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CN102245641A - 抗pcsk9的高亲和力人抗体 - Google Patents

抗pcsk9的高亲和力人抗体 Download PDF

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CN102245641A
CN102245641A CN200980150206XA CN200980150206A CN102245641A CN 102245641 A CN102245641 A CN 102245641A CN 200980150206X A CN200980150206X A CN 200980150206XA CN 200980150206 A CN200980150206 A CN 200980150206A CN 102245641 A CN102245641 A CN 102245641A
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Abstract

一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特异性结合并抑制其活性的人抗体或人抗体的抗原结合片段，其特征为，相对于给药前水平，能使血清LDL胆固醇含量下降40至80％达24天、60天或90天，而血清HDL胆固醇含量则下降很少或不下降，且经ALT和AST测量确定对肝功能影响很小或没有可测量的影响。

Description

抗PCSK9的高亲和力人抗体
发明领域
本发明涉及与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
关于相关技术的陈述
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成的，在内质网中经过自身催化分子内加工。证据显示，PCSK9促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。PCSK9蛋白的结构显示，它具有一个信号序列、接着是一个前结构域、一个含有保守三元残基(D186、H226和S386)的催化结构域，以及一个C端结构域。它是作为可溶性74-kDa前体合成的，在内质网中经过自身催化裂解而产生一个14-kDa前结构域和60-kDa催化片段。业已显示该自身催化活性是分泌过程所需要的。裂解之后，上述前结构域保持与催化结构域紧密相连的状态。
PCSK9的抗体在例如WO 2008/057457、WO 2008/057458、WO 2008/057459、WO 2008/063382、WO 2008/125623以及US2008/0008697等专利中均有述及。
发明概要
在第一个方面，本发明提供了一些与人PCSK9(hPCSK9)特异性结合且中和其活性的完全人单克隆抗体(mAbs)及其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，并至少具有以下一个特征：
(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35％并保持这种下降趋势达至少24天，较佳的是使血清总胆固醇含量下降至少约30至40％；
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80％并保持这种下降趋势达至少24天；
(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40％；
(iv)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平，降低血清HDL胆固醇含量不超过5％。
在一个实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，并至少具有以下一个特征：
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70％并保持这种下降趋势达至少60天或90天；
(ii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40％；
(iii)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平，降低血清HDL胆固醇含量不超过5％。
在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基238的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的一个或一个以上氨基酸残基238、153、159和343的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段的特征是与在SEQ ID NO：755的192、194、197和/或237位置不含氨基酸残基的表位结合。
在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基366的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段与在SEQ ID NO：755的147、366和380位置包含一个或一个以上氨基酸残基的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段的特征是，在SEQ ID NO：755的215和/或238位置与不含氨基酸残基的表位结合。
在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是，经表面等离子体共振技术测量，相对于pH 7.4条件下的结合亲和力(KD)，在pH 5.5条件下显示与hPCSK9的结合亲和力KD增强。在一个特殊的实施方案中，经表面等离子体共振技术测量，该抗体或其片段在酸性pH条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性pH条件下增强至少20倍、至少40倍或至少50倍。
在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是，经表面等离子体共振技术测量，未显示在酸性pH条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性pH条件下有所增强。在一个特殊的实施方案中，与中性pH条件相比，酸性pH条件下的结合力较小且T1/2较短。
在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人、人GOF突变D374Y、猕猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及仓鼠的PCSK9结合。
在一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人和猴的PCSK9结合，但不与小鼠、大鼠或仓鼠的PCSK9结合。
这些mAbs抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)，或可仅包含一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修饰以影响其功能，例如消除残余的效应子功能(Reddy et al.(2000)J.Immunol.164：1925-1933)。
在一个实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链可变域(HCVR)：SEQ ID NO：2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、698、714、718、722、738和742，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，该HCVR是一个选自下列一组序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：50、66、70、74、90、94、122、138、142、218、234、238、242、258、262、314、330和334。在一个较特殊的实施方案中，该HCVR包含SEQ ID NO：90或218。
在一个实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个选自下列一组序列的轻链可变域(LCVR)：SEQ ID NO：10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740和744，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，该LCVR是一个选自下列一组序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：58、68、72、82、92、96、130、140、144、226、236、240、250、260、264、322、332和336。在一个较特殊的实施方案中，该LCVR包含SEQ ID NO：92或226。
在一个特殊的实施方案中，该抗体或其片段包含一个选自下列一组序列的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对：SEQ ID NO：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。在一个实施方案中，该HCVR和LCVR是一对选自下列一组序列对的氨基酸序列对：SEQ ID NO：50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、330/332和334/336。在一个较特殊的实施方案中、该HCVR/LCVR序列对包含SEQ ID NO：90/92或218/226。
在第二个方面，本发明的特点是有一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链CDR3(HCDR3)域：SEQID NO：8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、680、704和728，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链CDR3(LCDR3)域：SEQ ID NO：16、40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、616、640、664、688、712和736，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，该HCDR3/LCDR3序列对是SEQ ID NO：56/64、80/88、128/136、224/232、248/256或320/328。在一个较特殊的实施方案中，该HCDR3/LCDR3包含SEQ ID NO：80/88或224/232。
在一个进一步的实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链CDR1(HCDR1)域：SEQ ID NO：4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、628、652、676、700和724，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；一个选自下列一组序列的重链CDR2(HCDR2)域：SEQ ID NO：6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、606、630、654、678、702和726、或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；一个选自下列一组序列的轻链CDR1(LCDR1)域：SEQ ID NO：12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708和732，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链CDR2(LCDR2)域：SEQ ID NO：14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、638、662、686、710和734、或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，该重链和轻链CDR序列是SEQ ID NO：52、54、56、60、62、64；76、78、80、84、86、88；124、126、128、132、134、136；220、222、224、228、230、232；244、246、248、252、254、256；以及316、318、320、324、326、328。在一个较特殊的实施方案中，该重链和轻链CDR序列是SEQ ID NO：76、78、80、84、86、88；或220、222、224、228、230、232。
在一个相关的实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或抗体片段包含位于选自下列一组序列的重链和轻链序列对内的重链和轻链CDR域：SEQ IDNO：2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500、502/504、506/514、522/524、526/528、530/538、546/548、550/552、554/562、570/572、574/576、578/586、594/596、598/600、602/610、618/620、622/624、626/634、642/644、646/648、650/658、666/668、670/672、674/682、690/692、694/696、698/706、714/716、718/720、722/730、738/740和742/744。在一个实施方案中，该CDR序列位于选自下列一组氨基酸序列对的HCVR和LCVR域内：SEQ ID NO：50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、330/332和334/336。在一个较特殊的实施方案中，该CDR序列位于选自下列一组氨基酸序列对的HCVR和LCVR域内：SEQ ID NO：90/92或218/226。
在一个实施方案中，本发明提供了一些与hPCSK9特异性结合且中和其活性的完全人单克隆抗体(mAbs)或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段显示了一个或多个如下特征：
(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35％并保持这种下降趋势达至少24天，较佳的是使血清总胆固醇含量下降至少约30至40％；
(ii)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80％并保持这种下降趋势达至少24天；
(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40％；
