ES2839973T3

ES2839973T3 - Método para el enriquecimiento del ADN del tumor circulante

Info

Publication number: ES2839973T3
Application number: ES15790214T
Authority: ES
Inventors: Jacob Vincent Micallef; Marielle Herzog; Mark Edward Eccleston
Original assignee: Belgian Volition SPRL
Current assignee: Belgian Volition SPRL
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: DK3213084T4; CN111505305A; CN111505305B; IL251896A0; CA2965752C; SG11201702978VA; US20220334128A1; JP6721599B2; EP3213084A1; JP2017534300A; AU2015340378B2; EP3213084B2; PL3213084T3; SG10201903822XA; AU2015340378A1; EP3213084B1; NZ731116A; CN107209190B; CN107209190A; EP3809140A1

Abstract

Uso de un agente ligante de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t para detectar, aislar y/o purificar nucleosomas libres de células de origen tumoral o ADN tumoral circulante (ADNct) de una muestra biológica.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el enriquecimiento del ADN del tumor circulante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un método para la purificación o enriquecimiento de nucleosomas libres de células circulantes de origen tumoral y ADN tumoral asociado de sangre, suero o plasma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ADN celular existe como un complejo de proteína-ácido nucleico llamado cromatina. El nucleosoma es la unidad básica de la estructura de la cromatina y consiste en ADN bicatenario (ADNds) enrollado alrededor de un complejo proteico. El ADN se enrolla alrededor de nucleosomas consecutivos en una estructura que a menudo se dice que se asemeja a un "collar de perlas" y esto forma la estructura básica de la cromatina abierta o eucromatina. En la cromatina compactada o heterocromatina, este collar está enrollado y superenrollado en una estructura cerrada y compleja.

Cada nucleosoma en la cromatina consiste en un complejo proteico de ocho histonas centrales altamente conservadas (que comprende un par de cada una de las histonas H2A, H2B, H3, y H4). Alrededor de este complejo se enrollan aproximadamente 146 pares de bases (pb) de ADN. Se informa que los nucleosomas libres de células comprenden ADN de 160-200 pb, lo que puede deberse a la presencia de ADN enlazador adicional. Otra histona, H1 o H5, actúa como un conector y está implicada en la compactación de cromatina.

El recambio celular normal en adultos humanos implica la creación por división celular de unas 1011 células diariamente y la muerte de un número similar, principalmente por apoptosis. Durante el proceso de apoptosis, la cromatina se degrada en mononucleosomas y oligonucleosomas, algunos de los cuales pueden encontrarse en la circulación. En condiciones normales, se reporta que el nivel de nucleosomas circulantes encontrado en sujetos sanos es bajo. Se encuentran niveles elevados en sujetos con una variedad de afecciones, incluyendo muchos cánceres, enfermedades autoinmunes, afecciones inflamatorias, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio (Holdenrieder & Stieber, 2009).

Las anomalías del ADN son características de todas las enfermedades cancerosas. El ADN de las células cancerosas difiere del de las células sanas de muchas maneras, incluyendo, pero no limitado a, mutaciones puntuales, translocaciones, número de copias de genes, anomalías en microsatélites, integridad de la cadena de ADN y modificaciones de nucleótidos (por ejemplo, metilación de citosina en la posición 5). Estas alteraciones asociadas a tumores en la estructura o secuencia del ADN se investigan de forma rutinaria en células cancerosas o tejido extraído en una biopsia o cirugía con fines de diagnóstico clínico, pronóstico y tratamiento. Las características genéticas y epigenéticas de los tumores varían entre diferentes tipos de tumores y entre diferentes pacientes con la misma enfermedad tumoral. Además, estas características varían a lo largo del tiempo dentro del mismo cáncer del mismo paciente con la progresión de la enfermedad y en el desarrollo de resistencias adquiridas a fármacos u otras terapias. Por lo tanto, la investigación en serie del ADN tumoral en las células extraídas mediante cirugía o biopsia puede ayudar al médico a monitorizar la progresión de la enfermedad y detectar cualquier recidiva o resistencia al tratamiento adquirida en un estadio temprano (posiblemente muchos meses antes de la detección radiológica) y permitir cambios potencialmente exitosos en el curso del tratamiento.

Sin embargo, los ensayos de ADN de tejidos tienen limitaciones, ya que los procedimientos de biopsia invasiva no se pueden realizar repetidamente en pacientes con fines de monitorización. Para algunos pacientes, es posible que la biopsia no se utilice en absoluto. La biopsia es cara de realizar, incómoda para el paciente, presenta un riesgo para el paciente y puede provocar complicaciones quirúrgicas. Además, un tumor en un paciente puede consistir en múltiples clones tumorales localizados dentro de diferentes áreas del mismo tumor o dentro de diferentes metástasis (en cáncer metastásico), de las cuales no pueden tomarse siempre muestras en una biopsia. Por lo tanto, una investigación de ADN de biopsia de tejido proporciona una instantánea del tumor, tanto en el tiempo como en el espacio, entre diferentes clones tumorales localizados dentro de diferentes áreas de un tumor en un momento particular en el tiempo.

La sangre de los pacientes con cáncer contiene ADN tumoral circulante (ADNct) que se cree que se origina a partir de la liberación de fragmentos de cromatina o nucleosomas en la circulación a partir de células cancerosas moribundas o muertas. La investigación de muestras concordantes de sangre y tejido de pacientes con cáncer muestra que las mutaciones asociadas al cáncer, presentes en el tumor de un paciente (pero no en sus células sanas) también están presentes en el ADNct en muestras de sangre tomadas del mismo paciente (Newman et al, 2014). De manera similar, las secuencias de ADN que están metiladas diferencialmente (alteradas epigenéticamente por metilación de restos de citosina) en células cancerosas también pueden detectarse como secuencias metiladas en el ADNct en la circulación. Además, la proporción de ADN circulante libre de células (ADNcf) que está comprendido por ADNct está relacionada con la carga tumoral, por lo que la progresión de la enfermedad se puede monitorizar tanto cuantitativamente por la proporción de ADNct presente como cualitativamente por su composición genética y/o epigenética. El análisis del ADNct puede producir datos muy útiles y clínicamente precisos respecto al ADN que se origina a partir de todos o muchos clones diferentes dentro del tumor y que, por tanto, integra espacialmente los clones tumorales. Además, el muestreo repetido a lo largo del tiempo es una opción mucho más práctica y económica. El análisis del (ADNct) tiene el potencial de revolucionar la detección y la monitorización de tumores, así como la detección de recidiva y resistencia adquirida a fármacos en un estadio temprano para la selección de tratamientos para tumores mediante la investigación del ADN tumoral sin procedimientos invasivos de biopsia de tejido. Tales ensayos de ADNct se pueden usar para investigar todos los tipos de anomalías de ADN asociadas con cáncer (p. ej., mutaciones puntuales, estado de modificación nucleótida, translocaciones, número de copias de genes, anomalías de microsatélites e integridad de la cadena de ADN) y tendrían aplicabilidad para la evaluación rutinaria del cáncer, monitorización regular y más frecuente y chequeo regular de regímenes de tratamiento óptimos (Zhou et al, 2012).

