ES2833010T3

ES2833010T3 - Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para CD19

Info

Publication number: ES2833010T3
Application number: ES15760045T
Authority: ES
Inventors: Yan Chen; Steve Shamah; Csaba Pazmany; Jui Dutta-Simmons
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2021-06-14
Anticipated expiration: 2035-08-28
Also published as: KR20230167766A; CU24494B1; RU2017110044A; MA40497A; BR112017003505A2; CN114106181A; CU20170023A7; AU2021203056A1; IL250831B2; TWI751102B; WO2016033570A1; KR102826436B1; MX2021013336A; EP3186280A1; RU2020144342A; SA517380971B1; TW201625686A; JP6727192B2; CN114106181B; TWI805109B

Abstract

Un anticuerpo de unión a CD19 o su fragmento de unión a antígeno de unión a D19 que comprende: una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para CD19

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 62/043.273 presentada el 28 de agosto de 2014, titulada ''Antibodies and Chimeric Antigen Receptors Specific for CD19", y la aplicación provisional de Estados Unidos N° 62/078.942 presentada 12 de noviembre de 2014, titulado "Antibodies and Chimeric Antigen Receptors Specific for CD19".

Incorporación por referencia de listado de secuencias

[0002] La presente solicitud está siendo presentada con una lista de secuencias en formato electrónico. La lista de secuencias se proporciona como un archivo titulado 735042000740seqlist.txt, creado el 28 de agosto de 2015, con un tamaño de 215 kilobytes.

Campo

[0003] La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a moléculas de unión a CD19, en particular, a anticuerpos anti-CD19, incluyendo fragmentos de anticuerpos. La presente divulgación se refiere además a receptores recombinantes que contienen dichos anticuerpos, incluidos receptores de antígenos quiméricos (CAR), que contienen dichos anticuerpos. La divulgación se refiere además a células modificadas genética que expresan tales receptores y anticuerpos, y su uso en terapia celular adoptiva.

Antecedentes

[0004] El CD19 se expresa en células B normales y en células y tejidos de diversas enfermedades y afecciones, incluidas la mayoría de las neoplasias malignas de células B. La mayoría de los pacientes con neoplasias malignas de células B no se curan con las terapias disponibles, incluidas las terapias dirigidos a CD19 y/u otros marcadores de células B. Se encuentran disponibles diversas moléculas de unión a CD19, que incluyen anticuerpos anti-CD19 y receptores de antígenos quiméricos que contienen porciones de anticuerpos anti-CD19, y células que expresan dichos receptores quiméricos. Se necesitan moléculas de unión a CD19 mejoradas y células dirigidas a CD19 diseñadas. Por ejemplo, existe la necesidad de moléculas y células con inmunogenicidad reducida y/o anticuerpos humanos, incluidos fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a CD19 y receptores quiméricos que expresan dichos anticuerpos humanos para su uso en terapia celular adoptiva. Se proporcionan instancias que satisfacen tales necesidades.

[0005] El documento WO2012170807 describe moléculas de unión anti-Pseudomonas PSL y usos de las mismas.

[0006] El documento WO2009054863 describe anticuerpos humanos que se unen a CD19 y sus usos.

[0007] El documento WO2009091826 describe composiciones y métodos relacionados con un receptor de antígeno quimérico específico de CD19 humano.

[0008] El documento US2005070693 describe una terapia que usa anticuerpos anti-CD-19.

[0009] Kochenderfer et al. (2012) describen el agotamiento de las células B y las remisiones de la malignidad junto con la toxicidad asociada a las citocinas en un ensayo clínico de células T anti-CD19 quiméricas-antígeno-receptortarnsducidas (Blood, vol.119 (12): 2709-2720).

[0010] Turtle et al. (2016) describen las células CD19 CAR-T de composición definida CD4+: CD8+ en pacientes adultos con l La de células B (The Journal of Clinical Investigation, vol.126 (6): 2123-2138).

Sumario

[0011] El objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

[0012] La invención proporciona anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende: una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; o una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos a continuación. La siguiente divulgación proporciona moléculas de unión a CD19, incluidos polipéptidos, como anticuerpos anti-CD19, incluidos fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos, como fragmentos de cadena sencilla, incluidos fragmentos de scFv, y polipéptidos que contienen dichos anticuerpos, incluidas proteínas de fusión, receptores, p. ej., receptores recombinantes, incluidos los receptores quiméricos como los receptores de antígenos quiméricos (CAR) que contienen el anticuerpo como componente de reconocimiento de antígenos. En casos particulares, los anticuerpos son anticuerpos humanos, tales como fragmentos de cadena sencilla humanos que incluyen scFv.

[0013] Se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluidos aquellos que se unen específicamente a CD19. En algunos casos, los anticuerpos contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) particulares, incluidas las CDR de cadena pesada (CDR-H) y CDR de cadena ligera (CDR-L). En algunos casos, las CDR tienen o incluyen secuencias de aminoácidos de las CDR de un anticuerpo de referencia o cadena o secuencia del mismo.

[0014] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de la misma región incluye una variable de cadena pesada de unión al antígeno (VH) y una variable de cadena ligera (VL) región. En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., la región VH del mismo, incluye una región 3 que determina la complementariedad de la cadena pesada (CDR-H3) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 20. En algunos casos, la región VH comprende en al menos al o aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la región VH establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 o 62, p. ej., al menos al o aproximadamente el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los mismos. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye una CDR-H1 de SEQ ID NO: 18 y una CDR-H3 de SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye además una secuencia de CDR-H2 que comprende SEQ ID NO: 81,82, 19 o 72.

[0015] En algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-H1, una CDR-H2, y/o una CDR-H3 que incluyen, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las secuencias de CDR 1, 2 y 3 contenidas dentro de la región variable de cadena pesada (Vh) de un anticuerpo de referencia. En algunos casos, la región VH del anticuerpo de referencia tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11 o 12. En algunos casos, tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, o 62.

[0016] En algunos casos, el anticuerpo tiene, p. ej., incluye además, una CDR-L1, una CDR-L2, y/o una CDR-L3, respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos de secuencias CDR 1, 2 y 3 contenidas dentro de la región variable de cadena ligera (Vl) de un anticuerpo de referencia. En algunos casos, la Vl del anticuerpo de referencia tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, o 17. En algunos casos, la VL del anticuerpo de referencia tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 65, 64, 66, 70, 69, 67, 90 o 91.

[0017] En algunos casos, el CDR dentro del anticuerpo de referencia, VH, o VL se refiere a la CDR definida por cualquier esquema de numeración, p. ej., los definidos en el presente documento. En algunos casos, la CDR en el anticuerpo de referencia o VH o VL se refiere a la CDR como se define por el esquema de numeración de Kabat como se describe en este documento, la CDR como se define en el esquema de Chothia como se describe en este documento, o el esquema de contacto como se describe en este documento.

[0018] En algunos casos, el anticuerpo contiene una cadena VH que incluye una CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3 en la que la CDR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos de DYAMH (SEQ ID NO: 18) o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 18; la CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 o 82 o 19 o 72 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 81 o con SEQ ID NO: 82 o con SEQ ID NO: 19 o con SEQ ID NO: 72; y/o la CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad amino ácido de secuencia con SEQ ID NO: 20.

[0019] En algunos casos, el anticuerpo comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 o 82, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuestas como SEQ ID NO: 20.