(iv)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5％；
(v)与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基238的表位结合；
(vi)相对于pH 7.4条件下，在pH 53时，表面等离子体共振测量显示hPCSK9的结合亲和力(KD)增强，亲和力增加至少约20倍至50倍；
(vii)与人、人GOF突变D374Y、猕猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及仓鼠的PCSK9结合；
(viii)包含含有SEQ ID NO：80和88的重链和轻链CDR3序列；
(ix)包含选自SEQ ID NO：90和92的CDR序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种与hPCSK9特异性结合及中和其活性的完全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段显示了一个或多个如下特征：
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70％并保持这种下降趋势达至少60天或90天；
(ii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40％；
(iii)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5％。
(iv)与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基366的表位结合；
(v)经表面等离子体共振技术测量，未显示在酸性pH条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性pH条件下有所增强；
(vi)与人和猴的PCSK9结合，但不与小鼠、大鼠或仓鼠的PCSK9结合；
(vii)包含含有SEQ ID NO：224和232的重链和轻链CDR3序列；
(viii)包含选自SEQ ID NO：218和226的CDR序列。
在第三方面，本发明提供了编码抗PCSK9抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括运载本发明核酸的重组表达载体，以及引入这类载体的宿主细胞，并包括一些在允许产生抗体和收集所产生抗体的条件下通过培养宿主细胞而生产抗体的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体或其片段，其包含一个由选自下列序列的核酸序列编码的HCVR：SEQ ID NO：1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、721、737和741，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。在一个实施方案中，该HCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的：SEQ ID NO：49、65、69、73、89、93、121、137、141、217、233、237、241、257、261、313、329和333。在一个较特殊的实施方案中，该HCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的：SEQ ID NO：89和217。
在一个实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个由选自下列一组序列的核酸序列编码的LCVR：SEQ ID NO：9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739和743，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。在一个实施方案中，该LCVR是由选自下列一组序列的核酸序列编码的：SEQ ID NO：57、67、71、81、91、95、129、139、143、225、235、239、249、259、263、321、331和335。在一个较特殊的实施方案中，该LCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的：SEQ ID NO：91和225。
在一个实施方案中，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的HCDR3域：SEQ ID NO：7、31、55、79、103、127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、631、655、679、703和727，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列；以及一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的LCDR3域：SEQ ID NO：15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711和735，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。在一个实施方案中，该HCDR3和LCDR3序列是由下列核酸序列分别编码的：SEQ ID NO：55/63、79/87、127/135、223/231、247/255和319/327。在一个较特殊的实施方案中，该HCDR3和LCDR3序列对是由下列核酸序列编码的：SEQ ID NO：79/87和223/231。
在一个进一步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDR1域：SEQ ID NO：3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699和723，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDR2域：SEQ ID NO：5、29、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、557、581、605、629、653、677、701和725，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列；一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDR1域：SEQ ID NO：11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707和731，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列；以及一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDR2域：SEQ ID NO：13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、613、637、661、685、709和733，或一种与其实质上相似具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同源性的序列。在一个实施方案中，该重链和轻链CDR序列是由下列核酸序列编码的：SEQ ID NO：51、53、55、59、61、63；75、77、79、83、85、87；123、125、127、131、133、135；219、221、223、227、229、231；243、245、247、251、253、255；以及315、317、319、323、325、327。在一个较特殊的实施方案中，该重链和轻链CDR序列是由下列核酸序列编码的：SEQ ID NO：75、77、79、83、85、87；以及219、221、223、227、229、231。
在第四个方面，本发明的特点是一种与hPCSK9特异性结合的分离的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个HCDR3和一个LCDR3，其中HCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20的氨基酸序列(SEQ ID NO：747)，其中X1是Ala；X2是Arg或Lys；X3是Asp；X4是Ser或Ile；X5是Asn或Val；X6是Leu或Trp；X7是Gly或Met；X8是Asn或Val；X9是Phe或Tyr；X10是Asp；X11是Leu或Met；X12是Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位；X16是Tyr或缺位；X17是Gly或缺位；X18是Met或缺位；X19是Asp或缺位，以及X20是Val或缺位；LCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO：750)，其中X1是Gln或Met；X2是Gln；X3是Tyr或Thr；X4是Tyr或Leu；X5是Thr或Gln；X6是Thr；X7是Pro；X8是Tyr或Leu，以及X9是Thr。
在一个进一步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的HCDR1序列(SEQ ID NO：745)，其中X1是Gly；X2是Phe；X3是Thr；X4是Phe；X5是Ser或Asn；X6是Ser或Asn；X7是Tyr或His；以及X8是Ala或Trp；一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的HCDR2序列(SEQ ID NO：746)；其中X1是Ile；X2是Ser或Asn；X3是Gly或Gln；X4是Asp或Ser；X5是Gly；X6是Ser或Gly；X7是Thr或Glu；以及X8是Thr或Lys；一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12的LCDR1序列(SEQ ID NO：748)，其中X1是Gln；X2是Ser；X3是Val或Leu；X4是Leu；X5是His或Tyr；X6是Arg或Ser；X7是Ser或Asn；X8是Asn或Gly；X9是Asn；X10是Arg或Asn；X11是Asn或Tyr；以及X12是Phe或缺位；一个结构式为X1-X2-X3的LCDR2序列(SEQ ID NO：749)，其中X1是Trp或Leu；X2是Ala或Gly；以及X3是Ser。图1显示了316P和300N mAbs的重链和轻链可变域的序列比对。
在第五个方面，本发明的特点是一种人抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由衍生自VH、DH和JH种系序列的核苷酸序列片段编码的重链可变区(HCVR)，以及一个由衍生自VK和JK种系序列的核苷酸序列片段编码的轻链可变区(LCVR)，其中该种系序列是(a)VH基因片段3-23、DH基因片段7-27、JH基因片段2、VK基因片段4-1以及JK基因片段2；或(b)VH基因片段3-7、DH基因片段2-8、JH基因片段6、VK基因片段2-28以及JK基因片段4。
在第六个方面，本发明的特点是一种与PCSK9蛋白(SEQ IDNO：755)结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段与一种变异PCSK9蛋白的结合比抗体或其片段与SEQ ID NO：755的PCSK9蛋白之间的结合低50％。在一个特殊的实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与该变异PCSK9蛋白的结合亲和力(KD)比与PCSK9(SEQ IDNO：755)的结合力低约50％、低约60％、低约70％、低约80％、低约90％或低约95％。
在一个实施方案中，该变异PCSK9蛋白在SEQ ID NO：755的238位包含至少一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变为D238R。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO：755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低90％，其中该变异蛋白在残基238处包含一个突变。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO：755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低80％，其中该变异蛋白在一个或一个以上残基153、159、238和343处包含一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变是S153R、E159R、D238R和D343R之一。
在一个实施方案中，该变异PCSK9蛋白在SEQ ID NO：755的366位包含至少一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变为E366K。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO：755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低95％，其中该变异蛋白在残基366处包含一个突变。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO：755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低70％、80％或90％，其中该变异蛋白在一个或一个以上残基147、366和/或380处包含一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变是S147F、E366K和V380M之一。
本发明包括具有一种经修饰的糖基化模式的抗PCSK9抗体。在某些应用中，进行修饰以除去某些不希望的糖基化位点也许是有益的，或例如除去岩藻糖基以提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参阅Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其它一些应用中，为了改变补体依赖性细胞毒性(CDC)，可进行半乳糖基化的修饰。
在第七个方面，本发明之特点是一种含有与hPCSK9特异性结合的重组人抗体或其片段以及一种药学上可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，本发明之特点是一种组合物，它是本发明之抗体或抗体的抗原结合片段和第二种治疗剂的结合。第二种治疗剂可为与本发明之抗体或其片段有利地结合的任何药剂，例如，一种通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶能够诱导胆固醇合成的细胞清除的药剂，例如西利维司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；能够抑制胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的药剂；能够增加脂蛋白分解代谢的药剂(如烟酸)；和/或在胆固醇如22-羟基胆固醇的清除过程中起作用的LXR转录因子的活化剂。
