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ES2898661T3 - Anticuerpos humanos de alta afinidad contra PCSK9 - Google Patents

Anticuerpos humanos de alta afinidad contra PCSK9 Download PDF

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ES2898661T3
ES2898661T3 ES16200305T ES16200305T ES2898661T3 ES 2898661 T3 ES2898661 T3 ES 2898661T3 ES 16200305 T ES16200305 T ES 16200305T ES 16200305 T ES16200305 T ES 16200305T ES 2898661 T3 ES2898661 T3 ES 2898661T3
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pcsk9
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Mark W Sleeman
Joel H Martin
Tammy Huang
Douglas Macdonald
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo humano que se une específicamente a la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (hPCSK9) que comprende un dominio de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de SEQ ID NO: 76, un dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de SEQ ID NO: 78, un dominio de CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEQ ID NO: 80, un dominio de CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de SEQ ID NO: 84, un dominio de CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEQ ID NO: 86 y un dominio de CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEQ ID NO: 88, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea la unión de hPCSK9 con el ectodominio del receptor de lipoproteína de baja densidad humana (hLDLR), el dominio hLDLR EGF-A y los dominios hLDLR EGF-AB.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanos de alta afinidad contra PCSK9
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con anticuerpos humanos y fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) humana, y métodos terapéuticos de uso de aquellos anticuerpos.
Declaración de la técnica relacionada
La proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) es una proproteína convertasa que pertenece a la subfamilia de la proteinasa K de la familia subtilasa secretora. La proteína codificada se sintetiza como un zimógeno soluble que experimenta procesamiento intramolecular autocatalítico en el retículo endoplásmico. La evidencia sugiere que PCSK9 aumenta el colesterol LDL en plasma, promoviendo la degradación del receptor de LDL, que media en la endocitosis de LDL en el hígado, la principal vía de eliminación de LDL de la circulación. La estructura de la proteína PCSK9 muestra que tiene una secuencia señal, seguida de un prodominio, un dominio catalítico que contiene una tríada conservada de restos (D186, H226 y S386) y un dominio del extremo C. Se sintetiza como un precursor de 74 kDa soluble que experimenta escisión autocatalítica en el ER, generando un prodomonio de 14 kDa y fragmento catalítico de 60 kDa. Se ha mostrado que la actividad autocatalítica se requiere para la secreción. Después de la escisión, el prodominio sigue fuertemente asociado al dominio catalítico.
Los anticuerpos contra PCSK9 se describen en, por ejemplo, los documentos WO 2008/057457, WO 2008/057458, WO 2008/057459, WO 2008/063382, WO 2008/125623 y US 2008/0008697.
Lagace, Thomas A et al. (The Journal of clinical investigation vol. 116,11 (2006): p2995-3005) describe cómo PCSK9 secretado disminuye el número de receptores de LDL en hepatocitos y en hígados de ratones parabióticos.
Alborn, William E et al. (Clinical Chemistry, Volumen 53, número 10, 1 (2007) p1814-1819) describe cómo la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 en suero se correlaciona directamente con el colesterol LDL en suero.
Breve sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones que se unen específicamente y neutralizan la actividad de PCSK9 humana (hPCSK9).
Específicamente, la invención proporciona un anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo humano que se une específicamente a la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (hPCSK9) que comprende un dominio de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de SEQ ID NO: 76, un dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de SEQ ID NO: 78, un dominio de CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEQ ID NO: 80, un dominio de CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de SEQ ID NO: 84, un dominio de CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEQ ID NO: 86 y un dominio de CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEQ ID NO: 88, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea la unión de hPCSK9 con el ectodominio del receptor de lipoproteína de baja densidad humana (hLDLR), el dominio hLDLR EGF-A y los dominios hLDLR EGF-AB.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a hPCSK9 y se caracterizan por al menos uno de:
(i) capaz de reducir el colesterol total en suero al menos aproximadamente el 25-35 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 24 días con respecto a un nivel de predosis, preferentemente la reducción en el colesterol total en suero es al menos aproximadamente el 30-40 %;
(ii) capaz de reducir el colesterol LDL en suero al menos aproximadamente el 65-80 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 24 días con respecto a un nivel de predosis;
(iii) capaz de reducir el triglicérido en suero al menos aproximadamente el 25-40 % con respecto al nivel de predosis;
(iv) no reduce el colesterol HDL en suero o reduce el colesterol HDL en suero no más del 5 % con respecto al nivel de predosis.
También se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a hPCSK9 y se caracterizan por al menos uno de:
(i) capaz de reducir el colesterol LDL en suero al menos aproximadamente el 40-70 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 60 o 90 días con respecto a un nivel de predosis;
(ii) capaz de reducir el triglicérido en suero al menos aproximadamente el 25-40 % con respecto al nivel de predosis;
(iii) no reduce el colesterol HDL en suero o reduce el colesterol HDL en suero no más del 5 % con respecto al nivel de predosis.
En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se caracteriza por unirse a un epítope que comprende el resto de aminoácido 238 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). En una realización más específica, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al epítope que comprende uno o más del resto de aminoácido 238, 153, 159 y 343 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). En una realización más específica, el anticuerpo o fragmento del mismo se caracteriza por unirse a un epítope que no comprende un resto de aminoácido en la posición 192, 194, 197 y/o 237 de SEQ ID NO:755.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo caracterizado por unirse a un epítope que comprende el resto de aminoácido 366 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). En el presente documento se describe un anticuerpo fragmento del mismo que se une al epítope que comprende uno o más del resto de aminoácido en la posición 147, 366 y 380 de SEQ ID NO:755. Más específicamente, el anticuerpo o fragmento del mismo se puede caracterizar por unirse a un epítope que no comprende un resto de aminoácido en la posición 215 y/o 238 de SEQ ID NO:755.
En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se caracteriza por presentar una afinidad de unión potenciada (Kd) por hPCSK9 a pH 5,5 con respecto a la Kd a pH 7,4, como se mide por resonancia de plasmones superficiales. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una afinidad potenciada al menos 20 veces, al menos 40 veces o al menos 50 veces por PCSK9 a un pH ácido con respecto a un pH neutro, como se mide por resonancia de plasmones superficiales.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de los mismos caracterizados por no presentar una afinidad de unión potenciada por PCSK9 a un pH ácido con respecto a un pH neutro, como se mide por resonancia de plasmones superficiales. La unión a un pH ácido puede ser menos y el T1/2 más corto que a un pH neutro.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a PCSK9 humana, con mutación GOF humana D374Y, de macaco cangrejero, macaco de la India, ratón, rata y hámster.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen a PCSK9 humana y de mono, pero no se unen a PCSK9 de ratón, rata o hámster
Los mAb pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solo una porción de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y se pueden modificar para afectar la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).
En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738 y 742, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. La HCVR puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:50, 66, 70, 74, 90, 94, 122, 138, 142, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 314, 330 y 334. En un aspecto más específico, la HCVR comprende SEQ ID NO:90 o 218.
El anticuerpo o fragmento del mismo como se describe en el presente documento puede comprender además una región variable de la cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740 y 744, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia. La LCVR puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 58, 68, 72, 82, 92, 96, 130, 140, 144, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 322, 332 y 336. En un aspecto específico, la LCVR comprende SEQ ID NO:92 o 226.
El anticuerpo o fragmento del mismo descrito en el presente documento puede comprender un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 y 742/744. HCVR y LCVR se pueden seleccionar de los pares de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 y 334/336. Más específicamente, el par de HCVR/LCVR puede comprender SEQ ID NO:90/92 o 218/226.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de CDR3 de cadena pesada (HCDR3) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488, 512, 536, 560, 584, 608, 632, 656, 680, 704 y 728, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de CDR3 de cadena ligera (LCDR3) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472, 496, 520, 544, 568, 592, 616, 640, 664, 688, 712 y 736, o secuencias sustancialmente similares del mismo que tienen al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia. Los pares de secuencias de HCDR3/LCDR3 pueden ser SEQ ID NO:56/64, 80/88, 128/136, 224/232, 248/256 o 320/328. HCDR3/LCDR3 puede comprender SEQ ID NO:80/88 o 224/232.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484, 508, 532, 556, 580, 604, 628, 652, 676, 700 y 724, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486, 510, 534, 558, 582, 606, 630, 654, 678, 702 y 726, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de CDR1 de cadena ligera (LCDR1) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468, 492, 516, 540, 564, 588, 612, 636, 660, 684, 708 y 732, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de CDR2 de cadena ligera (LCDR2) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470, 494, 518, 542, 566, 590, 614, 638, 662, 686, 710 y 734, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia. Las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera pueden ser SEQ ID NO:52, 54, 56, 60, 62, 64; 76, 78, 80, 84, 86, 88; 124, 126, 128, 132, 134, 136; 220, 222, 224, 228, 230, 232; 244, 246, 248, 252, 254, 256; y 316, 318, 320, 324, 326, 328. Las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera pueden ser SEQ ID n O: 76, 78, 80, 84, 86, 88; o 220, 222, 224, 228, 230, 232.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a hPCSK9, en donde el anticuerpo o fragmento comprende dominios de CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de pares de secuencias de cadena pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 y 742/744. Las secuencias de CDR contenidas dentro de HCVR y LCVR se pueden seleccionar de los pares de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 122/130, 138/140, 142/144, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 314/322, 330/332 y 334/336. Las secuencias de CDR pueden estar contenidas dentro de las HCVR y LCVR seleccionadas de los pares de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 90/92 o 218/226.
También se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente para neutralizar actividad de hPCSK9, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características:
(i) capaz de reducir el colesterol total en suero al menos aproximadamente el 25-35 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 24 días con respecto a un nivel de predosis, preferentemente la reducción en el colesterol total en suero es al menos aproximadamente el 30-40 %;
(ii) capaz de reducir el colesterol LDL en suero al menos aproximadamente el 65-80 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 24 días con respecto a un nivel de predosis;
(iii) capaz de reducir el triglicérido en suero al menos aproximadamente el 25-40 % con respecto al nivel de predosis;
(iv) no reduce el colesterol HDL en suero o reduce el colesterol HDL en suero no más del 5 % con respecto al nivel de predosis;
(v) se une al epítope que comprende el resto de aminoácido 238 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755);
(vi) presenta una afinidad de unión (Kd) potenciada por hPCSK9 a pH 5,5 con respecto a la Kd a pH 7,4, como se mide por resonancia de plasmones superficiales, en donde la afinidad potenciada es al menos aproximadamente un aumento de 20 a 50 veces en la afinidad;
(vii) se une a PCSK9 humana, con mutación GOF humana D374Y, de macaco cangrejero, macaco de la India, ratón, rata y hámster;
(viii) comprende secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera que comprenden SEQ ID NO:80 y 88;
(ix) comprende secuencias de CDR de SEQ ID NO:90 y 92.