[0020] En algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 110), en la que X1 es T, W, S o R; X2 es G o A; X3 es I, T, D o S; X4 es S, R, T o Q; X5 es nulo o S; X6 es nulo, D, N o G; X7 es nulo, V o L; X8 es Xo nulo; X9 es Xo nulo; X10 es X; X11 es X; X12 es Y, F, D o W; X13 es V, A o L y X14 es S, N o A. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo tiene una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1 X2 X3 X4 X5 X6X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 (SEQ ID NO: 111), donde X1 es T, Q, S o R; X2 es G o A; X3 es I, T, D, o S; X4 es S, R, T o Q; X5 es nulo o S; X6 es G, D, N o nulo; X7 es nulo, V o L; X8 es D, G, I, L, S, o nulo; X9 es S, G, A, I, R o nulo; X10 es H, Y, F, S o N; X11 es R, N, D, H, o Y; X12 es Y, F, D o W; X13 es V, A o L; y X14 es S, N, o A; y/o

una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 112), en la que X1 es D o S; X2 es F, V, N, K o A; X3 es S, T, D, o N; X4 es K, V, N, Q, o R; X5 es R, V, o L; X6 es P, K, A o E; y X7 es S, P, A o T, y/o una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 115), donde X1 es X; X2 es S, Q, A o T; X3 es Y, S, W, R; X4 es A, D, R, T, o Y; X5 es X; X6 es X; X7 es S, P, L, Y, G; X8 es Xo nulo; X9 es Xo nulo; X10 es L o nulo; X11 es X; y X12 es V, T o L. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 114), donde X1 es S, G, T, A, Q, C o N; X2 es S, Q, A o T; X3 es Y, S, W, R; X4 es A, D, R, T, o Y; X5 es A, S, P, G, N o D; X6 es I, S, G, T, A, L, H, R, N; X7 es S, P, L, Y, G; X8 es P, T, S, Q, M, R, N o nulo; X9 es S, L, N, A, M o nulo; X10 es L o nulo; X11 es Y, W, F, V, A o L; y X12 es V, T, o L.

[0021] En algunos de tales casos, en dicha CDR-L1, X3 es I, T, o S; X4 es S, T o Q; X8 es D, G, I, S, o nulo; X9 es S, G, I o nulo; X10 es H, Y, S o N; X11 es R, N, D, o H; X12 es Y o D; y X13 es V o L; y/o en dicho CDR-L2, X1 es D; X4 es K, V, N, Q, o R; X6 es P, K o A; y X7 es S, A, o T; y/o en dicho CDR-L3, X1 es S, G, T, A, Q, C, o N; X5 es A, S, P, G, N, o D; X6 es I, S, G, T, A, L, H, R o N; X8 es P, T, S, Q, M, R, N o nulo; X9 es S, L, N, A, M o nulo; y X11 es Y, W, F, V, A o L. En algunos casos, en dicho CDR-L3, X1 es S, G, Q o N; X2 es S, Q o T; X4 es A, D, T, o Y; X5 es A, S, o G; y X6 es I, S, N, R, A, H, o T.

[0022] En algunos casos, el CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG); o la CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72 (GISWNSGSIGYADSVKG).

[0023] En algunos casos, la CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21, 25, 28, o 31. En algunos casos, la CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 78, 21, o 28.

[0024] En algunos casos, el CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29 o 32. En algunos casos, la CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 98, 22, o 29.

[0025] En algunos casos, el CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30 o 33. En algunos casos, la CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 107, 24 o 30.

[0026] En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 21, 22, y 23, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 21, 22 y 24 o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente; la CDR-L1, CDR-L2 y CDRL3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 25, 26 y 27, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 28, 29 y 30, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 31, 32 y 33, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 80, 100 y 109, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 77, 97 y 106, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 74, 94 y 103, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 73, 93 y 101, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 75, 95 y 104, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 79, 99 y 108, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 78, 98 y 107, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 76, 96 y 105, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 73, 93 y 102, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; o la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 77, 97 y 106, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma.

[0027] En algunos casos, el CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 120, o 121, o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma.

[0028] En algunos casos, las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 18, 81, y 20, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 18, 19 y 20, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; la CDR-H1, CDR-H2 y CDRH3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 18, 82 y 20, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma; o las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 18, 72 y 20, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente, con la misma.

[0029] En algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13S (SEQ ID NO: 36), donde X1 es T, S o Q, X3 es T, S o D, X4 es T o S, X5 es nulo o S, X6 es nulo, D o N, X7 es nulo o V, X8 es nulo, G o I, X9 es nulo, G o R, X10 es S, Y o N, X11 es D o N, X12 es D o Y, X13 es V o A; la CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4 RPS (SEQ ID NO: 37), donde X1 es D o S, X2 es V, N o K, X3 es S, N o D y X4 es K, Q o N; y/o la CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 113), donde X1 es C, S, A, G o N; X2 es S, A o T; X3 es Y, W o R; X4 es A o D; X5 es G, D o S; X6 es R, S o N; X7 es Y, L o G; X8 es N o S; X9 es S, N o nulo; X10 es nulo; X11 es V, A o W; y X12 es L o V.

[0030] En algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13S (SEQ ID NO: 36), donde X1 es T, S o Q, X3 es T, S o D, X4 es T o S, X5 es nulo o S, X6 es nulo, D o N, X7 es nulo o V, X8 es nulo, G o I, X9 es nulo, G o R, X10 es S, Y o N, X11 es D o N, X12 es D o Y, X13 es V o A; la CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos X 1 X 2 X3 X 4 RPS (SEQ ID NO: 37), donde X1 es D o S, X2 es V, N o K, X3 es S, N o D y X4 es K, Q o N; y/o la CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 38), donde X1 es C, S, A, G o N; X2 es S, A o T; X3 es Y, W o R; X4 es A o D; X5 es G, D o S; X6 es R, S o N; X7 es Y, L o G; X8 es N o S; X9 es S o nulo; X10 es V, A o N; X11 es W o nulo; y X12 es L o V.

[0031] En algunas de tales casos, en la CDR-L1, X1 es T o S, X3 es T o S, X11 es D o N, y X13 es V; y/o en el CDR-L2, X2 es V o N y X4 es K o P.

[0032] En algunos casos, el CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG) o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 19.

[0033] En algunos casos, la CDR-L1 comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 21, 25, 28 o 31 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos; y/o la CDR-L2 comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 22, 26, 29 o 32 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la misma; y/o la CDR-L3 comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 23, 24, 27, 30 o 33 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0034] En algunos casos, la CDR-L1, CDR-L2, y/o CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 21, 22, y/o 23, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente.

[0035] En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 21, 22, y 24, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente.

[0036] En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 25, 26, y 27, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente.

[0037] En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 28, 29, y 30, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente. En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 31, 32 y 33, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0038] En algunos casos, las CDR de cadena pesada y ligera son cualquier combinación de las CDR-L y antes mencionadas secuencias de CDR-H, que incluye secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0039] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0040] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0041] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0042] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0043] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0044] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0045] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0046] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0047] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0048] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0049] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0050] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0051] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0052] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0053] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0054] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0055] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0056] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0057] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0058] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0059] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0060] En casos particulares, el anticuerpo o fragmento comprende una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0061] En casos particulares, la región VH del anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11,60, 63, o 62 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos; y/o la región VL del anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 71,90, 65, 64 o 69 o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0062] En algunos casos, las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12 y 17, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con las mismas, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 15, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 13, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 14, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 16, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 71, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 y 68, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 65, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 60 y 64, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 61 y 66, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 70, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 y 69, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 67, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente;

las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 91, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente; o las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 90, respectivamente, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos, respectivamente.

[0063] En algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 13; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 14; en algunos casos, la región VH comprende SEQ ID NO: 11 y la región VL comprende SEQ ID NO: 15; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 16, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la misma; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 17, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0064] En algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 12 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 13; en algunos casos, la región VH comprende SEQ ID NO: 12 y la región VL comprende SEQ Id NO: 14; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 12 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 15; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 12 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 16, o secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la misma; en algunos casos, la región VH comprende la SEQ ID NO: 12 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 16, o las secuencias que tienen al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0065] En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de cadena única, tal como uno con dos o más regiones variables unidas por uno o más flexible enlazador inmunoglobulina. En algunos casos, el anticuerpo es un scFv. En algunos casos, el scFv comprende un enlazador que es rico en serina y/o glicina, como un enlazador que comprende repeticiones de GGGS (SEQ ID NO: 122) o Gg Gg S (SEQ ID NO: 123), como una que comprende el conjunto de secuencias adelante SEQ ID NO: 34. En algunos casos el enlazador comprende una secuencia de SEQ ID NO: 43.

[0066] En algunos casos, el fragmento de anticuerpo, p. ej., scFv, contiene una región Vh o porción de la misma, seguido de un enlazador, seguido de una Vl o partes de la misma. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo, p. ej., scFv, contiene una región Vl o una porción de la misma seguida de un enlazador, seguida de una región Vh o porción de la misma.