La sangre, suero y plasma se pueden utilizar como un sustrato para ensayos de ADNct y se puede emplear cualquier método de análisis de ADN que incluye, sin limitación, secuenciación de ADN, análisis de secuenciación de ADN epigenético (p. ej., para secuencias que contienen 5-metilcitosina), PCR, BEAMing, NGS (dirigido o de genoma completo), PCR digital, PCR fría (co-amplificación a temperatura de desnaturalización menor-PCR), MAP (Pirofosforolisis Activada por MIDI), PARE (análisis personalizado de extremos reorganizados) y Espectrometría de Masas.

Como las anomalías del ADN son características de todas las enfermedades cancerosas y se ha observado ADNct para todas las enfermedades cancerosas en las que se ha investigado, los ensayos de ADNct tienen aplicabilidad en todas las enfermedades cancerosas. Los cánceres investigados incluyen, sin limitación, cáncer de vejiga, de mama, colorrectal, melanoma, de ovario, de próstata, de pulmón, de hígado, de endometrio, ovárico, linfoma, oral, leucemias, cabeza y cuello y osteosarcoma (Crowley et al, 2013; Zhou et al., 2012; Jung et al, 2010). La naturaleza de los ensayos de ADNct se ilustrará ahora mediante la descripción de tres enfoques de ejemplo (no limitativos).

El primer ejemplo implica la detección de una mutación de la secuencia génica asociada al cáncer en el ADNct. Los análisis de sangre que implican la detección de una sola mutación génica en el ADNct generalmente tienen una baja sensibilidad clínica. Hay dos razones para esto. En primer lugar, aunque todos los cánceres tienen mutaciones, la frecuencia de cualquier mutación particular en una enfermedad cancerosa particular suele ser baja. Por ejemplo, aunque las mutaciones en K-ras y p53 se consideran dos de las mutaciones cancerosas más frecuentes y se han estudiado en una amplia gama de cánceres, incluyendo los cánceres de vejiga, mama, colon, pulmón, hígado, páncreas, endometrio y ovario, se detectaron en el 23%-64% y el 17%-54% de las muestras de tejido canceroso, respectivamente. En segundo lugar, incluso si el tejido canceroso de un paciente contiene la mutación, el nivel o la concentración de ADNct mutado presente en la sangre del paciente puede ser bajo y difícil de detectar. Por ejemplo, las mutaciones en K-ras y p53 podrían detectarse en el ADNct del 0%-75% de los pacientes con tejido positivo para K-ras y p53. La suma de estos dos efectos significó que se detectaron mutaciones en K-ras o p53 en la sangre de menos del 40% de los pacientes con cáncer (Jung et al, 2010).

El segundo ejemplo implica la detección de múltiples mutaciones de secuencias génicas asociadas al cáncer en el ADNct. Aunque las mutaciones de cualquier gen en particular, tal como K-ras o p53, pueden estar presentes solo en una minoría de los cánceres, todos los cánceres contienen mutaciones, por lo que el estudio de un panel de mutaciones lo suficientemente grande debería, en principio, facilitar la detección de la mayoría o incluso de todos los tumores. Por tanto, una forma de aumentar la sensibilidad clínica de tales ensayos es analizar una amplia gama de mutaciones en muchos genes. Newman et al han adoptado este enfoque para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) e investigaron secuencias de 521 exones y 13 intrones de 139 genes mutados de forma recurrente. Las mutaciones estudiadas abarcaron múltiples clases de alteraciones genéticas asociadas al cáncer, incluyendo la variación de un solo nucleótido (SNV) y los genes de fusión. De esta manera, los autores informaron de la detección de más de 95% de tumores en estadio II-IV y 50% de tumores en estadio I con una especificidad del 96% en los análisis de sangre de ADNct (Newman et al, 2014).

El tercer ejemplo implica la detección de alteraciones epigenéticas asociadas al cáncer en secuencias de genes particulares en el ADNct. Este enfoque se puede aplicar a cualquier modificación de ADN o nucleótidos. Un excelente ejemplo de este enfoque es la detección de genes que están metilados diferencialmente en los restos de citosina en ciertos cánceres. Se ha investigado un gran número de genes con este propósito en una variedad de cánceres. Algunos de estos son SEPTIN-9, APC, DAPK, GSTP1, MGMT, p16, RASSF1A, T1G1, BRCA1, ERa, PRB, TMS1, MLH1, HLTF, CDKN2A, SOCS1, SOCS2, PAX5, PGR, PTGS2 y RARp2 investigados en cánceres de vejiga, de mama, colorrectal, melanoma, ovárico y próstata. Un ejemplo ilustrativo de este enfoque es la detección de SEPTIN-9 metilado en ADNct para la detección del cáncer colorrectal (CRC) que se informó que detectaba el 68% de los casos de CRC con una especificidad clínica del 89% (Grutzmann et al, 2008).

La fracción de ADNct derivada de tumores de ADNcf circula como pequeños fragmentos de ADN con una longitud media de aproximadamente 180 pares de bases (pb) que es el tamaño esperado para los fragmentos de ADN que circulan en la forma de mononucleosomas (Newman et al, 2014). Se cree que estos fragmentos de ADN de 180 pb comprenden ADN nucleosómico más algo de ADN enlazador. Se informa que los pacientes con cáncer tienen niveles más altos de ADNcf que los sujetos sanos. Los trabajadores en el campo han informado de intervalos de 0-100 ng/ml (media de 30 ng/ml) de ADNcf para sujetos sanos y 0-1.000 ng/ml (media de 180 ng/ml) de ADNcf para sujetos con cáncer (Schwarzenbach et al, 2011). El ADNcf circulante consiste en moléculas de ADN de diversos tamaños hasta 20.000 pares de bases de longitud (Zhou et al, 2012). De acuerdo con la hipótesis de que el ADNct circula predominantemente como mononucleosomas, los niveles medidos de nucleosomas libres de células en la circulación son, como los niveles de ADN, más altos en pacientes con cáncer que en sujetos sanos (Holdenrieder et al, 2001). Sin embargo, los niveles elevados de nucleosomas circulantes per se no se usan clínicamente como biomarcadores de cáncer, ya que los nucleosomas son un producto no específico de la muerte celular y se observan niveles elevados para muchas afecciones que implican una muerte celular elevada, incluyendo el trauma agudo (Holdenrieder y Stieber, 2009). Como un producto de la muerte celular, los niveles de nucleosomas circulantes pueden aumentar notablemente con el tratamiento con fármacos citotóxicos o radioterapia. Sin embargo, los nucleosomas también se aclaran de la circulación, por lo que los niveles pueden aumentar con el tratamiento y luego disminuir como se muestra en las figuras 1 y 2 reproducidas por Holdenrieder et al,2001.