También se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente y neutraliza la actividad de hPCSK9, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características:
(i) capaz de reducir el colesterol LDL en suero al menos aproximadamente el 40-70 % y mantener la reducción durante al menos un periodo de 60 o 90 días con respecto a un nivel de predosis;
(ii) capaz de reducir el triglicérido en suero al menos aproximadamente el 25-40 % con respecto al nivel de predosis; (iii) no reduce el colesterol HDL en suero o reduce el colesterol HDL en suero no más del 5 % con respecto al nivel de predosis;
(iv) se une al epítope que comprende el resto de aminoácido 366 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755);
(v) no presenta una afinidad potenciada de unión por PCSK9 a un pH ácido con respecto a un pH neutro, como se mide por resonancia de plasmones superficiales;
(vi) se une a PCSK9 humana y de mono, pero no se une a PCSK9 de ratón, rata o hámster;
(vii) comprende secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera que comprenden SEQ ID NO:224 y 232; y (viii) comprende secuencias de CDR de SEQ ID NO:218 y 226.
En un tercer aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de los mismos de la invención. También están englobados por la invención vectores de expresión recombinantes que llevan los ácidos nucleicos de la invención, y células huésped en las que se han introducido dichos vectores, ya que son métodos de producción de los anticuerpos cultivando las células huésped en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos, y de recuperación de los anticuerpos producidos.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41,45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401,405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 521, 525, 529, 545, 549, 553, 569, 573, 577, 593, 597, 601, 617, 621,625, 641,645, 649, 665, 669, 673, 689, 693, 697, 713, 717, 721,737 y 741, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma. La HCVR se puede codificar por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 49, 65, 69, 73, 89, 93, 121, 137, 141,217, 233, 237, 241, 257, 261,313, 329 y 333. La HCVR se puede codificar por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 89 y 217. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además una LCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71,81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451,455, 465, 475, 479, 489, 499, 503, 513, 523, 527, 537, 547, 551, 561, 571, 575, 585, 595, 599, 609, 619, 623, 633, 643, 647, 657, 667, 671, 681, 691, 695, 705, 715, 719, 729, 739 y 743, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma. La LCVR se puede codificar por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57, 67, 71, 81, 91, 95, 129, 139, 143, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 321, 331 y 335. Más específicamente, la LCVR se puede codificar por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 91 y 225.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:7, 31,55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271,295, 319, 343, 367, 391,415, 439, 463, 487, 511, 535, 559, 583, 607, 631, 655, 679, 703 y 727, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma; y un dominio de LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159,
183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471,495, 519, 543, 567, 591, 615, 639, 663, 687, 711 y
735, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma. Las secuencias de HCDR3 y LCDR3 se pueden codificar por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55/63, 79/87, 127/135, 223/231, 247/255 y 319/327, respectivamente. El par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 se puede codificar por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 79/87 y 223/231.
El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además un dominio de HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291,315, 339, 363, 387, 411,435, 459, 483, 507, 531,555, 579, 603, 627, 651,675, 699 y 723, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma; un dominio de HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221,245, 269, 293, 317, 341,365, 389, 413, 437, 461, 485, 509, 533, 557, 581, 605, 629, 653, 677, 701 y 725, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma; un dominio de LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, 35, 59,
83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251,275, 299, 323, 347, 371,395, 419, 443, 467, 491,515, 539, 563, 587, 611,635, 659, 683, 707 y 731, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma; y un dominio de LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301,325, 349, 373, 397, 421,445, 469, 493, 517, 541,565, 589, 613, 637, 661,685, 709 y 733, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología de la misma. Las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera se pueden codificar por las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 51, 53, 55, 59, 61, 63; 75, 77, 79, 83, 85, 87; 123, 125, 127, 131, 133, 135; 219, 221, 223, 227, 229, 231; 243, 245, 247, 251, 253, 255; y 315, 317, 319, 323, 325, 327. Las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera se pueden codificar por las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 75, 77, 79, 83, 85,
87; y 219, 221,223, 227, 229, 231.
También se describe en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a hPCSK9, que comprende una HCDR3 y una LCDR3, en donde la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6- X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X15 - X16 - X17 - X18 - X19 - X20 (SEQ ID NO:747) en donde X1 es Ala, X2 es Arg o Lys, X3 es Asp, X4 es Ser o Ile, X5 es Asn o Val, X6 es Leu o Trp, X7 es Gly o Met, X8 es Asn o Val, X9 es Phe o Tyr, X10 es Asp, X11 es Leu o Met, X12 es
Asp o ausente, X13 es Tyr o ausente, X14 es Tyr o ausente, X15 es Tyr o ausente, X16 es Tyr o ausente, X17 es Gly o ausente, X18 es Met o ausente, X19 es Asp o ausente, y X20 es Val o ausente; y la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO:750) en donde X1 es Gln o Met, X2 es
Gin, X3 es Tyr o Thr, X4 es Tyr o Leu, X5 es Thr o Gin, X6 es Thr, X7 es Pro, X8 es Tyr o Leu, y X9 es Thr.
El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además una secuencia de HCDR1 de fórmula X1 - X2 - X3 -X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:745), en donde X1 es Gly, X2 es Phe, X3 es Thr, X4 es Phe, X5 es Ser o Asn, X6 es
Ser o Asn, X7 es Tyr o His, y X8 es Ala o Trp; una secuencia de HCDR2 de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8
(SEQ ID NO:746), en donde X1 es Ile, X2 es Ser o Asn, X3 es Gly o Gln, X4 es Asp o Ser, X5 es Gly, X6 es Ser o Gly,
X7 es Thr o Glu, y X8 es Thr o Lys; una secuencia de LCDR1 de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 -X11 - X12 (SEQ ID NO:748) en donde X1 es Gin, X2 es Ser, X3 es Val o Leu, X4 es Leu, X5 es His o Tyr, X6 es Arg o Ser,
X7 es Ser o Asn, X8 es Asn o Gly, X9 es Asn, X10 es Arg o Asn, X11 es Asn o Tyr, y X12 es Phe o ausente; una secuencia de LCDR2 de fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO:749) en donde X1 es Trp o Leu, X2 es Ala o Gly, y X3 es Ser. La Fig. 1 muestra el alineamiento de secuencias de regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras para los mAb 316P y 300N.
También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-PCSK9 humano o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de las secuencias de la línea germinal Vh, Dh y Jh, y una región variable de la cadena ligera (LCVR) codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias de la línea germinal Vk y Jk, en donde las secuencias de la línea germinal son (a) segmento del gen Vh 3-23, segmento del gen
Dh 7-27, segmento del gen Jh 2, segmento del gen Vk 4-1 y segmento del gen Jk 2; o (b) segmento del gen Vh 3-7, segmento del gen Dh 2-8, segmento del gen Jh 6, segmento del gen Vk 2-28 y segmento del gen Jk 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une a una proteína PCSK9 de
SEQ ID NO:755, en donde la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a una proteína PCSK9 de variante es inferior al 50 % de la unión entre el anticuerpo o fragmento del mismo y la proteína PCSK9 de SEQ ID NO:755. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a la proteína PCSK9 de variante con una afinidad de unión (Kd) que es inferior a aproximadamente el 50 %, inferior a aproximadamente el 60 %, inferior a aproximadamente el 70 %, inferior a aproximadamente el 80 %, inferior a aproximadamente el 90 % o inferior a aproximadamente el 95 % en comparación con la unión a PCSK9 (SEQ ID NO:755).
En una realización, la proteína PCSK9 de variante comprende al menos una mutación en la posición 238 de SEQ ID NO:755. En una realización más específica, la mutación es D238R. En una realización, la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo por la proteína PCSK9 de variante es al menos el 90 % menos con respecto a la proteína natural de SEQ ID NO:755, en donde la proteína de variante comprende una mutación en el resto 238. En una realización, la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo por la proteína PCSK9 de variante es al menos el 80 % menos con respecto a la proteína natural de SEQ ID NO:755, en donde la proteína de variante comprende una mutación en uno o más del resto 153, 159, 238 y 343. En una realización más específica, la mutación es una de S153R, E159R, D238R y D343R.
También descrito en el presente documento, la proteína PCSK9 de variante comprende al menos una mutación en la posición 366 de SEQ ID NO:755. La mutación puede ser E366K. La afinidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo por la proteína PCSK9 de variante puede ser al menos el 95 % menos con respecto a la proteína natural de SEQ ID NO:755, en donde la proteína de variante comprende una mutación en el resto 366. La afinidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo por la proteína PCSK9 de variante puede ser al menos el 70 %, 80 % o el 90 % menos con respecto a la proteína natural de SEQ ID NO:755, en donde la proteína de variante comprende una mutación en uno o más del resto 147, 366 y/o 380. La mutación puede ser una de S147F, E366K y V380M.
La invención engloba anticuerpos anti-PCSK9 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o por ejemplo, la eliminación de un resto de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, se puede hacer una modificación de la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
En un aspecto adicional, la invención caracteriza una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo como se define en las reivindicaciones que se une específicamente a hPCSK9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la invención caracteriza una composición que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, por ejemplo, un agente capaz de inducir un agotamiento celular de la síntesis de colesterol inhibiendo la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG)-coenzima A (CoA) reductasa, tal como, por ejemplo, cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.; capaz de inhibir la captación de colesterol y o la re-absorción de ácidos biliares; capaz de aumentar el catabolismo de lipoproteínas (tales como niacina); y/o activadores del factor de transcripción de LXR que desempeña una función en la eliminación de colesterol, tal como 22-hidroxicolesterol.
En el presente documento también se describen métodos de inhibición de la actividad de hPCSK9 usando el anticuerpo anti-PCSK9 o porción de unión al antígeno del anticuerpo de la invención, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se corrija, mejore, inhiba o prevenga por eliminación, inhibición o reducción de la actividad de PCSK9. Poblaciones específicas tratables por los métodos terapéuticos incluyen sujetos indicados para aféresis de LDL, sujetos con mutaciones activantes de PCSK9 (mutaciones de ganancia de función, "GOF"), sujetos con hipercolesterolemia familiar heterocigótica (heFH); sujetos con hipercolesterolemia primaria que son intolerantes a las estatinas o incontrolada por estatinas; y sujetos en riesgo de desarrollar hipercolesterolemia que puede ser tratada preventivamente. Otras indicaciones incluyen dislipidemia asociada a causas secundarias, tales como diabetes 2 mellitus de tipo, enfermedades hepáticas colestásicas (cirrosis biliar primaria), síndrome nefrótico, hipotiroidismo, obesidad; y la prevención y el tratamiento de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.
El anticuerpo anti-hPCSK9 o fragmento de anticuerpo de la invención puede ser útil para reducir colesterol total elevado, colesterol no HDL, colesterol LDL y/o apolipoproteína B (apolipoproteína B100).
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención se puede usar solo o en combinación con un segundo agente, por ejemplo, un inhibidor de HMG-CoA reductasa y/u otros fármacos hipolipemiantes.
Realizaciones adicionales incluyen un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo como se ha definido anteriormente para su uso para atenuar o inhibir la enfermedad o afección mediada por PCSK9.
