ES2857734T3

ES2857734T3 - Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas

Info

Publication number: ES2857734T3
Application number: ES17206703T
Authority: ES
Inventors: Oliver Ast; Peter Bruenker; Tanja Fauti; Anne Freimoser-Grundschober; Christiane Neumann; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Pablo Umana
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2021-09-29
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: EA201400254A1; MY169358A; CA2837975A1; EP3892640A1; US20240425616A1; RS56879B1; PH12013502531A1; ECSP14013220A; BR112014003769A2; US20130078249A1; EA030147B1; CN103748114B; KR20140034310A; KR101963923B1; SI2748201T1; TW201321413A; BR112014003769A8; PE20141521A1; CO6811817A2; EP3321286B1

Abstract

Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, de los que uno es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 y el otro es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidades que se pueden asociar de forma estable; en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab; y en la que (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas

Campo de la invención

La presente invención en general se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas para activar linfocitos T. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas, y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, y a dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas para su uso en el tratamiento de enfermedad.

Antecedentes

La destrucción selectiva de una célula individual o un tipo de células específicas a menudo es deseable en una variedad de ámbitos clínicos. Por ejemplo, un objetivo principal del tratamiento del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, dejando las células y tejidos sanos intactos y sin daños.

Una forma atractiva de lograr esto es induciendo una respuesta inmunitaria contra el tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL) ataquen y destruyan las células tumorales. Los CTL constituyen las células efectoras más potentes del sistema inmunitario; sin embargo, no se pueden activar por el mecanismo efector mediado por el dominio Fc de anticuerpos terapéuticos convencionales.

A este respecto, los anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse con un "brazo" a un antígeno de superficie en células diana, y con el segundo "brazo" a un componente invariante activador del complejo receptor de linfocitos T (TCR), se han vuelto de interés en los últimos años. La unión simultánea de un anticuerpo de este tipo a ambas de sus dianas forzará una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxico y la posterior lisis de la célula diana. Por tanto, la respuesta inmunitaria se redirige a las células diana y es independiente de la presentación de antígenos peptídicos por la célula diana o la especificidad del linfocito T como sería pertinentepara la activación restringida para MHC normal de CTL. En este contexto, es crucial que los CTL solo se activen cuando una célula diana les presente el anticuerpo biespecífico, es decir, se imite la sinapsis inmunológica. Son en particular deseables anticuerpos biespecíficos que no requieren preacondicionamiento o coestimulación de linfocitos para provocar lisis eficaz de células diana.

Se han desarrollado formatos de anticuerpos biespecíficos e investigado su idoneidad para inmunoterapia mediada por linfocitos T. De estos, las denominadas moléculas BiTE (captadoras de linfocitos T biespecíficos) se han caracterizado muy bien y ya se han mostrado prometedoras en el ámbito clínico (revisado en Nagorsen y Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). Las BiTE son moléculas scFv en tándem en las que dos moléculas scFv se fusionan por un conector flexible. Otros formatos biespecíficos que se evalúan para el acoplamiento de linfocitos T incluyen diacuerpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) y derivados de los mismos, tales como diacuerpos en tándem (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)). Un desarrollo más reciente son las moléculas denominadas DART (redirección de afinidad doble), que se basan en el formato de diacuerpos pero presentan un puente disulfuro C terminal para estabilización adicional (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Los denominados triomab, que son moléculas de IgG completas híbridas de ratón/rata y que también se están evaluando actualmente en ensayos clínicos, representan un formato de mayor tamaño (revisado en Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).

La variedad de formatos que se están desarrollando muestra el gran potencial atribuido a la redirección y activación de linfocitos T en inmunoterapia. Sin embargo, la tarea de generar anticuerpos biespecíficos adecuados para esto no es de ninguna manera trivial, sino que implica varios retos que se han de cumplir relacionados con eficacia, toxicidad, aplicabilidad y producibilidad de los anticuerpos.

Las construcciones pequeñas tales como, por ejemplo, las moléculas BiTE (aunque pueden reticular eficazmente células diana y efectoras) tienen una semivida en suero muy corta lo que requiere que se administren a los pacientes por infusión continua. Por otra parte, los formatos de tipo IgG (aunque tienen el gran beneficio de una semivida larga) experimentan toxicidad asociada con las funciones efectoras naturales inherentes de las moléculas IgG. Su potencial inmunógeno constituye otro rasgo característico desfavorable de los anticuerpos biespecíficos de tipo IgG, en especial formatos no humanos, para el desarrollo terapéutico exitoso. Finalmente, un reto principal en el desarrollo general de anticuerpos biespecíficos ha sido la producción de construcciones de anticuerpos biespecíficos en una cantidad y pureza clínicamente suficientes, debido al emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de especificidades diferentes tras la coexpresión, lo que disminuye el rendimiento de la construcción correctamente ensamblada y da como resultado varios productos secundarios no funcionales de los que el anticuerpo biespecífico deseado puede ser difícil separar.

Dadas las dificultades y desventajas asociadas con los anticuerpos biespecíficos actualmente disponibles para la inmunoterapia mediada por linfocitos T, sigue existiendo la necesidad de obtener formatos mejorados novedosos de dichas moléculas. La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas diseñadas para la activación y redireccionamiento de linfocitos T que combinan buena eficacia y producibilidad con baja toxicidad y propiedades farmacocinéticas favorables.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, de los que uno es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 y el otro es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidades que se pueden asociar de forma estable; en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab; y en la que (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en el primer y el segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc y opcionalmente uno o más péptidos conectores.

De acuerdo con la invención, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. De acuerdo con la invención, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, o el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno.

De acuerdo con la invención, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. Además, de acuerdo con la invención, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización de este tipo, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En otro modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno activadora de linfocitos T se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar directamente o a través de conectores peptídicos adecuados.

En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En modos de realización particulares, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana.

En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, (a) un residuo aminoacídico en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y un residuo aminoacídico en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable; o (b) en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc uno o más residuos aminoacídicos se reemplazan por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable. En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V); y opcionalmente en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A); y opcionalmente en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeración EU).

En un modo de realización, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora. En un modo de realización, la una o más sustituciones aminoacídicas en el dominio Fc que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de E233, L234, L235, N297, p 331 y P329 (numeración EU). En modos de realización particulares, cada subunidad del dominio Fc comprende tres sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora en la que dichas sustituciones aminoacídicas son L234A, L235A y P329G (numeración EU).

En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, la función efectora es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido o pluralidad de polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención. La invención proporciona además una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado de la invención.

En otro aspecto se proporciona un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se engloban por la invención procedimientos de uso de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y la composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento. En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de cáncer.

Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. Configuraciones ejemplares de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento. Ilustración de (A) la molécula "1 1 IgG scFab, de un brazo", y (B) "1+1 IgG scFab, de un brazo, invertida". En la molécula "1 1 IgG scFab, de un brazo", la cadena ligera del Fab dirigido a linfocito T se fusiona con la cadena pesada por un conector, mientras que la molécula "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" tiene el conector en el Fab dirigido a tumor. (C) Ilustración de la molécula "2+1 IgG scFab". (D) Ilustración de la molécula "1 1 IgG scFab". (E) Ilustración de la molécula "1+1 IgG Crossfab". (F) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab". (G) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (H) Ilustración de la molécula de "fusión de cadena ligera (LC) 1+1 IgG Crossfab". (I) Ilustración de la molécula "1 1 CrossMab". (J) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida". (K) Ilustración de la molécula "1+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida". (L) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab, invertida, cadena ligera unida". (M) Ilustración de la molécula "1 1 IgG Crossfab, invertida, cadena ligera unida". Punto negro: modificación opcional en el dominio Fc que promueve la heterodimerización.

FIGURA 2. SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "1+1 IgG scFab, de un brazo" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 1, 3, 5), no reducido (A) y reducido (b ), y de "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 7, 9, 11), no reducido (C) y reducido (D).

FIGURA 3. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0,02 % (p/v); 50 pg de muestra inyectada) de "1 1 IgG scFab, de un brazo" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 1, 3, 5) (A) y "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 7, 9, 11) (B).

FIGURA 4. SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "1+1 IgG scFab, de un brazo" (anti-EGFR/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 43, 45, 57), no reducido (A) y reducido (B), y de "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-EGFR/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 11, 49, 51), no reducido (C) y reducido (D).

FIGURA 5. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0,02 % (p/v); 50 |jg de muestra inyectada) de "1 1 IgG scFab, de un brazo" (anti-EGFR/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 43, 45, 47) (A) y "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-EGFR/antihuCD3) (véanse SEQ ID NO 11, 49, 51) (B).

FIGURA 6. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-FAP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 11, 51, 55), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; m Op S 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0,02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (anti-FAP/antihuCD3).

FIGURA 7. SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de (A) "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 21, 23), no reducido (carril 2) y reducido (carril 3); de (B) "2+1 IgG scFab, LALA" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19), no reducido (carril 2) y reducido (carril 3); de (C) "2+1 IgG scFab, wt" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 13, 15), no reducido (carril 2) y reducido (carril 3); y de (D) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 25, 27), no reducido (carril 2) y reducido (carril 3).

FIGURA 8. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0,02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de (A) "2+1 IgG scFab, P329G LALA "(anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 21, 23); de (B) "2+1 IgG scFab, LALA" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19); de (C) "2+1 IgG scFab, wt" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 13, 15); y de (D) "2+1 IgG scFab, P329G LALA N297D" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 25, 27).

FIGURA 9. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (anti-EGFR/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 45, 47, 53), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOpS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0.02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "2+1 IgG scFab, P329G LALA "(anti-EGFR/antihuCD3).

FIGURA 10. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG scFab, P329G LALA" (anti-FAP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 57, 59, 61), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL Ge Healthcare; MOp S 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0.02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "2+1 IgG scFab, P329G LALA "(anti-FAP/anti-huCD3).

FIGURA 11. (A, B) SDS PAGE (Tris-Acetato al 4-12 % (A) o Bis/Tris al 4-12 % (B), NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "1 1 IgG Crossfab, Fc(ojal) P329G LALA / Fc(botón) wt "(anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 29, 31, 33), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL g E Healthcare; MOPS 2 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0,02 % (p/v); 50 |jg de muestra inyectada) de "1 1 IgG Crossfab, Fc(ojal) P329G LALA / Fc(botón) wt" (anti-MCSP/anti-huCD3).

FIGURA 12. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL g E Healthcare; MOpS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0.02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-huCD3).

FIGURA 13. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-cyCD3) (véanse SEQ ID NO 3, 5, 35, 37), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL g E Healthcare; MOp S 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0.02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-cyCD3).

FIGURA 14. (A, B) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab, invertida" (anti-CEA/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 33, 63, 65, 67), no reducido (A) y reducido (B). (C) Cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; MOPS 2 mM pH 7,3, NaCl 150 mM, NaCl al 0.02 % (p/v); 50 jg de muestra inyectada) de "2+1 IgG Crossfab, invertida "(Anti-CEA/anti-huCD3).

FIGURA 15. (A) Estabilidad térmica de "(scFv)2-Fc" y "(dsscFv)2-Fc" (anti-MCSP (LC007)/anti-huCD3 (V9)). Dispersión de luz dinámica medida en una rampa de temperatura de 25-75 °C a 0,05 °C/min. Curva negra: "(scFv)2-Fc"; curva gris: "(dsscFv)2-Fc". (B) Estabilidad térmica de "2+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 5, 21, 23) y "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33). Dispersión de luz dinámica medida en una rampa de temperatura de 25-75 °C a 0,05 °C/min. Curva negra: "2+1 IgG scFab"; curva gris: "2+1 IgG Crossfab".

FIGURA 16. Configuración del ensayo Biacore para (A) la determinación de la interacción de diversos mutantes de Fc con FcYRIIIa humano, y para (B) la unión simultánea de construcciones biespecíficas de linfocitos T con diana tumoral y CD3Y(G4S)5CD3s-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano.

FIGURA 17. Unión simultánea de construcciones biespecíficas de linfocitos T al dominio D3 de MCSP humano y CD3Y(G4S)5CD3£-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano. (A) "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), (B) "2+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 5, 21, 23).

^{FIGURA 18. Unión simultánea de construcciones biespecíficas de linfocitos T a EGFR humano y}CD3y(G4S)^sCD3e-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano. (A) "2+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 45, 47, 53), (B) "1+1 IgG scFab, de ^{un brazo" (véanse SEQ}iD No ^{43, 45, 47), (C) "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (véanse SEQ ID NO 11, 49,}51), y (D) "1+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 47, 53, 213).

FIGURA 19. Unión de la molécula "(scFv)2" (50 nM) a CD3 expresado en células Jurkat (A), o a MCSP en células Colo-38 (B) medida por FACS. Se representa la intensidad de fluorescencia media en comparación con células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solo.

FIGURA 20. Unión de la construcción "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) (50 nM) a CD3 expresado en células Jurkat (A), o a MCSP en células Colo-38 (B) medida por FACS. Se representa la intensidad de fluorescencia media en comparación con células tratadas con IgG anti-CD3 de referencia (como se indica), células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solo.

FIGURA 21. Unión de las construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo" (véanse SEQ ID NO 1, 3, 5) y "1+1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (véanse SEQ ID NO 7, 9, 11) (50 nM) a CD3 expresado en células Jurkat (A), o a MCSP en células Colo-38 (B) medida por FACS. Se representa la intensidad de fluorescencia media en comparación con células tratadas con IgG anti-CD3 o anti-MCSP de referencia (como se indica), células no tratadas y células teñidas con el anticuerpo secundario solo.

FIGURA 22. Unión dependiente de la dosis de la construcción biespecífica "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) y la correspondiente IgG anti-MCSP a MCSP en células Colo-38 como se mide por FACS.

FIGURA 23. Nivel de expresión superficial de diferentes marcadores de activación en linfocitos T humanos después de incubación con 1 nM de "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) o las construcciones biespecíficas CD3-MCSP de "(scFv)2" en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38, como se indica (proporción E:T de PBMC con respecto a células tumorales = 10:1). Se representa el nivel de expresión del marcador de activación ^{temprana CD69 (A) o del marcador de activación tardía}cD25 ^{(B) en linfocitos T CD8+ después de 15 o 24 horas de}incubación, respectivamente.

FIGURA 24. Nivel de expresión superficial del marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T humanos después de incubación con 1 nM de "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) o construcciones biespecíficas CD3-MCSP de "(scFv)2" en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38, como se indica (proporción E:T = 5:1). Se representa el nivel de expresión del marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8+ (A) o en linfocitos T CD4+ (B) después de 5 días de incubación.

FIGURA 25. Nivel de expresión superficial del marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8+ de macaco cangrejero (cyno) de dos animales diferentes (cynoNestor, cynoNobu) después de 43 horas de incubación con las concentraciones indicadas de la construcción biespecífica "2+1 IgG Crossfab" (dirigida a CD3 de macaco cangrejero y MCSP humano; véanse SEQ ID NO 3, 5, 35, 37), en presencia o ausencia de células diana tumorales MV-3 que expresan MCSP humano (proporción E:T = 3:1). Como controles, se usaron las IgG de referencia (IgG anti-CD3 de macaco cangrejero, IgG anti-MCSP humano) o PHA-M de estímulo no fisiológico.

^{FIGURA 26. Niveles de}IFN-y, ^{secretados por linfocitos pan T humanos que se activaron durante 18,5 horas por la construcción biespecífica CD3-MCSP "2+1 IgG scFab,}lAlA" ^(véanseSeQ ^{ID NO 5, 17, 19) en presencia de células}tumorales U87MG (proporción E:T = 5:1). Como controles, se administraron las correspondientes IgG anti-CD3 y anti-MCSP.

FIGURA 27. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MDA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 20 horas por diferentes concentraciones de las moléculas biespecíficas "2+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 5, 21, 23), "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "(scFv)2" y las correspondientes IgG.

