en a lq u ilo C 1-3, a lqu e n ilo C 2-3 y H; ^{cad a R}6 ^{se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru po que co n s is te en a lq u ilo C 1-3, a lqu e n ilo C 2-3 y H;}

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

Rs se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C^3-6;

R⁹se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO², alquilo C^1-6, -OR, -S(O)²R, -S(O)²N(R)², alquenilo C²-6, carbociclo y heterociclo C^3-6; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹-³, alquenilo C^2-3y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-18, alquenilo C^2-18, -R*YR", -YR" y H;

cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^3-14y alquenilo C^3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-12y alquenilo C^2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C^3-6;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

En otros casos, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20, alquenilo C^5-20, -R*YR", -YR" y -R"M'R';

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino y alquilo C^1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-18, alquenilo C^2-18, -R*YR", -YR" y H;

cad a X se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru po que con s is te en F, Cl, B r e I; y

m se s e le cc io n a de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

En otros casos más, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los que

Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-30, alquenilo C^5-20, -R*YR", -YR" y -R"M'R';

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH²)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R) C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR) C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)², -N(OR)C(=CHRg)N(R)², -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR y -C(=NRg)N(R)², y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R⁴es -(CH²)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R⁴es -(CH²)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R⁴es -CHQR y -CQ(R)², entonces Q es un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros;

cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C^3-6;

Rg se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO², alquilo C^1-6, -OR, -S(O)²R, -S(O)²N(R)², alquenilo C²-6, carbociclo y heterociclo C^3-6;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R⁴es -(CH²)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R⁴es -(CH²)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R⁴es -CHQR, y -CQ(R)², entonces Q es un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-30, alquenilo C^5-20, -R*YR", -YR" y -R"M'R';

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH²)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C (O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)², -N(OR)C(=CHRg)N(R)², -C(=NRg) R, -C(O)N(R)OR, y -C(=NRg)N(R)², y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C^3-6;

cad a R" se s e le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te del g ru po que co n s is te en a lqu ilo C 3-14 y a lq u e n ilo C 3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-12y alquenilo C^2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C^3-6;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -CRN(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, un grupo arilo, y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^2-14, alquenilo C^2-14, -R*YR", -YR" y -R*OR", o R²y R³, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴es -(CH²)nQ o -(CH²)nCHQR, donde Q es -N(R)², y n se selecciona de 3, 4 y 5;

R 7 se se le cc io n a del g ru po que co n s is te en a lq u ilo C 1-3, a lq u e n ilo C 2-3 y H;

cada R" se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^3-14y alquenilo C^3-14; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-12y alquenilo C^1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C^3-6;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^2-14, alquenilo C^2-14, -R*YR", -YR", y -R*OR", o R²y R³, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-30, alquenilo C^5-20, -R*YR", -YR", y -R"M'R';

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR", -YR" y -R*OR", o R²y R³, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q es -N(R)², y n se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;

cad que co n s is te en a lq u ilo C 1-3, a lqu e n ilo C 2-3 y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

o sales o estereoisómeros de los mismos.

En ciertos casos, un subconjunto de compuestos de la Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (IA):

o una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9; M¹es un enlace o M'; R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)², -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14. En algunos casos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluyen aquellos de Fórmula (IA), o una sal 0 estereoisómero de los mismos,

en donde

1 se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5; m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)²o -NHC(O)N(R)²;

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14. En algunos casos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (II):

o una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5; M¹es un enlace o M'; R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el que n es 2, 3 o 4, y Q es OH, -N^hC(S)N(R)², -NHC(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb, -HC(=NR9)N(R)2, -HC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14. En algunos casos, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluyen aquellos de Fórmula (II), o una sal 0 estereoisómero de los mismos, en donde

1 se selecciona de 1,2, 3, 4 y 5;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el que n es 2, 3 o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)²o -NHC(O)N(R)²; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14. En algunos casos, el compuesto de la fórmula (I) es de fórmula (IIa),

En algunos casos, el compuesto de la fórmula (I) es de fórmula (IIb),

En algunos casos, el compuesto de la fórmula (I) es de fórmula ( IIc),

En algunos casos, el compuesto de la fórmula (I) es de fórmula (IIe):

En algunos casos, el compuesto de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IIe) comprende un R⁴el cual se selecciona de -(CH²)nQ y -(CH²)nCHQR, en donde Q, R y n son como se definen en lo anterior.

En algunos casos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH²)nN(R)², -OC(O)R, -CX³, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)², -N(H)C(S)N(R)², -N(H)C(S)N(H)(R), y un heterociclo, en donde R es como se define en lo anterior. En algunos aspectos, n es 1 o 2. En algunos casos, Q es OH, -HC(S)N(R)²o -HC(O)N(R)2.

En algunos casos, el compuesto de la fórmula (I) es de fórmula (IId),

o una sal del mismo, en donde R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C^5-14y alquenilo C^5-14, n se selecciona de 2, 3 y 4 y R', R”, R⁵, R6 y m son como se definen en lo anterior.

En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), R²es alquilo C8. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), R³es alquilo C⁵-C⁹. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), m es 5, 7 o 9. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), cada R⁵es H. En algunos aspectos del compuesto de fórmula (IId), cada R6 es H.

En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una composición de lípidos (p. ej., una nanopartícula de lípido (LNP)) que comprende: (1) un compuesto que tiene la fórmula (I); (2) opcionalmente un lípido auxiliar (p. ej. un fosfolípido); (3) opcionalmente un lípido estructural (p. ej. un esterol); (4) opcionalmente un conjugado de lípido (p. ej. un PEG-lípido); y (5) opcionalmente un compuesto de amina cuaternaria. En casos de ejemplo, la composición de lípidos (p. ej., LNP) además comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, polipéptido de IL12A, o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A, p. ej., un polinucleótido encapsulado en la misma.

Como se utiliza en el presente documento, el término “alquilo” o “grupo alquilo” significa un hidrocarburo lineal o ramificado, saturado que incluye uno o más átomos de carbono (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono).

La notación “alquilo C^1-14” significa un hidrocarburo lineal o ramificado, saturado que incluye 1-14 átomos de carbono. Un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido.

Como se utiliza en el presente documento, el término “alquenilo” o “grupo alquenilo” significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye dos o más átomos de carbono (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un enlace doble.

La notación “alquenilo C^2-14” significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye 2-14 átomos de carbono y al menos un enlace doble. Un grupo alquenilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro, o más enlaces dobles. Por ejemplo, alquenilo C¹⁸puede incluir uno o más enlaces dobles. Un grupo alquenilo C¹⁸que incluye dos enlaces dobles puede ser un grupo linoleilo. Un grupo alquenilo puede estar opcionalmente sustituido.

Como se utiliza en el presente documento, el término “carbociclo” o “grupo carbocíclico” significa un sistema mono o multicíclico que incluye uno o más anillos de átomos de carbono. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince miembros.

La notación “carbociclo C^3-6” significa un carbociclo que incluye un solo anillo que tiene 3-6 átomos de carbono. Los carbociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles y pueden ser aromáticos (p. ej., grupos arilo). Ejemplos de carbociclos incluyen grupos ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo y 1,2-dihidronaftilo. Los carbociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.

Como se utiliza en el presente documento, el término “heterociclo” o “grupo heterocíclico” significa un sistema mono o multicíclico que incluye uno o más anillos, donde al menos un anillo incluye al menos un heteroátomo. Los heteroátomos pueden ser, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o veinte miembros. Los heterociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles y pueden ser aromáticos (p. ej., grupos heteroarilo). Ejemplos de heterociclos incluyen grupos imidazolilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tiofenilo, piridinilo, piperidinilo, quinolilo e isoquinolilo. Los heterociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.

Como se utiliza en el presente documento, un “grupo biodegradable” es un grupo que puede facilitar el metabolismo más rápido de un lípido en un sujeto. Un grupo biodegradable puede ser, pero no está limitado a, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo.

Como se utiliza en el presente documento, un “grupo arilo” es un grupo carbocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo.

Como se utiliza en el presente documento, un “grupo heteroarilo” es un grupo heterocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo y tiazolilo. Los grupos tanto arilo como heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Por ejemplo, M y M' se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en fenilo, oxazol y tiazol opcionalmente sustituido. En las fórmulas en el presente documento, M y M' se pueden seleccionar independientemente de la lista de grupos biodegradables anteriores.

Los grupos alquilo, alquenilo y ciclilo (p. ej., carbociclilo y heterociclilo) pueden estar opcionalmente sustituidos a menos que se especifique de otra manera. Los sustituyentes opcionales se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero no están limitados a, un átomo de halógeno (p. ej., un grupo cloruro, bromuro, fluoruro o yoduro), un ácido carboxílico (p. ej., -C(O)OH), un alcohol (p. ej., un hidroxilo, -OH), un éster (p. ej., -C(O)OR o -OC(O)R), un aldehído (p. ej., -C(O)H), un carbonilo (p. ej., -C(O)R, alternativamente representado por C=O), un haluro de acilo (p. ej., -C(O)X, en el cual X es un haluro seleccionado de bromuro, fluoruro, cloruro y yoduro), un carbonato (p. ej., -OC(O)OR), un alcoxi (p. ej., -OR), un acetal (p. ej., -C(OR)²R””, en el cual cada OR son grupos alcoxi que pueden ser iguales o diferentes y R”” es un grupo alquilo o alquenilo), un fosfato (p. ej., P(O)43-), un tiol (p. ej., -SH), un sulfóxido (p. ej., -S(O)R), un ácido sulfínico (p. ej., -S(O)OH), un ácido sulfónico (p. ej., -S(O)²OH), un tial (p. ej., -C(S)H), un sulfato (p. ej., S(O)42-), un sulfonilo (p. ej., -S(O)²-), una amida (p. ej., -C(O)n R²o -N(R)C(o )r ), un azido (p. ej., -N³), un nitro (p. ej., -NO²), un ciano (p. ej., -CN), un isociano (p. ej., -NC), un aciloxi (p. ej., -O^c(O)R), un amino (p. ej., -NR², -ⁿR^ho -NH²), un carbamoilo (p. ej., -OC(O)ⁿR², -OC(O)NRH o -OC(O)NH²), una sulfonamida (p. ej., -S(O)²NR², -S(O)²NRH, -S(O)²NH², -N(R)S(O)²R, -N(H)S(O)²R, -N(R)S(O)²H o -N(H)S(O)²H), un grupo alquilo, un grupo alquenilo y un grupo ciclilo (p. ej., carbociclilo o heterociclilo).

En cualquiera de los anteriores, R es un grupo alquilo o alquenilo, como se define en el presente documento. En algunos casos, los propios grupos sustituyentes pueden estar además sustituidos con, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se definen en el presente documento. Por ejemplo, un grupo alquilo C^1-6puede estar además sustituido con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se describe en el presente documento.

Los compuestos de una cualquiera de las fórmulas (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe) incluyen una o más de las siguientes características cuando sean aplicables.

En algunos casos, R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S y P, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)²y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5.

En otro caso, R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -C(R)N(R)²C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino y alquilo C^1-3, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5.

En otro caso, R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; y cuando Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R⁴es -(CH²)nQ en el que n es 1 o 2, o (ii) R⁴es -(CH²)nCHQR en el que n es 1, o (iii) R⁴es -CHQR y -CQ(R)², entonces Q es ya sea un heteroarilo de 5 a 14 miembros o heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros.

En otro caso, R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q se selecciona de un carbociclo C^3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O y S, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5.

En otro caso, R⁴es alquilo C^1-4no sustituido, p. ej., metilo no sustituido.

En ciertos casos, la descripción proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R⁴es -(CH²)nQ o -(CH²)nCHQR, donde Q es -N(R)², y n se selecciona de 3, 4 y 5.

En ciertos casos, la descripción proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R⁴se selecciona del grupo que consiste en -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR y -CQ(R)², donde Q es -N(R)², y n se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5.

En ciertos casos, la descripción proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C^2-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo, y R⁴es -(CH²)nQ o -(CH²)nCHQR, donde Q es -N(R)²y n se selecciona de 3, 4 y 5.

En ciertos casos, R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C^2-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo.

En algunos casos, R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20y alquenilo C^5-20.

En otros casos, R¹se selecciona del grupo que consiste en -R*YR”, -YR” y -R”M'R'.

En ciertos casos, R¹se selecciona de -R*YR” y -YR”. En algunos casos, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos casos, R* es alquilo C8 o alquenilo C8. En ciertos casos, R” es alquilo C^3-12. Por ejemplo, R” puede ser alquilo C³. Por ejemplo, R” puede ser alquilo C^4-8(p. ej., alquilo C⁴, C⁵, C6, C⁷o C8).

En algunos casos, R¹es alquilo C^5-20. En algunos casos, R¹es alquilo C6. En algunos casos, R¹es alquilo C8. En otros casos, R¹es alquilo C⁹. En ciertos casos, R¹es alquilo C¹⁴. En otros casos, R¹es alquilo C¹⁸.

En algunos casos, R¹es alquenilo C^5-20. En ciertos casos, R¹es alquenilo C¹⁸. En algunos casos, R¹es linoleilo. En ciertos casos, R¹es ramificado (p. ej., decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo o heptadeca-9-ilo). En ciertos casos, R¹es

En ciertos casos, R¹es alquilo C^5-20o alquenilo C^5-20no sustituido. En ciertos casos, R' es alquilo C^5-20o alquenilo C^5-20sustituido (p. ej., sustituido con un carbociclo C^3-6tal como 1-ciclopropilnonilo).

En otros casos, R¹es -R”M'R'.

En algunos casos, R' se selecciona de -R*YR” y -YR”. En algunos casos, Y es cicloalquilo C^3-8. En algunos casos, Y es arilo C^6-10. En algunos casos, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos casos, Y es un grupo ciclohexilo. En ciertos casos, R* es alquilo C¹.

En algunos casos, R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^3-12y alquenilo C^3-12. En algunos casos, R” adyacente a Y es alquilo C¹. En algunos casos, R” adyacente a Y es alquilo C^4-9(p. ej., alquilo C⁴, C⁵, C6, C7 o C8 o C9).

En algunos casos, R' se selecciona de alquilo C⁴y alquenilo C⁴. En ciertos casos, R' se selecciona de alquilo C⁵y alquenilo C⁵. En algunos casos, R' se selecciona de alquilo C6 y alquenilo C6. En algunos casos, R' se selecciona de alquilo C7 y alquenilo C7. En algunos casos, R' se selecciona de alquilo C9 y alquenilo C9. En otros casos, R' se selecciona de alquilo C¹¹y alquenilo C¹¹. En otros casos, R' se selecciona de alquilo C¹², alquenilo C¹², alquilo C¹³, alquenilo C¹³, alquilo C¹⁴, alquenilo C¹⁴, alquilo C¹⁵, alquenilo C¹⁵, alquilo C¹⁶, alquenilo C¹⁶, alquilo C¹⁷, alquenilo C¹⁷, alquilo C¹⁸y alquenilo C¹⁸. En ciertos casos, R' es ramificado (p. ej., decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo o heptadeca-9-ilo). En ciertos casos, R' es

En ciertos casos, R' es alquilo C^1-18no sustituido. En ciertos casos, R' es alquilo C^1-18sustituido (p. ej., alquilo Ci-5 sustituido con un carbociclo C^3-6tal como 1-ciclopropilnonilo).

En algunos casos, R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^3-14y alquenilo C^3-14. En algunos casos, R” es alquilo C³, alquilo C⁴, alquilo C⁵, alquilo C6, alquilo C⁷o alquilo C8. En algunos casos, R” es alquilo C⁹, alquilo C¹⁰, alquilo C¹¹, alquilo C¹², alquilo C¹³o alquilo C¹⁴.

En algunos casos, M' es -C(O)O-. En algunos casos, M' es -OC(O)-.

En otros casos, M' es un grupo arilo o grupo heteroarilo. Por ejemplo, M' se puede seleccionar del grupo que consiste en fenilo, oxazol y tiazol.

En algunos casos, M es -C(O)O-. En algunos casos, M es -OC(O)-. En algunos casos, M es -C(O)N(R')-. En algunos casos, M es -P(O)(OR')O-.

En otros casos, M es un grupo arilo o grupo heteroarilo. Por ejemplo, M se puede seleccionar del grupo que consiste en fenilo, oxazol y tiazol.

En algunos casos, M es el mismo que M'. En otros casos, M es diferente de M'.

En algunos casos, cada R⁵es H. En algunos de dichos casos, cada R6 también es H.

En algunos casos, R⁷es H. En otros casos, R⁷es alquilo C^1-3(p. ej., metilo, etilo, propilo o i-propilo).

En algunos casos, R²y R³son independientemente alquilo C^5-14o alquenilo C^5-14.

En algunos casos, R²y R³son iguales. En algunos casos, R²y R³son alquilo C8. En ciertos casos, R²y R³son alquilo C². En otros casos, R²y R³son alquilo C³. En algunos casos, R²y R³son alquilo C⁴. En ciertos casos, R²y R³son alquilo C⁵. En otros casos, R²y R³son alquilo C6. En algunos casos, R²y R³son alquilo C⁷. En otros casos, R²y R³son diferentes. En ciertos casos, R²es alquilo C8. En algunos casos, R³es C^1-7(p. ej., alquilo C¹, C², C³, C⁴, C⁵, C6 o C⁷) o alquilo C⁹.

En algunos casos, R7 y R3 son H.

En ciertos casos, R²es H.

En algunos casos, m es 5, 7 o 9.

En algunos casos, R⁴se selecciona de -(CH²)nQ y -(CH²)nCHQR.

En algunos casos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH²)nN(R)², -OC(O)R, -CX³, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)², -N(H)C(S)N(R)², -N(H)C(S)N(H)(R), -C(R)N(R)²C(O)OR, un carbociclo y un heterociclo.

En ciertos casos, Q es -OH.

En ciertos casos, Q es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o no sustituido, p. ej., Q es un imidazol, una pirimidina, una purina, 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-on-9-ilo (o guanin-9-ilo), adenin-9-ilo, citosin-1-ilo o uracil-1-ilo. En ciertos casos, Q es un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros sustituido, p. ej., sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de oxo (=O), OH, amino y alquilo C^1-3. Por ejemplo, Q es 4-metilpiperazinilo, 4-(4-metoxibencil)piperazinilo o isoindolin-2-il-1,3-diona.

En ciertos casos, Q es un arilo C^6-10(tal como fenilo) o cicloalquilo C^3-6no sustituido o sustituido.

En algunos casos, n es 1. En otros casos, n es 2. En casos adicionales, n es 3. En ciertos casos, n es 4. Por ejemplo, R⁴puede ser -(CH²)²OH. Por ejemplo, R⁴puede ser -(CH2)3OH. Por ejemplo, R⁴puede ser -(CH2)4OH. Por ejemplo, R⁴puede ser bencilo. Por ejemplo, R⁴puede ser 4-metoxibencilo.

En algunos casos, R⁴es un carbociclo C^3-6. En algunos casos, R⁴es un cicloalquilo C^3-6. Por ejemplo, R⁴puede ser ciclohexilo opcionalmente sustituido con p. ej., OH, halógeno, alquilo C^1-6, etc. Por ejemplo, R⁴puede ser 2-hidroxiciclohexilo.

En algunos casos, R es H.

En algunos casos, R es alquilo C^1-3no sustituido o alquenilo C^2-3no sustituido. Por ejemplo, R⁴puede ser -CH2CH(OH)CH3 o -CH2CH(OH)CH2CH3.

En algunos casos, R es alquilo C^1-3sustituido, p. ej., CH²OH. Por ejemplo, R⁴puede ser -CH²CH(OH)CH²OH.

En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O, S y P. En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un carbociclo de C^3-20opcionalmente sustituido (p. ej., carbociclo C^3-18, carbociclo C^3-15, carbociclo C^3-12o carbociclo C^3-10), ya sea aromático o no aromático. En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un carbociclo C^3-6. En otros casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un carbociclo C6, tal como un grupo ciclohexilo o fenilo. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C^3-6está sustituido con uno o más grupos alquilo (p. ej., en el mismo átomo del anillo o en átomos del anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo o fenilo que lleva una o más sustituciones alquilo C⁵. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C^3-6formado por R²y R³, está sustituido con un grupo carbociclo. Por ejemplo, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo o fenilo que está sustituido con ciclohexilo. En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un carbociclo C^7-15, tal como un grupo cicloheptilo, ciclopentadecanilo o naftilo.

En algunos casos, R⁴se selecciona de -(CH²)nQ y -(CH²)nCHQR. En algunos casos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH²)nN(R)², -OC(O)R, -CX³, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R) y un heterociclo. En otros casos, Q se selecciona del grupo que consiste en un imidazol, una pirimidina y una purina.

En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos casos, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un carbociclo C^3-6, tal como un grupo fenilo. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C^3-6está sustituido con uno o más grupos alquilo (p. ej., en el mismo átomo del anillo o en átomos del anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, pueden formar un grupo fenilo que lleva una o más sustituciones alquilo C⁵.

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

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En otros casos, el compuesto de Fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en el Compuesto 1-Compuesto 147, o sales o estereoisómeros de los mismos.

Los restos amina de los compuestos de lípido descritos en el presente documento se pueden protonar en ciertas condiciones. Por ejemplo, el resto amina central de un lípido de acuerdo con la fórmula (I) se protona típicamente (es decir, se carga positivamente) a un pH por debajo del pKa del resto amino y no se carga sustancialmente a un pH por encima del pKa. Tales lípidos se pueden mencionar como aminolípidos ionizables.

En un caso específico, los aminolípidos ionizables Compuesto 18.

En algunos casos, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), varía de aproximadamente 1% en moles a 99% en moles en la composición de lípido.

En un caso, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), es al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en moles en la composición de lípido.

En un caso, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), varía de aproximadamente 30% en moles a aproximadamente 70% en moles, de aproximadamente 35% en moles a aproximadamente 65% en moles, de aproximadamente 40% en moles a aproximadamente 60% en moles, y de aproximadamente 45% en moles a aproximadamente 55% en moles en la composición de lípido.

En un caso específico, la cantidad del aminolípido ionizable, p. ej., el compuesto de fórmula (I), es aproximadamente 50% en moles en la composición de lípido.

Además del aminolípido ionizable descrito en el presente documento, p. ej., el compuesto de fórmula (I), la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede comprender componentes adicionales tales como fosfolípidos, lípidos estructurales, compuestos de amina cuaternaria, PEG-lípidos y cualquier combinación de los mismos.

En otros aspectos, la nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 20-60% de aminolípido ionizable: 5-25% de lípido fosfolípido: 25-55% de esterol; y 0.5-15% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 20-60% del Compuesto 18: 5-25% de fosfolípido: 25-55% de colesterol; y 0.5-15% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 50% de aminolípido ionizable: aproximadamente 10% de fosfolípido: aproximadamente 38.5% de colesterol; y aproximadamente 1.5% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 50% del Compuesto 18: aproximadamente 10% de fosfolípido: aproximadamente 38.5% de colesterol; y aproximadamente 1.5% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 49.83% de aminolípido ionizable: aproximadamente 9.83% de fosfolípido: aproximadamente 30.33% de colesterol; y aproximadamente 2.0% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 49.83% del Compuesto 18: aproximadamente 9.83% de fosfolípido: aproximadamente 30.33% de colesterol; y aproximadamente 2.0% de lípido modificado con PEG.

b. Componentes adicionales en la composición de lípido

(i) Fosfolípidos

La composición de lípido de la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más fosfolípidos, por ejemplo, uno o más fosfolípidos saturados o (poli)insaturados o una combinación de los mismos. En general, los fosfolípidos comprenden una resto de fosfolípido y uno o más restos de ácido graso. Por ejemplo, un fosfolípido puede ser un lípido de acuerdo con la fórmula (VII):

en la cual Rp representa un resto de fosfolípido y R¹y R²representan restos de ácido graso con o sin insaturación que pueden ser iguales o diferentes.

Un resto de fosfolípido se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidilcolina y una esfingomielina.

Un resto de ácido graso se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

Fosfolípidos particulares pueden facilitar la fusión a una membrana. Por ejemplo, un fosfolípido catiónico puede interaccionar con uno o más fosfolípidos negativamente cargados de una membrana (p. ej., una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido a una membrana puede permitir que uno o más elementos (p. ej., un agente terapéutico) de una composición que contiene lípido (p. ej., LNP) pase a través de la membrana permitiendo, p. ej., el suministro del uno o más elementos a un tejido objetivo (p. ej., tejido tumoral).

También se contemplan especies de fosfolípidos no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclación y alquinos. Por ejemplo, un fosfolípido se puede funcionalizar con o reticular con uno o más alquinos (p. ej., un grupo alquenilo en el cual uno o más enlaces dobles se reemplazan con un enlace triple). En condiciones de reacción apropiadas, un grupo alquino puede dar una cicloadición catalizada con cobre tras la exposición a una azida. Tales reacciones pueden ser útiles en la funcionalización de una bicapa lipídica de una composición de nanopartícula para facilitar la permeación de la membrana o reconocimiento celular o la conjugación de un composición de nanopartícula a un componente útil tal como un resto de dirección o de formación de imagen (p. ej., un colorante).

Los fosfolípidos incluyen, pero no están limitados a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípido, tal como esfingomielina. En algunos casos, una composición farmacéutica para suministro intratumoral descrito en el presente documento puede comprender más de un fosfolípido. Cuando se utiliza más de un fosfolípido, tales fosfolípidos pueden pertenecer a la misma clase de fosfolípido (p. ej., MSPC y DSPC) o diferentes clases (p. ej., MSPC y MSPE).

Los fosfolípidos pueden ser de un tipo simétrico o asimétrico. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “fosfolípido simétrico” incluye glicerofosfolípidos que tienen restos de ácido graso coincidentes y esfingolípidos en los cuales el resto de ácido graso variable y la cadena de hidrocarburo de la cadena principal de esfingosina incluyen un número comparable de átomos de carbono. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “fosfolípido asimétrico” incluyen lisolípidos, glicerofosfolípidos que tienen diferentes restos de ácido graso (p. ej., restos de ácido graso con diferentes números de átomos de carbono y/o insaturaciones (p. ej., enlaces dobles)), y esfingolípidos en los cuales el resto de ácido graso variable y la cadena de hidrocarburo de la cadena principal de esfingosina incluye un número diferente de átomos de carbono (p. ej., el resto de ácido graso variable incluye al menos dos o más átomos de carbono que la cadena de hidrocarburo o al menos dos átomos de carbono menos que la cadena de hidrocarburo).

En algunos casos, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende al menos un fosfolípido simétrico. Los fosfolípidos simétricos se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en

1.2- dipropionil-sn-glicero-3-fosfocolina (03:0 PC),

1.2- dibutiril-sn-glicero-3-fosfocolina (04:0 PC),

1.2- dipentanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (05:0 PC),

1.2- dihexanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (06:0 PC),

1.2- diheptanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (07:0 PC),

1.2- dioctanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (08:0 PC),

1.2- dinonanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (09:0 PC),

1.2- didecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (10:0 PC),

1.2- diundecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (11:0 PC, DUPC),

1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina (12:0 PC),

1.2- ditridecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (13:0 PC),

1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0 PC, DMPC),

1.2- dipentadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0 PC),

1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0 PC, DPPC),

1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (4ME 16:0 PC),

1.2- diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 PC, DSPC),

1.2- dinonadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (19:0 PC),

1.2- diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:0 PC),

1.2- dihenaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (21:0 PC),

1.2- dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22:0 PC),

1.2- ditricosanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (23:0 PC),

1.2- dilignoceroil-sn-glicero-3-fosfocolina (24:0 PC),

1.2- dimiristoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Cis) PC),

1.2- dimiristelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:1 (A9-Trans) PC),

1.2- dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Cis) PC),

1.2- dipalmitelaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:1 (A9-Trans) PC),

1.2- dipetroselenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (A6-Cis) PC),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (A9-Cis) PC, DOPC),

1.2- dielaidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 (A9-Trans) PC),

1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:2 (Cis) PC, DLPC),

1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:3 (Cis) PC, DLnPC),

1.2- dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:1 (Cis) PC),

1.2- diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (20:4 (Cis) PC, DAPC),

1.2- dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22:1 (Cis) PC),

1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22:6 (Cis) PC, DHAPC),

1.2- dinervonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (24:1 (Cis) PC),

1.2- dihexanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (06:0 PE),

1.2- dioctanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (08:0 PE),

1.2- didecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (10:0 PE),

1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (12:0 PE),

1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (14:0 PE),

1.2- dipentadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0 PE),

1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0 PE),

1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (4ME 16:0 PE),

1.2- diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (17:0 PE),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0 PE, DSPE),

1.2- dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:1 PE),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (A9-Cis) PE, DOPE),

1.2- dielaidoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 (A 9-Trans) PE),

1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:2 PE, DLPE),

1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:3 PE, DLnPE),

1.2- diarachidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (20:4 PE, DAPE),

1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (22:6 PE, DHAPE),

1.2- di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) sal de sodio (DOPG) y

cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende al menos un fosfolípido simétrico seleccionado del grupo no limitante que consiste en DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 Diéter PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE, DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende al menos un fosfolípido asimétrico. Los fosfolípidos asimétricos se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en

1-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-16:0 PC, MPPC),

1-miristoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-18:0 PC, MSPC),

1-palmitoil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-02:0 PC),

1-palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-14:0 PC, PMPC),

1-palmitoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:0 PC, PSPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:1 PC, POPC),

1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:2 PC, PLPC),

1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-20:4 PC),

1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-22:6 PC),

1-estearoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-14:0 PC, SMPC),

1-estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-16:0 PC, SPPC),

1-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-18:1 PC, SOPC),

1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-18:2 PC),

1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-20:4 PC),

1-estearoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-22:6 PC),

1-oleoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1-14:0 PC, OMPC),

1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1-16:0 PC, OPPC),

1-oleoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1-18:0 PC, OSPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:1 PE, POPE),

1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:2 PE),

1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-20:4 PE),

1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-22:6 PE),

1 -estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:1 PE),

1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:2 PE),

1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-20:4 PE),

1-estearoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-22:6 PE),

1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC) y

cualquier combinación de los mismos.

Los lípidos asimétricos útiles en la composición de lípido también pueden ser lisolípidos. Los lisolípidos se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en

1-hexanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (06:0 Lyso PC),

1-heptanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (07:0 Lyso PC),

1-octanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (08:0 Lyso PC),

1-nonanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (09:0 Lyso PC),

1-decanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (10:0 Lyso PC),

1-undecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (11:0 Lyso PC),

1-lauroil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (12:0 Lyso PC),

1-tridecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (13:0 Lyso PC),

1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0 Lyso PC),

1-pentadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0 Lyso PC),

1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0 Lyso PC),

1-heptadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (17:0 Lyso PC),

1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Lyso PC),

1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1 Lyso PC),

1-nonadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (19:0 Lyso PC),

1-araquidoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (20:0 Lyso PC),

1-behenoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (22:0 Lyso PC),

1-lignoceroil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (24:0 Lyso PC),

1-hexacosanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (26:0 Lyso PC),

1-miristoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (14:0 Lyso PE),

1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0 Lyso PE),

1-estearoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0 Lyso PE),

1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lyso PE),

1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Lyso PC) y

cualquier combinación de los mismos.

En algún caso, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende al menos un fosfolípido asimétrico seleccionado del grupo que consiste en MPPC, MSPC, PMPC, PSPC, SMPC, SPPC y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el fosfolípido asimétrico es 1-miristoil-2-estearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (MSPC). En un caso particular, el fosfolípido asimétrico es uno o más fosfolípidos descritos en la Solicitud Internacional N° PCT/US 17/27492, presentada el 13 de abril de 2017. En algunos casos, las composiciones de lípido descritas en el presente documento pueden contener uno o más fosfolípidos simétricos, uno o más fosfolípidos asimétricos o una combinación de los mismos. Cuando múltiples fosfolípidos están presentes, se pueden presentar en relaciones equimolares o relaciones no equimolares. En un caso, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende una cantidad total de fosfolípido (p. ej., MSPC) que varía de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 10% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 15% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 10% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 10% en moles en la composición de lípido. En un caso, la cantidad del fosfolípido es de aproximadamente 8% en moles a aproximadamente 15% en moles en la composición de lípido. En un caso, la cantidad del fosfolípido (p. ej., MSPC) es aproximadamente 10% en moles en la composición de lípido.

En algunos aspectos, la cantidad de un fosfolípido específico (p. ej., MSPC) es al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% en moles en la composición de lípido.

(ii) Compuestos de amina cuaternaria

La composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más compuestos de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP). La expresión “compuesto de amina cuaternaria” se utiliza para incluir aquellos compuestos que tienen uno o más grupos amina cuaternaria (p. ej., grupos trialquilamino) y que llevan permanentemente una carga positiva y existen en una forma de una sal. Por ejemplo, el uno o más grupos amina cuaternaria pueden estar presentes en un lípido o un polímero (p. ej., PEG). En algunos casos, el compuesto de amina cuaternaria comprende (1) un grupo amina cuaternaria y (2) al menos un grupo de cola hidrofóbico que comprende (i) una cadena de hidrocarburo, lineal o ramificada, y saturada o insaturada, y (ii) opcionalmente un éter, éster, carbonilo, o enlace de cetal entre el grupo amina cuaternaria y la cadena de hidrocarburo. En algunos casos, el grupo amina cuaternaria puede ser un grupo trimetilamonio. En algunos casos, el compuesto de amina cuaternaria comprende dos cadenas de hidrocarburo idénticas. En algunos casos, el compuesto de amina cuaternaria comprende dos cadenas de hidrocarburo diferentes.