[0067] En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, o 10, o una secuencia que tiene al menos o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con los mismos.

[0068] En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 87, o 89, o tiene una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia.

[0069] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento se une específicamente a la misma, similar, y/o una superposición de epítopo de CD19 como el epítopo unido específicamente por un anticuerpo de referencia, y/o los compite de anticuerpos para la unión a CD19 con la referencia anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo anti-CD 19 murino o quimérico o humano o humanizado, FMC63, SJ25C1, un anticuerpo que tiene una secuencia de región variable de SEQ ID NO: 39 y/o 40, o un anticuerpo que tiene una variable secuencia de región de SEQ ID NO: 41 y/o 42. En algún aspecto, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo que incluye una secuencia como se describe en este documento, que incluye la secuencia o secuencias de cualquiera de los casos mencionados anteriormente. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo de referencia puede ser un scFv que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57., 59, 87 u 89. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento proporcionado contiene una o más o todas las CDR que son distintas de las del anticuerpo de referencia. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo o fragmento proporcionado contiene una o más o todas las CDR que son distintas de las CDR correspondientes en el anticuerpo designado FMC63 o SJ25C1.

[0070] Por ejemplo, se proporcionan anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno que específicamente se unen al mismo o un epítopo de la superposición de CD19 como el epítopo unido específicamente por el anticuerpo de referencia, tales como FMC63, SJ25C1, un anticuerpo que tiene una secuencia de región variable de SEQ ID NO: 39 y/o 40, o un anticuerpo que tiene una secuencia de región variable de SEQ ID NO: 41 y/o 42, y que comprende CDR de cadena pesada y ligera que son distintas de las CDR presentes en el anticuerpo de referencia.

[0071] En algunos casos, el anticuerpo compite para la unión con el anticuerpo de referencia a al menos el mismo grado como compite el anticuerpo de referencia para la unión consigo mismo a CD19, o un grado de competencia que no más de 1,5 a 2 veces más bajo, 3 veces más bajo, 4 veces más bajo, 5 veces más bajo o 10 veces más bajo que la competencia por el anticuerpo de referencia, y/o una CI50 medida que no es más de 1,5 veces o 2 veces o 3 veces o 4 veces o 5 veces o 10 veces mayor que la CI50 del anticuerpo de referencia que compite por unirse consigo mismo, p. ej., medido en el mismo ensayo.

[0072] En algunos casos, el anticuerpo tiene una afinidad de unión que es al menos tan alta o sustancialmente tan alta como la afinidad de unión por CD19 del anticuerpo de referencia. En algunos aspectos, el anticuerpo tiene una afinidad de unión de una CE50 que es aproximadamente igual o menor que el anticuerpo de referencia de CE50 o no más de aproximadamente 1,5 veces o no más de aproximadamente 2 veces mayor, no más de 3 veces mayor, y/o no más de 10 veces mayor que la CE50 del anticuerpo de referencia. En algunos casos, la afinidad de unión del anticuerpo se compara con la forma correspondiente del anticuerpo de referencia. La comparación se realiza generalmente mediante el mismo ensayo o uno similar.

[0073] En algunos de tales casos, CD19 es un CD19 humano. En algunos de dichos casos, el anticuerpo o fragmento se une específicamente, muestra afinidad de unión y/o compite por unirse a CD19 humano.

[0074] En algunos casos, el anticuerpo es humano. En algunos casos, el anticuerpo es recombinante. En algunos casos, el anticuerpo es monoclonal. En algunos casos, se aísla el anticuerpo.

[0075] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. La región constante puede incluir uno o más de CH1, CH2, CH3 y/o CH4, y/o CL, de un anticuerpo humano u otro, y ser de cualquier clase, incluidas IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, p. ej., incluyendo IgG humana, p. ej., IgG1 o IgG4, dominios de región constante. En algunos casos, la región constante comprende o es una región Fc, tal como una región Fc de IgG humana.

[0076] También se proporcionan moléculas tales como moléculas quiméricas y/o de fusión, incluyendo receptores, tales como receptores recombinantes, que incluyen el anticuerpo de cualquiera de los casos (p. ej., contenido en o parte de un dominio extracelular) y dominios adicionales, tales como dominios de señalización intracelular, espaciadores, enlazadores y/o dominios transmembrana. En algunos casos, el receptor es un receptor de antígeno quimérico, que comprende una porción extracelular que comprende el anticuerpo o fragmento de cualquiera de los casos y un dominio de señalización intracelular.

[0077] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento comprende un scFv. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un ITAM y/o un dominio de señalización capaz de entregar una señal que se aproxima a la de la ligadura natural de una molécula que contiene ITAM o complejo receptor tal como un complejo receptor TCR. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z).

[0078] En algunos casos, el receptor incluye además uno o más dominios, como un dominio transmembrana, que une el dominio transmembrana anticuerpo que une el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana comprende una porción transmembrana de una molécula coestimuladora, tal como una molécula coestimuladora de células T, p. ej., CD28 y/o 41BB. En algunos casos, la molécula coestimuladora de células T se selecciona del grupo que consiste en CD28 y 41BB y, en algunos casos, el receptor incluye dominios de señalización de CD28 y 41BB.

[0079] También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (incluyendo fragmentos) de cualquiera de las instancias o el receptor, p. ej., receptor antígeno quimérico de cualquiera de los casos, los vectores que incluyen tales ácidos nucleicos, y células que contienen los vectores y/o ácidos nucleicos, p. ej., para la expresión de anticuerpos y/o moléculas.

[0080] Por lo tanto, también se proporcionan las células y vectores para producir y expresar las moléculas, incluyendo los anticuerpos y moléculas tales como los receptores, p. ej., receptores de antígenos quiméricos (CAR). Por ejemplo, se proporcionan células modificadas genéticamente que expresan el receptor de antígeno quimérico de cualquiera de los casos. En algunos aspectos, la célula es una célula T. En algunos aspectos, la célula es una célula NK. En algunos aspectos, la célula es una célula madre.

[0081] También se proporcionan composiciones que comprenden los anticuerpos, receptores, moléculas y/o células, incluyendo composiciones farmacéuticas, p. ej., que incluye además las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como portadores.

[0082] También se proporcionan métodos de administración, incluyendo los métodos de tratamiento, llevados a cabo mediante la administración de la célula, un anticuerpo, receptor, composición, u otra molécula, de cualquiera de los casos, a un sujeto, p. ej., de una manera eficaz, p. ej., cantidad terapéuticamente eficaz. En algunos casos, el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno asociado con CD19, como una neoplasia maligna de células B, como leucemia linfocítica crónica de células B (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemias pro-linfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comunes, leucemias linfoblásticas agudas nulas, linfomas no Hodgkin, linfomas difusos de células B grandes (DLBCL), mielomas múltiples, linfoma folicular, linfoma esplénico de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolentes, o linfoma de Hodgkin, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria en la que están implicadas las células B.

[0083] En algunos casos, la administración del anticuerpo o receptor está asociada con un menor grado de inmunogenicidad en comparación con la administración de un anticuerpo de referencia (o receptor que contiene el anticuerpo de referencia) que compite por la unión con el anticuerpo o une a un epítopo superpuesto. En algunos aspectos, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo humanizado, quimérico o no humano.

Breve descripción de los dibujos

[0084]

Figura 1: Las Figuras 1A y 1B muestran los resultados de un ensayo de unión comparando la unión de los scFv humanos ejemplares para CD19 que expresan células HEK293 en comparación con la unión a células HEK293 que no expresan CD 19. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 2 muestra un gel de SDS que evalúa la purificación de anticuerpos anti-CD19 ejemplares (fragmentos scFv).

Figura 3: Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran resultados de estudios que evalúan las afinidades de unión de varios anticuerpos scFv ejemplares (fragmentos scFv), incluidos los anticuerpos anti-CD19. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 4 muestra los resultados de estudios que evalúan las afinidades de unión de varios anticuerpos scFv ejemplares, que incluyen fragmentos de anticuerpo scFv antiCD19. IFM = intensidad de fluorescencia media.