Aunque el nivel de nucleosomas libres de células circulantes per se no se ha usado en la práctica clínica como un biomarcador sanguíneo en el cáncer, la composición epigenética de los nucleosomas libres de células circulantes en términos de su modificación de histonas, variante de histonas, modificación del ADN y contenido en aductos se ha investigado como biomarcadores sanguíneos en el cáncer ( documentos WO 2005/019826; WO 2013/030577; WO 2013/030579; WO 2013/084002 ).

El origen biológico del ADNcf no se comprende bien. La fragmentación de la cromatina para producir mononucleosomas y oligonucleosomas es una característica de la muerte celular apoptótica. Se cree que las células necróticas producen moléculas de ADN más grandes de miles de pares de bases de longitud, pero la fragmentación del ADN también puede ocurrir en algunos casos de necrosis. Además, las secuencias de repetición de ADN comunes (p. ej., secuencias ALU o LINE1) pueden liberarse como fragmentos de ADN de 200-400 pares de bases a partir de células que experimentan muerte celular no apoptótica o necrótica (Schwarzenbach et al, 2011). Las células también pueden secretar fragmentos de ADN como una forma de comunicación intercelular. Se cree que el origen del ADNct está relacionado con la muerte de las células cancerosas. Los fragmentos de ADN pueden liberarse como nucleosomas a partir de células tumorales necróticas y/o apoptóticas. Sin embargo, las células necróticas y apoptóticas suelen ser fagocitadas por macrófagos u otras células depuradoras y los macrófagos que han engullido células necróticas o apoptóticas pueden liberar ADN (Schwarzenbach et al, 2011).

Hay una variedad de métodos disponibles para extraer el ADNcf de sangre, suero o plasma y estos han sido comparados respecto al rendimiento del ADN extraído y a su eficiencia de extracción de fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Los métodos de extracción con fenol-cloroformo y yoduro de sodio proporcionan el mayor rendimiento y extraen pequeños fragmentos de ADN de menos de 200 pb de longitud. Se informa que otros métodos ensayados (incluyendo los métodos disponibles comercialmente) tienen rendimientos de extracción de ADN más bajos y no logran extraer pequeños fragmentos de ADN de menos de 200 pb de longitud (Fong et al, 2009).

La extracción de ADNcf de sangre, suero o plasma para el análisis del ADNct generalmente se realiza utilizando productos de extracción de ADN disponibles comercialmente. Tales métodos de extracción reivindican altas recuperaciones de ADN circulante (>50%) y se reivindica que algunos productos (por ejemplo, el kit de ácido nucleico circulante QIAamp producido por Qiagen) extraen fragmentos de ADN de pequeño tamaño. Los volúmenes de muestra típicos utilizados están en el rango de 1-5 mL de suero o plasma.

Actualmente, no existen ensayos basados en ADNct de uso rutinario con fines de oncología clínica debido a una serie de limitaciones. Una limitación metodológica importante es el requisito de un ADN de alta calidad. Los métodos de muestreo de ADNct actuales producen muestras de ADNct de mala calidad debido a la naturaleza de la muestra. La principal dificultad radica en la presencia de grandes cantidades de ADNcf no tumoral en la circulación, lo que complica cualquier análisis del ADNct. Las estimaciones de diferentes trabajadores varían, pero la fracción de ADNct presente en la circulación puede ser demasiado baja para ser detectada o superior al 50% de ADNcf. Sin embargo, para la mayoría de los pacientes con cáncer, la fracción de ADNct es una pequeña parte del ADNcf. Por ejemplo, estudios recientes informan que la fracción de ADNct aumenta con el tamaño del tumor en pacientes con cáncer de pulmón antes del tratamiento. El nivel más alto encontrado fue el 3,2% en un paciente con una gran carga tumoral, pero se encontró que la mayoría de los pacientes tenían fracciones de ADNct inferiores al 0,1% (Newman et al, 2014). Esto significa que, para muchas muestras de pacientes, se debe analizar un nivel muy bajo de ADNct en presencia de un nivel mucho más alto de ADN no derivado de tumores. Además, este ADN es del mismo sujeto y, por lo tanto, con una secuencia similar e interferirá en cualquier método para la cuantificación o análisis del ADNct.

Un problema similar ocurre para la medición de los nucleosomas libres de células circulantes y/o la composición epigenética de los nucleosomas circulantes como biomarcadores de cáncer porque los nucleosomas per se son un indicador no específico de la muerte celular y se liberan como parte del proceso normal de renovación celular del cuerpo, así como en afecciones asociadas con niveles elevados de muerte celular tales como enfermedades autoinmunes, ictus, sepsis, postraumatismo, quemaduras, infarto de miocardio, ictus cerebral, durante el rechazo del injerto después de un trasplante de órganos y después de un ejercicio intenso. Por tanto, los nucleosomas de origen tumoral circulan junto con otros nucleosomas no tumorales de diversos orígenes celulares y tisulares. Estos nucleosomas no tumorales interferirán en cualquier método de cuantificación o análisis epigenético de nucleosomas de origen tumoral.

El documento US2014107039 describe inhibidores de péptidos del Complejo Represivo Polycomb 2 (PRC2) y su uso para el tratamiento del cáncer y otras afecciones asociadas con la actividad aberrante de metiltransferasa de PRC2.

El documento US2013230858 métodos, procesos y aparatos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas en ácidos nucleicos fetales obtenidos de una muestra biológica de una mujer embarazada.

Jung et al. (2010) Molecular & Cellular Proteomics, 9: 838-850 describe investigaciones de espectrometría de masas cuantitativas en los efectos de la deficiencia Suz12 en H3.2 y H3.3 a partir de células madre embrionarias de ratón. De Raedt et al. (2014) Cancer Discovery, 4: 1114, describe que las subunidades PRC2 son supresores de tumores en tumores sólidos deficientes en NF1.

El documento WO2013075237 describe la relación entre las variaciones en la secuencia de aminoácidos de las proteínas histonas, incluida la H3.3, y los trastornos asociados a la proliferación. Describe métodos terapéuticos y de detección basados en esta relación.

Tachiwana et al. (2010) Life Science: Structural Biology, 18-19, describe la estructura cristalina de nucleosomas humanos que contienen una variante de histona específica de testículo, H3T.

Por tanto, existe una gran necesidad de un método para el enriquecimiento de nucleosomas circulantes y ADNct de origen tumoral a partir de muestras de sangre, suero o plasma.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t para detectar, aislar y/o purificar nucleosomas libres de células de origen tumoral o ADN circulante (ADNct) de una muestra biológica.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para aislar nucleosomas libres de células circulantes de origen tumoral a partir de una muestra biológica por purificación por afinidad en donde dicho método comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con una fracción aislada con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

(iii) analizar los nucleosomas aislados y/o el ADN asociado.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para aislar ADN tumoral purificado circulante (ADNct) de una muestra biológica, en donde dicho método comprende las etapas de:

(i) aislar nucleosomas circulantes libres de células que contienen histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t poniendo en contacto la muestra con un agente de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) extraer el ADN de la muestra de nucleosoma aislado en la etapa (i); y

(iii) analizar el ADN extraído.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de inmunoensayo que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra biológica con un agente de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) poner en contacto la muestra unida en la etapa (i) con un segundo agente de unión que se une a un epítopo epigenético de un nucleosoma;

(iii) detectar y/o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión a dicho epítopo; y

(iv) usar la presencia o el grado de tal unión como una medida de la presencia del epítopo en nucleosomas derivados de tumor en la muestra.