En algunos casos, la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende al menos un compuesto de amina cuaternaria. El compuesto de amina cuaternaria se puede seleccionar del grupo no limitante que consiste en

1.2- dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP),

cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA),

cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio (DOTIM),

trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)-etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB),

bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE),

bromuro de N-(1,2-dioleoiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE),

cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC),

1.2- dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLePC),

1.2- diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP),

1.2- dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP),

1.2- dilinoleoil-3-trimetilamonio-propano (DLTAP),

1.2- dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP)

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSePC)

1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DPePC),

1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMePC),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOePC),

1.2- di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfocolina (14:1 EPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (16:0-18:1 EPC),

y cualquier combinación de los mismos.

En un caso, el compuesto de amina cuaternaria es 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

Los compuestos de amina cuaternaria se conocen en la técnica, tales como los descritos en los documentos US 2013/0245107 A1, US 2014/0363493 A1, US 8,158,601, WO 2015/123264 A1 y WO 2015/148247 A1. En un caso, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento varía de aproximadamente 0.01% en moles a aproximadamente 20% en moles.

En un caso, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento varía de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 3% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 3% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 3% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 6% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 6% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 6% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 7% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 7% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 7% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 8% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 8% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 8% en moles a aproximadamente 10% en moles, de aproximadamente 9% en moles a aproximadamente 20% en moles, de aproximadamente 9% en moles a aproximadamente 15% en moles, de aproximadamente 9% en moles a aproximadamente 10% en moles.

En un caso, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento varía de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 10% en moles.

En un caso, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento es aproximadamente 5% en moles. En un caso, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento es aproximadamente 10% en moles.

En algunos casos, la cantidad del compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) es al menos aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5 o 20% en moles en la composición de lípido descrita en el presente documento.

En algunos casos, la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprende un compuesto de fórmula (I). En un caso, la relación en moles del compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTA) es aproximadamente 100:1 a aproximadamente 2.5:1. En un caso, la relación en moles del compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) es aproximadamente 90:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 5:1 o aproximadamente 2.5:1. En un caso, la relación en moles del compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) al compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido descrita en el presente documento es aproximadamente 10:1.

En algunos casos, la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprende la composición de lípido descrita en la Solicitud Internacional N° PCT/US2017/027492, presentada el 13 de abril de 2017.

En algunos aspectos, la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprende un compuesto de amina cuaternaria. En algunos aspectos, la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprende DOTAP.

(iii) Lípidos estructurales

La composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más lípidos estructurales. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “lípido estructural” se refiere a esteroles y también a lípidos que contienen restos de esterol. En algunos casos, el lípido estructural se selecciona del grupo que consiste en colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y mezclas de los mismos. En algunos casos, el lípido estructural es colesterol.

En un caso, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento varía de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 60% en moles, de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 55% en moles, de aproximadamente 30% en moles a aproximadamente 50% en moles o de aproximadamente 35% en moles a aproximadamente 45% en moles.

En un caso, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición de lípido descrita en el presente documento varía de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 30% en moles, de aproximadamente 30% en moles a aproximadamente 35% en moles o de aproximadamente 35% en moles a aproximadamente 40% en moles.

En un caso, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición de lípido descrita en el presente documento es aproximadamente 23.5% en moles, aproximadamente 28.5% en moles, aproximadamente 33.5% en moles o aproximadamente 38.5% en moles.

En algunos casos, la cantidad del lípido estructural (p. ej., un esterol tal como colesterol) en la composición de lípido descrita en el presente documento es al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60% en moles.

En algunos aspectos, el componente de la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas para suministro intratumoral descritas no comprende colesterol.

(iv) Polietilenglicol (PEG)-Lípidos

La composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más de un lípido con polietilenglicol (PEG).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “PEG-lípido” se refiere a lípidos modificados con polietilenglicol (PEG). Ejemplos no limitantes de PEG-lípidos incluyen fosfatidiletanolamina modificada con PEG y ácido fosfatídico, conjugados de PEG-ceramida (p. ej., PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Tales lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un PEG-lípido puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido con PEG-DSPE.

En algunos casos, el PEG-lípido incluye, pero no se limitan a 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxi-polietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-disterilglicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (PEG-DPPE) o PEG-1,2-dimiristiloxlpropil-3-amina (PEG-c-DMA).

En un caso, el PEG-lípido se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG y mezclas de los mismos.

En algunos casos, el resto de lípido de los PEG-lípidos incluyen los que tienen longitudes de aproximadamente C¹⁴a aproximadamente C²², preferiblemente de aproximadamente C¹⁴a aproximadamente C¹⁶. En algunos casos, un resto de PEG, por ejemplo un mPEG-NH², tiene un tamaño de aproximadamente 1000, 2000, 5000, 10 000, 15000 o 20000 daltons. En un caso, el PEG-lípido es PEG-DMG.

En un caso, las nanopartículas de lípido descritas en el presente documento pueden comprender un PEG-lípido el cual es un PEG no difundible. Ejemplos no limitantes de PEG no difundibles incluyen PEG-DSG y PEG-DSPE.

Los PEG-lípidos se conocen en la técnica, tales como los descritos en la Patente de EE. UU. N° 8158601 y Publicación Internacional N° WO 2015/130584 A2.

En un caso, la cantidad de PEG-lípido en la composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento varía de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 5% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 5% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 5% en moles, de aproximadamente 1.5% en moles a aproximadamente 5% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 5% en moles % en moles, de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 4% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 4% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 4% en moles, de aproximadamente 1.5% en moles a aproximadamente 4% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 4% en moles, de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 3% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 3% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 3% en moles, de aproximadamente 1.5% en moles a aproximadamente 3% en moles, de aproximadamente 2% en moles a aproximadamente 3% en moles, de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 2% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 2% en moles, de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 2% en moles, de aproximadamente 1.5% en moles a aproximadamente 2% en moles, de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 1.5% en moles, de aproximadamente 0.5% en moles a aproximadamente 1.5% en moles o de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 1.5% en moles.

En un caso, la cantidad de PEG-lípido en la composición de lípido descrita en el presente documento es aproximadamente 1.5% en moles.

En un caso, la cantidad de PEG-lípido en la composición de lípido descrita en el presente documento es al menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, o 5% en moles.

En algunos aspectos, la composición de lípido de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprende un PEG-lípido.

En algunos casos, la composición de lípido descrita en el presente documento comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I) y un fosfolípido asimétrico. En algunos casos, la composición de lípido comprende el compuesto 18 y MSPC.

En algunos casos, la composición de lípido descrita en el presente documento comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I), y un compuesto de amina cuaternaria. En algunos casos, la composición de lípido comprende el compuesto 18 y DOTAP.

En algunos casos, la composición de lípido descrita en el presente documento comprende un aminolípido ionizable, p. ej., un compuesto de fórmula (I), un fosfolípido asimétrico, y un compuesto de amina cuaternaria. En algunos casos, la composición de lípido comprende el compuesto 18, MSPC y DOTAP.

En un caso, la composición de lípido comprende aproximadamente 50% en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48), aproximadamente 10% en moles de DSPC o MSPC, aproximadamente 33.5% en moles de colesterol, aproximadamente 1.5% en moles de PEG-DMG, y aproximadamente 5% en moles de DOTAP. En un caso, la composición de lípido comprende aproximadamente 50% en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48), aproximadamente 10% en moles de DSPC o MSPC, aproximadamente 28.5% en moles de colesterol, aproximadamente 1.5% en moles de PEG-DMG y aproximadamente 10% en moles de DOTAP.

En algunos casos, la nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 20-60% de aminolípido ionizable: 5-25% de fosfolípido: 25-55% de esterol; y 0.5-15% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 20-60% del Compuesto 18: 5-25% de fosfolípido: 25-55% de colesterol; y 0.5-15% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 50% de aminolípido ionizable: aproximadamente 10% de fosfolípido: aproximadamente 38.5% de colesterol; y aproximadamente 1.5% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 50% del Compuesto 18: aproximadamente 10% de fosfolípido: aproximadamente 38.5% de colesterol; y aproximadamente 1.5% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 49.83% de aminolípido ionizable: aproximadamente 9.83% de fosfolípido: aproximadamente 30.33% de colesterol; y aproximadamente 2.0% de lípido modificado con PEG. En otros aspectos, el vehículo de nanopartícula de lípido comprende una relación molar de aproximadamente 49.83% del Compuesto 18: aproximadamente 9.83% de fosfolípido: aproximadamente 30.33% de colesterol; and aproximadamente 2.0% de lípido modificado con PEG.

Los componentes de la nanopartícula de lípido se pueden adaptar para suministro óptimo de los polinucleótidos basándose en el resultado deseado. Como un ejemplo no limitante, la nanopartícula de lípido puede comprender 40-60% en moles de un aminolípido ionizable (p. ej., un compuesto de fórmula (I)), 8-16% en moles de fosfolípido, 30-45% en moles de colesterol, 1-5% en moles de PEG-lípido y opcionalmente 1-15% en mol de compuesto de amina cuaternaria.

En algunos casos, la nanopartícula de lípido puede comprender 45-65% en moles de un aminolípido ionizable (p. ej., un compuesto de la fórmula (I)), 5-10% en moles de fosfolípido, 25-40% en moles de colesterol, 0.5-5% en moles de PEG-lípido, y opcionalmente 1-15% en moles de compuesto de amina cuaternaria.

Ejemplos no limitantes de partículas de lípido de ácido nucleico se describen en la Publicación de Patente de EE. UU. N° 20140121263.

(v) Otros aminolípidos ionizables

La composición de lípido de la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender uno o más lípidos ionizables además de un lípido de acuerdo con la fórmula (I). Como se utiliza en el presente documento, la expresión “lípido ionizable” tiene su significado ordinario en la técnica y puede referirse a un lípido que comprende uno o más restos cargados. En algunos casos, un lípido ionizable puede estar positivamente cargado o negativamente cargado. Un lípido ionizable puede estar positivamente cargado, en cuyo caso se puede denominar “ lípido catiónico”. Por ejemplo, una molécula ionizable puede comprender un grupo amina, denominada aminolípidos ionizables.

Los lípidos ionizables se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en

3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinaetanamina (KL10),

N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazindietanamina (KL22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25),

1.2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA),

2.2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino)butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA),

2.2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA),

1.2- dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1-amina (L608),

2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA),

(2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)) y

(2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)). Además de estos, un aminolípido ionizable también puede ser un lípido que incluye un grupo amina cíclica.

Los lípidos ionizables también pueden ser los compuestos descritos en la Solicitud Internacional N° WO 2015/199952 A1. Por ejemplo, los aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a:

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(vi) Otros componentes de la composición de lípido

La composición de lípido de una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede incluir uno o más componentes además de los descritos en lo anterior. Por ejemplo, la composición de lípido puede incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes que alteran la superficie (p. ej., tensioactivos) u otros componentes. Por ejemplo, una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2005/0222064. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (p. ej., glucosa) y polisacáridos (p. ej., glucógeno y derivados y análogos de los mismos). La composición de lípido puede incluir un amortiguador tal como, pero no limitado a, citrato o fosfato a un pH de 7, sal y/o azúcar. La sal y/o azúcar se pueden incluir en las formulaciones descritas en el presente documento para la isotonicidad.

Se puede incluir y/o utilizar un polímero para encapsular o encapsular parcialmente una composición farmacéutica descrita en el presente documento (p. ej., una composición farmacéutica en forma de nanopartícula de lípido). Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero se puede seleccionar de, pero no está limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.

La relación entre la composición de lípido y el intervalo de polinucleótido puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1 (p/p).

En algunos casos, la relación entre la composición de lípido y el polinucleótido puede ser aproximadamente 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 o 60:1 (p/p). En algunos casos, la relación en p/p de la composición de lípido al polinucleótido que codifica un agente terapéutico es aproximadamente 20:1 o aproximadamente 15:1.

En algunos casos, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede contener más de un polipéptido. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede contener dos o más polinucleótidos (p. ej., RNA, por ejemplo, mRNA).

En un caso, las nanopartículas de lípidos descritas en el presente documento pueden comprender polinucleótidos (p. ej., mRNA) en una relación en peso de lípido:polinucleótido de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1 o 70:1, o un intervalo o cualquiera de estas relaciones tales como, pero no limitadas a, 5:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 60:1 o de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 70:1.

En un caso, las nanopartículas de lípidos descritas en el presente documento pueden comprender el polinudeótido en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 2 mg/ml tal como, pero no limitado a, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.3 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1.6 mg/ml, 1.7 mg/ml, 1.8 mg/ml, 1.9 mg/ml, 2.0 mg/ml o mayor que 2.0 mg/ml.

En un caso, las formulaciones que comprenden los polinucleótidos y nanopartículas de lípidos descritas en el presente documento pueden comprender de 0.15 mg/ml a 2 mg/ml del polinucleótido descrito en el presente documento (p. ej., mRNA). En algunos casos, la formulación puede comprender además amortiguador de citrato 10 mM y la formulación puede comprender adicionalmente hasta 10% p/p de sacarosa (p. ej., al menos 1% p/p, al menos 2% p/p/, al menos 3% p/p, al menos 4% p/p, al menos 5% p/p, al menos 6% p/p, al menos 7% p/p, al menos 8% p/p, al menos 9% p/p o 10% p/p).

(vii) Composiciones de nanopartículas

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se formulan como nanopartículas de lípidos (LNP). Por consiguiente, la presente descripción también proporciona composiciones de nanopartículas que comprenden (i) una composición de lípido que comprende un agente de suministro tal como un compuesto de fórmula (I) como se describe en el presente documento, y (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12b e IL12A. En tal composición de nanopartículas, la composición de lípido descrita en el presente documento puede encapsular el polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A.

Las composiciones de nanopartículas típicamente tienen un tamaño del orden de micrómetros o más pequeñas y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas de lípido (LNP), liposomas (p. ej., vesículas lipídicas) y lipoplexos. Por ejemplo, una composición de nanopartícula puede ser un liposoma que tiene una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.

Las composiciones de nanopartículas incluyen, por ejemplo, nanopartículas de lípidos (LNP), liposomas y lipoplexos. En algunos casos, las composiciones de nanopartículas son vesículas que incluyen una o más bicapas lipídicas. En ciertos casos, una composición de nanopartícula incluye dos o más bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos. Las bicapas lipídicas se pueden funcionalizar y/o reticular una a otra. Las bicapas lipídicas pueden incluir uno o más ligandos, proteínas o canales.

Las composiciones de nanopartículas de la presente descripción comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la fórmula (I). Por ejemplo, la composición de nanopartícula puede incluir uno o más de los Compuestos 1-147 o uno o más de los Compuestos 1-342. Las composiciones de nanopartículas también pueden incluir una variedad de otros componentes. Por ejemplo, la composición de nanopartícula puede incluir uno o más de otros lípidos además de un lípido de acuerdo con la fórmula (I), tal como (i) al menos un fosfolípido, (ii) al menos un compuesto de amina cuaternaria, (iii) al menos un lípido estructural, (iv) al menos un PEG-lípido o (v) cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende un compuesto de fórmula (I), (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende un compuesto de la fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48), un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC), y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP).

En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende una composición de lípido que consiste esencialmente en el compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende una composición de lípido que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende una composición de lípido que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48), un fosfolípido (p. ej., DSPC o MSPC) y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP). En algunos casos, la composición de nanopartícula comprende una composición de lípido que consiste o consiste esencialmente en un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un compuesto de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP).

En un caso, la composición de nanopartícula comprende (1) una composición de lípido que comprende aproximadamente 50% en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10% en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 33.5% en moles de colesterol; aproximadamente 1.5% en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG²k-DMG); aproximadamente 5% en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.

En un caso, la composición de nanopartícula comprende (1) una composición de lípido que comprende aproximadamente 50% en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10% en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 28.5% en moles de colesterol; aproximadamente 1.5% en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG²k-DMG); aproximadamente 10% en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.

En un caso, la composición de nanopartícula comprende (1) una composición de lípido que comprende aproximadamente 50% en moles de un compuesto de fórmula (I) (p. ej., Compuestos 18, 25, 26 o 48); aproximadamente 10% en moles de DSPC o MSPC; aproximadamente 23.5% en moles de colesterol; aproximadamente 1.5% en moles de PEG-DMG (p. ej., PEG²k-DMG); aproximadamente 15% en moles de DOTAP; y (2) un polinucleótido.

Las composiciones de nanopartículas se pueden caracterizar por una variedad de métodos. Por ejemplo, se puede utilizar microscopia (p. ej., microscopia electrónica de transmisión y microscopia electrónica de barrido) para examinar la morfología y distribución de tamaños de una composición de nanopartículas. Se pueden utilizar dispersión dinámica de luz o potenciometría (p. ej., titulaciones potenciométricas) para medir potenciales zeta. La dispersión dinámica de luz también se puede utilizar para determinar tamaños de partículas. Los instrumentos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) también se pueden utilizar para medir múltiples características de una composición de nanopartículas, tal como el tamaño de partículas, índice de polidispersidad y potencial zeta.

Como se define generalmente en el presente documento, el término “ lípido” se refiere a una molécula pequeña que tiene propiedades hidrofóbicas o anfifílicas. Los lípidos pueden ser naturales o sintéticos. Ejemplos de clases de lípidos incluyen, pero no están limitados a, grasas, ceras, metabolitos que contienen esterol, vitaminas, ácidos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos y policetidas y lípidos de prenol. En algunos ejemplos, las propiedades anfifílicas de algunos lípidos los llevan a formar liposomas, vesículas o membranas en medio acuoso.

En algunos casos, una nanopartícula de lípido (LNP) puede comprender un lípido ionizable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “lípido ionizable” tiene su significado ordinario en la técnica y puede referirse a un lípido que comprende uno o más restos cargados. En algunos casos, un lípido ionizable puede estar positivamente cargado o negativamente cargado. Un lípido ionizable puede estar positivamente cargado, en cuyo caso se puede denominar “lípido catiónico”. Por ejemplo, una molécula ionizable puede comprender un grupo amina, denominados aminolípidos ionizables. Como se utiliza en el presente documento, un “resto cargado” es un resto químico que lleva una carga electrónica formal, p. ej., monovalente (+1, o -1), divalente (+2, o -2), trivalente (+3, o -3), etc. El resto cargado puede ser aniónico (es decir, negativamente cargado) o catiónico (es decir, positivamente cargado). Ejemplos de restos positivamente cargados incluyen grupos amina (p. ej., amina primaria, secundaria y/o terciaria), grupos amonio, grupo piridinio, grupos guanidina y grupos imidizolio. En un caso particular, los restos cargados comprenden grupos amina. Ejemplos de grupos negativamente cargados o precursores de los mismos, incluyen grupos carboxilato, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfonato, grupos fosfato, grupos hidroxilo y similares. La carga del resto cargado puede variar, en algunos casos, con las condiciones ambientales, por ejemplo, cambios en el pH pueden alterar la carga del resto, y/o causar que el resto llegue a estar cargado o no cargado. En general, la densidad de carga de la molécula se puede seleccionar como sea deseado.

Se debe entender que los términos “cargado” o “resto cargado” no se refieren a una “carga negativa parcial” o “carga positiva parcial” en una molécula. Las expresiones “carga negativa parcial” y “carga positiva parcial” se dan con su significado ordinario en la técnica. Una “carga negativa parcial” puede obtenerse cuando un grupo funcional comprende un enlace que se polariza de modo que tira de la densidad electrónica hacia un átomo del enlace, creando una carga negativa parcial en el átomo. Los expertos en la técnica, en general, reconocerán enlaces que se pueden polarizar de esta manera.

En algunos casos, el lípido ionizable es un aminolípido ionizable, algunas veces denominado en la técnica como “lípido catiónico ionizable”. En un caso, el aminolípido ionizable puede tener una cabeza hidrofílica positivamente cargada y una cola hidrofóbica que se conectan por una estructura enlazadora.

El tamaño de las nanopartículas puede ayudar a combatir reacciones biológicas tales como, pero no limitadas a, inflamación o puede incrementar el efecto biológico del polinucleótido.

Como se utiliza en el presente documento, “tamaño” o “tamaño promedio” en el contexto de composiciones de nanopartículas se refieren al diámetro promedio de una composición de nanopartículas.

En un caso, el polinucleótido que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A se formula en nanopartículas de lípido que tienen un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm tal como, pero no limitado a, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.

En un caso, las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En un caso, la nanopartícula tiene un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.

En algunos casos, la dimensión más grande de una composición de nanopartícula es 1 pm o más corta (p. ej., 1 pm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, o más corta).

Una composición de nanopartículas puede ser relativamente homogénea. Se puede utilizar un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, por ejemplo, la distribución del tamaño de partículas de la composición de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (p. ej., menor que 0.3) generalmente indica una distribución del tamaño de partículas estrecha. Una composición de nanopartículas puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0.25, tal como 0.01,0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11,0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24 o 0.25. En algunos casos, el índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas descrita en el presente documento puede ser de aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.20.

El potencial zeta de una composición de nanopartículas se puede utilizar para indicar el potencial electrocinético de la composición. Por ejemplo, el potencial zeta puede describir la carga de superficie de una composición de nanopartículas. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más altamente cargadas pueden interaccionar indeseablemente con células, tejidos y otros elementos en el cuerpo. En algunos casos, el potencial zeta de una composición de nanopartículas descrita en el presente documento puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.

En algunos casos, el potencial zeta de las nanopartículas de lípido puede ser de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 60 mV, and de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 50 mV. En algunos casos, el potencial zeta de las nanopartículas de lípido puede ser de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 15 mV a aproximadamente 45 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, y de aproximadamente 25 mV a aproximadamente 35 mV. En algunos casos, el potencial zeta de las nanopartículas de lípido puede ser aproximadamente 10 mV, aproximadamente 20 mV, aproximadamente 30 mV, aproximadamente 40 mV, aproximadamente 50 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 70 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 90 mV y aproximadamente 100 mV.

La expresión “eficiencia de encapsulación” de un polinucleótido describe la cantidad del polinucleótido que es encapsulado o se asocia de otra manera con una composición de nanopartículas después de la preparación, con respecto a la cantidad inicial proporcionada. Como se utiliza en el presente documento, “encapsulación” puede referirse al cerrado, confinamiento, rodeado o encapsulado, completo, sustancial o parcial.

La eficiencia de encapsulación es a ser posible alta (p. ej., cerca de 100%). La eficiencia de encapsulación se puede medir, por ejemplo, al comparar la cantidad del polinucleótido en una solución que contiene la composición de nanopartículas antes y después de romper la composición de nanopartículas con uno o más disolventes o detergentes orgánicos.

La fluorescencia se puede utilizar para medir la cantidad de polinucleótido libre en una solución. Para las composiciones de nanopartículas descritas en el presente documento, la eficiencia de encapsulación de un polinucleótido puede ser al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ⁸⁵%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En algunos casos, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos 80%. En ciertos casos, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos 90%.

La cantidad de un polinucleótido presente en una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede depender de múltiples factores tales como el tamaño del polinucleótido, objetivo deseado y/o aplicación, u otras propiedades de la composición de nanopartículas así como de las propiedades del polinucleótido.

Por ejemplo, la cantidad de un mRNA útil en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño (expresado como longitud o masa molecular), secuencia y otras características del mRNA. Las cantidades relativas de un polinucleótido en una composición de nanopartículas también pueden variar.

Las cantidades relativas de la composición de lípido y el polinucleótido presentes en una composición de nanopartículas de lípido de la presente descripción se pueden optimizar de acuerdo con las consideraciones de eficiencia y tolerabilidad. Para composiciones que incluyen un mRNA como un polinucleótido, la relación N:P puede servir como una medida útil.

Puesto que la relación N:P de una composición de nanopartículas controla tanto la expresión como tolerabilidad, son deseables las composiciones de nanopartículas con relaciones N:P bajas y expresión alta. Las relaciones N:P varían de acuerdo con la relación de lípidos a RNA en una composición de nanopartículas.

En general, se prefiere una relación N:P menor. El uno o más RNA, lípidos y cantidades de los mismos se pueden seleccionar para proporcionar una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1 o 30:1. En ciertos casos, la relación N:P puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. En otros casos, la relación N:P es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. En ciertos casos, la relación N:P está entre 5:1 y 6:1. En un aspecto específico, la relación N:P es aproximadamente 5.67:1.

Además de proporcionar composiciones de nanopartículas, la presente descripción también proporciona métodos para producir nanopartículas de lípidos que comprenden encapsular un polinucleótido. Tal método comprende utilizar cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y producir nanopartículas de lípidos de acuerdo con métodos de producción de nanopartículas de lípidos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Wang et al., (2015) “Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles” Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al., (2015) “Delivery Systems for Biopharmaceuticals. Part I: Nanoparticles and Microparticles” Curr. Pharm. Technol. 16:940-954; Naseri et al., (2015) “Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application” Adv. Pharm. Bull.

5:305-13; Silva et al., (2015) “Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals” Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, y referencias citadas en los mismos.

25. Otros agentes de suministro

a. Liposomas, lipoplexos y nanopartículas de lípidos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden un agente de suministro, p. ej., un liposoma, un lioplexo, una nanopartícula de lípido o cualquier combinación de los mimos. Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se pueden formular utilizando uno o más liposomas, lipoplexos o nanopartículas de lípidos. Se pueden utilizar liposomas, lipoplexos o nanopartículas de lípidos para mejorar la eficacia de la producción de proteínas dirigida por polinucleótidos ya que estas formulaciones pueden incrementar la transfección celular por el polinucleótido; y/o incrementar la traducción de la proteínas codificadas. Los liposomas, lipoplexos, o nanopartículas de lípidos también se pueden utilizar para incrementar la estabilidad de los polinucleótidos.

Los liposomas son vesículas artificialmente preparadas que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y se pueden utilizar como un vehículo de suministro para la administración de formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños. Una vesícula multilaminar (MLV) puede ser de cientos de nanómetros en diámetro, y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos. Una vesícula unicelular pequeña (SUV) puede ser más pequeña que 50 nm de diámetro, y una vesícula unilaminar grande (LUV) puede estar entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no está limitado a, opsoninas o ligandos para mejorar la unión de los liposomas al tejido no saludable o para activar sucesos tales como, pero no limitados a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un bajo o un alto valor de pH para mejorar el suministro de las formulaciones farmacéuticas.

La formación de liposomas puede depender de la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposomales, la naturaleza del medio en el cual las vesículas de lípido están dispersadas, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su toxicidad potencial, cualesquiera procedimientos adicionales implicados durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño óptimo, polidispersidad y la vida en anaquel de las vesículas para la aplicación prevista y la reproducibilidad lote a lote y el aumento de escala de producción de productos liposomales seguros y eficientes, etc.

Como un ejemplo no limitante, los liposomas tales como vesículas de membranas sintéticas se pueden preparar por los métodos, aparatos y dispositivos descritos en las Publicaciones de EE. UU. N° US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 y US20130183372. En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden estar encapsulados por el liposoma y/o pueden estar contenidos en un núcleo acuoso que luego puede ser encapsulado por el liposoma como se describe en, p. ej., Publicaciones Internacionales N° WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901, WO2012006378 y WO2013086526; y Publicaciones de EE. UU. N° US20130189351, US20130195969 y US20130202684.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprende un núcleo de aceite y un lípido catiónico que puede interaccionar con el polinucleótido anclando la molécula a la partícula de emulsión. En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una emulsión de agua en aceite que comprende una fase hidrofóbica continua en la cual la fase hidrofílica se dispersa. Las emulsiones de ejemplo se pueden hacer por los métodos descritos en las Publicaciones Internacionales N° WO2012006380 y WO201087791.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un complejo de lípido-policatión. La formación del complejo de lípido-policatión se puede realizar por métodos como se describen en, por ejemplo, la Publicación de Patente de Ee . UU. N° US20120178702. Como un ejemplo no limitante, el policatión puede incluir un péptido catiónico o un polipéptido tal como, pero no limitado a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional N° WO2012013326 o Publicación de EE. UU. N° US20130142818.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en una nanopartícula de lípido (LNP) tales como los descritos en las Publicaciones Internacionales N° WO2013123523, WO2012170930, WO2011127255 y WO2008103276; y Publicación de EE. UU. N° US20130171646.

Las formulaciones de nanopartículas de lípidos típicamente comprenden uno o más lípidos. En algunos casos, el lípido es un lípido ionizable (p. ej., un aminolípido ionizable). En algunos casos, el lípido es un lípido catiónico. En algunos casos, las formulaciones de nanopartículas de lípidos además comprenden otros componentes, que incluyen un fosfolípido, un lípido estructural, un compuesto de amina cuaternaria, y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo un PEG o lípido modificado con PEG.

Los lípidos catiónicos e ionizables pueden incluir aquellos como se describen en, p. ej., las Publicaciones Internacionales N° WO2015199952, WO2015130584, WO2015011633, y WO2012040184, WO2013126803, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276 y WO2013086373; Patentes de EE. UU. N° 7,893,302, 7,404,969, 8,283,333 y 8,466,122; y Publicaciones de EE. UU. N° US20110224447, US20120295832, US20150315112, US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541, US20130123338 y US20130225836. En algunos casos, la cantidad de los lípidos catiónicos e ionizables en la composición de lípidos varía de aproximadamente 0.01% en moles a aproximadamente 99% en moles.

Los lípidos ionizables de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los Compuestos 1-147 descritos en el presente documento, DLin-MC3-DMA (MC3), DLin-DMA, DLenDlVIA, DLin-D-DMA, DLin-K-DMA, DLin-M-C2-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-KC3-DMA, DLin-KC4-DMA, DLin-C2K-DMA, DLin-MP-DMA, DODMA, 98N12-5, C12-200, DLin-C-DAP, DLin-DAC, DLinDAP, DLinAP, DLin-EG-DMA, DLin-2-DMAP, KL10, KL22, KL25, Octil-CLinDMA, Octil-CLinDMA (2R), Octil-CLinDMA (2S), y cualquier combinación de los mismos. Otros lípidos ionizables de ejemplo incluyen, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (L608), (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (16Z,19Z)-N5N-dimetilpentacosa-16,19-dien-8-amina (13Z, 16Z)-N,N-dimetildocosa-13,16-dien-5-amina, (12Z,15z)-N,N-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (¹5Z, 18z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (¹5Z, 18z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22z)-N,N-dimeihiloctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien-10-amina (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriaconta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-1 -nonilicosa-11, 14-dien-1 -il]pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-10-amina, (15Z)-N,N-dimetilheptacos-15-en-10-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-10-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-10-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12,15-dien-1-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptadecan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetil-[(1R,2S)-2-undeciIciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil}dodecan-1-amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-1 -[(octiloxi)metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1 -iloxi]propan-2-amina, 1 -{2-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-1 -[(octiloxi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2s )-1 -[(11Z, 14Z)-icosa-11,14-dien-1 -iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1 -(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctil)oxi]-3-[(9z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}-ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina, y (11E,20z,23z)-N,N-dimetilnonacosa-11,20,2-trien-10-amina y cualquier combinación de los mismos.

Los fosfolípidos incluyen, pero no están limitados a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácido fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípido, tal como esfingomielina. En algunos casos, los fosfolípidos son DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 Diéter PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE, DLnPE, DAPE, DHAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, los fosfolípidos son MPPC, MSPC, PMPC, PSPC, SMPC, SPPC, DHAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, la cantidad de fosfolípidos (p. ej., DSPC y/o MSPC) en la composición de lípido varía de aproximadamente 1% en moles a aproximadamente 20% en moles.

Los lípidos estructurales incluyen esteroles y lípidos que contienen restos de esterol. En algunos casos, los lípidos estructurales incluyen colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y mezclas de los mismos. En algunos casos, el lípido estructural es colesterol. En algunos casos, la cantidad del lípidos estructurales (p. ej., colesterol) en la composición de lípido varía de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 60% en moles.

El compuesto de amina cuaternaria como se describe en el presente documento incluye 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTiM), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), bromuro de N-(1,2-dioleoiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLePC), 1,2-diestearoil-3-trimetilamoniopropano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-dilinoleoil-3-trimetilamonio-propano (DLTAP), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSePC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DPePC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMePC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOePC), 1,2-di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfocolina (14:1 EPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (16:0-18:1 EPC) y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, la cantidad de los compuestos de amina cuaternaria (p. ej., DOTAP) en la composición de lípido varía de aproximadamente 0.01% en moles a aproximadamente 20% en moles.

Los lípidos modificados con PEG incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (p. ej., PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Tales lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un PEG-lípido puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG DMPE, PEG-DPPC o un lípido de PEG-DSPE. En algunos casos, los PEG-lípido son 1,2-dimiristoil-sn-glicerol-metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diesterilglicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE) o PEG-1,2-dimiristiloxlpropil-3-amina (PEG-c-DMA). En algunos casos, el resto de PEG tiene un tamaño de aproximadamente 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 o 20 000 daltons. En algunos casos, la cantidad de PEG-lípido en la composición de lípido varía de aproximadamente 0.1% en moles a aproximadamente 5% en moles.