在第八个方面，本发明的特点是一些用本发明之抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段抑制hPCSK9活性的方法，其中该治疗方法包括施用一种疗效量的含有本发明之抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的疾病是通过除去、抑制或降低PCSK9的活性而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或症状。可以本发明之方法治疗的具体人群包括需要LDL血浆置换的患者、PCSK9激活突变(获得功能的突变，即GOF)的患者、杂合家族性高胆固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素无法控制的原发性高胆固醇血症患者；以及具有患高胆固醇血症的危险但可进行预防性治疗的患者。其它症状包括与次要原因如II型糖尿病相关的血脂异常、胆汁郁积型肝病(原发性胆汁性肝硬变化)、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症；以及动脉粥样硬化和心血管疾病的预防和治疗。
在本发明之方法的一些特殊的实施方案中，本发明之抗hPCSK9抗体或抗体片段可用于降低偏高的总胆固醇、非HDL胆固醇、LDL胆固醇、和/或载脂蛋白B(载脂蛋白B100)的含量。
本发明之抗体或抗体片段可单独使用或与第二种药剂如一种HMG-CoA还原酶的抑制剂和/或其它降低脂质的药物结合使用。
其它的实施方案包括将如上所定义的抗体或抗体的抗原结合片段用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症。
本发明包括在用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症的药剂的制造过程中，使用如上所定义的抗体或抗体的抗原结合片段。在一些特殊的实施方案中，其中PCSK9介导的疾病或症状是高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、杂合家族性高胆固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。
在阅读以下详细叙述的过程中，其它的实施方案将变得很明显。
附图的简要说明
图1：重链(A)和轻链(B)可变区和抗体H1H316P和H1M300N的CDR序列比较表。
图2：血清中抗体浓度随时间的变化。316P 5mg/kg(□)；300N 5mg/kg(○)；316P 15mg/kg(ν)；300N 15mg/kg(●)。
图3：以
Figure BDA0000068178550000151
衝液对照
Figure BDA0000068178550000152
化百分比表示的血清
Figure BDA0000068178550000153
固醇水平。对照(T)；316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(σ)；316P 15mg/kg(□)；300N15mg/kg(△)。
图4：以衝液对照
Figure BDA0000068178550000155
化百分比表示的血清LDL固醇水平。对照(T)；316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(σ)；316P 15mg/kg(□)；300N 15mg/kg(△)。
图5：相对于缓冲液对照归一化的血清LDL胆固醇水平。
Figure BDA0000068178550000161
衝液对照(T)；316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(σ)；316P 15mg/kg(□)；300N 15mg/kg(△)。
图6：以衝液对照化百分比表示的血清HDL
Figure BDA0000068178550000164
固醇水平。对照(T)；316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(σ)；316P 15mg/kg(□)；300N 15mg/kg(△)。
图7：以
Figure BDA0000068178550000165
衝液对照
Figure BDA0000068178550000166
化百分比表示的血清甘油三酯水平。
Figure BDA0000068178550000167
衝液对照(T)；316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(σ)；316P 15mg/kg(□)；300N 15mg/kg(△)。
图8：单剂量皮下注射后，以从基
Figure BDA0000068178550000168
的
Figure BDA0000068178550000169
化百分比表示的血清LDL
Figure BDA00000681785500001610
固醇水平。316P 5mg/kg(ν)；300N 5mg/kg(●)。
图9：单剂量皮下注射后血清抗体浓度随时间的变化。316P 5mg/kg(●)；300N 5mg/kg(σ)。
图10：小鼠总肝匀浆LDL受体的西方印迹试验。于注射PBS(1-3行)、5mg/kg 316P(4-6行)或5mg/kg非hPCSK9特异性mAb(7-8行)后24小时，以及1.2mg/kg hPCSK9-mmh(所有行)注射后4小时取样。
图11：316P对PCSK9hu/hu小鼠体内血清LDL胆固醇水平的响。缓冲液对照(()；316P 1mg/kg
Figure BDA00000681785500001612
316P 5mg/kg
Figure BDA00000681785500001613
316P 10mg/kg
Figure BDA00000681785500001614
图12：C57BL/6小鼠的抗hPCSK9mAb血清药代动力学特性。单剂量注射：对照I mAb(λ)为10mg/kg；316P(σ)为10mg/kg以及300N(ν)为10mg/kg。
图13：hPCSK9杂合小鼠的抗hPCSK9 mAb血清药代动力学特性：单剂量10mg/kg：对照I mAb(λ)；316P(σ)和300N(ν)。
图14：316P对喂以正常饲料的叙利亚仓鼠体内血清LDL胆固醇水平的影响。缓冲液对照(●)；316P 1mg/kg(ν)；316P 3mg/kg(σ)；316P 5mg/kg(τ)。
本发明的详细说明
在描述本发明的方法之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，但现将描述的是首选的方法和材料。
定义
本文所用的术语“人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9”或“hPCSK9”是指具有SEQ ID NO：754所示核酸序列和SEQ ID NO：755所示氨基酸序列或其生物活性片段的hPCSK9。
本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子。每条重链均由一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区组成(由CH1、CH2和CH3域组成)。每条轻链均由一个轻链可变区(LCVR或VL)和一个轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着保存性更好的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的删除也是可能的。在科学文献中已经叙述了其中一个或两个CDR被删除以用于结合的抗体。Padlan et al.(1995 FASEB J.9：133-139)基于已发表的晶体结构，分析了抗体及其抗原之间的接触域，并得出结论，只有约五分之一至三分之一的CDR残基与抗原实际接触。Padlan还发现了许多抗体，其中一个或两个CDR不含与抗原接触的氨基酸(还可参阅Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
不接触抗原的CDR残基可基于先前的研究利用分子模拟和/或根据经验从位于Chothia CDR域外的Kabat CDR域识别(例如CDRH2中的H60-H65残基往往是不需要的)。如果一个CDR或其残基被删除，通常它会被另一人抗体序列或这类序列共有区内占据相应位置的氨基酸取代。CDR和氨基酸内的取代位置也可根据经验选择。经验取代可以是保守的或不保守的取代。
本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明之人mAbs抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人抗体”并不意在包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人构架序列上的mAbs抗体。
“特异性结合”或类似术语意为一个抗体或抗原结合片段与一个在生理条件下相对稳定的抗原形成复合体。特异性结合可以一个至少约1x10-6M或更小的平衡离解常数来描述(例如一个较小的KD就意味着较紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等方法。但是，特异性结合hPCSK9的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的PCSK9分子可显示交叉反应性。然而，与hPCSK9及一个或一个以上其它抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性抗体)依然被认为是“特异性结合”hPCSK9的抗体，如本文所用。
术语“高亲和力”抗体是指经表面等离子共振技术例如BIACORETM或溶液亲和ELISA法测定，与hPCSK9的结合亲和力为至少10-10M、较佳的是10-11M、更佳的是10-12M的mAbs抗体。
术语“慢离解速率(slow off rate)”、“Koff”或“kd”是指经表面等离子共振技术例如BIACORETM测定，以1x10-3s-1或更低、较佳的是以1x10-4s-1或更低的速率常数从hPCSK9离解的抗体。
本文所用的抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体片段”)这一术语是指抗体中一个或多个保持了与hPCSK9特异性结合能力的片段。抗体片段可包括一个Fab片段、一个F(ab′)2片段、一个Fv片段、一个dAb片段、一个含有CDR的片段，或一个分离的CDR。
本发明的具体实施方案、抗体或抗体片段可与一种治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联。
本文所用的“分离抗体”意指实质上不含其它具有不同抗原特异性的mAbs的抗体(例如特异性结合hPCSK9的分离抗体就在实质上不含能特异性结合hPCSK9之外抗原的mAbs)。但是，特异性结合hPCSK9的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的PCSK9分子可具有交叉反应性。
本文所用的“中和抗体”(或“中和PCSK9活性的抗体”)意指其与hPCSK9的结合将导致PCSK9的至少一种生物活性被抑制的抗体。PCSK9生物活性的这种抑制可通过以本领域内众所周知的若干标准体外或体内测定法中一种或多种方法测定PCSK9生物活性的一个或多个指标进行评估(参阅下文的实施例)。
本文所用的术语“表面等离子共振”是指一种光学现象。基于这种光学现象可利用例如BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)来检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。
本文所用的术语“KD”意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡离解常数。
术语“表位”是指抗原中与抗体结合的区域。表位可定义为结构性表位或功能性表位。功能性表位通常是结构性表位的一个亚型，并具有直接影响相互作用亲和力的残基。表位可以是构象表位，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，后者是分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基类或磺酰基类；在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
术语“本质上同一性”或“本质上相同”当指核酸或其碎片时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，用下述任何著名的算法如FASTA、BLAST或GAP测量，至少具有90％的核苷酸碱基序列相同性，更首选的是至少具有95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基序列相同性。
当应用于多肽时，术语本质上相似”指两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的预设间隙重量达排列到最佳比对时，两者至少有90％的序列相同性，更首选的是至少有95％、98％或99％的序列相同性。首选的是，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于某些保守取代的情况中，可将序列相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参阅例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。首选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet et al.(1992)Science 256：144345中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中任何正值的变化。“中度保守的”取代是PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。
多肽的序列相似性通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如“GAP”和“BESTFIT”的程序，可以默认参数使用这些程序，以确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG Version 6.1。还可以用GCG Version 6.1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重迭区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明之序列与含有大量的源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一首选的算法是BLAST计算机程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403410及(1997)NucleicAcids Res.25：3389402.
