CN108496083A

CN108496083A - 用于检测包含组蛋白修饰和变体的核小体的方法

Info

Publication number: CN108496083A
Application number: CN201680074822.1A
Authority: CN
Inventors: J.V.米卡莱夫; M.E.埃克莱斯顿
Original assignee: Belgium Wills LLC
Current assignee: Belgium Wills LLC; Belgian Volition SPRL
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2018-09-04
Also published as: JP2018536849A; EP3365681B1; JP6925328B2; US20190064183A1; US10768182B2; EP3365681A1; WO2017068359A1; GB201518674D0

Abstract

本发明涉及用于检测和测量含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞单核小体和寡核小体的存在的方法，以及所述测量用于检测和诊断疾病的用途。

Description

用于检测包含组蛋白修饰和变体的核小体的方法

发明领域

本发明涉及包含组蛋白H1蛋白或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体，用作诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。本发明进一步涉及用于检测和测量含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的单核小体和寡核小体和核小体的存在的方法以及这种测量用于检测和诊断疾病的用途。本发明还涉及鉴定用于检测和诊断疾病的组蛋白H1修饰和变体生物标志物的方法以及通过所述方法鉴定的生物标志物。

发明背景

人体包含数百种细胞类型。所有这些细胞类型都含有相同的基因组，但在体内具有广泛不同的表型和不同的功能。这种表型多样性归因于基因组在不同细胞类型中的差异表达。差异基因表达的控制尚未完全理解，但其基本机制包括通过与基因相关的许多相互关联的表观遗传信号进行基因调控，包括控制染色质堆积为常染色质或异染色质，控制核小体定位和核酸酶可及位点，DNA的甲基化以及DNA包裹的核小体结构的变化。

核小体是染色质结构的基本单位，并且由8个高度保守的核心组蛋白(包含各组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一对)的蛋白复合物组成。在该复合物周围包裹着约146个碱基对的DNA。另一组蛋白H1或H5，作为接头并参与染色质致密化。DNA在通常被称为类似于“串上的珠(beads on a string)”的结构中缠绕连续核小体周围，并且这形成了开放或常染色质的基本结构。在致密或异染色质中，该串盘绕并超级盘绕成封闭和复杂的结构(Herranz andEsteller, 2007)。

核小体的结构可以通过组蛋白的转录后修饰(PTM)以及包含变体组蛋白而变化。组蛋白的PTM通常包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化等等。已知组蛋白修饰涉及基因表达的表观遗传调控(Herranz andEsteller, 2007)。核小体的结构也可以通过包含替代的组蛋白同种型或变体(其为不同的基因或剪接产物并且具有不同氨基酸序列)而变化。组蛋白变体可分为许多细分为单独类型的家族。大量组蛋白变体的核苷酸序列是已知的并且可以在例如National HumanGenome Research Institute NHGRI Histone DataBase (Mariño-Ramírez, L et al.The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011, Article ID bar048; 和http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank (NIH genetic sequence)DataBase、EMBL Nucleotide Sequence Database和DNA Data Bank of Japan (DDBJ)公众可得。

成年人的正常细胞更新涉及通过细胞分裂每天约10¹¹个细胞的产生并且主要由细胞凋亡导致类似数量的死亡。在细胞死亡过程中，染色质被分解成染色质片段，包括单核小体和寡核小体，其中一些可能作为无细胞核小体被释放到循环或其它体液中。据报道，在正常情况下，健康受试者中存在的循环核小体水平较低。在具有包括许多癌症、自身免疫疾病、炎性病况、中风和心肌梗塞的各种病况的受试者中发现水平升高(Holdenreider &Stieber, 2009)。与无细胞核小体相关的DNA是无细胞DNA。

单核小体和寡核小体可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，并且已经报道了几种方法(Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003)。这些测定通常使用抗组蛋白抗体(例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4)作为捕获抗体和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合物抗体作为检测抗体。使用这些测定法，实地的技术人员报告，血清中的核小体水平比采自相同患者的血浆样品更高(高达一个数量级)。通过PCR进行的DNA血浆和血清测量也是如此(Holdenrieder et al, 2005)。对此的原因尚不清楚，但作者推测，这可能是由于在凝血过程中DNA的额外释放。然而，我们发现现有技术的核小体ELISA测定的结果彼此不一致。此外，虽然血清或血浆中的大多数循环DNA被报道作为单核小体和寡核小体形存在(Holdenrieder et al, 2001)，但测量到的血清或血浆中的核小体和DNA水平并不完全一致。已报道通过实时PCR(聚合酶链式反应)测量的循环无细胞核小体水平与循环DNA水平的ELISA结果之间的相关系数在血清中为r=0.531，在血浆中为r=0.350 (Holdenrieder et al, 2005)。

目前的核小体ELISA方法用于细胞培养，主要作为检测细胞凋亡的方法(Salgameet al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003)，并且也用于测量血清和血浆中的循环无细胞核小体(Holdenrieder et al, 2001)。已经通过ELISA方法在许多不同癌症的研究中测量了由临死细胞释放到循环中的无细胞血清和血浆核小体水平，以评估它们作为潜在生物标志物的用途(Holdenrieder et al, 2001)。据报道在大多数，但不是全部研究的癌症中平均循环核小体水平高。在肺癌受试者中观察到最高的循环核小体水平。在前列腺癌中观察到最低水平，其在健康受试者的正常范围内。然而，据报道恶性肿瘤患者的血清核小体浓度差异很大，并且发现一些晚期肿瘤疾病患者的循环核小体水平低，在健康受试者测量的范围内(Holdenrieder et al, 2001)。由于这一点以及核小体水平升高的多种非癌症原因，循环核小体水平在临床上不被用作癌症的生物标志物(Holdenrieder and Stieber, 2009)。

用于检测组蛋白PTM的ELISA方法也是本领域已知的。用于游离组蛋白(未附着到核小体复合物中的其它组蛋白和DNA)中PTM检测的ELISA方法用于检测通常通过酸提取从细胞裂解物中提取的组蛋白中的PTM。已经报道了用于检测循环无细胞核小体中的PTM的免疫测定法(WO2005/019826)。还报道了直接包被到微量滴定孔的纯化核小体中组蛋白PTM的ELISA检测方法(Dai et al, 2011)。在该方法中，通过消化来自培养细胞的染色质提取物获得的核小体直接包被到微量滴定孔中并与抗PTM抗体反应。本领域技术人员将清楚，该方法需要相对纯的核小体样品，并且不适合于直接测量复杂生物介质例如血液或血清中的组蛋白PTM。

在血浆中已经报道了在与特定DNA序列相关的无细胞核小体中检测组蛋白PTM(H3K9Me，在赖氨酸残基K9处单甲基化的组蛋白H3)的改良染色质免疫沉淀(ChIP)方法。据报道，序列特异性组蛋白甲基化的水平与循环核小体的浓度无关(Deligezer et al,2008)。

除了由核小体位置和核小体结构介导的表观遗传发信号(就组成型组蛋白变体和PTM结构而言)之外，细胞中基因表达的控制也通过对DNA核苷酸进行修饰来调节，包括DNA的胞嘧啶甲基化状态。本领域在一段时间已知，DNA可在胞嘧啶核苷酸的5位甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。据报道，5-甲基胞嘧啶形式的甲基化DNA发生在邻近鸟嘌呤核苷酸存在胞嘧啶核苷酸的DNA序列中的位置。这些位置简称为“CpG”。据报道，超过70％的CpG位置在脊椎动物中被甲基化(Pennings et al, 2005)。含有高比例CpG位点的基因组区域通常被称为“CpG岛”，并且约60％的人类基因启动子序列与这些CpG岛相关(Rodriguez-Paredes andEsteller, 2011)。在活性基因中，这些CpG岛通常是低甲基化的。基因启动子序列的甲基化与稳定的基因失活有关。DNA甲基化通常也发生在包括Alu重复元件和长散布核苷酸元件的重复元件中(Herranz and Estellar, 2007; Allen et al, 2004)。