FIGURA 28. Destrucción (medida por la liberación de LDH) de células tumorales MDA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 20 horas por diferentes concentraciones de las construcciones biespecíficas y las correspondientes IgG. Se compararon las construcciones "2+1 IgG scFab" que difieren en su dominio Fc (que tiene un dominio Fc natural (véanse SEQ ID NO 5, 13, 15) o bien un dominio Fc mutado para suprimir la función de la célula efectora (NK): P329G LALA (véanse SEQ ID NO 5, 21,23), P329G LALA N297D (véanse SEQ ID NO 5, 25, 27)) y la construcción "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33).

FIGURA 29. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con la construcción "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) biespecífica CD3-MCSP, la molécula "(scFv)2" o las correspondientes IgG durante 18,5 horas.

FIGURA 30. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con la construcción "2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) biespecífica CD3-MCSP, la molécula "(scFv)2" o las correspondientes IgG durante 18 horas.

FIGURA 31. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MDA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), y activación durante 23,5 horas por diferentes concentraciones de la construcción "2+1 IgG scFab, LALA "(véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) biespecífica CD3-MCSP, la molécula" (scFv) 2 "o las correspondientes IgG.

FIGURA 32. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 19 horas por diferentes concentraciones de las construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo" (véanse SEQ ID NO 1, 3, 5), "1+1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (véanse SEQ ID NO 7, 9, 11) o "(scFv)2" biespecíficas CD3-MCSP, o las correspondientes IgG.

FIGURA 33. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con la construcción biespecífica CD3-MCSP "1 1 IgG scFab" ^(véanseSeQ ^{ID NO 5, 21, 213) o la molécula "(scFv)2" durante 20 horas.}

FIGURA 34. Destrucción (medida por la liberación de LDH) de células tumorales MDA-MB-435 tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1) y activación durante 21 horas por diferentes concentraciones de las construcciones biespecíficas y las correspondientes IgG. Se compararon las construcciones "2+1 IgG Crossfab" ^{(véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "1 1 IgG Crossfab" (véanse}SeQ ^{ID NO 5, 29, 31, 33) biespecíficas CD3-MCSP,}la molécula "(scFv)2" y las correspondientes IgG.

FIGURA 35. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de diferentes células diana (células diana tumorales Colo-38 positivas para MCSP, células madre mesenquimales derivadas de médula ósea o tejido adiposo, o pericitos de placenta; como se indica) inducida por la activación de linfocitos T humanos por 135 ng/ml o 1,35 ng/ml de la construcción biespecífica CD3-MCSP "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) (proporción E:T = 25:1).

FIGURA 36. La destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células diana tumorales Colo-38, medida después de una incubación durante la noche de 21 h, tras el cocultivo con PBMC humanos y diferentes construcciones ^{biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) y}"(^scF^v)²") ^{o una IgG anti-MCSP}glucomanipulada (GlycoMab). La proporción de célula efectora con respecto a diana se fijó en 25:1 (A) o varió como se representa (B). Se aislaron PBMC de sangre roja (A) o de una capa leucoplaquetarias (B).

FIGURA 37. Efecto citotóxico dependiente del tiempo de la construcción "2+1 IgG Crossfab", dirigida a CD3 de macaco cangrejero y MCSP humano (véanse SEQ ID NO 3, 5, 35, 37). Se representa la liberación de LDH de células MV-3 que expresan MCSP humano tras el cocultivo con PBMC de macaco cangrejero primarios (proporción E:T = 3:1) durante 24 h o 43 h. Como controles, se usaron las IgG de referencia (IgG anti-CD3 cyno e IgG anti-MCSP humano) con la misma molaridad. PHA-M sirvió como control para la activación de linfocitos T (no fisiológica).

FIGURA 38. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células de melanoma MV-3 positivas para huMCSP tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG Crossfab "(véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "(scFv)2") durante ~ 26 horas.

FIGURA 39. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales LS-174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas CD3-EGFR ("2+1 IgG scFab "(véanse SEQ ID NO45, 47, 53), "1 1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO47, 53, 213) y "(scFv)2") o IgG de referencia durante 18 horas.

FIGURA 40. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales LS-174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas CD3-EGFR ("1 1 IgG scFab, de un brazo" (véanse SEQ ID NO 43, 45, 47), "1 1 IgG scFab, de un brazo, ^{invertida" (véanse SEQ ID NO 11, 49, 51), "1 1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 47, 53, 213) y}"(^scF^v)²") ^{o IgG de}referencia durante 21 horas.

FIGURA 41. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales LS-174T positivas para EGFR tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (A) o bien linfocitos T indiferenciados humanos (B), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas CD3-EGFR ("1+1 IgG scFab, de un brazo" (véanse SEQ ID NO 43, 45, 47), "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (véanse SEQ ID NO 11, 49, 51) y "(scFv)2") o IgG de referencia durante 16 horas. La proporción de célula efectora con respecto a diana fue de 5:1.

FIGURA 42. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de fibroblastos GM05389 positivos para FAP tras el cocultivo con linfocitos pan T humanos (proporción E:T = 5:1), tratados con diferentes construcciones biespecíficas ^{CD3-FAP ("1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (véanse}SeQ ^{ID NO 11, 51, 55), "1 1 IgG scFab" (véanse SEQ ID}NO 57, 61,213), "2+1 IgG scFab" (véanse SEQ ID NO 57, 59, 61) y "(scFv)2") durante ~18 horas.

FIGURA 43. Análisis de citometría de flujo de niveles de expresión de CD107a/b, así como de niveles de perforina en linfocitos T CD8+ que se han tratado con diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) y "(scFv)2") o las correspondientes IgG de control en presencia (A) o ausencia (B) de células diana durante 6 h. Se incubaron linfocitos pan T humanos con 9,43 nM de las diferentes moléculas en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38 en una proporción de efector con respecto a diana de 5:1. Se añadió monensina después de la primera hora de incubación para incrementar los niveles de proteína intracelular evitando el transporte proteico. Se establecieron ventanas en todas las células positivas para CD107a/b, positivas para perforina o positivas dobles, como se representa.

FIGURA 44. Proliferación relativa de linfocitos T humanos CD8+ (A) o bien CD4+ (B) tras la incubación con 1 nM de ^{diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG scFab, LALA" (véanse}SeQ ^{ID NO 5, 17, 19) o "(scFv)2")}o las correspondientes IgG de control en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38 en una proporción de célula efectora con respecto a diana de 5:1. Los linfocitos pan T humanos marcados con CFSE se caracterizaron por FACS. El nivel de proliferación relativo se determinó estableciendo una ventana alrededor de las células no proliferativas y usando el número de células de esta ventana en relación con el número de células medido global como referencia.

FIGURA 45. Niveles de diferentes citocinas medidos en el sobrenadante de PBMC humanos después del tratamiento con 1 nM de diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG scFab, LALA" (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19) o "(scFv)2") o las correspondientes IgG de control en presencia (A) o ausencia (B) de células tumorales Colo-38 durante 24 horas. La proporción de célula efectora con respecto a diana fue de 10:1.

FIGURA 46. Niveles de diferentes citocinas medidos en el sobrenadante de sangre completa después del tratamiento con 1 nM de diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG scFab", "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) o "(scFv)2") o las correspondientes IgG de control en presencia (A, B) o ausencia (C, D) de células tumorales Colo-38 durante 24 horas. Entre las construcciones biespecíficas estaban diferentes construcciones "2+1 IgG scFab" que tenían un dominio Fc natural (véanse SEQ ID NO 5, 13, 15) o bien un dominio Fc mutado para suprimir la función de la célula efectora (NK) (LALA (véanse SEQ ID NO 5, 17, 19), P329G LALA (véanse SEQ ID NO 5, 2, 23) y P329G LALA N297D (véanse SEQ ID NO 5, 25, 27)).

FIGURA 47. Análisis de CE-SDS. Electroforetograma mostrado como SDS PAGE de 2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179). (carril 1: reducido, carril 2: no reducido).

FIGURA 48. Cromatografía de exclusión por tamaño analítica de 2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179) (producto final). Se inyectaron 20 pg de muestra.

FIGURA 49. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MV-3 positivas para MCSP tras el cocultivo por PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas ^{CD3-MCSP durante ~ 44 horas ("2+1 IgG Crossfab" (véanse}SeQ ^{ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, LC unida"}(véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanos a partir de sangre roja de voluntarios sanos.

FIGURA 50. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 positivas para MCSP tras el cocultivo por PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas ^{CD3-MCSP durante ~ 22 horas ("2+1 IgG Crossfab" (véanse}SeQ ^{ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, LC unida"}(véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanos a partir de sangre roja de voluntarios sanos.

FIGURA 51. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales Colo-38 positivas para MCSP tras el cocultivo por PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas ^{CD3-MCSP durante ~ 22 horas ("2+1 IgG Crossfab" (véanse}SeQ ^{ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, LC unida"}(véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanos a partir de sangre roja de voluntarios sanos.

FIGURA 52. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células WM266-4 positivas para MCSP tras el cocultivo por PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP durante ~ 22 horas ("2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, LC unida" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179)). Se aislaron PBMC humanos a partir de sangre roja de voluntarios sanos.

FIGURA 53. Nivel de expresión superficial del marcador de activación temprana CD69 (A) y el marcador de activación tardía CD25 (B) en linfocitos T CD8+ humanos después de 22 horas de incubación con 10 nM, 80 pM o 3 pM de diferentes construcciones biespecíficas CD3-MCSP ("2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, LC unida" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179)) en presencia o ausencia de células diana tumorales Colo-38 que expresan MCSP humano (proporción E:T = 10:1).

FIGURA 54. Análisis de CE-SDS. (A) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 1 1 IgG Crossfab; ^{intercambio VL/VH (LC007/V9) (véanse}SeQ ^{ID NO 5, 29, 33, 181): a) no reducido, b) reducido. (B) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 1+1 CrossMab; intercambio}CL/cH1 ^{(LC007/V9) (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 185):}a) reducido, b) no reducido. (C) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 2+1 IgG Crossfab, invertida; ^{intercambio CL/CH1}(LC007/v9) ^{(véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 187): a) reducido, b) no reducido. (D)}Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 2+1 IgG Crossfab; intercambio VL/VH (M4-3 ML2/V9) (véanse ^{SEQ ID NO 33, 189, 191, 193): a) reducido, b) no reducido. (E) Electroforetograma mostrado como}SDS-pAgE ^de2+1 IgG Crossfab; intercambio CL/CH1 (M4-3 ML2/V9) (véanse SEQ ID NO 183, 189, 193, 195): a) reducido, b) no reducido. (F) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 2+1 IgG Crossfab, invertida; intercambio CL/CH1 (CH1A1A/V9) (véanse SEQ ID NO 65, 67, 183, 197): a) reducido, b) no reducido. (G) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 2+1 IgG Crossfab; intercambio CL/CH1 (M4-3 ML2/H2C) (véanse SEQ ID NO 189, 193, 199, 201): a) reducido, b) no reducido. (H) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de 2+1 IgG Crossfab, invertida; intercambio CL/CH1 (431/26/V9) (véanse SEQ ID NO 183, 203, 205, 207): a) reducido, b) no reducido. (I) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de "fusión de cadena ligera 2+1 IgG Crossfab" (CH1A1A/V9) (véanse SEQ ID NO 183, 209, 211, 213): a) reducido, b) no reducido. (J) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-MCSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 217), no reducido (izquierda) y reducido (derecha). (K) Electroforetograma mostrado como SDS-PAGE de "2+1 IgG Crossfab, invertida" (anti-McSP/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 219): a) reducido, b) no reducido. (L) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "1 1 IgG Crossfab" (anti-CD33/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 33, 213, 221, 223), reducido (izquierda) y no reducido (derecha). (M) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-CD33/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 33, 221, 223, 225), reducido (izquierda) y no reducido (derecha). (N) SDS PAGE (Bis/Tris al 4-12 %, NuPage Invitrogen, teñido con Coomassie) de "2+1 IgG Crossfab" (anti-CD20/anti-huCD3) (véanse SEQ ID NO 33, 227, 229, 231), no reducido.

FIGURA 55. Unión de construcciones biespecíficas (CEA/CD3 "2+1 IgG Crossfab, invertida (VL/VH)" (véanse SEQ ID NO 33, 63, 65, 67) y "2+1 IgG Crossfab, invertida (CL/CH1)

2 (véanse SEQ ID NO 65, 67, 183, 197)) a CD3 humano, expresado por células Jurkat (A), o CEA humano, expresado por células LS-174T (B) como se determina por FACS. Como control, también se evaluaron la concentración máxima equivalente de las IgG de referencia y la tinción de fondo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC anti-IgG humana de cabra, específico del fragmento Fcy, Jackson ImmunoResearch Lab n.° 109-096-098).

FIGURA 56. Unión de construcciones biespecíficas (MCSP/CD3 "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) ^{y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (véanse SEQ ID}nO ^{5, 23, 183, 187)) a CD3 humano, expresado por células Jurkat}(A), o a MCSP humano, expresado por células tumorales WM266-4 (B) como se determina por FACS.

FIGURA 57. Unión de la "fusión de cadena ligera 1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 183, 209, 211, 213) a CD3 humano, expresado por células Jurkat (A), o CEA humano, expresado por células LS-174T (B) como se determina por FACS.

FIGURA 58. Unión de las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 217) y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 219) a CD3 humano, expresado por células Jurkat (A), o MCSP humano, expresado por células tumorales WM266-4 (B) como se determina por FACS.

FIGURA 59. Nivel de expresión superficial del marcador de activación temprana CD69 (A) o del marcador de activación ^{tardía CD25 (B) en linfocitos T}cD4^{+ o CD8+ humanos después de 24 horas de incubación con las concentraciones}indicadas de las construcciones CD3/MCSP "1 1 CrossMab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 185), "1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 29, 33, 181) y "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33). El ensayo se realizó en presencia o ausencia de células diana MV-3, como se indica.

FIGURA 60. Nivel de expresión superficial del marcador de activación temprana CD25 en linfocitos T CD4+ o CD8+ de dos macacos cangrejeros diferentes (A y B) en presencia o ausencia de células tumorales MV-3 positivas para ^{huMCSP tras el cocultivo con PBMC de macaco cangrejero (proporción E:T = 3:1, normalizado a números de}cD3⁺), ^{tratado con "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 217) y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (véanse SEQ}iD NO 5, 23, 215, 219) durante ~ 41 horas.

FIGURA 61. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MKN-45 (A) o LS-174T (B) tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 28 horas por diferentes concentraciones de la construcción "2+1 IgG Crossfab, invertida (VL/VH)" (véanse SEQ ID NO 33, 63, 65, 67) frente a "2+1 IgG Crossfab, invertida (CL/CH1)" (véanse SEQ ID NO 65, 67, 183, 197).

FIGURA 62. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales WM266-4 tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 26 horas por diferentes concentraciones de la construcción "2+1 IgG Crossfab (VL/VH)" (véanse SEQ ID NO 33, 189, 191, 193) frente a "2+1 IgG Crossfab (CL/CH1)" (véanse SEQ ID NO 183, 189, 193, 195).

FIGURA 63. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MV-3 tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 27 horas por diferentes concentraciones de las ^{construcciones "2+1 IgG Crossfab}(VH/vL)" ^{(véanse SEQ ID NO 33, 189, 191, 193) frente a "2+1 IgG Crossfab}(CL/CH1)" (véanse SEQ ID NO183, 189, 193, 195).

FIGURA 64. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales WM266-4 (A) o MV-3 (B) positivas para MCSP humano tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 21 horas por diferentes concentraciones de "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), "1+1 CrossMab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 185) y "1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 29, 33, 181), como se indica.

FIGURA 65. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MKN-45 (A) o LS-174T (B) tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 28 horas por diferentes ^{concentraciones de la "fusión de LC 1+1 IgG Crossfab" (véanse}sEq ^{ID NO 183, 209, 211, 213).}

FIGURA 66. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MC38-huCEA tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y activación durante 24 horas por diferentes concentraciones de "fusión de LC 1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 183, 209, 211, 213) frente a una referencia "2+1 IgG Crossfab" no dirigida.