在一些特殊的实施方案中，本发明之方法所使用的抗体或抗体片段可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽之表位的抗原结合域。可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个IgCH3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig CH3结构域包含一个降低或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰(按照IMGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含一个Y96F修饰(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个CH3域内找到的其它修饰包括：在IgG1 mAbs的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2 mAbs的情况下为N44S、K52N和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4 mAbs情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。
“有效治疗量”这一短语意为对受药对象能产生所需作用的量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并可由本领域专业人员使用已知技术确定(例如参阅Lloyd(1999)The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)。
人抗体的制备
在转基因小鼠体内产生人抗体的方法是众所周知的(例如参阅美国第6,596,541号专利，Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNETM)。VELOCIMMUNETM技术涉及到这样一种转基因小鼠的产生：该小鼠的基因组包含一些与内源小鼠恒定区基因座有效地连接(operably linked)的人重链和轻链可变区，使得该小鼠能响应抗原刺激而产生一种包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。将编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA分离出来，并与编码人重链和轻链恒定区的DNA有效地连接。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在具体的实施方案中，该细胞是一种CHO细胞。
抗体可在治疗过程中用于阻断配体-受体之间的相互作用或抑制受体组分之间的相互作用，而不是通过固定补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)来杀灭细胞，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ACDC)来杀灭细胞。因此，抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是重要的。因此，可根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同型。
人抗体可以两种与铰链异质性有关的形式存在。在一种形式中，抗体分子包含一种约150-160kDa的稳定的四链构建物，其中两个二聚体通过一个重链间的二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是通过重链间的二硫键连接在一起，而是形成了一种由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。这两种形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。
第二种形式在各种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区之单个氨基酸取代可将第二种形式(Angal et al.(1993)Molecular Immunology30：105)的出现频度显著地降低到利用人IgG1铰链所观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体。所述的突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。
通常，用所研究抗原冲击致敏VELOCIMMUNETM小鼠，并从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)。淋巴细胞可与一个骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后对这种杂交瘤细胞系进行筛选，以识别能产生对相关抗原具有特异性之抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与合乎需要的重链和轻链的同型恒定区连接。这种抗体蛋白可在一种细胞如CHO细胞中产生。另外，编码抗原特异的嵌合抗体或轻链和重链可变域的DNA可直接从抗原特异的淋巴细胞中分离出来。
首先，分离包含一个人可变区和一个小鼠恒定区的抗体的高亲和力嵌合抗体。如下所述，根据所需的特点，包括亲和力、选择性、表位等鉴定和选择抗体。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明之完全人抗体，例如野生型的或经修饰的IgG1或IgG4(例如SEQ ID NO：751、752、753)。所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特性则存在于可变区中。
表位作图和相关技术
为筛选能与特定表位结合的抗体(例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗体)，可进行常规的交联-阻断分析，如Antibodies，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)中所述。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)。
术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由毗连的氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折迭而并列在一起的非毗连氨基酸形成。由毗连氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折迭形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。
修饰辅助概况分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-basedAntibody Profiling，ASAP)，是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克隆抗体(mAbs)进行分类的方法(美国专利2004/0101920号)。每一类均可反映与另一类所代表的表位截然不同或部分重迭的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的mAbs，从而可使鉴定工作集中在遗传上不同的mAbs上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某些罕见杂交瘤克隆，后者能产生具有所需特性的mAbs。MAP可用来将本发明的抗PCSK9mAbs抗体分类成结合不同表位的mAbs抗体组。
在各种各样的实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与催化域(SEQ ID NO：755的约153至425)内的一个表位结合；更具体的是，与从约153至约250或从约250至约425的片段内的一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约153至约208、从约200至约260、从约250至约300、从约275至约325、从约300至约360、从约350至约400，和/或从约375至约425的片段内一个表位结合。
在各种各样的实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与前肽域(SEQ ID NO：755的31至152残基)内的一个表位结合；更具体的是，与从约31残基至约90残基或从约90残基至约152残基内一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约31残基至约60残基、从约60残基至约90残基、从约85残基至约110残基、从约100残基至约130残基、从约125残基至约150残基、从约135残基至约152残基，和/或从约140残基至约152残基的片段内的一个表位结合。
在某些实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与C端域(SEQ ID NO：755的426至692残基)内的一个表位结合；更具体的是，与从约426残基至约570残基或从约570残基至约692残基内一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约450残基至约500残基、从约500残基至约550残基、从约550残基至约600残基，和/或从约600残基至约692残基的片段内的一个表位结合。
在某些实施方案中，抗体或抗体片段与一个表位结合，该表位包括催化域、前肽域或C端域内和/或两个或三个不同域内的一个以上所列举表位(例如催化域和C端域内，或前肽域和催化域内，或前肽域、催化域和C端域内的表位)。
在某些实施方案中，该抗体或抗原结合片段与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基238的hPCSK9上的一个表位结合。实验结果(表27)显示，当D238发生突变时，mAb 316P的KD显示结合亲和力下降＞400倍(～1x10--9M至～410x10-9M)且T1/2下降＞30倍(从～37至～1min)。在一个特殊的实施方案中，该突变是D238R。在某些实施方案中，本发明之抗体或抗原结合片段与在153、159、238和343位置上含有两个或两个以上氨基酸残基的hPCSK9的一个表位结合。
如下所示，氨基酸残基153、159或343的突变导致了亲和力下降约5至10倍或T1/2类似的缩短。在一些特殊的实施方案中，突变为S153R、E159R和/或D343R。
在某些实施方案中，该抗体或抗原结合片段与包含hPCSK9(SEQ ID NO：755)的氨基酸残基366的hPCSK9上的一个表位结合。实验结果(表27)显示，当E366发生突变时，mAb 300N的亲和力显示约50倍的下降(～.7x10--9M至～36X10-9M)且T1/2也类似地缩短(从～120至～2min)。在一个特殊的实施方案中，该突变是E366K。
本发明包括与本文所述的任何特殊代表性抗体一样与表位结合的抗PCSK9抗体。类似地，本发明还包括与本文所述的任何特殊代表性抗体在与PCSK9或PCSK9片段结合过程中竞争的抗PCSK9抗体。
使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之对照抗PCSK9抗体一样与同样的表位结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是否与本发明之对照抗PCSK9抗体一样与同样的表位结合，让该对照抗体与PCSK9蛋白或肽在饱和条件下结合。然后，评估试验抗体与该PCSK9分子结合的能力。如果该试验抗体在与对照抗PCSK9抗体饱和结合之后能够与PCSK9结合，就可得出结论，该试验抗体和对照抗PCSK9抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该试验抗体在与对照抗PCSK9抗体饱和结合之后不能与PCSK9分子结合，那么该试验抗体就可与本发明之对照抗PCSK9抗体所结合的同一表位结合。
为了确定一种抗体是否与对照抗PCSK9抗体在结合过程中竞争，在两个方向实施上述结合方法：在第一个方向，让对照抗体与PCSK9分子在饱和条件下结合，然后评估试验抗体与该PCSK9分子的结合。在第二个方向，让试验抗体与PCSK9分子在饱和条件下结合，然后评估对照抗体与该PCSK9分子的结合。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与PCSK9分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与对照抗体在与PCSK9结合的过程中竞争。如同本领域专业人员所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体未必与对照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重迭或邻近的表位结合而在空间上阻断该对照抗体。
如果每个抗体竞争性地抑制(阻断)另一抗体与抗原的结合，两个抗体就会与同一或重迭的表位结合。换言之，一种1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的抗体将抑制另一抗体的结合达至少50％，但较佳的是75％，90％或甚至99％，如竞争结合分析所测量(参阅例如Junghans et al.，Cancer Res.199050：1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的几乎所有的氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的某些氨基酸突变也能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重迭的表位。
然后可进行其它常规实验(例如肽突变和结合分析)以确定是否观察到的试验抗体的结合不足实际上是由于与对照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间阻断(或另一现象)是观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、表面等离子体共振技术、流式细胞计量法或本领域内所具备的任何其它定量或定性的抗体结合分析。
在一个特殊的实施方案中，本发明包括一种抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段，它与序列号为SEQ ID NO：755的PCSK9蛋白结合，其中该抗体或其片段与PCSK9和PCSK9蛋白变体之间的结合低于该抗体或片段与序列号为SEQ ID NO：755的PCSK9蛋白之间的结合的50％。在一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体在153、159、238和343位置包含至少一个残基突变。在一个更特殊的实施方案中，至少一个突变是S153R、E159R、D238R和D343R。在另一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体包含至少一个位于366的突变。在一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体在147、366和380位置包含至少一个残基突变。在一个更特殊的实施方案中，该突变是S147F、E366K和/或V380M。