组蛋白变体(也称为组蛋白同种型)也已知为基因表达的表观遗传调节子(Herranz and Esteller, 2007)。已经使用多种技术在体内和体外研究了组蛋白变体，包括编码特定变体的基因的敲减研究(例如使用RNAi敲减)、染色质免疫沉淀、氨基酸的稳定同位素标记和定量质谱蛋白组学、免疫组织化学和蛋白质印迹(Whittle et al, 2008;Boulard et al, 2010; Sporn et al, 2009; Kapoor et al, 2010; Zee et al, 2010;Hua et al, 2008)。

已报道来自诊断患有肺癌、乳腺癌和黑素瘤的受试者在手术时或通过活检移除的组织样品中的组蛋白变体表达的免疫组织化学研究。这些免疫组织化学研究报道，切除的癌症组织样品中组蛋白macroH2A(mH2A)和H2AZ变体的染色可能在这些癌症中具有预后应用(Sporn et al, 2009, Hua et al, 2008, Kapoor et al, 2010)。用于临床用途的免疫组织化学方法的一个缺点是组织样品收集是涉及侵入性的手术或活检。免疫组织化学方法的另一个缺点是它们不适合于早期诊断或筛查诊断，因为在进行活检或组织切除前通常必须已经存在合理的疾病预期。微小侵入性血液ELISA试验适用于更广泛的应用，并且可以克服这些缺点，对于患者而言是优选的，并且对于医疗保健提供者而言更快、更低成本和更高通量。

WO2005/019826涉及通过分析与来自个体的样品中的无细胞核小体相关的组蛋白修饰来诊断疾病状况，例如癌症和自身免疫疾病。WO2013/030579涉及用于检测和测量含有特定组蛋白变体的单核小体和寡核小体以及核小体的存在的方法以及这种测量用于检测和诊断疾病的用途。

我们现在描述关于组蛋白H1分析无细胞核小体的方法；包括组蛋白H1是否存在于核小体中，并且如果存在的话，就存在的变体(或同种型)而言其性质以及任何组蛋白H1翻译后修饰(PTM)的包含。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了包含组蛋白H1蛋白或组蛋白H1修饰、或组蛋白H1变体或同种型的无细胞核小体，其用作检测或诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的结合剂接触；

(ii)检测或定量所述结合剂与样品中的组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的结合；和

(iii)使用所述结合的存在或程度作为样品中组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型或含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体存在的量度。

(i)使样品与结合非组蛋白H1核小体表位的第一结合剂接触；

(ii)使核小体或样品与结合组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的第二结合剂接触；

(iii)检测或定量所述第二结合剂与样品中组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的结合；和

(iv)使用所述结合的存在或程度作为样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的量度。

(i)使样品与结合组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的第一结合剂接触；

(ii)使核小体或样品与结合非组蛋白H1核小体表位的第二结合剂接触；

(iii)检测或定量所述第二结合剂与样品中的非组蛋白H1核小体表位的结合；和

根据本发明的另一方面，提供了用于检测细胞中如本文所定义的含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

(i)从细胞中分离染色质；

(ii)消化、超声处理或以其它方式分解染色质以形成单核小体和/或寡核小体；和

(iii)根据如本文所定义的方法检测或测量所述核小体中组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测血液、血清或血浆样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

(i)从核小体复合物除去、释放或提取组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型以产生游离组蛋白H1或游离组蛋白H1修饰、变体或同种型部分；

(ii)检测或定量样品中的游离组蛋白H1或游离组蛋白H1修饰、变体或同种型；和

(iii)使用游离组蛋白H1或游离组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在或量作为样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的量度。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测或诊断动物或人受试者中疾病状态的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；和

(ii)使用检测的核小体相关组蛋白H1或核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平以鉴定受试者的疾病状态。

根据本发明的另一方面，提供了用于评估动物或人受试者对于医学治疗的适合性的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测的核小体相关组蛋白H1或核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平作为选择用于受试者的适合治疗的参数。

根据本发明的另一方面，提供了用于监测动物或人受试者的治疗的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；

(ii)一次或多次重复检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；和

(iii)使用检测的核小体相关组蛋白H1或核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。

根据本发明的另一方面，提供了鉴定用于检测或诊断动物或人受试者中疾病状态的组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；

(ii)检测或测量健康受试者或对照受试者的体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；和

(iii)使用在患病和对照受试者中检测到的水平之间的差异来鉴定组蛋白H1修饰、变体或同种型是否可用作疾病状态的生物标志物。

根据本发明的另一方面，提供了通过本文所定义的方法鉴定的生物标志物。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测无细胞核小体相关的组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的试剂盒，其包含对组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型或其组分部分，或组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型或其组分部分的结构/形状模拟物特异的配体或结合剂，以及根据本文所定义的任一方法使用试剂盒的说明书。

根据本发明的另一方面，提供了无细胞核小体相关的组蛋白H1作为诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

根据本发明的另一方面，提供了无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型作为诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

发明详述

根据本发明的第一方面，提供了含有组蛋白H1蛋白的无细胞核小体，其用作诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

根据本发明的另一方面，提供了包含组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体，其用作诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

核小体核心由8种组蛋白组成，包括各H2A、H2B、H3和H4组蛋白的一对。组蛋白H1(H1)不是核心组蛋白，而是位于核心外侧并充当接头。具体而言，H1涉及将“串上的珠”子结构包装成高级结构。不受理论束缚，本发明人已经确定源自肿瘤的无细胞核小体相关的H1受到进一步修饰，其导致组蛋白H1修饰、变体和/或同种型的存在或组蛋白H1的完全丧失。

主要组蛋白H1变体或同种型包括但不限于在增殖和静息体细胞中表达的H1.0和H1.10以及在分裂细胞中以高水平表达的H1变体H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H.1.5和H1.6。此外，还有种系特异性变体，包括主要在睾丸中表达的H1.8和主要在卵母细胞中表达的H1.7。染色质的组蛋白变体组成在癌细胞中发生改变，据报道，在常见H1同种型中，组蛋白H1.0同种型表达在癌细胞中下调，而组蛋白同种型H1.1、H1.2、H1.3、H1.4和H1.5在癌细胞中以高水平表达(Scaffidi; 2015)。因此，在一个实施方案中，与无细胞核小体相关的组蛋白H1变体和/或同种型包含至少一种如本文所列的组蛋白H1变体和/或同种型。

组蛋白H1可以在位于蛋白的N-和C-末端尾巴以及球状结构域内的氨基酸残基进行翻译后修饰，这些修饰可能与癌症有关(Izzo和Schneider; 2015)。应该理解，本文提及“组蛋白H1修饰”是指H1翻译后修饰(PTM)，其可包括乙酰化、甲基化(其可以是单甲基化、二甲基化或三甲基化)、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、瓜氨酸化、羟基化、糖基化、亚硝基化、谷氨酰胺化和/或异构化。具有修饰的组蛋白氨基酸残基可以是组蛋白氨基酸序列内的任何Ser、Lys、Arg、His、Glu、Pro或Thr残基。