La invención engloba el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo como se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por PCSK9. En realizaciones específicas, en donde la enfermedad o afección mediada por PCSK9 es hipercolesterolemia, hiperlipidemia, aféresis de LDL, hipercolesterolemia familiar heterocigótica, intolerante a las estatinas, incontrolada por estatinas, el riesgo de desarrollar hipercolesterolemia, dislipidemia, enfermedad hepática colestásica, síndrome nefrótico, hipotiroidismo, obesidad, aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.
Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada resultante.
Breve descripción de la figura
Fig. 1. Tablas de comparación de secuencias de regiones variables de cadena pesada (A) y cadena ligera (B) y CDR de anticuerpos H1H316P y H1M300N.
Fig. 2. Concentraciones de anticuerpo en suero con el tiempo. 316P 5 mg/kg (□); 300N 5 mg/kg (O); 316P 15 mg/kg (v); 300N 15 mg/kg (•).
Fig. 3. Nivel de colesterol total en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (o); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (A).
Fig. 4. Nivel de colesterol LDL en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (o); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (A).
Fig. 5. Nivel de colesterol LDL en suero normalizado al control de tapón. Control de tapón (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (o); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (A).
Fig. 6. Nivel de colesterol HDL en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (o); 316P 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (A).
Fig. 7. Nivel de triglicéridos en suero como un porcentaje del cambio con respecto al control de tampón. Control de tampón (T); 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (o); 316p 15 mg/kg (□); 300N 15 mg/kg (A).
Fig. 8. Nivel de colesterol LDL en suero expresado como un porcentaje del cambio con respecto al nivel inicial tras una administración subcutánea de dosis única. 316P 5 mg/kg (v); 300N 5 mg/kg (•).
Fig.9. Concentraciones de anticuerpo en suero con el tiempo tras una administración subcutánea de dosis única.
316P 5 mg/kg (•); 300N 5 mg/kg (o).
Fig. 10. Transferencia Western para receptor de LDL de ratón de homogeneizados de hígado total. Las muestras se tomaron 24 horas después de la administración de PBS (carriles 1-3), 5 mg/kg 316P (carriles 4-6) o 5 mg/kg de mAb no específico de hPCSK9 (carriles 7-8) y 4 horas después de 1,2 mg/kg de hPCSK9-mmh (todos los carriles).
Fig. 11. Efectos de 316P sobre el nivel de colesterol LDL en suero en ratones PCSK9hu/hu. Control de tampón ( P ) ; 316P 1 mg/kg (■); 316P 5 mg/kg (B ); 316P 10 mg/kg ( ■ ) .
Fig.12. Perfil farmacocinético en suero de mAb anti-hPCSK9 en ratones C57BL/6. Dosis única de mAb de Control I (A) a 10 mg/kg; 316P (o) a 10 mg/kg y 300N (v) a 10 mg/kg.
Fig. 13. Perfil farmacocinético en suero de mAb anti-hPCSK9 en ratones heterocigóticos para hPCSK9: dosis única a 10 mg/kg: mAb de Control I (A); 316P (o) y 300N (v).
Fig. 14. Efecto de 316P sobre los niveles de colesterol LDL en suero en hámster sirio alimentado con una dieta normal. Control de tampón (•); 316P 1 mg/kg (v); 316P 3 mg/kg (o); 316P 5 mg/kg (t).
Descripción detallada
Antes de que se describan los presentes métodos, se debe entender que la presente invención no se limita a métodos particulares, y condiciones experimentales descritas, ya que pueden variar dichos métodos y condiciones. También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares solo, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales preferidos.
Definiciones
El término "proproteína humana convertasa subtilisina/kexina tipo 9" o "hPCSK9", como se usa en el presente documento, se refiere a hPCSK9 que tiene la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO:754 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:755, o un fragmento biológicamente activo de la misma.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada ("HCVR" o "VH") y una región constante de la cadena pesada (que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3). Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera ("LCVR o "VL") y una región constante de la cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y llegaron a la conclusión de que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR están en realidad en contacto con el antígeno. Padlan también encontró muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase, por tanto, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
Se pueden identificar restos de CDR que no están en contacto con antígeno basándose en estudios previos (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 son frecuentemente no requeridos), de regiones de Kabat CDR que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelado molecular y/o empíricamente. Si una CDR o resto(s) de la misma se omite, normalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. También se pueden seleccionar empíricamente posiciones para la sustitución dentro de CDR y aminoácidos a sustituir. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAb humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir mAb en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón) han sido injertadas en secuencias de FR humana.
El término "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x10-6 M o menos (por ejemplo, una Kd más pequeña indica una unión más ajustada). Métodos de determinación de si dos moléculas se unen específicamente son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmones superficiales, y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hPCSK9 puede, sin embargo, presentar reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de PCSK9 de otras especies. Además, anticuerpos multi-específicos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen a hPCSK9 y uno o más antígenos adicionales se consideran, sin embargo, anticuerpos que "se unen específicamente" a hPCSK9, como se usa en el presente documento.
El término anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a aquellos mAb que tienen una afinidad de unión por hPCSK9 de al menos 10-10 M; preferentemente 10-11 M; incluso más preferentemente 10-12 M, como se mide por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad por solución.
Por el término "constante de disociación", "Kdis" o "kd" se indica un anticuerpo que se disocia de hPCSK9 con una velocidad constante de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o menos, como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™.
El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a hPCSK9. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada.
Las realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden conjugar con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros mAb que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hPCSK9 está sustancialmente libre de mAb que se unen específicamente a antígenos distintos de hPCSK9). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hPCSK9 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de PCSK9 de otras especies.
Un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza actividad de PCSK9"), pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a hPCSK9 produce la inhibición de al menos una actividad biológica de PCSK9. Esta inhibición de la actividad biológica de PCSK9 se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de PCSK9 por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo convencionales conocidos en la técnica (véase los ejemplos más adelante).
El término "resonancia de plasmones superficiales", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ).
El término "KD", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término "epítope" es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo. Los epítopes se pueden definir como estructurales o funcionales. Los epítopes funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopes estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopes también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epítopes pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específica.
El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de manera óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay identidad de la secuencia nucleotídica en al menos aproximadamente el 90 %, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de nucleótidos, como se mide por cualquier algoritmo muy conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se trata más adelante.
Como se aplica a polipéptidos, el término "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos el 95 %, 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Una “sustitución conservativa de aminoácido” es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren una de la otra por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz PAM250 de verosimilitud logarítmica desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345. Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz PAM250 de verosimilitud logarítmica.
La similitud de secuencia para los polipéptidos se mide normalmente usando un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de similitud asignada a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas, tales como GAP y BESTFIT que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre los polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína no mutante y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También se pueden comparar secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados: un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda e investigación (Pearson (2000) arriba). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402.
En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso en el método de la invención puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para epítopes de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico a modo de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primero y segundo dominios CH3 de Ig se diferencian el uno del otro por al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la proteína A, tal como una modificación H95R (por la numeración de exones de IMGT; H435R por la numeración de EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I por EU) en el caso de mAb IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de mAb IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de mAb IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se indica una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del fin del tratamiento, y podrá ser determinada por un experto en la materia usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Preparación de anticuerpos humanos
Se conocen métodos de generación de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE™). La tecnología VELOCiMMu NE™ implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras humanas operativamente unidas a loci de región constante de ratón endógeno de forma que el ratón produzca un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se aísla y une operativamente a ADN que codifica las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera humanas. El ADN se expresa entonces en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. En una realización específica, la célula es una célula CHO.
Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles en bloquear una interacción ligando-receptor o inhibir la interacción del componente del receptor, en vez de destruir células mediante fijación del complemento y participación en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), o destruir células mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La región constante de un anticuerpo es así importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de célula. Así, el isotipo de un anticuerpo se puede seleccionar basándose en si se desea que el anticuerpo medie en la citotoxicidad.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas a heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de anticuerpo comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150­ 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro de cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semi-anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta es debida a, pero no se limita a, diferencias estructurales asociadas al isotipo de región bisagra del anticuerpo. Una simple sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de lgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta niveles normalmente observados usando una bisagra de lgG1 humana. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, CH2 o CH3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE™ se expone al antígeno de interés, y células linfáticas (tales como linfocitos B) se recuperan de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea de células de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera se puede aislar y unir a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo se puede producir en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas se pueden aislar directamente de linfocitos específicos de antígeno.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe más adelante, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítope, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo humano completo de la invención, por ejemplo, lgG1 o lgG4 no muíante o modificado (por ejemplo, SEQ ID NO:751, 752, 753). Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, la unión al antígeno con alta afinidad y las características de especificidad por diana residen en la región variable.
Mapeo de epítopes y tecnologías relacionadas
Para seleccionar anticuerpos que se unen a un epítope particular (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de IgE a su receptor de alta afinidad), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el descrito en Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen mutantes de barrido con alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o análisis por escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopes, extracción de epítopes y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
El término “epítope” se refiere a un sitio sobre un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T. Se pueden formar epítopes de linfocitos B tanto a partir tanto de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos son normalmente retenidos por exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítope normalmente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.
El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpo basado en la estructura del antígeno (ASAP), es un método que clasifica grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos frente al mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a las superficies del antígeno modificadas química o enzimáticamente (documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítope único bien claramente diferente de o bien parcialmente solapante con el epítope representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de mAb genéticamente idénticos, tal que la caracterización se pueda basar en mAb genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado del hibridoma, el MAP puede facilitar la identificación de clones raros de hibridoma que producen mAb que tienen las características deseadas. El MAP se puede usar para clasificar los mAb anti-PCSK9 de la invención en grupos de mAb que se unen a diferentes epítopes.
En el presente documento se describen anticuerpos anti-hPCSK9 o fragmentos de unión al antígeno que se unen a un epítope dentro del dominio catalítico, que es aproximadamente 153 a 425 de SEQ ID NO:755); más específicamente, un epítope de aproximadamente 153 a aproximadamente 250 o de aproximadamente 250 a aproximadamente 425; más específicamente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al epítope dentro del fragmento de aproximadamente 153 a aproximadamente 208, de aproximadamente 200 a aproximadamente 260, de aproximadamente 250 a aproximadamente 300, de aproximadamente 275 a aproximadamente 325, de aproximadamente 300 a aproximadamente 360, de aproximadamente 350 a aproximadamente 400, y/o de aproximadamente 375 a aproximadamente 425.
El anticuerpo anti-hPCSK9 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento se puede unir a un epítope dentro del dominio de propéptido (restos 31 a 152 de SEQ ID NO:755); más específicamente, un epítope de aproximadamente el resto 31 a aproximadamente el resto 90 o de aproximadamente el resto 90 a aproximadamente el resto 152; más específicamente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une al epítope dentro del fragmento de aproximadamente el resto 31 a aproximadamente el resto 60, de aproximadamente el resto 60 a aproximadamente el resto 90, de aproximadamente el resto 85 a aproximadamente el resto 110, de aproximadamente el resto 100 a aproximadamente el resto 130, de aproximadamente el resto 125 a aproximadamente el resto 150, de aproximadamente el resto 135 a aproximadamente el resto 152, y/o de aproximadamente el resto 140 a aproximadamente el resto 152.