Figura 5: Las Figuras 5A y 5B muestran los resultados de los ensayos de unión competitiva, evaluando la unión del anticuerpo marcado respectivo en presencia de concentraciones variables de anticuerpos competidores. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 6 muestra los resultados de los ensayos de unión competitiva, que evalúan la unión de un anticuerpo scFv de referencia marcado en presencia de concentraciones variables de anticuerpos scFv competidores. IFM = intensidad de fluorescencia media.

Figura 7: La Figura 7A muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño; se calibró una columna, se inyectaron proteínas estándar y se recogieron fracciones para generar referencias.

La Figura 7B muestra los resultados tras la inyección de un scFv anti-CD19 (clon 18B) en la misma columna y la recogida de la fracción en las mismas condiciones.

La Figura 8A muestra los resultados de un ensayo de unión que evalúa la unión de clones de scFv humanos ejemplares a células que expresan CD19 en orden de izquierda a derecha como sigue: solo células, sobrenadante simulado (Moc. Supe.) anticuerpo de control negativo (Ctrl Neg.), Clon 18, Clones 200 a 287, solo células, Moc. Supe, Ctrl. Neg. y Clon 18. Ejemplos de aciertos que muestran la unión específica de CD19 (indicados por un asterisco) son (en orden de izquierda a derecha): Clon 213, Clon 227, Clon 241, Clon 255, Clon 272, Clon 278, Clon 283 y Clon 285. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 8B muestra los resultados de un ensayo de unión que evalúa la unión de clones de scFv humanos ejemplares a células que expresan CD19 en orden de izquierda a derecha como sigue: células solamente, sobrenadante simulado (Moc. Supe.) Anticuerpo de control negativo (Ctrl Neg.), Clon 18B, Clones 300-387, solo células, Moc. Supe., Ctrl. Neg. y Clon 18B. Ejemplos de aciertos que muestran la unión específica de CD19 (indicado por un asterisco) son (en orden de izquierda a derecha): Clon 302, Clon 305, Clon 313, Clon 314, Clon 318, Clon 324, Clon 327, Clon 328, Clon 336, Clon 339, Clon 377, Clon 379 y Clon 382. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 8C muestra los resultados de un ensayo de unión que evalúa la unión de clones scFv humanos ejemplares a células que expresan CD19 en orden de izquierda a derecha como sigue: células solamente, sobrenadante simulado (Moc. Supe.) Anticuerpo de control negativo (Ctrl Neg.), Clon 18B, Clones 400-487, solo células, Moc. Supe., Ctrl. Neg. y Clon 18B. Los ejemplos de aciertos que muestran la unión específica de CD19 (indicados por un asterisco) son (en orden de izquierda a derecha): Clon 440 y Clon 448.

La Figura 8D muestra los resultados de un ensayo de unión que compara la unión de scFv humanos de ejemplo con células K562 que expresan CD19 en comparación con las células K562 que no expresan CD19. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 9 muestra un gel de SDS que evalúa la purificación de anticuerpos anti-CD19 ejemplares (fragmentos scFv).

Figura 10: Las Figuras 10A-E muestran resultados de ensayos de unión separados que evalúan las afinidades de unión de varios anticuerpos scFv ejemplares, incluidos los fragmentos de anticuerpo scFv anti-CD19. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 11 muestra los resultados de los ensayos de unión competitiva, que evalúan la unión de un anticuerpo scFv de referencia marcado en presencia de concentraciones variables de anticuerpos scFv competidores. IFM = intensidad de fluorescencia media.

La Figura 12A muestra la expresión en la superficie celular de los diversos CAR, en orientación VH-VL (HL) HL; línea oscura) u orientación VL-VH (LH; línea gris), en células T CD8+ transducidos medidas por expresión de EGFRt para células antes del enriquecimiento (pre) y después del enriquecimiento después de la clasificación con un anticuerpo anti-EGFR y la expansión por estimulación con CD19+ B-LCL (publicación). La Figura 12B muestra un gel de SDS que evalúa la expresión de CAR anti-CD19 humanos ejemplares en células T humanas primarias transducidas.

Las Figuras 13A y 13B muestran la actividad citolítica de células T CD8+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD19 contra células que expresan CD19. C es EGFRt solo (control negativo); FM es FMC63 scFv CAR, 18 es Clon 18 scFv CAR, 17 es Clon 17 scFv CAR, 76 es Clon 76 scFv CAR, 5 es Clon 5 scFv CAR y 18B es Clon 18B scFv CAR.

Las Figuras 14A y 14B muestran la secreción de citocinas de células T CD8+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD19 después de cocultivo con células que expresan CD19. C es EGFRt solo (control negativo); FM es FMC63 scFv CAR, 18 es Clon 18 scFv CAR, 17 es Clon 17 scFv CAR, 76 es Clon 76 scFv CAR, 5 es Clon 5 scFv CAR y 18B es Clon 18B scFv CAR.

La Figura 15 muestra la secreción de citocinas de células T CD4+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD19 después de cocultivo con células que expresan CD19. C es EGFRt solo (control negativo); FM es FMC63 scFv CAR, 18 es Clon 18 scFv CAR, 17 es Clon 17 scFv CAR, 76 es Clon 76 scFv CAR, 5 es Clon 5 scFv CAR y 18B es Clon 18B scFv CAR.

Las Figuras 16A y 16B muestran la proliferación de células T CD8+ humanas primarias o células T CD4+, respectivamente, que expresan varios CAR específicos anti-CD19 contra células que expresan CD19 después de cocultivo con células que expresan CD19.

Figura 17: La Figura 17A muestra la actividad antitumoral de células T CD8+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD19 después de la administración a ratones NSG injertados con células Raji que expresan luciferasa de luciérnaga. La Figura 17B muestra la actividad antitumoral de células T CD4+ y CD8+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD 19 y administradas en una proporción 1:1 a ratones NSG injertados con células Raji.

Figura 18: La Figura 18A muestra la secuencia de aminoácidos de una región próxima a la membrana de 74 residuos o 75 residuos para cada una de las tres moléculas de CD19 quiméricas diferentes. Debajo de las tres secuencias mostradas en la Figura 18A, cada posición alineada de la región representada en la que las secuencias humana y rhesus contienen un aminoácido idéntico está marcada con un asterisco ("*"). Las posiciones en las que la secuencia rhesus contiene una sustitución de aminoácidos no idéntica pero conservadora en comparación con la secuencia humana se marcan con un ":". Las posiciones en las que la secuencia rhesus contiene una sustitución de aminoácidos no idéntica pero semiconservadora en comparación con las secuencias humanas se marcan con un ".". Las posiciones en las que la secuencia rhesus contiene una inserción o una sustitución no idéntica, no conservadora/semiconservadora en comparación con la secuencia humana no se marcan con un símbolo. La Figura 18B muestra la secreción de citocinas de células T CD8+ humanas primarias que expresan varios CAR específicos anti-CD19 después del cocultivo con células que expresan moléculas CD19 humanas, CD19 rhesus o CD19 quiméricas rhesus/humanas (V1, V2 o V3). C es EGFRt solo (control negativo); FM es FMC63 scFv CAR, 18 es Clon 18 scFv CAR, 17 es Clon 17 scFv CAR, 76 es Clon 76 scFv CAR, 5 es Clon 5 scFv CAR y 18B es Clon 18B scFv CAR.

Descripción detallada

[0085] Se proporcionan moléculas de unión a CD19, incluyendo anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, tales como fragmentos de cadena sencilla, incluyendo scFv) y los receptores recombinantes, que incluyen receptores quiméricos que contienen tales anticuerpos y fragmentos, ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos y fragmentos y células, tales como células recombinantes, que expresan y para la producción de estos anticuerpos y fragmentos. También se proporcionan métodos para fabricar y usar los anticuerpos y fragmentos, así como células que expresan o contienen los anticuerpos y fragmentos.

I. Moléculas de unión a CD19

[0086] En algunos aspectos se proporcionan moléculas de unión a CD19, tales como polipéptidos de unión a CD19. Dichas moléculas de unión incluyen anticuerpos que se unen específicamente a CD19, como una molécula de CD19 humana, incluidos sus fragmentos de unión a antígeno. También entre las moléculas de unión se encuentran receptores recombinantes tales como receptores de antígenos quiméricos que contienen tales anticuerpos.