(i) poner en contacto una muestra biológica con un primer agente de unión que se une a un epítopo epigenético de un nucleosoma;

(ii) poner en contacto la muestra unida en la etapa (i) con un agente de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t; (iii) detectar y/o cuantificar la unión de dicho agente de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t a nucleosomas en la muestra; y

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de cáncer que comprende la etapa de detectar la variante de histona asociada a nucleosomas libres de células circulantes H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano o animal.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un kit que comprende un agente de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en un método descrito en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células per se en un paciente con cáncer de cabeza y cuello, tratado con 16 dosis diarias de radioterapia. Los niveles se midieron con un ELISA de nucleosoma comercial que emplea un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo de nucleosoma central (copiado de Holdenrieder et al; 2001)

Figura 2: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células per se en un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas, tratado con quimioterapia citotóxica el día 1. Los niveles se midieron durante más de 42 días con un ELISA de nucleosoma comercial empleando un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo de nucleosoma central (copiado de Holdenrieder et al, 2001)

Figura 3: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células per se y niveles circulantes de nucleosomas libres de células que contienen la variante de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en 6 pacientes con CCR antes de la cirugía y a las 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la cirugía. Los niveles de nucleosomas libres de células per se se midieron con un ELISA de nucleosoma comercial que emplea un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo nucleosómico central. Los niveles de nucleosomas circulantes libres de células que contienen variantes de histonas se midieron con un ensayo similar, pero empleando un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a las variantes de histona H3.1, H3.2 o H3t.

Figura 4: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células per se y niveles circulantes de nucleosomas libres de células que contienen la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t y 5-metilcitosina (5mc) en 6 pacientes con CCR antes de la cirugía y en 6 , 24, 48, 72 y 96 horas postoperatorias. Los niveles de nucleosomas libres de células per se se midieron con un ELISA de nucleosoma comercial que emplea un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo nucleosómico central. Se midieron los niveles de nucleosomas circulantes libres de células que contenían variantes de histona H3 y 5mc con un ensayo que empleaba un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t y un anticuerpo marcado dirigido a unirse a 5mc.

Figura 5: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células que contienen (i) tanto la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t como la modificación de histona H3K27Ac o (ii) ambas variantes de histona H3.1, H3.2 o H3t y 5-metilcitosina (5mc) en pacientes sanos y pacientes con CCR. La expresión de los niveles de nucleosomas circulantes libres de células que contienen la variante de la histona H3, así como la modificación de la histona H3K27Ac en relación con los que contienen 5mc, conduce a una discriminación mejorada entre las muestras de sangre tomadas de sujetos sanos y sujetos con CCR (iii).

Figura 6: Niveles circulantes de nucleosomas libres de células que contienen (i) tanto la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t como 5-metilcitosina o (ii) nucleosomas per se que contienen 5-metilcitosina (5mc) en pacientes recién diagnosticados de cáncer de próstata y sujetos de control sanos de edad similar. Los datos también se muestran como diagramas de caja para nucleosomas libres de células que contienen (iii) a, ambas variantes de histona H3.1, H3.2 o H3t y 5-metilcitosina o (iii) b, nucleosomas per se que contienen 5-metilcitosina ( 5mc) pacientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La estructura de los nucleosomas en términos de su composición de señales epigenéticas puede variar en las células cancerosas. El uso de anticuerpos u otros agentes de unión dirigidos a unirse a señales epigenéticas que son más comunes en las células cancerosas que en otras células puede ser selectivo para la unión de nucleosomas libres de células de origen tumoral en una muestra biológica tomada de un sujeto que contiene nucleosomas libres de células con una mezcla de orígenes celulares.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de unión de una histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t para detectar, aislar y/o purificar ADN tumoral circulante (ADNct) de una muestra biológica.

En una realización, los nucleosomas libres de origen tumoral células se aíslan y/o purifican.

El ADNct en muestras de pacientes a menudo está presente a concentraciones muy bajas o indetectables y además comprende sólo una pequeña proporción del ADNcf presente. El rendimiento clínico y la utilidad de los ensayos de cáncer basados en el análisis de ADNct mejorarían si se dispusiera de muestras de mejor calidad. De forma similar, los nucleosomas libres de células de origen tumoral circulan como parte de una mezcla de nucleosomas con una variedad de orígenes y comprenden solo una proporción de los nucleosomas libres de células presentes. Sorprendentemente, ahora mostramos que el enriquecimiento o aislamiento de nucleosomas de origen tumoral, junto con la fracción de ADNct asociada a nucleosomas de ADNcf, a partir de muestras de sangre, suero o plasma puede realizarse utilizando un método de aislamiento de purificación por afinidad.

Holdenrieder ha informado de que niveles circulantes de nucleosomas libres de células elevados son característicos de enfermedades tumorales malignas y benignas (Holdenrieder et al, 2001). Sin embargo, esto no es útil para la detección de cáncer, ya que los niveles de nucleosomas circulantes son un marcador no específico de muerte celular y están elevados en una amplia variedad de afecciones que incluyen enfermedades autoinmunes, accidente cerebrovascular, sepsis, postraumatismo, quemaduras, infarto de miocardio, infarto cerebral, durante el rechazo del injerto después de un trasplante de órganos y después de un ejercicio intenso (Holdenrider y Stieber, 2009). Holdenrieder midió los nucleosomas circulantes usando una técnica de ELISA en la que el primer anticuerpo inmovilizado empleado se dirigió a unirse a un epítopo central de nucleosoma común y el segundo anticuerpo marcado se dirigió a unirse a ADN bicatenario. Este método ELISA está diseñado para detectar todos los nucleosomas, o nucleosomas per se, completos con ADNds asociado independientemente de la estructura epigenética.

Los niveles de nucleosomas circulantes pueden aumentar notablemente 2-5 días después de un aumento repentino de la muerte celular como resultado de cualquier número de causas dispares que incluyen traumatismo, accidente cerebrovascular o tratamiento con fármacos citotóxicos o radioterapia. Los niveles caen después durante un período de 2-3 días como se muestra en las Figuras 1 y 2 (reproducido de Holdenrieder et al,2001). Este efecto se debe a la inducción de la muerte celular seguida por el aclaramiento de la circulación (Holdenrieder y Stieber, 2009).