FIGURA 67. Destrucción (como se mide por la liberación de LDH) de células tumorales MV-3 (A) o WM266-4 (B) positivas para MCSP humano tras el cocultivo con PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), tratadas con las construcciones "2+1 IgG Crossfab (V9)" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, invertida (V9)" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 187), "2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 217) y "2+1 IgG Crossfab, invertida (anti-CD3)" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 219).

Descripción detallada

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos, de las mismas.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos aminoacídicos, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos aminoacídicos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo, un antígeno del complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define adicionalmente en el presente documento. Los restos de unión a antígeno particulares incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define además en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, ó, £, y o p. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas denominadas antígenos en el presente documento (por ejemplo, MCSP, FAP, CEA, EGFR, CD33, CD3) pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Las proteínas humanas ejemplares útiles como antígenos incluyen, pero no se limitan a: proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), también conocido como proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (UniProt n.° Q6UVK1 (versión 70), NCBI RefSeq n.° NP_001888.2); proteína de activación de fibroblastos (FAP), también conocida como seprasa (Uni. Prot. n.os Q12884, Q86Z29, Q99998, NCBI n.° de acceso NP_004451); antígeno carcinoembrionario (CEA), también conocido como molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (UniProt n.° P06731 (versión 119), NCBI RefSeq n.° NP_004354.2); CD33, también conocido como gp67 o Siglec-3 (UniProt n.° P20138, NCBI n.os de acceso NP_001076087, NP_001171079); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también conocido como ErbB-1 o Herl (UniProt n.° P0053, NCBI n.os de acceso NP_958439, NP_958440) y c D3, en particular la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 130), NCBI RefSeq n.° NP_000724.1, SEQ ID NO: 265 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), NCBI GenBank n.° BAB71849.1, SEQ ID NO: 266 para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]). En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se une a un epítopo de un antígeno activador de linfocitos T o un antígeno de célula diana que se conserva entre el antígeno activador de linfocitos T o el antígeno diana de diferentes especies.

Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es menor que aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por SPR. En determinados modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, <100 nM, <10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).

"Unión reducida", por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide, por ejemplo, por SPR. Por claridad, el término incluye además la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Un "antígeno activador de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico expresado en la superficie de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, que puede inducir la activación de linfocitos T tras la interacción con una molécula de unión a antígeno. Específicamente, la interacción de una molécula de unión a antígeno con un antígeno activador de linfocitos T puede inducir la activación de linfocitos T desencadenando la cascada de señalización del complejo receptor de linfocitos T. En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3.

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento pueden inducir la activación de las linfocitos T. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. Como se usa en el presente documento, los términos "primero" y "segundo" con respecto a los restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específicos de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a menos que explícitamente así se establezca.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y c L de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad del dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

Como se usa en el presente documento, el término "monocatenaria" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos. En determinados modos de realización, uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria, es decir, una molécula Fab en la que la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se conectan por un conector peptídico para formar una única cadena peptídica. En dicho modo de realización particular, el extremo C de la cadena ligera de Fab se conecta al extremo N de la cadena pesada de Fab en la molécula Fab monocatenaria.

Por una molécula Fab "de entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta de la región variable de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada, y una cadena peptídica compuesta de la región variable de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera. Por claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región constante de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento. Por el contrario, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende la región variable de la cadena pesada se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab de entrecruzamiento.

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), ó (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, Y1 (IgG1), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv), y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p.269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129 134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen en general estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) y por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDR1

1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).

2 "AbM" con una "b" minúscula, como se usa en la tabla 1, se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, etc.) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la habilidad del experto en la técnica convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): f R1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó , £, y y H, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991. Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que pueden tener autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o previene la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento en particular incluye modificaciones separadas realizadas a cada una de las dos subunidades del dominio Fc deseado para asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría ser no idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son los mismos. En algunos modos de realización, la modificación que promueve asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación se puede realizar para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc, o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida al sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, se puede indicar una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc a glicina como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido divulgado en el presente documento puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.

Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para los propósitos de la presente divulgación, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o parcial o sustancialmente purificado por cualquier técnica adecuada.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente divulgación. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro divulgados en el presente documento, así como formas de hebra positiva y negativa, y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a la secuencia de nucleótidos de referencia divulgada en el presente documento, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).

El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión divulgado en el presente documento comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas.

El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión divulgado en el presente documento comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión divulgado en el presente documento comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombras algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta cultivada o tejido animal o vegetal cultivado.

Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que, después del acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo, provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC, es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, publicación PCT n.° WO 2006/082515 o publicación PCT n.° WO 2012/130831).

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Descripción detallada de los modos de realización

En el presente documento se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, de los que uno es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T y el otro es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidades que se pueden asociar de forma estable;

en la que el primer resto de unión a antígeno es

(a) una molécula Fab monocatenaria en la que la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se conectan por un conector peptídico, o

(b) una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab.

Formatos de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones ejemplares se representan en la figura 1.

En algunos modos de realización, el segunda resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización particular de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria. De forma alternativa, en un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Opcionalmente, si el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En un modo de realización alternativo de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria. De forma alternativa, en un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento.

Aún en otro modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena ligera de Fab al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo N de la cadena ligera de Fab al extremo C de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento.

En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un modo de realización particular de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer y un segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad y, opcionalmente, uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización incluso más específico, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En particular, de estos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En otros modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, "n" es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. Un conector peptídico en particular adecuado para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno entre sí es (G4S)2. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno es EPKSC(D)-(G4S)2 (SEQ ID NO: 150 y 151). Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando un resto de unión a antígeno se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con un único resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana (por ejemplo, como se muestra en la figura 1A, 1B, 1D, 1E, 1H, 1I, 1K o 1M) es útil, en particular casos donde se espera internalización del antígeno de célula diana después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno específico para el antígeno de célula diana puede potenciar la internalización del antígeno de célula diana, reduciendo de este modo su disponibilidad.

En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dos o más restos de unión a antígeno específicos para un antígeno de célula diana (véanse los ejemplos mostrados en la figura 1C, 1F, 1G, 1J o 1L), por ejemplo para optimizar la dirección al sitio diana o para permitir la reticulación de antígenos de células diana.

En consecuencia, en determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende además un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente al mismo antígeno de célula diana que el primer o segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, y el segundo y tercer resto de unión a antígeno se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria. En un modo de realización particular de este tipo, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Opcionalmente, si el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí. El segundo y el tercer resto de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana. En un modo de realización, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno y el dominio Fc son parte de una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T en la que el resto de unión a antígeno es un molécula Fab monocatenaria o una molécula Fab de entrecruzamiento, en particular una molécula Fab de entrecruzamiento, fusionada al extremo N de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

En un modo de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste esencialmente en un primer, un segundo y un tercer resto de unión a antígeno, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización particular de este tipo, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En alguna de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. Dependiendo de la configuración del primer y el segundo resto de unión a antígeno, la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno, o la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno. La fusión de las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo resto de unión a antígeno reduce además el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera de Fab no coincidentes, y también reduce el número de plásmidos necesarios para la expresión de algunas de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un conector peptídico, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL-CL-conector-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4)), y un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un segundo polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un conector peptídico, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL-CL-conector-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En uno de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un segundo polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que una tercera cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) y un tercer polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena pesada de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL-CH1-CH2-CH2(-CH4)), y un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab (VH-CL) y un polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En modos de realización alternativos, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena ligera de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CL-CH2-CH2(-CH4)), y un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab (VH-CH1) y un polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena pesada de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena ligera de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)). Todavía en otros modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena ligera de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena pesada de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena pesada de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena ligera de Fab (es decir, una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4)).

En algunos de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento, en el que una región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab (VH-CL), y un polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En otros de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento, en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab (VL-CH1), y un polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). Todavía en otros de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende además un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal un polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CH1-VL-CL), un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de cadena ligera de Fab (VH-CL-VL-CL), un polipéptido en el que un polipéptido de cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena ligera de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab (VL-CL-VL-CH1), o un polipéptido en el que un polipéptido de cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena pesada de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab (VL-CL-VH-CL).

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que una tercera cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) y un tercer polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena ligera de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena pesada de Fab (es decir, una cadena ligera de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena ligera se reemplaza por una región constante de la cadena pesada) (VL-CL-VL-CH1), un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena ligera de Fab (VH-CL). En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende un polipéptido en el que una segunda cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena pesada de Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena ligera de Fab (es decir, una cadena ligera de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena ligera se reemplaza por una región variable de la cadena pesada) (VL-CL-VH-CL), un polipéptido en el que una segunda cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que una primera región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región constante de la cadena pesada de Fab (VL-CH1). La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que una tercera cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH-CH1-CH2-CH3(-CH4)) y un tercer polipéptido de cadena ligera de Fab (VL-CL). En determinados modos de realización, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (por ejemplo, resto de unión a antígeno, dominio Fc) se pueden fusionar directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. De forma adecuada, los conectores peptídicos no inmunógenos incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en los que n es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.

Dominio Fc

El dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de forma estable entre sí. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración EU), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio in vivo en el brazo Fab de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG1 humana se da en SEQ ID NO: 149.

Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento comprenden diferentes restos de unión a antígeno, fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc; por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T en producción recombinante, será ventajoso por tanto introducir en el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un modo de realización específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de "botón-en-ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro del que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable.

La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248,7-15 (2001)).

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno activador de linfocitos T se fusiona (opcionalmente por medio del resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno activador de linfocitos T a la subunidad que contiene un botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de moléculas de unión a antígeno que comprenden dos restos de unión a antígeno que se pueden unir a un antígeno activador de linfocitos T (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen botón).

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a la dirección indeseable de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T hacia células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células portadoras de antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas lo que, en combinación con las propiedades activadoras de linfocitos T y la semivida larga de la molécula de unión a antígeno, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (portadoras del receptor de Fc) distintas de linfocitos T incluso puede reducir la eficacia de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T debido a la destrucción potencial de linfocitos T, por ejemplo, por linfocitos NK.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con el dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce función efectora. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor de Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para tener afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento que comprenden dicho dominio Fc, pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se genomanipula para tener función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a células NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es menor de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329. En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331. En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi por completo la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgG1. Por tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P. Para reducir además su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E. En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G. En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G. Dichos mutantes de dominios Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural, es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G.

En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular, una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión a receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos del dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de Ee . UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluarla actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para tener una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir a C1q y, por tanto, tener actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Restos de unión a antígeno

La molécula de unión a antígeno divulgada en el presente documento es biespecífica, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a dos determinantes antigénicos distintos. De acuerdo con la presente divulgación, los restos de unión a antígeno son moléculas Fab (es decir, dominio de unión a antígeno compuestos de una cadena pesada y una ligera, comprendiendo cada una una región variable y una constante). En un modo de realización, dichas moléculas Fab son humanas. En otro modo de realización, dichas moléculas Fab son humanizadas. Aún en otro modo de realización, dichas moléculas Fab comprenden regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas.

Al menos uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria o una molécula Fab de entrecruzamiento. Dichas modificaciones previenen el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera de diferentes moléculas Fab, mejorando de este modo el rendimiento y la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento en la producción recombinante. En una molécula Fab monocatenaria particular útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, el extremo C de la cadena ligera de Fab se conecta al extremo N de la cadena pesada de Fab por un conector peptídico. El conector peptídico permite la disposición de la cadena pesada y ligera de Fab para formar un resto de unión a antígeno funcional. Los conectores peptídicos adecuados para conectar la cadena pesada y ligera de Fab incluyen, por ejemplo, (G4S)6-GG (SEQ ID NO: 152) o (SG3)2-(SEG3)4-(SG3)-SG (SEQ ID NO: 153). En una molécula Fab de entrecruzamiento particular útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, las regiones constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian. En otra molécula Fab de entrecruzamiento útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, las regiones variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian.

En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede unir simultáneamente a un antígeno de célula diana, en particular un antígeno de célula tumoral, y un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede reticular un linfocito T y una célula diana por unión simultánea a un antígeno de célula diana y un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, en particular una célula tumoral. En un modo de realización, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T al antígeno activador de linfocitos T sin unión simultánea al antígeno de célula diana no da como resultado la activación del linfocito T.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede redireccionar la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T.

En particular, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la presente divulgación es un linfocito T citotóxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

Resto de unión a antígeno activador de linfocitos T

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno activador de linfocitos T (también denominado en el presente documento un "resto de unión a antígeno activador de linfocitos T"). En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T proporciona unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T. El resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede ser una molécula Fab convencional o una molécula Fab modificada, es decir, una molécula Fab monocatenaria o de entrecruzamiento. En modos de realización en las que hay más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana comprendido en la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, el resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T es preferentemente un Fab modificado. molécula.

En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en particular CD3 humano (SEQ ID NO: 265) o CD3 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 266), lo más en particular CD3 humano. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T es reactiva de forma cruzada para (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos modos de realización, el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad épsilon de CD3.

En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal H2C (descrito en la publicación PCT n.° WO 2008/119567) por la unión a un epítopo de CD3. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal V9 (descrito en Rodrigues etal., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) y la patente de EE. UU. n.° 6.054.297) por la unión a un epítopo de CD3. Aún en otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal FN18 (descrito en Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)) por la unión a un epítopo de CD3. En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir con el anticuerpo monoclonal SP34 (descrito en Pessano et al., EMBO J4, 337-340 (1985)) por la unión a un epítopo de CD3. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 que el anticuerpo monoclonal SP34. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende la ^cDR1 ^{de la cadena pesada de SEQ ID NO: 163, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 165, la CDR3 de la cadena pesada de}SeQ ^{ID NO: 167, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO:}171, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 173 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 175. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 169 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 177, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la ^{cadena pesada de SEQ ID}No: ^{249, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 251, la CDR3 de la cadena pesada}de SEQ ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 257, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 259 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 261. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir por la unión a un epítopo de CD3 con un resto de unión a antígeno que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 251, la ^{CDR3 de la cadena pesada de}sEq ^{ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de}sEq ^{ID NO: 257, la CDR2 de la cadena ligera de}SeQ ^{ID NO: 259 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 261. En un modo de realización, el}resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 que un resto de unión a antígeno que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: ^{251, la CDR3 de la cadena pesada de}SeQ ^{ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 257, la CDR2}de la cadena ligera de SEQ ID NO: 259 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 261. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 255 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, ^{90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID}No: ^{263, o variantes de las mismas que conservan}la funcionalidad. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T puede competir por la unión a un epítopo de CD3 con una fracción de unión a antígeno que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 255 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 263. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une al mismo epítopo de CD3 que un resto de unión a antígeno que comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 255 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 263. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende una versión humanizada de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 255 y una versión humanizada de la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 263. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 249, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 251, la CDR3 de la ^{cadena pesada de SEQ ID NO: 253, la CDR1 de la cadena ligera de}SeQ ^{ID NO: 257, la CDR2 de la cadena ligera}de SEQ ID NO: 259, la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 261, y las secuencias estructurales de la región variable de la cadena ligera y pesada humana.

Resto de unión a antígeno de célula diana

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento comprende al menos un resto de unión a antígeno que se puede unir a un antígeno de célula diana (también denominado en el presente documento un "resto de unión a antígeno de célula diana"). En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende no más de dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana. El resto de unión a antígeno de célula diana es en general una molécula Fab que se une a un determinante antigénico específico y puede dirigir la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que porta el determinante antigénico.

En determinados modos de realización, el resto de unión a antígeno de célula diana se dirige a un antígeno asociado con una afección patológica, tal como un antígeno presentado en una célula tumoral o una célula infectada por virus. Los antígenos adecuados son antígenos de superficie celular, por ejemplo, pero sin limitarse a, receptores de superficie celular. En modos de realización particulares, el antígeno es un antígeno humano. En un modo de realización específico, el antígeno de célula diana se selecciona del grupo de proteína de activación de fibroblastos (FAP), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD19, CD20 y CD33.

En modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para el proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP). En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal LC007 (véanse las SEQ ID NO: 75 y 83, y la publicación de solicitud de patente europea n.° EP2748195) por la unión a un epítopo de MCSP. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 69, la CDR2 de la cadena pesada ^{de SEQ ID NO: 71, la CDR3 de la cadena pesada de}SeQ ^{ID NO: 73, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO:}77, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 79 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 81. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 75 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID No: ^{83, o variantes de las mismas}que conservan la funcionalidad. En modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal M4-3 ML2 (véanse las SEQ ID NO: 239 y 247, y la publicación de solicitud de patente europea n.° EP2748195) por la unión a un epítopo de MCSP. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP se une al mismo epítopo de MCSP que el anticuerpo monoclonal M4-3 ML2. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 233, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 235, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 237, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 241, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 243 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 245. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, en particular aproximadamente un 98 %, 99 % o 100 %, idéntica a SEQ ID NO: 239 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, en particular aproximadamente un 98 %, 99 % o 100 %, idéntica a SEQ ID NO: 247, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para MCSP comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una versión con afinidad madurada del anticuerpo ^{monoclonal M4-3 ML2. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para}MCSp comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 239 con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, en particular dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones aminoacídicas; y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 247 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, en particular dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones aminoacídicas. Cualquier residuo aminoacídico dentro de las secuencias de la región variable se puede sustituir por un aminoácido diferente, incluyendo los residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR, siempre que se conserve la unión a MCSP, en particular a MCSP humano. Las variantes preferentes son las que tienen una afinidad de unión por MCSP al menos igual (o más fuerte) a la afinidad de unión del resto de unión a antígeno que comprende las secuencias de la región variable sin sustituir.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 7, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 9 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 11, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 13, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 15 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 17, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 19 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 21, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 23 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. Todavía en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 25, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 27 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 31, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 35, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 37 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 39, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 41 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 3, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 179, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 29, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 181, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 185, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 23, ^{la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183 y la secuencia polipeptídica de SEQ}iD ^{NO: 187, o variantes de la}misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 189, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 191 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 193, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183, la secuencia polipeptídica de ^{SEQ ID NO: 189, la secuencia polipeptídica de}SeQ ^{ID NO: 193 y la secuencia polipeptídica de}SeQ ^{iD NO: 195, o}variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 189, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 193, la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 199 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 201, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 215 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 217, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 5, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 23, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 215 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 219, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24,

26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218 y SEQ ID NO: 220.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal GA201 por la unión a un epítopo de EGFR. Véase la publicación PCT WO 2006/082515. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para EGFR comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO:

85, la CDR2 de la cadena pesada de SeQ ^IDNo: ^{87, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 89, la CDR1 de}la cadena ligera de SEQ ID NO: 93, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 95 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 97. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para EGFR comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, ^{95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ}iD ^{NO: 91 y una secuencia de región variable de la cadena}ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 99, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 43, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 47, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 49, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 11, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 53, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 47, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 12.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal 3F2 por la unión ^{a un epítopo de FAP. Véase la publicación PCT}Wo ^{2012/020006. En un modo de realización, el resto de unión a}antígeno que es específico para FAP comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 101, la CDR2 de la ^{cadena pesada de}SeQ ^IDNo: ^{103, la CDR3 de la cadena pesada de}sEq ^{ID NO: 105, la CDR1 de la cadena ligera}de SEQ ID NO: 109, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ iD NO: 111 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:

113. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para FAP comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 107 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 115, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

Aún en otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 55, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 11, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 57, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 59 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 61, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:

112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 12.

En modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para el antígeno carcinoembrionario (CEA). En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo monoclonal BW431/26 (descrito en la patente europea n.° EP 160 897, y Bosslet et al., Int. J Cancer 36, 75-84 (1985)) por la unión a un epítopo de CEA. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos uno, típicamente dos o más restos de unión a antígeno que pueden competir con el anticuerpo ^{monoclonal CH1A1A (véanse SEQ ID NO 123 y 131) por la unión a un epítopo de CEA. Véase la publicación}pCt número WO 2011/023787. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CEA se une al mismo epítopo de CEA que el anticuerpo monoclonal CH1A1A. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CEA comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 117, la CDR2 de la ^{cadena pesada de SEQ ID}No: ^{119, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 121, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 125, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ}iD ^{NO: 127 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO:}129. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CEA comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, en particular aproximadamente un 98 %, 99 % o 100 %, idéntica a SEQ ID NO: 123 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, en particular aproximadamente un 98 %, 99 % o 100 %, idéntica a SEQ ID NO: 131, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CEA comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una versión con afinidad madurada del anticuerpo monoclonal CH1A1A. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 123 con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, en particular dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones aminoacídicas; y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 131 con una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete, en particular dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones aminoacídicas. Cualquier residuo aminoacídico dentro de las secuencias de la región variable se puede sustituir por un aminoácido diferente, incluyendo los residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR, siempre que se conserve la unión a CEA, en particular a CEA humano. Las variantes preferentes son las que tienen una afinidad de unión por CEA al menos igual (o más fuerte) a la afinidad de unión del resto de unión a antígeno que comprende las secuencias de la región variable sin sustituir.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 63, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 65, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 67 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 65, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 67, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183 y la secuencia polipeptídica de SEQ iD NO: 197, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 203, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 205 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 207, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 183, la secuencia polipeptídica de ^{SEQ ID NO: 209, la secuencia polipeptídica de}SeQ ^{ID NO: 211 y la secuencia polipeptídica de}SeQ ^{ID NO: 213, o}variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212 y SEQ ID NO: 214.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende al menos un resto de unión a antígeno que es específico para CD33. En un modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CD33 comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 133, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 135, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 137, la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 141, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ iD NO: 143 y la CDR3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 145. En otro modo de realización, el resto de unión a antígeno que es específico para CD33 comprende una secuencia de región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 139 y una secuencia de región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 147, o variantes de las mismas que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 213, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 221 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 223, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 33, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 221, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 223 y la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 225, o variantes de la misma que conservan la funcionalidad.

En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224 y SEQ ID NO: 226.

Polinucleótidos

Se proporcionan además en el presente documento polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento o un fragmento de la misma.

Los polinucleótidos divulgados en el presente documento incluyen los que son al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a las secuencias expuestas en SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264, incluyendo fragmentos funcionales o variantes de los mismos.

Los polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgados en el presente documento se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica toda la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un resto de unión a antígeno se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la porción de la cadena pesada del resto de unión a antígeno, una subunidad del dominio Fc y opcionalmente (parte de) otro resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el resto de unión a antígeno. En otro ejemplo, la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) uno o más restos de unión a antígeno se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) un resto de unión a antígeno. Cuando se coexpresen, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En determinados modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica un fragmento de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, y un dominio Fc que consiste en dos subunidades, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab monocatenaria. En un modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica el primer resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una molécula Fab monocatenaria comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. Aún en otro modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica el primer resto de unión a antígeno, la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una molécula Fab monocatenaria comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En determinados modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica un fragmento de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, y un dominio Fc que consiste en dos subunidades, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. En un modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del primer resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. Aún en otro modo de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada del primer resto de unión a antígeno, la cadena pesada del segundo resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. En otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. Aún en otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc. Todavía en otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En otros modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena pesada de un tercer resto de unión a antígeno y una subunidad del dominio Fc. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc.

En otros modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena ligera de un resto de unión a antígeno. En algunos modos de realización, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab. En otros modos de realización, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab. Todavía en otros modos de realización, un polinucleótido aislado divulgado en el presente documento codifica la cadena ligera del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización más específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una cadena ligera de Fab. En otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena ligera de Fab. Aún en un modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una región variable de la cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una cadena ligera de Fab. Aún en otro modo de realización específico, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido en el que una cadena ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región variable de la cadena ligera de Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una región constante de la cadena pesada de Fab.

En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable como se muestra en SEQ ID NO 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 y 263. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica como se muestra en SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 y 231. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 o 264. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 o 264. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en Se Q ID NO 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 o 263. En otro modo de realización, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptídica que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 231. La presente divulgación engloba un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de la región variable de SEQ ID NO 75, 83, 91, 99, 107, 115, 123, 131, 139, 147, 169, 177, 239, 247, 255 o 263 con sustituciones aminoacídicas conservadoras. La divulgación también engloba un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 231 con sustituciones aminoacídicas conservadoras.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido divulgado en el presente documento es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN divulgado en el presente documento puede ser monocatenario o bicatenario.

Procedimientos recombinantes

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento), por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan y se insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos divulgados en el presente documento. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento) junto con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento) (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector divulgado en el presente documento puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico divulgado en el presente documento puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o bien no fusionadas con un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento) divulgada en el presente documento, o variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterógenas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterógeno. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica celular. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos tisulares, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles de tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas adenoasociadas (AAV).

Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos divulgadas en el presente documento se pueden asociar con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido divulgado en el presente documento. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, se puede disponer el ADN que codifica una secuencia señal en dirección 5' del ácido nucleico que codifica una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento o un fragmento de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados modos de realización, se usa el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que se asocia de forma funcional con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterógeno, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir con la secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón. Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos ejemplares de los péptidos señal secretores se muestran en SEQ ID NO: 154-162.

El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la posterior purificación (por ejemplo, una marca histidina) o ayudar a marcar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede incluir dentro de o en los extremos del polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T (fragmento).

En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos divulgados en el presente documento. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores divulgados en el presente documento. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que se puede genomanipular para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicación y para soportar la expresión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o traducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.4l7.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (Co S-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC-5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo, se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado es un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización se proporciona un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se fusionan genéticamente entre sí. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se puede diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. Los ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se encuentran en las secuencias proporcionadas en el presente documento. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En determinados modos de realización, el uno o más restos de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T comprenden al menos una región variable de anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivar de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo como se describe en la patente de e E. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 para McCafferty).

Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente pueden ser de origen murino, primate o humano. Si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se destina para uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo son de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 para Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales críticos (por ejemplo, los que son importantes para conservar buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann etal., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe en enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivar de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). También se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano (véanse, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)).

Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.

En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno útiles en el presente documento se genomanipulan para tener una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. La capacidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o dominio variable que compite con un anticuerpo de referencia por la unión a un antígeno particular, por ejemplo, un anticuerpo que compite con el anticuerpo V9 por la unión a CD3. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une por el anticuerpo de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba antígeno inmovilizado (por ejemplo, CD3) en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo, anticuerpo V9) y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba el antígeno inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar la cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión, y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión de la cadena pesada expresadas como se describe en los ejemplos estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demostró por SDS-PAGE reductora (véase por ejemplo, la figura 2). Se resolvieron tres bandas aproximadamente a Mr 25.000, Mr 50.000 y Mr 75.000, correspondientes a los pesos moleculares predichos de la proteína de fusión de cadena ligera, cadena pesada y cadena pesada/cadena ligera de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

Ensayos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T por un receptor de Fc o un antígeno diana se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (Ge Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo por citometría de flujo (FACS). Se describe un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión en lo siguiente y en los ejemplos a continuación.

De acuerdo con un modo de realización, Kd se mide por resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores de Fc, se captura el receptor de Fc recombinante con marca His por un anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el anticuerpo anti-Penta-His con acetato de sodio 10 mM, pH 5.0, a 40 pg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 pl/min para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, se captura el receptor de Fc durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie por cuadruplicado de la construcción biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P200,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 pl/min durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el antígeno diana, se capturan las construcciones biespecíficas por un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip de sensor CM5 activado como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His. La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12000 UR. Se capturan las construcciones biespecíficas durante 90 s a 300 nM. Se pasan los antígenos diana a través de las cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentración de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 pl/min. Se sigue la disociación durante 180 s.

Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en estado estacionario para derivar la constante de disociación Kd por ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

Se puede medir la actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento por diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana tales como células tumorales y la inducción de regresión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se proporciona además un procedimiento de producción de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento, y (b) formular la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T disueltas o dispersadas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y opcionalmente un ingrediente activo adicional serán conocidos para el experto en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para administración animal (por ejemplo, humana), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiere por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o aerosol, y si es necesario que sea estéril para dichas vías de administración como inyección. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en la presente invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntiva, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación por aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada con baño de células diana directo, por medio de un catéter, por medio de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro procedimiento o cualquier combinación de los anteriores como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. Mack Printing Company). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se usa más comúnmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento.

Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, como se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones Inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas previamente, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular con materiales hidrófobos o poliméricos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden fabricar por medio de procesos de mezclado, disolución, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Procedimientos y composiciones terapéuticas

Se puede usar cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T proporcionadas en el presente documento en procedimientos terapéuticos. Se pueden usar moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T como se divulgan en el presente documento como agentes inmunoterápicos, por ejemplo en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consecuente con una buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadores de linfocitos T como se divulga en el presente documento para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T como se divulga en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T como se divulga en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En determinados modos de realización, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros modos de realización, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se describe en el presente documento para su uso en la inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En determinados modos de realización, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En un modo de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro modo de realización, el medicamento es para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. Todavía en otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento. En un modo de realización, se administra una composición a dicho individuo, que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. En un modo de realización, el procedimiento comprende poner en contacto una célula diana con una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento en presencia de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para inducir la lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo. En un modo de realización este tipo, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T para inducir la lisis de una célula diana. En un modo de realización, un "individuo" es un ser humano.

En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el(los)/la(s): abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede que no proporcione una cura sino que solo proporciona un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.

En algunos modos de realización, una cantidad eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se administra a una célula. En otros modos de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se administra a un individuo para el tratamiento de enfermedad.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, la anamnesis y respuesta del paciente a la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T descritas en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Son preferentes las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T que presentan índices terapéuticos grandes. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto, y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, a disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células por los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de ADN, un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales, o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T usada, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente como apropiada.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma composición o en composiciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso se puede producir la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T divulgada en el presente documento antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional. También se pueden usar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T divulgadas en el presente documento en combinación con radioterapia.

Artículos de fabricación

En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T como se divulga en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en este modo de realización puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones divulgados en el presente documento. Se entiende que se pueden practicar otros diversos modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Procedimientos generales

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., publicación NIH n.° 91-3242.

Secuenciación de ADN

Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.

Síntesis génica

Se generaron segmentos de genes deseados, cuando se requirió, por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR del ARN que se origina en el tejido apropiado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas. SEQ ID NO 154-162 dan péptidos líder ejemplares y secuencias polinucleotídicas que los codifican, respectivamente.

Aislam iento de linfocitos pan T humanos primarios de PBMC

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) por centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucoplaquetarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre roja de donantes humanos sanos. En resumen, se diluyó sangre con PBS estéril y se estratificó con cuidado sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, H8889). Después de la centrifugación durante 30 minutos a 450 x g a temperatura ambiente (freno desconectado), se desechó parte del plasma por encima de la interfase que contenía PBMC. Se transfirieron PBMC a tubos Falcon de 50 ml nuevos y se rellenaron los tubos con PBS hasta un volumen total de 50 ml. Se centrifugó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 x g (freno activado). Se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación a 4 °C durante 10 minutos a 350 x g). Se contó automáticamente (ViCell) la población de PBMC resultante y se almacenó en medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO2 al 5 % en la estufa hasta el inicio del ensayo.

Se realizó enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T II (Miltenyi Biotec n.° 130-091-156), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se diluyeron los sedimentos celulares en 40 pl de tampón frío por 10 millones de células (PBS con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM, filtrado estéril) y se incubaron con 10 pl de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 millones de células durante 10 min a 4 °C. Se añadieron 30 pl de tampón frío y 20 pl de microesferas magnéticas anti-biotina por 10 millones de células, y se incubó la mezcla durante otros 15 min a 4 °C. Se lavaron las células añadiendo 10-20x el volumen actual y una etapa de centrifugación posterior a 300 x g durante 10 min. Se resuspendieron hasta 100 millones de células en 500 pl de tampón. Se realizó la separación magnética de linfocitos pan T humanos no marcados usando columnas LS (Miltenyi Biotec n.° 130-042 401) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población de linfocitos T resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en medio AIM-V a 37 °C, CO2 al 5 % en la estufa hasta el inicio del ensayo (no más de 24 h).