En algunos casos, las formulaciones de LNP descritas en el presente documento pueden comprender adicionalmente una molécula potenciadora de la permeabilidad. Las moléculas potenciadoras de la permeabilidad no limitantes se describen en la Publicación de EE. UU. N° US20050222064.

Las formulaciones de LNP pueden contener además un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede incrementar los tiempos en la circulación in vivo y/o incrementar el suministro dirigido de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato se pueden hacer por los métodos descritos en, p. ej., la Publicación Internacional N° WO2013033438 o Publicación de EE. UU. N° US20130196948. La formulación de LNP también puede contener un conjugado de polímero (p. ej., un conjugado soluble en agua) como se describe en, p. ej., las Publicaciones de EE. UU. N° US20130059360, US20130196948 y US20130072709.

Las formulaciones de LNP pueden comprender un conjugado para aumentar el suministro de nanopartículas de la presente descripción en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir la eliminación fagocítica de las nanopartículas en un sujeto. En algunos casos, el conjugado puede ser un “auto” péptido diseñado a partir de la proteína CD47 de membrana humana (p. ej., las “auto” partículas descritas por Rodriguez et al., Science 2013339, 971-975). Como muestran Rodriguez et al., los auto péptidos retrasaron la eliminación mediada por macrófago de nanopartículas lo que aumentaba el suministro de las nanopartículas.

Las formulaciones de LNP pueden comprender un vehículo carbohidrato. Como un ejemplo no limitante, el vehículo carbohidrato puede incluir, pero no está limitado a, un material fitoglucógeno modificado con anhídrido o tipo glucógeno, octenil succinato de fitoglucógeno, fitoglucógeno beta-dextrina, fitoglucógeno modificado con anhídrido beta-dextrina (p. ej., Publicación Internacional N° WO2012109121).

Las formulaciones de LNP se pueden recubrir con un tensioactivo o polímero para mejorar el suministro de la partícula. En algunos casos, la LNP se puede recubrir con un recubrimiento hidrofílico tal como, pero no limitado a, recubrimientos de PEG y/o recubrimientos que tienen una carga de superficie neutra como se describe en la Publicación de EE. UU. N° US20130183244.

Las formulaciones de LNP se pueden diseñar para alterar las propiedades de superficie de las partículas de modo que las nanopartículas de lípidos pueden penetrar la barrera mucosa como se describe en la Patente de EE. UU. N° 8,241,670 o Publicación Internacional N° WO2013110028.

La LNP diseñada para penetrar la mucosa puede comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero-vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, pero no está limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.

La LNP diseñada para penetrar la mucosa también puede incluir agentes que alteran la superficie tales como, pero no limitados a, polinucleótidos, proteínas aniónicas (p. ej., albúmina de suero bovino), tensioactivos (p. ej., tensioactivos catiónicos tales como por ejemplo bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcares (p. ej., ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (p. ej., heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (p. ej., N-acetilcisteína, artemisa, bromelaína, papaína, clerodendro, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y varias DNasas que incluyen rhDNasa.

En algunos casos, la LNP que penetra el moco puede ser una formulación hipotónica que comprende un recubrimiento que aumenta la penetración de mucosas. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio al cual se está suministrado. Los ejemplos no limitantes de formulaciones hipotónicas se pueden encontrar en, por ejemplo, la Publicación Internacional N° WO2013110028.

En algunos casos, el polinucleótido descrito en el presente documento se formula como un lipoplexo, tal como, sin limitación, el sistema ATUPLEXTM, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de siRNA-lipoplexo de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECTTM de STEMGENT® (Cambridge, MA), y polietilenimina (PEI) o suministro dirigido basado en protamina y no dirigido de ácidos nucleicos (Aleku et al., Cáncer Res. 200868:9788-9798; Strumberg et al., Int J Clin Pharmacol Ther 201250:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther.

201023:334-344; Kaufmann et al., Microvasc Res 201080:286-293 Weide et al., J Immunother. 200932:498-507; Weide et al., JImmunother. 200831:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther.4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 20076; 104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se formulan como una nanopartícula de lípido sólida (SLN), la cual puede ser esférica con un diámetro promedio entre 10 a 1000 nm. La SLN posee una matriz de núcleo de lípido sólida que puede solubilizar moléculas lipofílicas y se puede estabilizar con tensioactivos y/o emulsionantes. Las SLN de ejemplo pueden ser aquellas como se describen en la Publicación Internacional N° WO2013105101.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular para liberación controlada y/o suministro dirigido. Como se utiliza en el presente documento, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de composición farmacéutica o de compuesto que sigue un patrón particular de liberación para producir un resultado terapéutico. En un caso, los polinucleótidos se pueden encapsular en un agente de suministro descrito en el presente documento y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o suministro dirigido. Como se utiliza en el presente documento, el término “encapsulado” significa encerrado, rodeado o insertado. En relación con la formulación de los compuestos de la descripción, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. La expresión “sustancialmente encapsulado” significa que al menos más de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.9 o más de 99.999% de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede estar encerrado, rodeado o insertado dentro del agente de suministro. “Parcialmente encapsulado” significa que menos de 10, 10, 20, 30, 40 50 o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede estar encerrado, rodeado o insertado dentro del agente de suministro.

Ventajosamente, la encapsulación se puede determinar al medir el escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción utilizando fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 o más de 99.99% de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción está encapsulado en el agente de suministro.

En algunos casos, la formulación de liberación controlada del polinucleótido puede incluir al menos un recubrimiento de liberación controlada (p. ej., OPADRY®, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa tales como dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®)). En algunos casos, la formulación de liberación controlada del polinucleótido puede comprender un sistema de polímero como se describe en la Publicación de EE. UU. N° US20130130348, o un p Eg y/o derivado de polímero relacionado con PEG como se describe en la Patente de EE. UU. N° 8,404,222.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden encapsular en una nanopartícula terapéutica, denominados en el presente documento como “polinucleótidos de nanopartículas terapéuticas”. Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular por métodos descritos en, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N° WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, y WO2012054923; y Publicaciones de EE. UU. N° US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20120140790, US20130123351 y US20130230567; y Patentes de EE. UU. N° 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 y 8,318,211.

En algunos casos, el polinucleótido de nanopartícula terapéutica se puede formular para liberación sostenida. Como se utiliza en el presente documento, “ liberación sostenida” se refiere a una composición farmacéutica o compuesto que sigue una velocidad de liberación durante un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, pero no está limitado a, horas, días, semanas, meses y años. Como un ejemplo no limitante, la nanopartícula de liberación sostenida de los polinucleótidos descritos en el presente documento se puede formular como se describe en la Publicación Internacional N° WO2010075072 y Publicaciones de EE. Uu . N° US20100216804, US20110217377, US20120201859 y US20130150295.

En algunos casos, el polinucleótido de nanopartícula terapéutica se puede formular para ser específico del objetivo, tales como los descritos en las Publicaciones Internacionales N°. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y WO2011084518; y Publicaciones de EE. UU. N° US20100069426, US20120004293y US20100104655.

Las LNP se pueden preparar utilizando mezcladores o micromezcladores microfluídicos. Los mezcladores microfluídicos de ejemplo pueden incluir, pero no están limitados a, un micromezclador interdigital de hendidura que incluye, pero no se limita a los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador de espiga escalonado (SHM) (véase Zhigaltsevet al., “Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing”, Langmuir 28:3633-40 (2012); Belliveau et al., “Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticle for in vivo delivery of siRNA”, Molecular Therapy-Nucleic Acids. 1 :e37 (2012); Chen et al., “Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticle enabled by controlled microfluidic formulation”, J. Am. Chem. Soc. 134(16):6948-51 (2012)). Los micromezcladores de ejemplo incluyen Mezclador Microestructurado Interdigital de hendidura (SIMM-V2) o un Micromezclador Interdigital de hendidura estándar (SSEVIM) o Caterpillar (CPMM) o chorro de impacto (IJMM,) del Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania. En algunos casos, los métodos para hacer LNP utilizando SHM además comprenden mezclar al menos dos corrientes de entrada en donde el mezclado ocurre por advección caótica inducida por microestructura (MICA). De acuerdo con este método, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espiga causando flujo rotacional y doblando los fluidos uno alrededor del otro. Este método también puede comprender una superficie para el mezclado de fluidos en donde la superficie cambia las orientaciones durante el ciclo de fluido. Los métodos para generar las LNP utilizando SHM incluyen aquellos descritos en las Publicaciones de EE. UU. N° US20040262223y US20120276209.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en nanopartículas de lípido utilizando tecnología microfluídica (véase Whitesides, George M., “The Origins and the Future of Microfluidics”, Nature 442:368-373 (2006); y Abraham et al., “Chaotic Mixer for Microchannels”, Science 295:647-651 (2002)). En algunos casos, los polinucleótidos se pueden formular en nanopartículas de lípido utilizando un chip micromezclador tal como, pero no limitado a, los de Harvard Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, Reino Unido). Un chip micromezclador se puede utilizar para el mezclado rápido de dos o más corrientes de fluidos con un mecanismo de división y recombinación.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en nanopartículas de lípidos que tienen un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm tal como, pero no limitado a, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente de 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.

En algunos casos, las nanopartículas de lípidos pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En un caso, la nanopartícula de lípidos puede tener un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.

En algunos casos, los polinucleótidos se pueden suministrar utilizando LNP más pequeñas. Tales partículas pueden comprender un diámetro desde inferior a 0.1 pm hasta 100 nm tal como, pero no limitado a, menos de 0.1 pm, menos de 1.0 pm, menos de pm, menos de 10 pm, menos de 15 um, menos de 20 um, menos de 25 um, menos de 30 um, menos de 35 um, menos de 40 um, menos de 50 um, menos de 55 um, menos de 60 um, menos de 65 um, menos de 70 um, menos de 75 um, menos de 80 um, menos de 85 um, menos de 90 um, menos de 95 um, menos de 100 um, menos de 125 um, menos de 150 um, menos de 175 um, menos de 200 um, menos de 225 um, menos de 250 um, menos de 275 um, menos de 300 um, menos de 325 um, menos de 350 um, menos de 375 um, menos de 400 um, menos de 425 um, menos de 450 um, menos de 475 um, menos de 500 um, menos de 525 um, menos de 550 um, menos de 575 um, menos de 600 um, menos de 625 um, menos de 650 um, menos de 675 um, menos de 700 um, menos de 725 um, menos de 750 um, menos de 775 um, menos de 800 um, menos de 825 um, menos de 850 um, menos de 875 um, menos de 900 um, menos de 925 um, menos de 950 um o menos de 975 um.

Las nanopartículas y micropartículas descritas en el presente documento se pueden diseñar geométricamente para modular macrófagos y/o la respuesta inmunitaria. Las partículas geométricamente diseñadas pueden tener formas, tamaños y/o cargas de superficie variadas para incorporar los polinucleótidos descritos en el presente documento para suministro dirigido tal como, pero no limitado a, suministro pulmonar (véase, p. ej., Publicación Internacional N° WO2013082111). Otras características físicas de las partículas geométricamente diseñadas pueden incluir, pero no están limitados a, fenestraciones, brazos angulados, asimetría y rugosidad de la superficie, carga que puede alterar las interacciones con células y tejidos.

En algún caso, las nanopartículas descritas en el presente documento son nanopartículas sigilosas o nanopartículas sigilosas específicas de objetivo tales como, pero no limitado a, las descritas en la Publicación de EE. UU. N° US20130172406. Las nanopartículas sigilosas o sigilosas específicas de objetivo pueden comprender una matriz polimérica, que puede comprender dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, poliésteres, polianhídridos, poliéteres, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos, policianoacrilatos o combinaciones de los mismos.

b. Lipidoides

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden un agente de suministro, p. ej., un lipidoide. Los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se pueden formular con lipidoides. Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contienen estos lipidoides y por lo tanto para lograr un suministro efectivo del polinucleótido, considerado por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación de lipidoide por vías de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos de lipidoides de polinucleótidos se pueden administrar por varios medios que incluyen, pero no limitados a, vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.

La síntesis de lipidoides se describe en la bibliografía (véase Mahon et al., Bioconjug. Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001).

Las formulaciones con los diferentes lipidoides, que incluyen, pero no limitados a hidrocloruro de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluyendo derivados y variantes) y MD1, se pueden ensayar para determinar la actividad in vivo. El lipidoide “98N12-5” se describe por Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879. El lipidoide “C12-200” se describe por Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869 y Liu y Huang, Molecular Therapy. 2010669-670.

En un caso, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un lipidoide de aminoalcohol. Los lipidoides de aminoalcohol se pueden preparar por los métodos descritos en la Patente de EE. UU. N° 8,450,298.

Las formulaciones de lipidoides pueden incluir partículas que comprenden ya sea 3 o 4 o más componentes además de los polinucleótidos. Los lipidoides y las formulaciones polinucleótidos que comprenden lipidoides se describen en la Publicación Internacional N° WO 2015051214.

c. Hialuronidasa

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A, y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) y hialuronidasa para inyección (p. ej., inyección intramuscular o subcutánea). La hialuronidasa cataliza la hidrolisis de hialuronano, que es un constituyente de la barrera intersticial. La hialuronidasa disminuye la viscosidad de hialuronano, para de esta manera incrementar la permeabilidad del tejido (Frost, Expelí Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Alternativamente, la hialuronidasa se puede utilizar para incrementar el número de células expuestas a los polinucleótidos administrados por vía intramuscular, intratumoral o subcutánea.

d. Miméticos de nanopartículas

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se encapsulan dentro y/o son absorbidos en un mimético de nanopartícula. Un mimético de nanopartícula puede imitar la función de suministro de organismos o partículas tales como, pero no limitado a, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como un ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden encapsular en una partícula que no es virión que puede imitar la función de suministro de un virus (véase p. ej., Publicación Internacional N° WO2012006376 y Publicaciones de EE. UU. N° US20130171241 y US20130195968.

e. Nanotubos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) fijados o de otra manera unidos a (p. ej., a través de fuerzas estéricas, iónicas, covalentes y/u otras fuerzas) a al menos un nanotubo, tal como, pero no limitado a, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases dobles con un enlazador, nanotubos de carbono y/o nanotubos de carbono de pared sencilla. Los nanotubos y formulaciones de nanotubos que comprenden un polinucleótido se describen, p. ej., en la Publicación Internacional N° WO2014152211.

f. Nanopartículas autoensambladas o macromoléculas autoensambladas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en nanopartículas autoensambladas, o macromoléculas anfifílicas (AM) para suministro. Las AM comprenden polímeros anfifílicos biocompatibles que tienen una cadena principal de azúcar alquilado covalentemente unida a poli(etilenglicol). En solución acuosa, las AM se autoensamblan para formar micelas. Las nanopartículas autoensambladas de ácido nucleico se describen en la Solicitud Internacional N° PCT/US20l4/027077, y las AM y métodos para formar AM se describen en la Publicación de EE. UU. N° US20130217753.

g. Nanopartículas inorgánicas, nanopartículas semiconductoras y metálicas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en nanopartículas inorgánicas, o nanopartículas dispersables en agua que comprenden un material semiconductor o metálico. Las nanopartículas inorgánicas pueden incluir, pero no están limitadas a, sustancias de arcilla que son hinchables en agua. Las nanopartículas dispersables en agua pueden ser nanopartículas hidrofóbicas o hidrofílicas. Como un ejemplo no limitante, las nanopartículas inorgánicas, semiconductoras y metálicas se describen en, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 5,585,108 y 8,257,745; y Publicaciones de EE. UU. N° US20120228565, US20120265001 y US20120283503.

h. Selladores quirúrgicos: geles e hidrogeles

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en un sellador quirúrgico. Los selladores quirúrgicos tales como geles e hidrogeles se describen en la Solicitud Internacional N° PCT/US2014/027077.

i. Formulaciones en suspensión

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en suspensiones. En algunos casos, las suspensiones comprenden un polinucleótido, depósitos de aceite inmiscibles en agua, tensioactivos y/o cotensioactivos y/o codisolventes. Las suspensiones se pueden formar preparando primero una solución acuosa de un polinucleótido y una fase de base de aceite que comprende uno o más tensioactivos y luego mezclando las dos fases (acuosa y de base de aceite).

Los aceites de ejemplo para formulaciones en suspensión pueden incluir, pero no están limitados a, aceite de sésamo y Miglyol (que comprende ésteres de ácidos grasos caprílicos y cápricos derivados de aceite de coco y palmiste saturados y glicerina o propilenglicol), aceite de maíz, aceite de soja, aceite de cacahuate, cera de abejas y/o aceite de semilla de palma. Los tensioactivos de ejemplo pueden incluir, pero no están limitados a Cremophor, polisorbato 20, polisorbato 80, polietilenglicol, transcutol, Capmul®, labrasol, miristato de isopropilo y/o Span 80. En algunos casos, las suspensiones pueden comprender codisolventes que incluyen, pero no limitados a etanol, glicerol y/o propilenglicol.

En algunos casos, las suspensiones pueden proporcionar modulación de la liberación de los polinucleótidos en el ambiente circundante por difusión de un depósito inmiscible en agua seguido por resolubilización en un ambiente circundante (p. ej., un ambiente acuoso).

En algunos casos, los polinucleótidos se pueden formular de modo que tras inyección, se forma una emulsión espontáneamente (p. ej., cuando se suministra a una fase acuosa), la cual puede proporcionar una relación alta de área superficial a volumen para la liberación de polinucleótidos de una fase de aceite a una fase acuosa. En algunos casos, el polinucleótido se formula en una nanoemulsión, la cual puede comprender un núcleo hidrofóbico líquido rodeado por o recubierto con una capa de lípido o tensioactivo. Las nanoemulsiones de ejemplo y sus preparaciones se describen en, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 8,496,945.

j. Cationes y aniones

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) y un catión o anión, tales como Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+ y combinaciones de los mismos. Las formulaciones de ejemplo pueden incluir polímeros y un polinucleótido en complejo con un catión de metal como se describe en, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 6,265,389 y 6,555,525. En algunos casos, las nanopartículas catiónicas pueden contener una combinación de cationes divalentes y monovalentes. El suministro de polinucleótidos en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprenden nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad del polinucleótido al actuar como un depósito de acción prolongada y/o reducir la velocidad de degradación por nucleasas.

k. Nanopartículas y micropartículas moldeadas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en nanopartículas moldeadas en varios tamaños, formas y química. Por ejemplo, las nanopartículas y/o micropartículas se pueden hacer utilizando la tecnología PRINT® de LIQUIDA TECHNOLOGIES® (Morrisville, NC) (p. ej., Publicación Internacional. N° WO2007024323.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) se formula en micropartículas. Las micropartículas pueden contener un núcleo del polinucleótido y una corteza de un polímero biocompatible y/o biodegradable, que incluye pero no limitado a, poli(a-hidroxiácido), un poli(ácido hidroxibutírico), una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido. La micropartícula puede tener superficies adsorbentes para adsorber polinucleótidos. Las micropartículas pueden tener un diámetro de al menos 1 micrómetro a al menos 100 micrómetros (p. ej., al menos 1 micrómetro, al menos 10 micrómetros, al menos 20 micrómetros, al menos 30 micrómetros, al menos 50 micrómetros, al menos 75 micrómetros, al menos 95 micrómetros y al menos 100 micrómetros). En algún caso, las composiciones o formulaciones de la presente descripción son microemulsiones que comprenden micropartículas y polinucleótidos. Las micropartículas, microemulsiones de ejemplo y sus preparaciones se describen en, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 8,460,709, 8,309,139 y 8,206,749; Publicaciones de EE. UU. N° US20130129830, US2013195923 y US20130195898; y Publicación Internacional N° WO2013075068.

l. NanoJackets y Nanoliposomas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en NanoJackets y nanoliposomas de Keystone Nano (State College, PA). Los NanoJackets se hacen de materiales que se encuentran de forma natural en el cuerpo incluyendo calcio, fosfato y también pueden incluir una cantidad pequeña de silicatos. Los NanoJackets pueden tener un tamaño que varía de 5 a 50 nm.

Los nanoliposomas se hacen de lípidos tales como, pero no limitados a, lípidos que se encuentran de forma natural en el cuerpo. Los nanoliposomas pueden tener un tamaño que varía de 60-80 nm. En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se formulan en un nanoliposoma tal como, pero no limitado a, nanoliposomas de ceramida.

m. Células o minicélulas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) que se transfectan ex vivo en células, que con posterioridad se trasplantan a un sujeto. Las formulaciones basadas en células del polinucleótido descrito en el presente documento se pueden utilizar para asegurar la transfección celular (p. ej., en el vehículo celular), alterar la biodistribución del polinucleótido (p. ej., al dirigir el vehículo celular a los tejidos específicos o tipos de células) y/o incrementar la traducción de la proteína codificada.

Las células de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, glóbulos rojos, virosomas y células electroporadas (véase, por ejemplo, Godfrin et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang et al., Expert Opin Biol Ther.

2012 12:385-389; Hu et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:10980-10985; Lund et al., Pharm Res. 2010 27:400-420; Huckriede et al., J Liposome Res. 2007; 17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 20062:1-7; de Jonge et al., Gene Ther. 2006 13 :400-411).

Una variedad de métodos son conocidos en la técnica y son adecuados para la introducción del ácido nucleico en una célula, que incluyen técnicas mediadas virales y no virales. Ejemplos de técnicas mediadas no virales típicas incluyen, pero no están limitadas a, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque de calor, magnetofección, transferencia mediada por liposoma, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímero catiónico (DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (p Eg ) y similares) o fusión celular.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden suministrar en partículas similares a virus sintéticas (VLP) sintetizadas por los métodos como se describe en las Publicaciones Internacionales N° WO2011085231 y WO2013116656; y Publicación de EE. UU. N° 20110171248.

La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (p. ej., frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana de plasma celular. Los métodos de sonoporación se conocen para suministrar ácidos nucleicos in vivo (Yoon y Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema y Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 20078:355-361; Newman y Bettinger, Gene Ther. 2007 14:465-475; Publicaciones de EE. UU. N° US20100196983 y US20100009424.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden suministrar por electroporación. La técnica de electroporación se conoce para suministrar ácidos nucleicos in vivo y clínicamente (Andre et al., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella et al., Curr Gene Ther. 2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128-138). Los dispositivos de electroporación los venden por muchas compañías en todo el mundo incluyendo, pero no limitado a BTX® Instruments (Holliston, MA) (p. ej., el Sistema In vivo AgilePulse) e Inovio (Blue Bell, PA) (p. ej., dispositivo de suministro intramuscular Inovio SP-5P o el dispositivo de suministro intradérmico CELLECTR^a® 3000).

En algunos casos, las células se seleccionan del grupo que consiste en células de mamífero, células bacterianas, células de plantas, microbianas, algas y fúngicas. En algunos casos, las células son células de mamífero, tales como, pero no limitado a, células humanas, de ratón, rata, cabra, caballo, conejo, hámster o vaca. En un caso adicional, las células pueden ser de una línea celular establecida, que incluye, pero no limitado a, HeLa, NS0, SP2/0, KEK 293T, Vero, Caco, Caco-2, MDCK, COS-1, COS-7, K562, Jurkat, CHO-K1, DG44, CHOK1SV, CHO-S, Huvec, CV-1, Huh-7, NIH3T3, HEK293, 293, A549, HepG2, IMR-90, MCF-7, U-20S, Per.C6, SF9, SF21 o células de Ovario de hámster chino (CHO).

En ciertos casos, las células son células fúngicas, tales como, pero no limitadas a, células de Chrysosporium, células de Aspergillus, células de Trichoderma, células de Dictyostelium, células de Candida, células de Saccharomyces, células de Schizosaccharomyces y células de Penicillium.

En ciertos casos, las células son células bacterianas tales como, pero no limitadas a, células de E. coli, B. subtilis o BL21. Las células primarias y secundarias que se van a transfectar por los métodos de la descripción se pueden obtener de una variedad de tejidos e incluyen, pero no están limitadas a, todos los tipos de células que se pueden mantener en cultivo. Las células primarias y secundarias incluyen, pero no están limitadas a, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales (p. ej., células epiteliales de mamífero, células epiteliales intestinales), células endoteliales, células gliales, células neurales, elementos formados de la sangre (p. ej., linfocitos, células de la médula ósea), células del músculo y precursores de estos tipos de células somáticas. Las células primarias también se pueden obtener de un donante de la misma especie o de otras especies (p. ej., ratón, rata, conejo, gato, perro, cerdo, vaca, ave, oveja, cabra, caballo).

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento en minicélulas bacterianas. Como un ejemplo no limitante, las minicélulas bacterianas pueden ser las descritas en la Publicación Internacional N° WO2013088250 o Publicación de EE. UU. N° US20130177499.

n. Composiciones semisólidas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en una matriz hidrofóbica para formar una composición semisólida o tipo pasta. Como un ejemplo no limitante, la composición semisólida o tipo pasta se puede hacer por los métodos descritos en la Publicación Internacional N° WO201307604.

o. Exosomas

En algunos casos, las composiciones y formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en exosomas, que se pueden cargar con al menos un polinucleótido y suministrar a células, tejidos y/u organismos. Como un ejemplo no limitante, los polinucleótidos se pueden cargar en las exosomas como se describe en la Publicación Internacional N° W02013084000.

p. Suministro basado en seda

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) que se formula para suministro basado en seda. El sistema de suministro basado en seda se puede formar poniendo en contacto una solución de fibroína de seda con un polinucleótido descrito en el presente documento. Como un ejemplo no limitante, un sistema de suministro basado en seda de liberación sostenida y métodos para elaborar tal sistema se describen en la Publicación de EE. UU. N° US20130177611.

q. Aminoácido-lípidos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) que se formula con un aminoácido-lípido. Los aminoácido-lípidos son compuestos lipofílicos que comprenden un resto de aminoácido y una o más colas lipofílicas. Ejemplos no limitantes de aminoácido-lípidos y métodos para elaborar aminoácido-lípidos se describen en la Patente de EE. UU. N° 8,501,824. Las formulaciones de aminoácido-lípidos pueden suministrar un polinucleótido en forma liberable que comprende un aminoácido-lípido que se une y libera los polinucleótidos. Como un ejemplo no limitante, la liberación de los polinucleótidos descritos en el presente documento se puede proporcionar por un enlazador lábil frente a ácidos como se describe en, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 7,098,032, 6,897,196, 6,426,086, 7,138,382, 5,563,250 y 5,505,931.

r. Microvesículas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en una formulación de microvesícula. Las microvesículas de ejemplo incluyen las descritas en la Publicación de EE. UU. N° US20130209544. En algunos casos, la microvesícula es un microvesícula mediada por ARRDC1 (ARMM) como se describe en la Publicación Internacional N° WO2013119602.

s. Complejos interpolielectrolitos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en un complejo interpolielectrolito. Los complejos interpolielectrolitos se forman cuando los polímeros de carga dinámica forman complejos con una o más moléculas aniónicas. Ejemplos no limitantes de polímeros de carga dinámica y complejos interpolielectrolitos y métodos para preparar complejos interpolielectrolitos se describen en la Patente de EE. UU. N° 8,524,368.

t. Sistemas poliméricos cristalinos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en sistemas poliméricos cristalinos. Los sistemas poliméricos cristalinos son polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos. Los polímeros de ejemplo se describen en la Patente de EE. UU. N° 8,524,259.

u. Polímeros, nanopartículas biodegradables y nanopartículas de cubierta de núcleo

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) y un polímero natural y/o sintético. Los polímeros incluyen, pero no se limitan a, polietenos, polietilenglicol (PEG), poli(l-lisina) (PLL), PEG injertado a PLL, lipopolímero catiónico, lipopolímero catiónico biodegradable, polietilenimina (PEI), poli(alquileniminas) ramificadas reticuladas, un derivado de poliamina, un poloxámero modificado, polímero biodegradable elástico, copolímero biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímeros de multibloque, poli[ácido a-(a-aminobutil)-L-glicólico) (PAGA), copolímeros de multibloque catiónicos reticulados biodegradables, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfazenos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), polímeros que contienen amina, polímeros de dextrano, derivados de polímeros de dextrano o combinaciones de los mismos.

Los polímeros de ejemplo incluyen, DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA) formulaciones de MIRUS® Bio (Madison, WI) y Roche Madison (Madison, WI), formulaciones de polímero PHASERXTM tales como, sin limitación, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (PHASERX®, Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxámero, adyuvante VAXFECTIN® de Vical (San Diego, CA), quitosán, ciclodextrina de Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros y polímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Polímeros RONDELTM (Suministro de Nanopartícula de RNAi/Oligonucleótido) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) y polímeros de co-bloques sensibles al pH tales como PHASERX® (Seattle, WA).

Las formulaciones de polímero permiten una liberación sostenida o retardada del polinucleótido (p. ej., después de la inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado para el polinucleótido puede dar como resultado, por ejemplo, la traducción de una proteína codificada durante un período prolongado de tiempo. La formulación de polímero también se puede utilizar para incrementar la estabilidad del polinucleótido. Las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir, pero no están limitadas a, microesferas de PLGA, etileno-acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, Ga ), TISSELL® (Baxter International, Inc. Deerfield, IL), selladores basados en PEG y c Os EAL® (Baxter International, Inc. Deerfield, IL).

Como un ejemplo no limitante, el mRNA modificado se puede formular en microesferas de PLGA preparando las microesferas de PLGA con velocidades de liberación ajustables (p. ej., días y semanas) y encapsulando el mRNA modificado en las microesferas de PLGA a la vez que se mantiene la integridad del mRNA modificado durante el procedimiento de encapsulación. EVAc son polímeros biocompatibles no biodegradables, que se utilizan ampliamente en aplicaciones de implante de liberación sostenida preclínicas (p. ej., productos de liberación prolongada Ocusert a un inserto oftálmico de pilocarpina para glaucoma o Progestasert un dispositivo intrauterino de progesterona de liberación sostenida; sistemas de suministro transdérmico Testoderm, Duragesic and Selegiline; catéteres). El poloxámero F-407 NF es un copolímero de tribloques de tensioactivo no iónico, hidrofílico de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno que tienen una baja viscosidad a temperaturas de menos de 5°C y forma un gel sólido a temperaturas mayores de 15°C.

Como un ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular con el compuesto polimérico de PEG injertado con PLL como se describe en la Patente de EE. UU. N° 6, 177,274. Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular con un copolímero de bloques tal como un copolímero de bloques de PLGA-PEG (véase p. ej., Publicación de EE. UU. N° US20120004293 y Patentes de EE. UU. N° 8,236,330 y 8,246,968) o un copolímero de bloques de PLGA-PEG-PLGA (véase p. ej., Patente de EE. UU. N° 6,004,573).

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular con al menos un polímero que contiene amina tal como, pero no limitado una polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli(amidoamina), poli(amina-co-ésteres) o combinaciones de los mismos. Los polímeros de poliamina de ejemplo y su uso como agentes de suministro se describen en, p. ej., Patentes de EE. UU. N° 8,460,696, 8,236,280.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en un lipopolímero catiónico biodegradable, un polímero biodegradable o un copolímero biodegradable, un copolímero de poliéster biodegradable, un polímero de poliéster biodegradable, un copolímero biodegradable lineal, PAGA, un copolímero de multibloques catiónico reticulado biodegradable o combinaciones de los mismos como se describe en, p. ej., Patentes de EE. UU. N° 6,696,038, 6,517,869, 6,267,987, 6,217,912, 6,652,886, 8,057,821 y 8,444,992; Publicaciones de EE. UU. N° US20030073619, US20040142474, US20100004315, US2012009145 y US20130195920; y Publicaciones Internacionales N° WO2006063249 y WO2013086322.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en o con al menos un polímero de ciclodextrina como se describe en la Publicación de EE. UU. N° US20130184453. En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en o con al menos un polímero de unión a catión reticulado como se describe en las Publicaciones Internacionales N° WO2013106072, WO2013106073 y WO2013106086. En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular en o con al menos polímero de albúmina PEGilado como se describe en Publicación de EE. UU. N° US20130231287.

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden formular como una nanopartícula utilizando una combinación de polímeros, lípidos, y/u otros agentes biodegradables, tales como, pero no limitados a, fosfato de calcio. Los componentes se pueden combinar en una arquitectura de cubierta de núcleo, híbrida y/o capa por capa, para permitir el ajuste preciso de la nanopartícula para suministro (Wang et al., Nat Mater. 20065:791-796; Fuller et al., Biomaterials. 200829:1526-1532; DeKoker et al., AdvDrug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su et al., Mol Pharm. 6 de junio de 2011; 8(3):774-87). Como un ejemplo no limitante, la nanopartícula puede comprender una pluralidad de polímeros tales como, pero no limitados a polímeros hidrofílicos-hidrofóbicos (p. ej., PEG-PLGA), polímeros hidrofóbicos (p. ej., Pe G) y/o polímeros hidrofílicos (Publicación Internacional N° WO20120225129).

El uso de nanopartículas de cubierta de núcleo se ha enfocado adicionalmente en un procedimiento de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel reticulados catiónicos y varias cubiertas (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A . 2011 108:12996-13001). La complejación, suministro e internalización de las nanopartículas poliméricas se pueden controlar precisamente al alterar la composición química tanto en los componentes del núcleo como de la cubierta de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de cubierta de núcleo pueden suministrar eficientemente siRNA a hepatocitos de ratón después de unir covalentemente el colesterol a la nanopartícula.