A. Anticuerpos CD19

[0087] Se proporcionan anticuerpos anti-CD19, incluyendo fragmentos de anticuerpos funcionales, incluyendo los que comprenden una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, tales como scFv. También se proporcionan moléculas que contienen tales anticuerpos, p. ej., proteínas de fusión y/o receptores recombinantes tales como receptores quiméricos, incluyendo receptores de antígenos. Entre los anticuerpos anti-CD19 proporcionados se encuentran los anticuerpos humanos. En algunos casos, los anticuerpos, tales como los anticuerpos humanos, se unen específicamente a un epítopo o región particular de CD19, generalmente un epítopo o región extracelular. En algunos casos, los anticuerpos se unen al mismo o similar epítopo o región de CD19 unido por otro anticuerpo, tal como uno o más de los anticuerpos de ratón, FMC63 o SJ25C1. En algunos casos, los anticuerpos se unen a un epítopo superpuesto de CD19 unido por uno de estos anticuerpos conocidos y/o compiten por unirse con dicho anticuerpo. Los anticuerpos incluyen anticuerpos aislados. Las moléculas incluyen moléculas aisladas.

[0088] El término "anticuerpo" en este documento se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos (de unión a antígeno) funcionales, incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluidos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (p. ej., sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas genéticamente modificadas y/o de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, p. ej., biespecíficos, anticuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, triscFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" debe entenderse que incluye fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluidos anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluidas IgG y subclases de las mismas, IgM, IgE, IgA e IgD.

[0089] Los términos "región determinante de complementariedad", y "CDR," sinónimo de "región hipervariable" o "HVR", son conocidos en la técnica para referirse a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de las regiones variables de anticuerpos, que confieren especificidad de antígeno y/o afinidad de unión. En general, hay tres CDR en cada región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres CDR en cada región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Las "regiones marco" y "FR" se conocen en la técnica para referirse a las porciones que no son CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. En general, hay cuatro FR en cada región variable de cadena pesada de longitud completa (FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4), y cuatro FR en cada región variable de cadena ligera de longitud completa (FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4).

[0090] Los precisos límites de secuencia de aminoácidos de una CDR dada o FR se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de una serie de esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración "Chothia"), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography", J. Mol. Biol. 262, 732-745. (Esquema de numeración de "Contact"), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains”, Dev Comp Immunol, enero de 2003; 27 (1): 55-77 (esquema de numeración "IMGT"), y Honegger A y Plückthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J Mol Biol, 8 de junio de 2001; 309 (3): 657-70, (esquema de numeración "Aho").

[0091] Los límites de una CDR o FR determinada pueden variar dependiendo del esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se basa en alineaciones estructurales, mientras que el esquema Chothia se basa en información estructural. La numeración de los esquemas de Kabat y Chothia se basa en las longitudes de secuencia de la región de anticuerpos más comunes, con inserciones acomodadas por letras de inserción, p. ej., "30a", y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan ciertas inserciones y eliminaciones ("indeles") en diferentes posiciones, lo que da como resultado g en numeración diferencial. El esquema de contacto se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia.

[0092] La Tabla 1, a continuación, enumera los límites de posición ejemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDRH3 identificados por los esquemas Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de residuos se enumera utilizando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia. Los FR están ubicados entre CDR, p. ej., con FR-L1 ubicado entre CDR-L1 y CDR-L2, y así sucesivamente. Se observa que debido a que el esquema de numeración de Kabat que se muestra coloca inserciones en H35A y H35B, el final del bucle Chothia CDR-H1 cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat que se muestra varía entre H32 y H34, dependiendo de la longitud del bucle.

Tabla 1

[0093] Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, una "CDR" o "región determinante complementaria" o CDR especificadas individuales (p. ej., "CDR-H1, CDR-H2), de un anticuerpo dado o región del mismo, tal como una región variable del mismo, debe entenderse que abarca una región determinante complementaria (o la específica) tal como se define en cualquiera de los esquemas mencionados anteriormente. Por ejemplo, cuando se establece que una CDR particular (p. ej., una CDR-H3) contiene la secuencia de aminoácidos de una CDR correspondiente en una secuencia de aminoácidos Vh o Vl dada, se entiende que dicha CDR tiene una secuencia de la CDR correspondiente (p. ej., CDR-H3) dentro de la región variable, tal como se define por cualquiera de los esquemas anteriormente mencionados. En algunos casos, se especifican secuencias de CDR especificadas.

[0094] Del mismo modo, a menos que se especifique lo contrario, una FR o FR(s) especificado(s) individual(es) (p. ej., FR-H1, FR-H2), de un anticuerpo dado o región del mismo, tal como una región variable del mismo, debe entenderse que abarca una región marco (o la específica) definida por cualquiera de los esquemas conocidos. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de una CDR, FR o FR o CDR en particular, como la CDR definida por el método Kabat, Chothia o Contact. En otros casos, se proporciona la secuencia de aminoácidos particular de una CDR o FR.

[0095] El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres CDR. (Véase, p. ej., Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., WH Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio Vh o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que unen un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio Vh o Vl de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios Vl o Vh complementarios, respectivamente. Véase, p. ej., Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352: 624-628 (1991).

[0096] Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpos un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula otra que un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab’, Fab'-SH, F(ab’)2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (p. ej., scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena única que comprenden una región de cadena pesada variable y/o una región de cadena ligera variable, como scFv.

[0097] Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano.

[0098] Los fragmentos de anticuerpo pueden hacerse por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por las células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos de forma recombinante, tales como fragmentos que comprenden arreglos que no ocurren naturalmente, tales como aquellos con dos o más regiones de anticuerpos o cadenas unidas por enlazadores sintéticos, p. ej., enlazadores peptídicos, y/o que pueden no producirse por digestión enzimática de un anticuerpo intacto de origen natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpos son scFv.

[0099] Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos CDR se derivan de CDR no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos de aminoácidos FR se derivan de FR humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir opcionalmente al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo no humano, se refiere a una variante del anticuerpo no humano que se ha humanizado, típicamente para reducir la inmunogenicidad en humanos, al tiempo que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo humano no parental. En algunos casos, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (p. ej., el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), p. ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

[0100] Entre los anticuerpos anti-CD19 proporcionados se encuentran los anticuerpos humanos. Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o célula humana, o una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos, incluidas las bibliotecas de anticuerpos humanos. El término excluye las formas humanizadas de anticuerpos no humanos que comprenden regiones de unión a antígenos no humanos, tales como aquellas en las que todas o sustancialmente todas las CDR no son humanas.

[0101] Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición antigénica. Dichos animales contienen típicamente todos o una parte de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan los loci de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes extracromosómicamente o integrados al azar en los cromosomas del animal. En tales animales transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógenos generalmente se han inactivado. Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de anticuerpos humanos, que incluyen la presentación de fagos y bibliotecas libres de células, que contienen secuencias que codifican anticuerpos derivadas de un repertorio humano.

[0102] Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran anticuerpos monoclonales, incluyendo fragmentos de anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de o dentro de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles variantes que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo epítopo en un antígeno. No se debe interpretar que el término requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Se puede preparar un anticuerpo monoclonal mediante una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, la generación a partir de un hibridoma, métodos de ADN recombinante, presentación de fagos y otros métodos de presentación de anticuerpos.

[0103] Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos, y no se limitan a una longitud mínima. Los polipéptidos, incluidos los anticuerpos y las cadenas de anticuerpos proporcionados y otros péptidos, p. ej., enlazadores y péptidos de unión a CD19, pueden incluir residuos de aminoácidos que incluyen residuos de aminoácidos naturales y/o no naturales. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, p. ej., glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. En algunos aspectos, los polipéptidos pueden contener modificaciones con respecto a una secuencia nativa o natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como por mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación por PCR.

Anticuerpos anti-CD19 ejemplares

[0104] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD19, p. ej., fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, contiene en particular secuencias de CDR de cadena pesada y/o ligera y/o secuencias de la región variable de cadena ligera y/o pesada (VH o VL). También entre los anticuerpos proporcionados se encuentran aquellos que tienen secuencias al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticas a dicha secuencia.