Aislam iento de linfocitos T indiferenciados humanos primarios de PBMC

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) por centrifugación por densidad en Histopaque a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas leucoplaquetarias) obtenidas de bancos de sangre locales o de sangre roja de donantes humanos sanos. El enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC se realizó usando el kit de aislamiento de linfocitos T indiferenciados CD8+ de Miltenyi Biotec (n.° 130-093-244), de acuerdo con las instrucciones del fabricante pero omitiendo la última etapa de aislamiento de los linfocitos T CD8+ (véase también la descripción para el aislamiento de linfocitos pan T humanos primarios).

Aislam iento de linfocitos pan T murinos de esplenocitos

Se aislaron bazos de ratones C57BL/6, se transfirieron a un tubo en C GentleMACS (Miltenyi Biotech n.° 130-093 237) que contenía tampón MACS (PBS+BSA al 0,5 %+EDTA 2 mM) y se disociaron con el disociador GentleMACS para obtener suspensiones de células disociadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La suspensión celular se pasó a través de un filtro de separación previa para retirar partículas de tejido no disociadas restantes. Después de la centrifugación a 400 x g durante 4 min a 4 °C, se añadió tampón de lisis ACK para lisar los glóbulos rojos (incubación durante 5 min a temperatura ambiente). Se lavaron las células restantes con tampón MACS dos veces, se contaron y se usaron para el aislamiento de linfocitos pan T murinos. Se realizó la selección (magnética) negativa usando el kit de aislamiento de linfocitos pan T de Miltenyi Biotec (n.° 130-090-861), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se contó la población de linfocitos T resultante automáticamente (ViCell) y se usó de inmediato para otros ensayos.

Aislam iento de PBMC de macaco cangrejero primarios de sangre heparinizada

Se prepararon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) por centrifugación por densidad a partir de sangre roja de donantes de macaco cangrejero sanos, como sigue: Se diluyó sangre heparinizada 1:3 con PBS estéril y medio Lymphoprep (Axon Lab n.° 1114545) a un 90 % con PBS estéril. Se colocaron en capa dos volúmenes de la sangre diluida sobre un volumen del gradiente de densidad diluido y se separó la fracción de PBMC por centrifugación durante 30 min a 520 x g, sin freno, a temperatura ambiente. Se transfirió la banda de PBMC a un tubo Falcon de 50 ml nuevo y se lavó con PBS estéril por centrifugación durante 10 min a 400 x g a 4 °C. Se realizó una centrifugación a baja velocidad para retirar las plaquetas (15 min a 150 x g, 4 °C), y se contó la población de PBMC resultante automáticamente (ViCell) y se usó de inmediato para otros ensayos.

Células diana

Para la evaluación de moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a MCSP se usaron las siguientes líneas celulares tumorales: la línea celular de melanoma humano WM266-4 (ATCC n.° CRL-1676), derivada de un sitio metastásico de un melanoma maligno y que expresa niveles altos de MCSP humano; y la línea celular de melanoma humano MV-3 (un obsequio de The Radboud University Nijmegen Medical Center), que expresa niveles medios de MCSP humano.

Para la evaluación de moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a CEA se usaron las siguientes líneas celulares tumorales: la línea celular de cáncer gástrico humano MKN45 (DSMZ n.° ACC 409), que expresa niveles muy altos de CEA humano; la línea celular de adenocarcinoma de colon de mujer humana de raza blanca LS-174T (ECACC n.° 87060401), que expresa niveles medios a bajos de CEA humano; la línea celular de carcinoma pancreático epitelioide humano Panc-1 (ATCC n.° CRL-1469), que expresa niveles (muy) bajos de CEA humano; y una línea celular de carcinoma de colon murino MC38-huCEA, que se genomanipuló internamente para expresar CEA humano de manera estable.

Además, se usó una línea celular de leucemia de linfocitos T humanos, Jurkat (ATCC n.° TIB-152), para evaluar la unión de diferentes construcciones biespecíficas a CD3 humanos en células.

Ejemplo 1

Preparación, purificación y caracterización de moléculas de unión a antígeno biespecíficas

Se subclonaron las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante o bien la cadena ligera constante preinsertada en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se impulsó la expresión de anticuerpo por un promotor MPSV y se localiza una secuencia señal poliA sintética en el extremo 3' de c Ds . Además, cada vector contenía una secuencia OriP de EBV.

Se produjeron las moléculas cotransfectando células HEK293 EBNA con los vectores de expresión de mamífero. Se transfectaron células HEK293 EBNA en crecimiento exponencial usando el procedimiento de fosfato de calcio. De forma alternativa, se transfectaron células HEK293 EBNa que crecían en suspensión usando polietilenimina (PEI). Para la preparación de construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo/un brazo invertida", se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1 ("vector cadena pesada": "vector cadena ligera": "vector cadena pesada-scFab"). Para la preparación de construcciones "2+1 IgG scFab", se transfectaron células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:2:1 ("vector cadena pesada": "vector cadena ligera": "vector cadena pesada-scFab"). Para la preparación de construcciones "1+1 IgG Crossfab", se transfectaron células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 ("vector segunda cadena pesada": "vector primera cadena ligera": "vector cadena ligera Crossfab": "vector primera cadena pesadacadena pesada Crossfab"). Para la preparación de construcciones "2+1 IgG Crossfab", se transfectaron células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:2:1:1 ("vector segunda cadena pesada": "vector cadena ligera": "vector de primera cadena pesada-cadena pesada Crossfab)": "vector cadena ligera Crossfab". Para la preparación de la construcción "2+1 IgG Crossfab, cadena ligera enlazada", se transfectaron células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 ("vector cadena pesada": "vector cadena ligera": "vector cadena pesada (CrossFab-Fab-Fc)": "vector cadena ligera unida"). Para la preparación de la construcción "1 1 CrossMab", se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 ("vector primera cadena pesada": "vector segunda cadena pesada": "vector primera cadena ligera": "vector segunda cadena ligera"). Para la preparación de la construcción "fusión de cadena ligera 1 1 IgG Crossfab", se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1:1:1 ("vector primera cadena pesada": "vector segunda cadena pesada": "vector cadena ligera Crossfab": "vector segunda cadena ligera").

Para la transfección usando fosfato de calcio, se cultivaron células como cultivos monocapa adherentes en matraces en T usando medio de cultivo DMEM complementado con FCS al 10 % (v/v) y se transfectaron cuando tenían una confluencia entre un 50 y un 80 %. Para la transfección de un matraz T150, se sembraron 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 ml de medio de cultivo DMEM complementado con FCS (al 10 % v/v final), y se dispusieron las células a 37 °C en una estufa con una atmósfera de CO2 al 5 % durante la noche. Para cada matraz T150 que se va a transfectar, se preparó una solución de ADN, CaCh y agua mezclando 94 pg de ADN de vector plasmídico total dividido en la correspondiente proporción, agua hasta un volumen final de 469 pl y 469 pl de una solución de CaCl2 1 M. A esta solución se le añadieron 938 pl de una solución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM y Na2HPO41,5 mM a pH 7,05, se mezcló de inmediato durante 10 s y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 s. Se diluyó la suspensión con 10 ml de DMEM complementado con f Cs al 2 % (v/v) y se añadió al T150 en lugar del medio existente. Posteriormente, se añadieron 13 ml adicionales de medio de transfección. Se incubaron las células a 37 °C, CO2 al 5 % durante aproximadamente de 17 a 20 horas y, a continuación, se reemplazó el medio con 25 ml de DMEM, FCS al 10 %. Se recogió el medio de cultivo acondicionado aproximadamente 7 días después del intercambio de medio por centrifugación durante 15 min a 210 x g, se filtró de forma estéril (filtro de 0,22 • m), se complementó con acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

Para la transfección usando polietilenimina (PEI) se cultivaron células HEK293 EBNA en suspensión en medio de cultivo CD CHO sin suero. Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 5 min a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclaron los vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 200 pg de ADN. Después de la adición de 540 pl de PEI, se agitó en vórtex la mezcla durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en una estufa con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadieron ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 % (Lonza). Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para su purificación por centrifugación durante 15 min a 210 x g, se filtró la solución de forma estéril (filtro de 0,22 pm), se complementó con acida de sodio hasta una concentración final de un 0,01 % p/v, y se mantuvo a 4 °C. Se purificaron las proteínas secretadas de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad de proteína A, seguido de una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño.

Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5 o 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos diez volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5, seguido de una etapa de lavado adicional usando seis volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM, citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 5,45. Posteriormente, se lavó la columna con 20 ml de MES 10 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 5,0, y se eluyó la proteína diana en seis volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. De forma alternativa, se eluyó proteína diana usando un gradiente en 20 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,5 a citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 2,5. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8. Se concentró la proteína diana y se filtró antes de cargarse en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con solución de fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM a pH 6,7. Para la purificación de 1 1 IgG Crossfab, se equilibró la columna con solución de histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM a pH 6,0.

Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de las construcciones biespecíficas se analizaron por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y se usó tinción con Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain de Invitrogen), usando el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles Tris-acetato al 4-12 % o Bis-Tris al 4-12 %). De forma alternativa, se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas por análisis CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor, usando el sistema Caliper LabChip GXII (Caliper Lifescience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizó el contenido de agregados de las muestras de proteína usando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño analítica Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare) en MOPS 2 mM, NaCI 150 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 7,3 a 25 °C. De forma alternativa, se analizó el contenido de agregados de muestras de anticuerpo usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO4125 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.

Las figuras 2-14 muestran los resultados de la SDS PAGE y la cromatografía de exclusión por tamaño analítica y la tabla 2A muestra los rendimientos, contenido de agregados después de proteína A y contenido de monómero final de las preparaciones de las diferentes construcciones biespecíficas.

La figura 47 muestra el resultado de los análisis CE-SDS de la construcción "2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida" biespecífica anti-CD3/anti-MCSP (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29 y 179). Se usaron 2 pg de muestra para los análisis. La figura 48 muestra el resultado de la cromatografía de exclusión por tamaño analítica del producto final (20 pg de muestra inyectada).

La figura 54 muestra los resultados de los análisis CE-SDS y SDS PAGE de diversas construcciones, y la tabla 2A muestra los rendimientos, contenido de agregados después de proteína A y contenido de monómero final de las preparaciones de las diferentes construcciones biespecíficas.

TABLA 2A. Rendimientos, contenido de agregados después de proteína A y contenido de monómero final.

Como controles, se generaron moléculas de unión a antígeno biespecíficas en el formato scFv en tándem de la técnica anterior ("(scFv)2") y fusionando un scFv en tándem con un dominio Fc ("(scFv)2-Fc"). Se produjeron las moléculas en células HEK293-EBNA y se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A seguido de una etapa cromatográfica de exclusión por tamaño de manera análoga como se describe anteriormente. Debido a la alta formación de agregados, algunas de las muestras se tuvieron que purificar además aplicando muestras eluidas y concentradas de la columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) a una columna Superdex 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,7 para obtener proteínas con contenido en monómero alto. Posteriormente, se determinaron la concentración de proteína, pureza y peso molecular, y contenido de agregados como se describe anteriormente.

Los rendimientos, contenido de agregados después de la primera etapa de purificación y contenido de monómero final para las moléculas de control se muestran en la tabla 2B. La comparación del contenido de agregados después de la primera etapa de purificación (proteína A) indica la estabilidad superior de las construcciones IgG Crossfab e IgG scFab en comparación con las moléculas "(scFv)2-Fc" y "(dsscFv)2-Fc" estabilizada con puente disulfuro.

TABLA 2B. Rendimientos, contenido de agregados después de proteína A y contenido de monómero final.

Se realizó el seguimiento de la estabilidad térmica de las proteínas por dispersión de luz dinámica (DLS). Se aplicaron 30 g de muestra de proteína filtrada con una concentración de proteína de 1 mg/ml por duplicado a un lector de placas Dynapro (Wyatt Technology Corporation; EE. UU.). Se aumentó la temperatura de 25 a 75 °C a 0,05 °C/min, recogiéndose el radio y la intensidad de dispersión total. Los resultados se muestran en la figura 15 y tabla 2A. Para la molécula "(scFv)2-Fc" (antiMCSP/anti huCD3) se observaron dos puntos de agregación, a 49 °C y 68 °C. La construcción "(dsscFv)2-Fc" tiene una temperatura de agregación incrementada (57 °C) como resultado del puente disulfuro introducido (figura 15A, tabla 2C). Ambas, las construcciones "2+1 IgG scFab" y "2+1 IgG Crossfab" se agregan a temperaturas mayores que 60 °C, demostrando su estabilidad térmica superior en comparación con los formatos "(scFv)2-Fc" y "(dsscFv)2-Fc" (figura 15B, tabla 2C).

TABLA 2C. Estabilidad térmica determinada por dispersión de luz dinámica.

Ejemplo 2

Análisis de resonancia de plasmón superficial del receptor de Fc y unión a antígeno diana

Procedimiento

Se realizan todos los experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un Biacore T100 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).

Análisis de la unión de FcR de diferentes variantes de Fc

La configuración del ensayo se muestra en la figura 16A. Para analizar la interacción de diferentes variantes de Fc con FcYRIIIa-V158 humano y FcyRIV murino, se realiza el acoplamiento directo de alrededor de 6.500 unidades de resonancia (UR) del anticuerpo anti-Penta His (Qiagen) en un chip CM5 a pH 5,0 usando kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). Se capturan HuFcYRIIIa-V158-K6H6 y muFcYRIV-aviHis-biotina durante 60 s a 4 y 10 nM respectivamente.

Se pasan las construcciones con diferentes mutaciones de Fc a través de las celdas de flujo durante 120 s a una concentración de 1000 nM con un caudal de 30 pl/min. Se realiza el seguimiento de la disociación durante 220 s. Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia. Aquí, se pasan las variantes de Fc sobre una superficie con anticuerpo anti-Penta His inmovilizado pero en la que se ha inyectado HBS-EP en lugar de HuFcYRIIIa-V158-K6H6 o muFcYRIV-aviHis-biotina. Se determinó la afinidad por FcYRIIIa-V158 humano y FcyRIV murino para Fc natural usando un intervalo de concentración de 500 -4000 nM.

Se usó la respuesta en estado estacionario para derivar la constante de disociación Kd por ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Las constantes cinéticas se derivaron usando el programa informático de evaluación Biacore T100 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica.

Resultado

Se realizó el seguimiento de la interacción de variantes de Fc con FcYRIIIa humano y FcyRIV murino por resonancia de plasmón superficial. La unión a huFcYRIIIa-V158-K6H6 y muFcYRIV-aviHis-biotina capturados se reduce significativamente para todos los mutantes Fc analizados en comparación con la construcción con un dominio Fc natural (wt).

Los mutantes Fc con la menor unión al receptor de Fcy humano fueron P329G L234A L235A (LALA) y P329G LALA N297D. La mutación LALA sola no fue suficiente para anular la unión a huFcYRIIIa-V158-K6H6. La variante de Fc que lleva solo la mutación LALA tenía una afinidad de unión residual a FcYRIIIa humano de 2,100 nM, mientras que el Fc wt se unió al receptor de FcYRIIIa humano con una afinidad de 600 nM (tabla 3). Se derivaron ambos valores de Kd por el modelo de unión 1:1, usando una única concentración.

Solo se pudo analizar la afinidad por FcYRIIIa-V158 humano y FcyRIV murino para Fc wt. Los valores de Kd se enumeran en la tabla 3. La unión al FcyRIV murino se eliminó casi por completo para todos los mutantes Fc analizados.

TABLA 3. Afinidad de variantes de Fc por FcYRIIIa-V158 humano y FcyRIV murino.