例如，核心组蛋白序列内的赖氨酸残基可以被单甲基化、二甲基化或三甲基化、乙酰化或泛素化，核心组蛋白序列内的精氨酸残基可以被单甲基化、对称或不对称二甲基化或转化为瓜氨酸，核心组蛋白序列内的丝氨酸或苏氨酸残基可被磷酸化和/或核心序列内的脯氨酸残基可被异构化。

本领域技术人员将理解，用于描述特定组蛋白修饰的符号指示哪个组蛋白已被修饰，已被修饰的特定氨基酸和已发生修饰的类型。例如，H1K64(Ac)表示组氨酸H1在赖氨酸64处的乙酰化。

在一个实施方案中，生物标志物包含与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰。在进一步的实施方案中，组蛋白H1修饰选自磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和/或甲酰化。H1修饰可包括：磷酸化位点：S2、T4、T11、S/T18、S27、T31、S36、S37、T39、S41、S44、S107、T138、T142、T146、T147、T154、T155、T165、S172、S173、T180、S/T187、S189；乙酰化位点：S2、K17、K26、K34、K46、K49、K52、K63、K64、K85、K88、K90、K93、K97、K109、K168、K169、K192、K209；甲基化位点：K26、K27、K34、K52、K64、K97、K106、K119、K148、K168、K169、K187；泛素化位点：K17、K21、K34、K46、K47、K64、K65、K75、K76、K85、K86、K90、K91、K97、K98、K106、K107；甲酰化位点：K17、K34、K46、K63、K64、K67、K75、K85、K88、K90、K97、K110、K140、K141、K160。因此，在一个实施方案中，与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰包含至少一种如本文所列的组蛋白H1修饰。

本领域技术人员清楚的是，包含对含有不同或另外的组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的测试将可能改善使用这种模式的差异诊断的区分。因此，在一个实施方案中，生物标志物包含至少一种与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰和/或变体和/或同种型。

在一个实施方案中，核小体是无细胞单核小体或寡核小体。

根据可提及的本发明的一个具体方面，提供了组蛋白H1修饰、变体或同种型作为诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

在一个实施方案中，组蛋白H1修饰、变体或同种型用作癌症的生物标志物。在另一个实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、食管癌、肾癌、大肠癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌或胃癌。在可提及的一个具体实施方案中，癌症是结肠癌、肺癌、口腔癌或胰腺癌。

在一个实施方案中，联合位于核小体核心内的另一个核小体表位或在癌症中也变化的相关DNA，在癌细胞中高度表达的组蛋白变体用作经典双抗体免疫测定方法中的固相抗体。

在另一个实施方案中，本发明的测定小组用作受试者疾病状态的小组测试。

术语“生物标志物”是指过程、事件或状况的独特的生物或生物衍生指示物。生物标志物可用于诊断方法，例如，临床筛查和预后评估以及监测治疗结果，确定最有可能对特定治疗反应的患者，药物筛选和开发。生物标志物及其用途对于鉴定新药治疗和发现药物治疗的新靶是有价值的。

检测方法

根据本发明的另一方面，提供了通过免疫测定检测和测量样品中含有组蛋白H1的无细胞核小体的方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合组蛋白H1的抗体或其它结合剂接触；

(ii)检测和/或定量所述抗体或其它结合剂与样品中组蛋白H1的结合；和

(iii)使用所述结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体相关组蛋白H1存在的量度。

如本文所解释的，令人惊讶地发现源自肿瘤细胞的无细胞核小体更可能丢失组蛋白H1(即组蛋白H1缺失)。因此，如果检测和测量的无细胞核小体与组蛋白H1不相关，则认为这些来源于肿瘤。

根据本发明的另一方面，提供了通过免疫测定检测和测量样品中含有特异性组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合组蛋白H1修饰、变体或同种型的抗体或其它结合剂接触；

(ii)检测和/或定量所述抗体或其它结合剂与样品中组蛋白H1修饰、变体或同种型物类的结合；和

(iii)使用所述结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在的量度。

如本文所解释的，当源自肿瘤细胞的无细胞核小体确实具有组蛋白H1存在时，那么该H1很可能以与源自健康细胞的大多数核小体中存在的H1变体不同的变体或同种型存在。类似地，存在于源自肿瘤细胞的无细胞核小体中的H1很可能含有不同于源自健康细胞的核小体中存在的H1修饰模式。因此，与无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型很可能源自肿瘤。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测样品中含有组蛋白H1的无细胞核小体的存在的双抗体免疫测量或夹心免疫测定方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合核小体或非组蛋白H1核小体表位的第一结合剂接触；

(ii)使核小体或样品与结合组蛋白H1的第二结合剂接触；

(iii)检测或定量所述第二结合剂与样品中的组蛋白H1的结合；和

(iv)使用所述结合的存在或程度作为样品中含有组蛋白H1的核小体的存在的量度。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测样品中含有组蛋白H1的无细胞核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合组蛋白H1的第一结合剂接触；

(ii)使核小体或样品与结合核小体或非组蛋白H1核小体表位的第二结合剂接触；

(iii)检测或定量所述第二结合剂与样品中的核小体或非组蛋白H1核小体表位的结合；和

根据本发明的另一方面，提供了用于检测和测量样品中含有特定组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的双抗体免疫测量或夹心免疫测定方法。该方面的一个实施方案是免疫测定，其包括以下步骤：

(i)使可含有无细胞核小体的样品与结合核小体或非组蛋白H1核小体表位的第一抗体或其它结合剂接触；

(ii)使无细胞核小体或样品与结合组蛋白H1修饰、变体或同种型的第二抗体或其它结合剂接触；

(iii)检测和/或定量所述第二抗体或其它结合剂与样品中的组蛋白H1修饰、变体或同种型物类的结合；和

(iv)使用所述结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在的量度。

根据另一个实施方案，提供了通过免疫测定检测和测量样品中含有特定组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的方法，其包括以下步骤：

(i)将可含有无细胞核小体的样品与结合组蛋白H1修饰、变体或同种型的第一抗体或其它结合剂接触；

(ii)使无细胞核小体或样品与结合核小体或非组蛋白H1核小体表位的第二抗体或其它结合剂接触；

(iii)检测和/或定量所述第二抗体或其它结合剂与样品中的核小体或非组蛋白H1核小体表位的结合；和

(iv)使用所述结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型存在的量度。

多种抗体或其它结合剂可以在本发明中用作结合核小体的结合剂。这些包括涉及结合存在于完整核小体而不是游离组蛋白的表位(例如，在核小体中两个组蛋白之间的连接处存在的表位)的结合剂，以及针对任何核小体组分，包括常见核小体蛋白、组蛋白或核酸表位的结合剂。

本文对于“非组蛋白H1核小体表位”的提及是指存在于核小体中的任何不存在于组蛋白H1上的表位。这样的表位包括在组蛋白H2A、H2B、H3或H4或任何DNA表位中存在的任何表位。使用其中一种抗体与组蛋白H1表位结合并且另一种抗体结合“非组蛋白H1核小体表位”的双抗体测定法确保通过测定法检测到的组蛋白H1表位被掺入核小体中。