El anticuerpo anti-hPCSK9 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se puede unir a un epítope dentro del dominio del extremo C (restos 426 a 692 de SEQ ID NO:755); más específicamente, un epítope de aproximadamente el resto 426 a aproximadamente el resto 570 o de aproximadamente el resto 570 a aproximadamente el resto 692; más específicamente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede unir a un epítope dentro del fragmento de aproximadamente el resto 450 a aproximadamente el resto 500, de aproximadamente el resto 500 a aproximadamente el resto 550, de aproximadamente el resto 550 a aproximadamente el resto 600, y/o de aproximadamente el resto 600 a aproximadamente el resto 692.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede unir a un epítope que incluye más de uno de los epítopes enumerados dentro del dominio catalítico, de propéptido o del extremo C, y/o dentro de dos o tres dominios diferentes (por ejemplo, epítopes dentro de los dominios catalítico y del extremo C, o dentro de los dominios del propéptido y catalíticos, o dentro de los dominios del propéptido, catalítico y del extremo C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une al epítope en hPCSK9 que comprende el resto de aminoácido 238 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Resultados experimentales (Tabla 27) muestran que cuando D238 se mutó, la Kd de mAb 316P presentó una reducción de >400 veces en la afinidad de unión (~1 x10-9 M a ~410 x10-9 M) y T1/2 disminuyó >30 veces (de ~37 a ~1 min). En una realización específica, la mutación fue D238R.
En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención se une a un epítope de hPCSK9 que comprende dos o más de los restos de aminoácidos en las posiciones 153, 159, 238 y 343.
Como se muestra a continuación, una mutación en el resto de aminoácido 153, 159 o 343 produjo aproximadamente una disminución de 5 a 10 veces en la afinidad o acortamiento similar en T1/2. En realizaciones específicas, la mutación fue S153R, E159R y/o D343R.
El anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente documento se puede unir a un epítope en hPCSK9 que comprende el resto de aminoácido 366 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Resultados experimentales (Tabla 27) muestran que cuando E366 se mutó, la afinidad del mAb 300N presentó una disminución de aproximadamente 50 veces (~0,7 x10-9 M a ~36 x10-9 M) y un acortamiento similar en T1/2 (de ~ 120 a ~2 min). La mutación puede ser E366K.
En el presente documento se describen anticuerpos anti-PCSK9 que se unen al mismo epítope que cualquiera de los anticuerpos a modo de ejemplo específicos descritos en el presente documento. También en el presente documento se describen anticuerpos anti-PCSK9 que compiten para unirse a PCSK9 o un fragmento de PCSK9 con cualquiera de los anticuerpos a modo de ejemplo específicos descritos en el presente documento.
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítope o no, o compite por la unión con un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítope que un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia de la invención, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido PCSK9 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de PCSK9. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a PCSK9 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, se puede sacar la conclusión de que el anticuerpo de prueba se une con un epítope diferente que el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la molécula de PCSK9 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba se puede unir al mismo epítope que el epítope unido por el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia de la invención.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, la metodología de unión anteriormente descrita se realiza en dos orientaciones: En una primera orientación, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de PCSK9 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula de PCSK9. En una segunda orientación, se deja que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de PCSK9 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de PCSK9. Si, en ambas orientaciones, solamente el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unión a la molécula de PCSK9, entonces se llega a la conclusión de que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la PCSK9. Como se apreciará por un experto habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al epítope idéntico que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión con un epítope solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítope o epítope de solapamiento si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1,5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, 90 % o incluso el 99 % como se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 199050: 1495-1502). Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítope si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopes de solapamiento si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Entonces se puede llevar a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de prueba es de hecho debida a la unión al mismo epítope que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es el responsable de la ausencia de unión observada. Se pueden realizar experimentos de este tipo usando ELISA, RIA, resonancia de plasmones superficiales, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión de anticuerpo cuantitativo o cualitativo disponible en la materia.
En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une a una proteína PCSK9 de SEQ ID NO:755, en donde la unión entre el anticuerpo o fragmento del mismo a PCSK9 y una proteína PCSK9 de variante es inferior al 50 % de la unión entre el anticuerpo o fragmento y la proteína PCSK9 de SEQ ID NO:755. En una realización específica, la proteína PCSK9 de variante comprende al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 153, 159, 238 y 343. En una realización más específica, la al menos una mutación es S153R, E159R, D238R y D343R. La proteína PCSK9 de variante puede comprender al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 366. La proteína PCSK9 de variante puede comprender al menos una mutación de un resto en una posición seleccionada del grupo que consiste en 147, 366 y 380. La mutación puede ser S147F, E366K y/o V380M.
Inmunoconjugados
La invención engloba un anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 humano conjugado con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Agentes de citotoxina incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos de agentes de citotoxina y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo el documento WO 05/103081.
Biespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los mAb multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol.
147:60-69. Los mAb anti-PCSK9 humanos se pueden unir o co-expresar con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) a una o más de otras entidades moleculares; tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
Un formato de anticuerpo biespecífico a modo de ejemplo que se puede usar en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primer y segundo dominios CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde la diferencia de al menos un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la proteína A, tal como una modificación de H95R (por numeración de exones de IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen; D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por e U) en el caso de anticuerpos lgG4. Se contemplan variaciones del formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-PCSK9 y fragmentos de anticuerpo descritos engloban proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los mAb descritos, pero que retienen la capacidad de unirse a PCSK9 humana. Dichos mAb de variante y fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia de origen, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los mAb descritos. Asimismo, el ADN que codifica el anticuerpo anti-PCSK9 engloba secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de anticuerpo de la invención. Ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos y de ADN de variante se tratan anteriormente.
Dos proteínas de unión al antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar bajo condiciones experimentales similares, tanto dosis únicas como dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su tasa de absorción, y aún se pueden considerar bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcado, no son esenciales para la obtención de concentraciones de fármaco en el cuerpo eficaces en, por ejemplo, uso crónico, y se consideran médicamente insignificativas para el medicamento particular estudiado. En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si un paciente se puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, que incluyen un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia reducida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, hasta el punto que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en la que la concentración de anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero, u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad humana in vivo; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos en la que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Pueden construirse variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-PCSK9 de la invención, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, se pueden delecionar o sustituir restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización.
Población de tratamiento
La invención se refiere a métodos terapéuticos para tratar un paciente humano en necesidad de una composición de la invención. Aunque modificaciones en el estilo de vida y el tratamiento con fármacos convencionales son frecuentemente satisfactorios en reducir los niveles de colesterol, no todos los pacientes son capaces de lograr los niveles de colesterol objetivo recomendados con dichos enfoques. Diversas afecciones, tales como la hipercolesterolemia familiar (FH), parecen ser resistentes a reducir los niveles de LDL-C, a pesar del uso agresivo de terapia convencional. La hipercolesterolemia familiar homocigótica y heterocigótica (hoFH, heFH) es una afección asociada a enfermedad vascular aterosclerótica prematura. Sin embargo, los pacientes diagnosticados con hoFH son muy insensibles a la terapia con fármacos convencional y tienen opciones de tratamiento limitadas. Específicamente, el tratamiento con estatinas, que reducen LDL-C inhibiendo la síntesis del colesterol y regulando por incremento el receptor de LDL hepático, puede tener poco efecto en pacientes cuyos receptores de LDL son no existentes o defectuosos. Se ha informado recientemente de una reducción de LDL-C media de solo menos de aproximadamente el 20 % en pacientes con hoFH confirmada por genotipo tratados con la dosis máxima de estatinas. La adición de ezetimiba 10 mg/día a esta pauta produjo una reducción total de los niveles de LDL-C del 27 %, que está todavía muy lejos de la óptima. Asimismo, muchos pacientes son no sensibles a las estatinas, están poco controlados con la terapia con estatinas, o no pueden tolerar la terapia con estatinas; en general, estos pacientes son incapaces de lograr el control del colesterol con tratamientos alternativos. Hay una gran necesidad médica sin cumplir de nuevos tratamientos que puedan tratar los inconvenientes de las actuales opciones de tratamiento.
Poblaciones específicas tratables por los métodos terapéuticos incluyen pacientes indicados para aféresis de LDL, sujetos con mutaciones (GOF) activantes de PCSK9, hipercolesterolemia familiar heterocigótica (heFH); sujetos con hipercolesterolemia primaria que son intolerantes a las estatinas o incontrolada por estatinas; y sujetos en riesgo de desarrollar hipercolesterolemia que puede ser tratada preventivamente.
Administración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas según la invención se administrará con vehículos adecuados, excipientes, y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar transferencia mejorada, administración, tolerancia, y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónico) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semi-sólidos y mezclas semi-sólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto que se va a administrar, la enfermedad objetivo, las afecciones, la vía de administración, y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas a PCSK9, que incluyen hipercolesterolemia, trastornos asociados a LDL y apolipoproteína B, y trastornos del metabolismo de los lípidos, y similares, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, se pueden ajustar la frecuencia y la duración del tratamiento.
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica también se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, arriba, pp. 317-327; véase generalmente arriba).
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba (véase Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). En otra realización más, un sistema de liberación controlada se puede colocar en proximidad de la diana de la composición, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, arriba, vol. 2, pp. 115-138, 1984).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosa, subcutánea, intracutánea e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables se pueden preparar por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrito anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio aceitoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, están, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que se pueden usar en combinación con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio aceitoso se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que se pueden usar en combinación con un agente solubilizante, tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada. Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío se puede desechar y sustituir fácilmente con un cartucho nuevo que contiene la composición farmacéutica. Entonces puede reutilizarse el dispositivo de administración de pluma. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo de administración de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica contenida en un recipiente dentro del dispositivo. Una vez se vacía el recipiente de la composición, se desecha el dispositivo entero.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y auto-inyección reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos incluyen, pero ciertamente no se limitan a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DIs Et RONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma Hu Ma LOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar algunos. Ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente no se limitan a, pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para adecuarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo anteriormente dicho contenida es generalmente aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente dicho esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.