En algunos casos, un núcleo de lípido hueco que comprende una capa de PLGA media y una capa de lípido neutra exterior que contiene PEG se puede utilizar para suministro de los polinucleótidos como se describe en el presente documento. En algunos casos, las nanopartículas de lípido pueden comprender un núcleo de los polinucleótidos descritos en el presente documento y una cubierta de polímero, la cual se utiliza para proteger los polinucleótidos en el núcleo. La cubierta de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en el presente documento y que se conocen en la técnica, la cubierta de polímero se puede utilizar para proteger los polinucleótidos en el núcleo.

Las nanopartículas de cubierta de núcleo para el uso con los polinucleótidos descritos en el presente documento se describen en la Patente de EE. UU. N° 8,313,777 o Publicación Internacional N° WO2013124867.

v. Péptidos y Proteínas

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) que se formula con péptidos y/o proteínas para incrementar la transfección de células por el polinucleótido, y/o para alterar la biodistribución del polinucleótido (p. ej., dirigiendo a tejidos específicos o tipos de células), y/o incrementar la traducción de la proteína codificada (p. ej., Publicaciones Internacionales N° WO2012110636 y WO2013123298. En algunos casos, los péptidos pueden ser los descritos en las Publicaciones de EE. UU. N° US20130129726, US20130137644 y US20130164219.

w. Conjugados

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) que se unen covalentemente a un vehículo o grupo dirigido, o que incluyen dos regiones de codificación que conjuntamente producen una proteína de fusión (p. ej., que llevan un grupo dirigido y proteína o péptido terapéutico) como un conjugado. El conjugado puede ser un péptido que dirige selectivamente la nanopartícula a las neuronas en un tejido u organismo, o ayuda a cruzar la barrera hematoencefálica.

Los conjugados incluyen una sustancia que se encuentra naturalmente, tal como una proteína (p. ej., albúmina de suero humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un carbohidrato (p. ej., un dextrano, pululano, quitina, quitosán, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, p. ej., un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (p. ej., un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero estirenoanhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicólido), copolímero éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplo de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptidopoliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa helicoidal.

En algunos casos, el conjugado puede funcionar como un vehículo para el polinucleótido descrito en el presente documento. El conjugado puede comprender un polímero catiónico tal como, pero no limitado a, poliamina, polilisina, polialquilenimina y polietilenimina que se puede injertar con poli(etilenglicol). Los conjugados de ejemplo y sus preparaciones se describen en la Patente de EE. UU. N° 6,586,524 y Publicación de EE. UU. N° US20130211249.

Los conjugados también pueden incluir grupos dirigidos, p. ej., un agente dirigido a la célula o tejido, p. ej., una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificada tal como una célula de riñón. Un grupo dirigido puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A de tensioactivo, carbohidrato de Mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, manosa multivalente de N-acetil-glucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético de péptido RGD o un aptámero.

Los grupos dirigidos pueden ser proteínas, p. ej., glicoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificada tal como célula de cáncer, célula endotelial o célula de hueso. Los grupos dirigidos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, manosa multivalente de N-acetil-glucosamina, fructuosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido o un activador de MAP cinasa p38.

El grupo dirigido puede ser cualquier ligando que es capaz de dirigirse a un receptor específico. Los ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, aptámeros, ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimiocina, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos LDL y HDL. En casos particulares, el grupo dirigido es un aptámero. El aptámero puede ser no modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descritas en el presente documento. Como un ejemplo no limitante, el grupo dirigido puede ser un conjugado de unión al receptor de glutatión (GR) para el suministro dirigido a través de la barrera del sistema nervioso central-sangre como se describe en, p. ej., la Publicación de EE. UU. N° US2013021661012.

En algunos casos, el conjugado puede ser un conjugado de biomolécula sinérgica-polímero, que comprende un sistema de liberación continua de larga duración para proporcionar una mayor eficacia terapéutica. Los conjugados de biomolécula sinérgica-polímero pueden ser aquellos descritos en la Publicación de EE. UU. N° US20130195799. En algunos casos, el conjugado puede ser un conjugado de aptámero como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2012040524. En algunos casos, el conjugado puede ser un conjugado de polímero que contiene amina como se describe en la Patente de EE. UU. N° 8,507,653. En algunos casos, los polinucleótidos se pueden conjugar con SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PHASERX®, Inc. Seattle, WA).

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se conjugan covalentemente con un polipéptido que penetra la célula, que también puede incluir una secuencia señal o una secuencia dirigida. Los conjugados se pueden diseñar para tener estabilidad incrementada y/o transfección celular incrementada; y/o la biodistribución alterada (p. ej., dirigida a tejidos o tipos de célula específicos).

En algunos casos, los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden conjugar con un agente para aumentar el suministro. En algunos casos, el agente puede ser un monómero o polímero tal como un monómero dirigido o un polímero que tiene bloques dirigidos como se describe en la Publicación Internacional N° WO2011062965. En algunos casos, el agente puede ser un agente de transporte covalentemente acoplado a un polinucleótido como se describe en, p. ej., Patentes de EE. UU. N° 6,835,393 y 7,374,778. En algunos casos, el agente puede ser un agente que aumenta el transporte de barrera de membrana tales como aquellos descritos en las Patentes de EE. UU. N° 7,737,108 y 8,003,129.

x. Micro-órganos

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en un micro-órgano que luego puede expresar un polipéptido codificado de interés en una formulación terapéutica de larga duración. Los micro-órganos de ejemplo y formulaciones se describen en la Solicitud Internacional N° WO2014152211.

y. Pseudoviriones

En algunos casos, las composiciones o formulaciones de la presente descripción comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento (p. e., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A) en pseudoviriones (p. ej., pseudoviriones desarrollados por Aura Biosciences, Cambridge, MA).

En algunos casos, el pseudovirión utilizado para suministrar los polinucleótidos se puede obtener de virus tales como, pero no limitados a, herpes y papilomavirus como se describe en, p. ej., las Publicaciones de EE. UU. N° US20130012450, US20130012566, US21030012426 y US20120207840; y Publicación Internacional N° WO2013009717.

El pseudovirión puede ser una partícula similar a virus (VLP) preparada por los métodos descritos en las Publicaciones de EE. UU. N° US20120015899 y US20130177587, y Publicaciones Internacionales N° WO2010047839, WO2013116656, WO2013106525 y WO2013122262. En un aspecto, las VLP pueden ser bacteriófagos MS, Qp, R17, fr, GA, Sp, MI, I, MXI, NL95, AP205, f2, PP7, y virus de planta, virus del arrugamiento del nabo (TCV), virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV), virus del mosaico sureño de la judía (SBMV) y miembros del género Bromovirus que incluyen virus del moteado del haba, virus del mosaico del bromo, virus de mancha amarilla de Casia, virus del moteado clorótico del guisante pinto (CCMV), virus del moteado amarillo de Melandrio y virus latente de belleza primaveral. En otro aspecto, la VLP puede derivar del virus de influenza como se describe en la Publicación de EE. UU. N° US20130177587 y Patente de EE. UU. N° 8,506,967. En un aspecto, la VLP puede comprender una molécula B7-1 y/o B7-2 anclada a una membrana lipídica o el exterior de la partícula tal como se describe en la Publicación Internacional N° WO2013116656. En un aspecto, la VLP puede derivar de norovirus, proteína VP6 recombinante de rotavirus o VP2/VP6 de capa doble tal como la VLP como se describe en la Publicación Internacional N° WO2012049366.

En algunos casos, el pseudovirión puede ser una partícula similar a virus de papiloma humano como se describe en la Publicación Internacional N° WO2010120266 y Publicación de EE. UU. N° US20120171290. En algunos casos, la partícula similar a virus (VLP) puede ser una partícula autoensamblada. En un aspecto, los pseudoviriones pueden ser nanopartículas derivadas de viriones como se describe en las Publicaciones de EE. UU. N° US20130116408 y US20130115247; y Publicación Internacional N° WO2013119877.

Ejemplos no limitantes de formulaciones y métodos para formular los polinucleótidos descritos en el presente documento también se proporcionan en la Publicación Internacional N° WO2013090648.

26. Composiciones y formulaciones para su uso

Ciertos aspectos de la descripción se dirigen a composiciones o formulaciones que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en lo anterior.

En algunos casos, la composición o formulación comprende:

(i) un polinucleótido (p. ej., un RNA, por ejemplo, un mRNA) que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada de secuencia (p. ej., un ORF) que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A (p. ej., la secuencia tipo natural, fragmento funcional o variante del mismo), en donde el polinucleótido comprende al menos una nucleobase químicamente modificada, p. ej., 5-metoxiuracilo (p. ej., en donde al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99% o 100% de los uracilos son 5-metoxiuracilos), y en donde el polinucleótido además comprende un sitio que se une al miRNA, p. ej., un sitio que se une al miRNA que se une al miR-122 (p. ej., un sitio de unión a miR-122-3p o miR-122-5p); y

(ii) un agente de suministro que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (I), p. ej., cualquiera de los Compuestos 1-147 (p. ej., Compuesto 18, 25, 26 o 48) o cualquiera de los Compuestos 1-232.

En algunos casos, el contenido de uracilo o timina del ORF con respecto al contenido de uracilo y timina mínimo teórico de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de IL12B, el polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A (% U^tmo % T^tm), está entre aproximadamente 100% y aproximadamente 150%.

En algunos casos, los polinucleótidos, composiciones o formulaciones anteriores se utilizan para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con la IL12, p. ej., cáncer.

27. Formas de administración

Los polinucleótidos, composiciones y formulaciones farmacéuticas de la descripción descritos en lo anterior se pueden administrar por cualquier vía que produzca un resultado terapéuticamente efectivo. Estas incluyen, pero no están limitadas a la administración enteral (en el intestino), gastroenteral, epidural (en la materia dura), oral (por medio de la boca), transdérmica, peridural, intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica, (en la propia piel), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardiaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea, (a través del ojo), inyección intracavernosa (en una cavidad patológica) intracavitaria (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para la distribución sistémica), transmucosal (difusión a través de una membrana mucosa), transvaginal, insuflación (aspiración), sublingual, sublabial, enema, gotas para los ojos (sobre la conjuntiva), en gotas para oídos, auricular, (o en o por medio del oído), bucal (dirigida hacia la mejilla), conjuntival, cutánea, dental (a un diente o dientes), electro-ósmosis, endocervical, endosinusial, endotraqueal, extracorporal, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracartilaginosa (dentro de un cartílago), intracaudal (dentro de la cauda equina), intracisternal (dentro de la cisterna magna cerebelomedular), intracorneal (dentro de la córnea), intracornal dental, intracoronaria (dentro de las arterias coronarias), intracuerpo cavernoso (dentro de los espacios dilatables del cuerpo cavernoso del pene), intradiscal (dentro de un disco), intraductal (dentro de un conducto de una glándula), intraduodenal (dentro del duodeno), intradural (dentro o debajo de la dura madre), intraepidérmica (en la epidermis), intraesofágica (en el esófago), intragástrica (dentro del estómago), intragingival (dentro de las encías), intraileal (dentro de la parte distal del intestino delgado), intralesional (dentro o introducida directamente en una lesión localizada), intraluminal (dentro de un lumen de un tubo), intralinfática (dentro de la linfa), intramedular (dentro de la cavidad ósea de un hueso), intrameningea (dentro de las meninges), intraocular (dentro del ojo), intraovárica (dentro del ovario), intrapericárdica (dentro del pericardio), intrapleural (dentro de la pleura), intraprostática (dentro de la glándula de próstata) intrapulmonar (dentro de los pulmones o sus bronquios), intrasinal (dentro de los senos nasales o periorbitales), intraespinal (dentro de la columna vertebral), intrasinovial (dentro de la cavidad sinovial de una articulación), intratendinosa (dentro de un tendón), intratesticular (dentro del testículo), intratecal (dentro del líquido cefalorraquídeo en cualquier nivel del eje cefalorraquídeo), intratorácica (dentro del tórax), intratubular (dentro de los túbulos de un órgano), intratumoral (dentro de un tumor), intratimpánica (dentro del oído medio), intravascular (dentro de un vaso o vasos), intraventricular (dentro de un ventrículo), iontoforesis (por medio de corriente eléctrica donde iones de sales solubles migran en los tejidos del cuerpo), irrigación (en baño o lavado de heridas abiertas o cavidades corporales), laríngea (directamente en la laringe), nasogástrica (a través de la nariz y en el estómago), técnica de apósito oclusivo (administración por vía tópica que luego se cubre por un apósito que ocluye la zona), oftálmica (al ojo externo), orofaríngea (directamente a la boca y faringe), parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (dentro del tracto respiratorio al inhalar por vía oral o nasal para el efecto local o sistémico), retrobulbar (detrás del puente de Varolio o detrás del globo ocular), intramiocárdica (que entran al miocardio), tejido blando, subaracnoide, subconjuntival, submucosal, tópica, transplacental (en o a través de la placenta), transtraqueal (a través de la pared de la tráquea), transtimpánica (a través o en la cavidad timpánica), ureteral (en el uréter), uretral (en la uretra), vaginal, bloque caudal, de diagnóstico, bloque nervioso, perfusión biliar, perfusión cardíaca, fotoforesis o espinal. En casos específicos, las composiciones se pueden administrar de una manera que les permite cruzar la barrera hematoencefálica, barrera vascular u otra barrera epitelial. En algunos casos, una formulación para una ruta de administración puede incluir al menos un ingrediente inactivo.

Los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A o un fragmento funcional o variante del mismo) se pueden suministrar a una célula desnudos. Como se utiliza en el presente documento “desnudo” se refiere al suministro de polinucleótidos libres de agentes que promueven la transfección. Por ejemplo, los polinucleótidos suministrados a las células pueden no contener modificaciones. Los polinucleótidos desnudos se pueden suministrar a la célula utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en el presente documento.

Los polinucleótidos de la presente descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A o un fragmento funcional o variante del mismo) se pueden formular, utilizando los métodos descritos en el presente documento. Las formulaciones pueden contener polinucleótidos que pueden estar modificados y/o no modificados. Las formulaciones además pueden incluir, pero no están limitados a, agentes de penetración celular, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de suministro, un polímero bioerosionable o biocompatible, un disolvente y un depósito de suministro de liberación sostenida. Los polinucleótidos formulados se pueden suministrar a la célula utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en el presente documento.

Las composiciones también se pueden formular para el suministro directo a un órgano o tejido en cualquiera de varias maneras en la técnica que incluyen, pero no limitadas a, el empapamiento o baño directo, por vía de un catéter, por geles, polvo, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas, utilizando substratos tal como tela o materiales biodegradables recubiertos o impregnados con las composiciones, y similares.

La presente descripción abarca el suministro de polinucleótidos de la descripción (p. ej., un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A y/o polipéptidos de fusión de IL12B e IL12A o un fragmento funcional o variante del mismo) en formas adecuadas para administración parenteral e inyectable. Las formas farmacéuticas líquidas para administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, de cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes. En ciertos casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.

Una composición farmacéutica para administración parenteral puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Alguno o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para el uso en composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluye ácido clorhídrico, manitol, nitrógeno, acetato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer, USP y solución de cloruro de sodio isotónica. Los aceites fijos, estériles se emplean comúnmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier mezcla de aceite fijo incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tal como el ácido oleico se pueden utilizar en la preparación de soluciones inyectables. La formulación estéril también puede comprender adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes amortiguadores.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro retenedor de bacterias y/o incorporando agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.

Las formulaciones inyectables pueden ser para inyección directa en una región de un tejido, órgano y/o sujeto. Como un ejemplo no limitante, se puede inyectar directamente en un tejido, órgano y/o sujeto una formulación mediante la inyección intramiocárdica en la región isquémica. (Véase, p. ej., Zangi et al. Nature Biotechnology 2013).

Con el fin de prolongar el efecto de un ingrediente activo, frecuentemente es deseable retardar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede realizar mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco luego depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco parenteralmente administrada se realiza disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólida. Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos del cuerpo.

28. Kits y dispositivos

a. Kits

La descripción proporciona una variedad de kits para utilizar de manera conveniente y/o de manera efectiva los nucleótidos reivindicados de la presente descripción. Típicamente los kits comprenderán cantidades y/o números de componentes suficientes para permitir a un usuario realizar múltiples tratamientos de un sujeto(s) y/o realizar múltiples experimentos.

En un aspecto, la presente descripción proporciona kits que comprenden las moléculas (polinucleótidos) de la descripción.

Dichos kits pueden ser para la producción de proteínas, que comprenden un primer polinucleótido que comprende una región traducible. El kit además puede comprender envasado e instrucciones y/o un agente de suministro para formar una composición de formulación. El agente de suministro puede comprender una solución salina, una solución amortiguada, un lipidoide o cualquier agente de suministro descrito en el presente documento.

En algunos casos, la solución amortiguadora puede incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. En otro caso, la solución amortiguadora puede incluir, pero no está limitada a, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5%, sacarosa al 5% con calcio 2 mM, manitol al 5%, manitol al 5% con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con calcio 2 mM y mañosa (Véase, p. ej., la Publicación de EE. UU. N° 20120258046). En un caso adicional, las soluciones amortiguadoras se pueden precipitar o se pueden liofilizar. La cantidad de cada componente puede variar para permitir la concentración reproducible más alta, consistente de solución salina o formulaciones amortiguadoras simples. Los componentes también se pueden variar con el fin de incrementar la estabilidad del RNA modificado en la solución amortiguadora durante un período de tiempo y/o en una variedad de condiciones. En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteína, que comprenden: un polinucleótido que comprende una región traducible, proporcionado en una cantidad efectiva para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando se introduce en una célula objetivo; un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico inhibidor, proporcionado en una cantidad efectiva para inhibir sustancialmente la respuesta inmunitaria innata de la célula; y envasado e instrucciones.

En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteína, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, en donde el polinucleótido presenta degradación reducida por una nucleasa celular, y envasado e instrucciones.

En un aspecto, la presente descripción proporciona kits para la producción de proteína, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, en donde el polinucleótido presenta degradación reducida por una nucleasa celular, y una célula de mamífero adecuada para la traducción de la región traducible del primer ácido nucleico.

b. Dispositivos

La presente descripción proporciona dispositivos que pueden incorporar polinucleótidos que codifican polipéptidos de interés. Estos dispositivos contienen en una formulación estable los reactivos para sintetizar un polinucleótido en una formulación disponible para ser suministrada inmediatamente a un sujeto que lo necesite, tal como un paciente humano.

Los dispositivos para administración se pueden emplear para suministrar los polinucleótidos de la presente descripción de acuerdo con pautas posológicas individuales, múltiples o divididas enseñadas en el presente documento. Tales dispositivos se enseñan en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud International N° WO2013151666.

Los métodos y dispositivos conocidos en la técnica para administración múltiple a células, órganos y tejidos se contemplan para el uso junto con los métodos y composiciones descritos en el presente documento como casos de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, los métodos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean por ejemplo lúmenes o catéteres así como dispositivos que utilizan calor, corriente eléctrica o mecanismos impulsados por radiación.

De acuerdo con la presente descripción, estos dispositivos de administración múltiple se pueden utilizar para suministrar las dosis individuales, múltiples o divididas contempladas en el presente documento. Tales dispositivos se enseñan por ejemplo, en la Publicación de Solicitud International N° WO2013151666.

En algunos casos, el polinucleótido se administra por vía subcutánea o intramuscular mediante al menos 3 agujas en tres diferentes sitios, opcionalmente adyacentes, de manera simultánea, o dentro de un período de 60 minutos (p. ej., la administración en 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios simultáneamente o dentro de un período de 60 minutos).

c. Métodos y dispositivos que utilizan catéteres y/o lúmenes

Los métodos y dispositivos que utilizan catéteres y lúmenes se pueden emplear para administrar los polinucleótidos de la presente descripción en una pauta posológica individual, múltiple o dividida. Tales métodos y dispositivos se describen en la Publicación de Solicitud Internacional N° WO2013151666.

d. Métodos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica

Los métodos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica se pueden emplear para suministrar los polinucleótidos de la presente descripción de acuerdo con las pautas posológicas individual, múltiple o dividida enseñadas en el presente documento. Tales métodos y dispositivos se describen en la Publicación de Solicitud International N° WO2013151666.

29. Definiciones

Con el fin de que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Como se utiliza en esta solicitud, excepto que se proporcione expresamente de otra manera en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado expuesto a continuación.

Definiciones adicionales se exponen a lo largo de toda la solicitud.

La descripción incluye casos en los cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, es empleado en, o de otra manera relevante para un producto o procedimiento dado. La descripción incluye casos en las cuales más de uno, o todos de los miembros del grupo están presentes en, son empleados en, o de otra manera relevantes para un producto o procedimiento dado.

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Los términos “un” (o “una”) así como las expresiones “uno o más” y “al menos uno” se pueden utilizar intercambiablemente en el presente documento. En ciertos aspectos, el término “un” o “una” significa “ individual”. En otro aspecto, el término “un” o “una” incluye “dos o más” o “múltiples”.

Además, “y/o” donde se utiliza en el presente documento debe considerarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. De esta manera, el término “y/o” como se utiliza en una frase tal como “A y/o B” en el presente documento se pretende que incluya “A y B”, “A o B”, “A” (solo) y “B” (solo). Del mismo modo, el término “y/o” como se utiliza en una frase tal como “A, B y/o C” se pretende que abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la cual se refiere esta descripción. Por ejemplo, el “Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; “The Dictionary of Cell and Molecular Biology” 3a ed., 1999, Academic Press; y el “Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology”, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta descripción.

Dondequiera que se describan aspectos en el presente documento con el lenguaje “que comprende”, de otra manera también se proporcionan aspectos análogos descritos en expresiones “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.

Las unidades, prefijos y símbolos se denotan en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Donde se cita un intervalo de valores, se debe entender que cada valor de número entero intermedio, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior citados de ese intervalo también se describe específicamente, junto con cada subintervalo entre tales valores. Los límites superior e inferior de cualquier intervalo pueden estar independientemente incluidos en o excluidos del intervalo, y cada intervalo donde cualquiera, ninguno o ambos límites se incluyen también se abarca dentro de la descripción. Donde se cita un valor explícitamente, se debe entender que los valores que son aproximadamente la misma cifra o cantidad que el valor citado también están dentro del alcance de la descripción. Donde se describe una combinación, cada subcombinación de los elementos de esa combinación también se describe específicamente y está dentro del alcance de la descripción. A la inversa, donde diferentes elementos o grupos de elementos se describen individualmente, también se describen combinaciones de los mismos. Donde cualquier elemento de una descripción se describe como que tiene una pluralidad de alternativas, ejemplos de esa descripción en los cuales cada alternativa se excluye individualmente o en cualquier combinación con las otras alternativas también se describen de esta manera; más de un elemento de una descripción puede tener tales exclusiones, y todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones se describen por la presente.

Los nucleótidos se mencionan por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación de 5' a 3'. Las nucleobases se mencionan en el presente documento por sus símbolos de una letra comúnmente conocidos recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Por consiguiente, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina, U representa uracilo.

Los aminoácidos se mencionan en el presente documento ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. A menos que se indique de otra manera, las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi.

Aproximadamente: El término “aproximadamente” como se utiliza en conexión con un valor numérico por toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones denota un intervalo de precisión, común y aceptable para un experto en la técnica. En general, tal intervalo de precisión es ± 10%.

Donde se dan intervalos, están incluidos los puntos extremos. Además, a menos que se indique de otra manera o sea evidente de otra manera en el contexto y entendimiento de un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en diferentes casos de la descripción, hasta la décima de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera.

Administrado en combinación: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “administrado en combinación” o “administración combinada” significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o dentro de un intervalo tal que puede haber un solapamiento de un efecto de cada agente en el paciente. En algunos casos, se administran dentro de aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 o 1 minuto uno del otro. En algunos casos, las administraciones de los agentes están espaciadas suficiente cerca entre sí tal que se logra un efecto combinatorio (p. ej., sinérgico).

Sustitución de aminoácido: La expresión “sustitución de aminoácido” se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido presente en una secuencia parental o de referencia (p. ej., una secuencia de IL12 de tipo natural) por otro resto de aminoácido. Un aminoácido puede ser sustituido en una secuencia parental o de referencia (p. ej., una secuencia de polipéptido de IL12 de tipo natural), por ejemplo, mediante la síntesis de péptido química o a través de métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, una referencia a una “sustitución en la posición X” se refiere a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X por un resto de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, los patrones de sustitución se pueden describir de acuerdo con el esquema AnY, en donde A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido presente naturalmente u originalmente en la posición n, e Y es el resto de aminoácido de sustitución. En otro aspecto, los patrones de sustitución se pueden describir de acuerdo con el esquema An(YZ), en donde A es el código de una sola letra correspondiente al resto de aminoácido que sustituye el aminoácido presente naturalmente u originalmente en la posición X, e Y y Z son restos de aminoácido de sustitución alternativos, es decir,

En el contexto de la presente descripción, las sustituciones (aún cuando se indican como sustitución de aminoácidos) se llevan a cabo a nivel de ácido nucleico, es decir, la sustitución de un resto de aminoácido con un resto de aminoácido alternativo se lleva a cabo sustituyendo el codón que codifica el primer aminoácido con un codón que codifica el segundo aminoácido.

Animal: Como se utiliza en el presente documento, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunos casos, “animal” se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunos casos, “animal” se refiere a animales no humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertos casos, el animal no humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, una vaca, un primate o un cerdo). En algunos casos, los animales incluyen, pero no están limitados a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunos casos, el animal es un animal transgénico, animal genéticamente modificado o un clon.

Aproximadamente: Como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertos casos, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se establezca de otra manera o sea evidente de otro modo del contexto (excepto donde tal número excedería 100% de un valor posible).

Asociado con: Como se utiliza en el presente documento con respecto a una enfermedad, la expresión “asociado con” significa que el síntoma, medición, característica o estado en cuestión está ligado con la diagnosis, desarrollo, presencia o progresión de esa enfermedad. Como asociación, puede estar ligado causativamente a la enfermedad, pero no necesariamente. Por ejemplo, los síntomas, secuelas o cualquiera de los efectos que causan una disminución en la calidad de vida de un paciente de cáncer se consideran asociados con el cáncer y en algunos casos de la presente descripción se pueden tratar, mejorar o prevenir al administrar los polinucleótidos de la presente descripción a un sujeto que lo necesite.

Cuando se utiliza con respecto a dos o más restos, los términos “asociado con”, “conjugado”, “ ligado”, “unido” y “conectado”, cuando se utilizan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están asociados o conectados físicamente entre sí, ya sea directamente o a través de uno o más restos adicionales que sirven como un agente de unión, para formar una estructura que es suficientemente estable de modo que los restos permanecen físicamente asociados en las condiciones en las cuales se utiliza la estructura, p. ej., condiciones fisiológicas. Una “asociación” no necesita ser estrictamente a través del enlace químico covalente directo. También puede sugerir el enlace iónico o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable tal que las entidades “asociadas” permanecen físicamente asociadas.

Bifuncional: Como se utiliza en el presente documento, el término “bifuncional” se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que es capaz de o mantiene al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar al mismo resultado o un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, los RNA modificados bifuncionales de la presente descripción pueden codificar un péptido de IL12 (una primera función) mientras que los nucleósidos que comprenden el RNA de codificación son, en y por sí mismos, capaces de prolongar la semivida del RNA (segunda función). En este ejemplo, el suministro del RNA modificado bifuncional a un sujeto que sufre una deficiencia de proteína produciría no únicamente una molécula de péptido o de proteína que puede mejorar o tratar una enfermedad o afecciones, sino también mantendría una población de RNA modificado presente en el sujeto durante un período prolongado de tiempo. En otros aspectos, un mRNA bifuncionalmente modificado puede ser una molécula quimérica que comprende, por ejemplo, un RNA que codifica un péptido de IL12 (una primera función) y una segunda proteína ya sea fusionada a la primera proteína o coexpresada con la primera proteína.

Biocompatible: Como se utiliza en el presente documento, el término “biocompatible” significa compatible con células vivas, tejidos, órganos o sistemas que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por el sistema inmunitario.

Biodegradable: Como se utiliza en el presente documento, el término “biodegradable” significa capaz de ser descompuesto en productos inocuos mediante la acción de cosas vivas.

Biológicamente activo: Como se utiliza en el presente documento, la frase “biológicamente activo” se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un sistema biológico y/u organismo. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico en ese organismo, se considera que es biológicamente activa. En casos particulares, un polinucleótido de la presente descripción se puede considerar biológicamente activo si incluso una porción del polinucleótido es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.

Quimera: Como se utiliza en el presente documento, “quimera” es una entidad que tiene dos o más partes o regiones incongruentes o heterogéneas. Por ejemplo, una molécula quimérica puede comprender una primera parte que comprende un polipéptido de IL12B, un polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A, y una segunda parte (p. ej., genéticamente fusionada a la primera parte) que comprende una segunda proteína terapéutica (p. ej., una proteína con una actividad enzimática distinta, un resto de unión al antígeno, o un resto capaz de prolongar la semivida en plasma de la IL12, por ejemplo, una región Fc de un anticuerpo).

Optimización de secuencia: La expresión “optimización de secuencia” se refiere a un procedimiento o serie de procedimientos mediante los cuales las nucleobases en una secuencia de ácido nucleico de referencia se reemplazan con nucleobases alternativas, que dan como resultado una secuencia de ácido nucleico con propiedades mejoradas, p. ej., expresión de proteína mejorada o inmunogenicidad disminuida.

En general, el objetivo en la optimización de secuencia es producir una secuencia de nucleótidos sinónima que codifica la misma secuencia de polipéptido codificada por la secuencia de nucleótidos de referencia. De esta manera, no hay sustituciones de aminoácidos (como resultado de la optimización de codones) en el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos optimizada en codones con respecto al polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia.

Sustitución de codón: Las expresiones “sustitución de codón” o “reemplazo de codón” en el contexto de la optimización de secuencia se refiere al reemplazo de un codón presente en una secuencia de ácido nucleico de referencia con otro codón. Un codón puede ser sustituido en una secuencia de ácido nucleico de referencia, por ejemplo, por síntesis de péptido química o mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, las referencias a una “sustitución” o “reemplazo” en una cierta ubicación en una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un mRNA) o dentro de una cierta región o subsecuencia de una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un mRNA) se refieren a la sustitución de un codón en tal ubicación o región por un codón alternativo.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “región de codificación” y “región codificante” y variantes gramaticales de los mismos, se refiere a un marco de lectura abierto (ORF) en un polinucleótido que tras la expresión produce un polipéptido o proteína.

Compuesto: Como se utiliza en el presente documento, el término “compuesto” se pretende que incluya todos los estereoisómeros e isótopos de la estructura representada. Como se utiliza en el presente documento, el término “estereoisómero” significa cualquier isómero geométrico (p. ej., isómero cis y trans), enantiómero o diastereómero de un compuesto. La presente descripción abarca todos y cada uno de los estereoisómeros de los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo formas estereoméricamente puras (p. ej., geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) y mezclas enantioméricas y estereoméricas, p. ej., racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoméricas de compuestos y medios para resolverlas en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes son bien conocidas. “ Isótopos” se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa que resultan de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Además, un compuesto, sal o complejo de la presente descripción se puede preparar en combinación con disolvente o moléculas de agua para formar solvatos e hidratos mediante métodos de rutina.

Poner en contacto: Como se utiliza en el presente documento la expresión “poner en contacto” significa establecer una conexión física entre dos o más entidades. Por ejemplo, poner en contacto una célula de mamífero con una composición de nanopartículas significa que la célula de mamífero y una nanopartícula se hacen para compartir una conexión física. Métodos para poner en contacto células con entidades externas tanto in vivo como ex vivo son bien conocidas en las técnicas biológicas. Por ejemplo, poner en contacto una composición de nanopartículas y una célula de mamífero dispuesta dentro de un mamífero se puede realizar por vías variadas de administración (p. ej., intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea) y puede implicar cantidades variadas de composiciones de nanopartículas. Por otra parte, más de una célula de mamífero se puede poner en contacto con una composición de nanopartículas.

Sustitución de aminoácido conservadora; Una “sustitución aminoácido conservadora” es una en la cual el resto de aminoácido en una secuencia de proteína se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, que incluyen cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina o histidina), cadenas laterales acídicas (p. ej., ácido aspártico o ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina o cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina o triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano o histidina). De esta manera, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido de la misma familia de cadena lateral, la sustitución de aminoácido se considera que es conservadora. En otro aspecto, una cadena de aminoácidos se puede reemplazar de forma conservadora con una cadena estructuralmente similar que difiere en orden y/o composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

Sustitución de aminoácido no conservadora: Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras incluyen aquellas en las cuales (i) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva (p. ej., Arg, His o Lys) sustituye a, o se sustituye por, un resto electronegativo (p. ej., Glu o Asp), (ii) un resto hidrofílico (p. ej., Ser o Thr) sustituye a, o se sustituye por, un resto hidrofóbico (p. ej., Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una cisteína o prolina sustituye a, o se sustituye por, cualquier otro resto o (iv) un resto que tiene una cadena lateral hidrofóbica o aromática voluminosa (p. ej., Val, His, Ile o Tip) sustituye a, o se sustituye por, una cadena lateral más pequeña (p. ej., Ala o Ser) o ninguna cadena lateral (p. ej., Gly).