对于组蛋白H2A、H2B和H3已报道多种同种型或变体。另一方面，据报道组蛋白H4以单一形式存在(Tachiwana et al, 2011)。本领域技术人员将清楚，使用靶向结合组蛋白H4的抗体或结合剂的本发明的ELISA方法将实际上结合样品中的所有核小体。本领域技术人员将进一步清楚，为该应用生产的适合抗体或配体可以靶向不经过PTM修饰的组蛋白H4区域。这将进一步增加所选表位作为所有或大多数核小体共同的表位的通用性。因此，在一个实施方案中，与核小体结合的抗体或其它结合剂靶向组蛋白H4，特别是不经过PTM修饰的组蛋白H4区域。类似地，本领域技术人员将清楚，可以将类似的适合抗体靶向结合所选择的其它组蛋白部分的区域，使得所述区域对于所述组蛋白部分的全部或大部分组蛋白变体或同种型是共同的，并且不经过PTM(例如但不限于组蛋白H2A、H2B或H3的共同区域)。

本领域技术人员将清楚，可以使用本发明的方法直接在其出现的任何样品中检测和测量核小体，例如在通过消化从细胞提取的染色质获得的样品中或在生物流体例如血液、血清或血浆样品中。

本发明的方法对于检测全部或大部分癌症是有效的。本领域技术人员将清楚，通过包括进一步的核小体结构测试和通过检查存在的不同核小体结构的比率，可以进一步改善本发明的临床表现。

本领域技术人员将清楚，所描述的本发明的方法包括多种实施方案，包括经典竞争性免疫测定以及生物传感器类型测定和例如由ForteBio Incorporated of USA销售的类型的无标记测定，其性质上可以是免疫测定。

根据本发明的一个实施方案，提供了通过无标记免疫测量的免疫测定检测和测量样品中组蛋白H1修饰、变体或同种型或无细胞核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型的方法，其包括以下步骤：

(ii)检测和/或定量所述抗体或其它结合剂与样品中组蛋白H1修饰、变体或同种型的结合；和

(iii)使用所述结合的存在或程度作为样品中组蛋白H1修饰、变体或同种型或无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在的量度。

根据本发明的另一方面，提供了通过竞争性免疫测定检测和测量样品中的无细胞组蛋白H1修饰、变体或同种型或无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的方法，其包括以下步骤：

i)使样品与结合组蛋白H1修饰、变体或同种型的抗体或其它结合剂接触；

(ii)检测和/或定量所述抗体或其它结合剂与样品中的组蛋白H1修饰、变体或同种型的结合；和

(iii)使用所述结合的存在或程度作为样品中组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在的量度。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测样品中包含组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体比例的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量样品中的核小体的水平；

(ii)根据本发明的方法检测或测量核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平；和

(iii)使用两次测量来确定含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的比例。

根据本发明该方面的一个实施方案；使用本发明的方法测量样品中总核小体水平和目的核小体相关组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平。在另一个实施方案中，使用现有技术的核小体ELISA方法来确定总核小体水平。在另一个实施方案中，将无细胞DNA的量度用作总核小体水平的代替。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测或测量细胞中含有组蛋白H1的无细胞核小体的存在和/或水平的方法，其包括以下步骤：

(i)从细胞中分离染色质；

(iii)通过本文所述的方法检测或测量单核小体和/或寡核小体中组蛋白H1的存在。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测或测量细胞中含有特定组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在和/或水平的方法，其包括以下步骤：

(i)从细胞中分离染色质；

(iii)通过本文所述的方法检测或测量单核小体和/或寡核小体中组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在。

用于从染色质产生单核小体和/或寡核小体的方法是本领域众所周知的，并且包括酶消化和超声处理(Dai et al, 2011)。

本领域技术人员将理解，所描述的检测细胞或组织中核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的方法比目前使用的方法包括IHC、蛋白质印迹或FACS更简单，更快速、更便宜、更定量和/或更可重复。特定的核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平、浓度或量可以以绝对项或相对项表示，例如作为存在的总核小体或总DNA的比例或作为与含有另一种组蛋白变体或PTM或核苷酸的核小体水平的比率。

用于本发明的抗组蛋白H1抗体包括涉及结合特定组蛋白H1变体或同种型的抗体、涉及结合特定组蛋白H1翻译后修饰的抗体和涉及结合组蛋白H1本身的抗体(涉及结合存在于所有或大多数H1同种型或变体中的共同H1表位)。所有这些类型的抗体在本领域中都是众所周知的并且可以商购获得。针对“非组蛋白H1核小体表位”的抗体涉及结合存在于核小体中的任何不存在于组蛋白H1上的表位。这样的表位包括存在于组蛋白H2A、H2B、H3或H4中的任何表位或任何DNA表位。这些抗体在本领域也是众所周知的并且可以商购获得。本领域技术人员将清楚，关于本发明的任何方面的术语抗体、结合剂或配体不是限制性的，而是旨在包括任何能够结合特定分子或实体的结合剂，并且任何适合的结合剂可以用于本发明的方法中。也将清楚的是，术语核小体旨在包括单核小体和寡核小体以及可以在流体介质中分析的任何染色质片段。

本发明的另一方面提供了能够特异性结合生物标志物的配体或结合剂，例如天然存在的或化学合成的化合物。根据本发明的配体或结合剂可以包含能够特异性结合生物标志物的肽、抗体或其片段或合成配体例如塑性抗体或适体或寡核苷酸。抗体可以是能够特异性结合生物标志物的单克隆抗体或其片段。根据本发明的配体可以用可检测标志物例如发光、荧光、酶或放射性标志物标记；可选地或另外地，根据本发明的配体可以用亲和标签例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或His(例如六-His)标签标记。或者，可以使用无标记技术(例如ForteBio Inc.的无标记技术)来确定配体结合。

根据本发明的生物传感器可以包含能够特异性结合针对生物标志物的抗体的生物标志物或其结构/形状模拟物。还提供了包含如本文所述的配体或模拟物的阵列。

本发明还提供了如本文所述的一种或多种配体的用途，其可以是天然存在的或化学合成的，并且适合地是肽、抗体或其片段、适体或寡核苷酸，或本发明的生物传感器或本发明的阵列或本发明的试剂盒检测和/或定量生物标志物的用途。在这些用途中，可以对本文定义的生物样品进行检测和/或定量。

鉴定和/或定量可以通过适合于鉴定来自患者的生物样品或生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中的特定蛋白的存在和/或量的任何方法来进行。在本发明的方法中，定量可以通过测量一个或多个样品中生物标志物的浓度来进行。可以在本发明的方法中测试的生物样品包括如上文所定义的那些。可以制备样品，例如适当时稀释或浓缩，并以常规方式储存。

生物标志物的鉴定和/或定量可以通过检测生物标志物或其片段来进行，例如，具有C端截短的片段或具有N端截短的片段。片段长度适合地大于4个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。特别注意，与组蛋白尾部相同或相关序列的肽是特别有用的组蛋白片段。

可以直接检测生物标志物，例如，通过SELDI或MALDI-TOF。或者，生物标志物可以直接或通过与一种或多种配体例如抗体或其生物标志物结合片段的相互作用，或能够特异性结合生物标志物的其它肽，或配体，例如适体或寡核苷酸间接检测。配体或结合剂可具有可检测标记，例如发光、荧光或放射性标记，和/或亲和标签。

例如，检测和/或定量可以通过选自以下的一种或多种方法来进行：SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、1-D基于凝胶的分析、2-D基于凝胶的分析、质谱(MS)、反相(RP)LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和力、HPLC、UPLC和其它基于LC或LCMS的技术。适合的LCMS技术包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA,USA)。也可以使用液相层析(例如高压液相层析(HPLC)或低压液相层析(LPLC))、薄层层析、NMR (核磁共振)光谱。

