CN114901832A - 分离循环核小体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体，特别是疾病来源的核小体的方法。这样的方法允许与疾病来源的核小体相关的遗传学和表观遗传学标记物的改进的分析。

Description

分离循环核小体的方法

技术领域

本发明涉及富集和分离循环的无细胞核小体，尤其是疾病来源的核小体的方法。这种方法允许与疾病来源的核小体相关的遗传学和表观遗传学标记物的改进的分析。

背景技术

细胞DNA以一种叫做染色质的蛋白核酸复合物存在。核小体是染色质结构的基本单位，并由缠绕在蛋白复合物周围的DNA组成。DNA缠绕在连续的核小体周围，其结构常常被说成像“串珠(beads on a string)”，且这形成了开放或常染色质的基本结构。在致密的或异染色质中，该串盘绕和超级盘绕成一个封闭而复杂的结构。

染色质中的每个核小体由有八个高度保守的核心组蛋白(包括组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对)的蛋白复合物组成。在这个复合物周围包裹着大约145个碱基对(bp)的DNA。另一种组蛋白H1可能位于核心组蛋白之外的核小体上，结合另一个20bp的DNA，产生含有约165bp的DNA的核小体(或染色小体)。组蛋白H1据说充当接头组蛋白，且另外的DNA常常被称为“接头DNA”，即染色体中连接一个核小体和另一个核小体的DNA。在染色体中分离两个核小体的接头DNA有时比20bp长，且长度可能高达80bp。

成年人类的正常细胞更新涉及每天大量的持续的细胞产生(通过细胞分裂)和细胞死亡。在凋亡过程中，染色质被分解为单核小体和寡核小体，其中一些可能在循环中发现。据报道，在正常情况下，健康受试者中发现的循环核小体水平较低。在患有多种病况(包括许多癌症、自身免疫疾病、炎症、中风和心肌梗死)的受试者中发现升高的水平(Holdenrieder & Stieber, 2009)。死细胞中的核小体也可能流入其他体液，例如尿液、粪便或痰。据报道，循环无细胞核小体主要包含单核小体和相关的DNA，其在细胞死亡时通过消化染色质作为染色质片段产生。

DNA异常是所有癌症疾病的特征。癌细胞的DNA在许多方面不同于健康细胞的DNA，包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数、微卫星异常、DNA链完整性和核苷酸修饰(例如5位处胞嘧啶的甲基化)。为了临床诊断、预后和治疗选择的目的，在活检或手术中去除的癌细胞或组织中，对DNA结构或序列中这些与肿瘤相关的改变进行常规研究。不同肿瘤类型之间以及同一肿瘤疾病的不同患者之间的肿瘤遗传学和表观遗传学特征不同。此外，在同一患者的同一癌症中，随着疾病的进展和在对药物或其他疗法的获得性抗性的发展中，这些特征会随着时间变化。因此，对手术或活检时去除的细胞中的肿瘤DNA的系列研究，可帮助临床医生评估最小残留病、预测患者预后、为患者选择适当的治疗、监测疾病进展，且在早期(可能比放射检测早几个月)检测任何复发或获得性治疗抗性，并允许治疗过程中可能成功的改变。

然而，组织DNA检验有局限性，因为侵入性活检程序不能对患者重复进行。对于一些患者，可能根本不使用活检。活检操作昂贵，让患者感到不适，造成患者风险，并可能导致手术并发症。此外，患者的肿瘤可能由位于同一肿瘤的不同区域或不同转移灶(转移癌)内的多个肿瘤克隆组成，并非所有克隆都可通过活检取样。因此，在特定时刻在位于肿瘤的不同区域的不同肿瘤克隆中，组织活检DNA研究在时间和空间上提供肿瘤的快照。

癌症患者的血液含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，这被认为是由于染色质片段或核小体从垂死或死亡的癌细胞释放到循环中而产生的。肿瘤来源的ctDNA以与单核小体预期尺寸一致的小DNA片段的形式循环。对癌症患者相匹配的血液和组织样品的研究表明，患者肿瘤中(但不在他/她的健康细胞中)存在的癌症相关突变也存在于取自相同患者的血液样品的ctDNA中(Newman等人, 2014)。类似地，癌细胞中差异甲基化(通过胞嘧啶残基甲基化的表观遗传学改变)的DNA序列也可以作为循环ctDNA中的甲基化序列检测到。此外，包含ctDNA的无细胞循环DNA(cfDNA)的比例与肿瘤负荷有关，所以可以通过存在的ctDNA比例对疾病进展进行定量监测，也可以通过它的遗传学和/或表观遗传学组分对疾病进展进行定性监测。ctDNA分析可以产生非常有用且临床上精确的数据，所述数据与源自肿瘤内所有或许多不同克隆并在空间上整合了肿瘤克隆的DNA有关。此外，随时间重复采样是一种更实际和更经济的选择。ctDNA分析有可能彻底改变肿瘤的检测和监测，以及在早期检测复发和获得性抗药性，以便通过没有侵入性组织活检程序的肿瘤DNA研究来选择肿瘤治疗方法。这种ctDNA检验可用于研究所有类型的癌症相关DNA异常(例如点突变、核苷酸修饰状态、易位、基因拷贝数、微卫星异常和DNA链完整性)，并适用于常规癌症筛查、定期和更频繁的监测和定期检查最佳治疗方案(Zhou等人, 2012)。

血液、血浆或血清可用作ctDNA测定的基质，且可采用任何DNA分析方法，包括但不限于遗传DNA测序、表观遗传学DNA测序分析(例如，对于含有5-甲基胞嘧啶的序列)、PCR、BEAMing、NGS(靶向或全基因组)、数字PCR、等温DNA扩增、冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR)、MAP(MIDI激活焦磷酸分解)、PARE(重排末端的个性化分析)和质谱。

由于DNA异常是所有癌症疾病的特征，并且ctDNA已在其已被研究的所有癌症疾病中观察到，因此ctDNA检验在所有癌症疾病中都具有潜在的适用性。研究的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、头颈部癌和骨肉瘤(Crowley等人, 2013年；Zhou等人, 2012；Jung等人，2010)。ctDNA检验的性质现在将通过概述一些(非限制性)示例方法来说明。

第一个实例涉及检测ctDNA中一个与癌症相关的基因序列突变。涉及检测ctDNA中单个基因突变的血液检验通常具有低临床敏感性。这有两个原因。首先，尽管所有癌症都有突变，但特定癌症疾病中任何特定突变的频率通常较低。例如，尽管K-ras和p53突变被认为是较频繁的癌症突变中的两种，并已在包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌在内的广泛的癌症中进行了研究，但它们分别在23%-64%和17%-54%的癌组织样品中被检测到。第二，即使患者的癌组织中确实含有突变，患者血液中存在的突变ctDNA的水平或浓度可能较低而难以检测。例如，在0%-75%的K-ras和p53组织阳性患者的ctDNA中可以检测到K-ras和p53突变。这两种效应的总和意味着，在少于40%的癌症患者血液中检测到K-ras或p53突变(Jung等人, 2010)。

第二个实例涉及检测ctDNA中多个与癌症相关的基因序列突变。尽管任何特定基因(例如K-ras或p53)的突变可能只存在于少数癌症中，但所有癌症都含有突变，因此，足够大的突变组原则上应该有助于检测大多数甚至所有肿瘤。因此，提高此类检验的临床敏感性的一种方法是检验许多基因的广泛突变。Newman等人对非小细胞肺癌(NSCLC)采取了这种方法，并研究了139个反复突变基因的521个外显子和13个内含子序列。研究的突变涵盖多种癌症相关基因改变，包括单核苷酸变异(SNV)和融合基因。通过这种方式，作者报告了在ctDNA血液检验中检测到多于95%的II-IV期肿瘤和50%的I期肿瘤，特异性为96%(Newman等人, 2014)。

第三个实例涉及检测ctDNA中特定基因序列的癌症相关表观遗传学改变。这种方法可以应用于任何DNA或核苷酸修饰。这种方法的一个主要实例是检测某些癌症中胞嘧啶残基上差异甲基化的基因。为了达到这一目的，对多种癌症中的大量基因进行了研究。其中一些是在膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌中研究的SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、T1G1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2和RARβ2。通常使用亚硫酸氢盐转化测序方法，其中从血浆中提取DNA，且然后用亚硫酸氢盐处理，其将未修饰的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。然后可以应用测序、PCR或其他方法来确定是否存在特定的甲基化基因序列。该方法的一个说明性实例是检测ctDNA中的甲基化SEPTIN-9以检测结直肠癌(CRC)，据报道，该方法检测到48%的CRC病例，临床特异性为91% (Church等人, 2014)。

第四个实例是“片段组学”方法，涉及循环DNA片段的序列分析以及与组织和细胞系的核酸酶可及位点分析(也称为DNA酶超敏分析)结果的比较。在该方法中，任何细胞类型的全基因组DNA蛋白占用模式都可以通过细胞中开放(非蛋白结合的)DNA的核酸酶消化来建立。蛋白结合的DNA不受核酸酶消化的影响，且提取后可对其测序，以鉴定细胞类型的独特DNA蛋白占用模式(或未占用的开放DNA模式)。循环cfDNA片段同样受到蛋白结合的保护，所述蛋白在性质上可能是组蛋白(如在核小体中的)，或者也可能是其他蛋白(例如转录因子)。cfDNA片段的界限与它们与核小体、转录因子或其他蛋白的结合有关，且通过对个体的cfDNA测序获得的片段模式可以构建到核小体和其他蛋白占用的图谱中。这种cfDNA占用图谱可以与已知组织或癌细胞系的占用图谱进行比较，后者是作为核酸酶可及位点图谱衍生的。据报道，该方法表明，如健康个体的cfDNA测序显示，调节元件和基因体中的核小体间距与淋巴和髓细胞系的占用模式密切相关。晚期癌症患者的cfDNA测序显示出与癌细胞系的占用图谱最密切相关的另外的占用模式，常常与患者癌症的解剖起源相匹配(Snyder等人,2016)。这表明，对cfDNA模式的核小体和其他蛋白占用分析既可用于检测癌症，且也有可能用于鉴定癌症的器官部位。

第五个实例涉及分析受试者的癌细胞和健康细胞的全局基因组DNA甲基化模式。健康细胞的DNA在整个基因组中显示出全局分散的甲基化模式，这反映了特定细胞和组织的表观遗传学状态。细胞从健康状态过渡到恶性癌细胞涉及DNA甲基化(5-甲基胞嘧啶)的全局净损失，以及基因组调控(如基因启动子)区域内5-甲基胞嘧啶残基水平的局部增加，伴随着短的DNA区域内聚集了大量CpG位点。因此，癌细胞具有DNA的全局低甲基化，但确实出现的甲基化DNA(5-甲基胞嘧啶)倾向于密集地聚集在小区域。这意味着来自癌细胞的ctDNA片段倾向于非常低甲基化或非常高甲基化，且介于两者之间的ctDNA片段相对很少(即在甲基化水平的两个极端)，而来自正常细胞的DNA具有在两个极端之间不同的甲基化模式，且倾向于更适度地甲基化。癌症DNA的这些特性已被用作癌症物理化学检查的基础(Sina等人, 2018)。

与所有这些ctDNA分析方法相关的主要问题是癌症患者cfDNA的突变等位基因分数(MAF—特定基因组位置的突变等位基因比例)较低。这些方法的ctDNA分析靶标在更大量造血来源的循环cfDNA中稀释。这意味着由肿瘤来源的ctDNA构成的cfDNA比例较低，这对所有ctDNA分析方法造成了限制。出于这个原因，增加患者样品的MAF已成为ctDNA领域工作者的目标。cfDNA片段的MAF是尺寸依赖性的，且长度为90-150bp大小的cfDNA片段比更大的cfDNA片段具有更高的MAF，且因此具有更高的ctDNA分数。

Mouliere等人, 2018表明，富集较小的cfDNA片段的样品导致更高的MAF、更高的ctDNA分数和ctDNA检测/分析结果的改善，以及癌症检测的临床结果的改善。通过生物信息学(in silico)方法对254名患者进行了ctDNA尺寸选择。然而，对35名患者进行了体外尺寸选择方法，以使用基于物理凝胶的方法对ctDNA进行物理富集，观察到的ctDNA富集更好，且癌症检测的临床结果得到改善。然而，该方法不适合常规临床使用。

据报道，癌症患者比健康受试者具有更高的cfDNA水平。该领域的工作者报告，健康受试者的cfDNA范围高达100 ng/ml(平均30 ng/ml)，而患癌受试者的cfDNA范围高达1000 ng/ml(平均180 ng/ml) (Schwarzenbach等人, 2011)。循环cfDNA由多种尺寸的DNA分子组成，长度可达20,000bp (Zhou等人, 2012)。与ctDNA主要以单核小体循环的假设一致，癌症患者测得的循环无细胞核小体水平(与DNA水平一样)高于健康受试者(Holdenrieder等人, 2001)。然而，循环核小体本身的水平升高并没有被临床用作癌症的生物标记物，因为核小体是细胞死亡的非特异性产物，且在许多涉及细胞死亡升高的病况(包括急性创伤)都观察到了水平升高(Holdenrieder和Stieber, 2009)。作为细胞死亡的产物，循环核小体水平在使用细胞毒性药物或放射疗法治疗时也会显著升高。然而，核小体也会从循环中清除，因此水平可能会随着治疗猛增，且然后下降(Holdenrieder等人,2001)。

尽管循环无细胞核小体本身的水平尚未在临床实践中用作癌症的基于血液的生物标记物，但循环无细胞核小体的表观遗传学组分(在其组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA修饰和加合物含量方面)已作为癌症中基于血液的生物标记物进行了研究(参见WO 2005/019826; WO 2013/030577; WO 2013/030579; WO 2013/084002)。

有多种方法可用于从血液、血清或血浆中提取cfDNA，且对这些方法在提取DNA的产量和提取不同长度DNA片段的效率方面进行了比较。苯酚-氯仿和碘化钠提取方法提供最高的产量，并提取长度小于200bp的小DNA片段。据报道，其他检验方法(包括商业上可购的方法)具有较低的DNA提取产量，且可能无法提取长度小于200bp的小DNA片段(Fong等人,2009)。

从血液、血清或血浆中提取cfDNA以分析ctDNA通常使用商业上可购的DNA提取产品进行。这种提取方法声称有循环DNA的高回收率(>50%)，且一些产品(例如，Qiagen生产的QIAamp循环核酸试剂盒)声称提取小尺寸的DNA片段。使用的典型样品体积在1-5mL血浆范围内。

由于一些限制，目前还没有基于ctDNA的检验广泛日常用于常见癌症的检测或诊断。主要的方法限制是对高质量DNA的要求。由于样品的性质，目前的ctDNA采样方法产生的ctDNA样品质量差。主要困难在于循环中存在大量非肿瘤cfDNA，这使ctDNA的任何分析复杂化。不同工作者的估计各不相同，但循环中存在的ctDNA分数可能太低而无法检测。对于大多数癌症患者来说，ctDNA分数只占cfDNA的一小部分。例如，最近的研究报告称，在治疗前的肺癌患者中，ctDNA分数随着肿瘤尺寸的增加而增加。在肿瘤负荷较大的患者中发现最高水平为3.2%，但发现大多数患者具有低于0.1%的ctDNA分数(Newman等人, 2014)。这意味着对于许多患者样品，必须在存在更高水平的非肿瘤来源的cfDNA的情况下分析非常低水平的ctDNA。此外，这种非肿瘤来源的cfDNA来自相同受试者，并因此具有相似的序列，且会干扰ctDNA的任何定量或分析方法。

尽管癌症患者的cfDNA水平常常升高，但ctDNA分数低且总ctDNA水平可能低于观察到的cfDNA增加。这可能表明，至少部分cfDNA的增加可能是肿瘤相关的，可能与肿瘤环境或基质有关，而不是直接来源于含有癌症相关DNA突变的恶性癌细胞。