Otras sustituciones de aminoácidos pueden ser identificadas fácilmente por los trabajadores expertos. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, una sustitución se puede tomar de uno cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para lisina, un reemplazo puede ser uno cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. Generalmente, las sustituciones en regiones funcionalmente importantes que se puede esperar que induzcan cambios en las propiedades de polipéptidos aislados son aquellas en las cuales (i) un resto polar, p. ej., serina o treonina, sustituye a (o se sustituye por) un resto hidrofóbico, p. ej., leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un resto de cisteína sustituye a (o se sustituye por) cualquier otro resto; (iii) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisina, arginina o histidina, sustituye a (o se sustituye por) un resto que tiene una cadena lateral electronegativa, p. ej., ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, sustituye a (o se sustituye por) uno que no tiene tal cadena lateral, p. ej., glicina. La probabilidad de que una de las sustituciones no conservadoras anteriores pueda alterar las propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la sustitución con respecto a las regiones funcionalmente importantes de la proteína: algunas sustituciones no conservadoras por consiguiente pueden tener poco o nada de efecto en las propiedades biológicas.

Conservado: Como se utiliza en el presente documento, el término “conservado” se refiere a nucleótidos o restos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótido o secuencia de polipéptido, respectivamente, que son aquellos que se encuentran no alterados en la misma posición de dos o más secuencias que son comparadas. Los nucleótidos o aminoácidos que se conservan relativamente son aquellos que son conservados entre las secuencias más relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otra parte en las secuencias.

En algunos casos, dos o más secuencias se dice que son “completamente conservadas” si son 100% idénticas entre sí. En algunos casos, dos o más secuencias se dicen que son “altamente conservadas” si son al menos 70% idénticas, al menos 80% idénticas, al menos 90% idénticas o al menos 95% idénticas entre sí. En algunos casos, dos o más secuencias se dice que son “altamente conservadas” si son aproximadamente 70% idénticas, aproximadamente 80% idénticas, aproximadamente 90% idénticas, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas entre sí. En algunos casos, dos o más secuencias se dice que son “conservadas” si son al menos 30% idénticas, al menos 40% idénticas, al menos 50% idénticas, al menos 60% idénticas, al menos 70% idénticas, al menos 80% idénticos, al menos 90% idénticas o al menos 95% idénticas entre sí. En algunos casos, dos o más secuencias se dice que son “conservadas” si son aproximadamente 30% idénticas, aproximadamente 40% idénticas, aproximadamente 50% idénticas, aproximadamente 60% idénticas, aproximadamente 70% idénticas, aproximadamente 80% idénticas, aproximadamente 90% idénticas, aproximadamente 95% idénticas, aproximadamente 98% idénticas o aproximadamente 99% idénticas entre sí. La conservación de secuencia se puede aplicar a la longitud completa de un polinucleótido o un polipéptido o se puede aplicar a una porción, región o característica de la misma.

Liberación Controlada: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de la composición farmacéutica o compuesto que sigue un patrón particular de liberación para realizar un efecto o resultado terapéutico.

Derivado covalente: La expresión “derivado covalente” cuando se refiere a polipéptidos incluye modificaciones de una proteína nativa o inicial con un agente derivatizante proteico orgánico o no proteico y/o modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar restos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o restos terminales, o aprovechando mecanismos de modificaciones postraduccionales que funcionan en células hospedantes recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos en identificar restos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de anticuerpos antiproteína para purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Tales modificaciones están dentro de la habilidad ordinaria en la técnica y se realizan sin experimentación excesiva.

Cíclico o Ciclado: Como se utiliza en el presente documento, el término “cíclico” se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, únicamente formadas por una cadena sin ruptura de subunidades. Las moléculas cíclicas tales como el RNA genéticamente modificado o mRNA de la presente descripción pueden ser unidades individuales o multímeros o comprenden uno o más componentes de un complejo o de estructura de orden más alto.

Citotóxico: Como se utiliza en el presente documento, “citotóxico” se refiere a matar o causar un efecto dañino, tóxico o mortal en una célula (p. ej., una célula de mamífero (p. ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prion o una combinación de los mismos.

Suministro: Como se utiliza en el presente documento, el término “suministro” significa proporcionar una entidad a un destino. Por ejemplo, el suministro de un polinucleótido a un sujeto puede implicar la administración de una composición de nanopartículas que incluye el polinucleótido al sujeto (p. ej., por una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea). La administración de una composición de nanopartículas a un mamífero o célula de mamífero puede implicar poner en contacto una o más células con la composición de nanopartículas.

Agente de Suministro: Como se utiliza en el presente documento, “agente de suministro” se refiere a cualquier sustancia que facilita, al menos en parte, el suministro in vivo, in vitro o ex vivo de un polinucleótido a células dirigidas.

Desestabilizado: Como se utiliza en el presente documento, el término “desestabiliza”, “desestabilizar” o “región desestabilizante” significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo natural o nativa de la misma región o molécula.

Etiqueta detectable: Como se utiliza en el presente documento, “etiqueta detectable” se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que se unen, se incorporan o se asocian con otra entidad que es fácilmente detectada por métodos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbencia y similares. Las etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Las etiquetas detectables se pueden ubicar en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritas en el presente documento. Pueden estar dentro de los aminoácidos, los péptidos o proteínas, o ubicadas en los extremos N o C.

Diastereómero: Como se utiliza en el presente documento, el término “diastereómero” significa estereoisómeros que no son imágenes especulares uno del otro y no son superponibles uno sobre el otro.

Digestión: Como se utiliza en el presente documento, el término “digestión” significa descomponer en piezas o componentes más pequeños. Cuando se refiere a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.

Distante: Como se utiliza en el presente documento, el término “distante” significa situado lejos del centro o alejado de un punto o región de interés.

Dominio: Como se utiliza en el presente documento, cuando se refiere a polipéptidos, el término “dominio” se refiere a un motivo de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades estructurales o funcionales identificables (p. ej., capacidad de unión, que sirve como un sitio para las interacciones de proteínaproteína).

Pauta posológica: Como se utiliza en el presente documento, una “pauta posológica” o una “pauta” es un programa de administración o régimen de tratamiento, profilaxis o cuidado paliativo determinado por el médico.

Cantidad efectiva: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “cantidad efectiva” de un agente es aquella cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos, y, como tal, una “cantidad efectiva” depende en el contexto en el cual está siendo aplicado. Por ejemplo, en el contexto de administrar un agente que trata una deficiencia de proteína (p. ej., una deficiencia de IL12), una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad de mRNA que expresa suficiente PBGF para mejorar, reducir, eliminar o prevenir los síntomas asociados con la deficiencia de IL12, comparado con la gravedad del síntoma observado sin la administración del agente. La expresión “cantidad efectiva” se puede utilizar intercambiablemente con “dosis efectiva”, “cantidad terapéuticamente efectiva” o “dosis terapéuticamente efectiva”.

Enantiómero: Como se utiliza en el presente documento, el término “enantiómero” significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la descripción, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (determinado por métodos convencionales en la técnica) de al menos 80% (es decir, al menos 90% de un enantiómero y como máximo 10% del otro enantiómero), al menos 90% o al menos 98%.

Encapsular: Como se utiliza en el presente documento, el término “encapsular” significa encerrar, rodear o insertar.

Eficiencia de encapsulación: Como se utiliza en el presente documento, “eficiencia de encapsulación” se refiere a la cantidad de un polinucleótido que llega a ser parte de una composición de nanopartículas, con respecto a la cantidad total inicial de polinucleótido utilizado en la preparación de una composición de nanopartículas. Por ejemplo, si 97 mg de polinucleótido se encapsulan en una composición de nanopartículas de un total de 100 mg de polinucleótido inicialmente proporcionado a la composición, la eficiencia de encapsulación se puede dar como 97%. Como se utiliza en el presente documento, “encapsulación” puede referirse al encerramiento, confinamiento, rodeado o inserción completo, sustancial o parcial.

Señal de escisión de proteína codificada: Como se utiliza en el presente documento, “señal de escisión de proteína codificada” se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.

Genéticamente modificado: Como se utiliza en el presente documento, los casos de la descripción son “genéticamente modificados” cuando se diseñan para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía de un punto de partida, molécula de tipo natural o nativa.

Suministro aumentado: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “suministro aumentado” significa el suministro de más (p. ej., al menos 1.5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido objetivo de interés (p. ej., hígado del mamífero) comparado con el nivel de suministro de un polinucleótido por una nanopartícula de control a un tejido objetivo de interés (p. ej., MC3, KC2 o DLinDMA). El nivel de suministro de una nanopartícula a un tejido particular se puede medir comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido, comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con la cantidad de proteína total en dicho tejido, o comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con la cantidad de polinucleótido total en dicho tejido. Se entenderá que el suministro aumentado de una nanopartícula a un tejido objetivo no necesita ser determinado en un sujeto que se está tratando, se puede determinar en un sustituto tal como un modelo animal (p. ej., un modelo de rata).

Exosoma: Como se utiliza en el presente documento “exosoma” es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo implicado en la degradación de RNA.

Expresión: Como se utiliza en el presente documento, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes sucesos: (1) producción de una plantilla de mRNA a partir de una secuencia de DNA (p. ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de mRNA (p. ej., mediante empalme, edición, formación de caperuza 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un mRNA en un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Ex Vivo: Como se utiliza en el presente documento, el término “ex vivo" se refiere a sucesos que ocurren fuera de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo). Los sucesos ex vivo pueden tener lugar en un ambiente mínimamente alterado de un ambiente natural (p. ej., in vivo).

Característica: Como se utiliza en el presente documento, una “característica” se refiere a un atributo, una propiedad o un elemento distintivo. Cuando se refiere a polipéptidos, “características” se definen como componentes basados en secuencia de aminoácidos distintos de una molécula. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente descripción incluyen manifestaciones de superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.

Formulación: Como se utiliza en el presente documento, una “formulación” incluye al menos un polinucleótido y uno o más de un vehículo, un excipiente y un agente de suministro.

Fragmento: Un “fragmento”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir la proteína de longitud completa aislada de células cultivadas. En algunos casos, un fragmento es una subsecuencia de una proteína de longitud completa (p. ej., IL12) en donde se han eliminado el extremo N y/o extremo C y/o subsecuencias internas. En algunos aspectos preferidos de la presente descripción, los fragmentos de una proteína de la presente descripción son fragmentos funcionales.

Funcional: Como se utiliza en el presente documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la cual presenta una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza. De esta manera, un fragmento funcional de un polinucleótido de la presente descripción es un polinucleótido capaz de expresar un fragmento de IL12 funcional. Como se utiliza en el presente documento, un fragmento funcional de IL12 se refiere a un fragmento de IL12 de tipo natural (es decir, un fragmento de cualquiera de sus isoformas que se encuentran naturalmente), o un mutante o variante de la misma, en donde el fragmento retiene al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% de la actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente.

Lípido auxiliar: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “lípido auxiliar” se refiere a un compuesto o molécula que incluye un resto lipídico (para la inserción en una capa lipídica, p. ej., bicapa lipídica) y un resto polar (para la interacción con la solución fisiológica en la superficie de la capa lipídica). Típicamente el lípido auxiliar es un fosfolípido. Una función del lípido auxiliar es “complementar” el aminolípido e incrementar la fusogenicidad de la bicapa y/o ayudar a facilitar el escape endosomal, p. ej., del ácido nucleico suministrado a las células. Los lípidos auxiliares también se cree que son un componente estructural clave para la superficie de la LNP.

Homología: Como se utiliza en el presente documento, el término “homología” se refiere a la relación total entre moléculas poliméricas, p. ej. entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de DNA y/o moléculas de RNA) y/o entre moléculas de polipéptidos. Generalmente, el término “homología” implica una relación evolutiva entre dos moléculas. De esta manera, dos moléculas que son homólogas tendrán un ancestro evolutivo común. En el contexto de la presente descripción, el término homología abarca tanto la identidad como la similitud.

En algunos casos, las moléculas poliméricas se consideran que son “homólogas” entre sí, si al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de los monómeros en la molécula son idénticos (exactamente el mismo monómero) o son similares (sustituciones conservadoras). El término “homólogo” necesariamente se refiere a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos).

Identidad: Como se utiliza en el presente documento, el término “identidad” se refiere a la conservación de monómeros total entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de polinucleótidos (p. ej. moléculas de DNA y/o moléculas de RNA) y/o entre moléculas de polipéptido. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, se puede realizar alineando las dos secuencias para propósitos de comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en una o tanto en una primera como en una segunda secuencias de ácido nucleico para la alineación óptima y las secuencias no idénticas se pueden no tener en cuenta para propósitos de comparación). En ciertos casos, la longitud de una secuencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Cuando se compara DNA y RNA, timina (T) y uracilo (U) se pueden considerar equivalentes.

Los programas de software adecuados están disponibles de varias fuentes y para alineación de secuencias tanto de proteína como de nucleótidos. Un programa adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es bl2seq, parte del paquete de programas BLAST disponible del Centro Nacional para Información Biotecnológica del gobierno de EE. UU. en el sitio web de BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias utilizando ya sea el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, p. ej., Needle, Stretcher, Water o Matcher, parte del paquete EMBOSS de programas de bioinformática y también disponibles del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa.

Las alineamientos de secuencia se pueden llevar a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X o Clustal Omega), MUSCLE, etc.

Diferentes regiones dentro de una sola secuencia objetivo de polinucleótido o polipéptido que se alinea con una secuencia de referencia de polinucleótido o polipéptido pueden tener cada una su propio porcentaje de identidad de secuencia. Se observa que el valor de porcentaje de identidad de secuencia está redondeado al décimo más cercano. Por ejemplo, 80.11, 80.12, 80.13 y 80.14 se redondean hacia abajo 80.1, mientras que 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 y 80.19 se redondean hasta 80.2. También se observa que el valor de longitud siempre será un número entero.

En ciertos aspectos, el porcentaje de identidad “% ID” de una primera secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) con una segunda secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) se calcula como % ID = 100 x (Y/Z), donde Y es el número de restos de aminoácidos (o nucleobases) puntuados como concordancias idénticas en la alineación de la primera y segunda secuencias (alineado por inspección visual o un programa de alineación de secuencias particular) y Z es el número total de restos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es más larga que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con la segunda secuencia será más alto que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con la primera secuencia.

Un experto en la técnica apreciará que la generación de una alineación de secuencias para el cálculo de un porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones de secuencia-secuencia binarias exclusivamente dirigidas por datos de secuencia primaria. También se apreciará que las alineaciones de secuencias se pueden generar al integrar datos de secuencia con datos de fuentes heterogéneas, tales como datos estructurales (p. ej., estructuras de proteína cristalográfica), datos funcionales (p. ej., ubicación de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra los datos heterogéneos para generar una alineación de múltiples secuencias es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org, y alternativamente disponible, p. ej., del EBI. También se apreciará que la alineación final utilizada para calcular el porcentaje de identidad de secuencia se puede curar ya sea automática o manualmente.

Respuesta inmunitaria: La expresión “respuesta inmunitaria” se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producida por las células anteriores o el hígado (que incluyen anticuerpos, citocinas y complemento) que dan como resultado daño selectivo, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o de inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. En algunos casos, la administración de una nanopartícula que comprende un componente de lípido y un agente terapéutico encapsulado puede activar una respuesta inmunitaria, que puede ser causada por (i) el agente terapéutico encapsulado (p. ej., un mRNA), (ii) el producto de expresión de tal agente terapéutico encapsulado (p. ej., un polipéptido codificado por el mRNA), (iii) el componente de lípido de la nanopartícula o (iv) una combinación de los mismos.

Respuesta inflamatoria: “Respuesta inflamatoria” se refiere a respuestas inmunitarias que implican sistemas de defensa específicos y no específicos. Una reacción del sistema de defensa específico es una reacción del sistema inmunitario específica para un antígeno. Ejemplos de reacciones del sistema de defensa específicas incluyen respuestas de anticuerpos. Una reacción del sistema de defensa no específica es una respuesta inflamatoria mediada por leucocitos generalmente incapaces de memoria inmunológica, p. ej., macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. En algunos aspectos, una respuesta inmunitaria incluye la secreción de citocinas inflamatorias, que da como resultado niveles de citocinas inflamatoria elevados.

Citocinas inflamatorias: La expresión “citocina inflamatoria” se refiere a citocinas que se elevan en una respuesta inflamatoria. Ejemplos de citocinas inflamatorias incluyen interleucina-6 (IL-6), CXCL1 (ligando de quimiocina (motivo CXC) 1; también conocida como GROa, interferón-Y (IFN^y), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10), o factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). La expresión citocinas inflamatorias incluye también otras citocinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, p. ej., interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12 (IL12), interleucina-13 (11-13), interferón a (IFN-a), etc.

In Vitro: Como se utiliza en el presente documento, el término “in vitro’’ se refiere a sucesos que ocurren en un ambiente artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, en una caja de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio).

In Vivo: Como se utiliza en el presente documento, el término “in vivo" se refiere a sucesos que ocurren dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).

Variantes de inserción y de eliminación: “Variantes de inserción” cuando se refieren a polipéptidos son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. “Inmediatamente adyacente” a un aminoácido significa conectado al grupo funcional ya sea alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido. “Variantes de eliminación” cuando se refieren a polipéptidos son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida eliminados. Ordinariamente, las variantes de eliminación tendrán uno o más aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

Intacto: Como se utiliza en el presente documento, en el contexto de un polipéptido, el término “ intacto” significa que retiene un aminoácido correspondiente a la proteína de tipo natural, p. ej., sin mutación o sustitución del aminoácido de tipo natural. A la inversa, en el contexto de un ácido nucleico, el término “intacto” significa la retención de una nucleobase correspondiente al ácido nucleico de tipo natural, p. ej., sin mutación o sustitución de la nucleobase de tipo natural.

Aminolípido ionizable: La expresión “aminolípido ionizable” incluye aquellos lípidos que tienen uno, dos, tres o más cadenas de ácido graso o alquilo graso y un grupo de cabeza de amino de pH valorable (p. ej., un grupo de cabeza de alquilamino o dialquilamino). Un aminolípido ionizable típicamente está protonado (es decir, positivamente cargado) a un pH por abajo del pKa del grupo de cabeza de amino y sustancialmente no está cargado a un pH por encima del pKa. Tales aminolípidos ionizables incluyen, pero no están limitados a, DLin-MC3-DMA(MC3) y (13Z,165Z)-N,N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1-amina (L608).

Aislado: Como se utiliza en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una sustancia o entidad que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada (ya sea en la naturaleza o en un marco experimental). Las sustancias aisladas (p. ej., polinucleótidos o polipéptidos) pueden tener niveles variables de pureza con respecto a las sustancias de las cuales se han aislado. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar de al menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, o más de los otros componentes con los cuales estaban asociados inicialmente. En algunos casos, las sustancias aisladas son más de aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% puras. Como se utiliza en el presente documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes.

Sustancialmente aislado: Por “sustancialmente aislado” se entiende que el compuesto se separa sustancialmente del ambiente en el cual se formó o se detectó. La separación parcial puede incluir, p. ej., una composición enriquecida en el compuesto de la presente descripción. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97% o al menos aproximadamente 99% en peso del compuesto de la presente descripción, o sal del mismo.

Un polinucleótido, vector, polipéptido, célula, o cualquier composición descrita en el presente documento que está “aislado” es un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o composición que está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones aislados incluyen los que se han purificado hasta un grado que ya no están en una forma en la cual se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, un polinucleótido, vector, polipéptido o composición que está aislado es sustancialmente puro.

Isómero: Como se utiliza en el presente documento, el término “isómero” significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la descripción. Se reconoce que los compuestos de la descripción pueden tener uno o más centros quirales y/o enlaces dobles y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). De acuerdo con la descripción, las estructuras químicas representadas en el presente documento, y por lo tanto los compuestos de la descripción, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (p. ej., geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, p. ej., racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de los compuestos de la descripción típicamente se pueden resolver en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes por métodos bien conocidos, tal como cromatografía de gases de fase quiral, la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase quiral, la cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o la cristalización del compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener de productos intermedios estereoméricamente o enantioméricamente puros, reactivos y catalizadores por métodos sintéticos asimétricos bien conocidos.

Enlazador. Como se utiliza en el presente documento, un “enlazador” (que incluye un enlazador de subunidades y un enlazador de polipéptido heterólogo como se denomina en el presente documento) se refiere a un grupo de átomos, p. ej., 10-1000 átomos, y puede estar compuesto de átomos o grupos tales como, pero no limitados a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado de la porción de nucleobase o azúcar en un primer extremo, y a una carga activa, p. ej., un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El enlazador puede ser de longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador se puede utilizar para cualquier propósito útil, tal como para formar multímeros de polinucleótidos (p. ej., a través de la unión de dos o más moléculas de polinucleótidos quiméricas o polinucleótidos IVT) o conjugados de polinucleótidos, así como para administrar una carga activa, como se describe en el presente documento. Ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no están limitados a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, como se describe en el presente documento. Ejemplos de enlazadores incluyen, pero no están limitados a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (p. ej., unidades monoméricas de etileno o propilenglicol, p. ej., dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y polímeros de dextrano y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, pero no están limitados a, restos escindibles dentro del enlazador, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N=N-), que se puede escindir utilizando un agente de reducción o fotólisis. Ejemplos no limitantes del enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que se puede escindir, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), u otros agentes de reducción y/o fotólisis, así como un enlace éster se puede escindir, por ejemplo, mediante hidrólisis acídica o básica.

Métodos de administración. Como se utiliza en el presente documento, “métodos de administración” puede incluir la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea u otros métodos para suministrar una composición a un sujeto. Un método de administración se puede seleccionar para el suministro dirigido (p. ej., para suministrar específicamente) a una región o sistema específico de un cuerpo.

Modificado. Como se utiliza en el presente documento, “modificado” se refiere a un estado o estructura cambiados de una molécula de la descripción. Las moléculas se pueden modificar de muchas maneras, que incluyen química, estructural y funcionalmente. En algunos casos, las moléculas de mRNA de la presente descripción se modifican por la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales, p. ej., en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos tales como las estructuras de caperuza no se consideran “modificados” aunque difieren de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.

Moco. Como se utiliza en el presente documento, “moco” se refiere a una sustancia natural que es viscosa y comprende glicoproteínas mucinas.

Composición de nanopartícula. Como se utiliza en el presente documento, una “composición de nanopartícula” es una composición que comprende uno o más lípidos. Las composiciones de nanopartículas típicamente tienen un tamaño del orden de micrómetros o más pequeñas y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas de lípidos (LNP), liposomas (p. ej., vesículas de lípido) y lipoplexos. Por ejemplo, una composición de nanopartícula puede ser un liposoma que tiene una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.

Se encuentra naturalmente. Como se utiliza en el presente documento, “se encuentra naturalmente” significa la existencia en la naturaleza sin ayuda artificial.

Vertebrado no humano. Como se utiliza en el presente documento, un “vertebrado no humano” incluye todos los vertebrados excepto Homo sapiens, incluyendo las especies salvajes y domesticadas. Ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, pero no están limitados a, mamíferos, tales como alpaca, buey, visón, camello, gato, ganado vacuno, ciervo, perro, burro, toro, cabra, conejillo de indias, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, oveja, búfalo de agua y yak.

Secuencia de ácido nucleico. Las expresiones “secuencia de ácido nucleico”, “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de polinucleótido” se utilizan intercambiablemente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico contigua. La secuencia puede ser ya sea un DNA de una sola hebra o doble hebra o RNA, p. ej., un mRNA.

La expresión “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprende un polímero de nucleótidos. Estos polímeros se denominan con frecuencia polinucleótidos. Los ácidos nucleicos o polinucleótidos de ejemplo de la descripción incluyen, pero no están limitados a, ácidos ribonucleicos (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de treosa (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos de péptido (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, que incluyen LNA que tiene una configuración p-D-ribo, a-LNA que tiene una configuración a-L-ribo (un diastereómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino, y 2'-amino-a-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino), ácidos nucleicos de etileno (ENA), ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA) o híbridos o combinaciones de los mismos.

La frase “secuencia de nucleótidos que codifica” se refiere a la secuencia de ácido nucleico codificante (p. ej., una molécula de mRNA o DNA) que codifica un polipéptido. La secuencia de codificación además puede incluir señales de iniciación y terminación operativamente unidas a elementos reguladores que incluyen un promotor y señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero al cual se administra el ácido nucleico. La secuencia de codificación además puede incluir secuencias que codifican péptidos de señal.

Fuera del objetivo: Como se utiliza en el presente documento, “fuera del objetivo” se refiere a cualquier efecto no previsto en uno cualquiera o más objetivos, genes o transcritos celulares.

Marco de lectura abierta: Como se utiliza en el presente documento, “marco de lectura abierto” u “ORF” se refiere a una secuencia que no contiene un codón de terminación en un marco de lectura dado.

Operativamente unido: Como se utiliza en el presente documento, la frase “operativamente unido” se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcritos, entidades, motivos o similares.

Opcionalmente sustituido: En el presente documento una frase de la forma “X opcionalmente sustituido” (p. ej., alquilo opcionalmente sustituido) se pretende que sea equivalente a “X, en donde X está opcionalmente sustituido” (p. ej., “alquilo, en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido”). No se pretende dar a entender que la característica “X” (p. ej., alquilo) per se es opcional.

Parte: Como se utiliza en el presente documento, una “parte” o “región” de un polinucleótido se define como cualquier porción del polinucleótido que es menor que la longitud completa del polinucleótido.

Paciente: Como se utiliza en el presente documento, “paciente” se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuido de un profesional entrenado para una enfermedad o afección particular.

Farmacéuticamente aceptable: La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que basado en el buen criterio médico, son adecuados para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, de acuerdo con una relación de beneficio/riesgo razonable.

Excipientes farmacéuticamente aceptables: La frase “excipiente farmacéuticamente aceptable”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier ingrediente diferente de los compuestos descritos en el presente documento (p. ej., un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio para un paciente. Los excipientes pueden incluir, p. ej.: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, disgregantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, agentes deslizantes (aumentadores de flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes de ejemplo incluyen, pero no están limitados a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato sódico de almidón, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.

Sales farmacéuticamente aceptables: La presente descripción también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a derivados de los compuestos descritos en donde el compuesto parental se modifica convirtiendo un resto de ácido o de base existente en su forma de sal (p. ej., haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, sales de ácido mineral u orgánico de restos básicos tales como aminas; sales de álcali u orgánicas de restos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen sales de acetato, ácido acético, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, ácido bencenosulfónico, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales de metal alcalino o alcalinotérreo representativas incluyen, sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes de amonio no tóxicos, de amonio cuaternario y de amina que incluyen, pero no limitados a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto parental formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción se pueden sintetizar a partir del compuesto parental que contiene un resto básico o ácido por métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o de base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiada en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se usan medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).

Solvato farmacéuticamente aceptable: La expresión “solvato farmacéuticamente aceptable” como se utiliza en el presente documento, significa un compuesto de la descripción en donde las moléculas de un disolvente adecuado se incorporan en la red cristalina. Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable en la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación en una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (p. ej., mono, di y trihidratos), /V-metilpirrolidinona (NMP), sulfóxido de dimetilo (DMSO), W,W'-dimetilformamida (DMF), W,W'-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMp U), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina un “hidrato”.

Farmacocinética: Como se utiliza en el presente documento, “farmacocinética” se refiere a una cualquiera o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas, que incluyen el grado y velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se denomina comúnmente ADME donde: (A) Absorción es el proceso de una sustancia que entra en la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por todos los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de los compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o Eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido del cuerpo.

Fisicoquímico: Como se utiliza en el presente documento, “fisicoquímico” significa o se refiere a una propiedad física y/o química.

Polinucleótido: El término “polinucleótido”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, que incluyen ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. Este término se refiere a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, el término incluye ácido desoxirribonucleico (“DNA”) de triple, doble y de una sola hebra, así como ácido ribonucleico (“RNA”) de triple, doble y de una sola hebra. También incluye formas modificadas, p. ej., mediante alquilación y/o formación de caperuza, y no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, el término “polinucleótido” incluye polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), incluyen tRNA, rRNA, hRNA, siRNA y mRNA, ya sea empalmados o no empalmados, cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen cadenas principales no nucleotídicas, p. ej., poliamida (p. ej., ácidos nucleicos de péptido “PNA”) y polímeros de polimorfolino, y otros polímeros de ácidos nucleicos específicos de secuencia sintéticos con la condición de que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permite el emparejamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el DNA y RNA. En aspectos particulares, el polinucleótido comprende un mRNA. En otro aspecto, el mRNA es un mRNA sintético. En algunos aspectos, el mRNA sintético comprende al menos una nucleobase no natural. En algunos aspectos, todas las nucleobases de una cierta clase se han reemplazado con nucleobases no naturales (p. ej., todas las uridinas en un polinucleótido descrito en el presente documento se pueden reemplazar con una nucleobase no natural, p. ej., 5-metoxiuridina). En algunos aspectos, el polinucleótido (p. ej., un RNA sintético o un DNA sintético) comprende únicamente nucleobases naturales, es decir, A (adenosina), G (guanosina), C (citidina) y T (timidina) en el caso de un DNA sintético, o A, C, G y U (uridina) en el caso de un RNA sintético.

El experto apreciará que las bases T en los mapas de codones descritos en el presente documento están presentes en el DNA, mientras que las bases T serían reemplazadas por bases U en los RNA correspondientes. Por ejemplo, una secuencia de codón-nucleótido descrita en el presente documento en forma de DNA, p. ej., un vector o una plantilla de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U basado en su mRNA transcrito correspondiente. A este respecto, ambas secuencias de DNA optimizadas en codones (que comprenden T) y sus secuencias de mRNA correspondientes (que comprenden U) se consideran secuencia de nucleótidos optimizada en codones de la presente descripción. Un experto también entendería que los mapas de codones equivalentes se pueden generar reemplazando una o más bases con bases no naturales. De esta manera, p. ej., un codón TTC (mapa de DNA) correspondería a un codón UUC (mapa de RNA), que a su vez correspondería a un codón ^ ^ C (mapa de RNA en el cual U se ha reemplazado con pseudouridina).

Los pares de bases A-T y G-C estándares se forman en condiciones que permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre el N3-H y C4-oxi de la timidina y el N1 y C6-NH2, respectivamente, de la adenosina y entre el C2-oxi, N3 y C4-NH2, de la citidina y el C2-NH2, N'-H y C6-oxi, respectivamente, de la guanosina. De esta manera, por ejemplo, la guanosina (2-amino-6-oxi-9-p-D-ribofuranosil-purina) se puede modificar para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-p-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación da como resultado una base de nucleósido que ya no formará de manera efectiva un par de bases estándar con citosina. Sin embargo, la modificación de citosina (1-p-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-p-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina) da como resultado un nucleótido modificado que formará pares de bases de manera efectiva con guanosina, pero formará un par de bases con isoguanosina (Patente de EE. UU. N° 5,681,702 de Collins et al.). La isocitosina está disponible en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); la isocitidina se puede preparar por el método descrito por Switzer et al., (1993) Biochemistry 32: 10489-10496 y las referencias citadas en el mismo; 2'-desoxi-5-metil-isocitidina se puede preparar por el método de Tor et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y las referencias citadas en el mismo; y los nucleótidos de isoguanina se pueden preparar utilizando el método descrito por Switzer et al., 1993, véase antes, y Mantsch et al., 1993, Biochem. 14: 5593-5601, o por los métodos descritos en la Patente de EE. UU. N° 5,780,610 de Collins et al. Otros pares de bases no naturales se pueden sintetizar por el método descrito en Piccirilli et al., 1990, Nature 343:33-37, para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo-[4,3]-pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona. Otras de tales unidades de nucleótido modificadas que forman pares de bases únicas son conocidas, tales como las descritas en Leach et al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer et al., véase antes.

Polipéptido: Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se utilizan intercambiablemente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede comprender aminoácidos modificados. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención, por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales tales como homocisteína, ornitina, p-acetilfenilalanina, D-aminoácidos y creatina), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.

El término, como se utiliza en el presente documento, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos incluyen productos de polinucleótidos codificados, polipéptidos que se encuentran naturalmente, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser un monómero o puede ser un complejo multimolecular tal como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos de una sola cadena o de multicadena. Los enlaces de disulfuro más comunes se encuentran en polipéptidos de multicadena. El término polipéptido también se puede aplicar a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más restos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido que se encuentra naturalmente correspondiente. En algunos casos, un “péptido” puede ser menor que o igual a 50 aminoácidos de largo, p. ej., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de largo.

Variante de polipéptido: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “variante de polipéptido” se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o de referencia. Las variantes de secuencia de aminoácidos pueden tener eliminaciones, supresiones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, comparado con una secuencia nativa o de referencia. Ordinariamente, las variantes tendrán al menos aproximadamente 50% de identidad, al menos aproximadamente 60% de identidad, al menos aproximadamente 70% de identidad, al menos aproximadamente 80% de identidad, al menos aproximadamente 90% de identidad, al menos aproximadamente 95% de identidad, al menos aproximadamente 99% de identidad con una secuencia nativa o de referencia. En algunos casos, serán al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% idénticas a una secuencia nativa o de referencia.