Hemos realizado experimentos similares utilizando el mismo ELISA de nucleosoma disponible comercialmente, empleando el mismo anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo central de nucleosoma común y el mismo anticuerpo marcado dirigido a unirse a ADN bicatenario, utilizado por Holdenrieder et al, para detectar todos los nucleosomas independientemente del estado epigenético. En estos experimentos medimos los niveles de nucleosomas libres de células circulantes en 6 pacientes con CCR antes de la cirugía y a las 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la cirugía. De acuerdo con los hallazgos de Holdenrieder, se observó un aumento después de cirugía en el nivel de nucleosomas en todos los casos, como se muestra en la Figura 3. El momento detallado del aumento de los niveles de nucleosomas, así como el momento de cualquier caída posterior, varió entre pacientes.

Es evidente que los nucleosomas liberados en la circulación de pacientes sin enfermedad tumoral (incluyendo, por ejemplo, debido a un traumatismo quirúrgico) no pueden tener un origen tumoral. Estos nucleosomas contribuirán al ADNcf, pero no contendrán ADNct. También resultará claro para los expertos en la técnica que los nucleosomas liberados después de la cirugía en nuestros propios experimentos pueden tener un origen tumoral pero también pueden tener un origen no tumoral debido al trauma de la cirugía. La fracción de dicho ADNcf que tiene un origen tumoral (es decir, la fracción de ADNct) puede determinarse como la fracción alélica del ADNcf que contiene mutaciones asociadas al tumor. Hemos desarrollado un método mediante el cual los nucleosomas circulantes de origen tumoral que contienen ADNct pueden enriquecerse o aislarse de otros nucleosomas y ADNcf.

Volvimos a analizar las muestras tomadas de los 6 pacientes con CCR antes y después de la cirugía usando un segundo método ELISA. Este segundo método ELISA empleó el mismo anticuerpo marcado dirigido a unirse a ADN bicatenario que el método disponible comercialmente utilizado por Holdenrieder, pero empleó un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t. Los resultados muestran que la respuesta en el nivel de nucleosomas que contienen H3.1, H3.2 o H3t a la cirugía es diferente a la respuesta observada para los nucleosomas per se usando el ELISA empleando un anticuerpo dirigido a unirse a un epítopo central de nucleosoma común. . El nivel de nucleosomas circulantes que contienen estas variantes H3 tiene diferentes características de respuesta al nivel de nucleosomas circulantes (totales) per se, y se ve menos afectado por la cirugía (Figura 3).

En la bibliografía se ha descrito una variedad de nucleótidos modificados epigenéticamente y se sabe que en el cáncer están alterados patrones de modificación epigenética en el ADN y/o restos de nucleótidos de ADN. El mejor descrito de estos incluye la metilación de citosina en la posición 5. El ADN que contiene 5-metilcitosina se denomina a menudo ADN metilado. Desarrollamos y realizamos un tercer método ELISA en los mismos 6 pacientes con CCR. Este ELISA fue un método para la medición de nucleosomas que contienen ADN que incorpora restos de 5-metilcitosina como ejemplo de un ensayo para ADN que contiene un nucleótido modificado epigenéticamente como se describe en el documento WO 2013/030577 pero usando un anticuerpo anti-H3.1, H3.2 o H3t inmovilizado como anticuerpo de captura. Este tercer método ELISA por tanto detectó nucleosomas libres de células que contenían tanto la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t como restos de 5-metilcitosina y, por lo tanto, fue similar al segundo método ELISA descrito anteriormente, pero utilizó un anticuerpo marcado diferente (dirigido a unirse a 5-metilcitosina en lugar de ADNds). Los resultados para los 6 pacientes con CCR muestran que el nivel de 5-metilcitosina asociada al nucleosoma variante H3 es bajo y se ve menos influenciado por la cirugía que el nivel de nucleosomas circulantes (totales) per se (Figura 4).

Además, hemos usado este ensayo para medir la variante de histona concurrente H3.1, H3.2, o H3t con los niveles de ADN metilado 5-metilcitosina en nucleosomas circulantes en sujetos sanos y sujetos con CRC. El nivel de ADN metilado en sujetos con cáncer fue era menor que en sujetos sanos. Este hallazgo concuerda con el hallazgo de la literatura publicada de que el ADN está globalmente hipometilado en las células cancerosas. Se estima que la metilación del ADN en las células cancerosas se reduce en aproximadamente un 50% en comparación con el ADN de las células sanas (Guerrero-Preston et al,2007; Soares et al, 1999). Sin embargo, se informa que el aumento asociado con el cáncer en el nivel de nucleosomas circulantes es de un 970% de promedio (Holdenrieder et al,2001) y el aumento del ADNcf es de aproximadamente un 600% (Schwarzenbach et al,2011). Se podría esperar que el gran aumento en el ADNcf total condujera a un aumento general en los niveles absolutos de ADN metilado asociado a nucleosoma circulante, a pesar de la caída (menor) en la proporción de nucleosomas libres de células circulantes que contienen ADN metilado. Sin embargo, los resultados del presente ensayo que emplea un anticuerpo de captura para la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t muestran una disminución en el nivel absoluto de nucleosomas circulantes que contienen ADN metilado (y variante de histona H3) en pacientes con cáncer, lo que indica que gran parte del aumento observado asociado al cáncer en el ensayo de nucleosomas circulantes (totales) per se no es de origen de células tumorales. Además, hemos mostrado que este ensayo de 5-metilcitosina asociado al nucleosoma variante H3 es eficaz para la detección de cáncer en un análisis de sangre que indica que todos o una gran proporción de los nucleosomas libres de células identificados por él son de origen tumoral. En la Figura 5 se muestra un diagrama de caja que muestra los resultados de este ensayo para pacientes con cáncer y pacientes sanos.

También hemos desarrollado y realizado un cuarto método ELISA para la medición de nucleosomas libres de células circulantes que contienen la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t y la modificación de histona H3K27Ac (lisina 27 acetilada de histona H3). Esto es similar a los ensayos para nucleosomas que contienen una histona modificada epigenéticamente como se describe en la bibliografía (documento WO 2005/019826) pero emplearon un anticuerpo anti-H3.1, H3.2 o H3t inmovilizado como anticuerpo de captura. Este cuarto ELISA fue idéntico al tercer método ELISA descrito anteriormente, excepto que empleó un anticuerpo marcado diferente dirigido a unirse a H3K27Ac (en lugar de 5-metilcitosina). De manera similar, hemos utilizado este cuarto ensayo para medir los niveles concurrentes de H3.1, H3.2 o H3t y H3K27Ac en los mismos nucleosomas circulantes libres de células en sujetos sanos y sujetos con CCR. El nivel de H3K27Ac en sujetos con cáncer fue más alto que en sujetos sanos. Este hallazgo concuerda con la bibliografía publicada que indica que la acetilación de H3K27 está elevada en la cromatina de las células cancerosas (Karczarski et al, 2014). Además, hemos mostrado que este ensayo es eficaz para la detección de cáncer en un análisis de sangre que indica que todos o una gran proporción de los nucleosomas libres de células identificados por él son de origen tumoral. En la Figura 5 se muestra un diagrama de caja que muestra los resultados de este ensayo para pacientes con cáncer y pacientes sanos. Los resultados del ensayo diferencian entre muestras de sangre tomadas de sujetos sanos y sujetos con cáncer. Cuando los resultados de los ensayos ELISA tercero y cuarto descritos aquí para nucleosomas libres de células circulantes modificados epigenéticamente que contienen variantes de histona H3, así como 5-metilcitosina (5mc) o H3K27Ac respectivamente, la discriminación entre sujetos con cáncer y sujetos sanos se mejora aún más. Estos resultados muestran que los ensayos para nucleosomas libres de células circulantes que contienen tanto la modificación de histona H3K27Ac como la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t son útiles en oncología clínica, incluida, entre otras, para la detección de cáncer, así como para predicción del pronóstico, selección de la terapia, monitorización del paciente y monitorización/detección de recaídas. Los ensayos para H3K27Ac asociado a nucleosomas se pueden realizar de forma aislada o como parte de un panel de ensayo que comprende ensayos epigenéticos y/o de otro tipo.