免疫偶联物
本发明包括一种与治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联的人抗PCSK9单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。适宜于形成免疫偶联物的细胞毒素和化疗剂的例子是本领域内众所周知的。参阅如WO 05/103081。
双特异性
本发明之抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性mAbs抗体可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽的抗原结合域。参阅，如Tutt et al.(1991)J.Immunol.147：60-69。人抗PCSK9 mAbs抗体可连接到另一个功能分子，如另一个肽或蛋白质上，或与之共同表达。例如，一种抗体或其片段可与一种或多种其它分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其它方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig CH3结构域含有一个降低或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰(按照IMGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含一个Y96F修饰(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个CH3域内找到的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下为N44S、K52N和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。
生物等效物
本发明之抗PCSK9抗体和抗体片段包括某些蛋白，这些蛋白含有不同于所述mAbs抗体的氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了与人PCSK9结合的能力。当与母体序列比较时，这类变异的mAbs抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，但显示了与所述mAbs抗体的生物活性基本上相当的生物活性。类似地，当与所披露序列比较时，本发明之编码抗PCSK9抗体的DNA序列含有的序列包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但可编码与本发明之抗PCSK9抗体或抗体片段基本上生物等效的抗PCSK9抗体或抗体片段。这类变异氨基酸和DNA序列的实例已在上面讨论。
如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替代物，当在相似实验条件下无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差别，则它们被认为是生物等效的。某些抗体如果它们的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将被认为是等效物或药物替代物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差别是有意设计的并反映在标签上，这种差别对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的(例如对于慢性用途)，并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床意义上的差别，则它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果一名患者可以在对照产品和生物产品之间转换一次或多次而不良副作用的风险并未如预期那样增加，包括与无这种转换的连续治疗相比在免疫原性方面无显著的临床变化或效率降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的作用机制起作用，且这类机制是众所周知的，则它们就是生物等效的。
生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量包括，例如，(a)一种在人类或其它哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b)一种体外试验，该试验已与人的体内试验生物利用率数据建立相关联系并可根据人的体内试验生物利用率数据合理预测；(c)一种人类或其它哺乳类动物的体内试验，其中抗体(或其目标)适当的急性药理作用是作为时间的函数测定的；以及(d)一种控制良好的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。
本发明抗PCSK9抗体的生物等效变体可通过例如取代生物活性不需要的各种残基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性并非必需的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复原时形成不必要或不正确的分子内二硫化物桥。
治疗群体
本发明提供了一些治疗方法以治疗需要使用本发明组合物的人类患者。尽管改变生活方式和常规药物治疗往往能成功地降低胆固醇水平，但并非所有患者都能用这些手段达到推荐的目标胆固醇水平。尽管积极地采用常规治疗，但各种各样的症状，如家族性高胆固醇血症(FH)，似乎会抵制降低LDL-C水平的措施。纯合和杂合家族性高胆固醇血症患者(hoFH、heFH)是与过早出现的动脉粥样硬化血管疾病相关的症状。但是，诊断为hoFH的患者在很大程度上对常规的药物治疗无反应且只有有限的治疗选择。具体来说，采用抑制胆固醇合成和上调肝脏LDL受体而降低LDL-C的抑制素进行治疗，对LDL受体不存在或有缺陷的患者效果甚小。据最近报道，在用最高剂量抑制素治疗的基因型确定的hoFH患者中，平均LDL-C下降还不到20％。在此治疗方案基础上增加10mg/日的依泽替米贝(ezetimibe)导致LDL-C水平总共下降了27％，但离最佳效果仍然相距甚远。类似地，许多患者对抑制素无反应、用抑制素治疗对病情的控制较差，或不能耐受抑制素治疗；一般来说，这些患者用其它治疗方式不能达到对胆固醇的控制。对于能克服现有治疗措施之缺点的新治疗方法有着很大的尚未满足的需要。
可以本发明之方法治疗的具体人群包括需要LDL血浆置换的患者、PCSK9激活(GOF)突变的患者、杂合家族性高胆固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素无法控制的原发性高胆固醇血症患者；以及具有患高胆固醇血症的危险但可进行预防性治疗的患者。
治疗给药和配方
本发明提供了一些含有本发明之抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明之治疗组合物将与适宜的载体、赋形剂以及其它加入配方中改善转移、递送、耐受性等的制剂一起施用。在药剂化学师所熟知的处方集里可以找到大量的适宜配方。雷氏药学大全：Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA.。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的泡囊(如LIPOFECTINTM)、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有聚乙二醇的半固体状混合物。还可参阅Powell et al.Compendium of Excipients for ParenteralFormulations(非肠道用配方赋形剂概论)，PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52：238-311。
其剂量可根据即将受药的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、病症、给药途径等因素而改变。当本发明之抗体用于治疗与PCSK9相关的各种病症和疾病，包括高胆固醇血症、与LDL和载脂蛋白B相关的疾病，以及脂质代谢疾病等时，对于一名成年患者来说以静脉输入本发明之抗体是有利的。通常是按照约0.01至约20mg/kg体重，较佳的是按照约0.02至7、约0.03至约5，或约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量输入。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调节。
各种给药系统是众所周知的并可用于本发明之医药组合物的给药，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊中、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅例如Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可以任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起给药。给药方式可以是全身性或局部性的。
该医药组合物也可以微囊尤其是脂质体形式给药(参阅Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat et al.(1989)in Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer(脂质体用于传染病和癌症治疗)，Lopez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；一般参阅同上)。
在某些情况下，该医药组合物可以一种控制性释放系统给药。在一个实施方案中，可使用一个泵(参阅Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料；参阅Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，Florida(1974)。在又一个实施方案中，可将一种控制释放系统置于该组合物目标的附件，从而只需要全身性剂量的一部分(参阅例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release(控制释放的医学应用)，出处同上，vol.2，pp.115-138，1984)。
可注射制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些可注射制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水介质或通常用于注射的油性介质中，以此方式制备该可注射制剂。作为注射用的水介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿瓶中。本发明之医药组合物可用标准的针头和针筒经皮下或静脉注射。此外，对于皮下给药，一种笔型给药装置可方便地用于本发明之医药组合物的给药。这种笔型给药装置可以重复使用或一次性使用。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的含医药组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一个含医药组合物的新药筒取代。该笔型给药装置就可重复使用。在一次性使用的笔型给药装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置有一个预先充满医药组合物的贮液器。一旦该贮液器内药物组合物用完，整个装置则被丢弃。
许多可重复使用的笔型和自动注射给药装置已用于本发明之医药组合物的皮下给药。其例子包括但当然不限于AUTOPENTM(OwenMumford，Inc.，Woodstock，英国)、DISETRONICTM笔(DisetronicMedical Systems，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利斯)、NOVOPENTM I、II和III型(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦)、BDTM笔(Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM，以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis，德国法兰克福)，此处仅列举几个品牌。用于本发明之医药组合物皮下给药的一次性使用的笔型给药装置的例子包括但当然不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)，FLEXPENTM(Novo Nordisk)，以及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利的是，上述口服或注射用医药组合物是制备成单位剂量的剂型，以包含一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5至约500mg；尤其是注射剂型，首选的是上述抗体含量为约5至约100mg，其它剂型中抗体含量为约10至约250mg。
本发明提供了一些治疗方法，其中将本发明之抗体或抗体片段用于治疗各种涉及hPCSK9的高胆固醇血症。本发明之抗PCSK9抗体或抗体片段对于高胆固醇血症及类似病症的治疗是尤其有用的。复合疗法可包括本发明之抗PCSK9抗体与例如一种或多种药剂结合，该药剂(1)通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶能够诱导胆固醇合成的细胞清除，如西利维司汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)；(2)能够抑制胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收；(3)能够增加脂蛋白分解代谢(如烟酸)；以及在胆固醇如22-羟基胆固醇的清除过程中起作用的LXR转录因子的活化剂，或一种固定的结合如依泽替米贝(ezetimibe)加辛伐他汀(simvastatin)；一种抑制素加胆汁树脂(如消胆胺(cholestyramine)、降脂树脂II(colestipol)、考来维仑(colesevelam)，烟酸与一种抑制素的固定结合(如烟酸加洛伐他汀)；或与其它降脂质药剂如欧米加-3-脂肪酸乙酯(如omacor)的固定结合。
实施例
举出以下实施例是为了向本领域一般技术人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的披露和说明，并非是为了限制被发明者视为其发明的范围。已作出许多努力以确保所用数字的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。