根据本发明的诊断或监测方法可以包括通过SELDI TOF或MALDI TOF分析样品来检测生物标志物的存在或水平。这些方法也适用于临床筛查、预后、监测治疗结果、确定最有可能对特定治疗反应的患者、用于药物筛选和开发、以及确定药物治疗的新靶标。

鉴定和/或定量分析物生物标志物可以使用涉及能够特异性结合生物标志物的抗体或其片段的免疫学方法进行。适合的免疫学方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别分析物生物标志物上的不同表位的两种抗体进行分析物生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)，直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶免疫测定(EIA)，荧光免疫测定(FIA)，蛋白质印迹，免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如使用金，银或乳胶颗粒，磁性颗粒或Q-点)。免疫学方法可以例如以微量滴定板或条带形式进行。

本发明的免疫测定包括采用酶检测方法的免疫测量测定(例如ELISA)、荧光标记免疫测量测定、时间分辨荧光标记免疫测量测定、化学发光免疫测量测定、免疫比浊测量测定法、颗粒标记免疫测量测定和免疫放射测量测定以及竞争性免疫测定方法，包括标记抗原和标记抗体竞争性免疫测定方法(具有各种标记类型包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和颗粒标记)。所有所述免疫测定方法在本领域中都是众所周知的，例如参见Salgame et al, 1997 and van Nieuwenhuijze et al, 2003。

特定于疾病的关键生物标志物的鉴定对诊断程序和治疗方案的整合至关重要。使用预测性生物标志物可开发适当的诊断工具，例如生物传感器；因此，在本发明的方法和用途中，可以使用生物传感器、微量分析系统、微工程系统、微分离系统、免疫层析系统或其它适合的分析装置进行鉴定和定量。生物传感器可结合用于检测生物标志物、电、热、磁、光学(例如全息图)或声学技术的免疫学方法。使用这样的生物传感器，可以检测生物样品中存在的预期浓度下的靶生物标志物。

如本文所用，术语“生物传感器”是指能够检测生物标志物存在的任何事物。本文描述了生物传感器的实例。

根据本发明的生物传感器可以包含能够特异性结合生物标志物的如本文所述的配体结合剂或配体。这样的生物传感器可用于检测和/或定量本发明的生物标志物。

本发明的生物标志物可以使用结合基于“智能”全息图或高频声学系统的技术的生物传感器来检测，这样的系统特别适用于“条形码”或阵列配置。

在智能全息图传感器(Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK)中，全息图像被存储在聚合物薄膜中，该膜被敏化以与生物标志物特异性反应。暴露时，生物标志物与聚合物反应，导致全息图显示的图像发生变化。测试结果读出可以是光学亮度、图像、图像的颜色和/或位置的变化。对于定性和半定量应用，可以通过目测读取传感器全息图，从而消除对检测设备的需求。当需要定量测量时，可以使用简单的颜色传感器读取信号。样品的不透明度或颜色不会影响传感器的操作。传感器的形式允许多路复用以同时检测多种物质。可以设计可逆和不可逆传感器以满足不同的要求，并且对目的特定生物标志物的连续监测是可行的。

适合地，用于检测本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器将生物分子识别与适合的手段组合，以将样品中生物标志物的存在或定量的检测转换成信号。生物传感器可以适用于“替代位点”诊断测试，例如在病房、门诊部、手术室、住所、场地和工作场所。

检测本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器包括声学、等离子体共振、全息、生物层干涉测量(BLI)和微工程传感器。可以在生物传感器中使用印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声共振器装置和其它新型声电系统来检测本发明的一种或多种生物标志物。

涉及本发明的一种或多种生物标志物的鉴定和/或定量的方法可以在台式仪器上执行，或者可以并入可以在非实验室环境中使用的一次性、诊断或监测平台，例如在医生的办公室或在病人的床边。用于执行本发明的方法的适合的生物传感器包括具有光学或声学读取器的“信用卡”。生物传感器可以被配置成允许收集的数据以电子方式传输给医生以供解释，并因此可以构成电子医学的基础。

诊断方法

根据本发明的另一方面，提供了用于在动物或人受试者中检测或诊断疾病状态的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1的无细胞核小体；和

(ii)使用检测到的核小体相关组蛋白H1水平来鉴定受试者的疾病状态。

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；和

(ii)使用检测到的核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平来鉴定受试者的疾病状态。

根据本发明的另一方面，提供了如下检测或诊断疾病存在的方法：测量或检测体液中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在和/或水平或浓度，并使用检测到的水平作为受试者疾病状态的生物标志物，包括但不限于，疾病的临床诊断、疾病类型或亚型的差异诊断或疾病预后或疾病复发或受试者对治疗方案的易感性的诊断。本领域技术人员将理解，用于诊断测试的体液包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、痰、粪便和其它流体。在一个优选的实施方案中，选作样品的体液是血液、血清或血浆。体液中的核小体相关组蛋白H1或核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型的测定响应水平、浓度或量可以以绝对项或相对项表示，例如但不限于作为存在的总核小体或总DNA水平的比例或与含有另一组蛋白变体或核苷酸或PTM的核小体的水平的比率。

在一个实施方案中，检测或测量无细胞核小体相关的组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型作为一组测量之一。

在本发明的一个实施方案中，提供对照样品，并且关于对照样品的结果定义区分阳性或阴性结果的测定截止水平。这可以是等同于高于或低于对照样品结果水平的任何比例。低于这个水平的患者结果被认为是阴性的，高于这个水平的患者结果被认为是阳性的。也可能存在非常接近截止水平的患者结果的“灰色区域”范围，对此该判定被认为是不确定的和/或应该重复测试。

本领域技术人员将清楚，包含组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体也可以在包括血液、血浆、血清和尿液的生物流体中如下检测：包括从核小体复合物中提取组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型蛋白的程序，随后是用于检测或定量提取的游离组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型蛋白的方法。适合的提取程序包括利用组蛋白基本性质的组蛋白的常用酸提取程序。游离组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的检测可以例如通过游离组蛋白部分的免疫测定来进行。因此，在本发明的一个实施方案中，组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型从包括血液、血浆、血清和尿液的生物流体中提取，并检测提取物中组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在。

本领域已知可以通过免疫测定方法检测作为包含其它部分的复合物的一部分而包含的蛋白的存在。本领域技术人员将清楚，可以在包括血液、血浆、血清和尿液的生物流体中通过包括流体中组蛋白、修饰、同种型或变体本身的直接免疫测定的程序检测含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体。在该程序中，利用针对组蛋白、修饰、同种型或变体上存在的表位的抗体的单抗体免疫测定，或利用针对组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型上存在的两种表位的两种抗体的2-位点免疫测定，用于检测核小体内组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在。因此，在本发明的另一个实施方案中，通过使用免疫测定方法直接在包括血液、血浆、血清、痰、粪便和尿液的生物流体中检测包含在核小体内的组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型。

因此，在本发明的一个实施方案中，组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型从包括血液、血浆、血清、痰、粪便和尿液的生物流体中提取，并且测试提取物。

如本文使用的术语“检测”和“诊断”包括疾病状态的鉴定、确认和/或表征。根据本发明的检测、监测和诊断方法可用于确认疾病的存在，通过评估疾病的发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断方法在评估临床筛查、预后、治疗选择、治疗益处评估(即用于药物筛选和药物开发)的方法中也是有用的。