在测量循环无细胞核小体和/或作为癌症生物标记物的循环核小体的表观遗传学组分时，也会出现类似的问题，即低MAF或低肿瘤相关或肿瘤来源分数。核小体本身是细胞死亡的指示物，且作为身体正常细胞更新过程的一部分以及在与细胞死亡水平升高相关的病况下释放，例如自身免疫疾病、中风、败血症、创伤后、烧伤、心肌梗死、脑卒中、器官移植后的移植物排斥期间和剧烈运动后。这意味着肿瘤来源的核小体与各种细胞和组织来源的其他非肿瘤核小体一起循环，且可能构成所有循环核小体的一小部分。非肿瘤核小体将干扰任何用于肿瘤相关核小体或肿瘤来源核小体的定量或表观遗传学分析的方法。在其他体液中可能出现类似的效应。例如，粪便可能含有结直肠癌细胞来源的核小体和相关DNA，以及源自健康结肠或直肠细胞的核小体。痰中可能含有肺癌细胞来源的核小体和相关DNA，以及源自健康肺细胞的核小体。在其他体液中将出现类似的效应。

因此，迫切需要更好的方法从体液样品中富集肿瘤来源或肿瘤相关的DNA和核小体。还需要分析方法来区分肿瘤和非肿瘤循环无细胞核小体，以改进癌症疾病状态的检测。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使样品与结合剂接触，所述结合剂结合经剪切的组蛋白分子(其中组蛋白尾的全部或部分缺失)；

(ii)从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离纯化的循环肿瘤DNA(ctDNA)的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)进行如本文所定义的方法；和

(ii)从分离的核小体中提取DNA。

根据本发明的又一方面，提供诊断癌症的方法，其包括：

(i)进行如本文所定义的方法，以从得自患者的生物样品中分离循环肿瘤核小体；和

(ii)分析分离的循环肿瘤核小体和/或相关的DNA。

根据本发明的又一方面，提供获得优先结合疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使用含有约150个碱基对或更少碱基对的DNA的核小体作为抗原，针对所述抗原产生抗体或其他结合剂；

(ii)将在步骤(i)中获得的抗体或其他结合剂呈递给含有约165个碱基对或更多碱基对的DNA的核小体；和

(iii)选择结合步骤(i)中的核小体但不结合步骤(ii)中的核小体的抗体或其他结合剂。

根据本发明的又一方面，提供获得优先结合非疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使用含有约165个碱基对或更多碱基对的DNA的核小体作为抗原，针对所述抗原产生抗体或其他结合剂；

(ii)将在步骤(i)中获得的抗体或其他结合剂呈递给含有约150个碱基对或更少碱基对的DNA的核小体；和

(iii)选择结合步骤(i)中的核小体但不结合步骤(ii)中的核小体的抗体或其他结合剂。

附图说明

图1. 与肿瘤来源和非肿瘤来源的循环核小体或染色质片段相关的循环DNA片段(bp)的尺寸分布图。大多数肿瘤来源的DNA片段长度小于150bp，而大多数非肿瘤来源的DNA片段长度大于150bp。

图2. 用H1蛋白结合核小体的结果。H1蛋白(重组H1和小牛胸腺来源的H1蛋白两者)结合含有接头DNA的多核小体，但不结合不含接头DNA的单核小体(含有147bp DNA的重组单核小体)。对于H2A、H2B、H3或H4组蛋白蛋白质未观察到核小体结合。

图3. 用MBD2蛋白结合核小体的结果。涂覆在珠上的MBD2蛋白结合含有高水平甲基化DNA的多核小体和核小体。

图4. 用MECP2蛋白结合核小体的结果。MECP2(一种MBD蛋白)结合含有接头DNA的核小体(HeLa多核小体)，但不结合不含接头DNA的核小体(含有147bp DNA的单核小体)。

图5. 使用MBD蛋白结合临床样品中核小体的ELISA测定结果。在28个人血浆样品中，将MBD作为ELISA测定的结合剂进行检验。结果表明，蛋白可以用作结合物以检测临床样品中的核小体。

图6. 结合含有接头DNA的核小体的抗体的产生。抗体对含有167bp或187bp DNA的单核小体有较高(且近似相等)的亲和力，但对含有147bp DNA的核小体的亲和力要低得多。

图7. 含有经剪切组蛋白的核小体的免疫测定结果。(A)靶向组蛋白H3(抗体对1)尾端附近的表位的测定对含有完整组蛋白H3的核小体具有强信号，但对通过组织蛋白酶消化去除(剪切)一些尾部的核小体具有降低的信号。靶向含有完整或经剪切的组蛋白H3(抗体对2)的核小体中存在的表位的测定不会出现这种效应。(B)旨在仅检测含有经剪切的组蛋白H3的核小体的测定，对含有完整组蛋白H3的核小体没有信号，但对经组织蛋白酶处理的核小体有强信号。

图8.使用用化学发光标记抗体分析的组蛋白H1.0蛋白的结果。由结合到各种核小体部分(与组蛋白1.0结合)的化学发光标记的抗组蛋白H3.1抗体产生的光信号(以相对光单位(RLU)表示)。结果显示与磁珠连接的H1.0蛋白结合Hela多核小体和Hela单核小体和含有167bp DNA的重组单核小体，但不结合含有147bp DNA(即不含接头DNA)的重组单核小体。

图9. 使用组蛋白H1蛋白进行蛋白印记分析的结果。使用标记的抗组蛋白H3.1抗体对与连接于磁珠的组蛋白H1蛋白结合的蛋白产生蛋白条带。结果显示，暴露于Hela多核小体、Hela单核小体和含有167bp DNA的重组单核小体的磁性组蛋白 H1出现条带，但对于含有147bp DNA的重组单核小体(即不含接头DNA)未观察到条带。

图10. 使用组蛋白H1.0蛋白在商业Hela细胞单核小体制剂中分离含有或不含接头DNA的单核小体的结果。(a)商业Hela细胞染色质单核小体制剂的DNA片段尺寸概况。(b)暴露于与磁珠连接的组蛋白H1.0后，相同单核小体制剂的磁性H1.0结合和未结合DNA片段部分的DNA片段尺寸概况。

图11. 在商业Hela细胞单核小体制剂中含有或不含接头DNA的单核小体的分离。用组蛋白H1.0融合蛋白，将涂覆组蛋白H1.0蛋白的MyOne甲苯磺酰基活化磁珠暴露于Hela细胞单核小体制剂中。生物分析仪结果显示，用H1涂覆的磁珠处理样品后，上清液中残留的未结合DNA部分产生了对应于约147bp的DNA尺寸的生物分析仪峰，其与对应于H1结合核小体相关的较长DNA的峰清楚地分离。从未经处理的Hela核小体制剂中提取的DNA在结合和未结合部分之间有一个中等尺寸的峰。结果以荧光单位(FU)对时间(秒)表示。

图12. 使用H1涂覆磁珠分离取自三名结直肠癌患者的血浆样品中含有或不含接头DNA的单核小体。生物分析仪结果显示了未经处理的DNA血浆样品的碱基对尺寸概况，以及用H1涂覆磁珠处理3个结直肠癌血浆样品后，与H1涂覆磁颗粒结合或残留在上清液中的DNA部分概况。结果显示，上清液中未结合的核小体产生了对应于约147bp的DNA尺寸的生物分析仪峰，其与约167bp处对应于结合H1涂覆磁珠的核小体相关的较长DNA的峰清楚地分离。

图13. 使用H1涂覆磁珠分离取自三名结直肠癌患者的血浆样品中含有或不含接头DNA的单核小体。生物分析仪结果显示了用H1涂覆磁珠处理3个结直肠癌血浆样品后，与H1涂覆磁颗粒结合或残留在上清液中的DNA部分碱基对尺寸概况。在所有6种情况下，结果显示，上清液中未结合的核小体产生了对应于约147bp的较短DNA尺寸的生物分析仪峰，其与约167bp处对应于结合H1涂覆磁珠的核小体相关的较长DNA的峰清楚地分离。

图14. 使用H1涂覆磁珠分离取自两名健康志愿者的血浆样品中含有或不含接头DNA的单核小体。生物分析仪结果显示了用H1涂覆磁珠处理2个健康血浆样品后，与H1涂覆磁颗粒结合或残留在上清液中的DNA部分碱基对尺寸概况(放大以说明目的DNA片段尺寸分布)。结果显示，与癌症患者相比，健康受试者中未经处理的、结合的和未结合的核小体部分在其相关DNA片段尺寸方面的差异较小。

图15. 使用HMGB1涂覆磁珠分离取自三名癌症患者的血浆样品中含有或不含接头DNA的单核小体。生物分析仪结果显示了用HMGB1涂覆磁珠处理2个肺癌血浆样品和1个CRC血浆样品后，与HMGB1涂覆磁珠结合或残留在上清液中的DNA部分碱基对尺寸概况。结果显示，上清液中未结合的核小体产生了对应于约147bp的DNA尺寸的生物分析仪峰，其与约167bp处对应于结合HMGB1涂覆磁珠的核小体相关的较长DNA的峰清楚地分离。

具体实施方式

我们之前报道了在用于诊断疾病的血液和其他体液中无细胞核小体的表观遗传学分析方法(参见WO2013/030577、WO2013/030578、WO2013/030579、WO2013/084002)。如本文所述，疾病来源的无细胞核小体被释放到循环中，但由于正常(健康)的细胞更新，这些核小体被已存在于循环中的无细胞核小体稀释。任何此类非疾病来源的核小体都会干扰从患病细胞释放的核小体的遗传学或表观遗传学分析。从体液样品中分离和去除非疾病(即健康)来源的无细胞核小体将导致更高纯度的疾病来源的无细胞核小体，提供样品中疾病来源核小体或染色质片段的改进的分析结果。

活细胞染色体中的每个核小体由有八个高度保守的核心组蛋白(包括组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对)的蛋白复合物组成。在这个复合物周围包裹着约145-147个碱基对(bp)的DNA。另一种组蛋白H1可能位于核心组蛋白之外的核小体上，并结合另一个20bp的DNA，产生含有约165bp DNA的核小体(或染色小体)。这个另外的DNA在本领域中被称为“接头DNA”，即连接一个核小体和另一个核小体的DNA。在染色体中，分离两个核小体的DNA可能长于20bp，例如，如果相邻的核小体都含有H1，则长度可能高达80bp。

我们之前已经报道，来源于肿瘤的无细胞核小体比来源于健康细胞的核小体含有组蛋白H1的频率更低(参见WO 2017/068371)。可以利用这种差异，使用H1抗体结合物对疾病相关或衍生核小体进行免疫亲和富集，以分离含有或不含组蛋白H1的核小体。

我们现在报道可以用其他手段分离核小体。这些手段利用基于与接头DNA的存在或不存在相关的核小体特征对核小体的分离。Underhill等人研究了大鼠中人类癌症异种移植产生的ctDNA片段的尺寸范围，并与健康大鼠cfDNA的尺寸范围进行了比较。如图1所示，循环DNA片段在长度高达约230bp的尺寸范围内存在。在健康受试者中，循环cfDNA主要是造血来源的，且具有长度约150-230bp内变化的片段尺寸范围，以及对应于循环寡核苷酸的少量较大DNA片段。健康造血cfDNA最常见的尺寸在长度上约为167bp，只有非常小部分的片段小于150bp。造血cfDNA也存在于具有例如癌症和妊娠的状况的受试者中，但也存在约120-150bp的另外较短循环DNA片段。ctDNA片段尺寸呈10bp的周期性，这与核小体DNA螺旋周期性有关，且最常见的尺寸在长度上为134bp和144bp。因此，大多数健康的cfDNA长度大于160bp，而大多数ctDNA长度小于150bp。不受理论约束，发明人推断，大多数非肿瘤(和非胎儿)来源的循环无细胞核小体可被视为含有接头DNA，而肿瘤来源的循环无细胞核小体可被视为不含接头DNA。

类似地，约150bp的短DNA(尤其是约145bp DNA)核小体在孕妇的总循环无细胞核小体中占比高于非孕妇健康受试者，且被认为是胎儿或胎盘来源。

此外，之前显示，使用作为免疫吸附剂固定在固体支撑物上的抗组蛋白H1抗体，可以从血液样品中分离含有组蛋白H1的核小体(WO 2017/068371)。

令人惊讶的是，发明人现在已经证明，作为免疫吸附剂固定在固体支撑物上的蛋白质组蛋白H1(自身)可用于从血浆样品中结合和去除含有接头DNA的核小体。此外，结合含有接头DNA的核小体的其他结合蛋白也可以类似的方式用于从血清或血浆或其他体液样品中结合和去除含有接头DNA的核小体。定向结合与含有接头DNA的核小体结合的分子的抗体或其他结合物，也可以类似的方式用于从血清或血浆或其他体液样品中结合和去除含有接头DNA的核小体。

包含接头DNA的核小体

本发明人已经发现，分离可以通过以下发生：(i)使用组蛋白特征(例如H1)结合接头DNA，(ii)使用(非组蛋白)染色质结合蛋白结合接头DNA，(iii)使用抗体或其他结合物来结合与接头DNA结合的染色质结合蛋白，或(iv)使用结合接头DNA相关的核小体特征的抗体或其他结合物。

因此，根据本发明的第一方面，提供从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

应当理解，第一方面的方法可用于去除含有接头DNA的核小体并分离不含接头DNA的核小体的负选择方法。因此，根据本发明的第二方面，提供从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体

在一个实施方案中，结合核小体相关接头DNA的结合剂是选自组蛋白H1、macroH2A或其片段或工程改造类似物的组蛋白蛋白质。

在一个实施方案中，结合核小体相关接头DNA的结合剂为组蛋白H1或其片段或工程改造类似物。因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与组蛋白H1接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合组蛋白H1的核小体。

应当理解，本发明的方法可使用组蛋白H1或其片段或工程改造类似物来进行。组蛋白H1具有本领域已知的若干种同种型。在一个实施方案中，组蛋白H1为组蛋白H1.0。

本文所述的分离方法可用于分离疾病(或胎儿)来源的核小体(由于不存在接头DNA)。因此，在一个实施方案中，提供从生物流体样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与组蛋白H1接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合组蛋白H1的核小体。

一些表观遗传学核小体特征与核小体相关接头DNA和/或组蛋白H1相互作用或影响核小体相关接头DNA和/或组蛋白H1的稳定性。例如，组蛋白同种型macroH2A(也称为“mH2A”)的基本接头在核小体的入口/出口位点稳定接头DNA (Bowerman和Wereszczynski,2016)。macroH2A的存在也取代了组蛋白H1与体内染色小体的天然结合。因为这个原因，macroH2A可被视为接头DNA的内部核小体结合物，其包括结合接头DNA的元件或结构域。因此，在一个实施方案中，macroH2A或接头DNA结合序列、macroH2A的结构域或其工程改造类似物可用作结合核小体相关接头DNA的高亲和力结合物。

在一个实施方案中，结合核小体相关接头DNA的结合剂是macroH2A或其片段或工程改造类似物。因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与macroH2A或其片段或工程改造类似物接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合macroH2A的核小体。

除了组蛋白蛋白质外，许多(非组蛋白)染色质结合蛋白也可用于结合接头DNA。此类蛋白包括但不限于克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶(DNMT)、高迁移率族或高迁移率族盒蛋白(HMG或HMGB)、聚[ADP-核糖]聚合酶(PARP)、含甲基-CpG结合结构域(MBD)的蛋白，例如MECP2和某些以非序列依赖方式与核小体接头DNA结合的转录因子，例如转录因子p53。

在一个实施方案中，结合剂与结合含有接头DNA的核小体的染色质结合蛋白结合。在接头DNA存在的情况下，提及的结合核小体的“染色质结合蛋白”是指结合无细胞核小体的接头DNA部分(即加合)的蛋白。因此仅在存在接头DNA的情况下优先或选择性结合的染色质结合蛋白可用作确定无细胞核小体中是否存在接头DNA的标记物。不受约束的，此类蛋白包括MBD、CHD、DNMT和PARP蛋白家族。可以理解的是，这些蛋白家族包括多个成员。例如，至少有9个CHD家族成员CHD1-CHD9。可以理解的是，术语“染色质”是指当DNA被包装在细胞内时，由DNA和组蛋白蛋白质形成的复合物。因此，组蛋白是染色质的组分，而术语“染色质结合蛋白”不包括组蛋白蛋白质本身。因此，组蛋白蛋白质(例如H1、H2A、H2B、H3和H4)不是染色质结合蛋白，即染色质结合蛋白不是组蛋白蛋白质。