实施例1：抗人PCSK9的人抗体的产生
将VELOCIMMUNETM小鼠用人PCSK9免疫，并以抗原特异免疫测定法用这些小鼠的血清以监测抗原免疫反应。从显示较高抗hPCSK9抗体效价的免疫小鼠的脾脏收获表达B细胞的抗hPCSK9，并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用如下所述的分析法筛选该杂交瘤以鉴定表达hPCSK9特异性抗体的细胞系。该分析法鉴定了几种产生嵌合的抗hPCSK9抗体的细胞系，这些抗体分别以H1M300、H1M504、H1M505、H1M500、H1M497、H1M498、H1M494、H1M309、H1M312、H1M499、H1M493、H1M496、H1M503、H1M502、H1M508、H1M495以及H1M492表示。
如美国专利2007/0280945A1中所述，人PCSK9特异性抗体还可从经抗原免疫的B细胞直接分离而不与骨髓瘤细胞融合。克隆重链和轻链可变域以产生完全人抗hPCSK9抗体，分别H1H313、H1H314、H1H315、H1H316、H1H317、H1H318、H1H320、H1H321以及H1H334表示。表达这些抗体的稳定的重组CHO细胞系得以确定。
实施例2：基因利用分析
为了分析所产生mAbs的结构，对编码抗体可变区的核酸进行了克隆和测序。经N-端氨基酸测序证实了预测的可变区氨基酸序列。从mAbs的核酸序列和预测的氨基酸序列出发，为每种抗体链鉴定了基因的用途。
表1
Figure BDA0000068178550000361
实施方案3：抗原结合亲和力测定
hPCSK9与上述杂交瘤细胞系所产生的mAbs结合的平衡离解常数(KD)是根据实时生物传感器表面等离子体共振分析(BIACORETMT100)的表面动力学测定的。通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，以4μl/min的流量将每种抗体捕获在其表面上达90秒钟，以形成捕获抗体表面。将浓度为50nM或12.5nM的hPCSK9-myc-myc-his(hPCSK9-mmh)注射在该捕获抗体的表面上，流量为50μl/min，注射300秒钟，并于25℃或37℃监测抗原-抗体离解过程达15分钟(KD＝pM；T1/2＝min)。
表2
Figure BDA0000068178550000371
hPCSK9与直接分离脾细胞所产生的mAbs结合的平衡离解常数(KD)是根据实时生物传感器表面等离子体共振分析(BIACORETMT100)的表面动力学测定的。通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生山羊抗人IgG多克隆抗体，以2ul/min的流量将每种选定的抗体捕获在其表面上达6秒钟，以形成捕获抗体表面。将浓度为50nM或12.5nM的人PCSK9-mmh注射在该捕获抗体的表面上，流量为70ul/min，注射5分钟，并于25℃或37℃监测抗原-抗体离解过程达15分钟(KD＝pM；T1/2＝min)
表3
Figure BDA0000068178550000381
选定mAbs与标记恒河猴(Macaca mulata)PCSK9(mmPCSK9；SEQ ID NO：756)(mmPCSK9-mmh)于25℃的离解速率(kd)以如上所述方式确定。
表4
  抗体   kd(1/s)   T1/2(min)
  H1H313P   2.92x10-5   396
  H1H318P   3.69x10-3   3
  H1H334P   8.06x10-3   1
  H1H315P   2.29x10-4   51
  H1H316P   2.29x10-4   51
  H1H320P   3.17x10-4   36
  H1M300   1.52x10-4   76
  H1M504   5.04x10-4   23
  H1M497   6.60x10-5   175
  H1M503   8.73x10-5   132
  H1M496   4.45x10-5   260
实施例4：pH值对抗原结合亲和力的影响
按照如上所述评估了pH值对CHO细胞产生的全人源抗hPCSK9 mAbs的抗原结合亲和力的影响。所测试的mAbs是全人源H1H316P(“316P”)(HCVR/LCVR SEQ ID NO：90/92；CDR序列SEQ ID NO：76/78/80和84/86/88)以及H1M300N(“300N”)(HCVR/LCVR SEQ ID NO：218/226；CDR序列SEQ IDNO：220/222/224和228/230/232)。将hPCSK9-mmh以高密度(约35至45共振单位，RU)或低密度(约5至14RU)捕获在抗myc mAb表面。将浓度为50nM的每种抗体的HBST溶液(pH 7.4或pH 5.5)于25℃注射在捕获的hPCSK9抗体表面，流量为100μl/ml，注射1.5分钟，并监测抗原-抗体离解过程达10分钟。对照抗体I：抗hPCSK9 mAbSEQ ID NO：79/101(WO 2008/063382)(KD＝pM；T1/2＝min)。
表5
Figure BDA0000068178550000391
按照如上所述以改进的BIACORETM分析法于pH 7.4或pH5.5测定316P和300N的抗原结合特性。简言之，以胺偶联法将mAbs固定在BIACORETM CM5传感芯片上。将11至100nM不同浓度myc-myc-his标记的hPCSK9、小鼠PCSK9(mPCSK9，SEQ ID NO：757)、含有D374Y获得功能(GOF)点突变的hPCSK9(hPCSK9(D374Y))、猕猴(Macaca fascicularis)PCSK9(mfPCSK9，SEQID NO：761)(mfPCSK9)、大鼠(Rattus norvegicus)PCSK9(rPCSK9，SEQ ID NO：763)以及his标记的叙利亚金仓鼠(Mesocricetus auratus)PCSK9(maPCSK9，SEQ ID NO：762)(maPCSK9)，以100μl/ml流量注射在抗体表面达1.5min，并于25℃(表6)或37℃(表7)实时监测抗原-抗体离解过程达5分钟。对照抗体II：抗hPCSK9 mAbs SEQ ID NO：67/12(WO 2009/026558)。注：在实验条件下未观察到结合现象(KD＝pM；T1/2＝min)。
表6 25℃温度下pH值的影响
Figure BDA0000068178550000401
表7 37℃温度下pH值的影响
Figure BDA0000068178550000411
实施例5：抗hPCSK9 mAbs与含有点突变D374Y的hPCSK9之结合
选定的抗hPCSK9 mAbs与含有获得功能(GOF)点突变D374Y的hPCSK9(hPCSK9(D374Y)-mmh)的结合亲和力是按照如上所述方法测定的。通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生山羊抗人IgG多克隆抗体，以40ul/min的流量将每种抗体捕获在其表面上达8至30秒钟，以形成捕获抗体表面。将浓度为1.78nM至100nM的hPCSK9(D374Y)-mmh注射在该捕获抗体的表面上，流量为50μl/min，注射5分钟，并于25℃监测hPCSK9(D374Y)-mmh和抗体离解过程达15分钟：对照抗体III：抗hPCSK9 mAbs SEQ ID NO：49/23(WO 2009/026558)(KD＝pM；T1/2＝min)。
表8
  抗体   KD   T1/2
  316P   1780   14
  300N   1060   49
  对照I   23600   25
  对照II   66   216
  对照III   1020   126
实施例6：抗hPCSK9 mAbs的结合特异性
将316P、300N和对照抗体I抗hPCSK9 mAbs捕获在BIACORETM2000胺偶联的抗hFc CM5芯片上。将标记的(myc-myc-his)人PCSK9、人PCSK1(hPCSK1)(SEQ ID NO：759)、人PCSK7(hPCSK7)(SEQ ID NO：760)，或小鼠PCSK9注射(100nM)在捕获的mAb表面上，并于25℃结合5分钟。记录RU的变化。结果：300N和对照抗体I仅与hPCSK9结合，而316P则与hPCSK9和mPCSK9两者都结合。
以ELISA测定了抗hPCSK9 mAbs的结合特异性。简言之，将抗hPCSK9抗体涂布在一个96孔板上。将1.2nM人PCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、maPCSK9-h、hPCSK1-mmh或hPCSK7-mmh加至抗体涂布的板上，并于室温培养1小时。然后以HRP缀合的抗His抗体检测与板结合的PCSK蛋白。结果显示，316P与人、小鼠和仓鼠PCSK9结合，而300N和对照抗体I仅与hPCSK9结合。所有抗hPCSK9 mAbs均不显示与hPCSK1或hPCSK7的显著结合。
实施例7：抗hPCSK9 mAbs的交叉反应性
用BIACORETM3000测定抗hPCSK9 mAbs与mmPCSK9、mfPCSK9、mPCSK9、maPCSK9或rPCSK9的交叉反应性。将抗hPCSK9 mAbs捕获在通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生的抗hFc的表面上。将纯化的带标记的hPCSK9、hPCSK9(D374Y)、mmPCSK9、mfPCSK9、mPCSK9、maPCSK9或rPCSK9分别以1.56nM至50nM的浓度于25℃或37℃注射在抗体表面。测定316P、300N、对照I、对照II或对照III与PCSK9蛋白之间的结合(KD＝pM；T1/2＝min)。
表9 316P mAb
表10 300N mAb
Figure BDA0000068178550000432
表11对照I mAb
Figure BDA0000068178550000441
表12对照II mAb
Figure BDA0000068178550000442
表13对照III mAb
Figure BDA0000068178550000443
实施例8：抑制hPCSK9和hLDLR域之间的结合
使用BIACORETM 3000评估选定抗hPCSK9 mAbs阻断hPCSK9与人LDLR全长胞外域(hLDLR-ecto SEQ ID NO：758)、hLDLR EGF-A域(SED ID NO：758的313-355氨基酸)、或hLDLREGF-AB域(SED ID NO：758的314-393氨基酸)(LDLR Genbank编号NM_000527)结合的能力。简言之，以胺偶联法将hLDLR-ecto、EGF-A-hFc或EGF-AB-hFc蛋白偶联在CM5芯片上，以产生受体或受体片段表面。将62.5nM(2.5倍过量于抗原)的抗hPCSK9 mAbs与25nM hPCSK9-mmh预混合，然后于25℃培养40分钟使抗体-抗原结合达到平衡以形成平衡溶液。于25℃将平衡溶液以2μl/min流量注射在受体或受体片段表面达40分钟。测定因抗hPCSK9 mAbs与hLDLR-ecto、EGF-A-hFc或EGF-AB-hFc的结合而引起的RU变化。结果显示，H1H316P和H1M300N阻断了hPCSK9-mmh与hLDLR-ecto、hLDLREGF-A域以及hLDLR EGF-AB域的结合；H1H320P阻断了hPCSK9-mmh与hLDLR-ecto以及hLDLR EGF-A域的结合；以及H1H321P阻断了hPCSK9-mmh与hLDLR EGF-A域的结合。
mAbs阻断hPCSK9与hLDLR-ecto、hLDLR EGF-A域或hLDLR EGF-AB域结合的能力也是用基于ELISA的免疫分析法评估的。简言之，分别以2μg/ml浓度将hLDLR-ecto、hLDLR EGF-A-hFc或hLDLR EGF-AB-hFc涂布在96孔板上，于4℃在PBS缓冲液中培养过夜，并用BSA阻断非特异性结合位点。用此板在以不同浓度抗hPCSK9 mAbs预平衡的PCSK9-mmh溶液中测量游离hPCSK9-mmh。将定量的hPCSK9-mmh(500pM)与0至～50nM不同量的抗体系列溶液预混合，然后在室温(RT)下培养1小时使抗体-抗原结合达到平衡。将此平衡样品溶液转移至受体或受体片段涂布的培养板上。结合1小时后，洗涤此培养板并用HRP辍合的myc抗体检测结合的hPCSK9-mmh。测定IC50值(以pM为单位)，其定义为使得与板上涂布的受体或受体片段结合的hPCSK9-mmh下降50％所需的抗体量。结果显示，在中性pH(7.2)和酸性pH(5.5)条件下，特异性mAbs均功能性地阻断PCSK9与三种受体的结合。
表14
Figure BDA0000068178550000461
mAbs阻断hPCSK9 GOF突变体hPCSK9(D374Y)-mmh与hLDLR EGF-A域或hLDLR EGF-AB域(IC50值，以pM为单位)结合的能力也是用上述基于ELISA的免疫分析法使用定量的0.05nMhPCSK9(D374Y)-mmh评估的。
表15
mAbs阻断mmPCSK9或mPCSK9与hLDLR-ecto域、hLDLREGF-A域或hLDLR EGF-AB域(IC50值，以pM为单位)结合的能力，是在中性pH(7.2)条件下使用定量的1nM mmh标记的mmPCSK9或1nM mPCSK9，用上述基于ELISA的免疫分析法评估的。
表16
mAbs阻断hPCSK9、mmPCSK9、rPCSK9、maPCSK9、mfPCSK9或mPCSK9与hLDLR EGF-A域结合的能力(IC50值，以pM为单位)，是在中性pH(7.2)条件下(表17)或酸性pH条件下(5.5，表18)，使用定量的0.5nM hPCSK9-mmh、1nM mmPCSK9-mmh、1nM rPCSK9-mmh、1nM maPCSK9-h、0.3nM mfPCSK9-mmh或1nM mPCSK9-mmh，用上述基于ELISA的免疫分析法评估的。
表17
Figure BDA0000068178550000472
表18
Figure BDA0000068178550000473
对316P和对照抗体I阻断hPCSK9与hLDLR结合的能力也进行了测定。简言之，以胺偶联法将重组hLDLR或hLDLR-EGFA-mFc固定在BIACORETM CM5芯片上。将100nM的hPCSK9-mmh和316P、对照抗体I mAb或一种非hPCSK9特异性mAb(分别为250nM)抗原-抗体混合物于室温下培养1小时，然后于25℃以流量10μl/ml注射在hLDLR或hLDLR-EGFA表面上达15分钟。记录因混合物中游离hPCSK9-mmh与hLDLR或hLDLR-EGFA的结合而引起的RU变化。hPCSK9与hLDLR或hLDLR-EGFA的结合完全被316P和300N阻断，但未被对照抗体I mAb阻断。
实施例9：表位作图