高效的诊断和监测方法提供了非常强大的“患者解决方案”，通过建立正确的诊断，具有改善预后的潜力，允许快速鉴别最适当的治疗(从而减少不必要的有害药物副作用暴露)，并降低复发率。

在一个实施方案中，所述生物标志物从肿瘤细胞释放。因此，根据本发明的另一方面，提供了用于检测肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：(i)测量与肿瘤细胞相关或从肿瘤细胞释放的生物样品中的生物标志物和(ii)证明所述生物标志物的水平与肿瘤的大小、阶段、攻击性或散布相关。

已知增加的细胞更新、细胞死亡和细胞凋亡导致无细胞核小体的循环水平增加(Holdenrieder et al, 2001)。循环无细胞核小体水平是一种非特异性指示物，出现在各种病况，包括炎性疾病、各种良性和恶性病况、自身免疫疾病以及创伤或缺血后(Holdenrieder et al, 2001)。本领域技术人员将清楚，本发明将应用于已经在受试者中发现循环核小体的各种疾病领域。这些包括但不限于创伤(例如严重受伤或手术)、极限运动(例如跑马拉松)、中风和心脏病发作以及败血症或其它严重感染。

在一个实施方案中，多次重复本发明的方法。该实施方案提供了允许在一段时间内监测检测结果的优点。这种安排将提供监测或评估疾病状态的治疗功效的益处。本发明的这些监测方法可以用于监测发作、进展、稳定、改善、复发和/或缓解。

因此，本发明还提供了在疑似患有疾病的受试者中监测疗法对于所述疾病状态的功效的方法，包括检测和/或定量存在于来自所述受试者的生物样品中的生物标志物。在监测方法中，测试样品可在两次或更多次的情况下获取。该方法可以进一步包括将测试样品中存在的生物标志物的水平与一个或多个对照和/或较早取自相同测试受试者的一个或多个先前测试样品比较，例如，在开始疗法之前，和/或在疗法的较早阶段来自相同的测试受试者。该方法可以包括检测在不同情况下获得的测试样品中生物标志物的性质或量的变化。

因此，根据本发明的另一方面，提供了用于评估动物或人受试者对于医学治疗的适合性的方法，其包括以下步骤：

(ii)使用检测的核小体相关组蛋白H1的水平作为选择用于受试者的适合治疗的参数。

(ii)使用检测的核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平作为选择用于受试者的适合治疗的参数。

(i)检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1的无细胞核小体；

(ii)一次或多次重复检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1的无细胞核小体；和

(iii)使用检测的核小体相关组蛋白H1水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。

(ii)一次或多次重复检测或测量受试者体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体；和

(iii)使用检测的核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。

根据本发明的另一方面，提供了用于在人或动物受试者中监测疗法对于疾病状态的功效的方法，包括：

(i)定量本文定义的生物标志物(即组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型)的量；和

(ii)比较测试样品中所述生物标志物的量与一个或多个对照和/或在较早时间取自同一测试受试者的一个或多个先前测试样品中存在的量。

将理解的是，本文所述的对于“生物标志物”的提及是指组蛋白H1本身或组蛋白H1修饰、变体或同种型。

测试样品中生物标志物水平相对于较早取自相同测试受试者的先前测试样品中水平的变化可以指示有益效果，例如，所述疗法对病症或疑似病症的稳定或改善。此外，一旦治疗已经完成，可以周期性地重复本发明的方法以便监测疾病的复发。

用于监测疗法功效的方法可以用于监测现有治疗和新疗法在人受试者和非人动物(例如在动物模型中)的治疗有效性。这些监测方法可以并入新药物质和物质组合的筛选中。

在另一个实施方案中，由于快速起效疗法导致的更快速变化的监测可以在数小时或数天的更短时间间隔内进行。

本文描述了诊断和监测疾病状态存在的诊断试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒另外含有能够鉴定和/或定量生物标志物的生物传感器。适合地，根据本发明的试剂盒可以包含一种或多种选自以下的组分：对生物标志物或生物标志物的结构/形状模拟物特异的配体结合剂或配体、一种或多种对照、一种或多种试剂和一种或多种消耗品；任选地连同根据本文定义的任何方法使用试剂盒的说明书。

用于疾病状态的生物标志物的鉴定允许诊断程序和治疗方案的整合。可以使用本发明的生物标志物的检测以在参与临床试验之前筛选受试者。生物标志物提供指示治疗反应、不应答、不利副作用概况、服药依从性程度和足够血清药物水平的实现的手段。生物标志物可用于提供不良药物反应的警告。生物标志物可用于个性化疗法的开发，因为评估反应可用于微调剂量，最大限度地减少处方药物的数量，减少获得有效治疗的延迟并避免药物不良反应。因此，通过监测本发明的生物标志物，可精确地调整患者护理以匹配由患者的病症和药物基因组学概况确定的需求，因此生物标志物可用于滴定最佳剂量、预测阳性治疗反应并鉴定那些有严重副作用高风险的患者。

基于生物标志物的测试为“新”患者提供了第一线评估，并为准确和快速诊断提供了客观量度，而这些都是采用目前手段无法实现的。

此外，诊断性生物标志物测试可用于鉴定患有轻度或无症状疾病或可能处于发生症状性疾病高风险的家族成员或患者。这允许启动适当的疗法或预防手段，例如，管理风险因素。这些方法被认为可以改善结果并可以预防疾病的明显发作。

生物标志物监测方法、生物传感器和试剂盒作为患者监测工具也是至关重要的，以使医生能够确定复发是否是由于病症恶化所致。如果药物治疗被评估为不足，则可以恢复或增加疗法；适当时，可改变疗法。由于生物标志物对疾病状态敏感，它们提供了药物疗法影响的指示。

用于检测疾病存在的生物标志物是发现延缓或阻止病症进展的新靶标和药物分子的重要靶标。由于生物标志物的水平指示病症和药物反应，生物标志物可用于在体外和/或体内测定中鉴定新型治疗化合物。本发明的生物标志物可用于筛选调节生物标志物活性的化合物的方法中。

因此，在本发明的另一方面，提供了如所述的结合剂或配体的用途，其可以是根据本发明的肽、抗体或其片段或适体或寡核苷酸；或根据本发明的生物传感器或根据本发明的阵列；或根据本发明的试剂盒鉴定能够促进和/或抑制生物标志物产生的物质的用途。

此外，提供了鉴定能够促进或抑制受试者中生物标志物产生的物质的方法，包括将测试物质给予受试动物并检测和/或定量受试者测试样品中存在的生物标志物的水平。

治疗方法

根据本发明的另一方面，提供了在动物或人受试者中治疗选自以下的疾病的方法：癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎，所述方法包括以下步骤：

(ii)使用检测的核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型的水平以鉴定受试者的疾病状态；和

(iii)手术治疗步骤(ii)中诊断为患有所述疾病的患者的受试者或给予其治疗剂。

本文所述的方法可以进一步包括将生物样品中存在的生物标志物的水平与一种或多种对照比较。在一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康(或“正常”)患者和/或具有相关良性疾病的患者。在另一个实施方案中，来自一种或多种对照的生物样品获自健康患者。

因此，根据本发明的另一方面，提供了在有需要的个体中治疗疾病的方法，其包括向在生物样品中如本文定义的被鉴定为具有不同水平的生物标志物(当与从对照受试者获得的生物样品中的所述生物标志物的水平相比时)的患者给予治疗剂的步骤。