染色质结合蛋白包含DNA结合结构域，其在接头DNA的情况下结合核小体，以便在体内发挥其功能。例如，CHD1通过C末端DNA结合结构域结合接头DNA，并使用源自ATP水解的能量重塑染色质。当将CHD1添加到含有201bp DNA片段的核小体时，观察到的ATP水解活性高，但添加到游离DNA或含有147bp DNA片段的核小体时，观察到的ATP水解活性低或不存在。缺失DNA结合结构域的截短CHD1蛋白不结合核小体或DNA，并且有很少或没有ATP水解活性(Ryan等人, 2011)。

HMG蛋白与组蛋白H1具有类似的核小体接头DNA结合特性。此外，它们和组蛋白H1竞争结合接头DNA和核小体入口/出口二联体，且还保护接头DNA免受核酸酶消化(Nalabothula等人, 2014)。

DNMT1还结合含有至少20bp接头DNA的核小体，并优先甲基化接头DNA，但不结合不含接头DNA的核小体 (Schrader等人, 2015)。

类似地，MBD蛋白MECP2结合含有接头DNA的核小体，并以与组蛋白H1结合类似的方式保护接头DNA免受核酸酶消化，但仅保护约11bp的接头DNA(而不是组蛋白H1的约20bp)(Dhasarathy和Wade, 2008)。

PARP-1以暴露的双链断裂结合含有接头DNA的核小体。在活细胞中，PARP-1结合诱导蛋白的构象变化，导致它的DNA依赖性激活和靶蛋白(包括核心组蛋白)的聚(ADP)-核糖基化(Sultanov等人, 2017)。

由于这些蛋白结合含有接头DNA的单核小体，我们推断此类分子可以直接用于分离、纯化或富集含有接头DNA的单核小体。

因此，在一个实施方案中，结合核小体相关接头DNA的结合剂是染色质结合蛋白或其片段或工程改造类似物。根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与染色质结合蛋白(或其片段或工程改造类似物)接触，所述染色质结合蛋白结合包含接头DNA的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合染色质结合蛋白的核小体。

在一个实施方案中，提供从生物流体样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与染色质结合蛋白接触，所述染色质结合蛋白结合包含接头DNA的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合染色质结合蛋白的核小体。

在一个实施方案中，结合接头DNA的染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶；

(c) 高迁移率族盒蛋白；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶；

(e) 甲基-CpG-结合结构域蛋白；或

(f) 转录因子。

在一个实施方案中，结合接头DNA的染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶；

(c) 高迁移率族盒蛋白；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶；或

(e) 甲基-CpG-结合结构域蛋白。

在一个实施方案中，结合接头DNA的染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白1 (CHD1)；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1 (DNMT1)；

(c) 高迁移率族盒1蛋白(HMGB1)；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶1 (PARP1)；

(e) 选自以下的甲基-CpG-结合结构域蛋白：MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)；或

(f) p53。

在一个实施方案中，结合接头DNA的染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白1 (CHD1)；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1 (DNMT1)；

(c) 高迁移率族盒1蛋白(HMGB1)；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶1 (PARP1)；或

(e) 选自以下的甲基-CpG-结合结构域蛋白：MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)。

染色质部分CHD1、DNMT1、HMGB1、PARP1、MBD和p53是接头DNA的结合物。

本文明确列出的染色质结合蛋白是本领域已知的。这些蛋白的天然序列可在公开可获得的数据库中找到，例如通用蛋白质资源库“UniProt” (CHD1 UniProt ID: O14646;DNMT1 UniProt ID: P26358; HMGB1 UniProt ID: P09429; PARP1 UniProt ID: P09874;MBD1 UniProt ID: Q9UIS9; MBD2 UniProt ID: Q9UBB5; MBD3 UniProt ID: O95983;MBD4 UniProt ID: O95243; MECP2 UniProt ID: P51608)。

组蛋白H1蛋白，或结合含有接头DNA的核小体的任何染色质结合蛋白或蛋白结构域，可被重新工程改造以产生具有更高结合亲和力或改进特异性(例如，以最小化不含接头DNA的核小体的结合)的蛋白或肽或两者。因此，在本发明的一个实施方案中，染色质结合蛋白是具有改变的氨基酸序列的基因重新工程改造蛋白，其更强烈地结合含有接头DNA的核小体和/或不太强烈地结合不含接头DNA的核小体。重新工程改造蛋白的方法在本领域是众所周知的，例如(Wiesler和Weinzierl, 2010)的方法。在一个优选的实施方案中，基因工程改造蛋白是H1的工程改造类似物，即重新工程改造的H1部分。

在一个实施方案中，结合包含接头DNA的核小体的染色质结合蛋白选自CHD、DNMT、HMGB、MBD和PARP蛋白家族。本领域技术人员将清楚，在本发明的背景下，目的蛋白结构域主要是DNA结合结构域，并且任何其他结构域(例如，任何酶结构域或染色质重塑结构域)可能不是必需的。因此，可以使用本文公开的结合蛋白片段。因此，在另一个实施方案中，结合蛋白包含染色质结合蛋白的DNA结合结构域，所述染色质结合蛋白在核小体的环境下结合接头DNA。

在一个优选的实施方案中，将组蛋白H1蛋白或染色质结合蛋白涂覆在固体支撑物上，例如琼脂糖(sepharose)、sephadex、塑料或磁珠。在一个实施方案中，所述固体支撑物包含多孔材料。在另一实施方案中，对组蛋白H1蛋白或染色质结合蛋白进行衍生以包含标签或接头，其可用于将组蛋白H1或染色质结合蛋白附着至经衍生以结合标签的合适支撑物。许多此类标签和支撑物是本领域已知的(例如，Sortag、点击化学、生物素/链霉亲和素、his标签/镍或钴、GST标签/GSH、抗体/表位标签等)。为便于使用，组蛋白H1蛋白或染色质结合蛋白涂覆的支撑物可包含在装置内，例如微流控装置。

在一个实施方案中，与核小体相关的接头DNA和衍生化组蛋白H1或染色质结合蛋白之间的结合可在液相发生(即，在将衍生化组蛋白H1或染色质结合蛋白结合到固体支撑物之前)。然后，可同时或随后使用接头反应实现衍生化组蛋白H1或染色质结合蛋白与固体支撑物的结合。

根据本发明的又一方面，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的循环无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合染色质结合蛋白的结合剂接触，所述染色质结合蛋白结合包含接头DNA的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

在本发明的该方面中，核小体通过其接头DNA的结合是通过蛋白的结合而间接发生的，所述蛋白通过核小体的接头DNA(直接)结合核小体。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从血液、血清或血浆样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合染色质结合蛋白的结合剂接触，所述染色质结合蛋白结合包含接头DNA的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，结合染色质结合蛋白的结合剂选自抗体(或其结合片段)、affimer或适体。在又一个实施方案中，结合剂是抗体。

应理解的是，上文描述的染色质结合蛋白的实施方案(当用作直接核小体结合物时)也适用于本发明的该方面，其中使用针对所述染色质结合蛋白的结合剂(即作为核小体结合的间接方法)。

在一个实施方案中，结合剂定向结合克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白和/或p53。在一个实施方案中，结合剂不定向结合高迁移率族盒蛋白。在又一个实施方案中，结合剂不定向结合甲基-CpG-结合结构域蛋白。

根据本发明的又一方面，提供结合剂，其结合与接头DNA相关的核心核小体特征。提及的与接头DNA相关的“核心核小体特征”是指仅或主要发生在含有接头DNA的核小体中的核心核小体颗粒(例如，核心组蛋白蛋白质之一，例如H2A、H2B、H3或H4，包括翻译后修饰及其同种型)的特征。在一些情况下，核小体特征可结合接头DNA、稳定或保护接头DNA免受核酸酶消化。

含有组蛋白同种型macroH2A的核小体被认为可稳定接头DNA (Bowerman和Wereszczynski, 2016)。本发明人已经发现，这种组蛋白同种型更优先与含有接头DNA的无细胞核小体相关，且因此可以用作从生物样品中分离健康来源的核小体的标记物。因此，在一个实施方案中，与接头DNA相关的核心核小体特征是组蛋白同种型macroH2A。

因此，根据本发明的又一方面，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合macroH2A或其片段的结合剂接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从血液、血清和血浆样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合macroH2A或其片段的结合剂接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

如本文所讨论的，含有或不含接头DNA的核小体可由包裹在核小体周围的DNA长度来定义。因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与工程改造成选择性结合包含长度大于150个碱基对的DNA的核小体的结合剂接触，其中结合剂结合到与含有接头DNA的核小体相关的核小体特征；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从血液、血清和血浆样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与工程改造成选择性结合包含长度大于150个碱基对的DNA的核小体的结合剂接触，其中结合剂结合到与含有接头DNA的核小体相关的核小体特征；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

基于这些不同特征的分离产生的核小体亚群可能不同，并可用于研究目的的各种应用和临床应用。例如，与健康细胞相比，癌细胞中核小体的结构可能不同。在含有具有混合细胞来源的无细胞核小体的生物样品中，使用定向结合一个或多个这些特征(其在来源于癌细胞的核小体中比健康细胞更常见(反之亦然))的抗体或其他结合物，允许通过正或负选择分离肿瘤来源的无细胞核小体。本发明的应用包括分离肿瘤来源的核小体、在取自孕妇的样品中分离母体和胎儿核小体、从正常循环核小体中分离疾病来源的核小体、分离含有甲基化或非甲基化DNA的核小体，以及分离用于研究或其他目的的各种核小体亚群。

在一个实施方案中，包含长度上约150或更多个碱基对的DNA的核小体是指保留接头DNA的核小体。核小体核心颗粒(即由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对组成的组蛋白八聚体)由约150bp的DNA组成，例如145-150bp的DNA，特别是147bp的DNA。因此，包含大于150bpDNA(例如大于155bp、160bp或165bp的DNA)的核小体含有接头DNA。在一个实施方案中，结合剂结合由至少165个碱基对DNA组成的核小体。在一个实施方案中，结合剂不结合包含约150bp或更少bp的DNA的核小体，即结合剂选择性地结合含有接头DNA的核小体。

在一个实施方案中，结合剂结合接头DNA内的区域。在该实施方案中，结合剂(直接)结合不与组蛋白(核心)八聚体接触的DNA区域，即接头DNA。

本文所述方法可用于分离、富集和/或纯化疾病来源的循环无细胞核小体，特别是从健康来源的循环无细胞核小体中分离、富集和/或纯化。本文提及的“疾病来源”是指源自患病(例如异常或不健康)细胞的核小体和染色质片段。本文提及的“健康来源”是指源自健康(例如正常或非患病)细胞的核小体和染色质片段。

本领域技术人员将理解，当结合剂定向结合与接头DNA相关的特征时，则它可用于结合(和去除)样品中健康来源的核小体，即在样品的未结合部分得到疾病来源的核小体。因此，这可以称为负选择方法。根据使用的是正或负选择方法，将确定分离的是哪个核小体部分(即正选择方法是结合部分或负选择方法是游离/洗脱部分)。

在一个实施方案中，循环无细胞核小体是肿瘤来源的。因此，本方法特别适用于作为富集样品的肿瘤来源的循环无细胞核小体的方法。然后富集的样品可用于后续分析，例如用于诊断方法。

与包含接头DNA的核小体(即包含“约165bp或更长DNA的核小体”或“长核小体”的核小体)相关的可用于分离核小体的特征包括组蛋白H1、macroH2A和结合接头DNA的染色质结合蛋白。在一个实施方案中，接头DNA的结合物(例如组蛋白H1、CHD、DNMT、HMGB、PARP和macroH2A或此类蛋白的DNA结合结构域)可直接用于结合和分离包含接头DNA的核小体。

在本发明的另一方面中，包含接头DNA的核小体可使用针对这些特征的抗体或其他结合物分离，包括针对macroH2A、CHD、DNMT、HMGB和PARP的结合物。在该实施方案中，包含接头DNA且还包含接头DNA的结合物的核小体被分离。任何包含接头DNA但不包含这种特征或结合物的核小体，例如具有“游离”接头DNA的核小体，均未分离。在一个实施方案中，样品可暴露于针对不同特征的结合物的混合物中(例如，固定在固相基质上)，以分离包含接头DNA的核小体，其包含与接头DNA相关的任何数量的不同核小体特征。在另一个实施方案中，样品可连续暴露于针对与接头DNA相关的不同核小体特征的多个结合物中。

应理解，本发明的实施方案可组合使用以结合包含接头DNA的核小体，其另外包含或另外不包含例如H1、CHD、DNMT、HMGB、PARP或macroH2A的特征。组合可涉及将样品连续或同时暴露于多个抗体和/或接头DNA结合蛋白。

如本文所要求的接触和从样品中分离核小体的方法在本领域是众所周知的，并且可以使用任何合适的分离方法。例如，分离方法可包括亲和色谱或磁性抗体珠。例如，如果使用亲和柱色谱装置，则可以理解，样品可通过包含所需结合剂的亲和柱。可收集结合到固相的核小体或穿流液(即未结合的核小体)以进一步分析，这取决于采用的是本文所述的正选择还是负选择方法。

应当理解，无论靶标核小体是否已经包含接头DNA的结合物，都可以使用本发明的结合剂。在这种情况下(即，接头DNA已经结合到另一个分子)，分离基于通过结合本发明使用的结合剂来取代接头DNA的那个结合物，因为与最初结合到核小体的结合物相比，本发明的结合物具有高相对浓度和/或高相对结合亲和力，例如由于平衡和动力学原因。

显然，具有较高结合亲和力的蛋白可能会取代具有较低结合亲和力的蛋白在核小体上的位置，特别是当存在过量的较高结合亲和力蛋白时。取代发生的速度将取决于(目前)结合部分的相对亲和力、浓度和解离速率。在一个实施方案中，H1用作结合剂。H1可用作结合剂，因为它对含有接头DNA的核小体有高的结合亲和力。

在一个实施方案中，肿瘤核小体和循环肿瘤DNA(ctDNA)分离是通过免疫亲和纯化方法进行的，所述方法使用结合剂，例如针对CHD、DNMT、HMGB、PARP、MBD或macroH2A的结合剂。本领域技术人员将清楚，任何能够特异性结合所需靶标的结合剂均可用于本发明的亲和纯化方法。此类结合剂可包括但不限于抗体、适体、affimer或结合蛋白(例如核小体结合蛋白)。

抗体可通过本领域已知的多种方法产生，包括免疫和文库方法，例如噬菌体展示。可针对目的部分或抗原诱导免疫反应，或可选择结合目的部分或抗原的文库。定向结合例如CHD1、DNMT1、HMGB1、PARP1、MBD或macroH2A的抗体可针对包括整个蛋白氨基酸序列的多种这类部分产生，并且可任选地含有进一步的组蛋白翻译后修饰(PTM)。蛋白可从活细胞中纯化或合成产生。或者，可使用代表氨基酸序列的一部分的肽序列，并且它还可以任选地含有组蛋白翻译后修饰。本领域技术人员将清楚，本发明的方法中可使用定向结合所需靶标的任何部分或全部的结合剂。

不含接头DNA的核小体

与短150bp(或更少)DNA核小体优先或选择性相关的特征同样可用于核小体类型的分离。可以理解的是，包含长度小于约150个碱基对的DNA的核小体是指失去其接头DNA的核小体。核小体核心颗粒(即组蛋白八聚体，由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对组成)由约150bp的DNA组成，例如145-150bp的DNA，特别是147bp的DNA。因此，包含小于约150bp DNA(例如小于149bp、小于148bp、小于147bp、小于146bp或小于145bp DNA)的核小体不含接头DNA。在一个实施方案中，结合剂选择性地结合包含小于150bp DNA的核小体，例如小于149bp、148bp、147bp、146bp或145bp的DNA。在一个实施方案中，结合剂结合由小于147bp的DNA组成的核小体。在一个实施方案中，结合剂不结合包含大于150bp DNA的核小体，即结合剂选择性地结合不含接头DNA的核小体。