Para confirmar adicionalmente que la fracción de nucleosoma circulante que contiene la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t está enriquecida en nucleosomas de origen tumoral y es útil para análisis de sangre de oncología, realizamos un método ELISA utilizando un anticuerpo anti-H3.1, H3.2 o H3t inmovilizado como anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-5-metilcitosina marcado (es decir, el tercer método ELISA descrito anteriormente) para nucleosomas que contienen tanto la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t, así como ADN que incorpora restos de 5-metilcitosina, en muestras tomadas de 9 hombres recién diagnosticados de cáncer de próstata y 10 hombres sanos de edad similar. Se encontró que los hombres con cáncer de próstata tenían niveles de 5-metilcitosina asociados al nucleosoma circulante más bajos que los hombres sanos y, por lo tanto, este ensayo puede usarse, ya sea solo o como parte de un panel de diagnóstico, como método para detectar el cáncer de próstata. A continuación, se repitió este ELISA, pero usando un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo central de nucleosoma común (un quinto diseño de ELISA). Este quinto ensayo mostró menos discriminación para el cáncer de próstata. En la Figura 6 se muestran los resultados.

Concluimos que los nucleosomas libres de células circulantes que contienen la variante de histona H3.1, H3.2 o H3t también pueden contener otras señales epigenéticas. También concluimos que los niveles de nucleosomas libres de células circulantes que contienen tanto una variante de histona H3 como otra señal epigenética particular pueden ser diferentes en sujetos sanos y con cáncer y que esto puede suceder en concordancia con los niveles observados en las células cancerosas. Además, concluimos que esto sigue siendo cierto a pesar de que el nivel de la señal epigenética particular puede estar elevado o deprimido en la cromatina de las células cancerosas. El hecho de que otros métodos ELISA idénticos, que capturan exactamente la misma fracción de nucleosoma circulante y difieren solo en la estructura de señalización epigenética dirigida por el anticuerpo marcado, pueden producir resultados que aumentan o disminuyen (para la misma fracción de nucleosoma circulante que contiene variantes de histona H3) en concordancia con la expresión de las mismas señales epigenéticas encontradas en la cromatina de las células cancerosas indica un origen tumoral para esta fracción de nucleosoma.

Concluimos además que los nucleosomas circulantes que contienen una variante de histona H3 también tienen características de liberación celular diferentes a otros nucleosomas circulantes. Tales nucleosomas tienen diferentes orígenes y son menos un resultado de la muerte celular inducida por trauma. Como los nucleosomas que contienen H3.1, H3.2 o H3t no se producen en gran medida por muerte celular inducida por traumatismos y pueden usarse como biomarcador de cáncer, está claro que son característicos del cáncer y tienen un origen predominantemente tumoral. La separación o aislamiento de nucleosomas que contienen histona H3.1, H3.2 o H3t produce un aislamiento o enriquecimiento de nucleosomas circulantes de origen tumoral que contienen ADNct de una muestra de líquido corporal como sangre, suero o plasma.

Será evidente para los expertos en la técnica que el nivel de nucleosomas que contienen una variante de histona H3 como una proporción de nucleosomas presentes puede usarse como una medida de la proporción de ADNcf que comprende ADNct en una muestra. Dicha medida es similar a las medidas de frecuencia alélica de mutaciones asociadas al cáncer en el ADNct y puede usarse como una medida de la carga tumoral y de la respuesta a la terapia.

Otras marcas epigenéticas características del cáncer pueden ser igualmente útiles en los métodos de la invención, siempre que ocurran con más frecuencia en los nucleosomas circulantes de origen tumoral, o ADNct, que otros nucleosomas circulantes, o ADNcf. No es necesario que la señal epigenética sea exclusiva de los nucleosomas o el ADN de origen tumoral, pero el aumento de frecuencia debería ser suficiente para enriquecer los nucleosomas y el ADN de origen tumoral. Estas marcas epigenéticas pueden incluir variantes de histonas (o isoformas), modificaciones de histonas, modificaciones de ADN y aductos de nucleosomas.

En una primera realización de la invención, se aísla una preparación de nucleosoma tumoral total o parcialmente purificada de una muestra de un fluido biológico. El método de purificación implica el aislamiento por afinidad de nucleosomas libres de células que contienen un epítopo de señal epigenética de histona o ADN característico de cáncer que emplea un agente de unión que se une a dicho epítopo epigenético. Pueden por tanto ser analizados la preparación de nucleosoma de tumor y/o su ADNct asociado. En una realización preferida, el aislamiento del nucleosoma y del ADNct tumoral se realiza mediante un método de purificación por afinidad inmunológica que emplea un agente de unión a la histona H3.1 o H3.2 o H3t. Será evidente para los expertos en la técnica que cualquier agente de unión capaz de unirse específicamente a una variante de histona H3 (u otro epítopo de nucleosoma apropiado característico de cáncer) puede usarse para los métodos de purificación por afinidad de la invención. Tales agentes de unión pueden incluir, entre otros, anticuerpos, aptámeros de proteínas de unión (p. ej., proteínas de unión a nucleosoma).

Los anticuerpos se pueden generar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de inmunización y biblioteca tales como presentación en fagos. La respuesta inmune puede inducirse frente a, o la biblioteca puede seleccionarse para unirse a, el resto o antígeno de interés. Los anticuerpos dirigidos a unirse a la variante de histona H3 se pueden generar frente a una variedad de tales restos que incluyen la secuencia de aminoácidos de la proteína isomorfa de histona H3 completa y pueden contener opcionalmente modificaciones de histonas postraduccionales. La proteína se puede purificar a partir de células vivas o producirse sintéticamente. Alternativamente, se puede usar una secuencia de péptidos que represente una parte de la secuencia de aminoácidos de isoforma de H3 y esta también puede contener opcionalmente modificaciones de histonas postraduccionales. También se pueden usar nucleosomas u otras fracciones de cromatina que contienen isoformas de histona H3.