* determinado usando una concentración (1000 nM)

Análisis de unión simultánea a antígeno tumoral y CD3

Se realizó el análisis de la unión simultánea de las construcciones biespecíficas de linfocitos T al antígeno tumoral y a CD3s humanos por acoplamiento directo de 1650 unidades de resonancia (UR) del dominio D3 biotinilado de MCSP en un chip sensor SA usando el procedimiento de acoplamiento estándar. Se inmovilizó EGFR humano usando un procedimiento de acoplamiento de amino estándar. Se inmovilizaron 8000 UR en un chip sensor CM5 a pH 5,5. La configuración del ensayo se muestra en la figura 16B.

Se capturaron diferentes construcciones biespecíficas de linfocitos T durante 60 s a 200 nM. Posteriormente se pasó CD3Y(G4S)5CD3s-AcTev-Fc(botón)-Avi/Fc(ojal) humano a una concentración de 2000 nM y un caudal de 40 pl/min durante 60 s. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia donde se pasó el CD3e recombinante sobre una superficie con dominio D3 inmovilizado de MCSP o EGFR sin construcciones biespecíficas de linfocitos T capturadas.

Resultado

Se analizó la unión simultánea tanto al antígeno tumoral como a CD3e humano por resonancia de plasmón superficial (figura 17, figura 18). Todas las construcciones se pudieron unir al antígeno tumoral y a CD3 simultáneamente. Para la mayoría de las construcciones, el nivel de unión (UR) después de la inyección de CD3e humano fue mayor que el nivel de unión logrado después de la inyección de la construcción sola, lo que refleja que tanto el antígeno tumoral como CD3e humano se unieron a la construcción.

Ejemplo 3

Unión de construcciones biespecíficas al respectivo antígeno diana en células

Se determinó la unión de las diferentes construcciones biespecíficas a CD3 en células Jurkat (ATCC n.° TIB-152), y el respectivo antígeno tumoral en células diana, por FACS. En resumen, se recogieron células, se contaron y se comprobaron para determinar su viabilidad. Se sembraron 0,15 - 0,2 millones de células por pocillo (en PBS que contenía BSA al 0,1 %; 90 pl) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con la concentración indicada de las construcciones biespecíficas y los correspondientes controles de IgG (10 pl) durante 30 min a 4 °C. Para una mejor comparación, se normalizaron todas las construcciones y controles de IgG a la misma molaridad. Después de la incubación, se centrifugaron las células (5 min, 350 x g), se lavaron con 150 pl de PBS que contenía BSA al 0,1 %, se resuspendieron y se incubaron durante otros 30 min a 4 °C con 12 pl/pocillo de un anticuerpo secundario conjugado con FITC o PE. Se detectaron las construcciones unidas usando FACSCantolI (programa informático FACS Diva). Se detectó la molécula "(scFv)2" usando un anticuerpo anti-His conjugado con FITC (Lucerna, n.° RHIS-45F-Z). Para todas las demás moléculas, se usó un fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC o PE anti-IgG humana de cabra, específico del fragmento Fcy (Jackson Immuno Research Fab n.° 109-096-098 / solución de trabajo 1:20, o n.° 109-116-170 / solución de trabajo 1:80, respectivamente). Se lavaron las células por adición de 120 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realizó una segunda etapa de lavado con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. A menos que se indique de otro modo, se fijaron las células con 100 pl/pocillo de tampón de fijación (BD n.° 554655) durante 15 min a 4 °C en la oscuridad, se centrifugaron durante 6 min a 400 x g y se mantuvieron en 200 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % hasta que se midieron las muestras con FACS CantoII. Se calcularon los valores de CE50 usando el programa informático GraphPad Prism. En un primer experimento, se analizaron diferentes construcciones biespecíficas dirigidas a MCSP humano y CD3 humano por citometría de flujo para determinar la unión a CD3 humano expresado en células de leucemia de linfocitos T humanos, Jurkat, o a MCSP humano en células de melanoma humano Colo-38.

Los resultados se presentan en la figura 19-21, que muestran la intensidad de fluorescencia media de las células que se incubaron con la molécula biespecífica, IgG de control, el anticuerpo secundario solo o se dejaron sin tratar.

Como se muestra en la figura 19, para ambos restos de unión a antígeno de la molécula "(scFv)2", es decir, CD3 (figura 191A) y MCSP (figura 19B), se observa una clara señal de unión en comparación con las muestras de control.

La molécula "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) muestra una buena unión a huMCSP en células Colo-38 (figura 20A). El resto de CD3 se une a CD3 ligeramente mejor que la IgG anti-CD3 humano de referencia (figura 20B).

Como se representa en la figura 21A, las dos construcciones "1 1" muestran señales de unión comparables a CD3 humano en células. La IgG anti-CD3 humano de referencia da una señal ligeramente más débil. Además, ambas construcciones sometidas a prueba ("1 1 IgG scFab, de un brazo" (SEQ ID NO 1,3, 5) y "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (SEQ ID NO 7, 9, 11)) muestran unión comparable a MCSP humano en células (figura 21B). La señal de unión obtenida con la IgG anti-MCSP humano de referencia es ligeramente más débil.

En otro experimento, se analizaron la construcción biespecífica "2+1 IgG scFab" purificada (SEQ ID NO 5, 17, 19) y la correspondiente IgG anti-MCSP humano por citometría de flujo para determinar la unión dependiente de la dosis a MCSP humano en células de melanoma humano Colo-38, para determinar si la construcción biespecífica se une a MCSP por medio de uno o ambos de sus "brazos". Como se representa en la figura 22, la construcción "2+1 IgG scFab" muestra el mismo patrón de unión que la IgG de MCSP.

Aún en otro experimento, se evaluó la unión de construcciones biespecíficas "2+1 IgG Crossfab, invertida" CD3/CEA con un intercambio VL/VH (véanse SEQ ID NO 33, 63, 65, 67) o bien CL/CH1 (véanse SEQ ID NO 66, 67, 183, 197) en el fragmento Crossfab para CD3 humano, expresado por células Jurkat, o a CEA humano, expresado por células LS-174T. Como control, también se evaluaron la concentración máxima equivalente de las correspondientes IgG y la tinción de fondo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC anti-IgG humana de cabra, específico del fragmento Fcy, Jackson ImmunoResearch Lab n.° 109-096-098). Como se ilustra en la figura 55, ambas construcciones muestran una buena unión al CEA humano, así como a CD3 humano en células. Los valores de CE50 calculados fueron 4,6 y 3,9 nM (CD3), y 9,3 y 6,7 nM (CEA) para las construcciones "2+1 IgG Crossfab, invertida (VL/VH)" y "2+1 IgG Crossfab, invertida (CL/CH1)", respectivamente.

En otro experimento, se evaluó la unión de las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 187) CD3/MCSP a c D3 humano, expresado por células Jurkat, o a MCSP humano, expresado por células WM266-4. La figura 56 muestra que, aunque la unión de ambas construcciones a MCSP en células fue buena de forma comparable, se redujo la unión de la construcción "invertida" a CD3 en comparación con la otra construcción. Los valores de CE50 calculados fueron 6,1 y 1,66 nM (CD3), y 0,57 y 0,95 nM (MCSP) para las construcciones "2+1 IgG Crossfab, invertida" y "2+1 IgG Crossfab", respectivamente.

En otro experimento, se determinó la unión de la construcción "fusión de cadena ligera (LC) 1+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 183, 209, 211,213) a CD3 humano, expresado por células Jurkat, y a CEA humano, expresado por células LS-174T. Como control, también se evaluaron la concentración máxima equivalente de las correspondientes IgG anti-CD3 y anti-CEA y la tinción de fondo debida al anticuerpo secundario marcado (fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con FITC anti-IgG humana de cabra, específico del fragmento Fcy, Jackson ImmunoResearch Lab n.° 109-096-098). Como se representa en la figura 57, parece que la unión de la "fusión de LC 1 1 IgG Crossfab" a CEA es muy reducida, mientras que la unión a CD3 fue al menos comparable a la IgG de referencia.

En un experimento final, se determinó la unión de las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 5, 23, 215, 217) y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (SEQ ID NO 5, 23, 215, 219) a CD3 humano, expresado por células Jurkat, y a MCSP humano, expresado por células tumorales WM266-4. Como se representa en la figura 58, la unión a CD3 humano se redujo para "2+1 IgG Crossfab, invertida" en comparación con la otra construcción, pero la unión a MCSP humano fue buena de forma comparable. Los valores de CE50 calculados fueron 10,3 y 32,0 nM (CD3) y 3,1 y 3,4 nM (MCSP) para la construcción "2+1 IgG Crossfab" y "2+1 IgG Crossfab, invertida", respectivamente.

Ejemplo 4

Análisis FACS de marcadores de activación superficial en linfocitos T humanos primarios tras el acoplamiento de construcciones biespecíficas

Se sometieron a prueba las moléculas "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) biespecífica dirigida a huMCSP-huCD3 purificada y "(scFv )2" por citometría de flujo para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación superficial temprana CD69, o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8+ en presencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

En resumen, se recogieron células Colo-38 positivas para MCSP con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobaron para determinar su viabilidad. Se ajustaron las células a 0,3 x 106 células (viables) por ml en medio AIM-V, se pipetearon 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 pl de la construcción biespecífica (diluida) a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 1 nM. Se aislaron células efectoras de PBMC humanos de sangre roja de un donante sano y se ajustaron a 6 x 106 células (viables) por ml en medio AIM-V. Se añadieron 50 pl de esta suspensión celular por pocilio de la placa de ensayo (véase anteriormente) para obtener una proporción E:T final de 10:1. Para analizar si las construcciones biespecíficas pueden activar linfocitos T exclusivamente en presencia de células diana que expresan el antígeno tumoral huMCSP, se incluyeron pocillos que contenían 1 nM de las respectivas moléculas biespecíficas, así como PBMC, pero no células diana.

Después de incubación durante 15 h (CD69), o 24 h (CD25) a 37 °C, CO2 al 5 %, se centrifugaron las células (5 min, 350 x g) y se lavó dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %. Se realizó la tinción superficial para CD8 (IgG1 de ratón, k; clon HIT8a; BD n.° 555635), CD69 (IgG1 de ratón; clon L78; BD n.° 340560) y CD25 (IgG1 de ratón, k; clon M-A251; BD n.° 555434) a 4 °C durante 30 min, de acuerdo con sugerencias del proveedor. Se lavaron las células dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y se fijaron durante 15 min a 4 °C, usando 100 pl/pocillo de tampón de fijación (BD n.° 554655). Después de la centrifugación, se resuspendieron las muestras en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron usando una máquina FACS Canto II (programa informático FACS Diva).

La figura 23 representa el nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 (A) o del marcador de activación tardía CD25 (B) en linfocitos T CD8+ después de 15 horas o 24 horas de incubación, respectivamente. Ambas construcciones inducen la regulación por incremento de ambos marcadores de activación exclusivamente en presencia de células diana. La molécula "(scFv)2" parece ser ligeramente más activa en este ensayo que la construcción "2+1 IgG scFab".

Se sometieron a prueba además las moléculas "2+1 IgG scFab" biespecífica dirigida a huMCSP-huCD3 purificada y "(scFv)2" por citometría de flujo para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T c D8+ o linfocitos T CD4+ en presencia de células tumorales que expresan MCSP humano. Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente, usando linfocitos efectores pan T humanos a una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de cinco días.

La figura 24 muestra que ambas construcciones inducen la regulación por incremento de CD25 exclusivamente en presencia de células diana tanto en linfocitos T CD8+ (A) como CD4+ (B). La construcción "2+1 IgG scFab" parece que induce menos regulación por incremento de CD25 en este ensayo, en comparación con la molécula "(scFv)2". En general, la regulación por incremento de CD25 es más pronunciada en linfocitos T CD8+ que en CD4+.

En otro experimento, se analizó "2+1 IgG Crossfab" purificada dirigida a CD3 de macaco cangrejero y MCSP humano (SEQ ID NO 3, 5, 35, 37) para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación superficial CD25 en linfocitos T CD8+ en presencia de células diana tumorales. En resumen, se recogieron células diana tumorales MV-3 que expresan MCSP humano con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en DMEM que contenía f Cs al 2 % y GlutaMax al 1 %. Se sembraron 30000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas (figura 25). Se ajustaron la construcción biespecífica y los diferentes controles de IgG a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras de PBMC de macaco cangrejero, aisladas de sangre de dos animales sanos, para obtener una proporción E:T final de 3:1. Después de una incubación durante 43 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se centrifugaron las células a 350 x g durante 5 min y se lavó dos veces con PBS, que contenía BSA al 0,1 %. Se realizó la tinción superficial para CD8 (Miltenyi Biotech n.° 130-080-601) y CD25 (BD n.° 557138) de acuerdo con las sugerencias del proveedor. Se lavaron las células dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 % y se fijaron durante 15 min a 4 °C, usando 100 pl/pocillo de tampón de fijación (BD n.° 554655). Después de la centrifugación, se resuspendieron las muestras en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron usando una máquina FACS Canto II (programa informático FACS Diva).

Como se representa en la figura 25, la construcción biespecífica induce la regulación por incremento dependiente de la concentración de CD25 en linfocitos T CD8+ solo en presencia de células diana. La IgG anti-CD3 cyno (clon FN-18) también puede inducir una regulación por incremento de CD25 en linfocitos T CD8+, sin estar reticulada (véanse los datos obtenidos con cynoNestor). No existe hiperactivación de los linfocitos T cyno con la concentración máxima de la construcción biespecífica (en ausencia de células diana).

En otro experimento, se comparó "2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179) CD3-MCSP con "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) CD3-MCSP para determinar su potencial para regular por incremento el marcador de activación temprana CD69 o el marcador de activación tardía CD25 en linfocitos T CD8+ en presencia de células diana tumorales. Se incubaron PBMC humanos primarios (aislados como se describe anteriormente) con las concentraciones indicadas de construcciones biespecíficas durante al menos 22 h en presencia o ausencia de células diana Colo38 positivas para MCSP. En resumen, se sembraron 0,3 millones de PBMC humanos primarios por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano, que contenía las células diana positivas para MCSP (o medio). La proporción de célula efectora con respecto a diana (E:T) final fue de 10:1. Se incubaron las células con la concentración indicada de las construcciones biespecíficas y los controles durante los tiempos de incubación indicados a 37 °C, CO2 al 5 %. Se tiñeron las células efectoras para determinar CD8 y CD69 o CD25 y se analizaron por FACS Canto II.

La figura 53 muestra el resultado de este experimento. No se detectaron diferencias significativas para la regulación por incremento de CD69 (A) o CD25 (B) entre las dos moléculas 2+1 IgG Crossfab (con o sin la cadena ligera unida).

Aún en otro experimento, se compararon las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ Id NO 5, 29, 33, 181) CD3/MCSP con la construcción "1+1 CrossMab" (véanse s EQ ID NO 5, 23, 183, 185) para determinar su potencial para regular por incremento CD69 o CD25 en linfocitos T CD4+ o CD8+ en presencia de células diana tumorales. Se realizó el ensayo como se describe anteriormente, en presencia o ausencia de células tumorales MV-3 que expresan MCSP humano, con un tiempo de incubación de 24 h.

Como se muestra en la figura 59, las construcciones "1+1 IgG Crossfab" y "2+1 IgG Crossfab" indujeron una regulación por incremento más pronunciada de los marcadores de activación que la molécula "1 1 CrossMab".

En un experimento final, se evaluaron las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 217) y "2+1 IgG Crossfab, invertida" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 215, 219) CD3/MCSP para determinar su potencial para regular por incremento CD25 en linfocitos T CD4+ o CD8+ de dos macacos cangrejeros diferentes en presencia de células diana tumorales. Se realizó el ensayo como se describe anteriormente, en presencia o ausencia de células tumorales MV-3 que expresan MCSP humano, con una proporción E:T de 3:1 y un tiempo de incubación de aproximadamente 41 h.

Como se muestra en la figura 60, ambas construcciones pudieron regular por incremento CD25 en linfocitos T CD4+ y CD8+ de manera dependiente de la concentración, sin diferencias significativas entre los dos formatos. Las muestras de control sin anticuerpo y sin células diana dieron una señal comparable a las muestras con anticuerpo pero sin dianas (no mostrado).