该方法使用正选择，通过结合不包含接头DNA的核小体来分离(即纯化)疾病来源的核小体。例如，此类特征包括但不限于核心组蛋白尾的剪切和三级折叠模式和/或组蛋白同种型H2AZ的包含。组蛋白H2AZ与核小体相关DNA对核酸酶活性的防护降低有关(Bonisch等人, 2012)，而组蛋白H2AZ水平升高与许多恶性癌症有关(Yang等人, 2018)。因此，在一个实施方案中，与不含接头DNA的核小体相关的核小体特征是组蛋白同种型H2AZ。类似地，染色质蛋白H2Abdb(组蛋白H2A的一种同种型)和CENP-A(组蛋白H3的一种同种型)与核小体相关DNA对核酸酶活性的防护降低有关。据显示，H2Abdb与DNA末端的结合不那么紧密(Bao等人, (2004))，而含有CENP-A的核小体比含有典型H3的核小体更容易分解(Conde eSilva等人, (2007))。因此，在进一步的实施方案中，与不含接头DNA的核小体相关的核小体特征是组蛋白同种型H2Abdb或CENP-A。

上述本发明的先前方面涉及含有接头DNA的核小体的结合剂。我们现在描述不含接头DNA的核小体(即含有约150bp或更少bp的DNA的核小体)的结合剂。因此，根据本发明的又一方面，提供这样的结合剂，其仅结合或优先结合含有短DNA片段、不含接头DNA的核小体的特征。至少有3种类型的此类结合剂，包括(i)“经剪切的组蛋白”的结合物，(ii)核心组蛋白同种型H2AZ的结合物，以及(iii)专门工程改造的结合物，以优先结合含有短DNA片段、不含接头DNA的核小体。

因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂接触，所述结合剂结合经剪切的组蛋白分子(即其中组蛋白尾的全部或部分缺失)；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

除了球状结构域外，核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4还包含突出核小体外的组蛋白尾。组蛋白尾可能经历多种翻译后修饰(PTM)，包括甲基化、乙酰化、丙酰化、丁基化、巴豆酰化、2-羟基异丁基化、丙二酰化、琥珀酰化、甲酰化、泛素化、瓜氨酸化、磷酸化、O-GlcNAc糖基化和ADP-核糖基化。染色质内不同的组蛋白修饰以协调的方式起作用，以调节基因转录。组蛋白的化学PTM通常通过组蛋白修饰酶选择性酶添加或消除组蛋白修饰来发生。然而，多个预先存在的PTM也可能通过组蛋白尾的调节性蛋白水解或剪切同时被物理和不可逆地去除。在组蛋白H3上，据报道在21位氨基酸附近发生剪切(Yi和Kim, 2018)。

如本文使用的术语“经剪切的组蛋白”是指组蛋白分子，其中组蛋白尾的全部或部分已被去除。当去除组蛋白尾，核小体保留其球状结构，但核小体内的组蛋白剪切使相关DNA越来越容易被核酸酶降解(Dhaenens等人, 2014)。因此，经剪切的核小体的结合物可以用作结合不含接头DNA的核小体的手段。

因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂接触，所述结合剂结合包含组蛋白分子(其中组蛋白尾的全部或部分被去除)的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

本发明的该方面可用于分离含有接头DNA的核小体(即未结合的核小体)和不含接头DNA的核小体(即通过结合剂结合的经剪切的组蛋白)。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂接触，所述结合剂结合包含组蛋白分子(其中组蛋白尾的全部或部分被去除)的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，含有经剪切的组蛋白分子的核小体包含小于155个碱基对的DNA。在又一个实施方案中，含有经剪切的组蛋白分子的核小体包含小于150个碱基对，例如小于148个碱基对的DNA或小于147个碱基对的DNA。

在一个实施方案中，结合剂结合经剪切的组蛋白H3蛋白。在又一个实施方案中，结合剂在氨基酸残基30之后的表位(即氨基酸残基30-33处的表位)处结合组蛋白H3。

或者，可在检测/分离经剪切的组蛋白的负选择方法中使用结合组蛋白尾的结合剂。因此，根据本发明的又一方面，提供从生物流体样品中分离无细胞核小体的方法(例如通过亲和纯化)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合核小体的组蛋白尾的结合剂接触；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

本发明的该方面可用于分离不含接头DNA的核小体(即未结合的核小体)和含有接头DNA的核小体(包含被结合剂结合的组蛋白尾的核小体)。

在一个实施方案中，结合剂结合组蛋白H3的组蛋白尾。在又一个实施方案中，结合剂在氨基酸残基30之前的表位处(即氨基酸残基4-8处的表位)结合组蛋白H3。

组蛋白同种型H2AZ与核小体不稳定性和核小体相关DNA对核酸酶活性的防护降低有关。含有组蛋白同种型H2AZ2.2的核小体特别易受DNA消化的影响(Bonisch等人， 2012)，因此组蛋白H2AZ的结合物可用作结合含有长度小于约150bp的短DNA片段且无接头DNA的核小体的手段。因此，在一个实施方案中，结合剂结合组蛋白H2AZ。在一个优选的实施方案中，H2AZ分子为H2AZ2.2。

因此，根据本发明的又一方面，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂接触，所述结合剂结合包含组蛋白H2AZ分子的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂接触，所述结合剂结合包含组蛋白H2AZ分子的核小体；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

结合物可以被专门工程改造成结合含有短DNA片段、不含接头DNA的核小体，而不结合或弱结合包含接头DNA的核小体(或染色小体)。此类结合剂可用于通过分离结合的不含接头DNA的核小体来富集生物样品的肿瘤相关核小体或胎儿核小体。类似地，结合物可以被专门工程改造成结合含有接头DNA的核小体，而不结合或弱结合含有短DNA片段、不含接头DNA的核小体。此类结合剂也可用于通过分离未结合的不含接头DNA的核小体来富集生物样品的肿瘤相关核小体或胎儿核小体。在一个优选的实施方案中，通过涉及正选择和负选择的文库选择方法(例如通过噬菌体展示文库抗体开发)来工程改造抗体结合物。通过将噬菌体抗体文库暴露于不含接头DNA的核小体(例如，由核心组蛋白蛋白质和145bp DNA片段组装而成的合成核小体)来进行正选择。在第一步中，任何强烈结合不含接头DNA的核小体的抗体被选作候选物。然后对表达正抗体的噬菌体进行第二个负选择步骤，其中将它们暴露于含有接头DNA的核小体(例如，由核心组蛋白蛋白质和约167bp或187bp的DNA片段组装而成的合成核小体)。任何结合含有接头DNA的核小体的抗体在第二步被拒绝。结合不含接头DNA的核小体但不结合含接头DNA的核小体的剩余抗体被选作适用于本发明的抗体结合物。由于特异于这些核小体的构象结构和/或在接头DNA的存在下不可结合的核小体表位(例如，由于空间位置的原因)，但在不存在接头DNA的核小体中未被掩盖，因此此类抗体可定向结合仅存在于无接头DNA的核小体中的核小体表位。

根据本发明的又一方面，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂结合，所述结合剂工程改造成选择性结合包含长度小于约150个碱基对的DNA的核小体，其中结合剂结合与不含接头DNA的核小体相关的核小体特征；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中不结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，提供通过亲和纯化从血液、血清和血浆样品中分离疾病或胎儿来源的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合剂结合，所述结合剂工程改造成选择性结合包含长度小于约150个碱基对的DNA的核小体，其中结合剂结合与不含接头DNA的核小体相关的核小体特征；和

(ii) 从样品中分离在步骤(i)中结合结合剂的核小体。

在一个实施方案中，核小体包含长度约147个碱基对的DNA，例如长度约145个碱基对的DNA。

结合剂

本领域技术人员将清楚，任何能够特异性结合所需靶标的结合剂均可用于本发明的方法。此类结合剂可包括但不限于抗体、affimer、适体或结合蛋白(例如核小体结合蛋白)。在一个实施方案中，结合剂选自抗体(或其片段)、affimer或适体，特别是抗体。

在一些实施方案中，组蛋白H1、macroH2A或染色质结合蛋白(优先结合接头DNA)本身被用作本发明方法中的结合剂。发明人惊奇地发现，此类蛋白可直接用作结合剂。不受理论约束，根据先前理解组蛋白H1将结合接头DNA(即与本文所述的染色质结合蛋白相同的区域)的事实，这些替代性结合蛋白特别令人惊讶，且因此出人意料的是可使用替代性结合剂。此外，本发明的方法可用于通过结合具有不同表观遗传学标记物的核小体，从样品中分离不同的核小体类型。

可以理解的是，在本发明的方法中可以使用结合剂的组合，即制备结合剂组以富集不同类型的核小体。因此，在一个实施方案中，使样品与多于一种类型的结合包含接头DNA的核小体的结合剂接触。

核小体和DNA分析

通过本发明方法分离的核小体和/或相关DNA可通过免疫测定、质谱、DNA测序(即分析相关DNA的特定基因序列或甲基化基因序列)、表观遗传学信号结构或其他特征分析。

一旦核小体部分(特别是为疾病(例如肿瘤)来源富集的核小体部分)被分离出来，可分析核小体相关DNA，例如分析其遗传或DNA序列标记物。因此，在一个实施方案中，所述方法包括：

(i) 使用如本文所定义的方法分离(即富集)疾病来源的核小体；和

(ii) 分析与步骤(i)中分离的核小体相关的DNA。

在一个优选的实施方案中，从疑似或诊断为癌症的受试者收集血浆样品。通过如本文所述的方法分离或富集血浆样品中不含接头DNA的核小体。提取为肿瘤来源富集的核小体相关的DNA，以产生长度约小于150bp的尺寸选择DNA片段文库。对DNA进行癌症相关突变异常和/或突变等位基因分数和/或基因甲基化异常分析。

可采用任何DNA分析方法，包括但不限于DNA测序(包括下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析)、BEAMing、PCR(包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR))、等温扩增、杂交、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)。

DNA分析可包括对任何遗传DNA标记物的分析，包括核苷酸取代、核苷酸插入、核苷酸缺失、甲基化DNA序列或其他DNA序列突变。在此类分析中可研究的典型癌症相关DNA异常包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数突变、微卫星异常、DNA链完整性和基因甲基化状态。

已经发现，癌症患者中通常有大量基因突变，但任何特定的突变可能仅在小部分癌症患者中发生。然而，所有癌症患者都确实有一些突变，因此在任何特定患者中检测到至少一种突变的概率随着检验的潜在突变的数量而增加。因此，通常检验一组基因突变。这样的组可包括但不限于ABL1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2A、AJUBA、AKT1、AKT2、AKT3、ALB、ALK、AMER1、APC、APEX1、APLNR、APOB、AR、ARAF、ARHGAP35、ARID1A、ARID2、ARID5B、ATF7IP、ATM、ATP11B、ATR、ATRX、ATXN3、AURKA、AXIN1、AXIN2、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L11、BCL9、BCOR、BIRC2、BIRC3、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD7、BTG2、BTK、CARD11、CASP8、CBL、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD44、CD70、CD79B、CDH1、CHD3、CHD8、CDK12、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN2A、CDKN2B、CEBPA、CHD4、CHEK2、COL5A1、CREBBP、CSF1R、CSNK2A1、CTNNB1、CTNND1、CUL1、CUL3、CYP2C19、CYP2D6、DACH1、DCUN1D1、DDR2、DICER1、DNMT3A、DPYD、EEF2、EGFR、ELF3、EP300、EPHA2、EPHA3、EPHA5、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ESR1、EZH2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCI、FANCL、FAS、FAT1、FBXW7、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FOXA2、FOXQ1、GAS6-AS1、GATA1、GATA2、GATA3、GATA6、GNA11、GNAQ、GNAS、H3F3A、H3F3C、HGF、HIST1H3B、HNF1A、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、IL6、IL6ST、IL7R、INSR、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KDR、KEAP1、KIT、KNSTRN、KRAS、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、LYN、MAGOH、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K4、MAPK1、MDM2、MDM4、MECOM、MED12、MEN1、MET、MGA、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH3、MSH6、MTOR、MUC6、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYO18A、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NKX2-1、NKX2-8、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP133、NUP93、PALB2、PAX5、PBRM1、PD-1、PDGFRA、PDGFRB、PD-L1、PD-L2、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、POLD1、POLE、PPP2R1A、PPP6C、PRKAR1A、PRKCI、PRKDC、PSIP1、PMS2、PTCH1、PTEN、PTMA、PTPDC1、PTPN11、PTPRC、PTPRD、RAC1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAF1、RARA、RASA1、RB1、RBM10、RET、RFC1、RHEB、RHOA、RHOB、RICTOR、RNF43、ROS1、RPS6KA3、RPS6KB1、RPTOR、RQCD1、RRAS2、RUNX1、RUNX1T1、RXRA、SCAF4、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SIN3A、SLX4、SMAD2、SMAD4、SMARCA1、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOS1、SOX17、SOX2、SOX9、SPOP、SPTA1、SPTAN1、SRC、SRSF2、STAG2、STAT3、STK11、TAF1、TBL1XR1、TBX3、TCEB1、TCF12、TCF7L2、TET2、TGFBR2、TGIF1、THRAP3、TLR4、TMSB4X、TNFAIP3、TOP1、TOP2A、TP53、TPMT、TRAF3、TSC1、TSC2、TSHR、TXNIP、U2AF1、UGT1A1、UNCX、USP9X、VHL、WHSC1、WT1 XPO1和ZFHX3基因中的一个或多个突变。

类似地，许多基因已被研究作为癌症中差异胞嘧啶甲基化状态的标记物。其中一些是SEPTIN-9、APC、DAPK、GSTP1、MGMT、p16、RASSF1A、TIG1、BRCA1、ERα、PRB、TMS1、MLH1、HLTF、CDKN2A、SOCS1、SOCS2、PAX5、PGR、PTGS2和RARβ2。

此外，根据本发明的另一方面，提供从生物流体样品中分离纯化的循环肿瘤DNA(ctDNA)的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 进行如本文所定义的方法；和

(ii) 分析分离的核小体的DNA。

本发明的该方面特别适用于分析不含接头DNA的核小体(即，在本发明的第二方面中分离的核小体)，因为此类核小体被预测为疾病来源的。任选地，在分析之前提取与分离的核小体相关的DNA。分析提取的DNA的许多方法是本领域已知。或者直接分析DNA，即不需要提取。

如果分离的无细胞核小体是肿瘤来源的，则作为存在于原始(未经处理)样品中的核小体的一部分检测的分离的肿瘤核小体水平可作为样品中构成循环肿瘤DNA(ctDNA)的DNA比例的指示物。此外，相反的水平是样品中健康来源的DNA的比例。因此，本文所述的方法可用于检测样品中ctDNA的水平/比例，或检测此类水平随时间的变化。这种测量类似于ctDNA中癌症相关突变的突变等位基因分数测量，且可用作肿瘤负荷和疗法反应的量度。

对于为疾病(例如肿瘤)来源富集的核小体，也可分析表观遗传学标记物(“表观遗传学表位”)，或用进一步的富集方法。因此，在一个实施方案中，所述方法包括：

(i) 通过如本文所定义的方法分离(即富集)疾病来源的无细胞核小体；

(ii) 分析步骤(i)中分离的无细胞核小体。

在一个实施方案中，分析步骤包括分析分离的无细胞核小体的表观遗传学核小体特征，或与核小体加合的其他蛋白的存在，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H1、H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸、经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)，或其组合。

检测到的富集的含有经修饰的核苷酸、组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型或核小体蛋白加合物的疾病来源的无细胞核小体的存在或水平可作为疾病状态、疾病预后、疾病监测、治疗监测、最小残留病或疾病对特定治疗的易感性的指示物或用于其他临床应用。

分离的疾病来源的核小体的分析可涉及任何合适的分析方法，其中许多是本领域已知的。这些方法包括但不限于使用针对常见核小体表位(例如DNA)或目的表观遗传学结构(包括组蛋白修饰、组蛋白变体、DNA修饰或与核小体加合的另一分子)的抗体或其他结合物，通过免疫测定的分析。这些方法包括WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579和WO 2013/084002中描述的所有方法，其通过引用并入本文。在不受限制的情况下，这些方法中的任何一种都可以与本发明组合使用。这些方法还包括用于分析疾病来源的循环核小体中存在的多种表位的多重方法。