为了测定表位结合特异性，产生了三种嵌合的PCSK9-mmh蛋白，其中用小鼠PCSK9域取代了特异性人PCSK9域。嵌合蛋白#1由一个小鼠PCSK9前结构域(SEQ ID NO：757的氨基酸残基1-155)接着一个人PCSK9催化域(SEQ ID NO：755的残基153-425)及一个小鼠PCSK9 C-端域(SEQ ID NO：757的残基429-694)(mPro-hCat-mC-term-mmh)组成。嵌合蛋白#2由一个人PCSK9前结构域(SEQ IDNO：755的残基1-152)接着一个小鼠PCSK9催化域(SEQ ID NO：757的残基156-428)及一个小鼠PCSK9C-端(hPro-mCat-mC-term-mmh)组成。嵌合的蛋白#3由小鼠PCSK9前结构域和一个小鼠PCSK9催化域接着一个人PCSK9C-端域(SEQ ID NO：755的残基426-692)(mPro-mCat-hC-term-mmh)组成。此外，产生了含有点突变D374Y的hPCSK9(hPCSK9(D374Y)-mmh)。
mAbs与试验蛋白hPCSK9-mmh、小鼠PCSK9-mmh、嵌合蛋白#1、#2和#3，以及hPCSK9(D374Y)-mmh的结合特异性以如下方式测试：将mAbs涂布在96孔板上于4℃过夜，然后将每种试验蛋白(1.2nM)加到板上。于室温结合1小时之后，洗涤培养板并用HRP-辍合的抗myc多克隆抗体检测结合的试验蛋白(++＝OD＞1.0；+＝OD 0.4-1.0；-＝OD＜0.4)。
表19
Figure BDA0000068178550000491
按照上述方法测试了316P、300N及对照抗体抗hPCSK9mAbs与hPCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、mmPCSK9-mmh、mfPCSK9-mmh、rPCSK9-mmh、嵌合蛋白#1、#2和#3以及hPCSK9(D374Y)-mmh的结合特异性，但蛋白浓度为1.7nM(-＝OD＜0.7；+＝OD 0.7-1.5；++＝OD＞1.5)。
表20
  316P   300N   对照I   对照II  对照III
  hPCSK9-mmh   ++   ++   ++   ++  ++
  mPCSK9-mmh   ++   -   -   ++  ++
  mmPCSK9-mmh   ++   ++   ++   ++  ++
  mfPCSK9-mmh   ++   ++   ++   ++  ++
  rPCSK9-mmh   ++   -   -   ++  +
  嵌合蛋白#1   ++   ++   -   ++  ++
  嵌合蛋白#2   ++   ++   -   ++  ++
  嵌合蛋白#3   ++   +   ++   ++  ++
  hPCSK9(D374Y)   ++   ++   ++   ++  ++
以BIACORETM结合分析法获得了选定mAbs的类似结果。简言之，将316P、300N或对照抗体I mAb捕获在胺偶联抗hFc CM5芯片上，并将每种蛋白100nM注射在mAb-捕获表面。测定因每种蛋白与mAb表面的结合而引起的RU变化。
表21
Figure BDA0000068178550000501
为了进一步评估与mPCSK9-mmh交叉反应的316P的结合特异性，开发了一种交叉竞争ELISA分析法以测定结合域特异性。简言之，先以1μg/ml将对嵌合蛋白#1、#2或#3具有特异性的mAbs涂布在96孔板上过夜。然后将人PCSK9-mmh(2μg/ml)加入每孔，再于室温培养1小时。加入316P(1μg/ml)并于室温再培养小时。使用HRP-辍合的抗hFc多克隆抗体检测板结合的316P。虽然316P与hPCSK9-mmh的结合未受对嵌合蛋白#2或嵌合蛋白#3具有特异性的mAbs存在的影响，但316P与hPCSK9-mmh的结合因对嵌合蛋白#1具有特异性的抗体存在而大大下降。
实施例10：基于BIACORETM的抗原结合特性评估
使用BIACORETM1000还确定了316P、300N、对照抗体I、II，以及III mAbs抗体结合特性。简言之，将hPCSK9-mmh捕获在抗myc表面。于25℃将一抗hPCSK9 mAb(50μg/ml)于25℃注射在PCSK9结合的表面达10分钟。然后于25℃将二抗hPCSK9mAb(50μg/ml)于25℃注射在第一mAb结合的表面上达10分钟。测量第一mAb阻断第二mAb结合的能力并表达为抑制百分比。
表22
Figure BDA0000068178550000511
实施例11：抗hPCSK9抗体吸收LDL量的增加
用人肝细胞肝癌细胞系(HepG2)测定抗hPCSK9mAbs增加LDL体外吸收的能力。将HepG2细胞以9x104细胞/孔密度接种在96孔板上DMEM完全培养基中，并在37℃、5％CO2条件下培养6小时，以形成HepG2单层细胞。将在无脂蛋白培养基(LPDS)中浓度为50nM的人PCSK9-mmh和在LPDS中各种不同浓度(500nM至0.98nM)的试验mAb加入。每次实验的数据均以IC50值表示(IC50＝LDL吸收增加50％时的抗体浓度)。此外，该实验还显示，316P和300N两者均能完全逆转hPCSK9对LDL吸收的抑制作用，而对照抗体I mAb或H1M508抗hPCSK9mAb只能逆转该抑制作用约50％。
表23
  抗体   IC50(nM)
  316P   21.30
  300N   22.12
  对照I   ＞250
  H1M508   ＞250
还按如上所述在HepG2细胞系中测试了抗hPCSK9 mAbs逆转不同哺乳动物物种PCSK9蛋白对LDL吸收的抑制作用的能力。简言之，用抗体在LPDS培养基中的系列稀释液(从500nM开始)和50nM的hPCSK9-mmh、mfPCSK9-mmh、mPCSK9-mmh、rPCSK9-mmh或maPCSK9-h培养HepG2细胞过夜。还用抗体在LPDS中的系列稀释液(从50nM开始)和1nM hPCSK9(D374Y)培养HepG2细胞过夜。如表24所示，虽然316P能完全逆转所测试的全部PCSK9蛋白对LDL的抑制作用，但300N只能逆转hPCSK9、hPCSK9(D374Y)和mfPCSK9对LDL吸收的抑制作用。数值以nM IC50表示。
表24
实施例12：hPCSK9体内生物作用的中和
为了评估中和PCSK9的生物作用，以流体动力注射(HDD)法注射编码全长hPCSK9-mmh的DNA重组子，将hPCSK9过分表达在C57BL/6小鼠体内。给4只小鼠(C57BL/6)注射空白载体/盐水(对照)，给16小鼠在尾部静脉注射一种50μg hPCSK9-mmh-DNA/盐水混合物，剂量等于它们体重的10％。HDD注射7天后，注射hPCSK9导致了总胆固醇上升1.6倍、LDL-胆固醇(LDL-C)上升3.4倍以及非HDL胆固醇上升1.9倍(相对于对照)。以定量ELISA评估，第7天的血清hPCSK9水平全都大于1μg/ml。
HDD注射后，于第6天给3个实验组(1、5或10mg/kg)(每组n＝4)经腹腔(i.p.)注射H1M300N，导致血清胆固醇水平的显著衰减。注射后第18小时，在分别用1、5或10mg/kg H1M300N处理的组内，总胆固醇分别降低了9.8％、26.3％和26.8％，LDL-C分别降低了5.1％、52.3％和56.7％，非HDL胆固醇分别降低了7.4％、33.8％和28.6％。
实施例13：猴体内药代动力学和血清化学研究
在体重为5-7kg、年龄为3-5岁的原生雄性猕猴(Macacafascicularis)中进行了一项药代动力学(PK)研究。
分组。将猴子分为5个处理组：处理组1(n＝3)接受对照缓冲液(10mM磷酸钠，pH 6，1ml/kg)；处理组2(n＝3)接受1ml/kg316P(5mg/ml)；处理组3(n＝3)接受1ml/kg 300N(5mg/ml)；处理组4(n＝3)接受1ml/kg 316P(15mg/ml)；以及处理组5(n＝3)接受1ml/kg 300N(15mg/ml)。所有处理均采取IV快速注射，然后用1ml盐水冲洗。总剂量(ml)根据最近的体重计算(每只动物在适应期间称重两次，整个研究期间每周称重一次)。在第1天只注射一剂试验mAb或对照缓冲液。
动物饲养管理。动物被关在一种温度和湿度受监控的环境中。目标温度和相对湿度范围分别在18-29℃和30-70％之间。自动照明系统提供12小时白昼周期。为了研究或设施相关的活动，黑暗周期可以打断。动物被分别关在符合“动物保护法”(Animal Welfare Act)和“实验动物饲养管理及使用指南”(The Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals，National Research Council 1996)中所推荐的笼子里。
饲料和喂食。按照SNBL USA SOP规定，每天喂动物两次。当特殊步骤要求时(例如在抽血进行血清化验、采尿之前，或当进行涉及麻醉的步骤时)，则给动物禁食。定期分析饲料内污染物，发现符合制造商规格。
实验设计。从SNBL USA库存选择适当数量的动物。由兽医人员检查动物健康状况，并进行血清化验、血液和凝固筛选。将16只经确认为健康的雄性动物用于研究。将15只雄性动物编入特殊研究组，剩下的动物作为备用。采用一种包括血清胆固醇水平(基于适应期两次抽取的平均值)的分层随机方案将动物分配至研究组。
适应期。在开始用药前，让经检疫的动物适应研究室至少14天。从所有动物收集适应期数据，包括备用动物。评估所有动物的可能影响研究表现的行为异常。在第1天之后将备用动物送回库房。
采血。以静脉穿刺方式从受控的神智清醒的动物外周静脉采血。尽可能一次抽取血液，然后妥善地分配。
PK研究。在用药前、2分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时分别将血样(1.5ml)采入血清分离管(SST)，然后每24小时一次。将样品储存血清转移至2个小瓶内并储存于-60℃或以下。
用一种优化ELISA法(酶联免疫吸附分析法)分析血清样品。简言之，先用hPCSK9-mmh涂布微量滴定板。然后将试验mAb316P或300N捕获在hPCSK9-mmh板上。使用一种生物素酰化小鼠抗hIgG4检测捕获的316P或300N，然后与NeutrAvidin-HRP的结合。使用100至1.56ng/ml不同浓度的316P或300N作为标准。使用不含316P或300N的百分之一猴血清(分析基质)作为零标准(0ng/ml)。图2所示的结果表明，血清316P和300N水平呈剂量依赖性增加。用WinNonlin软件分析PK参数(非房室模型分析，Model 201-静脉快速注射)。
表25
Figure BDA0000068178550000551
血清化学。在用药前12小时、48小时分别采集血样，然后每隔48小时采血一次供临床化学分析，尤其是分析脂质特性(即胆固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯)。除用药后12小时的采样，所有动物在采样前均禁食过夜。样品体积为约1ml。使用一台Olympus自动分析仪测定化学参数。所测量的参数为(Xybion代号)：白蛋白(ALB)；碱性磷酸酯酶(ALP)；丙氨酸氨转移酶(ALT)；天冬氨酸转氨酶(AST)；总胆红素(TBIL)；钙(Ca)；总胆固醇(TCho)；肌氨酸激酶(CK)；肌酐(CRN)；伽玛谷氨酰基转氨酶(GGT)；葡萄糖(GLU)；无机磷(IP)；总蛋白(TP)；甘油三酯(TRIG)；血尿氮(BUN)；球蛋白(GLOB)；白蛋白/球蛋白比(A/G)；氯(Cl)；钾(K)；钠(Na)；LDL和HDL胆固醇。残留血清储存于-20℃或以下，并于分析后一周之后才弃置。
从取样至用药后105天的结果显示在图3-7中。在接受了316P和300N的动物中，在第一次给药后24小时内总胆固醇和LDL-C有所下降，而不论剂量多少。血清总胆固醇迅速和显著下降(35％，图3)。至第6天，观察到LDL-C的～80％的显著下降(图4-5)。在接受15mg/kg 300N的动物中，总胆固醇(～10-15％下降)和LDL-C(～40％下降)的下降至少持续至研究第80天。此外，在接受15mg/kg 316P的动物中，HDL-C上升(图6)。在研究期间，接受更高剂量(15mg/kg)316P或300N的动物也显示出甘油三酯的下降(图7)。316P显示出对LDL-C水平最大的抑制，相对于基线达80％。这种抑制的持久程度是剂量依赖性的，对于至少60％抑制(相对于基线LDL-C水平)，可分别持续约18天(5mg/kg剂量)和约45天(15mg/kg剂量)。300N显示了一种与316P不同的药效特性。在相当的剂量情况下，300N抑制LDL-C的持续时间要长得多(给药5mg/kg后对LDL-C的50％抑制持续达28天，给药15mg/kg后对LDL-C的50％抑制持续达约90天)。经ALT和AST测量确定，肝功能未发生变化或没有可测出的变化。在研究中接受抗PCSK9抗体的所有动物均显示LDL-C和总胆固醇迅速得到抑制。
在接受单剂皮下(SC)注射5mg/kg 316P或5mg/kg 300N(图8)的猕猴中，也观察到了316P和300N类似的LDL-C下降作用。316P和300N两者均显著地抑制LDL-C水平并分别维持LDL-C下降作用达约15天和30天(图8)。此药效作用(大约40％LDL-C抑制)似乎与猴血清中功能性抗体水平大致相关(图9)。随着抗体水平下降至低于10μg/ml，LDL-C抑制作用似乎也消失了。此外，300N显示了比316P长得多的循环半衰期，因此所观察到的LDL-C抑制作用也较持久。
表26
  PK参数   316P   300N
  Tmax(h)   60   84
  Cmax(μg/ml)   46   63
  T1/2(h)   64   286
实施例14：抗hPCSK9抗体导致LDL受体降解的衰减
为了评估PCSK9对肝脏LDL受体水平的生物影响以及随后对血清LDL-C水平的影响，对表达hPCSK9但不表达mPCSK9的小鼠(PCSK9hu/hu小鼠)静脉注射hPCSK9。具体来说，经尾部静脉给PCSK9hu/hu小鼠注射PBS(对照)，或1.2mg/kg hPCSK9-mmh。hPCSK9注射后6小时，观察到血清中总胆固醇上升1.4倍(相对于基线水平)，LDL-C上升2.3倍。hPCSK9注射后4小时，另一组动物(n＝3)的肝脏LDL受体水平分析显示肝匀浆中可检测LDL受体显著下降。
为了评估抗hPCSK9对肝脏LDL受体水平的生物影响以及然后对血清LDL-C水平的影响，在上述hPCSK9-mmh蛋白注射前20小时，以相当剂量(5mg/kg，腹腔注射)对PCSK9hu/hu小鼠注射316P和一种非hPCSK9特异性mAb。hPCSK9注射4小时后，处死小鼠并收集总共8种器官(肝、脑、肺、肾、心、回肠、肾上腺以及胰腺)，并以西方印迹试验测定LDL受体水平。仅在肝内观察到LDL受体水平的变化。与注射PBS对照剂相比，316P注射显著地阻断了PCSK9介导的总胆固醇和LDL胆固醇的上升(LDL-C基线为2.49mg/dl，PCSK9注射后6小时为3.1mg/dl；上升25％，与载体注射相比为135％)。与单独注射PBS相比，先前注射的非hPCSK9特异性mAb阻断LDL-C上升的幅度约为27％(LDL-C＝4.1mg/dl，与PBS 5.6mg/dl相比)。对另一组小鼠(每组n＝3)LDL受体水平的分析显示，注射PCSK9导致LDL受体水平的显著下降。这种下降被316P阻断但未被非hPCSK9特异性mAb阻断(图10)。
在PCSK9hu/hu小鼠中评估了不同剂量316P的影响，结果LDL-C和hPCSK9水平都上升。首先喂PCSK9hu/hu小鼠一种高碳水化合物饲料达8周，结果LDL-C和hPCSK9水平都上升～2倍。给小鼠注射316P或非hPCSK9特异性mAb，剂量分别为1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg。24小时后收集血清并分析LDL-C水平。316P以一种剂量依赖的方式有效地降低了LDL-C水平(图11)。此外，注射剂量为10mg/kg的316P使LDL-C水平在24小时内迅速地降低至初始值(喂饲料前)(数据未显示)。