En las presentes investigaciones se ha empleado un anticuerpo que se une a la secuencia peptídica ATKAARKSAPATGGVKKPH. Esta secuencia de aminoácidos aparece en la secuencia de las variantes de histonas H3.1, H3.2 y H3t, pero no en otras variantes de histonas H3. Será evidente para los expertos en la técnica que en los métodos de la invención se pueden emplear agentes de unión dirigidos a unirse a cualquiera o todas las variantes de histonas H3.1 y/o H3.2 y/o H3t y/o H3.2 y/o H3t. En el presente documento nos hemos referido principalmente a la histona H3.1, pero esta notación pretende incluir la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en todas partes.

(i) poner en contacto la muestra con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

(iii) analizar los nucleosomas aislados y/o el ADN asociado.

El análisis de los nucleosomas aislados de origen tumoral puede implicar cualquier método de análisis adecuado, muchos de los cuales se conocen en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitación, el análisis ELISA que usa un segundo anticuerpo u otro agente de unión a un epítopo de nucleosoma común tal como ADNds o a una estructura epigenética de interés que incluye una modificación de histona, variante de histona, modificación de ADN u otra molécula aducida a un nucleosoma. Estos métodos incluyen todos los métodos descritos en los documentos WO 2005/019826, WO 2013/030577, WO 2013/030579 y WO 2013/084002, en donde se emplea un agente de unión a una variante de histona H3 en lugar de un agente de unión antiepítopo de nucleosoma general de forma que los nucleosomas circulantes de origen tumoral (en vez de los nucleosomas per se) se analizan respecto de su composición epigenética. Estos métodos también incluyen métodos multiplex para el análisis de múltiples epítopos presentes en nucleosomas circulantes de origen tumoral.

Según una realización de este aspecto, se proporciona un inmunoensayo para el análisis de un epítopo epigenético particular de nucleosomas circulantes derivados de tumores en términos de cualquier histona modificada asociada al nucleosoma particular, variante de histona, nucleótido modificado o en términos de la presencia de cualquier otra molécula aducida a un nucleosoma que comprende las etapas de:

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a dicho epítopo;

(iv) usar la presencia o el grado de tal unión como una medida de la presencia del epítopo particular de nucleosomas derivados de tumor en la muestra.

Según una realización alternativa, se proporciona un método para detectar y medir nucleosomas libres de células que contienen un epítopo epigenético particular, o composición de nucleosomas circulantes derivados de tumores, en términos de cualquier histona modificada asociada al nucleosoma particular, variante de histona, nucleótido modificado o en términos de la presencia de otra molécula aducida a un nucleosoma que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con un primer agente de unión que se une a dicho epítopo;

(ii) poner en contacto laos nucleosomas o la muestra con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(iii) detectar y/o cuantificar la unión de dichos agentes de unión a histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t a nucleosomas en la muestra; y

El análisis de nucleosomas de origen tumoral aislados mediante un método de la invención también puede implicar cualquier método proteómico conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, métodos de electroforesis, métodos crom atográficos y cualquier método que implique espectrometría de masas, incluyendo métodos que implican cromatografía y espectrometría de masas y/o espectrometría de masas marcada con isótopos estables y/o métodos que implican la digestión de proteínas para producir péptidos para la identificación y/o la cuantificación por espectrometría de masas o cualquier método de espectrometría de masas combinatoria con cualquier otro método. En una realización preferida de la invención, se prepara una preparación de nucleosomas circulantes enriquecida con nucleosomas de origen tumoral mediante purificación por afinidad de nucleosomas circulantes en una muestra de sangre, suero o plasma tomada de un paciente con cáncer y la composición epigenética de la preparación de nucleosomas se investiga mediante un método que implica espectrometría de masas. En una realización el método comprende las etapas de:

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

(iii) analizar los nucleosomas aislados en la etapa (ii) usando un método que comprende espectrometría de masas.

En una realización, el aislamiento de nucleosomas que contienen ADNct se realiza mediante un método de purificación por afinidad inmunológica que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la muestra con un agente de unión dirigido a unirse a un epítopo epigenético que ocurre más comúnmente en los nucleosomas derivados de tumores que en los no derivados de tumores;

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

(iii) extraer el ADN de la muestra de nucleosomas aislados en la etapa (ii); y

En una realización adicional, el agente de unión dirigido a unirse a un epítopo epigenético característico de los nucleosomas derivados de tumores se dirige a unirse a la variante de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en un método de purificación por afinidad inmunológica que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto la fracción aislada con un agente de unión a la variantes de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

1

(iii) opcionalmente extraer el ADN de los nucleosomas aislados en la etapa (ii).

La investigación del ADNct aislado o purificado puede implicar el análisis de cualquiera o todos los tipos de anomalías del ADN asociadas al cáncer, incluyendo, sin limitación, análisis epigenéticos, incluyendo la metilación de secuencias de ADN, mutaciones puntuales, translocaciones, número de copias de genes, anomalías de los microsatélites e integridad de la cadena de ADN. Además, se puede emplear cualquier método de análisis de ADN, incluyendo, sin limitación, secuenciación de ADN, análisis de secuenciación de ADN metilado, PCR, BEAMing, NGS (genoma diana o completo), PCR digital, PCR fría (coamplificación a temperatura de desnaturalización más baja-PCR), MAP (Pirofosforólisis Activada por MIDI), PARE (análisis personalizado de extremos reorganizados) y Espectrometría de Masas.

En una realización, la muestra biológica comprende una muestra de sangre, suero o plasma.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de cáncer que comprende el paso de detectar la variante de histona asociada a nucleosoma libre de células circulantes H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano o animal.

En una realización, el método de diagnóstico comprende adicionalmente detectar una o más modificaciones de histonas, nucleótidos modificados, variantes de histonas o isoformas o aductos de nucleosomas.

En otra realización adicional, la modificación de histona comprende H3K27Ac y/o 5-metilcitosina.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un kit que comprende un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

La invención se ilustrará ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

Un anticuerpo dirigido a unirse específicamente a la isoforma de histona H3.1. H3.2 o H3t se biotinila e inmoviliza en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal) mediante el método recomendado por el fabricante. Las perlas se lavan varias veces con tampón de carga usando un sistema de separación magnética. El suero o plasma extraído de un paciente con cáncer se diluye en tampón de carga y se añade a las perlas. Los nucleosomas que contienen la variante de histona H3 se adsorben en las perlas. Otros componentes del suero/plasma permanecen en disolución y se eliminan mediante separación magnética. Las perlas se lavan con tampón. Los nucleosomas que contienen la variante de histona H3 ahora se aíslan en las perlas. El ADNct asociado con los nucleosomas aislados se extrae mediante el método de fenol/cloroformo u otros métodos de extracción estándar. El ADN extraído puede analizarse para detectar características genéticas o epigenéticas del cáncer.