通过本发明方法分离的疾病来源核小体的分析还可涉及本领域已知的任何蛋白组学方法，包括但不限于电泳方法、色谱法和任何涉及质谱的方法，包括涉及色谱和质谱和/或稳定同位素标记质谱的方法和/或涉及蛋白消化以产生用于通过质谱或与任何其他方法一起的任何组合质谱法进行鉴定和/或定量的肽的方法。

在一个实施方案中，表位选自组蛋白修饰(例如组蛋白翻译后修饰[PTM])、经修饰的核苷酸、组蛋白变体或同种型、或核小体加合物或其变体。在又一个实施方案中，经修饰的核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。

文献中已经描述了多种表观遗传学修饰的核苷酸，并且已知DNA和/或DNA核苷酸残基中的表观遗传学修饰模式在癌症中改变。这些中描述最详细的包括5位处胞嘧啶的甲基化，即“5-甲基胞嘧啶”。含有5-甲基胞嘧啶的DNA常常被称为“甲基化DNA”。据估计，与健康细胞的DNA相比，癌细胞中DNA的甲基化降低约50% (Guerrero Preston等人, 2007；Soares等人, 1999)。然而，与癌症相关的循环核小体水平的增加可能是数倍(Holdenrieder等人, 2001和Schwarzenbach等人, 2011)。

进一步表观遗传学表位的测定可单独进行，或作为测定组的一部分进行。

在一个实施方案中，对从本文所述方法获得的分离核小体样品进行进一步富集步骤。因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括将分离的核小体与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触。先前已经显示，组蛋白3同种型(H3.1、H3.2和H3t)可用于ctDNA富集。

获得结合剂的方法

如本文所述的核小体相关DNA片段尺寸的差异可用于设计和获得用于本发明的结合剂。获得优先结合短(例如小于150bp DNA)核小体的结合物或抗体的一种方法是使用含有约147bp DNA的重组或合成核小体作为抗原，针对其来产生抗体。在该方法的一个优选方面，为了负选择的目的，也测试结合短DNA核小体的抗体或结合物对于更长的约167bp DNA核小体的结合。通过该方法，可以选择并产生结合短DNA核小体但不结合长DNA核小体的抗体，作为富集或纯化短DNA核小体的试剂。

根据本发明的又一方面，提供获得优先结合疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使用含有约150个碱基对或更少碱基对的DNA的核小体作为抗原，针对其产生抗体或其他结合剂；

(ii) 将在步骤(i)中获得的抗体或其他结合剂呈递给含有约165个碱基对或更多碱基对的DNA的核小体；和

(iii) 选择结合步骤(i)的核小体但不结合(或仅弱结合)步骤(ii)的核小体的抗体或其他结合剂。

根据本发明的又一方面，提供获得优先结合非疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使用含有约165个碱基对或更多碱基对的DNA的核小体作为抗原，针对其产生抗体或其他结合剂；

(ii) 将在步骤(i)中获得的抗体或其他结合剂呈递给含有约150个碱基对或更少碱基对的DNA的核小体；和

(iii) 选择结合步骤(i)的核小体但不结合(或仅弱结合)步骤(ii)中的核小体的抗体或其他结合剂。

在一个实施方案中，用作抗原的核小体是重组或合成核小体。用于生成或检验短核小体结合物的核小体可含有约150个碱基对或更少，例如147个碱基对或更少，或145个碱基对或更少。用于生成或检验含有接头DNA的核小体结合物的核小体(或寡核小体或其他染色质片段)可含有约155个碱基对或更多，例如160个碱基对或更多，或165个碱基对或更多，或167个碱基对或更多。

在所述方法的一个优选实施方案中，噬菌体展示文库抗体选择用于识别抗体。例如，噬菌体展示文库可用于结合短DNA核小体的噬菌体系的正选择，以及结合长DNA核小体的噬菌体系的负选择。因此，在一个实施方案中，所述方法包括噬菌体展示文库抗体选择。

根据本发明的又一方面，提供产生结合物的方法，所述结合物选择性地结合含有接头DNA的核小体，同时不结合或弱结合含有短DNA片段的核小体(即不含接头DNA的核小体)，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使结合物文库与核小体接触，

(ii) 分离步骤(i)中结合包含大于约165个碱基对的DNA的核小体的结合物，

(iii) 将步骤(ii)中分离的结合物与包含长度小于约150个碱基对的DNA的核小体接触；和

(iv) 分离步骤(iii)中不结合或弱结合包含长度小于约150个碱基对的DNA的核小体的结合物。

因此，根据本发明的又一方面，提供产生结合物的方法，所述结合物选择性地结合含有短DNA片段的核小体(即不含接头DNA的核小体)，同时不结合或弱结合含有接头DNA的核小体，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使结合物文库与核小体接触，

(ii) 分离步骤(i)中结合包含小于150个碱基对的DNA的核小体的结合物，

(iii) 将步骤(ii)中分离的结合物与包含长度大于165个碱基对DNA的核小体接触；和

(iv) 分离步骤(iii)中不结合或弱结合包含长度大于165个碱基对的核小体的结合物。

使用抗体结合物的方法

在另外的实施方案中，本文所述的方法还可包括使步骤(i)中结合的样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触。因此，所述方法可使用两种结合剂，以测定通过本文所述方法分离的核小体的含量。

在本发明的免疫测定方法中，可使用选择性结合含有接头DNA的核小体或选择性结合不含接头DNA的核小体的抗体作为此类核小体的直接量度。根据本发明的又一方面，提供了用于检测或测量不含接头DNA的核小体的免疫测定，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与选择性结合不含接头DNA的核小体的抗体结合剂接触；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中不含接头DNA的无细胞核小体的量度。

根据本发明的又一方面，提供了用于检测或测量含接头DNA的核小体的免疫测定，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与选择性结合含接头DNA的核小体的抗体结合剂接触；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中含接头DNA的无细胞核小体的量度。

在本发明的富集方法中，也可使用选择性结合含有接头DNA的核小体或选择性结合不含接头DNA的核小体的抗体。

使用非抗体结合物的免疫测定方法

发明人惊奇地发现，结合核小体的蛋白可直接用于无细胞核小体的分离和检测方法。这种方法避免了产生抗体的需要，而是可利用天然蛋白质。因此，根据又一方面，提供了结合蛋白用于从体液样品分离无细胞核小体的用途。

根据本发明的又一方面，提供在生物流体样品中检测无细胞核小体的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与选自组蛋白H1、macroH2A、染色质结合蛋白或其片段、类似物或工程改造衍生物的第一结合剂接触；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体的量度。

另一方面，提供在生物流体样品中检测无细胞核小体的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合核小体或其组分的第一结合剂接触；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与选自组蛋白H1、macroH2A、染色质结合蛋白或其片段、类似物或工程改造衍生物的第二结合剂接触；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体的量度。

在一个实施方案中，染色质结合蛋白与接头DNA缔合。在又一个实施方案中，染色质结合蛋白选自：MBD、HMGB、CHD、DNMT和PARP。

根据又一方面，提供在生物流体样品中检测无细胞核小体的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合核小体或其组分的第一结合剂接触；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与结合染色质结合蛋白的第二结合剂接触，所述染色质结合蛋白选自CHD、DNMT、PARP和MBD；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中染色质结合剂的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体的量度。

根据又一方面，提供在生物流体样品中检测无细胞核小体的免疫测定方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与结合染色质结合蛋白的第一结合剂接触，所述染色质结合蛋白选自CHD、DNMT、PARP和MBD；

(ii) 将步骤(i)中结合的样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触；和

(iii) 检测或测量所述第二结合剂与样品中核小体的结合；和

(iv) 使用这种结合的存在或程度作为样品中无细胞核小体的量度。

循环细胞外小泡

血液含有大量细胞外小泡(ECV)，其含有或结合DNA、核小体和/或其他蛋白核酸复合物。外泌体是可能包含核小体和/或DNA和/或其他染色质片段的ECV的一个实例。与外泌体或其他ECV相关的核小体，包括含有接头DNA的核小体，可受到保护而不与染色质蛋白或其他结合物结合，或不易与染色质蛋白或其他结合物结合，且因此当在本发明方法中使用这些部分时，可保持不结合。使用本文所述方法未被蛋白结合的任何此类含有接头DNA的ECV相关核小体可残留在上清液中。这种效应可通过从样品中去除外泌体和/或其他ECV来防止。

因此，根据本发明的又一方面，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 从样品中去除外泌体或其他ECV；

(ii) 使样品与结合核小体相关接头DNA的结合剂接触；和

(iii) 从样品中分离在步骤(ii)中不结合结合剂的核小体。

本领域技术人员将理解，上述步骤(i)和(ii)可以以任何顺序或同时进行。

ECV的许多结合物是本领域已知的，且可用于结合ECV和去除样品中的ECV。用于从样品中分离外泌体和其他ECV的商业产品也是可获得的。凝集素是已知结合大多数或所有外泌体的蛋白。因此，在一个实施方案中，使用凝集素从样品中去除外泌体或其他ECV。在本发明的一个优选的实施方案中，将凝集素蛋白附着到固相支撑物上，并用于结合样品中存在的外泌体和其他ECV。暴露于凝集素蛋白后，样品上清液中的外泌体/ECV以及因此任何含有接头DNA的外泌体或ECV相关核小体被耗尽。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供通过亲和纯化从生物流体样品中分离含有接头DNA的无细胞核小体和不含接头DNA的无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使样品与凝集素部分接触；

(ii) 使样品与结合核小体相关接头DNA的结合剂接触；和

(iii) 从样品中分离在步骤(ii)中不结合结合剂的核小体。

本领域技术人员将理解，上述步骤(i)和(ii)可以以任何顺序或同时进行。在一个优选的实施方案中，样品是血浆样品。

检测和治疗癌症的方法

根据本发明的又一方面，提供如下检测或诊断疾病存在的测定方法：测量或检测体液中含有少量或不含接头DNA的核小体的存在和/或水平，并使用所检测的水平作为受试者疾病状态的生物标记物(单独作为检验组的成员)，包括但不限于疾病的临床诊断、疾病类型或亚类的鉴别诊断或疾病预后或疾病复发，或受试者对治疗方案的易感性诊断。本领域技术人员将理解，用于诊断检验的体液包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、脑脊液和其他流体。在一个优选的实施方案中，选择作为样品的体液为血液、血清或血浆。体液中含有少量或不含接头DNA的分离核小体可通过多种方法测量，包括质谱和免疫测定。或者，可通过物理或化学方法测量核小体相关DNA，包括但不限于色谱法、电泳法、PCR和DNA测序方法。

体液中含有少量或不含接头DNA的核小体的测定反应、水平、浓度或数量可以用绝对值或相对值表示，例如，但不限于存在的总核小体水平的比例，或与另一核苷酸或组蛋白变体或组蛋白PTM水平的比率，或与总DNA水平的比率。在一个实施方案中，样品中含有或不含接头DNA的核小体的比率用作癌症的标记物。因此，高比率的[不含接头DNA的核小体]/[含接头DNA的核小体]指示癌症。类似地，可以确定[长度小于150bp的DNA片段]/[长度大于150bp的DNA片段]的量或浓度的比率，或者可以确定突变等位基因分数。这里以DNA片段尺寸的截止值为150bp为例。可以使用其他截止值。

本文所述方法可与诊断方法结合使用。例如，可使用本文所述的方法富集样品以分离肿瘤来源的DNA或无细胞核小体，且然后富集的样品可用于通过检测与疾病相关的进一步表观遗传学标记物的诊断方法中。

因此，根据本发明的又一方面，提供诊断癌症的方法，其包括：

(i) 进行如本文所定义的方法，以从获自患者的生物样品中分离循环肿瘤核小体；和

(ii) 分析分离的循环肿瘤核小体和/或相关DNA。

在一个实施方案中，步骤(ii)包括分析分离的循环肿瘤核小体的表观遗传学核小体特征，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸或经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)，与核小体加合的蛋白或其组合。

在一个实施方案中，使用DNA测序分析相关DNA，例如选自下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR(包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR))、等温扩增、杂交、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)的测序方法。

根据本发明的又一方面，提供在动物或人类受试者中诊断或检测癌症的方法，其包括以下步骤：

(i) 进行如本文所定义的方法；

(ii) 将步骤(i)中获得的分离的肿瘤来源核小体与另一种结合剂接触，所述另一种结合剂结合肿瘤来源核小体的表观遗传学表位(“生物标记物”)；

(iii) 检测和/或定量所述另一种结合剂与所述表位的结合；和

(iv) 使用所述表位的测量水平作为受试者中存在癌症的指示。

可直接对纯化或富集的核小体样品进行检测和/或定量，或间接对其提取物或其稀释物进行检测和/或定量。定量样品中存在的生物标记物的量可包括确定样品中存在的生物标记物的浓度。根据本文所述的本发明的检测、监测和诊断的用途和方法可用于确认疾病的存在，通过评估发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的用途和方法也用于评估临床筛查、预后、疗法选择、治疗益处评估的方法，即用于药物筛查和药物开发。

本文所述的诊断方法还可包括将生物样品中存在的第二结合剂的水平与一个或多个对照进行比较。在一个实施方案中，来自一个或多个对照的生物样品取自健康(或“正常”)患者和/或患有相关良性疾病的患者。在另一个实施方案中，来自一个或多个对照的生物样品取自健康患者。

根据本发明的又一方面，提供诊断癌症的方法，其包括以下步骤：

(a) 通过本发明方法测量获自受试者的体液样品中不含接头DNA的核小体水平；和

(b) 使用步骤(a)中测量的核小体水平确定患者是否患有癌症。

根据本发明的又一方面，提供诊断癌症的方法，其包括以下步骤：

(a) 通过本发明方法测量获自受试者的体液样品中不含接头DNA的核小体和含接头DNA的核小体的比率；和

(b) 使用步骤(a)中测量的比率确定患者是否患有癌症。

在本发明的一个方面中，本文所述的方法可用于监测患者的癌症复发进展。在另一方面，本文所述的方法可用于为患者选择合适的疗法。例如，分析与分离的核小体相关的DNA可确定患者癌症的基因型，其可能使他们对特定疗法的反应更多或更少。在本发明的一方面，本文所述的方法可用于监测最小残留病(MRD)，即鉴定已治疗的患者中残留恶性细胞的存在。MRD的检测表明治疗是不完整的。

根据本发明的又一方面，提供治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(a) 从患者获得样品；

(b) 通过本发明方法测量样品中含有长度约小于150bp的短DNA片段的核小体水平；

(c) 使用步骤(b)中测量的核小体水平确定患者是否患有癌症；和

(d) 如果患者在步骤(c)中确定患有癌症，则施用治疗。

根据本发明的又一方面，提供治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(a) 从患者获得样品；

(b) 通过本发明方法测量样品中含有长度约小于150bp的短DNA片段和约大于150bp的长DNA片段的核小体的比率；

(c) 使用步骤(b)中测量的核小体比率确定患者是否患有癌症；和

(d) 如果患者在步骤(c)中确定患有癌症，则施用治疗。

在一个实施方案中，本发明方法用于测量样品中含有短或长DNA片段(即长度分别约小于150bp和大于150bp)的核小体水平，是如本文所述的本发明的免疫测定方法。

根据本发明的又一方面，提供治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

(a) 从患者获得样品；

(b) 通过本发明方法分离样品中约150bp或更少的DNA片段；

(c) 使用步骤(b)中分离的DNA片段的水平确定患者是否患有癌症；和

(d) 如果患者在步骤(c)中确定患有癌症，则施用治疗。

本发明方法的一个重要方面是通过改进ctDNA检测和分析方法，促进癌症疾病的改进检测和治疗。先前背景技术中概述的五种ctDNA分析方法中的四种需要对DNA片段进行测序和/或对甲基化DNA片段进行测序。然而，由于分析样品中的ctDNA水平较低，这些方法很难实现。