La invención se refiere a métodos terapéuticos en los que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es útil para tratar hipercolesterolemia asociada a una variedad de afecciones que implican a hPCSK9. Los anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de anticuerpos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento de hipercolesterolemia y similares. Las terapias de combinación pueden incluir el anticuerpo anti-PCSK9 de la invención con, por ejemplo, uno o más de cualquier agente que (1) induce un agotamiento celular de la síntesis de colesterol inhibiendo la 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG)-coenzima A (CoA) reductasa, tal como cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina; (2) inhibe la captación de colesterol y o re-absorción de ácidos biliares; (3) aumenta el catabolismo de lipoproteínas (tales como niacina); y activadores del factor de transcripción de LXR que desempeña una función en la eliminación de colesterol, tales como 22-hidroxicolesterol o combinaciones fijas, tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam), una combinación fija de niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina); o con otros agentes hipolipemiantes, tales como ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, omacor).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se exponen de manera que se proporcione a aquellos expertos habituales en la materia de una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención. Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados, pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o próxima a atmosférica.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra PCSK9 humana
Se inmunizaron ratones VELOCIMMUNE™ con PCSK9 humana, y se monitorizó la respuesta inmunitaria del anticuerpo por inmunoensayo específico de antígeno usando suero obtenido de estos ratones. Se fusionaron linfocitos B que expresaban anti-hPCSK9 recogidos de los bazos de ratones inmunizados que se mostró que tenían elevados títulos de anticuerpos anti-hPCSK9 con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Los hibridomas se cribaron y se seleccionaron para identificar líneas celulares que expresaban anticuerpos específicos de hPCSK9 usando ensayos como se describen a continuación. Los ensayos identificaron varias líneas celulares que produjeron anticuerpos anti-hPCSK9 quiméricos designados H1M300, H1M504, H1M505, H1M500, H1M497, H1M498, H1M494, H1M309, H1M312, H1M499, H1M493, H1M496, H1M503, H1M502, H1 M508, H1M495 y H1M492.
También se aislaron anticuerpos específicos de PCSK9 humana directamente de linfocitos B inmunizados con antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Se clonaron las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras para generar anticuerpos anti-hPCSK9 completamente humanos designados H1H313, H1H314, H1H315, H1H316, H1H317, H1H318, H1H320, H1H321 y H1H334. Se establecieron líneas celulares CHO que expresaban anticuerpos recombinantes estables que expresaban estos anticuerpos.
Ejemplo 2. Análisis de utilización de genes
Para analizar la estructura de los mAb producidos, se clonaron y secuenciaran los ácidos nucleicos que codificaban las regiones variables del anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos predichas de las regiones variables se confirmaron por secuenciación de aminoácidos del extremo N. A partir de la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos predicha de los mAb, se identificó el uso de genes para cada cadena de anticuerpo.
Tabla 1
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Ejemplo 3. Determinación de la afinidad de unión al antígeno
Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (Kd) para la unión de hPCSK9 a mAb generados por las líneas celulares de hibridoma descritas anteriormente por cinética superficial en un ensayo biosensor en tiempo real de resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™ T100). Cada anticuerpo se capturó a un caudal de 4 pl/min durante 90 s sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón creada mediante acoplamiento químico directo al chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectó hPCSK9-mycmyc-his (hPCSK9-mmh) a una concentración de 50 nM o 12,5 nM sobre las superficies de anticuerpo capturado a un caudal de 50 pl/min durante 300 s, y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo durante 15 min a tanto 25 °C como 37 °C (Kd = pM; T1/2 = min).
Tabla 2
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Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (Kd) para la unión de hPCSK9 a mAb generados mediante aislamiento directo de esplenocitos por cinética superficial en un ensayo biosensor en tiempo real de resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™ T100). Cada anticuerpo seleccionado se capturó a un caudal de 2 ul/min durante 6 min sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectó PCSK9-mmh humana a una concentración de 50 nM o 12,5 nM sobre la superficie de anticuerpo capturado a un caudal de 70 ul/min durante 5 min, y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo durante 15 min a tanto 25 °C como 37 °C (Kd = pM; T1/2 = min).
Tabla 3
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Se determinó la velocidad de disociación (kd) de mAb seleccionados para PCSK9 de macaco de la India (Macaca mulata) marcada (mmPCSK9; SEQ ID NO:756) (mmPCSK9-mmh) a 25 °C como se ha descrito anteriormente.
Tabla 4
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Ejemplo 4. Efecto del pH sobre la afinidad de unión al antígeno
Se evaluaron los efectos del pH sobre la afinidad de unión al antígeno por mAb anti-hPCSK9 completamente humanos producidos por células CHO como se ha descrito anteriormente. Los mAb probados son versiones completamente humanas de H1H316P ("316P'') (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 90/92; secuencias de CDR SEQ ID NO: 76/78/80 y 84/86/88) y H1M300N ("300N'') (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 218/226; secuencias de CDR SEQ ID NO:220/222/224 y 228/230/232). Se capturó hPCSK9-mmh sobre una superficie de mAb anti-myc tanto a una densidad alta (aproximadamente 35 a 45 unidades de resonancia) (UR) como a una densidad baja (aproximadamente 5 a 14 UR). Cada anticuerpo, a 50 nM en HBST (pH 7,4 o pH 5,5), se inyectó sobre la superficie de hPCSK9 capturada a un caudal de 100 pl/min durante 1,5 min a 25 °C y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo durante 10 min. Control I: mAb anti-hPCSK9 SEQ ID NO:79/101 (documento WO 2008/063382) (Kd = pM; T1/2 = min).
Tabla 5
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Las propiedades de unión al antígeno de 316P y 300N a pH 7,4 o pH 5,5 se determinaron por un ensayo BIACORE™ modificado como se ha descrito anteriormente. Brevemente, los mAb se inmovilizaron sobre chips sensores CM5 de BIACORE™ mediante acoplamiento de amina. Se inyectaron concentraciones variables de hPCSK9 marcada con myc-myc-his, PCSK9 de ratón (mPCSK9, SEQ ID NO:757), hPCSK9 con una mutación puntual de ganancia de función (GOF) de D374Y (hPCSK9(D374Y)), PCSK9 de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) (mfPCSK9, SEQ ID NO:761) (mfPCSK9), PCSK9 de rata (Rattus norvegicus) (rPCSK9, SEQ ID NO:763) y PCSK9 de hámster dorado sirio marcada con his (Mesocricetus auratus) (maPCSK9, SEQ ID NO:762) (maPCSK9), que oscilaban de 11 a 100 nM, sobre la superficie del anticuerpo a caudal de 100 pl/min durante 1,5 min y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo en tiempo real durante 5 min a tanto 25 °C (Tabla 6) como 37 °C (Tabla 7). Control II: mAb anti-hPCSK9 SEQ ID NO:67/12 (documento WO 2009/026558). NB: No se observó unión en la condición experimental (Kd = pM; T1/2 = min).
Tabla 6. Efecto del pH a 25 °C
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Tabla 7. Efecto del pH a 37 °C
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Ejemplo 5. mAb anti-hPCSK9 que se unen a hPCSK9 con la mutación puntual D374Y
Se determinó la afinidad de unión de mAb anti-hPCSK9 seleccionados por hPCSK9 con una mutación puntual de ganancia de función (GOF) de D374Y (hPCSK9(D374Y)-mmh) como se ha descrito anteriormente. Cada anticuerpo se capturó a un caudal de 40 ul/min durante 8-30 s sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectó hPCSK9(D374Y)-mmh a concentraciones variables de 1,78 nM a 100 nM sobre la superficie de anticuerpo capturado a un caudal de 50 pl/min durante 5 min, y se monitorizó la disociación de hPCSK9(D374Y)-mmh y anticuerpo durante 15 min a 25 °C. Control III: mAb anti-hPCSK9 SEQ ID NO:49/23 (documento WO 2009/026558) (Kd = pM; T 1 /2 = min).
Tabla 8
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Ejemplo 6. Especificidad de unión de mAb anti-hPCSK9
Se capturaron 316P, 300N y el mAb anti-hPCSK9 de Control I sobre un chip CM5 anti-hFc acoplado a amina en BIAc Or E™ 2000. Se inyectaron PCSK9 humana marcada (myc-myc-his), PCSK1 humana (hPCSK1) (SEQ ID NO:759), PCSK7 humana (hPCSK7) (SEQ ID NO:760) o PCSK9 de ratón (100 nM) sobre la superficie del mAb capturado y se dejó que se unieran a 25 °C durante 5 min. Se registraron los cambios en UR. Resultados: 300N y Control I se unieron solo a hPCSK9, y 316P se unió tanto a hPCSK9 como a mPCSK9.
Se determinaron las especificidades de unión de los mAb anti-hPCSK9 por ELISA. Brevemente, se recubrió anticuerpo anti-hPCSK9 sobre una placa de 96 pocillos. Se añadieron PCSK9-mmh humana, mPCSK9-mmh, maPCSK9-h, hPCSK1-mmh o hPCSK7-mmh, a 1,2 nM, a placas recubiertas de anticuerpo y se incubaron a TA durante 1 h. Entonces se detectó proteína PCSK unida a la placa por anticuerpo anti-His conjugado con HRP. Los resultados muestran que 316P se une a PCSK9 humana, de ratón y hámster, mientras que 300N y Control I solo se unieron a hPCSK9. Ninguno de los mAb anti-hPCSK9 presentó unión significativa a hPCSK1 o hPCSK7.
Ejemplo 7. Reactividad cruzada de mAb anti-hPCSK9
Se determinó la reactividad cruzada de mAb anti-hPCSK9 con mmPCSK9, mfPCSK9, mPCSK9, maPCSK9 o rPCSK9 usando BIACORE™ 3000. Los mAb anti-hPCSK9 se capturaron en una superficie anti-hFc creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™. Se inyectó hPCSK9 marcado, hPCSK9(D374Y), mmPCSK9, mfPCSK9, mPCSK9, maPCSK9 o rPCSK9, cada uno a 1,56 nM a 50 nM, sobre la superficie del anticuerpo a tanto 25 °C como a 37 °C. Se determinaron la unión entre 316P, 300N, Control I, Control II, o Control III y las proteínas PCSK9 (Kd = pM; T1 /2 = min).
Tabla 9. mAb 316P
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Tabla 10. mAb 300N
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Tabla 11. mAb de Control I
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Tabla 12. mAb de Control II
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Tabla 13. mAb de Control III
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Ejemplo 8. Inhibición de la unión entre dominios de hPCSK9 y hLDLR
Se evaluó la capacidad de mAb anti-hPCSK9 seleccionados para bloquear la unión de hPCSK9 al dominio extracelular de longitud completa de LDLR humano (hLDLR-ecto SEQ iD NO:758), dominio EGF-A de hLDLR (aminoácidos 313­ 355 de SED ID NO:758) o dominios EGF-AB de hLDLR (aminoácidos de 314-393 de SEQ ID NO:758) (número de Genbank de LDLR NM_000527) usando BIACORE™ 3000. Brevemente, la proteína hLDLR-ecto, EGF-A-hFc o EGF-AB-hFc se acopló a amina en un chip CM5 para crear una superficie de receptor o de fragmento de receptor. Se premezclaron mAb anti-hPCSK9 seleccionados, a 62,5 nM (exceso de 2,5 veces con respecto al antígeno) con 25 nM de hPCSK9-mmh, seguido de 40 min de incubación a 25 °C para permitir que la unión al antígeno del anticuerpo alcanzara el equilibrio para formar soluciones equilibradas. Las soluciones equilibradas se inyectaron sobre las superficies de receptor o de fragmento de receptor a 2 pl/min durante 40 min a 25 °C. Se determinaron los cambios en UR debidos a la unión de los mAb anti-hPCSK9 a hLDLR-ecto, EGF-A-hFc o EGF-AB-hFc. Los resultados muestran que H1H316P y H1M300N bloquearon la unión de hPCSK9-mmh a hLDLR-ecto, dominio EGF-A de hLDLR y dominios EGF-AB de hLDLR; H1H320P bloqueó la unión de hPCSK9-mmh a hLDLR-ecto y dominio EGF-A de hLDLR; y H1H321P bloqueó la unión de hPCSK9-mmh al dominio EGF-A de hLDLR.