Ejemplo 5

Secreción de interferón-Y tras la activación de linfocitos pan T humanos con construcciones biespecíficas de CD3

Se analizó "2+1 IgG scFab" purificada dirigida a MCSP y CD3 humano (SEQ ID NO 5, 17, 19) para determinar su potencial para inducir la activación de linfocitos T en presencia de células U-87MG positivas para MCSP humano, medido por la liberación de interferón humano (IFN)-y en el sobrenadante. Como controles, se usaron IgG anti-MCSP humano y anti-CD3 humano, ajustadas a la misma molaridad. En resumen, se recogieron células diana de astrocitoma de glioblastoma U-87MG que expresan huMCSP (ECACC 89081402) con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.° 12055-091). Se sembraron 20 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de anticuerpo para obtener una concentración final de 1 nM. Se añadieron linfocitos efectores pan T humanos, aislados de la capa leucoplaquetaria, para obtener una proporción E:T final de 5:1. Después de una incubación durante la noche de 18,5 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se centrifugó la placa de ensayo durante 5 min a 350 x g y se transfirió el sobrenadante a un placa de 96 pocillos recién preparada. Se midieron los niveles de IFN-y humano en el sobrenadante por ELISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit BD OptEIA Human If N-y ELISA II de Becton Dickinson, n.° 550612).

Como se representa en la figura 26, las IgG de referencia muestran inducción nula a débil de la secreción de IFN-y, mientras que la construcción "2+1 IgG scFab" puede activar linfocitos T humanos para secretar IFN-y.

Ejemplo 6

Citotoxicidad de linfocitos T redirigida mediada por construcciones biespecíficas reticuladas dirigidas a CD3 en linfocitos T y MCSP o EGFR en células tumorales (ensayo de liberación de LDH)

En una primera serie de experimentos, se analizaron construcciones biespecíficas dirigidas a CD3 y MCSP para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales tras la reticulación de la construcción por medio de la unión de los restos de unión a antígeno a sus respectivos antígenos diana en células (figuras 27-38).

En un experimento, se compararon las construcciones "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 21, 23) y "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) purificadas dirigidas a CD3 humano y MCSP humano, y la correspondiente molécula "(scFv)2". En resumen, se recogieron células diana de melanoma humano MDA-MB-435 que expresan huMCSP con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.° 12055-091). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de la construcción a la concentración indicada. Todas las construcciones y las correspondientes IgG de control se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos efectores pan T humanos para obtener una proporción E:T final de 5:1. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 pg/ml de PHA-M (Sigma n.° L8902; mezcla de isolectinas aisladas de Phaseolus vulgaris). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación durante la noche de 20 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.° 11644 793001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la figura 27, ambas construcciones "2+1" inducen apoptosis en células diana comparable a la molécula "(scFv )2".

Además, se compararon las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "2+1 IgG scFab" purificadas que difieren en su dominio Fc, así como la molécula "(scFv)2". Las diferentes mutaciones en el dominio Fc (L234A+L235A (LALA), P329G y/o N297D, como se indica) reducen o suprimen la función de la célula efectora (NK) inducida por construcciones que contienen un dominio Fc natural (wt). Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente.

La figura 28 muestra que todas las construcciones inducen apoptosis en células diana comparable a la molécula "(scFv)2".

La figura 29 muestra el resultado de una comparación de "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2" para determinar su potencial para inducir la apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales. Los procedimientos experimentales fueron como se describe anteriormente, usando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1, y una incubación durante la noche de 18,5 h. Como se representa en la figura, la construcción "2+1 IgG scFab" muestra una actividad citotóxica comparable a la molécula "(scFv )2".

De forma similar, la figura 30 muestra el resultado de una comparación de la construcción "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2", usando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de 18 h. Como se representa en la figura, la construcción "2+1 IgG scFab" muestra una actividad citotóxica comparable a la molécula (scFv)2.

La figura 31 muestra el resultado de una comparación de la construcción "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2", usando células diana de melanoma humano MDA-MB-435 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y una incubación durante la noche de 23,5 h. Como se representa en la figura, la construcción induce apoptosis en las células diana de forma comparable a la molécula "(scFv)2". La construcción "2+1 IgG scFab" muestra una eficacia reducida a las mayores concentraciones.

Además, se analizaron diferentes construcciones biespecíficas que son monovalentes para ambas dianas, CD3 humano y MCSP humano, así como la correspondiente molécula "(scFv)2" para determinar su potencial para inducir la apoptosis mediada por linfocitos T. La figura 32 muestra los resultados para las construcciones "1+1 IgG scFab, de un brazo" (SEQ ID n O 1, 3, 5) y "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (SEQ ID NO 7, 9, 11), usando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1 y un tiempo de incubación de 19 h. Como se representa en la figura, ambas construcciones "1 1" son menos activas que la molécula "(scFv)2", siendo la molécula "1 1 IgG scFab, de un brazo" superior a la molécula "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" en este ensayo.

La figura 33 muestra los resultados para la construcción "1 1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 21, 213), usando células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP en una proporción E:T de 5:1, y un tiempo de incubación de 20 h. Como se representa en la figura, la construcción "1 1 IgG scFab" es menos citotóxica que la molécula "(scFv)2".

En otro experimento, se analizaron "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), "1 1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 5, 29, 31, 33) purificadas y la molécula "(scFv)2" para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales tras la reticulación de la construcción por medio de la unión de ambos antígenos diana, CD3 y MCSP, en células. Se usaron células de melanoma humano MDA-MB-435 que expresan huMCSP como células diana, la proporción E:T fue de 5:1 y el tiempo de incubación de 20 h. Los resultados se muestran en la figura 34. La construcción "2+1 IgG Crossfab" induce apoptosis en células diana de forma comparable a la molécula "(scFv)2". La comparación de los formatos "IgG Crossfab" mono y bivalente muestra claramente que el bivalente es mucho más potente.

Aún en otro experimento, se analizó la construcción "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) purificada para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en diferentes células diana (tumorales). En resumen, se recogieron células diana tumorales Colo-38 positivas para MCSP, células madre mesenquimales (derivadas de médula ósea, Lonza n.° PT-2501 o tejido adiposo, Invitrogen n.° R7788-115) o pericitos (de placenta; PromoCell n.° C-12980), como se indica, con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.° 12055-091). Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas. Se añadieron células efectoras de PBMC humanos aisladas de sangre roja de un donante sano para obtener una proporción E:T final de 25:1. Después de una incubación de 4 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la figura 35, solo se pudo observar citotoxicidad mediada por linfocitos T significativa con células Colo-38. Este resultado está en línea con las células Colo-38 que expresan niveles significativos de MCSP, mientras que las células madre mesenquimales y los pericitos expresan MCSP solo de forma muy débil.

También se compararon la construcción "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2" con un anticuerpo IgG anti-MCSP humano glucomanipulado, que tiene una proporción reducida de N-glucanos fucosilados en su dominio Fc (MCSP GlycoMab). Para este experimento se usaron células diana de melanoma humano Colo-38 que expresan huMCSP y células efectoras de PBMC humanos, en una proporción E:T fija de 25:1 (figura 36A) o bien en diferentes proporciones E:T de 20:1 a 1:10 (figura 36B). Se usaron las diferentes moléculas en las concentraciones indicadas en la figura 36A, o en una concentración fija de 1667 pM (figura 36B). Se realizó la lectura después de 21 h de incubación. Como se representa en la figura 36 A y B, ambas construcciones biespecíficas muestran una mayor potencia que MSCP GlycoMab.

En otro experimento, se analizó "2+1 IgG Crossfab" purificada dirigida a CD3 de macaco cangrejero y MCSP humano (SEQ ID NO 3, 5, 35, 37). En resumen, se recogieron células diana tumorales MV-3 que expresan MCSP humano con tampón de disociación celular, se lavaron y se resuspendieron en DMEM que contenía FCS al 2 % y GlutaMax al 1 %. Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de la construcción o la IgG de referencia a las concentraciones indicadas. Se ajustaron la construcción biespecífica y los diferentes controles de IgG a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras de PBMC de macaco cangrejero, aisladas de sangre de macacos cangrejeros sanos, para obtener una proporción E:T final de 3:1. Después de una incubación durante 24 h o 43 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la figura 37, la construcción biespecífica induce la liberación de LDH dependiente de la concentración de células diana. El efecto es más fuerte después de 43 h que después de 24 h. La IgG anti-CD3 cyno (clon FN-18) también puede inducir la liberación de LDH de las células diana sin estar reticulada.

La figura 38 muestra el resultado de una comparación de la construcción "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) purificada y "(scFv)2", usando la línea celular de melanoma humano que expresa MCSP (MV-3) como células diana y PBMC humanos como células efectoras con una proporción E:T de 10:1 y un tiempo de incubación de 26 h. Como se representa en la figura, la construcción "2+1 IgG Crossfab" es más potente en términos de CE50 que la molécula "(scFv)2".

En una segunda serie de experimentos, se analizaron construcciones biespecíficas dirigidas a CD3 y EGFR para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células diana tumorales tras la reticulación de la construcción por medio de la unión de los restos de unión a antígeno a sus respectivos antígenos diana en células (figuras 39-41).

En un experimento, se compararon las construcciones "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 45, 47, 53) y "1 1 IgG scFab" (SEQ ID NO 47, 53, 213) purificadas dirigidas a CD3 y EGFR, y la correspondiente molécula "(scFv)2". En resumen, se recogieron células diana tumorales LS-174T que expresan EGFR humano con tripsina, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.° 12055-091). Se sembraron 30000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadió la respectiva dilución de anticuerpo a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos efectores pan T humanos para obtener una proporción E:T final de 5:1. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 1 pg/ml de p HA-M (Sigma n.° L8902). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación durante la noche de 18 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la figura 39, la construcción "2+1 IgG scFab" muestra una actividad citotóxica comparable a la molécula "(scFv )2", mientras que la construcción "1 1 IgG scFab" es menos activa.

En otro experimento, se compararon "1+1 IgG scFab, de un brazo" (SEQ ID NO 43, 45, 47), "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (SEQ ID NO 11,49, 51), "1 1 IgG scFab" (SEQ ID n O 47, 53, 213) purificadas y la molécula "(scFv)2". Las condiciones experimentales fueron como se describe anteriormente, excepto por el tiempo de incubación que fue de 21 h.

Como se representa en la figura 40, la construcción "1 1 IgG scFab" muestra una actividad citotóxica ligeramente menor que la molécula "(scFv)2" en este ensayo. Ambas construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo (invertida)" son claramente menos activas que la molécula "(scFv)2".

Aún en otro experimento, se compararon las construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo" (SEQ ID NO 43, 45, 47) y "1 1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (SEQ ID NO 11, 49, 51) purificadas y la molécula "(scFv)2". El tiempo de incubación en este experimento fue de 16 h, y el resultado se representa en la figura 41. Incubadas con linfocitos pan T humanos, ambas construcciones "1 1 IgG scFab, de un brazo (invertida)" son menos activas que la molécula "(scFv)2", pero muestran una liberación de LDH dependiente de la concentración de las células diana (figura 41A). Tras el cocultivo de las células tumorales LS-174T con linfocitos T indiferenciados aislados de PBMC, las construcciones tuvieron solo una actividad basal, siendo la más activa de ellas la molécula "(scFv)2" (figura 41B).

En otro experimento, se analizaron "1+1 IgG scFab, de un brazo, invertida" (SEQ ID NO 11, 51, 55), "1 1 IgG scFab" (57, 61, 213) y "2+1 IgG scFab" (57, 59, 61) purificadas dirigidas a CD3 y proteína de activación de fibroblastos (FAP) y la correspondiente molécula "(scFv)2" para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por linfocitos T en células fibroblastos GM05389 que expresan FAP humanas tras reticulación de la construcción por medio de la unión de ambos restos diana a sus respectivos antígenos diana en las células. En resumen, se recogieron células diana GM05389 humanas con tripsina el día antes, se lavaron y se resuspendieron en medio AIM-V (Invitrogen n.° 12055-091). Se sembraron 30000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 % para permitir que las células se recuperen y se adhieran. Al día siguiente se centrifugaron las células, se desechó el sobrenadante y se añadió medio recién preparado, así como la respectiva dilución de las construcciones o IgG de referencia a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron linfocitos efectores pan T humanos para obtener una proporción E:T final de 5:1. Como control positivo para la activación de linfocitos pan T humanos, se usó 5 pg/ml de PHA-M (Sigma n.° L8902). Para la normalización, se determinó la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras, pero sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de una incubación durante la noche adicional de 18 h a 37 °C, CO2 al 5 %, se midió la liberación de LDH de células diana apoptóticas/necróticas en el sobrenadante se midió con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Como se representa en la figura 42, la construcción "2+1 IgG scFab" muestra una actividad citotóxica comparable a la molécula "(SCFV) 2" en términos de valores de CE50. La construcción "1+1 IgG scFab, de un brazo, invertida" es menos activa que las otras construcciones sometidas a prueba en este ensayo.

En otro conjunto de experimentos, se comparó "2+1 IgG Crossfab, cadena ligera unida" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 179) CD3/MCSP con "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) CD3/MCSP. En resumen, se recogieron células diana (células de melanoma Colo-38 humanas, WM266-4 o MV-3 o humanas) con tampón de disociación celular el día del ensayo (o con tripsina un día antes de que se iniciara el ensayo), se lavaron y se resuspendieron en el medio de cultivo celular apropiado (RPMI1640, incluyendo FCS al 2 % y Glutamax al 1 %). Se sembraron 20000 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se añadió la respectiva dilución de anticuerpo como se indica (triplicado). Se añadieron PBMC como células efectoras para obtener una proporción de células efectoras con respecto a diana (E:T) final de 10:1. Se ajustaron todas las construcciones y controles a la misma molaridad, el tiempo de incubación fue de 22 h. Se realizó la detección de la liberación de LDH y normalización como se describe anteriormente.

Las figuras 49 a 52 muestran el resultado de cuatro ensayos realizados con células de melanoma MV-3 (figura 49), células Colo-38 (figuras 50 y 51) o células WM266-4 (figura 52). Como se muestra en la figura 49, la construcción con la cadena ligera unida fue menos potente en comparación con la que no tenía la cadena ligera unida en el ensayo con células MV-3 como células diana. Como se muestra en la figura 50 y 51, la construcción con la cadena ligera unida fue más potente en comparación con la que no tenía la cadena ligera unida en los ensayos con células Colo-38 que expresan niveles altos de MCSP como células diana. Finalmente, como se muestra en la figura 52, no hubo diferencia significativa entre las dos construcciones cuando se usaron células WM266-4 que expresan niveles altos de MCSP como células diana.

En otro experimento, se compararon dos construcciones "2+1 IgG Crossfab, invertida" dirigidas a CEA, en las que en el fragmento Crossfab se intercambiaron las regiones V (VL/VH, véanse SEQ ID NO 33, 63, 65, 67) o bien las regiones C (CL/CH1, véanse SEQ ID NO 65, 67, 183, 197). Se realizó el ensayo como se describe anteriormente, usando PBMC humanos como células efectoras y células diana que expresan CEA humano. Se recogieron células diana (células tumorales MKN-45 o LS-174T) con tripsina-EDTA (LuBiosciences n.° 25300-096), se lavaron y se resuspendieron en RPMI1640 (Invitrogen n.° 42404042), incluyendo Glutamax al 1 % (LuBiosciences n.° 35050087) y FCS al 2 %. Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadieron las construcciones biespecíficas a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras de PBMC humanos para obtener una proporción E:T final de 10:1, el tiempo de incubación fue de 28 h. Se calcularon los valores de CE50 usando el programa informático GraphPad Prism 5.

Como se muestra en la figura 61, la construcción con el intercambio CL/CH1 muestra una actividad ligeramente mejor en ambas líneas celulares diana que la construcción con el intercambio VL/VH. Los valores calculados de CE50 fueron de 115 y 243 pM en células MKN-45 y de 673 y 955 pM en células LS-174T para la construcción con intercambio CL/CH1 y la construcción con intercambio VL/VH, respectivamente.