Polipéptido por fármaco unitario (PUD): Como se utiliza en el presente documento, un PUD o producto por fármaco unitario, se define como una porción subdividida de la dosis diaria total, habitualmente 1 mg, pg, kg, etc., de un producto (tal como un polipéptido) medido en el fluido corporal o tejido, habitualmente definido en concentración tal como pmol/ml, mmol/ml, etc. dividido entre la medición del fluido corporal.

Prevenir: Como se utiliza en el presente documento, el término “prevenir” se refiere retardar parcial o completamente el inicio de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retardar parcial o completamente el inicio de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retardar parcial o completamente el inicio de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno o condición particular; retardar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad particular, trastorno y/o afección; y/o disminuir el riesgo de desarrollar la patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.

Profármaco: La presente descripción también incluye profármacos de los compuestos descritos en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, “profármacos” se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que está en una forma prevista para que esta sustancia, molécula o entidad actúe como un producto terapéutico tras alteración química o física. Los profármacos se pueden unir covalentemente o secuestrar de alguna manera y se liberan o se convierten en la porción de fármaco activa antes de, en o después de la administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando grupos funcionales presentes en los compuestos de tal manera que las modificaciones son escindidas, ya sea en manipulación de rutina o in vivo, a los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en donde grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y uso de profármacos se discute en T. Higuchi y V. Stella, “Pro-drugs as Novel DeliverySystems”, vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Proliferar: Como se utiliza en el presente documento, el término “proliferar” significa crecer, expandir o incrementar o causar crecimiento, expansión o incremento rápidamente. “Proliferativo” significa que tiene la habilidad para proliferar. “Antiproliferativo” significa que tiene propiedades contrarias u opuestas a las propiedades proliferativas.

Profiláctico: Como se utiliza en el presente documento, “profiláctico” también se refiere a una acción terapéutica o curso de acción utilizada para prevenir la dispersión de la enfermedad.

Profilaxis: Como se utiliza en el presente documento, una “profilaxis” se refiere a una medida tomada para mantener la salud y prevenir la dispersión de la enfermedad. Una “profilaxis inmunitaria” se refiere a una medida para producir inmunidad activa o pasiva para prevenir la dispersión de la enfermedad.

Sitio de escisión de proteína: Como se utiliza en el presente documento, “sitio de escisión de proteína” se refiere a un sitio donde la escisión controlada de la cadena de aminoácidos se puede realizar por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.

Señal de escisión de proteína: Como se utiliza en el presente documento, “señal de escisión de proteína” se refiere a al menos un aminoácido que etiqueta o marca un polipéptido para la escisión .

Proteína de interés: Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “proteínas de interés” o “proteínas deseadas” incluyen aquellas no proporcionadas en el presente documento y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de las mismas.

Próximo: Como se utiliza en el presente documento, el término “próximo” significa situado más cercano al centro o un punto o región de interés.

Pseudouridina: Como se utiliza en el presente documento, pseudouridina (^y) se refiere al isómero de C-glicósido del nucleósido uridina. Un “análogo de pseudouridina” es cualquier modificación, variante, isoforma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen, pero no están limitados a, 1 -carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 1-metilpseudouridina (it^ y ), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1 -desaza-pseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tiouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 ^y) y 2'-O-metil-pseudouridina (Ym).

Purificado: Como se utiliza en el presente documento, “purificar”, “purificado”, “purificación” significa hacer sustancialmente puro o limpio de componentes indeseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.

Secuencia de ácido nucleico de referencia: La expresión “secuencia de ácido nucleico de referencia” o “ácido nucleico de referencia” o “secuencia de nucleótidos de referencia” o “secuencia de referencia” se refiere a una secuencia de ácido nucleico de partida (p. ej., un RNA, p. ej., una secuencia de mRNA) que se puede optimizar en secuencia. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de ácido nucleico de tipo natural, un fragmento o variante de la misma. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de ácido nucleico previamente optimizada en secuencia.

Transfección repetida: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “transfección repetida” se refiere a la transfección del mismo cultivo celular con un polinucleótido una pluralidad de veces. El cultivo celular se puede transfectar al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces, al menos 15 veces, al menos 16 veces, al menos 17, veces al menos 18 veces, al menos 19 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces, al menos 50 veces o más.

Sales: En algunos aspectos, la composición farmacéutica para suministro intratumoral descrita en el presente documento comprende sales de algunos de sus constituyentes de lípido. El término “sal” incluye cualquier complejo aniónico y catiónico. Ejemplos no limitantes de aniones incluyen aniones inorgánicos y orgánicos, p. ej., fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, oxalato (p. ej., hemioxalato), fosfato, fosfonato, hidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, óxido, carbonato, bicarbonato, nitrato, nitrito, nitruro, bisulfito, sulfuro, sulfito, bisulfato, sulfato, tiosulfato, hidrogenosulfato, borato, formiato, acetato, benzoato, citrato, tartrato, lactato, acrilato, poliacrilato, fumarato, maleato, itaconato, glicolato, gluconato, malato, mandelato, tiglato, ascorbato, salicilato, polimetacrilato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, bromato, hipobromito, yodato, un alquilsulfonato, un arilsulfonato, arsenato, arsenito, cromato, dicromato, cianuro, cianato, tiocianato, hidróxido, peróxido, permanganato y mezclas de los mismos.

Muestra: Como se utiliza en el presente documento, el término “muestra” o “muestra biológica” se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (p. ej., fluidos corporales, que incluyen pero no limitados a sangre, moco, fluido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, fluido vaginal y semen). Una muestra además puede incluir un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción del mismo, que incluye pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Una muestra además se refiere a un medio, tal como un caldo de nutrientes o gel, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o molécula de ácido nucleico.

Secuencia señal: Como se utiliza en el presente documento, las frases “secuencia señal”, “péptido señal” y “péptido de tránsito” se utilizan intercambiablemente y se refieren a una secuencia que puede dirigir el transporte o localización de una proteína a un cierto orgánulo, compartimento celular o exportación extracelular. La expresión abarca tanto el polipéptido de secuencia señal como la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal. De esta manera, las referencias a una secuencia señal en el contexto de un ácido nucleico se refieren de hecho a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de secuencia señal.

Ruta de transducción de señal: Una “ruta de transducción de señal” se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señal que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. Como se utiliza en el presente documento, la frase “receptor de superficie celular” incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula.

Similitud: Como se utiliza en el presente documento, el término “similitud” se refiere a la relación total entre moléculas poliméricas, p. ej. entre moléculas de polinucleótidos (p. ej. moléculas de DNA y/o moléculas de RNA) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que un cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.

Dosis unitaria individual: Como se utiliza en el presente documento, una “dosis unitaria individual” es una dosis de cualquier agente terapéutico administrado en una dosis/en una vez/una sola vía/un solo punto de contacto, es decir, un suceso de administración individual.

Dosis dividida: Como se utiliza en el presente documento, una “dosis dividida” es la división de la dosis unitaria individual o la dosis diaria total en dos o más dosis.

Suministro específico: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “suministro específico”, “suministrar específicamente” o “específicamente suministrando” significa el suministro de más (p. ej., al menos 1.5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido objetivo de interés (p. ej., el hígado de mamífero) comparado con un tejido fuera del objetivo (p. ej., el bazo de mamífero). El nivel de suministro de una nanopartícula a un tejido particular se puede medir comparando la cantidad de proteína producida en un tejido con respecto al peso del tejido, comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con respecto al peso del tejido, comparando la cantidad de proteína producida en tejido con respecto a la cantidad de proteína total en el tejido, o comparando la cantidad de polinucleótido en un tejido con respecto a la cantidad de polinucleótido total en el tejido. Por ejemplo, para la dirección renovascular, un polinucleótido se proporciona específicamente a un riñón del mamífero comparado con el hígado y el bazo si se suministra 1.5, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces o 20 veces más polinucleótido por 1 g de tejido a un riñón comparado con aquel suministrado al hígado o bazo después de la administración sistémica del polinucleótido. Se entenderá que no es necesario determinar la capacidad de una nanopartícula para suministrar específicamente a un tejido objetivo en un sujeto que se está tratando, se puede determinar en un sustituto tal como un modelo de animal (p. ej., un modelo de rata).

Estable: Como se utiliza en el presente documento “estable” se refiere a un compuesto que es suficientemente fuerte para sobrevivir al aislamiento hasta un grado de pureza útil a partir de una mezcla de reacción, y en algunos casos capaz de formulación en un agente terapéutico eficaz.

Estabilizado: Como se utiliza en el presente documento, el término “estabilizar”, “estabilizado”, “región estabilizada” significa hacer o llegar a ser estable.

Estereoisómero: Como se utiliza en el presente documento, el término “estereoisómero” se refiere a todas las posibles formas isoméricas así como conformacionales diferentes que un compuesto puede tener (p. ej., un compuesto de cualquier fórmula descrito en el presente documento), en particular todas las formas estereoquímica y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereoisómeros, enantiómeros y/o confórmeros de la estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente descripción pueden existir en diferentes formas tautoméricas, estando todos estos últimos incluidos dentro del alcance de la presente descripción.

Sujeto: Por “sujeto” o “ individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quién se desea diagnosis, prognosis o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, animales de mascota tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado vacuno, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; osos, animales para alimentación tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervo y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámster y cobayo; y así sucesivamente. En ciertos casos, el mamífero es un sujeto humano. En otros casos, un sujeto es un paciente humano. En un caso particular, un sujeto es un paciente humano que necesita tratamiento.

Sustancialmente: Como se utiliza en el presente documento, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de exhibir extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas entenderá que las características biológicas y químicas raramente, si es que sucede alguna vez, se completan y/o proceden hasta estar completas o logran o evitan un resultado absoluto. El término “sustancialmente” por lo tanto se utiliza en el presente documento para capturar la falta potencial de compleción inherente en muchas características biológicas y químicas.

Sustancialmente igual: Como se utiliza en el presente documento y en relación con diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2%.

Sustancialmente simultáneo: Como se utiliza en el presente documento y en relación con la pluralidad de dosis, el término significa dentro de 2 segundos.

Que sufre: Un individuo quien está “sufriendo” una enfermedad, trastorno y/o afección se le ha diagnosticado o presenta una o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.

Susceptible a: Un individuo que es “susceptible a” una enfermedad, trastorno y/o afección no se le ha diagnosticado y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunos casos, un individuo quien es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (p. ej. cáncer) se puede caracterizar por uno o más de lo siguiente: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección ; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad incrementada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición a y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo quien es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo quien es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

Liberación sostenida: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “liberación sostenida” se refiere a perfil de liberación de composición farmacéutica o compuesto que sigue una velocidad de liberación durante un período de tiempo específico.

Sintético: El término “sintético” significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos u otras moléculas de la presente descripción puede ser química o enzimática.

Células dirigidas: Como se utiliza en el presente documento, “células dirigidas” se refiere a una cualquiera o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, por ejemplo un mamífero, un ser humano, un sujeto o un paciente.

Tejido objetivo: Como se utiliza en el presente documento, “tejido objetivo” se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejidos de interés en el cual el suministro de un polinucleótido daría como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Ejemplos de tejidos objetivo de interés incluyen tejidos, órganos y sistemas específicos o grupos de los mismos. En aplicaciones particulares, un tejido objetivo puede ser un riñón, un pulmón, un bazo, endotelio vascular en vasos (p. ej., intracoronarios o intrafemorales), o tejido de tumor (p. ej., por inyección intratumoral). Un “tejido fuera del objetivo” se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejido en el cual la expresión de la proteína codificada no da como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado. En aplicaciones particulares, los tejidos fuera del objetivo pueden incluir el hígado y el bazo.

La presencia de un agente terapéutico en un tejido fuera del objetivo puede ser el resultado de: (i) la fuga de un polinucleótido desde el sitio de administración al tejido periférico o tejido distante fuera del objetivo (p. ej., el hígado) por difusión o a través de la corriente sanguínea (p. ej., un polinucleótido previsto para expresar un polipéptido en un cierto tejido alcanzaría el hígado y el polipéptido sería expresado en el hígado); o (ii) la fuga de un polipéptido después de la administración de un polinucleótido que codifica tal polipéptido al tejido periférico o tejido distante fuera del objetivo (p. ej., hígado) por difusión o a través de la corriente sanguínea (p. ej., un polinucleótido expresaría un polipéptido en el tejido objetivo, y el polipéptido se difundiría al tejido periférico).

Secuencia dirigida: Como se utiliza en el presente documento, la frase “secuencia dirigida” se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o localización de una proteína o polipéptido.

Extremo: Como se utiliza en el presente documento, los términos “extremos” o “extremo”, cuando se refieren a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Tal extremidad no se limita únicamente al primer sitio o sitio final del péptido o polipéptido sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptido de la descripción se pueden caracterizar por tener tanto un extremo N (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH²)) y un extremo C (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). Las proteínas de la descripción en algunos casos están constituidas por múltiples cadenas de polipéptidos unidas entre sí por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estas clases de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. Alternativamente, los extremos de los polipéptidos se pueden modificar de modo que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptido tal como un conjugado orgánico.

Agente terapéutico: La expresión “agente terapéutico” se refiere a un agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico y/o induce un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Por ejemplo, en algunos casos, un mRNA que codifica un polipéptido de IL12b , polipéptido de IL12A o polipéptidos tanto de IL12B como IL12A puede ser un agente terapéutico.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad de un agente para suministrar (p. ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que sufre o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retardar el inicio de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Resultado terapéuticamente efectivo: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “resultado terapéuticamente efectivo” significa un resultado que es suficiente en un sujeto que sufre o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retardar el inicio de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Dosis diaria total: Como se utiliza en el presente documento, una “dosis diaria total” es una cantidad dada o prescrita en un período de 24 h. La dosis diaria total se puede administrar como una dosis unitaria individual o una dosis dividida.

Factor de transcripción: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “factor de transcripción” se refiere a una proteína de unión de DNA que regula la transcripción del ^dN^aen RNA, por ejemplo, mediante activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción solos, mientras que otros actúan de acuerdo con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede tanto activar como reprimir la transcripción en ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias objetivo específicas altamente similares a una secuencia de consenso específica en una región reguladora de un gen objetivo. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen objetivo solo o en un complejo con otras moléculas.

Transcripción: Como se utiliza en el presente documento, el término “transcripción” se refiere a métodos para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula. Los métodos de transfección incluyen, pero no están limitados a, métodos químicos, tratamientos físicos y lípidos catiónicos o mezclas.

Transfección: Como se utiliza en el presente documento, “transfección” se refiere a la introducción de un polinucleótido en una célula en donde un polipéptido codificado por el polinucleótido se expresa (p. ej., mRNA) o el polipéptido modula una función celular (p. ej., siRNA, miRNA). Como se utiliza en el presente documento, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un polinucleótido (p. ej., un mRNA) en un polipéptido o proteína y/o modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Tratar, tratamiento, terapia: Como se utiliza en el presente documento, el término “tratar” o “tratamiento” o “terapia” se refiere a aliviar, mejorar, recuperarse, mitigar parcial o completamente, retardar el inicio de, inhibir la progresión de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, p. ej., porfiria intermitente aguda. Por ejemplo, “tratar” la porfiria intermitente aguda puede referirse a la disminución de síntomas asociados con la enfermedad, prolongar la duración de la vida (incrementar la tasa de supervivencia) de los pacientes, reducir la gravedad de la enfermedad, prevenir o retardar el inicio de la enfermedad, etc. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que presenta únicamente signos tempranos de una enfermedad, trastorno y/o afección para el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección.

No modificado: Como se utiliza en el presente documento, “no modificado” se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiada de alguna manera. No modificado, puede referirse, pero no siempre, a la forma de tipo natural o nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden someterse a una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida “no modificada” para una modificación subsecuente.

Uracilo: El uracilo es una de las cuatro nucleobases en el ácido nucleico de RNA, y se representa por la letra U. El uracilo se puede unir a un anillo de ribosa, o más específicamente, una ribofuranosa por un enlace p-Niglicosídico para dar el nucleósido uridina. El nucleósido uridina también se abrevia comúnmente de acuerdo con el código de una letra de su nucleobase, es decir, U. De esta manera, en el contexto de la presente descripción, cuando un monómero en una secuencia de polinucleótido es U, tal U se designa intercambiablemente como un “uracilo” o una “uridina”.

Contenido de uridina: Las expresiones “contenido de uridina” o “contenido de uracilo” son intercambiables y se refieren a la cantidad de uracilo o uridina presente en una cierta secuencia de ácido nucleico. El contenido de uridina o contenido de uracilo se puede expresar como un valor absoluto (número total de uridina o uracilo en la secuencia) o relativo (porcentaje de uridina o uracilo con respecto al número total de nucleobases en la secuencia de ácido nucleico).

Secuencia modificada en uridina: Las expresiones “secuencia modificada en uridina” se refieren a un ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., una secuencia mRNA sintética) con un contenido diferente de uridina total o local (contenido de uridina más alto o más bajo) o con diferentes patrones de uridina (p. ej., distribución de gradiente o agrupación) con respecto al contenido de uridina y/o patrones de uridina de una secuencia de ácido nucleico candidata. En el contenido de la presente descripción, las expresiones “secuencia modificada en uridina” y “secuencia modificada en uracilo” se consideran equivalentes e intercambiables.

Un “codón alto en uridina” se define como un codón que comprende dos o tres uridinas, un “codón bajo en uridina” se define como un codón que comprende una uridina, y un “codón sin uridina” es un codón sin ninguna uridina. En algunos casos, una secuencia modificada en uridina comprende sustituciones de codones altos en uridina por codones bajos en uridina, sustituciones de codones altos en uridina por codones sin uridina, sustituciones de codones bajos en uridina por codones altos en uridina, sustituciones de codones bajos en uridina por codones sin uridina, sustitución de codones sin uridina por codones bajos en uridina, sustituciones de codones sin uridina por codones altos en uridina, y combinaciones de los mismos. En algunos casos, un codón alto en uridina se puede reemplazar con otro codón alto en uridina. En algunos casos, un codón bajo en uridina se puede reemplazar con otro codón bajo en uridina. En algunos casos, un codón sin uridina se puede reemplazar con otro codón sin uridina. Una secuencia modificada en uridina puede estar enriquecida en uridina o rarificada en uridina.

Enriquecido en uridina: Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “enriquecido en uridina” y variantes gramaticales se refieren al incremento del contenido de uridina (expresado en el valor absoluto o como un valor en porcentaje) en un ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., una secuencia de mRNA sintética) con respecto al contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico candidata, correspondiente. El enriquecimiento en uridina se puede implementar sustituyendo codones en la secuencia de ácido nucleico candidata por codones sinónimos que contienen menos nucleobases uridina. El enriquecimiento en uridina puede ser global (es decir, con respecto a la longitud completa de una secuencia de ácido nucleico candidata) o local (es decir, con respecto a una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico candidata).

Rarificado en uridina: Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “rarificado en uridina” y variantes gramaticales se refieren a una disminución en el contenido de uridina (expresado en el valor absoluto o como un valor en porcentaje) en un ácido nucleico optimizado en secuencia (p. ej., una secuencia de mRNA sintética) con respecto al contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico candidata, correspondiente. La rarificación en uridina se puede implementar sustituyendo codones en la secuencia de ácido nucleico candidata por codones sinónimos que contienen menos nucleobases uridina. La rarificación en uridina puede ser global (es decir, con respecto a la longitud completa de una secuencia de ácido nucleico candidata) o local (es decir, con respecto a una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico candidata).

Variante: El término variante como se utiliza en la presente descripción se refiere a variantes tanto naturales (p. ej., polimorfismos, isoformas, etc.) como variantes artificiales en las cuales al menos un resto de aminoácido en una secuencia nativa o de partida (p. ej., una secuencia de tipo natural) se ha eliminado y se ha insertado un aminoácido diferente en su lugar en la misma posición. Estas variantes se pueden describir como “variantes de sustitución”. Las sustituciones pueden ser individuales, donde únicamente un aminoácido en la molécula se ha sustituido, o pueden ser múltiples, donde dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula. Si se insertan o eliminan aminoácidos, la variante resultante sería una “variante de inserción” o una “variante de eliminación” respectivamente.

En las reivindicaciones, artículos tales como “un”, “una” y “el”, “la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran conformes si es uno, más de uno, o todos los miembros del grupo que están presentes en, son empleados en o relevantes de otra manera para un producto o procedimiento dado a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente del contexto. La descripción incluye casos en los cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, es empleado en, o de otra manera relevante para un producto o procedimiento dado. La descripción incluye casos en los cuales más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, son empleados en, o de otra manera relevantes para un producto o procedimiento dado.

También se observa que el término “que comprende” se propone para ser abierto y permite pero no requiere la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando el término “que comprende” se utiliza en el presente documento, el término “que consiste en” también está así abarcado y descrito.

Donde se dan intervalos, se incluyen los puntos de los extremos. Además, debe entenderse que a menos que se indique de otra manera o sea evidente de otro modo a partir del contexto y entienda un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en diferentes aspectos de la descripción, a la décima de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: Eficacia antitumoral in vivo del mRNA modificado de IL12 en un modelo singénico de adenocarcinoma de colon (MC38) (administración intravenosa)

Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de mRNA de IL12, administrado como una sola dosis intravenosa (IV) en ratones que llevan tumores de adenocarcinoma M38.

A. Preparación del mRNA modificado de IL12 y el control

Se preparó un polinucleótido (mRNA) que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica un polipéptido de IL12 murino de tipo natural (IL12 murino) y un sitio de unión de miRNA (miR-122) en su 3' UTR (mIL12_miR122) (secuencia expuesta a continuación).

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El elemento de unión de miR-122 se incorporó para disminuir la producción de proteína del hígado. También se preparó un mRNA de control negativo (versión no traducible de mRNA), p. ej., NST-FIX. Los mRNA se modificaron completamente con N1-metilpseudouridina. Ambos mRNA modificados se formularon en nanopartículas de lípidos de MC3 (LNP).

B. Modelo de ratón de adenocarcinoma de colon MC-38

Los tumores de adenocarcinoma de colon MC-38 se implantaron por vía subcutánea en ratones como se describe en Rosenberg et al., Science 233: 1318-1321 (1986)).

Once días después de la implantación del tumor, se administró a dos grupos de animales una sola dosis intravenosa de mRNA modificado de IL12 formulado en LNP (en una dosis de ya sea 0.1 mg/kg (Grupo 4) o 0.05 mg/kg (Grupo 5). Dos grupos de animales de control se trataron con dosis equivalentes de mRNA de control negativo (LNP de NST-FIX) (Grupo 7 y Grupo 8), PBS (Grupo 1) o proteína IL12 murina recombinante, 1 |ig (Grupo 2).

El volumen del tumor se midió utilizando calibradores manuales. El volumen del tumor medio al día 24 (Fig. 5) se registró en milímetros cúbicos (mm3).

C. Resultados

La administración intravenosa de mRNA de IL12 murino dio como resultado niveles de IL12 (FIG. 2A) e IPN^y(FIG. 2B) en el plasma dependientes de la dosis y AUC incrementada de IL12 e IPNy (Tabla 8), cada uno de los cuales fueron más altos que los niveles después de la administración de una cantidad comparable de proteína IL12 recombinante mediante inyección intraperitoneal (FIGS. 2A-2B).

^

Los números entre paréntesis indican el incremento de x-veces para el mRNA sobre la proteína.

La FIG. 3 representa la eficacia robusta de una sola dosis intravenosa (IV) de mRNA de IL12 murino en nanopartícula de lípido (LNP), en dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4) y 0.05 mg/kg (Grupo 5) (indicado por las líneas con los triángulos invertidos) comparado con los Grupos 1 (PBS), 2 (proteína IL12) 7 y 8 (controles de NST-FIX, 0.1 mg/kg y 0.05 mg/kg, respectivamente).

Las FIGS. 4A-4F representan el volumen de tumor medio y el número de respuestas completas (CR) observadas después de la administración de una sola dosis intravenosa (IV) de: mRNA de IL12 murino en nanopartícula de lípido (LNP), en dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4)(FIG. 4F) y 0.05 mg/kg (Grupo 5)(FIG. 4E), PBS (Grupo 1)(FIG. 4^a), proteína IL12 (Grupo 2)(FIG. 4D), controles de NST-FIX, 0.1 mg/kg y 0.05 mg/kg (Grupos 7 y 8, respectivamente) (FIGS. 4C y 4B, respectivamente). Las respuestas completas (CR) se muestran en las FIGS. 4E y 4F únicamente. La FIG. 4E muestra que 6 de 8 CR (es decir, 75% de CR) se observaron en el Grupo 5 (mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP), en una dosis de 0.05 mg/kg). La FIG. 4F muestra que 5 de 9 CR (es decir, 56% de CR) se observaron en el Grupo 4 (mRNA de IL12 en nanopartícula de lípido (LNP) en una dosis de 0.1 mg/kg). Aparte de los grupos de mRNA de IL12, ningún otro grupo observó ninguna CR.

La FIG. 5 representa el beneficio de supervivencia el día 47 postimplantación de tumor de una sola dosis intravenosa (IV) de mRNA de IL12 murino en nanopartícula de lípido (LNP) en una dosis de 0.05 mg/kg (Grupo 5) y en una dosis de 0.1 mg/kg (Grupo 4).

En particular, las FIGS. 3-5 demuestran la ventaja de la administración intravenosa de mRNA de IL12 murino sobre la proteína en términos de la farmacocinética (PK), farmacodinámica (PD) y eficacia terapéutica mejoradas, con una sola dosis IV.

La Tabla 9 representa la ventaja de tolerabilidad de la administración local (intratumoral) del mRNA de IL12 sobre la administración sistémica (intravenosa). Nueve (9) de 10 ratones que recibieron por vía intratumoral mRNA de IL12 fueron viables el día 20 comparado con 3 de 12 ratones que recibieron por vía intravenosa mRNA de IL12.

Tabla 9: Tolerabilidad intravenosa e intratumoral de la administración de IL12 murina

Ejemplo 2: Eficacia antitumoral in vivo de mRNA modificado de IL12 murino en un modelo de adenocarcinoma de colon (MC38) (administración intratumoral)

Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de mRNA de IL12 murino, administrado por vía intratumoral en ratones que llevan tumores de adenocarcinoma M38.

A. Preparación del mRNA modificado de IL12 y el control

Se preparó el polinucleótido mIL12_miR122 como se describe en el Ejemplo 1. También se preparó un mRNA de control negativo, mRNA de NST-FIX. Ambos mRNA modificados se formularon en nanopartículas de lípidos (LNP) MC3 como se describe en el Ejemplo 1.

B. Modelo de ratón de adenocarcinoma de colon MC-38

Once días después de la implantación del tumor, los animales recibieron una sola dosis intratumoral de mRNA modificado de IL12 murino formulado en LNP de MC3 (4 ug de mRNA por dosis). Dos grupos de animales de control se trataron con una dosis equivalente y el régimen de mRNA de control negativo (NST-FIX LNP) o PBS.

El volumen del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados en la FIG. 6B utilizando calibradores manuales. El volumen de tumor medio el día 24 (FIG. 6A) y el volumen de tumor individual el día 47 (FIG. 6B) se registraron en milímetros cúbicos (mm3). Los puntos finales en el estudio fueron ya sea la muerte del animal o un volumen de tumor que alcanza 1500 mm3.

C. Resultados

La FIG. 6A muestra que el volumen de tumor medio se redujo cuando se administró mRNA modificado de IL12 murino formulado en LNP de MC3. En contraste, la administración de un mRNA modificado de control (NST-FIX) o PBS a los ratones tuvo poco efecto en la reducción del volumen de tumor medio cuando se evaluó hasta el día 24.

La FIG. 6B muestra que la administración de aproximadamente 4 |ig de mRNA modificado de IL12 murino formulado en LNP de MC3 por animal a los ratones disminuyó los volúmenes de tumor individuales en algunos animales comparado con los animales que recibieron el mRNA modificado de control (NST-FIX) o PBS. Las respuestas completas (CR) se observaron en 3 de 7 animales (44%), con 3 animales retirados debido a ulceración. Estos datos muestran que los polinucleótidos mIL12_miR122 tienen eficacia antitumoral cuando se administran por vía intratumoral in vivo.

Ejemplo 3: Eficacia antitumoral in vivo del mRNA modificado de IL12 en un modelo singénico de linfoma de células B (A20)

Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de mRNA de IL12 murino, administrado por vía intratumoral en ratones que llevan tumores de linfoma de célula B A20.

A. Preparación de mRNA modificados del IL12 y controles

Se preparó un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en codones que codifica un polipéptido de IL12 (IL12 murina) sin un sitio de unión a miRNA (miRless) (IL12 miRless) (secuencia expuesta a continuación).

GGGAAAÜAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAÜAAGAGCCACCAUGUG U C C U C A G A A G C U A A C C A U C U C C U G G U U U G C C A U C G U U U U G C U G G U G U C U C C A C U C A U G G C C A U G U G G G A G C U G G A G A A A G A C G U U U A U G U U G U A G A G G U G G A C U G G A C U C C C G A U G C C C C U G G A G A A A C A G U G A A C C U C A C C U G U G A C A C G C C U G A A G A A G A U G A C A U C A C C U G G A C C U C A G A C C A G A G A C A U G G A G U C A U A G G C U C U G G A A A G A C C C U G A C C A U C A C U G U C A A A G A G U U C C U A G A U G C U G G C C A G U A C A C C U G C C A C A A A G G A G G C G A G A C U C U G A G C C A C U C A C A U C U G C U G C U C C A C A A G A A G G A A A A U G G A A U U U G G U C C A C U G A A A U U U U A A A A A A U U U C A A A A A C A A G A C U U U C C U G A A G U G U G A A G C A C C A A A U U A C U C C G G A C G G U U C A C G U G C U C A U G G C U G G U G C A A A G A A A C A U G G A C U U G A A G U U C A A C A U C A A G A G C A G U A G C A G U U C C C C U G A C U C U C G G G C A G U G A C A U G U G G A A U G G C G U C U C U G U C U G C A G A G A A G G U C A C A C U G G A C C A A A G G G A C U A U G A G A A G U A U UC A G U G U C C U G C C A G G A G G A U G U C A C C U G C C C A A C U G C C G A G G A G A C C C U G C C C A U U G A A C U G G C G U U G G A A G C A C G G C A G C A G A A U A A A U A U G A G A A C U A C A G C A C C A G C U U C U U C A U C A G G G A C A U C A U C A A A C C A G A C C C G C C C A A G A A C U U G C A G A U G A A G C C U U U G A A G A A C U C A C A G G U G G A G G U C A G C U G G G A G U A C C C U G A C U C C U G G A G C A C U C C C C A U U C C U A C U U C U C C C U C A A G U U C U U U G U U C G A A U C C A G C G C A A G A A A G A A A A G A U G A A G G A G A C A G A G G A G G G G U G U A A C C A G A A A G G U G C G U U C C U C G U A G A G A A G A C A U C U A C C G A A G U C C A A U G C A A A G G C G G G A A U G U C U G C G U G C A A G C U C A G G A U C G C U A U U A C A A U U C C U C A U G C A G C A A G U G G G C A U G U G U U C C C U G C A G G G U C C G A U C C G G A G G C G G A G G G A G C G G A G G C G G A G G G A G C G G A G G C G G A G G G A G C A G G G U C A U U C C A G U C U C U G G A C C U G C C A G G U G U C U U A G C C A G U C C C G A A A C C U G C U G A A G A C C A C A G A U G A C A U G G U G A A G A C G G C C A G A G A A A A A C U G A A A C A U U A U U C C T J GC A C U G C U G A A G A C A U C G A U C A U G A A G A C A U C A C A C G G G A C C A A A C C A G C A C A U U G A A G A C C U G U U U A C C A C U G G A A C U A C A C A A G A A C G A G A G U U G C C U G G C U A C U A G A G A G A C U U C U U C C A C A A C A A G A G G G A G C U G C C U G C C C C C A C A G A A G A C G U C U U U G A U G A U G A C C C U G U GC C U U G G U A G C A U C U A U G A G G A C U U G A A G A U G U A C C A G A C A G A G U U C C A G G C C A U C A A C G C A G C A C U U C A G A A U C A C A A C C A U C A G C A G A U C A U U U U A G A C A A G G G C A U G C U G G U G G C C A U C G A U G A G C U G A U G C A G U C U C U G A A U C A U A A U G G C G A G A C U C U GC GC C A G A A A C C U C C U G U G G G A G A A G C A G A C C C U U A C A G A G U G A A A A U G A A G C U C U G C A U C C U G C U U C A C G C C U U C A G C A C C C G C G U C G U G A C C A U C A A C A G G G U G A U G G G C U A U C U G A G C U C C G C C U G A U A A U A G G C U G G A G C C U C G G U G G C C A U G C U U C U U G C C C C U U G G G C C U C C C C C C A G C C C C U C C U C C C C U U C C U G C A C C C G U A C C C C C G U G G U C U U U G A A U A A A G U C U G A G U G G G C G G C (SEQ ID N O : 242)

Se preparó el polinucleótido mIL12_miR122 como se describe en el Ejemplo 1. También se preparó un mRNA de control negativo (NST) (versión no traducible del mismo mRNA) (ⁿS^tIL12_miRless). Todos los mRNA modificados se formularon en nanopartículas de lípido (LNP) de MC3 como se describe en el Ejemplo 1. B. Modelo de tumor de linfoma de células B A20

Los modelos de ratón de linfoma de células B utilizando la línea celular A20 son útiles para analizar tumores. (Kim et al., Journal of Immunology 122:549-554 (1979); Donnou et al., Advances in Hematology 2012:701704 (2012)). Las células A20 se obtienen de un linfoma de células B de un ratón BALB/c y se cultivan típicamente en ratones singénicos como un implante subcutáneo. Se implantaron 500000 células A20 por vía subcutánea en ratones BALB/c para generar tumores subcutáneos. Se vigiló en los tumores el tamaño y palpabilidad. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3, los ratones se agruparon en tres grupos. Un grupo de ensayo recibió por vía intratumoral mIL12_miRless en nanopartículas de lípidos (LNP) basadas en MC3 en una dosis de 5 |ig de mRNA por animal. El segundo grupo de ensayo recibió por vía intratumoral mIL12_miR122 en nanopartículas de lípido (LNP) basadas en MC3 en una dosis de 5 |ig de mRNA por animal. El grupo de control recibió una dosis equivalente de mRNA de control no traducido (NST). Los animales recibieron la dosis el día 10 postimplantación. Los resultados se muestran en las FIGS. 7A-7C.