También se evaluó la capacidad de los mAb para bloquear la unión de hPCSK9 a hLDLR-ecto, dominio EGF-A de hLDLR, o dominios EGF-AB de hLDLR con un inmunoensayo basado en ELISA. Brevemente, se recubrieron hLDLR-ecto, EGF-A-hFc de hLDLR o EGF-AB-hFc de hLDLR, cada uno a 2 pg/ml, sobre una placa de 96 pocillos en tampón PBS durante la noche a 4 °C, y los sitios de unión no específica se bloquearon con BSA. Esta placa se usó para medir hPCSK9-mmh libre en una solución de PCSK9-mmh pre-equilibrada con concentraciones variables de mAb antihPCSK9. Se premezcló una cantidad constante de hPCSK9-mmh (500 pM) con cantidades variables de anticuerpo, que oscilaban de 0 a -50 nM en diluciones sucesivas, seguido de 1 h de incubación a temperatura ambiente (TA) para permitir que la unión al antígeno del anticuerpo alcanzara el equilibrio. Las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron a placas recubiertas de receptor o fragmento de receptor. Después de 1 hora de unión, las placas se lavaron y se unieron a hPCSK9-mmh detectada usando anticuerpo anti-myc conjugado con HRP. Se determinaron los valores de CI50 (en pM) como la cantidad de anticuerpo requerida para lograr el 50 % de reducción de hPCSK9-mmh unida al receptor o fragmento de receptor recubierto en la placa. Los resultados muestran que los mAb específicos bloquean funcionalmente que PCSK9 se una a tres receptores a tanto pH neutro (7,2) como a pH ácido (5,5).
Tabla 14
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También se evaluó la capacidad de los mAb para bloquear la unión de hPCSK9(D374Y)-mmh mutante GOF de hPCSK9 al dominio EGF-A de hLDLR o dominio EGF-AB de hLDLR (valores de CI50 en pM) con el inmunoensayo basado en ELISA descrito anteriormente usando una cantidad constante de hPCSK9(D374Y)-mmh 0,05 nM.
Tabla 15
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Se evaluó la capacidad de los mAb para bloquear tanto la unión de mmPCSK9 como de mPCSK9 al dominio hLDLR-ecto, dominio EGF-A de hLDLR o dominio EGF-AB de hLDLR (valores de CI50 en pM) a pH neutro (7,2) con el inmunoensayo basado en ELISA descrito anteriormente usando una cantidad constante de 1 nM de mmPCSK9 marcada con mmh o 1 nM de mPCSK9.
Tabla 16
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Se evaluó la capacidad de los mAb para bloquear la unión de hPCSK9, mmPCSK9, rPCSK9, maPCSK9, mfPCSK9, 0 mPCSK9 al dominio EGF-A de hLDLR (valores de CI50 en pM) a pH neutro (7,2) (Tabla 17) o pH ácido (5,5, Tabla 18) con el inmunoensayo basado en ELISA descrito anteriormente usando una cantidad constante de 0,5 nM de hPCSK9-mmh, 1 nM de mmPCSK9-mmh, 1 nM de rPCSK9-mmh, 1 nM de maPCSK9-h, 0,3 nM de mfPCSK9-mmh o 1 nM de mPCSK9-mmh.
Tabla 17
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Tabla 18
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También se determinó la capacidad de 316P y Control I para bloquear la unión de hPCSK9 a hLDLR. Brevemente, se inmovilizó tanto hLDLR recombinante coma hLDLR-EGFA-mFc sobre chips CM5 de BIACORE™ mediante acoplamiento de amina. Se incubó una mezcla de antígeno-anticuerpo de hPCSK9-mmh 100 nM y 316P, mAb de Control I, o un mAb no específico de hPCSK9 (cada uno a 250 nM) a TA durante 1 h, y entonces se inyectó sobre la superficie de hLDLR o hLDLR-EGFA al caudal de 10 pl/min durante 15 min a 25 °C. Se registraron los cambios en UR debido a la unión entre hPCSK9-mmh libre en la mezcla a tanto hLDLR como hLDLR-EGFA. La unión de hPCSK9 a tanto hLDLR como a hLDLR-EGFA se bloqueó completamente por 316P y 300N, pero no por mAb de Control I.
Ejemplo 9. Mapeo de epítopes
Con el fin de determinar la especificidad de unión al epítope, se generaron tres proteínas PCSK9-mmh quiméricas en las que dominios específicos de PCSK9 humana se sustituyeron con dominios de PCSK9 de ratón. La proteína quimérica N.° 1 consiste en un pro-dominio de PCSK9 de ratón (restos de aminoácidos 1-155 de SEQ ID NO:757), seguido de un dominio catalítico de PCSK9 humana (restos 153-425 de SEQ ID NO:755) y un dominio del extremo C de PCSK9 de ratón (restos 429-694 SEQ ID NO:757) (mPro-hCat-mC-term-mmh). La proteína quimérica N.° 2 consiste en un pro-dominio de PCSK9 humana (restos 1-152 de SEQ ID NO:755), seguido de un dominio catalítico de PCSK9 de ratón (restos 156-428 de SEQ ID NO:757) y un extremo C de PCSK9 de ratón (hPro-mCat-mC-term-mmh). La proteína quimérica N.° 3 consiste en el pro-dominio de PCSK9 de ratón y un dominio catalítico de PCSK9 de ratón, seguido de un dominio del extremo C de PCSK9 humana (restos 426-692 de SEQ ID NO:755) (mPro-mCat-hC-termmmh). Además, se generó hPCSK9 con una mutación puntual de D374Y (hPCSK9(D374Y)-mmh).
Se probaron al especificidad de unión de mAb para probar proteínas hPCSK9-mmh, PCSK9-mmh de ratón, las proteínas quiméricas N.° 1, N.° 2 y N.° 3, y hPCSK9(D374Y)-mmh del siguiente modo: los mAb se recubrieron sobre una placa de 96 pocillos durante la noche a 4 °C, luego se añadió cada proteína de prueba (1,2 nM) a la placa. Después de 1 h de unión a TA, la placa se lavó y la proteína de prueba unida se detectó usando anticuerpo policlonal anti-myc conjugado con HRP (++ = DO>1,0; = DO 0,4 - 1,0; - = DO < 0,4).
Tabla 19
Figure imgf000027_0001
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Se probaron la especificidad de unión de 316P, 300N y mAbs anti-hPCSK9 de control a hPCSK9-mmh, mPCSK9-mmh, mmPCSK9-mmh, mfPCSK9-mmh, rPCSK9-mmh, proteínas quiméricas N.° 1, N.° 2 y N.° 3, y hPCSK9(D374Y)-mmh como se ha descrito anteriormente, excepto que la concentración de proteína fue 1,7 nM (- = DO < 0,7; = DO 0,7 - 1,5; + = DO > 1,5).
Tabla 20
Figure imgf000028_0001
Se obtuvieron resultados similares para los mAb seleccionados por el ensayo de unión BIACORE™. Brevemente, se capturó 316P, 300N o mAb de Control I sobre un chip CM5 anti-hFc acoplado a amina y se inyectaron 100 nM de cada proteína sobre la superficie capturada por mAb. Se determinaron los cambios en UR debidos a la unión de cada proteína a la superficie de mAb.
Tabla 21
Figure imgf000029_0002
Para evaluar además la especificidad de unión de 316P, que reacciona de forma cruzada con mPCSK9-mmh, se desarrolló un ensayo de ELISA de competición cruzada para determinar la especificidad del dominio de unión. Brevemente, los mAb específicos para la proteína quimérica N.° 1, N.° 2 o N.° 3 se recubrieron primero sobre una placa de 96 pocillos durante la noche a 1 pg/ml. Entonces se añadió PCSK9-mmh humana (2 pg/ml) a cada pocillo seguido de 1 h de incubación a TA. Se añadió 316P (1 pg/ml) y se incubó durante otra hora a TA. Se detectó 316P unido a placa usando anticuerpo policlonal anti-hFc conjugado con HRP. Aunque la unión de 316P a hPCSK9-mmh no estuvo afectada por la presencia de mAb específicos para cualquier proteína quimérica N.° 2 o proteína quimérica N.° 3, la unión de 316P a hPCSK9-mmh se redujo enormemente por la presencia de anticuerpo específico para la proteína quimérica N.° 1.
Ejemplo 10. Evaluación del perfil de unión al antígeno basado en BIACORE™
También se establecieron perfiles de unión de anticuerpo para 316P, 300N, mAb de Control I, II y III usando BIACORE™ 1000. Brevemente, se capturó hPCSK9-mmh sobre una superficie anti-myc. Se inyectó un primer mAb anti-hPCSK9 (50 pg/ml) sobre la superficie unida a PCSK9 durante 10 min, a un caudal de 10 pl/min a 25 °C. Entonces se inyectó un segundo mAb anti-hPCSK9 (50 pg/ml) sobre la superficie unida al primer mAb durante 10 min, a un caudal de 10 pl/min a 25 °C. Se midió la capacidad del primer mAb para bloquear la unión del segundo mAb y se expresa como porcentaje de inhibición.
Tabla 22
Figure imgf000029_0001
Ejemplo 11. Aumento de la captación de LDL por anticuerpos anti-hPCSK9
Se determinó la capacidad de mAb anti-hPCSK9 para aumentar la captación de LDL in vitro usando una línea celular de carcinoma de hígado hepatocelular humano (HepG2). Se sembraron células HepG2 sobre placas de 96 pocillos a 9 x 104 células/pocillo en medio completo DMEM y se incubaron a 37 °C, 5 % CO2 , durante 6 h para formar monocapas de HepG2. Se añadió PCSK9-mmh humana, a 50 nM en medio deficiente en lipoproteína (LPDS), y un mAb de prueba en diversas concentraciones de 500 nM a 0,98 nM en medio LPDS. Los datos se expresan como valores de CI50 para cada experimento (CI50 = concentración de anticuerpo a la que la captación de LDL aumenta el 50 %). Además, el experimento también mostró que tanto 316P como 300N fueron capaces de invertir completamente el efecto inhibidor de hPCSK9 sobre la captación de LDL, mientras que el mAb de Control I o el mAb anti-hPCSK9 H1M508 invirtieron el efecto inhibidor aproximadamente el 50 %.