De forma similar, se compararon dos construcciones "2+1 IgG Crossfab" dirigidas a MCSP, en las que en el fragmento Crossfab se intercambiaron las regiones V (VL/VH, véanse SEQ ID NO: 33, 189, 191, 193) o bien las regiones C (CL/CH1, véanse SEQ ID NO: 183, 189, 193, 195). Se realizó el ensayo como se describe anteriormente, usando PBMC humanos como células efectoras y células diana que expresan MCSP humano. Se recogieron células diana (WM266-4) con tampón de disociación celular (LuBiosciences n.° 13151014), se lavaron y se resuspendieron en RPMI1640 (Invitrogen n.° 42404042), incluyendo Glutamax al 1 % (LuBiosciences n.° 35050087) y FCS al 2 %. Se sembraron 30 000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añadieron las construcciones a las concentraciones indicadas. Todas las construcciones y controles se ajustaron a la misma molaridad. Se añadieron células efectoras de PBMC humanos para obtener una proporción E:T final de 10:1, el tiempo de incubación fue de 26 h. Se calcularon los valores de CE50 usando el programa informático GraphPad Prism 5.

Como se representa en la figura 62, las dos construcciones muestran actividad comparable, teniendo la construcción con el intercambio CL/CH1 un valor de CE50 ligeramente menor (12,9 pM para la construcción con intercambio CL/CH1, en comparación con 16,8 pM para la construcción con intercambio VL/VH).

La figura 63 muestra el resultado de un ensayo similar, realizado con células diana MV-3 que expresan MCSP humano. De nuevo, ambas construcciones muestran actividad comparable, la construcción con el intercambio CL/CH1 tiene un valor de CE50 ligeramente menor (aproximadamente 11,7 pM para la construcción con intercambio CL/CH1, en comparación con aproximadamente 82,2 pM para la construcción con intercambio VL/VH). No se pudieron calcular los valores de CE50 exactos, puesto que las curvas de destrucción no alcanzaron una meseta a altas concentraciones de los compuestos.

En otro experimento, se compararon las construcciones "2+1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 3, 5, 29, 33) y "1 1 IgG Crossfab" (véanse SEQ ID NO 5, 29, 33, 181) CD3/MCSP con "1 1 CrossMab" (véanse SEQ ID NO 5, 23, 183, 185) CD3/MCSP. Se realizó el ensayo como se describe anteriormente, usando PBMC humanos como células efectoras y células diana WM266-4 o MV-3 (proporción E:T = 10:1) y un tiempo de incubación de 21 h.

Como se muestra en la figura 64, la construcción "2+1 IgG Crossfab" es la molécula más potente en este ensayo, seguida de "1 1 IgG Crossfab" y "1 1 CrossMab". Esta clasificación es incluso más pronunciada con células MV-3, que expresan niveles medios de MCSP, en comparación con las células WM266-4 que expresan niveles altos de MCSP. Los valores de CE50 calculados en células MV-3 fueron 9,2, 40,9 y 88,4 pM, en células WM266-4 33,1, 28,4 y 53,9 pM, para "2+1 IgG Crossfab", "1 1 IgG Crossfab" y "1 1 CrossMab", respectivamente.

En otro experimento, se sometieron a prueba diferentes concentraciones de la construcción "fusión de LC 1 1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 183, 209, 211, 213), usando células diana tumorales MKN-45 o LS-174T y células efectoras de PBMC humanos en una proporción E:T de 10:1 y un tiempo de incubación de 28 horas. Como se muestra en la figura 65, la construcción "fusión de LC 1 1 IgG Crossfab" indujo apoptosis en células diana MKN-45 con una CE50 calculada de 213 pM, mientras que la CE50 calculada es de 1,56 nM con células LS-174T, mostrando la influencia de los diferentes niveles de expresión de antígenos tumorales sobre la potencia de las construcciones biespecíficas dentro de un determinado período de tiempo.

Aún en otro experimento, se comparó la construcción "fusión de LC 1 1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 183, 209, 211, 213) con una molécula "2+1 IgG Crossfab" no dirigida. Se usaron células tumorales MC38-huCEA y PBMC humanos (proporción E:T = 10:1) y un tiempo de incubación de 24 horas. Como se muestra en la figura 66, la construcción "fusión de LC 1+1 IgG Crossfab" indujo apoptosis de células diana de manera dependiente de la concentración, con un valor de CE50 calculado de aproximadamente 3,2 nM. Por el contrario, "2+1 IgG Crossfab" no dirigida mostró destrucción mediada por linfocitos T independiente de antígenos de células diana solo a la mayor concentración.

En un experimento final, se compararon "2+1 IgG Crossfab (V9)" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), "2+1 IgG Crossfab, invertida (V9)" (SEQ ID NO 5, 23, 183, 187), "2+1 IgG Crossfab (anti-CD3)" (SEQ ID NO 5, 23, 215, 217), "2+1 IgG Crossfab, invertida (anti-CD3)" (SEQ ID NO 5, 23, 215, 219), usando células tumorales MV-3 o WM266-4 positivas para MCSP humano y PBMC humanos (proporción E:T = 10:1), y un tiempo de incubación de aproximadamente 24 horas. Como se representa en la figura 67, la destrucción mediada por linfocitos T de las construcciones "2+1 IgG Crossfab, invertida" parece ser ligeramente más fuerte o al menos igual a la inducida por las construcciones "2+1 IgG Crossfab" para ambos enlazadores de CD3. Los valores de CE50 calculados fueron como sigue:

Ejemplo 7

Ensayo de CD107a/b

Se sometieron a prueba la construcción "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2", ambas dirigidas a MCSP humano y CD3 humana, por citometría de flujo para determinar su potencial para regular por incremento CD107a y niveles de perforina intracelular en presencia o ausencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

En resumen, el día uno, se sembraron 30000 células diana tumorales Colo-38 por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 % para dejar que se adhieran. Se aislaron linfocitos pan T humanos primarios el día 1 o el día 2 de la capa leucoplaquetaria, como se describe.

El día dos, se añadieron 0,15 millones de células efectoras por pocillo para obtener una proporción E:T final de 5:1. Se añaden anticuerpos CD107a/b conjugados con FITC, así como las diferentes construcciones biespecíficas y controles. Se ajustaron las diferentes moléculas biespecíficas y anticuerpos a las mismas molaridades para obtener una concentración final de 9,43 nM. Después de una etapa de incubación de 1 h a 37 °C, se añadió CO2 al 5 %, monensina para inhibir la secreción, pero también para neutralizar el pH dentro de endosomas y lisosomas. Después de un tiempo de incubación adicional de 5 h, se tiñeron las células a 4 °C durante 30 min para la expresión de CD8 en superficie. Se lavaron las células con tampón de tinción (PBS/BSA al 0,1 %), se fijaron y se permeabilizaron durante 20 min usando el kit BD Cytofix/Cytoperm Plus con BD Golgi Stop (BD Biosciences n.° 554715). Se lavaron las células dos veces usando 1 x tampón b D Perm/Wash, y se realizó tinción intracelular para perforina a 4 °C durante 30 min. Después de una etapa de lavado final con 1 x BD Perm/tampón de lavado, se resuspendieron las células en PBS/BSA al 0,1 % y se analizaron en FACS CantolI (todos los anticuerpos se adquirieron de BD Biosciences o BioLegend).

Se establecieron ventanas en todas las células positivas para CD107a/b, positivas para perforina o positivas dobles, como se indica (figura 43). La construcción "2+1 IgG scFab" pudo activar linfocitos T y regular por incremento CD107a/b y los niveles de perforina intracelular solo en presencia de células diana (figura 43 A), mientras que la molécula "(scFv)2" muestra inducción (débil) de activación de linfocitos T también en ausencia de células diana (figura 43B). La IgG anti-CD3 de referencia bivalente da como resultado un nivel menor de activación en comparación con la molécula "(scFv)2" o la otra construcción biespecífica.

Ejemplo 8

Ensayo de proliferación

Se sometieron a prueba las moléculas "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y "(scFv)2", ambas dirigidas a CD3 humano y MCSP humano, por citometría de flujo para determinar su potencial para inducir la proliferación de linfocitos T CD8+ o CD4+ en presencia y ausencia de células tumorales que expresan MCSP humano.

En resumen, se ajustaron linfocitos pan T humanos recién aislados a 1 millón de células por ml en PBS caliente y se tiñeron con CFSE 1 pM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se dobló el volumen de tinción por adición de medio RPMI1640, que contenía FCS al 10 % y GlutaMax al 1 %. Después de la incubación a temperatura ambiente durante otros 20 min, se lavaron las células tres veces con medio precalentado para retirar el CFSE restante. Se recogieron células Colo-38 positivas para MCSP con tampón de disociación celular, se contaron y se comprobaron para determinar su viabilidad. Se ajustaron las células a 0,2 x 106 células (viables) por ml en medio AIM-V, se pipetearon 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (como se indica). Se añadieron 50 pl de las construcciones biespecíficas (diluidas) a los pocillos que contenían células para obtener una concentración final de 1 nM. Se ajustaron linfocitos efectores pan T humanos teñidos con CFSE a 2 x 106 células (viables) por ml en medio AIM-V. Se añadieron 50 pl de esta suspensión celular por pocillo de la placa de ensayo (véase anteriormente) para obtener una proporción E:T final de 5:1. Para analizar si las construcciones biespecíficas pueden activar linfocitos T solo en presencia de células diana que expresan el antígeno tumoral huMCSP, se incluyeron pocillos que contenían 1 nM de las respectivas moléculas biespecíficas, así como PBMC, pero no células diana. Después de incubación durante cinco días a 37 °C, CO2 al 5 %, se centrifugaron las células (5 min, 350 x g) y se lavó dos veces con 150 pl/pocillo de PBS incluyendo BSA al 0,1 %. Se realizó la tinción superficial para CD8 (IgG1 de ratón, k; clon HIT8a; BD n.° 555635), CD4 (IgG1 de ratón; k; clon RPA-T4; BD n.° 560649) o CD25 (IgG1 de ratón, k; clon M-A251; BD n.° 555434) a 4 °C durante 30 min, de acuerdo con sugerencias del proveedor. Se lavaron las células dos veces con 150 pl/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,1 %, se resuspendieron en 200 pl/pocillo de PBS con BSA al 0,1 % y se analizaron usando una máquina FACS CantoII (programa informático FACS Diva). El nivel de proliferación relativo se determinó estableciendo una ventana alrededor de las células no proliferativas y usando el número de células de esta ventana en relación con el número de células medido global como referencia.

La figura 44 muestra que todas las construcciones inducen la proliferación de linfocitos T CD8+ (A) o linfocitos T CD4+ (B) solo en presencia de células diana, de forma comparable a la molécula "(scFv)2". En general, los linfocitos T CD8+ activados proliferan más que los linfocitos T CD4+ activados en este ensayo.

Ejemplo 9

Ensayo de liberación de citocinas

Se analizaron la construcción "2+1 IgG scFab" (SEQ ID NO 5, 17, 19) purificada y la molécula "(scFv)2", ambas dirigidas a MCSP humano y CD3 humano, para determinar su capacidad para inducir secreción de novo mediada por linfocitos T de citocinas en presencia o ausencia de células diana tumorales.

En resumen, se aislaron PBMC humanos de las capas leucoplaquetarias y se sembraron 0,3 millones de células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron células diana tumorales Colo-38, que expresan MCSP humano, para obtener una proporción E:T final de 10:1. Se añadieron construcciones biespecíficas y controles de IgG a una concentración final 1 nM y se incubaron las células durante 24 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Al día siguiente, se centrifugaron las células durante 5 min a 350 x g y se transfirió el sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos profundos para el análisis posterior. Se realizó el análisis CBA de acuerdo con las instrucciones del fabricante para FACS CantolI, usando el kit Human Th1/Th2 Cytokine II (BD n.° 551809).

La figura 45 muestra los niveles de las diferentes citocinas medidas en el sobrenadante. En presencia de células diana, la principal citocina secretada tras la activación de linfocitos T es IFN-y. La molécula "(scFv)2" induce un nivel ligeramente mayor de IFN-y que la construcción "2+1 IgG scFab". Se podría encontrar la misma tendencia para TNF humano, pero los niveles globales de esta citocina fueron mucho menores en comparación con IFN-y. No existió secreción significativa de citocinas Th2 (IL-10 e IL-4) tras la activación de linfocitos T en presencia (o ausencia) de células diana. En ausencia de células diana Colo-38, solo se observó una inducción muy débil de secreción de TNF, que fue la mayor en las muestras tratadas con la molécula "(scFv)2".

En un segundo experimento, se analizaron las siguientes construcciones biespecíficas purificadas dirigidas a MCSP humano y CD3 humano: la construcción "2+1 IgG Crossfab" (SEQ ID NO 3, 5, 29, 33), la molécula "(scFv )2", así como diferentes moléculas "2+1 IgG scFab" que comprenden un dominio Fc natural o bien mutado (LALA, P329G y/o N297D, como se indica). En resumen, se sembraron 280 pl de sangre completa de un donante sano por pocilio de una placa de 96 pocillos profundos. Se añadieron 30000 células diana tumorales Colo-38, que expresan MCSP humano, así como las diferentes construcciones biespecíficas y los controles de IgG a una concentración final de 1 nM. Se incubaron las células durante 24 h a 37 °C, CO2 al 5 % y a continuación se centrifugó durante 5 min a 350 x g. Se transfirió el sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos profundos para el análisis posterior. Se realizó el análisis CBA de acuerdo con las instrucciones del fabricante para FACS Canto II, usando la combinación de los siguientes equipos CBA Flex Sets: granzima B humana (BD n.° 560304), Flex Set IFN-y humano (BD n.° 558269), Flex Set TNF humano (BD n.° 558273), Flex Set IL-10 humana (BD n.° 558274), Flex Set IL-6 humana (BD n.° 558276), Flex Set IL-4 humana (BD n.° 558272), Flex Set IL-2 humana (BD n.° 558270).

La figura 46 muestra los niveles de las diferentes citocinas medidas en el sobrenadante. La principal citocina secretada en presencia de células tumorales Colo-38 fue IL-6, seguida de IFN-y. Además, también los niveles de granzima B incrementaron fuertemente tras la activación de linfocitos T en presencia de células diana. En general, la molécula "(scFv)2" indujo niveles mayores de secreción de citocinas en presencia de células diana (figura 46, A y B). No existió secreción significativa de citocinas Th2 (IL-10 e IL-4) tras la activación de linfocitos T en presencia (o ausencia) de células diana.

En este ensayo, existió una secreción débil de IFN-y, inducida por diferentes construcciones "2+1 IgG scFab", incluso en ausencia de células diana (figura 46, C y D). En estas condiciones, no se pudieron observar diferencias significativas entre las construcciones "2+1 IgG scFab" con un dominio Fc natural o mutado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T que comprende un primer y un segundo resto de unión a antígeno, de los que uno es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD3 y el otro es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidades que se pueden asociar de forma estable;

en la que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variable o constante de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab; y

en la que (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

2. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, que consiste esencialmente en el primer y el segundo resto de unión a antígeno, el dominio Fc y opcionalmente uno o más péptidos conectores.

3. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 1, que comprende un tercer resto de unión a antígeno que es una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana.

4. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 3, en la que (i) el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, o (ii) el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno.

5. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, específicamente de IgG1 o IgG4.

6. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana.

7. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.

8. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 7, en la que (a) en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable; o (b) en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc, uno o más residuos aminoacídicos se reemplazan por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.

9. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V), y opcionalmente en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A);

y en la que opcionalmente en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeración EU).

10. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular un receptor de Fcy, y/o función efectora, en particular citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCc ).

11. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de la reivindicación 10, en la que dicha una o más sustituciones aminoacídicas están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeración EU).

12. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU).

13. Un polinucleótido o pluralidad de polinucleótidos aislados que codifican la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Una célula huésped que comprende el/los polinucleótido(s) aislado(s) de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T y b) recuperar la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T.

16. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 16 para su uso como medicamento.

18. La molécula de unión a antígeno biespecífica activadora de linfocitos T de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento de cáncer.