[0105] En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., fragmento de unión a antígeno del mismo, incluye una complementariedad de cadena pesada de la región 3 determinante (CDR-H3) que comprende una secuencia de aminoácidos de una CDR-H3 presente en un anticuerpo de referencia, tales como uno presente en un anticuerpo de referencia que tiene una región VH con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 62, 167 o 185, tal como se establece en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63 o 62. En algunos casos, la CDR-H3 comprende SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., su fragmento de unión a antígeno, tiene una región VH que tiene al menos 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con (o 100% de identidad con ella) la secuencia de aminoácidos de la región VH del anticuerpo de referencia, como el conjunto de secuencias de aminoácidos de la región VH en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63 62, 167 o 185, tal como se establece en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63 o 62.

[0106] En algunos casos, la CDR-H1 contiene la secuencia de aminoácidos DYAMH (SEQ ID NO: 18), la CDR-H2 contiene la secuencia de aminoácidos GISWNSGRIG (SEQ ID NO: 81), GISWNSGSIG (SEQ ID NO: 82), la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 19 (GISWn Sg RIGYADSVk G), o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72 (GISWNSGSIGYADSVKG), y/o la CDR-H3 contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0107] En algunos casos, el anticuerpo proporcionado contiene una CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0108] En algunos casos, el anticuerpo contiene un Vh que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11 o 12, o tiene una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia. En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., su fragmento de unión a antígeno, contiene una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63 o 62, o una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a tal secuencia. En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., su fragmento de unión a antígeno, contiene una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, 62, 167 o 185, o una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia.

[0109] En algunos casos, el anticuerpo contiene la secuencia de los residuos 1-119 de SEQ ID NO: 11,12, 60, 61,63, 62, 167 o 185 o una secuencia que comprende la parte de SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63, 62, 167 o 185 que incluyen las tres primeras regiones marco y las tres CDR de cadena pesada. En algunos casos, el anticuerpo contiene la secuencia de los residuos 1-119 de SEQ ID NO: 11,12, 60, 61, 63 o 62 o una secuencia que comprende la parte de SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61,63, o 62 que incluyen las tres primeras regiones marco y las tres CDR de cadena pesada.

[0110] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD19 incluye la complementariedad de la cadena ligera para determinar las regiones 1, 2 y/o 3 (CDR-L1, CDR-L2, y/o CDR-L3), respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos de secuencias de CDR 1,2 y/o 3 contenidas dentro de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (Vl) establecida en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 65, 64, 66, 70, 69, 67, 90, 91 o 187-205, tal como se establece en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 o 17, o en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71,90, 91,68, 65, 64, 66, 70, 69 o 67.

[0111] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD19 incluye un CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3 en que:

[0112] En algunos casos, el CDR-L1 contiene la secuencia de aminoácidos: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 110), en el que X1 es T, W, S o R; X2 es G o A; X3 es I, T, D o S; X4 es S, R, T o Q; X5 es nulo o S; X⁶es nulo, D, N o G; X7 es nulo, V o L; Xs es X o nulo; X9 es X o nulo; X10 es X; X11 es X; X12 es Y, F, D o W; X13 es V, A o L y X14 es S, N o A. Por ejemplo, en algunos casos, el CDR-L1 contiene la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 226), en la que X1 es T, Q, S o R; X2 es G, A o E; X3 es I, T, A, D, o S; X4 es S, R, TQ, G o I; X5 es nulo, S, R o T; X⁶es G, D, N o nulo; X7 es nulo, V, L o I; X⁸es D, G, I, L, S, o nulo; X9 es S, G, A, I, D, R o nulo; X 10 es H, Y, F, S o N; X 11 es R, N, D, H, Y o T; X 12 es Y, F, D, W, H, T o S; X13 es V, A o L; y X14 es S, N o A. En algunos casos, el CDR-L1 contiene la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 111), en la que X1 es T, Q, S o R; X2 es G o A; X3 es I, T, D, o S; X4 es S, R, T o Q; X5 es nulo o S; X⁶es G, D, N o nulo; X7 es nulo, V o L; X⁸es D, G, I, L, S, o nulo; X9 es S, G, A, I, R o nulo; X10 es H, Y, F, S o N; X11 es R, N, D, H, o Y; X12 es Y, F, D o W; X 13 es V, A o L; y X14 es S, N, o A.

[0113] En algunos casos, el CDR-L2 contiene la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 227), en la que X1 es D, S o G; X2 es F, V, N, K o A; X3 es S, T, D, o N; X4 es K, V, N, Q, o R; X5 es R, V, o L; Xa es P, K, A o E; y X7 es S, P, A o T. En algunos casos, la CDR-L2 contiene la secuencia de aminoácidos de X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷(SEQ ID NO: 112), donde X1 es D o S; X2 es F, V, N, K o A; X3 es S, T, D, o N; X4 es K, V, N, Q, o R; X5 es R, V, o L; X⁶es P, K, A o E; y X7 es S, P, A o T.

[0114] En algunos casos, el CDR-L3 contiene la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 228), en donde X1 es S, G, T, A, Q, C o N; X2 es S, Q, A o T; X3 es Y, S, W, R; X4 es A, D, R, T, o Y; X5 es A, S, P, G, N, o D; X⁶es I, S, G, T, A, L, H, R o N; X7 es S, P, L, Y, G; X⁸es P, T, S, Q, M, R, N o nulo; X9 es S, L, N, A, M, R o nulo; X10 es L, D o nulo; X11 es Y, W, F, V, A o L; y X12 es V, T, P o L. En algunos casos, el CDR-L3 contiene la secuencia de aminoácidos de X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 115), donde X1 es X; X2 es S, Q, A o T; X3 es Y, S, W, R; X4 es A, D, R, T, o Y; X5 es X; X⁶es X; X7 es S, P, L, Y, G; X⁸es X o nulo; X9 es X o nulo; X10 es L o nulo; X11 es X; y X12 es V, T o L. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo tiene una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO: 114), donde X1 es S, G, T, A, Q, C o N; X2 es S, Q, A o T; X3 es Y, S, W, R; X4 es A, D, R, T, o Y; X5 es A, S, P, G, N o D; X⁶es I, S, G, T, A, L, H, R, N; X7 es S, P, L, Y, G; X⁸es P, T, S, Q, M, R, N o nulo; X9 es S, L, N, A, M o nulo; X10 es L o nulo; X11 es Y, W, F, V, A o L; y X 12 es V, T, o L.

[0115] En algunos casos, en la CDR-L1, tal como se expone en SEQ ID NO: 110, 226 o 111, X3 es I, T, o S; X4 es S, T o Q; X⁸es D, G, I, S, o nulo; X9 es S, G, I o nulo; X10 es H, Y, S o N; X11 es R, N, D, o H; X12 es Y o D; y X13 es V o L; y/o en el CDR-L2, tal como se expone en SEQ ID NO: 227 o 112, X1 es D; X4 es K, V, N, Q, o R; X⁶es P, K o A; y X7 es S, A, o T; y/o en el CDR-L3, tal como se establece en SEQ ID NO: 228, 114 o 115, X1 es S, G, T, A, Q, C o N; X5 es A, S, P, G, N, o D; X⁶es I, S, G, T, A, L, H, R o N; Xa es P, T, S, Q, M, R, N o nulo; X9 es S, L, N, A, M o nulo; y X11 es Y, W, F, V, A o L. En algunos casos, en el CDR-L3, X i es S, G, Q o N; X2 es S, Q o T; X4 es A, D, T, o Y; X5 es A, S, o G; y X⁶es I, S, N, R, A, H, o T.

[0116] En algunos casos, el anticuerpo incluye una secuencia de aminoácidos que contiene una CDR-L1 expuesta en SEQ ID NO: 83, una CDR-L2 expuesta en SEQ ID NO: 84 y/o una CDR-L3 expuesta en SEQ ID NO: 85.