Tabla 23
Figure imgf000030_0002
También se probó la capacidad de los mAb anti-hPCSK9 para invertir el efecto inhibidor sobre la captación de LDL por la proteína PCSK9 de diferentes especies de mamífero en una línea celular HepG2 como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se incubaron las células HepG2 durante la noche con diluciones sucesivas de anticuerpo en medio LPDS (empezando con 500 nM) y 50 nM de hPCSK9-mmh, mfPCSK9-mmh, mPCSK9-mmh, rPCSK9-mmh o maPCSK9-h. También se incubaron células HepG2 durante la noche con diluciones sucesivas de anticuerpo en LPDS (empezando con 50 nM) y hPCSK9(D374Y) 1 nM. Como se muestra en la Tabla 24, aunque 316P fue capaz de invertir completamente el efecto inhibidor sobre LDL por todas las proteínas PCSK9 probadas, 300N solo fue capaz de invertir el efecto inhibidor sobre la captación de LDL por hPCSK9, hPCSK9(D374Y) y mfPCSK9. Los valores se expresan como CI50 en nM.
Tabla 24
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Ejemplo 12. Neutralización del efecto biológico de hPCSK9 in vivo
Para evaluar el efecto biológico de neutralizar PCSK9, hPCSK9 se expresó en exceso en ratones C57BL/6 por administración hidrodinámica (HDD) de construcciones de ADN que codificaban hPCSK9-mmh de longitud completa. Se inyectaron 4 ratones (C57BL/6) con vector vacío/solución salina (control), y 16 ratones se inyectaron con 50 pg de mezcla de ADN de hPCSK9-mmh/solución salina en la vena de la cola igual al 10 % de su peso corporal. En el día 7 después de HDD, la administración de hPCSK9 produjo una elevación de 1,6 veces del colesterol total, elevación de 3,4 veces en el colesterol LDL (LDL-C) y una elevación de 1,9 veces en el colesterol no HDL (con respecto al control). Los niveles de hPCSK9 en suero en el día 7 fueron todos superiores a 1 pg/ml, como se evalúa por ELISA cuantitativo.
La administración de H1M300N en el día 6 después de HDD a 3 grupos experimentales (1, 5 o 10 mg/kg) (n=4 por grupo) mediante inyección intraperitoneal (i.p.) produjo una atenuación significativa de los niveles de colesterol en suero. 18 horas después de la administración, el colesterol total se redujo el 9,8 %, 26,3 % y 26,8 %, LDL-C se redujo el 5,1 %, 52,3 % y 56,7 %, y el colesterol no Hd L se redujo el 7,4 %, 33,8 % y 28,6 % en los grupos tratados con 1,5 o 10 mg/kg de H1M300N, respectivamente.
Ejemplo 13. Estudio farmacocinético y de química del suero en monos
Se realizó un estudio farmacocinético (FC) en macacos cangrejero macho sin tratamiento previo (Macaca fascicularis) con un intervalo de peso corporal entre 5-7 kg y de edades entre 3-5 años.
Asignaciones de grupos. Los monos se asignaron en 5 grupos de tratamiento: Grupo de tratamiento 1 (n=3) recibió tampón de control (fosfato de sodio 10 mM, pH 6 , 1 ml/kg); Grupo de tratamiento 2 (n=3) recibió 1 ml/kg de 316P (5 mg/ml); Grupo de tratamiento 3 (n=3) recibió 1 ml/kg de 300N (5 mg/ml); Grupo de tratamiento 4 (n=3) recibió 1 ml/kg de 316P (15 mg/ml); y Grupo de tratamiento 5 (n=3) recibió 1 ml/kg de 300N (15 mg/ml). Todos los tratamientos se administraron por bolo IV, seguido de un lavado con 1 ml de solución salina. El volumen de dosis total (ml) se calculó en el peso corporal más reciente (cada animal fue pesado dos veces durante la aclimatación y una vez semanalmente durante todo el estudio). Se administró una dosis única de mAb de prueba o control de tampón en el día 1.
Cuidado de los animales. Los animales se alojaron en un entorno monitorizado de temperatura y humedad. El intervalo diana de temperatura y humedad relativa estuvo entre 18-29 °C y 30-70 %, respectivamente. Un sistema de iluminación automático proporcionó un ciclo diurno de 12 horas. El ciclo oscuro se podría interrumpir para actividades relacionadas con el estudio o la instalación. Los animales se alojaron individualmente en jaulas que cumplieron las recomendaciones del Acta de Bienestar de los Animales y las recomendaciones expuestas en The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council 1996).
Dieta y alimentación. Los animales se alimentaron dos veces al día según las SOP de SNBL USA. Los animales ayunaron si se requirió por procedimientos específicos (por ejemplo, antes de las extracciones de sangre para la química del suero, recogida de orina, o cuando se realizan procedimientos que implican sedación). La dieta se analizó rutinariamente para contaminantes y se encontró que estaba dentro de las especificaciones del fabricante.
Diseño experimental. Se seleccionó un número apropiado de animales de las existencias de SNBL USA. Se examinó la salud de los animales por el personal veterinario, y se sometieron a química del suero, hematología y cribado de coagulación. 16 machos, de salud confirmada, se asignaron al estudio. Se asignaron 15 machos a grupos de control específicos y el animal restante estuvo disponible como reserva. Se usó un esquema de aleatorización estratificado que incorpora nivel de colesterol en suero (basado en el promedio de dos extracciones en la aclimatación) para asignar animales a los grupos de estudio.
Periodo de aclimatación. Animales previamente en cuarentena se aclimataron a la sala del estudio durante un mínimo de 14 días antes del inicio de la dosificación. Se recogieron datos de la fase de aclimatación de todos los animales, que incluyeron la reserva. Todos los animales se evaluaron para anomalías del comportamiento que pudieran afectar el rendimiento en el estudio. El animal de reserva se devolvió a las existencias después de día 1.
Extracción de sangre. Se recogió sangre por venopunción de una vena periférica de animales conscientes inmovilizados. Siempre que fuera posible, la sangre se recogió mediante una única extracción y entonces se dividió apropiadamente.
Estudio FC. Se recogieron muestras de sangre (1,5 ml) predosis, 2 min, 15, min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, y posteriormente una vez cada 24 h en tubos separadores de suero (SST). El suero de almacenamiento de especímenes se transfiere a 2 viales y se guarda a -60 °C o por debajo.
Se analizaron muestras de suero usando un procedimiento de ELISA optimizado (enzimoinmunoanálisis de adsorción). Brevemente, se recubrió primero una placa de microtitulación con hPCSK9-mmh. El mAb de prueba 316P o 300N se capturó entonces sobre la placa de hPCSK9-mmh. Se detectó 316P o 300N capturado usando un anti-hIgG4 de ratón biotinilado seguido de unir a NeutrAvidin-HRP. Se usaron concentraciones variables de 316P o 300N, que oscilaban de 100 a 1,56 ng/ml, como patrones. Se usó un porcentaje de suero de mono (matriz de ensayo) en ausencia de 316P o 300N como patrón de cero (0 ng/ml). Los resultados, mostrados en la Fig. 2, indican un aumento dependiente de la dosis en los niveles de 316P y 300N en suero. Se analizaron los parámetros FC usando el software WinNonlin (análisis no compartimental, administración en bolo modelo 201- IV).
Tabla 25
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Química del suero. Se recogieron muestras de sangre pre-dosis, 12 h, 48 h, y posteriormente una vez cada 48 h, para el análisis de la química clínica, en particular perfiles de lípidos (es decir, colesterol, LDL-C, HDL-C, triglicéridos). Con la excepción de la muestra 12 h post-dosis, todos los animales se sometieron a un ayuno durante la noche antes de la recogida de muestras. El volumen de muestra fue aproximadamente 1 ml. Los parámetros de química se determinaron usando un analizador automático de Olympus. Parámetros medidos (código de Xybion): Albúmina (ALB); Fosfatasa alcalina (ALP); Alanina aminotransferasa (ALT); Aspartato transaminasa (AST); Bilirrubina total (TBIL); Calcio (Ca); Colesterol total (TCho); Creatina cinasa (CK); Creatinina (CRN); Gamma-glutamiltransaminasa (GGT); Glucosa (GLU); Fósforo inorgánico (IP); Proteína total (TP); Triglicérido (TRIG); Nitrógeno ureico en sangre (BUN); Globulina (GlOb ); Relación albúmina/globulina (A/G); Cloruro (Cl); Potasio (K); Sodio (Na); colesterol LDL y HDL. El suero residual se almacenó a -20 °C o por debajo y se desechó no antes de una semana después del análisis.
Los resultados de las muestras hasta el momento de tiempo día 105 post-dosis se muestran en las Fig. 3-7. Hubo una reducción en el colesterol total y LDL-C en animales que recibieron 316P y 300N, independientemente de la dosis, en el plazo de 24 horas desde la primera dosis. El colesterol total en suero se redujo rápidamente y consistentemente (~35 %, Fig. 3). Se observó una disminución consistente de ~80 % en LDL-C (Figs. 4-5) en el día 6. En animales que recibieron una dosis de 15 mg/kg de 300N, la reducción en tanto el colesterol total (~10-15 % de reducción) como LDL-C (~40 % de reducción) continuó hasta al menos el día 80 del estudio. Además, HDL-C se elevó en animales que recibieron 316P a 15 mg/kg (Fig. 6 ). Los animales que recibieron una dosis mayor (15 mg/kg) de tanto 316P como 300N también mostraron una reducción en los triglicéridos durante el transcurso del estudio (Fig. 7). 316P presentó supresión máxima de los niveles de LDL-C de hasta el 80 % con respecto al nivel inicial. La longitud de esta supresión fue dependiente de la dosis con al menos el 60 % de supresión (con respecto a los niveles de LDL-C del nivel inicial) durando aproximadamente 18 días (5 mg/kg dosis) y aproximadamente 45 días (15 mg/kg dosis). 300N presenta un perfil farmacodinámico distinto de 316P. La supresión de LDL-C por 300N se mantuvo durante un periodo de tiempo mucho más largo a dosis comparables (50 % de supresión de LDL-C durante 28 días siguiendo una dosis de 5 mg/kg y 50 % de supresión de LDL-C durante aproximadamente 90 días siguiendo una dosis de 15 mg/kg). Hubo poco o ningún cambio medible en la función hepática como se ha determinado por mediciones de ALT y AST. Todos los animales que recibieron un anticuerpo anti-PCSK9 en el estudio presentaron una rápida supresión de colesterol LDL-C y total.
También se observó un efecto reductor de LDL-C similar de 316P y 300N en macacos cangrejeros que recibieron una única administración subcutánea (SC) de tanto 5 mg/kg de 316P como 5 mg/kg de 300N (Fig. 8 ). Tanto 316P como 300N suprimieron espectacularmente los niveles de LDL-C y mantuvieron un efecto reductor de LDL-C durante aproximadamente 15 y 30 días, respectivamente (Fig. 8 ). Parece que el efecto farmacodinámico (aproximadamente 40 % de supresión de LDL-C) se correlaciona aproximadamente con los niveles de anticuerpo funcional en suero de mono (Fig. 9). A medida que disminuyen los niveles de anticuerpo por debajo de 10 pg/ml, pareció que la supresión de LDL-C disminuyó también. Además, 300N demostró una semivida en circulación sustancialmente más larga que 316P y, por lo tanto, una supresión de LDL-C observada más larga.