EJEMPLO 2

Un anticuerpo dirigido a unirse específicamente a la histona H3.1, H3.2 o H3t se biotinila e inmoviliza en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal) mediante el método recomendado por el fabricante. Las perlas se lavan varias veces con tampón de carga usando un sistema de separación magnética. El suero o plasma extraído de un paciente con cáncer se diluye en tampón de carga y se añade a las perlas. Los nucleosomas que contienen la variante de histona H3 se adsorben en las perlas. Otros componentes del suero/plasma permanecen en disolución y se eliminan mediante separación magnética. Las perlas se lavan con tampón. Los nucleosomas que contienen la variante de histona H3 ahora se aíslan en las perlas. Los nucleosomas aislados se eliminan de las perlas magnéticas utilizando un tampón de elución y los nucleosomas se analizan mediante métodos proteómicos que incluyen Espectroscopía de Masas.

EJEMPLO 3

Se analizaron muestras de suero tomadas de 6 pacientes con CCR antes de la cirugía y a las 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la cirugía para determinar los niveles de nucleosomas libres de células circulantes utilizando un ELISA de nucleosoma comercial (total) producido por Roche que emplea un epítopo central antinucleosoma común y un anticuerpo anti-ADNds marcado. A continuación, las muestras se volvieron a ensayar, pero usando un anticuerpo de captura de variante de anti-histona H3.1, H3.2 o H3t. Los niveles de nucleosomas medidos (totales) aumentaron después del trauma de la cirugía usando el ELISA comercial, pero la respuesta a la cirugía fue alterada y silenciada para los nucleosomas que contienen la variante de histona H3 medida usando el ensayo que emplea anticuerpos antihistona H3.1, H3.2 o H3t. Los resultados se muestran en la Figura 3.

EJEMPLO 4

Las muestras de suero tomadas de pacientes con CCR y sujetos de control sanos se analizaron usando un ELISA empleando un anticuerpo de captura de variante de antihistona H3.1, H3.2 o H3t y un anticuerpo H3K27Ac anti modificación de histona marcado o un anticuerpo anti-5-metilcitosina marcado. Cuando se utilizó el anticuerpo H3K27Ac anti-modificación de histona marcado, los resultados mostraron que estaba presente un nivel más alto de H3K27Ac asociado al nucleosoma en la circulación de los pacientes con cáncer que en los controles sanos. Por el contrario, cuando se utilizó el anticuerpo anti-5-metilcitosina marcado, los resultados mostraron que estaba presente un nivel más bajo de 5-metilcitosina asociada al nucleosoma estaba presente en la circulación de los pacientes con cáncer que en los controles sanos (Figura 5). Ambos hallazgos son consistentes con las alteraciones epigenéticas informadas para la cromatina de células y tejidos cancerosos (metilación global del ADN disminuida y acetilación global de H3K27 aumentada). Además, cuando los resultados son de los dos nucleosomas modificados epigenéticamente, los resultados se expresan como una proporción, los datos combinados diferencian a los sujetos sanos de los sujetos con CCR con alta precisión, como se muestra en la Figura 5. Estos resultados indican que estos métodos ELISA pueden usarse para detectar el cáncer y que los nucleosomas unidos al anticuerpo variante anti-histona H3 en fase sólida son predominantemente de origen tumoral.

EJEMPLO 5

Se analizaron muestras de suero tomadas de 9 hombres recién diagnosticados de cáncer de próstata y 10 hombres sanos de edad similar con un método ELISA usando un anticuerpo anti-H3.1, H3.2 o H3t inmovilizado como anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-5-metilcitosina marcado para nucleosomas que contienen ADN que incorpora restos de 5-metilcitosina. Se encontró que los hombres con cáncer de próstata tenían niveles de 5-metilcitosina asociados al nucleosoma circulante más bajos que los hombres sanos y, por lo tanto, este ensayo puede usarse, ya sea solo o como parte de un panel de diagnóstico, como método para detectar el cáncer de próstata. A continuación, se repitió este ELISA pero usando un anticuerpo inmovilizado dirigido a unirse a un epítopo central de nucleosoma común. Este ensayo mostró menos discriminación para el cáncer de próstata. En la Figura 6 se muestran los resultados.

REFERENCIAS

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Zhou et al, Seminars in Oncology, 39(4), 440-448, 2012.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente ligante de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t para detectar, aislar y/o purificar nucleosomas libres de células de origen tumoral o ADN tumoral circulante (ADNct) de una muestra biológica.

2. Un método para aislar nucleosomas libres de células de origen tumoral a partir de una muestra biológica mediante purificación por afinidad en donde dicho método comprende las etapas de:

(ii) aislar los nucleosomas unidos de la muestra; y

(iii) analizar los nucleosomas aislados y/o el ADN asociado.

3. El método según la reivindicación 2, en donde la etapa de analizar los nucleosomas aislados y/o el ADN asociado comprende un método de inmunoensayo, un método proteómico o espectrometría de masas.

4. Un método para aislar ADN tumoral circulante purificado (ADNct) a partir de una muestra biológica, en donde dicho método comprende las etapas de:

(i) aislar nucleosomas libres de células circulantes que contienen histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t poniendo en contacto la muestra con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(ii) extraer el ADN de la muestra de nucleosoma aislado en la etapa (i); y

(iii) analizar el ADN extraído.

5. El método según la reivindicación 4, en donde la etapa de analizar el ADN extraído comprende: secuenciación del ADN, análisis de secuenciación del ADN metilado, PCR, BEAMing, NGS (genoma diana o completo), PCR digital, PCR en frío (coamplificación a menor temperatura de desnaturalización-PCR), MAP (Pirofosforólisis Activada por MIDI), PARE (análisis personalizado de extremos reorganizados) o Espectrometría de Masas.

6. Un método de inmunoensayo que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra biológica con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

7. Un método de inmunoensayo que comprende las etapas de:

(ii) poner en contacto la muestra unida en la etapa (i) con un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t;

(iv) usar la presencia o el grado de dicha unión como una medida de la presencia del epítopo de nucleosomas derivados de tumor en la muestra.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el epítopo comprende una modificación de histona, un nucleótido modificado, una variante de histona o isoforma, o un aducto de nucleosoma.

9. El uso o método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la muestra biológica comprende una muestra de sangre, suero o plasma.

10. Un método de diagnóstico de cáncer que comprende la etapa de detectar la variante de histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t asociada al nucleosoma libre de células circulantes en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano o animal.

11. El método según la reivindicación 10, que comprende adicionalmente detectar una o más modificaciones de histonas, nucleótidos modificados, variantes de histonas o isoformas o aductos de nucleosomas.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la modificación de la histona comprende H3K27Ac y/o 5-metilcitosina.

13. Uso de un kit que comprende un agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t en un método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12.

14. El uso o métodos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el agente de unión a la histona H3.1 y/o H3.2 y/o H3t comprende un agente de unión a H3.1.