[0117] En algunos casos, el anticuerpo, p. ej., el fragmento de anticuerpo contiene una CDR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21, 25, 28, o 31. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21,25, 28, 31 o 146 a 152, tal como contiene el secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21,25, 28 o 31. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 78, 21 o 28.

[0118] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22, 26, 29 o 32. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29, 32 o 153 a 157, tal como contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29 o 32. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 98, 22, o 29.

[0119] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L3 que incluye la secuencia establecida en SEQ ID NO: 23, 24, 27, 30 o 33. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L3 que incluye la secuencia establecida en SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30, 33, 158 o 159, tal como contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30 o 33. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una CDR-L3 que incluye la secuencia establecida en SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 107, 24 o 30.

[0120] En algunos casos, las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 contienen las secuencias de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, respectivamente; las c Dr -L1, CDR-L2 y CDR-L3 incluyen las secuencias de las SEQ ID NO: 21, 22 y 24, respectivamente; las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 incluyen las secuencias de las SEQ ID NO: 25, 26 y 27, respectivamente; las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 contienen las secuencias de las SEQ ID NO: 28, 29 y 30, respectivamente; o CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 contienen las secuencias de las SEQ ID NO: 31, 32 y 33, respectivamente.

[0121] En algunos casos, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 21, 22, y 23, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 21, 22 y 24, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 25, 26 y 27, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 28, 29 y 30, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 31, 32 y 33, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 80 100 y 109, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 77 97 y 106, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 74 94 y 103, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 73 93 y 101, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 75 95 y 104, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 79 99 y 108, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 78, 98 y 107, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO : 76 96 y 105, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO : 73 93 y 102, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO : 77 97 y 106, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 163 164 y 165, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 80, 100 y 109, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 146, 97 y 106, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO 28, 153 y 158, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 74, 94 y 103, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 147, 154 y 121, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 148 , 94 y 103, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 75, 95 y 104, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 149, 155 y 119, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 150 , 22 y 120, respectivamente las CDR-L1 CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 21, 22 y 159, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 151 , 26 y 118, respectivamente las CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 28, 156 y 116, respectivamente o CDR-L1 CDR-L2 y CDRL3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 152, 157 y 117, respectivamente

[0122] También se proporcionan anticuerpos que tienen secuencias de al menos o aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idéntica a tales secuencias.

[0123] En algunos casos, las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de SEQ ID NOs: 18, 81, y 20, respectivamente; las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 18, 19 y 20, respectivamente; las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 18, 82 y 20, respectivamente; o las CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 18, 72 y 20, respectivamente.

[0124] También se proporcionan anticuerpos que tienen secuencias de al menos o aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idéntica a tales secuencias.

[0125] En algunos casos, la región VH del anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 6362, 167 o 185, tal como la SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 o 62; y/o la región VL del anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 6967 o 187 a 205, como SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91,68, 65, 64, 66, 70, 69 o 67. En algunos casos, la región VH del el anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 60, 63 o 62; y/o la región VL del anticuerpo o fragmento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 71,90, 65, 64, o 69.

[0126] También se proporcionan anticuerpos que tienen secuencias al menos en o alrededor 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a tales secuencias.

[0127] En algunos casos, las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 17, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 15, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 13, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 14, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 16, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 71, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 y 68, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 65, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 60 y 64, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 61 y 66, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 70, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 y 69, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 67, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 y 91, respectivamente; o las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 90, respectivamente. En algunos casos, las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 14, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 16, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 71, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 65, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 60 y 64, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 y 69, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 y 90, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 167 y 207, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 168 o 63 y 208, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 169 u 11 y 209, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 170 o 61 y 210, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 171 o 61 y 211, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 172 y 212, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 o 11 y 213, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 174 u 11 y 214, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 175 o 11 y 215, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 176 o 61 y 216, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 177 o 61 y 217, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 178 o 61 y 218, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 179 o 61 y 219, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 180 o 12 y 220, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 o 12 y 221, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 182 o 11 y 222, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 o 60 y 223, respectivamente; las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 184 u 11 y 224, respectivamente; o las regiones VH y VL del anticuerpo o fragmento comprenden la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 185 y 225, respectivamente.

[0128] También se proporcionan anticuerpos que tienen secuencias de por lo menos en o cerca de 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a tales secuencias.

[0129] En algunos casos, el anticuerpo o fragmento contiene una región Vh que incluye la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 11 o 12 o los residuos 1-119 de dicha secuencia o una secuencia que tiene al menos a o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia.

[0130] En algunos casos, los anticuerpos incluyen o pueden incluir además una región Vl que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, o una secuencia que tiene al menos o aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a dicha secuencia.

[0131] En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de una sola cadena, tal como un scFv o diacuerpo. En algunos casos, el anticuerpo monocatenario incluye uno o más enlazadores que unen dos dominios o regiones de anticuerpo, como una región de cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL). El enlazador es típicamente un enlazador peptídico, p. ej., un enlazador peptídico flexible y/o soluble. Entre los enlazadores se encuentran los ricos en glicina y serina y/o en algunos casos treonina. En algunos casos, los enlazadores incluyen además residuos cargados tales como lisina y/o glutamato, que pueden mejorar la solubilidad. En algunos casos, los enlazadores incluyen además uno o más de prolina.

[0132] En consecuencia, también se proporcionan fragmentos de anticuerpos monocatenarios, tales como scFv y diacuerpos, en particular fragmentos monocatenarios humanos, que normalmente comprenden enlazador(es) de unión de dos dominios o regiones de anticuerpo, tal como dominios de Vh y Vl . El enlazador es típicamente un enlazador peptídico, p. ej., un enlazador peptídico flexible y/o soluble, tal como uno rico en glicina y serina.

[0133] En algunos aspectos, los enlazadores ricos en glicina y serina (y/o treonina) incluyen al menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de tales aminoácido(s). En algunos casos, incluyen al menos o aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 70% o 75% de glicina, serina y/o treonina. En algunos casos, el enlazador está compuesto sustancialmente en su totalidad por glicina, serina y/o treonina. Los enlazadores generalmente tienen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30, p. ej., 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, y en algunos ejemplos entre 10 y 25 aminoácidos de longitud. Los enlazadores ejemplares incluyen enlazadores que tienen varios números de repeticiones de la secuencia GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 123) o GGGS (3GS; SEQ ID NO: 122), tales como entre 2, 3, 4 y 5 repeticiones de dicha secuencia. Los enlazadores ejemplares incluyen aquellos que tienen o consisten en una secuencia establecida en SEQ ID NO: 34 (GGGGSGGGGSGGGGS). Los enlazadores ejemplares incluyen además aquellos que tienen o consisten en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 43 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).

[0134] Por consiguiente, en algunos casos, también se proporcionan fragmentos de cadena sencilla, p. ej., scFv, que comprenden uno o más de los enlazadores mencionados anteriormente, tales como enlazadores ricos en glicina/serina, incluidos enlazadores que tienen repeticiones de GGGS (SEQ ID NO: 122) o GGGGS (SEQ ID NO: 123), tal como el enlazador indicado como SEQ ID NO: 34. En algunos casos, el enlazador tiene una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia indicada SEQ ID NO: 34.

[0135] El fragmento, p. ej., scFv, puede incluir una región Vh o una parte de la misma, seguida del enlazador, seguida de una Vl o partes de la misma. El fragmento, p. ej., el scFv, puede incluir la Vl, seguido por el enlazador, seguida de la VH.

[0136] En algunos aspectos, el scFv tiene la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, o 10, o tiene una secuencia de al menos o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a tal secuencia.

[0137] En algunos aspectos, el scFv tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 87, o 89, o tiene una secuencia de al menos o aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia.

[0138] En algunos aspectos, el scFv tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87, 89, o 207 a 225 o tiene una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia.

[0139] En algunos aspectos, el scFv contiene el VH, el enlazador y el VL como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 8789 o 207 a 225, o una secuencia al menos en o aproximadamente 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a dicha secuencia, pero en la que VH y VL están configuradas en la orientación opuesta, es decir, VL-VH, en comparación con dicha secuencia.