El estudio se llevó a cabo hasta el día 50 de postimplantación. Los puntos finales en el estudio fueron ya sea la muerte del animal o un punto final predeterminado de volumen de tumor de 2000 mm3.

C. Resultados

La FIG. 7A muestra que el volumen de tumor (medido en mm3) se incrementó a lo largo del tiempo en los 12 animales tratados con 5 |ig de mRNA de NST de control. La FIG. 7B muestra que el volumen de tumor disminuyó a lo largo del tiempo en algunos animales tratados con mIL12_miRless comparado con los animales que recibieron mRNA de control (NST). Las respuestas completas (CR) se observaron en 5 de 12 animales (42%). Por lo tanto, la administración intratumoral de mRNA de IL12 de murino es eficaz en el modelo de tumor A20.

La FIG. 7C muestra cambios en el volumen de tumor en animales tratados con 5 |ig de mIL12-miR122 (FIG.

7C). Las respuestas completas (CR) se lograron en 6 de 12 ratones en el grupo de IL12-miR122 (FIG. 7C). Los datos en las FIGS. 7A-7C muestran que los polinucleótidos mIL12_miRless y mIL12-miRI22 tienen eficacia antitumoral comparable cuando se administran por vía intratumoral in vivo.

Ejemplo 4: Eficacia antitumoral in vivo con una sola y múltiples dosis de un mRNA de IL12 modificado La eficacia antitumoral in vivo de un mRNA de IL12 murina modificado, administrado como una sola dosis de 0.5 |ig y un múltiple dosis (0.5 |ig durante 7 días x 6) se estudió en ratones BALB/C que llevan tumores de linfoma de células B A20.

A. mRNA de IL12 modificado

Se prepararon el polinucleótido mIL12_miR122 y el polinucleótido mIL12_miRless como se describe en los Ejemplos 1 y 3, respectivamente. Un grupo de mRNA de mIL12_miR122 se formuló en nanopartículas de lípido (LNP) basadas en MC3 como se describe en el Ejemplo 1. Otro grupo de mRNA de mIL12_miR122 se formuló en nanopartículas de lípido (LNP) basadas en el Compuesto 18.

B. Posología

El día 10 postimplantación, dos grupos de ratones que llevaban tumores A20 (n=12 en cada grupo) recibieron una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino en la forma de mRNA de IL12 miRless o IL12 miR122 en LNP basadas en MC3.

También el día 10 postimplantación, otro grupo de ratones que llevaban tumores A20 recibieron por vía intratumoral dosis semanales de 0.5 |ig de mRNA de IL12 miR122 en LNP basadas en MC3 durante 7 días x 6.

También el día 10 postimplantación, otro grupo de ratones que llevaban tumores A20 recibieron por vía intratumoral dosis semanales de 0.5 |ig de mRNA de IL12 miR122 en LNP basadas en el Compuesto 18 durante 7 días x 6.

Finalmente, 10 días postimplantación, otro grupo de ratones que llevaban tumores A20 (n=12 por grupo) recibieron dosis semanales de 0.5 |ig de mRNA de control negativo no traducido (NST) ya sea en LNP basadas en MC3 o LNP basadas en el Compuesto 18 durante 7 días x 6.

C. Resultados

Como se muestra en las FIGS. 8A-8B, la eficacia antitumoral in vivo en un modelo de tumor de linfoma de células B (A20) se logró después de que los ratones que llevaban tumores A20 recibieran una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murina en nanopartículas de lípido (LNP) basadas en MC3. La FIG. 8A representa el volumen de tumor disminuido en algunos ratones que recibieron IL12 miRless (0.5 |ig), y que se lograron cuatro (4) respuestas completas (CR). La FIG. 8B representa el volumen de tumor disminuido en algunos ratones que recibieron IL12 miR122 (0.5 |ig) y que se lograron tres (3) respuestas completas (CR).

Como se muestra en la FIG. 8C, la eficacia antitumoral in vivo aumentó con una pauta de administración semanal de mRNA de IL12 miR122 en LNP basadas en MC3 (0.5 |ig de mRNA durante 7 días x 6), comparado con una sola dosis (ver la FIG. 8B). La FIG. 8C muestra que se lograron cinco (5) CR en los 12 ratones que llevaban A20 que recibieron dosis semanales de 0.5 |ig de mRNA de IL12 miR122 durante siete (7) días x 6.

La eficacia antitumoral in vivo de mRNA de IL12 en LNP de Compuesto 18 aumentó comparado con la eficacia tumoral in vivo de mRNA de IL12 en LNP de MC3, como se puede observar por el retardo en el crecimiento de tumor (FIG. 8D). La FIG. 8D muestra los volúmenes de tumor individuales para 12 ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 murina en LNP basadas en compuesto 18 durante 7 días x 6. Las respuestas completas (CR) también se lograron en 5 de 12 animales.

Como se muestra en las FIGS. 8E-8F, el crecimiento de tumor se observó en ratones que llevaban tumores A20 que recibieron dosis semanales (7 días x 6) de 0.5 |ig de mRNA de control negativo no traducido (NST) en nanopartículas de lípido (LNP) basadas en MC3 (FIG. 8E) y 0.5 |ig de NST en LNP basadas en Compuesto 18 (FIG. 8F).

Estos datos muestran que los polinucleótidos que comprenden mRNA de IL12 murino modificado (tanto miR122 como miRless) muestran eficacia antitumoral en bajas dosis (0.5 |ig). También muestran que la eficacia antitumoral in vivo puede ser aumentada potencialmente con una pauta de administración múltiple. Finalmente, los datos muestran la eficacia antitumoral in vivo cuando 0.5 |ig de mRNA de IL12 miR122 en LNP basadas en MC3 y basadas en Compuesto 18 se administran por vía intratumoral semanalmente (durante 7 días x 6). En contraste, el crecimiento del tumor se observó en ratones que llevaban tumores A20 que recibieron dosis semanales (7 días x 6) de 0.5 |ig de mRNA de control negativo no traducido (NST) en nanopartícula de lípido (LNP) basada en MC3 y en LNP basada en Compuesto 18.

Ejemplo 5: Análisis de niveles de IL12 p70, IFNy, IP10, IL6, GCSF y GROa en el plasma y tumores de ratones que llevan A20 después de la administración de mRNA de IL12 murino

El día 10 de postimplantación, los grupos de ratones que llevaban tumores A20 (n=12 en cada grupo) recibieron una dosis de mRNA de miR122 IL12 (de 5 |ig, 2.5 |ig o 0.5 |ig) en LNP basadas en MC3 o LNP basadas en Compuesto 18, NST o proteína IL12 en las mismas dosis o PBS.

Los niveles de IL12 p70 del tumor y del plasma, así como el nivel de otras citosinas se determinó a las 6 y 24 horas después de la administración de las dosis. Los niveles de IL12 (p70) se determinaron utilizando un kit comercial de ELISA de tipo sándwich (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). Los niveles de IFN^y, IP10, IL6, G-CSF y GROa también se determinaron.

Resultados: las FIGS. 9A-9B muestran los niveles dependientes de dosis de IL12 en el plasma (FIG. 9A) y el tumor (FIG. 9B) a las 6 horas y 24 horas después de la administración de las dosis indicadas de mRNA de iL l 2 murina en una LNP basada en MC3 a ratones que llevaban tumores A20.

Las FIGS. 9C-9D muestran niveles elevados de IL12 en el plasma y el tumor después de la administración de las dosis indicadas de mRNA de IL12 murina en LNP basadas en Compuesto 18 comparado con mRNA de IL12 murina en LNP basadas en MC3. La FIG. 9C muestra los niveles de IL12 en el plasma a las 6 horas y 24 horas; la FIG. 9D muestra los niveles de IL12 en el tumor a las 6 horas y 24 horas. La Tabla 10 muestra el incremento en veces de IL12 en el plasma y el tumor después de la administración de mRNA de IL12 murina (6 horas y 24 horas).

Tabla 10: In r m n n v IL12 r l m 1 m r n MC3

___________

Las FIGS. 9E-9F muestran niveles incrementados de IFN^ya las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9E) y en el tumor (FIG. 9F) después de la administración de mRNA de IL12 murino a ratones que llevaban tumores A20.

Las FIGS. 9G-9H muestran niveles incrementados de IP10 a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9G) y en el tumor (FIG. 9H) después de la administración de mRNA de IL12 murino a ratones que llevaban tumores A20.

Las FIGS. 9I-9J muestran niveles disminuidos de IL6 a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 91) y en el tumor (FIG. 9J) después de la administración de mRNA de IL12 murino en LNP basada en Compuesto 18 comparado con mRNA de IL12 murino en LNP basada en MC3.

Las FIGS. 9K-9L muestran niveles disminuidos de G-CSF a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9K) y en el tumor (FIG. 9L) después de la administración de mRNA de IL12 murino en LNP basada en Compuesto 18 comparado con mRNA de IL12 murino en LNP basada en MC3.

Las FIGS. 9M-9N muestran niveles disminuidos de GROa a las 6 horas y 24 horas en el plasma (FIG. 9M) y en el tumor (FIG. 9N) después de la administración de mRNA de IL12 murino en LNP basada en Compuesto 18 comparado con mRNA de IL12 murino en LNP basada en MC3.

Los datos en este ejemplo muestran niveles dependientes de la dosis de IL12 en el plasma y el tumor con administración intratumoral de mRNA de IL12 murino (FIGS. 9A y 9B). Los datos también muestran niveles de IL12 incrementados en el plasma y en el tumor a partir de las LNP basadas en Compuesto 18 comparado con LNP basadas en MC3 (FIGS. 9C y 9D), así como niveles incrementados de IFNy e IP10, atribuibles a la administración de mRNA de IL12 murina (FIGS. 9E-9H). Finalmente, este ejemplo muestra niveles disminuidos de IL6, G-CSF y GROa en el plasma y en el tumor con el mRNA de IL12 murino formulado con el Compuesto 18 comparado con el mRNA de IL12 murino formulado con MC3 (FIGS. 9I-9N).

Ejemplo 6: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intravenosa (IV) de mRNA de IL12_miR122 en un modelo de A20 subcutáneo

A. Diseño del Estudio

500000 células A20 se implantaron por vía subcutánea en ratones BALB/c. Los ratones que llevaban el tumor A20 se agruparon en 2 grupos de tratamiento (N=10) cuando los promedios del tumor alcanzaron aproximadamente ~100 mm3. Los ratones recibieron vía IV 0.5 mg/kg de mRNA murino en una LNP que contiene Compuesto 18-PEG cada 7 días (Cada 7D).

El grupo de control se trató con mRNA de control negativo formulado en LNP, mientras que el grupo de tratamiento recibió LNP que contienen mRNA de IL12 murino con un elemento de unión de miR122 en la 3' UTR. El uso de la LNP que contiene el Compuesto 18 y la incorporación del elemento de unión de miR122 se propusieron para mitigar la potencial producción de proteína del hígado.

Los volúmenes de tumor y pesos corporales se midieron dos veces a la semana, y las observaciones clínicas generales se hicieron de acuerdo con un protocolo de IACUC aceptado hasta que se alcanzó un punto final predeterminado de volumen de tumor de 2000 mm3.

B. Datos de Eficacia

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con dosis semanales de mRNA de IL12 murino más un elemento de unión de miR122 formulado en una LNP que contiene Compuesto 18-PEG se muestran en la FIG. 10B comparado con controles negativos apropiados en la FIG. 10A. Los días de administración se indican por líneas discontinuas rojas verticales y el punto final predeterminado del volumen de tumor de 2000 mm3 se indica por líneas discontinuas negras horizontales.

C. Evaluación de efectos secundarios/toxicidad

Los pesos corporales individuales de los ratones tratados con dosis semanal de mRNA de IL12 murino más un elemento de unión de miR122 formulado en una LNP que contiene Compuesto 18-PEG se muestran en la FIG.

10D comparado con los controles negativos apropiados en la FIG. 10C.

D. Conclusión

La administración intravenosa de mRNA de IL12 murino retardó el crecimiento de tumores A20 comparado con el control negativo apropiado (es decir, el tratamiento IV de mRNA idénticamente formulado con un elemento de unión de miR122 que no tenía los codones de inicio “NST”). La dosis eficaz de 0.5 mg/kg cada 7D fue bien tolerada como se determinó por las observaciones clínicas generales y más cuantitativamente por las mediciones de peso corporal.

Ejemplo 7: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intraperitoneal (IP) de mRNA modificado de IL12 murino en un modelo IP de MC38

A. Diseño del estudio

El gen indicador de luciferasa se integró dentro de la línea celular de colon MC-38 para permitir la medición de bioluminiscencia de estas células si se cultivan en un contexto que la carga de tumor no pudiera ser evaluada por el calibrador en animales vivos. La producción de luz de estas células se ha relacionado con la carga de tumor.

500000 células habilitadas con luciferasa MC-38 (MC38-luc) se inocularon en la cavidad peritoneal como un modelo de metástasis de cáncer de colon en este espacio. Los ratones se asignaron a varios grupos de tratamiento basados en la señal bioluminiscente, y el tratamiento se inició 7 días después de inducción de la enfermedad.

Los ratones se trataron con una sola dosis intraperitoneal (IP) de mRNA murino formulado en una LNP (MC3:colesterol:DSPC:PEG-DMGat % en moles de 50:38.5:10:1.5) y se comparó con una sola dosis IP de 1 |ig de proteína IL12 de ratón recombinante. Una sola dosis de 2 niveles de dosis fijas de mRNA (2 |ig y 4 |ig) se administraron el día 7 después de inducción de la enfermedad, y los mRNA de IL12 murinos con y sin un elemento de unión de miR122 se evaluaron en diferentes grupos de tratamiento comparados con los controles negativos apropiados (mRNA sin NST de inicio con un elemento de unión de miR122 encapsulado en una LNP idénticamente formulada).

Los volúmenes de tumor y pesos corporales se midieron frecuentemente, y las observaciones clínicas generales se hicieron de acuerdo con los protocolos de IACUC apropiados.

B. Datos de eficacia

La bioluminiscencia (BL) se utilizó como un sustituto para la carga de tumor y se midió en varios días que incluyen el día 22 después de inducción de enfermedad como se representa en la FIG. 11A. Los grupos de tratamiento y niveles de dosis se indican en las FIGS. 11B. Los ratones recibieron no tratamiento, 2 |ig de mIL12_miRless, 2 |ig de mIL12_miR122, 2 |ig de NST_OX40L_122, 4 |ig de mIL12_miRless, 4 |ig de mIL12_miR122, 4 |ig de NST_OX40L_122 y 1 |ig de rm IL12. Los ratones tratados con mRNA de IL12 murino en todos los brazos presentaron menor señal de BL que los controles negativos.

C. Evaluación de efectos secundarios/toxicidad:

Los tratamientos generalmente fueron bien tolerados, y los grupos sin tratamiento presentaron un promedio de pérdida de peso corporal por encima de 10% (FIG. 11B).

D. Conclusión

Como se muestra en las FIGS. 11A y 11B, los ratones tratados hasta 150 días postimplantación con ambas dosis fijas de mRNA de IL12 murino presentaron niveles inferiores de señal de B^lcomo una medición de la carga de tumor comparada con los controles negativos, y este nivel de BL inhibido se asoció con un beneficio de supervivencia aparente del mRNA de IL12 murino administrado vía intraperitoneal. El mRNA de IL12 murino que contenía un dominio de unión de miR122 dentro de la 3' UTR presentó eficacia similar al mRNA sin este elemento regulador (miR-less). Las dosis efectivas empleadas se consideraron bien toleradas generalmente.

Los ratones tratados con dosis fijas de mRNA de IL12 murino presentaron niveles inferiores de señal de BL como una medida de la carga de tumor comparada con los controles negativos, y esto inhibió el nivel de BL que se asoció con un beneficio de supervivencia aparente del mRNA de IL12 murino administrado por vía intraperitoneal.

Ejemplo 8: Análisis de los niveles de IL12 e IFN^yen ratones después de la administración de mRNA de IL12 murino

Los ratones que llevaban tumores MC38 recibieron una o más dosis de mRNA de IL12 miR122 murino en LNP basada en Compuesto 18 estándar por vía intratumoral (iTu). En particular, a los ratones se les proporcionó una sola dosis intratumoral (iTu) de mRNA de IL12 miR122 murino (de 0.05 |ig, 0.5 |ig o 5.0 |ig) en LNP, múltiples dosis iTu (4x) de mRNA de IL12 miR122 murino en los mismos niveles, o 5.0 |ig de NST como un control.

Los niveles de IL12 e IPN^ydel plasma se determinaron a las 24 horas después de la administración de las dosis. Los niveles de IL12 e IPNy se determinaron utilizando un panel multiplexado basado en Luminex (panel 1A ProcartaPlex 36-Plex de citocina y quimiocina de ratón, Affymetrix eBioscience).

La FIG. 17A muestra los niveles dependientes de la dosis de IL12 en el plasma a las 24 horas después de la administración de las dosis indicadas de mRNA de IL12 murino a ratones que llevaban tumores. La concentración en el plasma de IL12 (ng/ml) se muestra a continuación en la Tabla 11.

Tabla 11. Niveles de proteína IL12 en el plasma (ng/ml)

^{Dosis Ü 1a Ü 2a ■ | 3a}

_{| 5 ug de NST Ü 0.007 ± 0.0008} ^{110.001 ± 0.0012} ■ 1 _{0.006 ± n/a} ^■ I....

0.05 ug de IL12_122 | | 0.320 ± 0.117 | | 0.165 ± 0.095 ■ | 0.559 ± 0.725 1 ¡ 0.143 ± 0.054 0.5 ug de IL12 122 Ü 1.59 ± 1.65 Ü 2.02 ± 1.49 ■ J 5.30 ± 9.57 Ü 121 ± 1.21 5 ug de IL12_122 Ü 195.8 ± 123.3 Ü 176.8 ± 221.4 ■ ¡ 86.61 ± 40.53 Ü 69.87 ± 62.50

La FIG. 17B muestra niveles incrementados de IFNy a las 24 horas en el plasma después de la administración de mRNA de IL12 murino a ratones que llevan tumores. Esta figura por lo tanto muestra que la administración de mRNA de IL12 murino induce la expresión de IPNy a lo largo de múltiples dosis.

Alternativamente, a los ratones que llevan células de adenocarcinoma de colon MC38 dentro de la cavidad peritoneal como un modelo de carcinomatosis se les proporcionó una sola dosis intraperitoneal (IP) fija de mRNA de IL12 miR122 murino (en 2 |ig o 4 |ig), mRNA de IL12 miRless murino (en 2 |ig o 4 |ig) o proteína IL12 recombinante (rmIL12) (en 1 |ig), el día 7 después de que se sembraron las células MC38. Los niveles de IL12 e IPNy en el plasma se determinaron después de la administración de la dosis utilizando técnicas convencionales.

Las FIGS. 18A-18B muestran niveles incrementados de IL12 en el plasma (FIG. 18A) e IPN^yen el plasma (FIG.

18B) después de la administración intraperitoneal (IP) de mRNA de IL12 murino a ratones que llevan tumores MC38.

Estos datos muestran que la administración tanto intratumoral como intraperitoneal de IL-12 induce niveles en plasma incrementados de IFN^y. Adicionalmente, la administración múltiple de IL-12 en un modelo de tumor MC38 induce niveles repetidos tanto de IL-12 como IFN^yen el plasma.

Ejemplo 9: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intratumoral (iTu) de mRNA de IL12_miR122 en un modelo de A20

Las células tumorales A20 se implantaron por vía subcutánea en ratones. Los ratones que llevaban tumor A20 se agruparon en 2 grupos de tratamiento (N=12). Los ratones recibieron dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA en LNP de Compuesto 18, cada 7 días (Cada 7D).

El grupo de control se trató con el mRNA de control negativo formulado en la misma LNP, mientras que el grupo de tratamiento recibió las LNP que contienen mRNA de IL12 murino con un sitio de unión de miR122 en la 3' UTR (mIL12-miR122).

Los volúmenes del tumor se midieron durante el transcurso de 90 días después de la implantación de células A20, y las observaciones clínicas generales se hicieron de acuerdo con un protocolo de IACUC aceptado hasta que se alcanzó un punto final predeterminado de volumen de tumor de 2000 mm3.

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con dosis iTu de mIL12-miR122 formulado en LNP de Compuesto 18 se muestran en la FIG. 19B comparado con el control negativo en la FIG. 19A. La FIG.

19B muestra que cuatro ratones lograron respuesta completa el Día 90.

Los que tenían respuestas completas aparentes (4/12) de la FIG. 19B se reestimularon con células de tumor A20. Los volúmenes de tumor individuales de los ratones reestimulados se muestra en la FIG. 19D comparado con el crecimiento de tumor en ratones que no habían recibido tratamiento previo estimulados con A20 en la FIG. 19C. La FIG. 19C muestra que 9 de 10 ratones de control que llevaban tumores recientemente implantados alcanzaron su punto final (volumen de tumor de 2000 mm3) el Día 45. Sin embargo, la FIG. 19D muestra que los cuatro que tuvieron respuestas completas de la FIG. 19B reestimulados con tumor A20 no mostraron ningún crecimiento de tumor hasta el Día 60. Esto indica que la administración de mRNA de mIL12-miR122 proporcionó a los ratones una respuesta inmunitaria de memoria que es suficiente para prevenir el crecimiento del tumor tras la reestimulación.

Ejemplo 10: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intratumoral (iTu) de mRNA de IL12_miR122 en un modelo de MC38-S

Las células MC38-S se implantaron en ratones. Generalmente, MC38-S, también descrito como MC38-2, es una línea celular más sensible a la terapia. Sin estar limitados por la teoría, una explicación para esta observación son los niveles incrementados de células T CD45+, células Treg CD8+, macrófagos asociados con tumor (TAM) y DC observadas así como las observaciones de que los tumores MC38-S son más lentos de crecimiento y más sensibles a los IMT ensayados. Todas estas características de los tumores MC38-S son en comparación con los tumores MC38-R (también descritos como MC38-1 o MC38-M) y ambos son modelos útiles.

Los ratones que llevaban tumor MC38-S se agruparon en 4 grupos de tratamiento (N=15). Los ratones recibieron por vía iTu 0.05 |ig, 0.5 |ig o 5 |ig de mRNA de IL12 murino en LNP de Compuesto 18. Como un control negativo, los ratones recibieron por vía iTu mRNA de NST-FIX o no se trataron. En estudios de una sola y múltiples dosis, los ratones en los grupos experimentales y de control recibieron el mismo régimen de administración.

Los volúmenes de tumor y la supervivencia se midieron en cada grupo durante el transcurso de 80 días después de la implantación de células MC38-S y las observaciones clínicas generales se hicieron de acuerdo con un protocolo aceptado hasta que se alcanzó un punto final predeterminado de volumen de tumor de 1500 mm3.

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con una sola dosis iTu de 0.05 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 20A y FIG. 21A, los ratones tratados con una sola dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 20B y FIG. 21B, los ratones tratados con una sola dosis iTu de 5 |ig de mRNA de IL12 murino formulado se muestran en la FIG. 20C y FIG. 21C, comparado con los controles negativos apropiados en la FIG. 20D. El punto final predeterminado del volumen de tumor de 1500 mm3 indicado por la línea discontinua negra horizontal. Las FIGS. 20A y 21A muestran que seis de 15 ratones lograron respuesta completa. Las FIGS. 20B, 21B, 20C y 21C muestran que 13 de 15 ratones lograron respuesta completa, indicando que una dosis baja de 0.5 |ig puede ser suficiente para ejercer una respuesta máximamente efectiva dada la respuesta similar observada con 5 |ig.

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con dos dosis iTu de 0.05 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 21D, los ratones tratados con dos dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 21E y los ratones tratados con dos dosis iTu de 5 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 21F. El punto final predeterminado del volumen de tumor de 1500 mm3 indicado por la línea discontinua negra horizontal. La FIG. 21D muestra que 9 de 15 ratones lograron la respuesta completa. Las FIGS. 21E y 21F muestran que 14 de 15 ratones lograron una respuesta completa. Estos datos muestran que en algunos tipos de tumor, una sola administración de mRNA de IL12 murino puede lograr un efecto antitumoral que es suficiente para reducir o eliminar el tumor.

Una tendencia de respuesta a la dosis estaba clara entre los niveles de dosis de 0.05 y 0.5 |ig. Parecía que se lograba un umbral < 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino. Dos dosis de mRNA de IL12 también eran beneficiosas por encima de una sola dosis. Todos los ratones a los que se administró alguna dosis de mRNA de IL12 murino presentaron un beneficio de supervivencia (FIG. 22). Por lo tanto, la administración intratumoral de mRNA de IL12 murino retardó o redujo el crecimiento o tamaño de los tumores MC38-S comparado con un control negativo apropiado y proporcionó un beneficio de supervivencia.

Ejemplo 11: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intratumoral (iTu) de mRNA de IL12_miR122 en un modelo de MC38-R

Las células MC38-R se implantaron en ratones. Generalmente, MC38-R, también denominado en el presente documento como MC38-1 o MC38-M, es una línea celular más resistente a la terapia. Sin estar limitados por la teoría, una explicación para esta observación son los niveles reducidos de células T CD45+, células Treg CD8+ y DC, y más células que llevan marcadores de “células supresoras derivadas de mieloides” que se observaron, así como las observaciones de que los tumores MC38-R son de crecimiento más rápido y generalmente menos sensibles a las terapias inmunomediadas. Todas estas características de los tumores MC38-R son en comparación con los tumores MC38-S y ambos son modelos útiles.

Los ratones que llevaban tumor MC38-R se agruparon en 4 grupos de tratamiento (N=13). Los ratones recibieron por vía iTu 0.05 |ig, 0.5 |ig o 5 |ig de mRNA de IL12 murino en LNP de Compuesto 18. Como control negativo, los ratones recibieron por vía iTu mRNA de NST-FIX o no se trataron. En estudios de una sola y múltiple dosis, los ratones en los grupos experimental y de control recibieron el mismo régimen de administración.

Los volúmenes de tumor y la supervivencia se midieron en cada grupo durante el transcurso de 75 días después de la implantación de células MC38-R.

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con una sola dosis iTu de 0.05 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 23A y FIG. 23E, los ratones tratados con una sola dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino formulado en una LNP se muestran en la FIG. 23B y FIG. 23F, los ratones tratados con una sola dosis iTu de 5 |ig de mRNA de IL12 murino formulado en una LNP se muestran en la FIG. 23C y FIG.

23G, comparado con los controles negativos apropiados en la FIG. 23D. El punto final predeterminado del volumen de tumor de 2000 mm3 indicado por la línea discontinua negra horizontal. Las FIGS. 23A y 23E muestran que ninguno de los ratones que llevaban tumor MC38-R, después de la administración de 0.05 |ig de mRNA de IL12 murino logró respuesta completa. Las FIGS. 23B y 23F muestran que dos ratones que llevaban tumor MC38-R, después de la administración de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino lograron respuesta completa. Las FIGS. 23C y 23G muestran que cuatro ratones que llevaban tumor MC38-R, después de la administración de 5 |ig de mRNA de IL12 murino lograron respuesta completa.

Los volúmenes de tumor individuales de los ratones tratados con múltiples dosis iTu de 0.05 |ig de mRNA de IL12 murino se muestran en la FIG. 23H, los ratones tratados con dos dosis iTu de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino formulado en una LNP se muestran en FIG. 231, y los ratones tratados con dos dosis iTu de 5 |ig de mRNA de IL12 murino formulado en una LNP se muestran en la FIG. 23J. El punto final predeterminado del volumen de tumor de 2000 mm3 indicado por la línea discontinua negra horizontal. Las FIGS.23H-23J muestran que las múltiples administraciones tienen eficacia similar a una sola administración.

Estos resultados indican que a pesar de la resistencia demostrada de los tumores MC38-R a otras terapias inmunomediadas, tales como anticuerpos antagonistas anti-PDI y anti-PD-LI, los ratones a los que se administró mRNA de IL12 murino presentaron un beneficio de supervivencia (FIG. 24). Los sucesos de supervivencia incluyeron los puntos finales de carga de tumor y los animales fuera del estudio debido a la ulceración/escara que ocurrió en ratones tratados y no tratados. La administración intratumoral de mRNA de IL12 murino retardó el crecimiento de los tumores MC38-R comparado con un control negativo apropiado y proporcionó un beneficio de supervivencia y fue generalmente bien tolerado.

Los niveles de IL12 p70 en el tumor y en el plasma, así como el nivel de otras citocinas, se determinaron 24 horas después de la administración de las dosis. Los resultados muestran niveles dependientes de la dosis de IL12 en el plasma con la administración intratumoral de mRNA de IL12 murino como se muestra previamente. Los resultados también muestran la expresión dependiente de la dosis sostenida de TNFa, IL-10, IL-13, IL-15/15R, IL-27, MIP-1p, MIP-1a, MCP-1, MCP-3, M-CSF, IL-4 e IL-5 después de la administración múltiple de IL12 murina (datos no mostrados). GM-CSF, IL-18, IL-3, RANTES e IL-6 tienen niveles de expresión elevados únicamente después de la administración de 5 |ig de IL12 murina (datos no mostrados).

Ejemplo 12: Células T CD8+ implicadas en la eficacia de mRNA de IL12

Para evaluar la función de las células T CD8+ en mediar la eficacia inducida por mRNA de IL12, las células MC38-R se implantaron en ratones, el clon 24.3 de agotamiento de células T CD8+ se utilizó para agotar las células T CD8+ y se vigilaron los niveles de células T CD8+ en la sangre para confirmar el agotamiento durante el transcurso del estudio de eficacia. El clon 24.3 o un anticuerpo de control se proporcionó a los ratones 2 días antes de la administración del mRNA de IL12 murino. El clon de agotamiento o anticuerpo de control se proporcionó en 0.5 mg diariamente durante 3 días consecutivos, 3 días de descanso, luego otras cinco dosis de anticuerpo de 0.2 mg administradas cada 4 días. La citometría de flujo se realizó por todo el experimento para confirmar el agotamiento de células T CD8+.

Utilizando el clon 24.3, las células T CD8+ se agotaron durante el transcurso de 28 días, mientras que un control de anticuerpo no agotó las células T CD8+ (FIG. 25). Los números de células T CD8+ en la sangre disminuyeron significativamente en todos los puntos de tiempo examinados por citometría de flujo, confirmando de esta manera el agotamiento efectivo.

Los ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino después del agotamiento de células T CD8+ mediante el clon 24.3, presentaron volumen de tumor incrementado (FIG. 26D) comparado con los ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino después del agotamiento de células T CD8+ simulado (FIG. 26B). Del mismo modo, los ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino después del agotamiento de células T CD8+ presentaron poca supervivencia comparado con los ratones que recibieron 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino después del agotamiento de células T CD8+ simulado (FIG. 26E). La FIG. 26A muestra el volumen de tumor en ratones tratados con mRNA de control negativo después del agotamiento de células T CD8+ simulado, y la FIG. 26C muestra el volumen de tumor en ratones tratados con mRNA de control negativo después del agotamiento de células T CD8+. Aunque el tratamiento de mRNA de IL12 murino parecía que daba como resultado algún retardo en el crecimiento de tumor incluso con el agotamiento de células T CD8+, no hubo ratones con respuestas completas en la ausencia de células T citotóxicas en contraste con el beneficio de supervivencia claro observado con el tratamiento de mRNA de IL12 murino y el agotamiento simulado. Los resultados indican que las células T CD8+ desempeñan una función esencial en la eficacia mediada por mRNA de IL12. Ejemplo 13: Cambios significativos en el infiltrado inmunitario en tumores tanto MC38-R como B16F10-AP3 después de la administración intratumoral de mRNA de IL12

Se produjeron cambios significativos en el infiltrado de células inmunitarias en los tumores tanto MC38-R como B16F10-AP3 después del tratamiento con mRNA de IL12. Los tumores MC38-R se trataron por vía intratumoral con 0.05 |ig o 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino y los tumores B16F10-AP3 se trataron por vía intratumoral con 0.1 |ig o 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino.