Tabla 26
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Ejemplo 14. Atenuación de la degradación de receptores de LDL por anticuerpos anti-hPCSK9
Para evaluar el efecto biológico de PCSK9 sobre los niveles de receptor de LDL hepático y los posteriores efectos sobre los niveles de LDL-C en suero, se administró hPCSK9 a ratones que expresaban hPCSK9 pero no mPCSK9 (ratones PCSK9hu/hu) mediante inyección intravenosa. Específicamente, se inyectaron ratones PCSK9hu/hu con PBS (control), o 1,2 mg/kg de hPCSK9-mmh mediante la vena de la cola. Seis horas después de la administración de hPCSK9, se observó una elevación de 1,4 veces (con respecto al nivel inicial) en el colesterol total y un elevación de 2,3 veces en LDL-C en suero. El análisis de los niveles de receptor de LDL hepático en una cohorte separada (n=3) de animales 4 horas después de la administración de hPCSK9 reveló una reducción significativa en el receptor de LDL detectable en homogeneizados de hígado.
Para evaluar el efecto biológico de anti-hPCSK9 en los niveles de receptor de LDL hepático y los posteriores efectos sobre los niveles de LDL-C en suero, se administraron 316P y un mAb no específico de hPCSK9 a ratones PCSK9hu/hu a dosis equivalentes (5 mg/kg i.p.) 20 horas antes de la inyección de la proteína hPCSK9-mmh descrita anteriormente. Cuatro horas después de la administración de hPCSK9, los ratones se sacrificaron y se recogió un total de ocho tejidos (hígado, cerebro, pulmón, riñón, corazón, íleon, adrenal y páncreas) y se determinaron los niveles de receptor de LDL por transferencia Western. Solo se observaron cambios en los niveles de receptor de LDL en el hígado. En comparación con la dosificación de control de PBS, la administración de 316P bloqueó significativamente el aumento mediado por PCSK9 en el colesterol total y el colesterol LDL (LDL-C = 2,49 mg/dl en el nivel inicial y 3,1 mg/dl 6 horas después de PCSK9; un aumento del 25 % en comparación con 135 % con vehículo). Antes de la administración del mAb no específico de hPCSK9 se bloquearon los aumentos de LDL-C por aproximadamente el 27 % de PBS solo (LDL-C = 4,1 mg/dl en comparación con PBS 5,6 mg/dl). El análisis de los niveles de receptor de LDL en una cohorte separada de ratones (n=3 por grupo) reveló una reducción significativa en los niveles de receptor de LDL con administración de PCSK9, que se bloqueó por 316P pero no por el mAb no específico de hPCSK9 (Fig. 10).
También se evaluó el efecto de diferentes dosis de 316P en ratones PCSK9hu/hu con tanto niveles de LDL-C elevados como de hPCSK9 elevada. Primero se pusieron ratones PCSK9hu/hu en una dieta rica en hidratos de carbono durante 8 semanas, produciendo una elevación de ~2 veces en tanto los niveles de LDL-C como de hPCSK9. Se administró a los ratones tanto el mAb 316P como uno no específico de hPCSK9, cada uno a 1 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg. Los sueros se recogieron 24 horas después y se analizaron los niveles de LDL-C. 316P fue eficaz en disminuir los niveles de LDL-C de un modo dependiente de la dosis (Fig. 11). Además, 316P administrado a una dosis de 10 mg/kg redujo rápidamente los niveles de LDL-C de nuevo a los valores originales (pre-dieta) en el plazo de 24 horas (datos no mostrados).
Ejemplo 15. Estudios FC en ratón
Se realizó un estudio FC en ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad y ratones heterocigóticos para hPCSK9 de 11­ 15 semanas de edad. Se administró SC una única inyección de Control I, 316P o 300N, cada una a 10 mg/kg. Se midieron sangrados de suero para niveles de hIgG a 0 h (pre-sangrado), 6 h, día 1, 3, 6, 10, 14, 21, 28, 35, 42 y 56, para un total de 12 momentos de tiempo, usando un ELISA de captura anti-hFc y de detección anti-hFc (Fig. 12 y 13). Todos los mAbs alcanzaron su Tmáx aproximadamente 3 días con niveles de Cmáx correspondientes de aproximadamente 47-115 pg/ml para ratones C57BL/6 y 55-196 pg/ml para los ratones heterocigóticos para hPCSK9. En el día 56, los niveles de mAb de Control I fueron aproximadamente 12 pg/ml y los niveles de 300N fueron aproximadamente 11 pg/ml, mientras que los niveles de 316P fueron aproximadamente inferiores a 0,02 pg/ml en ratones C57BL/6. En el día 56 en ratones heterocigóticos para hPCSK9, los niveles de mAb de Control I fueron aproximadamente 29 pg/ml, mientras que tanto los niveles de 300N como de 316P estuvieron por debajo del límite cuantificable (BQL) de 0,02 pg/ml.
Ejemplo 16. Unión del anticuerpo anti-hPCSK9 a hPCSK9 mutante/variante
Para evaluar además la unión entre hPCSK9 y los mAb anti-hPCSK9, se generaron 21 proteínas hPCSK9 de variante en las que cada variante contuvo una única mutación puntual y dos proteínas hPCSK9 de variante contuvieron cada una una mutación doble. Cada anticuerpo seleccionado se capturó en una superficie anti-hIgG de F(ab')2 creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Cada hPCSK9 de variante marcada con mmh a concentraciones variables de 100 nM a 25 nM se inyectó entonces sobre la superficie de anticuerpo capturado a un caudal de 60 pl/min durante 240 s, y la disociación de hPCSK9 de variante y el anticuerpo se monitorizó en tiempo real durante 20 min a 25 °C. nb: no se observó unión en estas condiciones experimentales (Kd = M x10-9; T 1 /2 = min; WT = no mutante).
Tabla 27
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Los resultados muestran que cuando el resto D238 se mutó, la afinidad de unión de 316P por hPCSK9 se redujo >400 veces, de una Kd de 1 x 10-9 M a 410 x 10-9 M; y T1 /2 se acortó aproximadamente 30 veces, de 37 a 1 min, que indica que 316P se une al epítope en hPCSK9 que comprende D238 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Adicionalmente, los ensayos BIACORE™ muestran que la afinidad de unión de 316P y T 1 /2 se redujeron aproximadamente 5 a 10 veces cuando se mutó un resto en 153, 159 o 343. Específicamente, Kd se redujo de aproximadamente 1 x 10-9 M a entre aproximadamente 5 - 8 x 10-9 M cuando se mutaron uno cualquiera de S153, E159 o D343; mientras que T 1 /2 disminuyó de aproximadamente 37 min a entre aproximadamente 4 - 6 min.
La unión de 300N a hPCSK9 se redujo aproximadamente 50 veces cuando se mutó el resto en la posición 366, produciendo una reducción de Kd de aproximadamente 0,7 x 10-9 M a aproximadamente 36 x 10-9 M y un T1 /2 más corto de aproximadamente 120 a 2 min. Estos resultados indican que 300N se une al epítope en hPCSK9, que comprende E366 de hPCSK9 (SEQ ID NO:755). Adicionalmente, los ensayos BIACORE™ muestran que la afinidad de unión de 300N y T1 /2 se redujeron entre 2 y >10 veces cuando se mutó un resto en 147 o 380. Específicamente, Kd se redujo de aproximadamente 0,69 x 10-9 M a entre aproximadamente 2 - 9 x 10-9 M cuando se mutaron cualquiera de S147 o V380; mientras que T 1 /2 se acortó de aproximadamente 120 min a entre aproximadamente 24 - 66 min. En comparación con 316P, la unión de 300N a hPCSK9 no se redujo por una mutación en el resto 238.
A diferencia, el anticuerpo de Control I no presentó una afinidad de unión alterada o T 1 /2 en respuesta a cualquiera de las mutaciones de posición probadas; el anticuerpo de Control II presentó una reducción de la afinidad de 40 veces cuando se mutó el resto 215 (R215E) (de ~0,1x10-9 a ~4,5x10-9), y T1 /2 fue aproximadamente 27 veces más corto (de ~333 a 12 min); mientras que el anticuerpo de Control III presentó una disminución de la afinidad cuando se mutó el resto 237 (Kd disminuyó de ~0,6x10-9 a ~5,9 x10-9, y T 1 /2 disminuyó de ~481 a -43 min).
Se probó la especificidad de unión de 316P, 300N y mAbs anti-hPCSK9 de control por variantes de hPCSK9 usando un inmunoensayo basado en ELISA. Los mAb anti-PCSK9 se recubrieron sobre una placa de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. Cada hPCSK9 de variante marcado con mmh en sobrenadantes de lisado de transfección transitoria de CHO-k1 se añadió a la placa recubierta de anticuerpo a diversas concentraciones que oscilaban de 0 a 5 nM. Después de 1 h de unión a TA, la placa se lavó y la hPCSK9 de variante unida se detectó usando anticuerpo policlonal anti-myc conjugado con HRP (- = DO < 0,7; = DO 0,7 - 1,5; + = DO > 1,5).
Tabla 28
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humano o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo humano que se une específicamente a la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (hPCSK9) que comprende un dominio de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de SEQ ID NO: 76, un dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de SEQ ID NO: 78, un dominio de CDR3 de cadena pesada (HCDR3) de SEQ ID NO: 80, un dominio de CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de SEQ ID NO: 84, un dominio de CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de SEQ ID NO: 86 y un dominio de CDR3 de cadena ligera (LCDR3) de SEQ ID NO: 88, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea la unión de hPCSK9 con el ectodominio del receptor de lipoproteína de baja densidad humana (hLDLR), el dominio hLDLR EGF-A y los dominios hLDLR EGF-AB.
2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 1, en donde la región variable de la cadena pesada (HCVR) tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 90 y/o la región variable de la cadena ligera (LCVR) tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 92.
3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 2, en donde la HCVR tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 90 y/o la LCVR tiene al menos el 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 92.
4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 3, en donde la HCVR tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 90 y/o la LCVR tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 92.
5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la reivindicación 4, en donde la HCVR tiene al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 90 y/o la LCVR tiene al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 92.
6. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde posiciones de restos que no son idénticas se diferencian por sustituciones conservativas de aminoácidos.
7. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, que es una IgG1 o IgG4.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o el anticuerpo de la reivindicación 7.
9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.
10. Un método de producción de un anticuerpo anti-PCSK9 humana o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión según la reivindicación 9 en una célula huésped aislada, cultivar la célula en condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento del mismo, y recuperar el anticuerpo o fragmento así producido.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el anticuerpo según la reivindicación 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el anticuerpo según la reivindicación 7, para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por PCSK9 en un sujeto, en donde la enfermedad o afección mediada por PCSK9 es hipercolesterolemia.
13. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el anticuerpo según la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por PCSK9 en un sujeto, en donde la enfermedad o afección mediada por PCSK9 es hipercolesterolemia.
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