在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一个实施方案中，癌症选自：乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肠癌、肝癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、口腔癌、头颈癌、白血病和骨肉瘤。

用于治疗所述疾病的治疗剂和手术方法是本领域技术人员熟知的。治疗癌症的方法包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法或其它治疗剂(例如药物或生物疗法，例如单克隆抗体)。

鉴定生物标志物的方法

根据本发明的另一方面，提供了鉴定用于检测疾病状态存在的生物标志物的方法。如本文所用的术语“鉴定”意指确认存在于生物样品中的生物标志物的存在。定量样品中存在的生物标志物的量可以包括测定样品中存在的生物标志物的浓度。鉴定和/或定量可以直接在样品上进行，或间接地在其提取物上或其稀释物上进行。

根据本发明的另一方面，提供了用于鉴定组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物以检测或诊断动物或人的疾病状态的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量患病受试者的体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平；

(ii)检测或测量对照受试者的体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平；和

(iii)使用在患病和对照受试者中检测到的水平之间的差异来鉴定特定的组蛋白H1修饰、变体或同种型是否可用作该疾病的生物标志物。

本领域技术人员将清楚，对照受试者可以在各种基础上进行选择，其可以包括例如已知没有疾病的受试者或可以是具有不同疾病的受试者(例如，用于差异诊断的研究)。

根据本发明的另一方面，提供了用于鉴定组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物以评估患病动物或人受试者的预后的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量患病受试者体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平；和

(ii)将在患病受试者体液中检测到的含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平与受试者的疾病结果相关联。

根据本发明的另一方面，提供了鉴定待用于选择对于需要治疗的患病动物或人受试者的治疗方案的组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物的方法，其包括以下步骤：

(ii)将在患病受试者体液中检测到的含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平与在那些受试者中观察到的治疗方案的功效相关联。

根据本发明的另一方面，存在提供了鉴定待用于监测患病动物或人受试者的治疗的组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物的方法，其包括以下步骤：

(i)检测或测量患病受试者体液中含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平；

(ii)在受试者的疾病进展期间一次或多次重复所述检测或测量；和

(iii)将在患病受试者体液中检测到的含有组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的水平与受试者中的疾病进展相关联。

根据本发明的另一方面，提供了通过本文定义的方法鉴定的生物标志物。

试剂盒

根据本发明的另一方面，提供了用于检测或测量含有组蛋白H1的无细胞核小体的试剂盒，所述试剂盒包含对组蛋白H1或其组分部分，或核小体或其组分部分的结构/形状模拟物特异的配体或结合剂，以及根据本文定义的任何方法使用试剂盒的说明书。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测或测量含有特定的组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的试剂盒，所述试剂盒包含对组蛋白H1修饰、变体或同种型或其组分部分，或核小体或其组分部分的结构/形状模拟物特异的配体或结合剂，以及根据本文定义的任何方法使用试剂盒的说明书。

提供诊断或监测试剂盒用于进行本发明的方法。这样的试剂盒将适当地包含用于检测和/或定量生物标志物的根据本发明的配体，和/或本文所述的生物传感器，和/或阵列，任选地连同使用试剂盒的说明书。

本发明的另一方面是用于检测疾病状态的存在的试剂盒，其包含能够检测和/或定量本文定义的一种或多种生物标志物的生物传感器。

应理解的是，本文所述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都通过引用并入本文，如同完全阐述的那样。

本发明现在将参照以下非限制性实施例进行说明。

实施例1

将含有无细胞核小体的人血液样品连续稀释并测定除核心组蛋白以外还含有组蛋白H1的无细胞核小体的存在。测定方法如下：将涉及结合共同H1表位(其在所有或大部分H1变体中存在)的抗组蛋白H1捕获抗体稀释于0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4中，并加入到微量滴定孔(100 µL/孔)并在4℃孵育过夜以用捕获抗体包被孔。倾析过量的抗组蛋白H1抗体。将牛血清白蛋白(20g/L)的溶液加入孔(150 µL/孔)并在室温下孵育60分钟以封闭孔上过量的蛋白结合位点。倾析过量的牛血清白蛋白溶液，并用洗涤缓冲液(200 µL/孔，含1％吐温20的0.05M TRIS/HCl缓冲液pH7.5)洗涤孔两次。将样品(10 µL/孔)和测定缓冲液(50 µL/孔,0.05M TRIS/HCl pH 7.5，含有0.9% NaCl, 0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40替代物)加入孔中，在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。将样品和测定缓冲液混合物倾析，并用洗涤缓冲液(200 µL/孔)将孔洗涤三次。加入涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的标记检测抗体溶液(50 µL/孔)，在室温在轻微搅拌下孵育90分钟。倾析过量的检测抗体，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入含有链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的溶液(50 µL/孔)并在室温在轻微搅拌下孵育30分钟。倾析过量的缀合物，再次用洗涤缓冲液(200 µL/孔)洗涤孔三次。加入有色底物溶液(100 µL/孔，2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)并在室温在轻微搅拌下孵育30分钟。加入含有1％十二烷基硫酸钠的STOP溶液(100 µL/孔)，并使用标准微量滴定板读取仪在405nm波长下测量孔的光密度(OD)。观察到随着核小体相关的组蛋白H1浓度增加而颜色增加的可再现剂量响应曲线，且在不存在核小体相关组蛋白H1的情况下观察到低背景信号。阳性ELISA信号表明通过ELISA检测到的组蛋白H1被掺入无细胞核小体内。

实施例2

将含有无细胞核小体的人血液样品连续稀释并测定除了核心组蛋白以外还含有组蛋白H1的无细胞核小体的存在。测定方法类似于实施例1中所述的方法，但是利用涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的捕获抗体和涉及结合所有或大部分H1变体中存在的共同H1表位的标记检测抗体。

实施例3

测定含有无细胞核小体的人血清或血浆样品中除了核心组蛋白之外还含有翻译后修饰的组蛋白H1的无细胞核小体的存在。该测定方法类似于实施例1中所述的测定方法，但是利用涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的捕获抗体和涉及结合H1 PTM表位(例如组蛋白H1分子，其包含通过乙酰化、单甲基化、二甲基化或三甲基化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、瓜氨酸化、羟基化、糖基化、亚硝基化、谷氨酰胺化和/或异构化修饰的氨基酸残基)的标记检测抗体。

实施例4

测定含有无细胞核小体的人血液样品中除了核心组蛋白之外还含有翻译后修饰的组蛋白H1的无细胞核小体的存在。该测定方法类似于实施例3中所述的测定方法，但是利用涉及结合H1 PTM表位的捕获抗体和涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的标记检测抗体。

实施例5

测定含有无细胞核小体的人血清或血浆样品中除了核心组蛋白之外还含有组蛋白H1变体的无细胞核小体的存在。该测定方法类似于实施例1中所述的测定方法，但是利用涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的捕获抗体和涉及结合组蛋白H1变体H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1.6、H1.7、H1.8或组蛋白变体H1.10特异的表位的标记检测抗体。

实施例6

测定含有无细胞核小体的人血液样品中除了核心组蛋白之外还含有组蛋白H1变体的无细胞核小体的存在。该测定方法类似于实施例5中描述的方法，但是利用涉及结合组蛋白H1变体H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1.6、H1.7、H1.8或组蛋白变体H1.10特异的表位的捕获抗体和涉及结合任何核小体核心表位或DNA表位的标记检测抗体。