在一个实施方案中，步骤(c)包括确定DNA片段的突变等位基因分数。在又一个或替代实施方案中，步骤(c)包括对DNA片段进行测序。然后，核苷酸序列可用于确定患者是否患有癌症，例如分析任何遗传DNA标记物，包括核苷酸取代、核苷酸插入、核苷酸缺失、甲基化DNA序列或其他DNA序列突变，如上文所述。

在一个实施方案中，施用的治疗选自：手术、放疗、化疗、免疫疗法、激素疗法和生物疗法。

试剂盒

根据本发明的又一方面，提供用于检测或分离或测量核小体的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)组蛋白H1、macroH2A或染色质结合蛋白和(ii)特异性结合核小体或其组分的结合剂，以及任选地根据如本文所定义的方法的试剂盒使用说明书。

根据本发明的又一方面，提供用于检测或分离或测量核小体的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)定向结合染色质结合蛋白的抗体或其他结合物和(ii)特异性结合核小体或其组分的结合剂，以及任选地根据如本文所定义的方法的试剂盒使用说明书。

本发明的试剂盒可替代地或另外包含用于分离和/或分析核小体相关DNA片段的试剂。根据本发明的又一方面，提供试剂盒，其包含：(i)组蛋白H1、macroH2A或染色质结合蛋白；和(ii)用于分离和/或分析核小体相关DNA片段的试剂，以及任选地根据如本文所定义的方法的试剂盒使用说明书。

根据又一方面，提供如本文所定义的试剂盒用于诊断癌症的用途。

本发明的一般特征

以下实施方案可应用于本文所述的本发明的各方面。

在一个实施方案中，核小体是无细胞单核小体或寡核小体。显然，如本文所用的术语“核小体”旨在包括单核小体和寡核小体，以及可在流体介质中分析的任何此类染色质片段。在又一个实施方案中，无细胞核小体是单核小体、寡核小体或其他染色体片段。

在一个实施方案中，生物流体(即体液)样品选自血液、血清或血浆样品。

在一个实施方案中，从受试者获得生物流体样品，并对样品中的无细胞核小体富集如本文所述的疾病相关或疾病来源的核小体。流体样品可以是取自受试者的任何生物流体(或体液)样品，包括但不限于脑脊液(CSF)、全血、血清、血浆、经血、子宫内膜液、尿液、唾液或其他体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼吸，例如作为浓缩呼吸，或其提取物或纯化物或其稀释物。生物样品还包括来自活着的受试者或死后采集的样本。可以例如在适当稀释或浓缩的情况下制备样品，并以常规方式储存。在一个特定的实施方案中，体液选自血液、血清和血浆。

生物样品的收集方法在本领域是众所周知的，并且应当理解，任何此类收集方法都适合与本文所述的方法一起使用。

在一个实施方案中，受试者是人或动物，例如人、马、狗或小鼠。本文对“受试者”或“患者”的提及可以互换使用。

本文所述的免疫测定方法是指抗核小体抗体或结合物，或是指结合核小体中存在的表位的抗体或其他结合物。本领域技术人员将清楚，此类结合物可定向结合核小体或染色质片段中存在的任何表位。此类表位包括但不限于组蛋白蛋白质(特别是核心组蛋白蛋白质)、组蛋白同种型、经修饰的组蛋白(例如组蛋白翻译后修饰)、与核小体相关的DNA(例如核苷酸、经修饰的核苷酸)、构象表位或组蛋白加合物(即与核小体加合的蛋白)。

在一个优选的实施方案中，将结合剂涂覆在固体支撑物上，例如琼脂糖(sepharose)、sephadex、塑料或磁珠。在一个实施方案中，所述固体支撑物包含多孔材料。在另一实施方案中，对结合剂进行衍生以包含标签或接头，其可用于将结合剂附着至经衍生以结合标签的合适支撑物。许多此类标签和支撑物是本领域已知的(例如，Sortag、点击化学、生物素/链霉亲和素、his标签/镍或钴、GST标签/GSH、抗体/表位标签等)。为便于使用，涂覆的支撑物可包含在装置内，例如微流控装置。

在一个实施方案中，疾病(分离的循环无细胞核小体来源于此)选自癌症、自身免疫疾病或炎性疾病。在又一个实施方案中，疾病是癌症。在又一个实施方案中，自身免疫疾病选自：系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。在又一个实施方案中，炎性疾病选自：克罗恩病、结肠炎、子宫内膜异位症和慢性阻塞性肺病(COPD)。

如果疾病是癌症，那么分离的核小体可被称为“肿瘤来源”或“肿瘤相关”核小体。由于ctDNA和循环核小体是所研究的所有癌症疾病类型的特征，本发明方法适用于所有癌症疾病。在一个实施方案中，肿瘤来源或肿瘤相关的无细胞核小体来源于选自以下的癌症：乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肠癌、肝癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、口腔癌、头颈癌、白血病和骨肉瘤。

本公开提供能够特异性结合核小体的配体或结合物，例如天然存在或化学合成的化合物。配体或结合物可包含能够特异性结合核小体的肽、抗体或其片段，或合成配体(例如塑料抗体)，或适体，或affimer或寡核苷酸。抗体可以是能够特异性结合核小体的单克隆抗体或其片段。配体或结合物(例如如本文所述的染色质结合剂，或针对核小体或其组分的结合剂)可以用可检测标记物标记，例如发光、荧光、酶或放射性标记物。替代地或另外地，配体可以用亲和标签标记，例如生物素、亲和素、链霉亲和素或His(例如六-His)标签。或者，可使用例如ForteBio Inc.的无标签技术来确定配体结合。

本文描述的方法使用特定靶标分离核小体。然后可进一步分析所述分离的核小体的特定生物标记物。术语“生物标记物”指过程、事件或病况的独特生物或生物衍生指示物。生物标记物可用于诊断方法(例如临床筛查)和预后评估，以及监测疗法结果、确定最有可能对特定治疗性治疗有反应的受试者，药物筛选和开发。例如，此类生物标记物包括无细胞核小体自身的水平(即，通过本发明方法分离的核小体的水平)或分离的无细胞核小体的表观遗传学特征的水平。

提供了用于进行本发明方法的诊断或监测试剂盒。此类试剂盒将适当地包含用于检测和/或定量靶标或生物标记物的配体，和/或生物传感器和/或本文所述的阵列，任选地和试剂盒使用说明书一起。本发明的又一方面是用于检测疾病状态存在的试剂盒，其包含能够检测和/或定量如本文所定义的一个或多个生物标记物的生物传感器。

如本文所用的术语“检测”和“诊断”涵盖疾病状态的鉴定、确认和/或表征。根据本发明的检测、监测和诊断方法可用于确认疾病的存在，通过评估发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的方法也可用于评估临床筛查、预后、疗法选择，评价治疗益处的方法，即用于药物筛选和药物开发。

有效的诊断和监测方法通过建立正确的诊断，提供具有改善预后潜力的非常有力的“患者解决方案”，允许快速鉴定最适当的治疗(因此减少有害药物副作用的不必要暴露)和降低复发率。

已知增加的细胞更新、细胞死亡和凋亡导致无细胞核小体的循环水平增加(Holdenrieder等人, 2001)。循环无细胞核小体水平是非特异性指示物，并出现在多种病况中，包括炎性疾病、多种良性和恶性病况、自身免疫疾病以及创伤或缺血后(Holdenrieder等人, 2001)。本领域技术人员将清楚，本发明将可应用于多种疾病领域，其中在受试者中发现循环核小体。这些包括但不限于创伤(例如严重损伤或手术)、剧烈运动(例如跑马拉松)、中风和心脏病发作、脓毒症或其它严重感染和子宫内膜异位。

本发明的免疫测定包括采用酶检测法的免疫测定法(例如ELISA)、荧光标记的免疫测定法、时间分辨荧光标记的免疫测定法、化学发光免疫测定法、免疫比浊测定法、微粒标记的免疫测定法和免疫放射测定法，以及竞争性免疫测定法，包括标记的抗原和标记的抗体竞争性免疫测定法，其具有多种标记类型，包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和微粒标记。所有所述免疫测定方法均是本领域众所周知的，参见例如Salgame等人, 1997和vanNieuwenhuijze等人, 2003。

任何DNA物理或化学分析方法可用于本发明的方法，包括测量DNA片段长度的方法(例如层析或电泳)。任何物理或化学方法也可用于进一步的DNA分析，例如由Sina等人,2018所述的。类似地，可使用任何DNA测序方法，包括下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR(包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR))、等温扩增、杂交、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)。

DNA分析可包括分析任何遗传DNA标记物，包括核苷酸取代、核苷酸插入、核苷酸缺失、甲基化DNA序列或其它DNA序列突变。可在这种分析中研究的典型癌症相关DNA异常包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数突变、微卫星异常、DNA链完整性和基因甲基化状态。

在一个实施方案中，本发明的方法多次重复。该实施方案提供了允许在一段时间内监测检测结果的优点。这样的安排将提供监测或评估疾病状态的治疗功效的益处。本发明的这种监测方法可用于监测发作、进展、稳定、改善、复发和/或缓解。

因此，本发明还提供了对怀疑患有这样的疾病的受试者监测疾病状态的治疗功效的方法，包括检测和/或定量来自所述受试者的生物样品中存在的生物标记物。在监测方法中，可以在两个或更多个时机采集检验样品。所述方法可进一步包括将存在于检验样品中的生物标记物的水平与一个或多个对照和/或与早先取自相同检验受试者(例如在疗法开始之前)和/或在疗法的早期阶段取自相同检验受试者的一个或多个先前检验样品进行比较。所述方法可包括检测在不同时机取得的检验样品中生物标记物的性质或量的变化。

检验样品中生物标记物的水平相对于早先取自相同检验受试者的先前检验样品的水平的变化可指示所述疗法对病症或疑似病症的有益作用，例如稳定或改善。此外，一旦治疗完成，本发明的方法可以周期性地重复以监测疾病的复发。

监测疗法功效的方法可用于监测人类受试者和非人类动物中(例如动物模型中)现有疗法和新疗法的治疗有效性。这些监测方法可以结合到新原料药和原料药组合的筛选中。

在又一个实施方案中，由于快速起效疗法而引起的更快速变化的监测可以以数小时或数天的较短间隔进行。

鉴定和/或定量可通过适于鉴定来自患者的生物样品或生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中特定蛋白的存在和/或量的任何方法进行。可以在本发明的方法中检验的生物样品包括如上文所定义的那些。可以例如在适当稀释或浓缩的情况下制备样品，并以常规方式储存。

本发明的方法可通过检测本文所述的靶标片段进行，例如具有C末端截短或具有N末端截短的片段。片段长度合适地大于4个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。这些片段可以是结合片段，即它们保留了完整蛋白结合靶标的能力。特别值得注意的是，具有与组蛋白尾相同或相关序列的肽是特别有用的组蛋白片段。

生物标记物可直接检测，例如通过SELDI或MALDI-TOF。或者，生物标记物可以经由与一种或多种配体相互作用直接或间接检测，所述配体例如能够特异性结合生物标记物的抗体或其生物标记物结合片段，或其它肽或配体，例如适体、affimer或寡核苷酸。配体或结合物可具有可检测的标记，例如发光、荧光或放射性标记，和/或亲和标签。

例如，检测和/或定量可通过选自以下的一种或多种方法进行：SELDI (-TOF)、MALDI (-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、基于质谱(MS)、反向(RP) LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和力、HPLC、UPLC和其他LC或LC MS的技术。合适的LC MS技术包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA,USA)。也可以使用液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR(核磁共振)光谱。

根据本发明的诊断或监测方法可包括分析样品以检测生物标记物的存在或水平。这些方法也适用于临床筛查、预后、监测疗法结果、鉴定最可能对特定治疗性治疗有反应的患者、用于药物筛选和开发，以及鉴定用于药物治疗的新靶标。

鉴定和/或定量可使用免疫学方法进行，涉及能够特异性结合生物标记物的抗体或其片段。合适的免疫学方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别分析物生物标记物上的不同表位的两种抗体进行分析物生物标记物的检测；放射免疫测定(RIA)，直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如使用金、银或胶乳颗粒、磁性颗粒或Q点)。免疫学方法可以例如以微量滴定板或条带形式进行。

涉及鉴定和/或量化的方法可以在台式仪器上进行，或者可以结合到一次性的、诊断或监测平台上，所述平台可在非实验室环境中使用，例如在医师的办公室或在患者的床边。用于进行本发明的方法的合适的生物传感器包括具有光学或声学读取器的“信用”卡。生物传感器可以被配置为允许收集的数据被电子地传输到医师用于解释，并且因此可以形成电子医疗的基础。如本文所用，术语“生物传感器”是指能够检测靶标存在的任何传感器。

本文描述了用于诊断和监测疾病状态的存在的诊断试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒另外含有能够鉴定和/或定量生物标记物的生物传感器。合适地，根据本发明的试剂盒可含有选自以下组的一种或多种组分：特异性针对生物标记物或生物标记物的结构/形状模拟物的配体结合物或配体，一种或多种对照，一种或多种试剂和一种或多种消耗品；任选地与根据如本文所定义的任何方法的试剂盒使用说明书一起。

用于疾病状态的生物标记物的鉴定允许诊断程序和治疗方案的整合。例如，生物标记物的检测可用于在受试者参与临床试验之前筛选受试者。生物标记物提供指示治疗性反应、没有反应、不利副作用概况、药物依从性程度和达到足够的血清药物水平的手段。生物标记物可用于提供药物不良反应的警告。生物标记物可用于开发个性化疗法，因为反应的评估可用于微调剂量、最小化处方药物的数量、减少获得有效疗法的延迟和避免不良药物反应。因此，通过监测生物标记物，可以精确地调整患者护理以匹配由患者的病症和药物基因组图谱确定的需求，因此生物标记物可用于滴定最佳剂量、预测积极治疗反应和鉴定处于严重副作用的高风险的那些患者。

基于生物标记物的检验提供了对“新”患者的一线评估，并提供了准确和快速诊断的客观测量，这使用目前的测量是无法实现的。

此外，诊断性生物标记物检验可用于鉴定患有轻度或无症状疾病或可能处于发展症状性疾病的高风险的家族成员或患者。这允许启动适当的疗法或预防措施，例如管理风险因素。这些方法被认为可改善结果并可预防疾病的明显发作。

生物标记物监测方法、生物传感器和试剂盒作为患者监测工具也是至关重要的，以使医师能够确定复发是否是由于病症的恶化。如果药理学治疗被评估为不充分的，则可以恢复或增加疗法；如果合适，可以改变疗法。由于生物标记物对病症状态敏感，它们提供药物疗法的影响的指示。

现在将参考以下非限制性实施例说明本发明。

实施例

实施例1

我们购买了两种H1蛋白产品。第一种是重组H1蛋白，购自Sigma-Aldrich(产品号：H1917-100UG)。第二种是从小牛胸腺分离的生物H1制剂，购自Merck-Millipore(产品号：382150)。通过在2-8℃下孵育过夜，我们将这些H1蛋白以及重组H2A、H2B、H3和H4组蛋白蛋白质(购自BPS Bioscience，产品号分别为52021、52022、52023和52024)以在100 µl磷酸盐缓冲液(PBS，产品号：70011-038)中的5 µg/ml涂覆在塑料微量滴定孔上。将孔封闭(wellChampion, Kem-En-Tec，产品号：4900A)，并加入10 µl溶液，所述溶液含有(i)从HeLa细胞纯化的人天然多核小体(Epicypher，产品号：16-0003)，其由含有接头DNA的单核小体和多核小体的混合物组成，或(ii)H3.3单核小体，其包含147bp的DNA，且因此无接头DNA(Epicypher，产品号：16-0012)。孵育过夜后，洗涤孔并通过加入标记的抗核小体抗体检测任何结合的核小体。使用颜色底物反应测定结合的标记抗体，而所得光密度(OD)用作结合的核小体的量度。