En los modelos tanto MC38-R como B16F10-AP3, el porcentaje de células mieloides CD11b+ dentro del tumor que da tinción positiva para la expresión de PDL1 se incrementó significativamente en la mayoría de puntos de tiempo, después del tratamiento de mRNA de IL12 (FIG. 27A y FIG. 27B).

El tratamiento de mRNA de IL12 además se correlacionó con un incremento en las células T CD8+ dentro de tumores en los modelos de ratón tanto MC38-R como B16F10-AP3 en puntos de tiempo tardíos. En particular, el porcentaje de células T, como se demuestra por la proporción de células T CD8+ fuera del infiltrado inmunitario (células CD45+) y el número de células positivas CD8+ por mg de tejido de tumor, fue estadísticamente más alto 7 días después de la administración de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino en ambos modelos de ratón (FIGS. 28A y 28B). Además, se observó un número significativamente más alto de células T en tumores en ratones B16F10-AP3 tratados con 0.1 |ig de mRNA de IL12 murino, demostrado por la proporción de células T CD8+ fuera del infiltrado inmunitario (células CD45+) (FIG. 28B). Tanto el porcentaje de células positivas para CD45 como las células por mg son informativos. El día 7, los tumores en los grupos de tratamiento son más pequeños que los controles, particularmente para los grupos de 0.1 |ig y 0.5 |ig.

Se observó una relación incrementada de células CD8+ a células T reguladoras (Treg) (CD8:Treg) en ambos modelos de ratón MC38-R (FIG. 29A) y B16F10-AP3 (FIG. 29B), demostrando una relación de efectoras o supresoras mejorada. En particular, los ratones MC38-R tratados con 0.05 |ig o 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino presentaron relaciones más altas estadísticamente significativas de células T CD8+ a células Treg comparado con los controles negativos, resultado tanto de un incremento en las células CD8+ como una disminución en las células Treg en el tejido de tumor el día 7 (FIG. 29A). De manera similar, los ratones B16F10-AP3 tratados con 0.1 |ig o 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino presentaron relaciones estadísticamente más altas de células T CD8+ a células Treg comparado con los controles negativos, resultado de un incremento en las células CD8+ (FIG. 29B).

La expresión de CD69, que es indicativo de la activación de linfocitos T y células NK, se incrementó en las células T CD8+ en los tumores tanto MC38-R como B16F10-AP3 (FIGS. 30A-30B).

La activación de células citolíticas naturales (NK) también se observó en los tumores tanto MC38-R como B16F10-AP3 tratados con mRNA de IL-12 (FIGS. 31A y 31B).

Un incremento en las células dendríticas de presentación cruzada se observó en ambos modelos de tumor MC38-R y B16F10-AP3. Los incrementos de cDC CD103+ se observaron tanto en los tumores MC38-R (FIG.

32A) como B16F10-AP3 (FIG. 32B) el día 7. Además, se encontró un porcentaje más grande de cDC CD8+ activadas en el ganglio linfático de drenado después del tratamiento con mRNA de IL12 murino en cada uno de 24 horas, 72 horas y el día 7 comparado con los controles en los tumores B16F10-AP3 (FIG. 32C).

Ejemplo 14: Eficacia antitumoral in vivo de mRNA modificado de IL12 en combinación con el anticuerpo anti-PD-LI en un modelo MC38-R

Dada la expresión incrementada de PD-L1 (véase el Ejemplo 11 anterior) después de la administración de mRNA de IL12 murino, se estudió la eficacia de una terapia de combinación de mRNA de IL12 murino y un anticuerpo anti-PD-LI. Para evaluar la eficacia de la monoterapia del anticuerpo anti-PD-L1, se administró a los ratones que llevaban tumor MC38-R un anticuerpo anti-PD-LI murino obtenido del clon 80. La FIG. 33A muestra los cambios de volumen de tumor en ratones después de la administración de un control de anticuerpo. La FIG.

33B muestra los cambios de volumen de tumor después de la administración del anticuerpo anti-PD-LI. Todos los ratones alcanzaron el punto final (es decir, tumor de 2000 mm3) demostrando insensibilidad de este modelo al tratamiento anti-PD-LI.

Los ratones que llevaban tumor MC38-R recibieron por vía iTu ya sea (i) mRNA de IL12 murino solo o (ii) mRNA de IL12 murino y un anticuerpo anti-PD-LI murino en combinación. Se ensayaron tres dosis de mRNA, es decir, 0.05 |ig (datos no mostrados) 0.5 |ig y 5 |ig. Los volúmenes del tumor y la supervivencia se midieron en cada grupo (n=15) durante el transcurso de 90 días después de la implantación de células MC38-R y las observaciones clínicas generales se hicieron de acuerdo con un protocolo aceptado hasta que se alcanzó un punto final predeterminado de volumen de tumor de 2000 mm3.

Las FIGS. 33C y 33E muestran que la terapia de combinación con 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino dio como resultado la respuesta completa en 6 de 15 ratones mientras que únicamente 1 de 15 ratones lograron respuesta completa después de la administración de mRNA de IL12 murino solo. Las FIGS. 33D y 33F muestran que 11 de 15 ratones lograron respuesta completa en la terapia de combinación con 5 |ig de mRNA de IL12 murino mientras que únicamente 5 de 15 ratones lograron respuesta completa después de la administración de mRNA de IL12 murino solo. La FIG. 33G muestra datos que confirman que un anticuerpo anti-PD-LI murino solo no tuvo alguna eficacia antitumoral en ratones que llevaban MC38-R en este estudio. Los resultados muestran que la terapia de combinación de mRNA de ⁱL12 murino y un inhibidor de punto de control, p. ej., el anticuerpo anti-PD-LI, puede presentar eficacia sinérgica en tumores de otra manera resistente a la terapia de inhibidor de punto de control, p. ej., MC38-R.

Ejemplo 15: Eficacia antitumoral in vivo de la administración intratumoral de mRNA modificado de IL12 en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1

Los ratones que llevaban tumor MC38-R o B16F10-AP3 recibieron una sola dosis intratumoral de mRNA modificado de IL12 murino formulado en LNP (mRNA de IL12 con miR122 formulado con LNP basada en el Compuesto 18) en una dosis de ya sea 0.05 |ig, 0.5 |ig o 5 |ig, sola o en combinación con una dosis intraperitoneal del anticuerpo anti-PD-LI (clon 80). Las dosis adicionales se administraron como se indica a continuación.

A. Resultados

Para ensayar el efecto del tratamiento combinado con un mRNA de IL12 murino y un anticuerpo anti-PD-L1 (aPD-L1), los ratones MC38-R se trataron once días después de implante con un anticuerpo anti-PD-LI murino solo (FIG. 34A), 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino solo (FIG. 34B) o tanto un anticuerpo anti-PD-LI murino y 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 34C). El tratamiento utilizando un anticuerpo anti-PD-LI solo tuvo poco efecto en el crecimiento del tumor (FIG. 34A) y el tratamiento con una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino dio como resultado una CR (FIG. 34B). Cuando el tratamiento intratumoral de mRNA de IL12 murino se combinó con la administración de anti-PD-L1 (administrado en seis dosis), hubo un incremento grande en el número de CR observadas. Ocho de quince ratones (53%) presentaron una respuesta completa después de una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino en combinación con un anticuerpo anti-PD-LI (FIG. 34C).

El efecto sinérgico del tratamiento de combinación utilizando mRNA de IL12 murino y un anticuerpo anti-PD-LI además se observó en ratones B16F10-AP3, que se cree que son inmunológicamente estériles y también son resistentes a las terapias de bloqueo de punto de control tales como anti PDL1. Mientras que los ratones B16F10-AP3 no tratados (FIG. 35A) y los B16F10-AP3 tratados con un anticuerpo anti-PD-LI solo (FIG. 35B) o una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino solo (FIG. 35C) no produjeron CR, los ratones tratados con una sola dosis de 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino en combinación con un anticuerpo anti-PD-LI (administrado en seis dosis en los días 11, 14, 18, 21, 25 y 28) dio como resultado dos CR de entre quince ratones (FIG. 35D).

Ejemplo 16: Efecto abscopal después de la administración de mRNA de IL12 murino dentro de un tumor distante

Para investigar los efectos abscopales potenciales de la administración intratumoral de mRNA de IL12 murino, tumores de adenocarcinoma de colon MC38 se implantaron bilateralmente en ratones (MC38-S; FIG. 36A). En un estudio en curso, 17/20 tumores MC38-S tratados con 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 36D) y 19/20 tumores MC38-S tratados con 5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 36F) hasta ahora han presentado una respuesta completa después de aproximadamente 50 meses. Además, 3/20 tumores distantes en los ratones tratados con 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 36E) y 16/20 tumores distantes en los ratones tratados con 5 |ig de mRNA de IL12 de murino de esta manera han presentado una respuesta completa después de aproximadamente 50 meses (FIG. 36G). Los resultados con control negativo se muestran en las FIGS. 36B y 36C.

Estos efectos abscopales se amplifican cuando el tratamiento de mRNA de IL12 murino se combina con el tratamiento de anti-PD-LI, en un estudio en curso. Los ratones a los que se implantaron tumores MC38 bilaterales recibieron por vía intratumoral en un tumor ya sea 0.5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 37C-37D) o 5 |ig de mRNA de IL12 murino (FIG. 37E-37F) ya sea como una monoterapia (FIGS. 37C y 37E) o combinado con un anticuerpo anti-PD-LI (administrado por inyección IP de 20 mg/kg dos veces por semana durante dos semanas; FIGS. 37D y 37F). Hasta el momento, se observaron 3/20 CR y 16/20 Cr bilateralmente en los ratones tratados con 0.5 |ig (FIG. 37C) y 5 |ig (FIG. 37E) de mRNA de IL12 murino, y se observaron 8/20 CR y 20/20 CR bilateralmente en los ratones tratados con una combinación de anti-PD-LI y 0.5 |ig (FIG. 37D) o 5 |ig (FIG. 37F) de mRNA de IL12 murino. Los resultados con control negativo se muestran en las FIGS. 37A y 37B.

Ejemplo 17: Evaluación de mRNA optimizados en codones que codifican IL12 humana

Además de la construcción mIL12_miR122 generada en el Ejemplo 1, se prepararon 20 mRNA optimizados en codones que codifican el polipéptido de IL12 humano (hIL12A b 001-020). Estos mRNA también tenían un sitio de unión de miR-122 en la 3'UTR.

Los mRNA se modificaron completamente con N1-metilpseudouridina. Los mRNA modificados se formularon en nanopartículas de lípido MC3 (LNP) para el cribado. Las células HeLa se transfectaron utilizando un protocolo de transfección estándar y se determinó la expresión -22 horas después de transfección. La expresión se normalizó respecto a la de la construcción muIL12 de tipo natural. La mayoría de las construcciones ensayadas tuvieron expresión igual o hasta ~2 veces por encima de la construcción mIL12_miR122.

Las construcciones que tienen alta expresión en células HeLa también se ensayaron para determinar la expresión en células MC38, células Heb3B y células A20 para confirmar la expresión en varias líneas de células de tumor.

Las variantes ML12AB_002, hIL12AB_006 y hIL12AB_021 además se seleccionaron para el ensayo in vivo. Se implantaron en los ratones C57B16 por vía subcutánea células A20 (modelo de tumor A20). Los tumores se dejaron crecer y posteriormente se inyectó en los tumores por vía intratumoral mRNA encapsulados en LNP. El plasma, tumor, hígado y bazo se recolectaron 6 y 24 horas después de administración de una sola dosis intratumoral de mRNA (n=6 por grupo). Las variantes ML12AB_002 y hIL12AB_006, en particular, mostraron buena expresión comparado con mRNA de mIL12_miR122, p. ej., en plasma y en tumor.

Basado en el cribado conjunto in vitro e in vivo, ML12AB_002 se seleccionó como un mRNA preferido que codifica hIL12AB (FIG. 38).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usar en un método para reducir el tamaño de un tumor o inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto que lo necesite, en donde

(a) la composición comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL-12, en donde el mRNA comprende un marco de lectura abierto ("ORF") que codifica un polipéptido de la subunidad p40 de interleucina 12 ("IL12B") y un polipéptido de la subunidad p35 de interleucina 12 ("IL12A"),

(b) el mRNA se formula como una nanopartícula lipídica que comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, un esterol y un lípido modificado con PEG, y

(c) el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dicha composición por vía intratumoral.

2. La composición para el uso de la reivindicación 1, que comprende además administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un ARNm que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una cantidad efectiva de una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control, en donde opcionalmente

(a) el polipéptido inhibidor de punto de control inhibe PD1, PD-L1, CTLA-4 o una combinación de los mismos; y/o

(b) el polipéptido inhibidor de punto de control comprende un anticuerpo,

en donde opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo anti-CTLA-4 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a CTLA-4, un anticuerpo anti-PD1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PD1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1, o una combinación de los mismos;

en donde, además opcionalmente, el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab, avelumab o durvalumab; el anticuerpo anti-CTLA-4 es tremelimumab o ipilimumab; el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab o pembrolizumab;

y/o

(c) la composición de la reivindicación 1 sola, o en combinación con la composición que comprende un mRNA que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o la composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control activa las células T en el sujeto.

3. Una composición para usar en un método de (i) activación de células T en un sujeto que lo necesite, (ii) aumento de una relación de células T efectoras a supresoras en un tumor de un sujeto que lo necesite, (iii) aumento del número de células citolíticas naturales (NK) activadas en un sujeto que lo necesite, y/o (vi) aumento de las células dendríticas de presentación cruzada en un tumor de un sujeto que lo necesite, en donde

(a) la composición comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL-12, donde el mRNA comprende un ORF que codifica un polipéptido de IL12B y un polipéptido de IL12A,

4. La composición para uso de la reivindicación 2(c) o 3, en donde la activación de células T comprende inducir la proliferación de células T; y/o en donde la activación de las células T comprende inducir la infiltración de células T en el tumor o aumentar el número de células T que se infiltran en el tumor; y/o en donde la activación de células T comprende inducir una respuesta de células T de memoria; y/o en donde las células T activadas comprenden células T CD4+, células T CD8+ o ambas.

5. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde

(a) la administración de la composición sola o en combinación con una composición que comprende un mRNA que comprende un ORF que codifica un polipéptido inhibidor de punto de control o una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control aumenta la relación de células T efectoras a supresoras en el tumor, en donde opcionalmente la relación de células T efectoras a supresoras es una relación de células T CD8+:células T reguladoras (Treg), en donde además, opcionalmente, la relación CD8+:Treg es al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140 o al menos 150; y/o

(b) la administración de la composición aumenta más el número de células NK activadas en el sujeto, en donde opcionalmente el número de células NK activadas aumenta al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, al menos aproximadamente seis veces, al menos aproximadamente siete veces, al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente nueve veces, o al menos aproximadamente diez veces; y/o las células NK activadas aumentadas se mantienen durante al menos aproximadamente un día, al menos aproximadamente dos días, al menos aproximadamente tres días, al menos aproximadamente cuatro días, al menos aproximadamente cinco días, al menos aproximadamente seis días, al menos aproximadamente siete días, al menos aproximadamente ocho días, al menos aproximadamente nueve días, al menos aproximadamente diez días, al menos aproximadamente 11 días, al menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, o al menos aproximadamente 14 días; y/o

(c) la administración de la composición aumenta las células dendríticas de presentación cruzada en el tumor del sujeto, en donde opcionalmente las células dendríticas de presentación cruzada son células CD103+.

6. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración de la composición reduce el tamaño de un tumor distal o inhibe el crecimiento de un tumor distal en el sujeto.

7. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polipéptido de IL12B y el polipéptido de IL12a están fusionados directamente o por un ácido nucleico que codifica un enlazador, en donde opcionalmente

(i) el polipéptido de IL12B está situado en el extremo 5' del polipéptido de IL12A o el enlazador, o

(ii) el polipéptido de IL12A está situado en el extremo 5' del polipéptido de IL12B o el enlazador; y/o

(iii) el polipéptido de IL12B comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a los aminoácidos 23 a 328 de la SEQ ID NO: 48, en donde la secuencia de aminoácidos tiene actividad de IL12B; y/o

(iv) el polipéptido de IL12A comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a los aminoácidos 336 a 532 de la SEQ ID NO: 48, en donde la secuencia de aminoácidos tiene actividad de IL12A; y/o

(v) el mRNA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal, en donde opcionalmente el péptido señal es un péptido señal de IL12B; y/o el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO: 48; y/o

(vi) el ORF codifica un polipéptido de IL12B unido operativamente mediante un enlazador a un polipéptido de IL12A; y/o

(vii) el ORF codifica un péptido señal de IL12B, un polipéptido de IL12B, un enlazador y un polipéptido de IL12A; y/o

(viii) el enlazador comprende un enlazador de Gly/Ser, en donde opcionalmente el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m, en donde n es 1,2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 y m es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, en donde además opcionalmente el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m, y en donde n es 6 y m es 1.

8. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde

(a) el polipéptido de IL12 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a la SEQ ID NO: 48;

(b) el mRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 a 44, 236 y 237;

(c) el mRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 236 o 237; y/o

(d) el mRNA comprende un ORF que comprende al menos un nucleósido químicamente modificado, en donde opcionalmente

(i) el al menos un nucleósido químicamente modificado se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, Nl-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos;

(ii) los nucleósidos en el ORF están modificados químicamente en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%; y/o

(iii) los nucleósidos químicamente modificados en el ORF se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina y cualquier combinación de los mismos.

9. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde

(a) los nucleósidos de uridina en el ORF están químicamente modificados en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%;

(b) los nucleósidos de adenosina en el ORF están químicamente modificados en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%;

(c) los nucleósidos de citidina en el ORF están químicamente modificados en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%;

(d) los nucleósidos de guanosina en el ORF están químicamente modificados en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100%; y/o

(e) el ARNm comprende un sitio de unión de miARN, en donde opcionalmente

(i) el sitio de unión de miRNA es un sitio de unión de miR-122; y/o

(ii) el sitio de unión de miRNA es un sitio de unión de miR-122-3p o miR-122-5p, o

(iii) el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a aacgccauua ucacacuaaa ua (SEQ ID NO: 51), en donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122; o

(iv) el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a uggaguguga caaugguguu ug (SEQ ID NO: 53), donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122; o

(v) el sitio de unión de miRNA comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% idéntica a caaacaccau ugucacacuc ca (SEQ ID NO: 54), en donde el sitio de unión de miARN se une a miR-122.

10. La composición para uso de cualquier reivindicación precedente en donde el mRNA

(a) comprende una región no traducida (UTR) en 5', en donde opcionalmente la 5' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia listada en la Tabla 3; y/o

(b) comprende una región no traducida (UTR) en 3', en donde opcionalmente la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia listada en la Tabla 4A o 4B, y/o el mRNA comprende un sitio de unión de miRNA dentro de la 3' UTR, en donde además, opcionalmente, el polinucleótido comprende una secuencia espaciadora de nucleótidos fusionada con el sitio de unión de miRNA en donde, además, opcionalmente, la secuencia espaciadora de nucleótidos comprende al menos 10 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos, al menos 90 nucleótidos, o al menos 100 nucleótidos; y/o

(c) comprende una estructura de caperuza 5' terminal; en donde opcionalmente la estructura de caperuza 5' terminal es una Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, caperuza 5'-metilG, o un análogo de los mismos, y/o

(d) comprende una cola 3' poliA; y/o

(e) comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez sitios de unión a miRNA; y/o

(f) comprende un ORF de codones optimizados; y/o

(g) es un polinucleótido transcrito in vitro (IVT) y/o es circular.

11. La composición para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde la nanopartícula de lípido comprende

(a) el lípido seleccionado del grupo que consiste en DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos PEGilados, lípidos de amino alcohol, KL22 y combinaciones de los mismos; o

(b) un compuesto que tiene la fórmula (I)

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde

R¹se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R ”M'R';

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)², y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)²y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br e I; y m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y

con la condición de que cuando R⁴es -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2;

en donde opcionalmente

(i) el compuesto es de Fórmula (IA):

( IA ) ,

0 una sal o estereoisómero del mismo, en donde

1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el cual n es 1,2, 3, 4, o 5 y Q es OH, -HC(S)N(R)²o - HC(O)N(R)²; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14, en donde preferiblemente m es 5, 7 o 9; o

(ii) el compuesto es de Fórmula (II):

l se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o -(CH²)nQ, en el cual n es 2, 3, o 4 y Q es OH, -HC(S)N(R)²o -HC(O)N(R)²; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14y alquenilo C^2-14; o (iii) el compuesto se selecciona del Compuesto 1 al Compuesto 147, y sales y estereoisómeros de los mismos; o

(iv) el compuesto es de la Fórmula (IIa),

o una sal o estereoisómero del mismo; o

(v) el compuesto es de la Fórmula (I Ib),

(vi) el compuesto es de la Fórmula (IIc) o (IIe),

(vii) R⁴en la fórmula I se selecciona de -(CH²)nQ y -(CH²)nCHQR, en donde Q, R y n son como se definen antes en (b) o (b) (i); o

(viii) el compuesto es de la Fórmula (IId),

en donde R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C^5-14y alquenilo C^5-14, n se selecciona de 2, 3 y 4, y R', R”, R⁵, R6 y m son como se definen antes en (b) o (b)(i), en donde opcionalmente R²es alquilo C8, y/o R³es alquilo C⁵, alquilo Ca, alquilo C⁷, alquilo C8 o alquilo C⁹, y/o m es 5, 7 o 9, y/o cada R⁵es H, en donde opcionalmente además cada Ra es H.

12. La composición para usar de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la nanopartícula de lípido comprende un compuesto que tiene la fórmula (I)

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde

Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C⁵³⁰, alquenilo C⁵²⁰, R*YR”, YR” y -R”M'R':

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C¹¹⁴, alquenilo C^2-14, -R*YR”, YR” y R*OR”, o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C³⁶, (CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, CQ(R)², y alquilo C¹⁶no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, OR, O(CH²)nN(R)², C(O)OR, OC(O)R, CX³, CX²H, CXH², CN, -N(R)², C(O)N(R)², N(R)C(O)R, N(R)S(O)²R, N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)², -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)², -C(=NRg)N(R)², -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR y C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5;

cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹³, alquenilo C²³y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹³, alquenilo C²³y H;

M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -(O)-, -C(S)-, -(S)S-, -(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, -S-S- un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C¹³, alquenilo C²³y H;

R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo y heterociclo C^3-6;

R⁹se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO², alquilo C^1-6, -OR, -S(O)²R, -S(O)²N(R)², alquenilo C²-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹³, alquenilo C²³y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹¹⁸, alquenilo C²¹⁸, -R*YR”, -” y H;

cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C³¹⁴y alquenilo C³¹⁴; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C¹¹²y alquenilo C²¹²; cada Y es independientemente un carbociclo C³⁶;

con la condición de que cuando R⁴es -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2; en donde opcionalmente

(a) el agente de suministro comprende el compuesto de Fórmula (IA):

0 una sal o estereoisómero del mismo, en donde

1 se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5;

m se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C^1-3no sustituido, o (CH²)nQ, en el cual Q es OH, NHC(S)N(R)², o -NHC(O)N(R)², -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)Rb, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo;

M y M' se seleccionan independientemente de -(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C¹¹⁴y alquenilo C²¹⁴; en donde además opcionalmente m es 5, 7 o 9; y/o

(b) el compuesto es de Fórmula (II)

l se selecciona de 1, 2, 3, 4 y 5;

M¹es un enlace o M';

R⁴es alquilo C¹³no sustituido, o (CH²)nQ, en el cual n es 2, 3 o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)², o NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R^b, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo;

M y M' se seleccionan independientemente de -(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S- un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C¹¹⁴y alquenilo C²¹⁴; y/o (c) M¹es M', en donde opcionalmente M y M' son independientemente -C(O)O- o -OC(O)-; y/o

(d) en donde 1 es 1, 3 o 5; y/o

(e) el compuesto se selecciona del grupo que consiste en el Compuesto 1 al Compuesto 232, sales y estereoisómeros de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

13. La composición para usar de cualquier reivindicación precedente, en donde

(a) el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en

1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC),

1.2- dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC),

1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC),

1.2- diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3 -fosfocolina (POPC),

1.2- di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC),

1-oleoil-2-colestenlhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC),

1-hexadecil-sn-glicero-3 -fosfocolina (C16 Lyso PC),

1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina,

1.2- diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina,

1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina,

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE),

1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16:0 PE),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,

1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,

1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,

1.2- diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,

1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina,

sal de sodio de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), esfingomielina, y mezclas de los mismos;

o en donde el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en

1-miristoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-16:0 PC, MPPC),

1-miristoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-18:0 PC, MSPC),

1-palmitoil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-02:0 PC),

1-palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-14:0 PC, PMPC),

1-palmitoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:0 PC, PSPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:1 PC, POPC),

1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-18:2 PC, PLPC),

1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (16:0-20:4 PC),

1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (14:0-22:6 PC),

1-estearoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-14:0 PC, SMPC),

1-estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-16:0 PC, SPPC),

1-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-18:1 PC, SOPC),

1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-18:2 PC),

1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-20:4 PC),

1-estearoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0-22:6 PC), 1-oleoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1-14:0 PC, OMPC),

1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3 -fosfocolina (18:1-16:0 PC, OPPC),

1-oleoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:1-18:0 PC, OSPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:1 PE, POPE),

1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-18:2 PE),

1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-20:4 PE),

1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (16:0-22:6 PE),

1 -estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:1 PE),

1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-18:2 PE),

1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-20:4 PE),

1-estearoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0-22:6 PE),

1- oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC) y

cualquier combinación de los mismos; y/o

(b) el esterol se selecciona del grupo que consiste en colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y mezclas de los mismos; y/o

(c) el PEG lípido se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG y mezclas de los mismos; y/o

(d) la nanopartícula de lípido comprende un lípido catiónico seleccionado del grupo que consiste en 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinaetanamina (KL10),

N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazinadietanamina (KL22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25),

1.2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA),

2.2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA),

4-(dimetilamino)butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA),

2.2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA),

1.2- dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA),

2- ({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA),

(2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)); y/o

(e) la nanopartícula de lípido comprende un compuesto de amina cuaternaria, en donde opcionalmente el compuesto de amina cuaternaria se selecciona del grupo que consiste en

1.2- dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP),

cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA),

trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2-(esperminacarboxamido)-etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB),

cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC),

1.2- dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLePC),

1.2- diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP),

1.2- dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP),

1.2- dilinoleoil-3-trimetilamonio-propano (DLTAP),

1.2- dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (DMTAP),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSePC),

1.2- diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DPePC),

1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMePC),

1.2- dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOePC),

1.2- di-(9Z-tetradecenoil)-sn-glicero-3-etilfosfocolina (14:1 EPC),

1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (16:0-18:1 EPC),

y cualquier combinación de los mismos.

14. La composición para uso de cualquier reivindicación precedente, en donde

(a) la administración trata un cáncer,

en donde opcionalmente el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer corticosuprarrenal, cáncer avanzado, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, metástasis de hueso, tumores del cerebro, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer infantil, cáncer de origen primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/rectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer de laríngeo e hipofaríngeo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de pene, tumores de pituitaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma en tejido blando de adulto, cáncer de la piel de células basales y escamosas, melanoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, cánceres secundarios causados por el tratamiento del cáncer, y cualquier combinación de los mismos; y/o

(b) la composición se administra por un dispositivo que comprende una bomba, parche, depósito de fármaco, dispositivo de aguja corta, dispositivo de una sola aguja, dispositivo de múltiples agujas, dispositivo de microaguja, dispositivo de inyección por chorro, dispositivo de suministro de polvo/partícula balística, catéter, lumen, criosonda, cánula, microcanular o dispositivos que utilizan calor, energía RF, corriente eléctrica o cualquier combinación de los mismos; y/o

(c) la cantidad efectiva está entre aproximadamente 0.10 mg/kg y aproximadamente 1000 mg/kg; y/o (d) el sujeto es un ser humano.

15. Una nanopartícula de lípido que comprende un mRNA que codifica un polipéptido de IL12 humano, en donde el mRNA comprende un ^oR^fque codifica un polipéptido de IL12B humano operativamente unido a un polipéptido de IL12A humano, y la nanopartícula de lípido comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, un esterol y un lípido modificado con PEG.

16. La nanopartícula de lípido de la reivindicación 15, en donde

(a) el polipéptido de IL12B está operativamente unido al polipéptido de IL12A por un enlazador de péptido; y/o (b) el polipéptido de IL12B se sitúa en el extremo 5' del polipéptido de IL12A o el enlazador de péptido; o (c) el polipéptido de IL12A se sitúa en el extremo 5' del polipéptido de IL12B o el enlazador de péptido; y/o (d) el enlazador de péptido comprende un enlazador de Gly/Ser, en donde el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m, en donde n es 1, 23, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 y m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20, en donde además opcionalmente el enlazador de Gly/Ser comprende (GnS)m, y en donde n es 6 y m es 1; y/o

(e) el ORF codifica un péptido señal, en donde opcionalmente el péptido señal es un péptido señal de IL12B humana; y/o

(f) el polipéptido de IL12B humano comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 23 a 328 de la SEQ ID NO: 48; y/o

(g) el polipéptido de IL12A humano comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 336 a 532 de la SEQ ID NO: 48; y/o

(h) el péptido señal de IL12B de humano comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO: 48; y/o

(i) el polipéptido de IL12 humano comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 48; y/o

(j) el mRNA comprende un sitio de unión de miRNA, opcionalmente un sitio de unión de miR-122, además opcionalmente un sitio de unión de miR-122-3p o miR-122-5p; además opcionalmente un sitio de unión de miR-122-5p que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 54; y/o

(k) el mRNA comprende una 3' UTR, en donde opcionalmente la 3' UTR comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 240 y/u opcionalmente un sitio de unión de miRNA se sitúa en la 3' UTR; y/o

(l) el mRNA comprende una 5' UTR, en donde opcionalmente la 5' UTR comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 39; y/o

(m) el mRNA comprende una estructura de caperuza 5' terminal; en donde opcionalmente la estructura de caperuza 5' terminal es una Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-desazaguanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, caperuza 5'-metilG o un análogo de los mismos; y/o

(n) el mRNA comprende una cola 3' poliA; y/o

(o) el mRNA comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 236 o 237; y/o

(p) el mRNA comprende un ORF que comprende al menos un nucleósido modificado, en donde opcionalmente el al menos un nucleósido químicamente modificado se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de los mismos, en donde preferiblemente el al menos un nucleósido químicamente modificado es N1-metilpseudouridina; y/o

(q) en donde la nanopartícula de lípido comprende de 30% en moles a 70% en moles, de 35% en moles a 65% en moles, de 40% en moles a 60% en moles o de 45% en moles a 55% en moles de un compuesto que tiene la fórmula (I):

o una sal o estereoisómero del mismo, en donde

Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^5-20, alquenilo C^5-20, -R*YR”, -YR” y -R ”M'R';

R²y R³se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C^1-14, alquenilo C^2-14, -R*YR”, -YR” y -R*OR” o R²y R³, junto con el átomo al cual están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;

R⁴se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C^3-6, -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)²y alquilo C^1-6no sustituido, donde Q se selecciona de un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH²)nN(R)², -C(O)OR, -OC(O)R, -CX³, -CX²H, -CXH², -CN, -N(R)², -C(O)N(R)², -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)²R, -N(R)C(O)N(R)², -N(R)C(S)N(R)²y -C(R)N(R)²C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4 y 5; cada R⁵se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H; M y M' se seleccionan independientemente de -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)²-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

R⁷se selecciona del grupo que consiste en alquilo C^1-3, alquenilo C^2-3y H;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, CI, Br y I; y

m se selecciona de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y

con la condición de que cuando R⁴es -(CH²)nQ, -(CH²)nCHQR, -CHQR o -CQ(R)², entonces (i) Q no es -N(R)²cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2; y/o (r) el lípido catiónico es el Compuesto 18.

17. Una nanopartícula de lípido como se define en las reivindicaciones 15 o 16, para usar en un método para tratar o retardar la progresión de cáncer en un individuo, en donde el medicamento comprende la nanopartícula de lípido y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y en donde el tratamiento comprende la administración del medicamento en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.

18. Un kit que comprende un medicamento que comprende una nanopartícula de lípido de las reivindicaciones 15 o 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional, y un prospecto que comprende instrucciones para la administración del medicamento solo o en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retardar la progresión de cáncer en un individuo, en donde opcionalmente el kit además comprende un prospecto que comprende instrucciones para la administración del primer medicamento y el segundo medicamento para tratar o retardar la progresión de cáncer en un individuo.

19. Una composición que comprende la nanopartícula de lípido de las reivindicaciones 15 o 16 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento o retardo de la progresión de cáncer en un individuo, en donde el tratamiento comprende la administración de dicha nanopartícula de lípido en combinación con una segunda composición, en donde la segunda composición comprende un polipéptido inhibidor de punto de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.

20. Una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula de lípido de las reivindicaciones 15 o 16 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde opcionalmente la nanopartícula de lípido se formula para administración intratumoral.

21. Un kit que comprende un recipiente que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 20 y un prospecto que comprende instrucciones para la administración de la composición farmacéutica para tratar o retardar la progresión de cáncer en un individuo, en donde opcionalmente el prospecto comprende además instrucciones para la administración de la composición farmacéutica en combinación con una composición que comprende un polipéptido inhibidor de punto de control y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para tratar o retardar la progresión de cáncer en un individuo.