实施例7

测定含有无细胞核小体的人血清或血浆样品中除核心组蛋白外还含有组蛋白H1分子和加合蛋白的无细胞核小体加合物的存在。该测定方法类似于实施例1中所述的方法，但是利用涉及结合任何组蛋白H1表位的捕获抗体和涉及结合加合到核小体的蛋白的标记检测抗体，例如涉及特异性结合高迁移率族蛋白(例如HMGB1)、多梳(polycomb)蛋白、染色质修饰酶、DNA修饰酶、转录因子、构筑或结构蛋白、转录增强因子、转录抑制因子、复制蛋白、DNA损伤修复蛋白或核激素受体(例如雌激素受体、雄激素受体、维生素D或视黄酸受体或甲状腺受体分子)的抗体。

实施例8

测定含有无细胞核小体的人血清或血浆样品中除核心组蛋白外还含有组蛋白H1分子和加合蛋白的无细胞核小体加合物的存在。该测定方法类似于实施例7中所述的测定方法，但是利用涉及结合加合到核小体的蛋白的捕获抗体和涉及结合任何组蛋白H1表位的标记检测抗体。

参考文献

Allen et al, (2004) Nucleic Acids Research 32(3): e38

Boulard et al, (2010) Epigenetics & Chromatin 3(8): 1-13

Cell Biolabs, Inc. Product Manual for “Global DNA Methylation ELISA Kit(5’-methyl-2’-deoxycytidine Quantitation”, (2011)

Dai et al, (2011) J Vis Exp. 50

Deligezer et al, (2008) Clinical Chemistry 54(7): 1125–1131

Epigentek Group Inc, Methylamp™ Global DNA Methylation QuantificationKit, User Guide, Version 2.0802, (2009)

Esteller, (2007) Nature Reviews Genetics 8: 286-298

Feinberg and Vogelstein, (1983) Nature 301: 89–92

Grutzmann et al, (2008) PLoS ONE 3(11): e3759

Hervouet et al, (2010) PLoS ONE 5(6): e11333

Hua et al, (2008) Molecular Systems Biology 4; Article number 188

Herranz and Esteller, (2007) Methods Mol Biol. 361: 25-62

Holdenrieder et al, (2001) Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 95: 114–120

Holdenrieder et al, (2001) Clin Chem Lab Med 39(7): 596–605

Holdenrieder et al, (2005) Clinical Chemistry 51(8): 1544-1546

Holdenreider and Stieber, (2009) Critical Reviews in Clinical LaboratorySciences 46(1): 1–24

Izzo and Schneider, (2015) Biochimica et Biophysica Acta S1874-9399 (15)189-3

Kapoor et al, (2010) Nature 468: 1105-1111

Mansour et al, (2010) PLoS ONE 5(12): e15585

Moore et al, (2008) The Lancet Oncology 9(4): 359 - 366

Ogoshi et al, (2011) Genomics 98(4): 280-7

Pennings et al, (2005) Briefings in functional genomics and proteomics 3(4): 351-361

Rodriguez-Paredes and Esteller, (2011) Nature Medicine 17(3): 330-339

Salgame et al, (1997) Nucleic Acids Research 25(3): 680-681

Scaffidi, (2015) BBA – Gene Reg. Mechanisms: doi: 10.1016/j.bbagrm.2015.09.008Sporn et al, (2009) Oncogene 28(38): 3423-8

Stroud et al, (2011) Genome Biology 12: R54

Tachiwana et al, (2011) Acta Cryst. D67: 578-583

Ting Hsiung et al, (2007) Cancer Epidemiology,Biomarkers & Prevention 16(1): 108-114

van Nieuwenhuijze et al, (2003) Ann Rheum Dis 62: 10–14

Vasser et al, (2009) Genetic Engineering and Biotechnology News, 29(7)

Whittle et al, (2008) PLoS Genet 4(9): 1-17

Zee et al, (2010) Epigenetics & Chromatin 3(22): 1-11

Zhang et al, (2011) Analytical Biochemistry413(2): 164-170。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.包含组蛋白H1蛋白或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体，其用作诊断癌症、子宫内膜异位、自身免疫疾病、炎性疾病、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

2.权利要求1的包含组蛋白H1蛋白的无细胞核小体，其用作诊断癌症、子宫内膜异位、自身免疫疾病、炎性疾病、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

3.权利要求1的包含组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体，其用作诊断癌症、子宫内膜异位、自身免疫疾病、炎性疾病、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺疾病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

4.权利要求1-3中任一项的核小体，其中核小体是无细胞单核小体或寡核小体。

5.权利要求1-4中任一项的核小体，其中在血液样品中测量无细胞核小体。

6.权利要求1-5中任一项的核小体，其中癌症是膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、食管癌、肾癌、大肠癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌或胃癌。

7.权利要求6的核小体，其中癌症是结肠癌、肺癌、口腔癌或胰腺癌。

8.用于检测样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

9.用于检测样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

(i)使样品与结合非组蛋白H1核小体表位的第一结合剂接触；

10.用于检测样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

11.权利要求8至10中任一项的方法，其中所述结合剂是抗体。

12.权利要求8至11中任一项的方法，其中所述样品是生物流体。

13.权利要求8至12中任一项的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。

14.用于检测细胞中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的方法，如权利要求8至13中任一项所定义，其包括以下步骤：

(i)从细胞中分离染色质；

(iii)根据权利要求8至13中任一项的方法检测或测量所述核小体中组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的存在。

15.用于检测血液、血清或血浆样品中含有组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的核小体的存在的方法，其包括以下步骤：

16. 用于检测或诊断动物或人受试者的疾病状态的方法，其包括以下步骤：

17. 用于评估动物或人受试者对于医学治疗的适合性的方法，其包括以下步骤：

18.用于监测动物或人受试者的治疗的方法，其包括以下步骤：

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中核小体相关组蛋白H1或核小体相关组蛋白H1修饰、变体或同种型作为一组测量之一被检测或测量。

20.鉴定用于检测或诊断动物或人受试者中疾病状态的组蛋白H1修饰、变体或同种型生物标志物的方法，其包括以下步骤：

(iii)使用在患病和对照受试者中检测到的水平之间的差异来鉴定组蛋白H1修饰、变体或同种型是否可用作所述疾病状态的生物标志物。

21.通过权利要求20的方法鉴定的生物标志物。

22.用于检测无细胞核小体相关的组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型的试剂盒，其包含对组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型或其组分部分，或组蛋白H1或组蛋白H1修饰、变体或同种型或其组分部分的结构/形状模拟物特异的配体或结合剂，以及根据权利要求8至20的任一方法使用试剂盒的说明书。

23.无细胞核小体相关的组蛋白H1作为诊断癌症、子宫内膜异位、自身免疫疾病、炎性疾病、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

24.无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型作为诊断癌症、子宫内膜异位、自身免疫疾病、炎性疾病、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

Claims

1.包含组蛋白H1蛋白或组蛋白H1修饰、变体或同种型的无细胞核小体，其用作诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物。

(i)使样品与结合非组蛋白H1核小体表位的第一结合剂接触；

11.权利要求8至10中任一项的方法，其中所述结合剂是抗体。

(i)从细胞中分离染色质；

21.通过权利要求20的方法鉴定的生物标志物。

23.无细胞核小体相关的组蛋白H1作为诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。

24.无细胞核小体相关的组蛋白H1修饰、变体或同种型作为诊断癌症、心肌病、系统性红斑狼疮、结肠炎、慢性阻塞性肺病、克罗恩病和类风湿性关节炎的生物标志物的用途。