结果示于图2，并表明含有接头DNA的单核小体和多核小体结合H1蛋白(重组H1和组织来源的H1蛋白两者)，但不含接头DNA的单核小体不结合H1蛋白。此外，核小体结合对组蛋白H1是特异性的，并且对于组蛋白H2A、H2B、H3或H4蛋白没有观察到。这些结果表明H1蛋白(而不是其它组蛋白蛋白质)可用于制备结合含有接头DNA的核小体的免疫吸附剂。结果还表明，H1蛋白或结合核小体的任何蛋白可在免疫测定中性用作一般性核小体的结合物，或用作与被该蛋白选择性结合的某些类型核小体的结合物。

实施例2

在存在和不存在重组生物素化组蛋白H1的情况下，我们将涂覆链霉亲和素的磁珠与含有167bp DNA的重组单核小体一起孵育，所述DNA包含Widom 601 DNA序列。然后使用磁铁分离珠，洗涤并用蛋白酶-K处理以释放任何结合的核小体DNA。提取释放的DNA，洗脱并使用Widom 601-序列特异性引物通过定量聚合酶链式反应(qPCR)方法测量。在H1存在下观察到的Ct值(信号越过高于背景的阈值所需的循环数的循环阈值)小于在H1不存在下观察到的Ct值的一半。这表明结合链霉亲和素珠的含有167bp DNA片段的重组核小体的结合，在H1存在时是它不存在时的超过400倍，且因此含有167bp DNA的核小体被H1结合在磁珠上。

该实验的结果表明，涂覆H1蛋白的珠可用于结合和分离含有167bp DNA(即包含接头DNA)的核小体，并可用于制备用于本发明方法的免疫吸附剂，以结合含有特定结构、性质或生物来源的核小体和/或富集或耗尽样品中的这些核小体。

该实验的结果显示固定化的组蛋白H1蛋白结合含有167bp DNA片段的重组核小体。实施例1中描述的实验结果显示固定化的组蛋白H1蛋白不结合含有147bp DNA片段的重组核小体。因此，组合起来，实施例1和2证明组蛋白H1蛋白可用于选择性结合含有接头DNA的核小体，并因此可用作富集和/或分离含有或不含接头DNA的核小体的工具。

实施例3

在与实施例2所述类似的实验中，使用取自诊断患有癌症的患者的血浆样品，将涂覆链霉亲和素的磁珠与重组生物素化组蛋白H1和血浆样品一起孵育。然后使用磁铁分离珠，洗涤并用蛋白酶-K处理以释放任何结合的核小体DNA。分离释放的DNA，且洗涤后，洗脱并用生物分析仪分析以测量分离的DNA的片段尺寸分布。观察到的分离DNA的尺寸分布由2个条带组成。在长度约150-230bp处观察到主带，其中在约170bp处的峰对应于如图1中所示的非肿瘤峰。在约300-450bp处观察到另一个更小的条带，对应于双核小体和三核小体预期的尺寸范围。

图1中在约120-150bp DNA处显示的肿瘤条带完全从血浆癌症样品中结合H1的核小体的片段尺寸概况中缺失。这表明含有长度小于150bp的DNA片段的核小体不结合连接组蛋白H1的磁珠。

结果显示本发明的方法可用于结合和去除血浆样品中含有接头DNA的单核小体和多核小体，而不含接头DNA的核小体残留在溶液中。由此液相被分离、纯化并富集肿瘤来源的血浆核小体。

实施例4

将涂覆组蛋白H1的磁珠试剂与取自癌症患者的血浆样品一起孵育。使用磁铁分离磁珠试剂，并使用本领域已知的方法提取与磁珠结合的DNA和存在于液相中的未结合的DNA两者。

研究任何癌症相关基因突变的存在，并在未经处理的样品中以及结合磁珠和未结合磁珠的DNA部分中确定突变等位基因分数。未结合部分的MAF高于未经处理样品或结合部分的MAF。

实施例5

将涂覆组蛋白H1的磁珠试剂与取自癌症患者的血浆样品一起孵育。使用磁铁分离磁性试剂，并使用本领域已知的方法提取液相中存在的DNA。对提取的DNA进行测序。

研究任何癌症相关基因突变的存在并确定突变等位基因分数。此外，使用“片段组学”方法研究DNA序列以鉴定血浆样品中DNA片段的组织来源。样品的MAF和/或突变概况和/或“片段组学”概况用于指示患者中癌症的存在。该信息可用于为患者选择适当的治疗。

还使用合适的方法(例如亚硫酸氢盐测序)分析提取的DNA的甲基化DNA。样品的甲基化DNA结果用于指示患者中癌症的存在、进展或复发。

实施例6

使用本领域已知的方法，例如(Wiesler和Weinzierl, 2010)的方法，开发遗传工程改造的蛋白以与含有接头DNA的核小体强烈结合。蛋白可基于任何蛋白或任何蛋白结构域。在本实施例中，用系统性氨基酸变化进行H1蛋白的突变分析，并检验衍生的H1突变体与含有接头DNA的核小体的结合。选择那些具有最强结合的突变体作为候选物用于免疫吸附剂以结合含有接头DNA的核小体。然后检验候选突变蛋白与不含接头DNA的核小体的结合，并选择没有或弱结合的候选蛋白。所开发的工程改造的蛋白可更强地结合含有接头DNA的核小体，而更弱地结合不含接头DNA的核小体。这种工程改造的蛋白或肽可大量生产并可用作本发明的方法的结合物。

实施例7

我们根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific)将甲基结合结构域2(MBD2)蛋白涂覆在Dynabeads M280磁珠上。将珠暴露于5 µg/ml含有未甲基化的接头DNA的重组多核小体(Active Motif,产品号：31466)、用微球菌核酸酶消化的纯化自HeLa细胞的人天然核小体(主要由单核小体组成，其中一些含有甲基化的DNA) (Diagenode，产品号：C01030102)和具有187bp DNA的半甲基化重组单核小体(所有这些都含有甲基化的接头DNA) (EpiCypher，产品号：SKU:16-2103)。磁性分离珠，洗涤并使用化学发光标记的抗核小体抗体测量结合的核小体。结果示于图3，并表明MBD蛋白结合含有接头DNA的多核小体。此外，含有高水平甲基化DNA的单核小体的核小体结合更强。

实施例8

我们开发了ELISA测定，其利用涂覆在微量滴定板孔表面上的MBD蛋白作为无细胞核小体的捕获蛋白，并使用该测定测量含有接头DNA的核小体的水平。简言之，通过在2-8℃下孵育过夜，将MBD蛋白以在100 µl磷酸盐缓冲液(PBS，产品号：70011-038)中的5 µg/ml涂覆在塑料微量滴定孔上。还以类似的方式将组蛋白H4涂覆在孔上，用作对照。将孔封闭(wellChampion, Kem-En-Tec，产品号：4900A)，并加入10 µl连续稀释的含有1 µg/ml纯化自HeLa细胞的人天然多核小体的溶液(Epicypher，产品号：16-0003)或含有1 µg/ml包含147bp的H3.3单核小体的溶液(Epicypher，产品号：16-0012)。孵育过夜后，洗涤孔并通过加入标记的抗核小体抗体检测任何结合的核小体。结果示于图4，并证明MBD结合含有接头DNA的核小体(HeLa多核小体)，但不结合不含接头DNA的核小体(H3.3单核小体)。

我们还使用该测定法检验了28个人血浆样品，且结果示于图5，包括基于纯化自HeLa细胞的人天然核小体(BPS Biosciences，产品号：52039)的稀释物的标准曲线。结果显示MBD可用作临床样品的ELISA类型测定中的结合剂。

实施例9

根据制造商的说明书，将克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶蛋白(DNMT)、高迁移率族或高迁移率族盒蛋白(HMG或HMGB)、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白(PARP)或p53涂覆在Dynabeads M280磁珠上。将珠暴露于多种核小体，包括含有147bp、167bp或187bp DNA的重组单核小体、重组多核小体(Active Motif，目录号31466)、纯化自HeLa细胞的人天然核小体和半甲基化重组单核小体(EpiCypher，目录号SKU:16-2103)。磁性分离珠，洗涤并使用化学发光标记的抗核小体抗体测量结合的核小体。结果可用于证明涂覆不同染色质结合蛋白的珠可用于结合和分离核小体，并可用于制备用于本发明方法的免疫吸附剂，以结合含有特定结构、性质或生物来源的核小体和/或富集或耗尽样品中的这些核小体。可以提取和分析与核小体(特别是不结合磁珠的核小体)相关的DNA。

实施例10

如上实施例9所述，将克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶蛋白(DNMT)、高迁移率族或高迁移率族盒蛋白(HMG或HMGB)、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白(PARP)或p53涂覆在微量滴定孔。封闭每个孔并加入样品。孵育后，弃去样品，洗涤孔并使用标记的抗核小体抗体测量结合的核小体。结果可用于证明用CHD、DNMT、HMG、HMGB或PARP涂覆的孔可用于免疫测定以测量样品中含有与固定在孔表面上的特定蛋白相关的特定结构的核小体的水平。

在另一个实验中，所用的标记抗体不是一般的抗核小体抗体，而是定向结合核小体的特定表观遗传学特征(例如组蛋白同种型、组蛋白修饰或与核小体加合的蛋白)。

实施例11

使用文库噬菌体展示技术，使用结合含有167bp DNA的单核小体的正选择来开发抗体。将文库中对于结合含有167bp DNA的单核小体鉴定为阳性的噬菌体结合物克隆以各种涂覆水平固定在固体支撑物上，并暴露于含有147bp、167bp或187bp DNA片段的单核小体。使用标记的抗核小体抗体检测核小体与结合物克隆的结合。选择对含有167bp和/或187bp DNA的单核小体(即含有接头DNA的核小体)具有高结合亲和力但对含有147bp DNA的单核小体具有低结合亲和力的克隆，并用于开发含有接头DNA的核小体的正结合选择的免疫吸附剂。

实施例12

使用文库噬菌体展示技术，使用结合含有147bp DNA的单核小体的正选择来开发抗体。将文库中对于结合含有147bp DNA的单核小体鉴定为阳性的噬菌体结合物克隆以各种涂覆水平固定在固体支撑物上，并暴露于含有147bp、167bp或187bp DNA片段的单核小体。使用标记的抗核小体抗体检测核小体与结合物克隆的结合。选择对含有147bp DNA的单核小体(即不含接头DNA的核小体)具有高结合亲和力但对含有167bp或187bp DNA的单核小体具有低结合亲和力的克隆，并用于开发不含接头DNA的核小体的正结合选择的免疫吸附剂。

实施例13

我们使用AxioMx Inc.文库噬菌体展示技术，对于结合含有147bp DNA的单核小体的克隆使用正选择，开发了抗体。

将产生的三种抗体生物素化并通过测量它们与含有147bp、167bp或187bp DNA的重组核小体的结合进行检验。简言之，通过用核小体溶液(1µg/ml)涂覆将重组核小体固定在微量滴定孔上。使用商购封闭试剂封闭孔。加入生物素化抗体溶液(1µg/ml)并在室温下温和震荡孵育2小时。随后倒出抗体溶液，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。加入含有链霉亲和素－辣根过氧化物酶(HRP)缀合物的溶液并在室温下孵育15分钟。再次洗涤孔并使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物并测量在450nm产生的光密度(OD)来测量结合的HRP。结果示于下表1。

表1. 3种抗体与不含接头DNA、含约20bp的接头DNA或含约40bp的接头DNA的核小体的结合

与涂覆的核小体相关的DNA的长度(bp)	OD抗体1	OD抗体2	OD抗体3
				147bp (无接头DNA)	0.34	0.93	0.63
167bp (约20bp接头DNA)	0.27	0.81	0.55
				187bp (约40bp接头DNA)	0.20	0.52	0.40
对照(无涂覆的核小体)	0.04	0.04	0.04

结果显示所有3种抗体对不含接头DNA的核小体的结合更强。对含有增加长度的接头DNA的核小体的结合较弱，且抗体可用于正选择和富集不含接头DNA的核小体。

将对于结合单核小体鉴定为阳性的噬菌体结合物克隆以各种涂覆水平固定到固体支撑物上，并暴露于含有147bp、167bp或187bp DNA片段的单核小体。该实验与上述核小体被固定并暴露于液相抗体的实验类似，但相反的是抗体被固定并暴露于液相核小体。使用标记的抗核小体抗体检测核小体与结合物克隆的结合。一种克隆的结果示于图6，并且证明该克隆对含有167bp或187bp DNA的单核小体具有高(并且近似相等)亲和力，但对含有147bp DNA的核小体(即无接头DNA的核小体)具有低得多的亲和力。本领域技术人员将清楚，对含有接头DNA的核小体比对不含接头DNA的核小体具有更高亲和力的结合物可用于结合含有接头DNA的核小体(几乎独占)，特别是如果那些核小体也以比不含接头DNA的核小体高得多的浓度存在于样品中。

结果证明可以开发抗体以选择性结合存在于含有或不含接头DNA的核小体上的表位。这样的工程改造的抗体或抗体片段可用于开发在本发明的方法中使用的免疫吸附剂，以结合具有不同结构、性质或生物来源的核小体和/或富集或耗尽样品中具有某些结构、性质或生物来源的核小体。例如，工程改造以优先结合不含接头DNA的核小体的抗体可用于正选择方法，以富集含有不含接头DNA的核小体的样品(通过结合不含接头DNA的那些核小体)。类似地，工程改造以优先结合含有接头DNA的核小体的抗体可用于负选择方法，以富集含有不含接头DNA的核小体的样品(通过结合并去除含有接头DNA的核小体)。

这些抗体的靶表位可以是各种类型。例如，靶表位可位于仅存在于含有接头DNA的核小体的结构中，或者位于仅存在于不含接头DNA的核小体的结构中。例如，这样的结构可以是另外的结构(特别是在含有接头DNA的核小体中)或可以通过以其它方式存在的结构的缺失或去除(特别是在不含接头DNA的核小体中)而暴露。靶表位在性质上也可以是构象的，使得接头DNA的存在或不存在与可选的核小体构象相关，所述核小体构象可以被为此目的开发的抗体以更高或更低的亲和力结合。其它靶表位也是可能的。

实施例14

使用涂覆链霉亲和素的磁珠试剂以及定向结合组蛋白同种型macroH2A的生物素化抗体进行类似于实施例3中所述的实验。将磁珠和生物素化抗体与取自癌症患者的血浆样品一起孵育。使用磁铁分离磁珠试剂，并使用本领域已知的方法提取结合磁珠的DNA和存在于液相中的未结合的DNA两者。

研究任何癌症相关基因突变的存在，并确定结合磁珠和未结合磁珠两者的DNA部分中的突变等位基因分数。未结合部分的MAF高于结合部分的MAF。

实施例15

根据制造商的说明书，将定向结合染色质结合蛋白(例如甲基结合结构域(MBD)、克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)、DNA (胞嘧啶-5)-甲基转移酶蛋白(DNMT)、高迁移率族或高迁移率族盒蛋白(HMG或HMGB)、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白(PARP)或p53)的抗体涂覆在Dynabeads M280磁珠上。将珠暴露于多种核小体，包括含有147bp、167bp或187bp DNA的重组单核小体、重组多核小体、用微球菌核酸酶消化的纯化自HeLa细胞的人天然核小体和半甲基化重组单核小体。磁性分离珠，洗涤并使用化学发光标记的抗核小体抗体测量结合的核小体。结果可用于证明用针对染色质结合蛋白的不同抗体涂覆的珠可用于结合和分离核小体，并可用于制备用于本发明方法的免疫吸附剂，以结合含有特定结构、性质或生物来源的核小体和/或富集或耗尽样品中的这些核小体。

实施例16

将定向结合染色质结合蛋白(例如甲基结合结构域(MBD)、克罗莫结构域解旋酶DNA结合蛋白(CHD)、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶蛋白(DNMT)、高迁移率族或高迁移率族盒蛋白(HMG或HMGB)、聚[ADP-核糖]聚合酶蛋白(PARP)或p53)的抗体涂覆在微量滴定孔。封闭每个孔并加入样品。孵育后，弃去样品，洗涤孔并使用化学发光标记的抗核小体抗体测量结合的核小体。结果证明用不同抗体涂覆的孔可用于含有染色质结合蛋白(例如MBD、CHD、DNMT、HMG、HMGB或PARP)的核小体的免疫测定。