实施例15：小鼠PK研究
在6周龄C57BL/6小鼠和11-15周龄hPCSK9杂合小鼠中进行了PK研究。皮下注射单剂对照抗体I、316P或300N，剂量为10mg/kg。使用一种抗hFc捕获和抗hFc检测夹心ELISA分析法，测量0小时(出血前)、6小时、第1、3、6、10、14、21、28、35、42和56天总共12个时间点的血清中hIgG水平(图12和13)。所有mAbs均在约3天内达到了它们的Tmax，C57BL/6小鼠和hPCSK9杂合小鼠相应的Cmax水平分别为约47-115μg/ml和55-196μg/ml。在第56天，C57BL/6小鼠体内对照抗体I mAb水平为约12μg/ml，300N水平为约11μg/ml，而316P水平为约低于0.02μg/ml。在第56天，hPCSK9杂合小鼠体内对照抗体I mAb水平为约29μg/ml，而300N和316P两者的水平为低于0.02μg/ml的数量极限(BQL)。
实施例16：抗hPCSK9抗体与突变/变异hPCSK9的结合
为了进一步评估hPCSK9和抗hPCSK9mAbs之间的结合，产生了21种变异hPCSK9蛋白，其中每种变体含有一个单点突变且两种变异hPCSK9蛋白都含有一个双突变。通过与BIACORETM芯片直接化学偶联而产生F(ab’)2抗hIgG表面，将每种选定的抗体捕获在其表面上以形成捕获抗体表面。然后，将每种mmh标记的变异hPCSK9以100nM至25nM不同的浓度和60μl/min流量注射在该捕获抗体表面达240秒，并于25℃实时监测变异hPCSK9-抗体离解过程达20分钟。注：在这些实验条件下未观察到结合(KD＝Mx10-9；T1/2＝分钟；WT＝野生型)。
表27
Figure BDA0000068178550000591
结果显示，当残基D238发生突变时，316P与hPCSK9的结合亲和力降低＞400倍，KD从1x10-9M变为410x10-9M；且T1/2缩短约30倍，从37变为1分钟，说明316P与hPCSK9上的一个含有hPCSK9(SEQ ID NO：755)的D238的表位结合。此外，BIACORETM分析显示，当153、159或343位的残基发生突变时，316P结合亲和力和T1/2降低约5倍至10倍。尤其是，当S153、E159或D343中如何一个发生突变时，KD从约1x10-9M降至约5-8x10-9M之间；而T1/2则从约37分钟降至约4-6分钟。
当位于366的残基发生突变时，300N与hPCSK9的结合降低约50倍，导致KD从约0.7x10-9M下降至约36x10-9M且T1/2从约120分钟缩短至2分钟。这些结果表明，300N与hPCSK9上一个表位结合，该表位含有hPCSK9(SEQ ID NO：755)的E366。此外，BIACORETM分析法显示，当位于147或380的残基发生突变时，300N结合亲和力和T1/2下降2倍至＞10倍。具体来说，当S147或V380中任何一个发生突变时，KD从约0.69x10-9M降至约2-9x10-9M之间；而T1/2从约120分钟缩短至约24-66分钟之间。与316P相比，300N与hPCSK9的结合不是由于残基238的突变而降低的。
相比之下，对于所测试的任何位突变，对照I抗体未显示结合亲和力或T1/2的改变；当残基215发生突变时(R215E)，对照II抗体显示亲和力下降40倍(从～0.1x10-9至～4.5x10-9)，T1/2缩短约27倍(从～333至12分钟)；而当残基237发生突变时，对照III抗体显示亲和力下降(KD从～0.6x10-9降至～5.9x10-9，且T1/2从～481降至～43分钟)。
使用一种基于ELISA的免疫分析法测试了316P、300N和对照抗hPCSK9 mAbs与hPCSK9变体结合特异性。将抗PCSK9 mAbs涂布在96孔板上于4℃过夜。将每种溶于CHO-k1瞬间转染裂解上清液的mmh标记的变异hPCSK9以0至5nM的不同浓度加到抗体涂布的培养板上。于室温结合1小时后，洗涤培养板并用HRP-辍合的抗myc多克隆抗体检测结合的变异hPCSK9(-＝OD＜0.7；+＝OD 0.7-1.5；++＝OD＞1.5)。
表28
Figure BDA0000068178550000611
实施例17：316P对正常脂血和高脂血仓鼠的影响
在正常脂血或高脂血叙利亚金仓鼠(Mesocricetus auratus)中，测试了抗PCSK9 mAb 316P降低血清LDL-C的能力。在进入研究之前，让雄性叙利亚仓鼠(6-8周龄，体重为80-100克)适应7天。所有动物均喂以标准饲料或一种补充了0.1％胆固醇和10％椰子油的高脂血饲料。给正常脂血仓鼠单剂皮下注射316P mAb，剂量为1、3或10mg/kg，给高脂血仓鼠注射剂量为3、10或30mg/kg。在注射后24小时和7、14以及22天，从所有动物组采取血清样品，评估此时的血清脂质水平并与注射mAbs前7天的基线水平比较。与载体注射相比较，正常脂血仓鼠的循环总胆固醇和LDL-C含量呈剂量依赖型显著降低。如图14所示，在注射所试验的最高剂量(10mg/kg)7天后，注射316P有效地降低了LDL-C水平，最多达60％。在高脂血仓鼠中未观察到类似的316P降低胆固醇的作用。
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Claims (21)

1.一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特异性结合的人抗体或人抗体的抗原结合片段，它具有以下一种或多种特征：
(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35％，并保持这种下降趋势达至少24天；
(ii)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80％，并保持这种下降趋势达至少24天，或能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70％，并保持这种下降趋势达至少60至90天；
(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40％；
(iv)达到(i)至(iii)中的一项或多项而不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5％；
(v)达到(i)至(iii)中的一项或多项但根据ALT和AST测量确定，对肝功能影响很小或没有可测量的影响。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，它包括
一个选自下列一组序列的重链CDR3(HCDR3)域：SEQ ID NO：8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、680、704和728；以及
一个选自下列一组序列的轻链CDR3(LCDR3)域：SEQ ID NO：16、40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、616、639、664、688、712以及736。
3.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中HCDR3/LCDR3是SEQ ID NO：80/88或224/232。
4.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，它进一步包括
一个选自下列一组序列的重链CDR1(HCDR1)域：SEQ ID NO：4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、628、652、676、7000以及724；
一个选自下列一组序列的重链CDR2(HCDR2)域：SEQ ID NO：6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、606、630、654、678、702以及726；
一个选自下列一组序列的轻链CDR1(LCDR1)域：SEQ ID NO：12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708和732；以及
一个选自下列一组序列的轻链CDR2(LCDR2)域：SEQ ID NO：14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、638、662、686、710和734。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中的轻链和重链CDR序列是选自以下一组序列：
SEQ ID NO：76、78、80、84、86、88；
SEQ ID NO：220、222、224、228、230、232。
6.如以上任何一项申请专利范围所述的抗体或抗原结合片段，其中HCVR是SEQ ID NO：90或218，LCVR是SEQ ID NO：90或218。
7.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含一个HCDR3序列和一个LCDR3序列，其中
该HCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20的氨基酸序列(SEQID NO：747)，其中X1是Ala；X2是Arg或Lys；X3是Asp；X4是Ser或Ile；X5是Asn或Val；X6是Leu或Trp；X7是Gly或Met；X8是Asn或Val；X9是Phe或Tyr；X10是Asp；X11是Leu或Met；X12是Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位；X16是Tyr或缺位；X17是Gly或缺位；X18是Met或缺位；X19是Asp或缺位；以及X20是Val或缺位；以及
该LCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO：750)，其中X1是Gln或Met；X2是Gln；X3是Tyr或Thr；X4是Tyr或Leu；X5是Thr或Gln；X6是Thr；X7是Pro；X8是Tyr或Leu；以及X9是Thr。
8.如权利要求7所述之抗体或抗原结合片段，其进一步包含HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2，其中
该HCDR1包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQ ID NO：745)，其中X1是Gly；X2是Phe；X3是Thr；X4是Phe；X5是Ser或Asn；X6是Ser或Asn；X7是Tyr或His；以及X8是Ala或Trp；
该HCDR2包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQ ID NO：746)，其中X1是Ile；X2是Ser或Asn；X3是Gly或Gln；X4是Asp或Ser；X5是Gly；X6是Ser或Gly；X7是Thr或Glu；以及X8是Thr或Lys；
该LCDR1包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12的氨基酸序列(SEQ ID NO：748)，其中X1是Gln；X2是Ser；X3是Val或Leu；X4是Leu；X5是His或Tyr；X6是Arg或Ser；X7是Ser或Asn；X8是Asn或Gly；X9是Asn；X10是Arg或Asn；X11是Asn或Tyr；以及X12是Phe或缺位；
该LCDR2包含一个结构式为X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQ IDNO：749)，其中X1是Trp或Leu；X2是Ala或Gly，以及X3是Ser。
9.如以上任何一项申请专利范围所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段与一种变异PCSK9蛋白的结合与该抗体或其片段与SEQID NO：755的PCSK9蛋白之间的结合相比低于50％。
10.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中的变异PCSK9蛋白在选自下列一组的位置上含有至少一个残基突变：
S153、E159、D238和D343；或
S147、E366和V380。
11.如以上任何一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其包括一个由衍生自VH、DH和JH种系基因片段的核苷酸序列片段编码的重链可变区(HCVR)，一个由衍生自Vk和Jk种系基因片段的核苷酸序列片段编码的轻链可变区(LCVR)，其中该种系序列为：
a)VH基因3-23、DH基因7-27、JH基因2、VK基因4-1、JK基因2，或
b)VH基因3-7、DH基因2-8、JH基因6、VK基因2-28、JK基因4。
12.一种编码上述任何一项权利要求所述抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
13.一种包含如权利要求11所述核酸分子的表达载体。
14.一种产生抗人PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其步骤包括将权利要求13所述之表达载体引入一个分离的宿主细胞，在允许抗体或其片段产生和收集所产生抗体或其片段的条件下培养该细胞。
15.一种含有如权利要求1至11所述之抗体或抗原结合片段以及一种药学上可接受载体的药物组合物。
16.如权利要求15所述之药物组合物，其进一步包含第二种治疗剂，该第二种治疗剂选自一种3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A (CoA)还原酶的抑制剂、一种抑制素、一种胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的抑制剂、一种增加脂蛋白分解代谢的药剂，或一种LXR转录因子活化剂。
17.一种治疗可用PCSK9拮抗剂减轻、改善、抑制或预防的疾病或症状的方法，其包括给需要治疗的患者施用一种治疗剂量的如权利要求15或16所述之药物组合物。
18.如权利要求17所述之方法，其中所述患者是人类患者，患有高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、被诊断为杂合家族性高胆固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。
19.一种如权利要求1至11项中任何一所述之抗体或抗体的抗原结合片段，用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症。
20.在用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症的药剂制造过程中，应用如权利要求1至7项中任何一所述之抗体或抗体的抗原结合片段。
21.如权利要求20所述之应用，其中PCSK9介导的疾病或症状是高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、杂合家族性高胆固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。
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