在另一个实验中，所用的第二抗体不是一般的抗核小体抗体，而是定向结合核小体的特定表观遗传学特征(例如组蛋白同种型、组蛋白修饰或与核小体加合的蛋白)。

实施例17

按照制造商的说明书，将定向结合组蛋白同种型H2AZ的抗体涂覆在DynabeadsM280磁珠。洗涤珠并加入样品。孵育后，弃去样品并再次洗涤磁珠。现在结合到固相的核小体富含不含接头DNA的核小体。分离的结合的核小体可例如通过质谱或通过核小体相关DNA的测序来分析。

实施例18

我们注意到，作为一般观察结果，与使用相同的第二抗体对含有组蛋白修饰H3K36Me3或H3K27Me3的核小体的测定相比，设计为使用在组蛋白尾中氨基酸4-8位处的表位定向结合组蛋白H3的第一抗体和定向结合核小体中其他地方的第二抗核小体抗体测量总核小体水平的测定有时对患者样品给出更低的结果。由于经修饰的核小体的子集的真实浓度不能超过总核小体的真实浓度，所以这是异常的观察结果。我们推断这个发现可能是由于含有经剪切的组蛋白的核小体的存在。据预测，这种经剪切的核小体在氨基酸4-8位处不含表位(因为它已被去除)，但在位置27和36处含有赖氨酸。

我们将不含经剪切的组蛋白的重组多核小体暴露于蛋白酶组织蛋白酶，其在氨基酸21位处切割H3的组蛋白尾。该消化的成功通过蛋白印迹证实。然后我们使用两对不同的抗体分析经蛋白酶处理的和未经处理的重组多核小体。第一种抗体对(对1)是上述抗体对，其由在组蛋白尾氨基酸4-8位处的表位定向结合组蛋白H3的一种抗体和定向结合核小体中其他地方的一种抗核小体抗体组成。第二种抗体对(对2)由在氨基酸30-33位处的表位定向结合组蛋白H3的一种抗体和定向结合核小体中其他地方的相同抗核小体抗体组成。

如所预期的，对于未经处理的不含经剪切的组蛋白的重组多核小体，两种抗体对给出等同的信号。对于经蛋白酶处理的和未经处理的多核小体，抗体对2给出了的等同的信号。这也是预期的，因为剪切位点在抗体结合位点下方，所以所有的核小体都含有对2中两种抗体的结合位点。然而，对于经蛋白酶处理的多核小体，抗体对1给出比未经处理的多核小体更低的信号。我们得出结论，这是因为剪切位点在氨基酸4-8位处的抗体结合位点的上方，所以从大部分核小体中去除了抗体的结合位点。

我们还使用设计用于测量含有经剪切的组蛋白的核小体的免疫测定来测量经蛋白酶处理和未经处理的多核小体。该测定使用仅靶向结合经剪切的组蛋白H3的抗体与定向结合核小体中其他地方的相同抗核小体抗体的组合。该测定对于未经处理的多核小体给出了阴性结果并对于经蛋白酶处理的多核小体给出了阳性结果。

这些结果，示于图7，证明我们能够选择性地结合含有经剪切的组蛋白的核小体，在固相支撑物上分离这些核小体，并通过任何方法(包括免疫测定或质谱)分析它们。本领域技术人员将清楚，还可以分析固定的含有经剪切的组蛋白的核小体的任何合适的表观遗传学特征。类似地，可以通过包括任何DNA测序方法的任何方法分析与分离的含有经剪切的组蛋白的核小体相关的DNA。

实施例19

我们通过在细菌大肠杆菌(Escherichia coli)中表达产生组蛋白H1.0蛋白。我们使用组蛋白H1的H1.0同种型，因为我们发现该同种型在本发明的方法中表现良好。组蛋白H1.0蛋白用于涂覆商业上可获得的磁珠并加入到含有商业上可获得的Hela细胞单核小体(通过消化Hela细胞染色质产生)、Hela细胞多核小体、含有组蛋白H3.1和147bp DNA的重组单核小体，和含有组蛋白H3.1和167bp DNA的重组单核小体的制剂的溶液中。磁性分离珠，洗涤并使用化学发光标记的抗组蛋白H3.1抗体测量结合的核小体。结果示于图8，表明磁珠结合含有接头DNA的多核小体和单核小体(Hela单核小体和含有167bp DNA的重组单核小体)，但不结合不含接头DNA的单核小体(含有147bp DNA的重组单核小体)。

实施例20

将用涂覆了小牛胸腺组蛋白H1蛋白的甲苯磺酰基活化的M280磁珠暴露于如上实施例19所述的含有商业上可获得的Hela细胞单核小体(通过消化Hela细胞染色质产生)、Hela细胞多核小体、含有组蛋白H3.1和147bp DNA的重组单核小体，和含有组蛋白H3.1和167bp DNA的重组单核小体的制剂的溶液中。磁性分离珠，洗涤并使用高摩尔浓度缓冲液从珠上洗脱结合的核小体。通过使用酶标记的抗组蛋白H3.1抗体开发的蛋白印迹法分析洗出物。结果示于图9。来自暴露于Hela多核小体的珠的磁珠洗出物产生强组蛋白H3.1条带，而暴露于含有接头DNA的单核小体(Hela单核小体和含有167bp DNA的重组单核小体)产生较弱组蛋白H3.1条带，但来自暴露于含有组蛋白H3.1但不含接头DNA的单核小体(含有147bpDNA的重组单核小体)的珠的洗出物未观察到条带。

实施例21

通过染色质消化制备的商业Hela细胞单核小体制剂可包含含有147bp DNA和167bp DNA片段的两种单核小体的混合物。我们购买了商业上可获得的Hela细胞单核小体的制剂，并使用Agilent生物分析仪分析制剂的相关DNA片段的尺寸。我们观察到，如图10(a)中所示，制剂给出约147bp的最大DNA片段尺寸的峰。然而，峰不是对称的，而是包含对应于存在较长DNA片段的肩峰。

将涂覆组蛋白H1.0蛋白的磁珠暴露于Hela细胞单核小体制剂。磁性分离珠并洗涤。然后，使用用于分离游离循环DNA片段的Qiagen DNA提取试剂盒提取在珠上分离的组蛋白H1.0结合的核小体相关DNA片段部分以及残留在溶液中的未结合的核小体相关DNA片段部分。使用Agilent生物分析仪分析结合和未结合的DNA部分的碱基对长度。结果示于图10(b)，并且显示未结合的部分含有大部分核小体，并且分析给出对应于约147bp DNA尺寸的生物分析峰。然而，没有观察到未经处理的制剂中存在的对应于较长DNA片段的肩峰。组蛋白H1.0-珠结合部分的分析给出较小的DNA峰，最大值对应于较长的DNA片段尺寸。

实施例22

使用Agilent生物分析仪分析通过染色质消化制备的商业上可获得的Hela细胞单核小体(包括含有147bp DNA和167bp DNA片段的单核小体)的相关DNA片段的尺寸，其中使用或不使用本发明的方法预先分离。

将新鲜制备的涂覆组蛋白H1.0蛋白的MyOne甲苯磺酰基活化的磁珠暴露于Hela细胞单核小体制剂，使用优化的珠与单核小体比率。磁性分离珠并洗涤。然后，使用用于分离游离循环DNA片段的QIAamp®循环核酸试剂盒，从未经处理的Hela核小体制剂以及处理后从珠上分离的组蛋白H1.0结合的核小体部分和从溶液上清液中残留的未结合部分提取DNA。使用Agilent生物分析仪分析未经处理的、与珠结合的和未结合的上清液DNA部分的碱基对长度。生物分析仪结果示于图11，并显示用H1涂覆的磁珠处理样品后上清液中残留的未结合DNA部分给出对应于约147bp DNA尺寸的生物分析仪峰，其与对应于包含与H1结合核小体相关的接头DNA的较长DNA片段(约167bp)的峰清楚地分离。从未经处理的Hela核小体制剂中提取的DNA在结合部分和未结合部分之间有一个中等尺寸的峰。

实施例23

使用Agilent生物分析仪分析取自3名患有结直肠癌的患者和2名健康志愿者的血浆样品的相关DNA片段的尺寸，其中使用和不使用本发明的方法预先分离。随后，类似地分析取自另外6名患有结直肠癌的患者的血浆样品。

将涂覆组蛋白H1.0蛋白(购自Sigma)的MyOne甲苯磺酰基活化的磁珠暴露于血浆样品。磁性分离珠并洗涤。然后，使用用于分离游离循环DNA片段的QIAamp®循环核酸试剂盒，从未经处理的血浆样品以及处理后从珠上分离的组蛋白H1.0结合的核小体血浆部分和从溶液上清液中残留的未结合染色质血浆部分提取DNA。使用Agilent生物分析仪分析未经处理的、与珠结合的和未结合的上清液DNA部分的碱基对长度。前3个癌症样品的生物分析仪结果示于图12，而随后6个癌症样品的结果示于图13。健康受试者的结果示于图14。3名癌症患者的结果定性地类似于在实施例22中对Hela核小体观察到的结果，并且显示用H1涂覆的磁珠处理样品后残留在上清液中的未结合的DNA部分给出对应于约147bp的DNA尺寸的生物分析峰，并且该峰与对应于包含与H1结合核小体相关的接头DNA的较长DNA片段(约167bp)的峰很好地分离。生物分析仪结果是对片段尺寸概况的分析，且不是精确定量的。然而，显然癌症样品的峰高度是不同的，从低于50FU到大约2000FU。尽管如此，无论存在的cfDNA水平如何，在所有情况下在片段尺寸概况中都发生峰的分离，表明峰概况是癌症核小体的特征，无论其数量如何。与癌症患者的结果相反，2名健康受试者的结果显示，2名受试者的cfDNA水平均较低，并且3个峰之间的差异较小。显然，H1-结合的、未结合的和未经处理的峰在癌症患者和健康受试者中的高度和相对位置是定性和定量不同的，并且可以单独地或组合地用作检测或诊断疾病的方法。特别地，在用含有接头DNA的核小体的结合物处理后，上清液中存在大量约147bp长的DNA片段(与不含接头DNA的核小体有关，而因此不结合H1)，可用作检测或诊断疾病的方法。

实施例24

使用Agilent生物分析仪分析取自2名患有肺癌的患者和1名患有结直肠癌的患者的血浆样品的相关DNA片段的尺寸，其中使用和不使用类似于实施例23所述的方法预先分离，但使用用购自HMGBiotech的HMGB1蛋白制剂涂覆的MyOne甲苯磺酰基活化的磁珠。癌症样品的生物分析仪结果示于图15。3名癌症患者的结果与实施例22中对Hela核小体观察到的结果定性地类似，并且显示用HMGB1涂覆的磁珠处理样品后上清液中残留的未结合DNA部分给出对应于约147bp DNA尺寸的生物分析峰，并且该峰与对应于包含与HMGB1结合核小体相关的接头DNA的较长DNA片段(约167bp)的峰很好地分离。

实施例25

使用所述的组蛋白H1涂覆磁珠富集取自一名患有结直肠癌的患者的血浆样品中含有短DNA片段的核小体。从未经处理的血浆样品以及与珠结合和上清液DNA部分分离DNA，并制备单链文库用于下一代测序。将文库分开，一半在测序前进行外显子组捕获(全外显子组测序-WES)，而其余的直接测序(全基因组测序-WGS)。在来自Illumina的Nova-seq上进行测序，且WEC获得约300X覆盖度，而WGS获得30X覆盖度。使用商业上可获得的试剂盒(Swift1S Accel和Claret Bio SRSLY)成功产生文库。在上清液部分中发现的DNA片段尺寸分布(文库产生前和文库产生后)小于与珠结合和未经处理部分的DNA片段尺寸分布。除了具有较小的DNA片段之外，上清液部分具有增加的已知癌症突变频率。例如，BRAF基因的突变等位基因分数在与珠结合DNA部分中为42％，而在上清液部分为58％。未经处理血浆的突变等位基因分数为50％。

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Claims (25)

1.一种用于从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从所述样品中分离在步骤(i)中结合所述结合剂的核小体。

2.一种用于从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合：

(a) 核小体相关接头DNA；

(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或

(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及

(ii)从所述样品中分离在步骤(i)中不结合所述结合剂的核小体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中结合核小体相关接头DNA的所述结合剂是选自组蛋白H1、macroH2A或其片段或工程改造的类似物的组蛋白蛋白质。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中结合核小体相关接头DNA的所述结合剂是染色质结合蛋白或其片段或工程改造的类似物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中结合接头DNA的所述染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解螺旋酶DNA结合(CHD)蛋白；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶(DNMT)蛋白；

(c) 高迁移率族盒蛋白(HMGB)蛋白质；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶(PARP)蛋白；或

(e) 甲基-CpG-结合结构域(MBD)蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)。

6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与结合接头DNA的染色质结合蛋白结合的所述结合剂选自抗体、affimer或适体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中结合接头DNA的所述染色质结合蛋白选自：

(a) 克罗莫结构域解螺旋酶DNA结合(CHD)蛋白；

(b) DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶(DNMT)蛋白；

(c) 高迁移率族盒蛋白(HMGB)蛋白质；

(d) 聚[ADP-核糖]聚合酶(PARP)蛋白；或

(e) 甲基-CpG-结合结构域(MBD)蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与接头DNA相关的所述核心核小体特征是组蛋白变体macroH2A。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述方法还包括：

(iii) 通过免疫测定、质谱和/或DNA分析分析步骤(ii)中分离的无细胞核小体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iii)包括分析所述分离的无细胞核小体的表观遗传学核小体特征，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸或经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)、与所述核小体加合的蛋白或其组合。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述DNA分析包括DNA测序，包括下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR，包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR)、等温扩增、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，所述方法还包括将步骤(i)中结合的所述样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生物流体样品选自血液、血清或血浆样品。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述样品与多于一种类型的结合包含接头DNA的核小体的结合剂接触。

15.一种用于从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合经剪切的组蛋白分子，其中全部或部分组蛋白尾缺失；

(ii)从所述样品中分离在步骤(i)中结合所述结合剂的核小体。

16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括：

(iii) 通过免疫测定、质谱和/或DNA分析分析步骤(ii)中分离的无细胞核小体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(iii)包括分析所述分离的无细胞核小体的表观遗传学核小体特征，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸或经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)、与所述核小体加合的蛋白或其组合。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述DNA分析包括DNA测序，包括下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR，包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR)、等温扩增、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)。

19. 一种从生物流体样品中分离纯化的循环肿瘤DNA(ctDNA)的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 进行权利要求2-18中任一项所述的方法；和

(ii)从所述分离的核小体中提取所述DNA。

20. 一种诊断癌症的方法，其包括：

(i) 进行权利要求2-18中任一项所述的方法，以从得自患者的生物样品中分离循环肿瘤核小体；和

(ii) 分析分离的循环肿瘤核小体和/或相关的DNA。

21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(ii)包括分析所述分离的循环肿瘤核小体的表观遗传学核小体特征，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸或经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)、与所述核小体加合的蛋白或其组合。

22.根据权利要求20所述的方法，其中使用DNA测序，例如选自下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR，包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR)、等温扩增、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)的测序方法分析所述相关的DNA。

23.一种用于获得优先结合疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使用含有约150个碱基对或更少碱基对的DNA的核小体作为抗原，针对所述抗原产生抗体或其他结合剂；

(ii)将在步骤(i)中获得的所述抗体或其他结合剂呈递给含有约165个碱基对或更多碱基对的DNA的核小体；和

(iii)选择结合步骤(i)的核小体但不结合步骤(ii)的核小体的所述抗体或其他结合剂。

24.一种用于获得优先结合非疾病来源的无细胞核小体的抗体或其他结合剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i) 使用含有约165个碱基对或更多DNA的核小体作为抗原，针对所述抗原产生抗体或其他结合剂；

(ii)将在步骤(i)中获得的所述抗体或其他结合剂呈递给含有约150个碱基对或更少DNA的核小体；和

(iii)选择结合步骤(i)的核小体但不结合步骤(ii)的核小体的所述抗体或其他结合剂。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述方法包括噬菌体展示文库抗体选择。

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