[0140] El anticuerpo, p. ej., fragmento de anticuerpo, puede contener al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, tal como uno o más dominios de región constante. En algunos casos, las regiones constantes incluyen una región constante de cadena ligera y/o una región constante 1 de cadena pesada (CH1). En algunos casos, el anticuerpo incluye un dominio CH2 y/o CH3, como una región Fc. En algunos casos, la región Fc es una región Fc de una IgG humana, como una IgG1 o IgG4.

[0141] En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anteriores, p. ej., fragmentos de anticuerpos, es humano. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-CD 19 humanos que se unen específicamente a CD19, tal como se unen específicamente a CD19 humano.

[0142] En algunos casos de un anticuerpo anti-CD 19 humano proporcionado, el anticuerpo humano contiene una región Vh que contiene una porción que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento V de cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal, una porción con al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento D de cadena pesada humana de nucleótidos de línea germinal, y/o una porción que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento J de cadena pesada humana de nucleótidos de línea germinal; y/o contiene una región Vl que contiene una porción con al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento V de nucleótido de la línea germinal kappa humana o cadena lambda, y/o una porción con al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por un segmento J de la cadena lambda o kappa humana de nucleótidos de la línea germinal. En algunos casos, la parte de la región Vh corresponde a CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3. En algunos casos, la parte de la región Vh corresponde a la región marco 1 (FR1), FR2, FR2 y/o FR4. En algunos casos, la parte de la región Vl corresponde a CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3. En algunos casos, la parte de la región Vl corresponde a FR1, FR2, FR2 y/o Fr4.

[0143] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-H1 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-H1 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-H1 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de una, dos o tres diferencias de aminoácidos en comparación con la región CDR-H1 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de la cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0144] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-H2 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-H2 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-H2 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de uno, dos o tres aminoácidos de diferencia en comparación con la región CDR-H2 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de la cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0145] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-H3 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-H3 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V, segmento D y segmento J de la cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-H3 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de una, dos o tres diferencias de aminoácidos en comparación con la región CDR-H3 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V, segmento D y segmento J de la cadena pesada humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0146] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-L1 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-L1 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-L1 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de una, dos o tres diferencias de aminoácidos en comparación con la región CDR-L1 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de la cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0147] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-L2 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-L2 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-L2 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de uno, dos o tres aminoácidos de diferencia en comparación con la región CDR-L2 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V de la cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0148] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una CDR-L3 que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la región CDR-L3 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V y un segmento J de la cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal. Por ejemplo, el anticuerpo humano en algunos casos contiene una CDR-L3 que tiene una secuencia que es 100% idéntica o con no más de una, dos o tres diferencias de aminoácidos en comparación con la región CDR-L3 correspondiente dentro de una secuencia codificada por un segmento V y segmento J de la cadena ligera humana de nucleótidos de la línea germinal.

[0149] En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una región marco que contiene secuencias de segmentos de genes de la línea germinal humana. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo humano contiene una región Vh en la que la región marco, p. ej., FR1, FR2, FR3 y FR4, tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una región marco codificada por un segmento de anticuerpo de la línea germinal humana, tal como un segmento V y/o J. En algunos casos, el anticuerpo humano contiene una región Vl en la que la región marco, p. ej., FR1, FR2, FR3 y FR4, tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una región marco codificada por un segmento de anticuerpo de la línea germinal humana, tal como un V y/o segmento. Por ejemplo, en algunas de tales casos, la secuencia de marco de la Vh V y/o L de secuencia difiere en no más de 10 aminoácidos, tales como no más de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos, en comparación con la región marco codificada por un segmento de anticuerpo de la línea germinal humana.

[0150] El anticuerpo, p. ej., fragmento de anticuerpo, puede contener al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, tal como uno o más dominios de región constante. En algunos casos, las regiones constantes incluyen una región constante de cadena ligera y/o una región constante 1 de cadena pesada (CH1). En algunos casos, el anticuerpo incluye un dominio CH2 y/o CH3, como una región Fc. En algunos casos, la región Fc es una región Fc de una IgG humana, como una IgG1 o IgG4.

[0151] También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y/o porciones, p. ej., cadenas, de la misma. Entre los ácidos nucleicos proporcionados se encuentran los que codifican los anticuerpos anti-CD19 descritos en este documento. Los ácidos nucleicos pueden incluir aquellos que abarcan nucleótidos y bases naturales y/o no naturales, p. ej., incluidos aquellos con modificaciones en la estructura principal. Los términos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" y "polinucleótido" pueden usarse indistintamente y se refieren a un polímero de nucleótidos. Dichos polímeros de nucleótidos pueden contener nucleótidos naturales y/o no naturales e incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN y PNA. "Secuencia de ácido nucleico" se refiere a la secuencia lineal de nucleótidos que comprende la molécula de ácido nucleico o polinucleótido. Ejemplos de ácidos nucleicos y vectores son aquellos que tienen las secuencias establecidas como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 86 y 88, y porciones que codifican CDR de los mismos, así como secuencias que contienen al menos90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con las mismas. El ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el Vl y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el Vh del anticuerpo (p. ej., las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo).

[0152] También se proporcionan vectores que contienen los ácidos nucleicos, células huésped que contienen los vectores, p. ej., para la producción de los anticuerpos. También se proporcionan métodos para producir los anticuerpos. En un caso adicional, se proporcionan uno o más vectores (p. ej., vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En un caso adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En uno de estos casos, una célula huésped comprende (p. ej., se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el Vl del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En algunos casos, se proporciona un método para preparar el anticuerpo anti-CD19, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporcionó anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped).

[0153] También se proporcionan procedimientos de preparación de los anticuerpos anti-CD 19 (incluyendo fragmentos de unión a antígeno). Para la producción recombinante del anticuerpo anti-CD 19, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, p. ej., como se describió anteriormente, puede aislarse e insertarse en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

[0154] Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o adecuados de expresión de huéspedes para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo hongos y cepas de levadura cuyas vías de glicosilación han sido modificadas para imitar o aproximarse a los de las células humanas, lo que resulta en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) y Li y col., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

[0155] Los ejemplos de células eucariotas que pueden ser usadas para expresar polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, células COS, incluyendo células COS 7; células 293, incluidas células 293-6E; Células CHO, incluidas CHO-S, DG44. Células Lec13 CHO y células FUT8 CHO; células PER.C6®; y células NSO. En algunos casos, las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo pueden expresarse en levadura. Véase, p. ej., la publicación de EE.UU. N° US 2006/0270045 A1. En algunos casos, se selecciona una célula huésped eucariota particular basándose en su capacidad para realizar modificaciones postraduccionales deseadas en las cadenas pesadas y/o cadenas ligeras. Por ejemplo, en algunos casos, las células CHO producen polipéptidos que tienen un mayor nivel de sialilación que el mismo polipéptido producido en las células 293.

[0156] En algunos casos, el anticuerpo se produce en un sistema sin células. Se describen ejemplos de sistemas libres de células, p. ej., en Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229 - 44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538 - 45 (2004); Endo y col., Biotechnol. Adv. 21: 695 - 713 (2003).

[0157] Los ejemplos proporcionados incluyen además vectores y células huésped y otros sistemas de expresión para expresar y producir los anticuerpos y otras proteínas de unión, incluyendo células eucariotas y procariotas huésped, incluyendo bacterias, hongos filamentosos y levaduras, así como células de mamífero tales como células humanas, así como sistemas de expresión libres de células.

Características a modo de ejemplo

[0158] En algunos aspectos, los anticuerpos proporcionados, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, tienen una o más características funcionales especificadas, tales como propiedades de unión, incluyendo la unión a epítopos particulares, tales como epítopos que son similares a o se superponen con los de otros anticuerpos, la capacidad de competir por la unión con otros anticuerpos y/o afinidades de unión particulares.

[0159] En algunos casos, los anticuerpos se unen específicamente a la proteína CD19. En algunos aspectos de cualquiera de los casos en este documento, CD19 se refiere a CD19 humano. Generalmente, la observación de que un anticuerpo u otra molécula de unión se une a CD19 o se une específicamente a CD19 no significa necesariamente que se una a CD19 de todas las especies. Por ejemplo, en algunos casos, las características de la unión a CD19, tales como la capacidad de unirse específicamente al mismo y/o competir por unirse al mismo con un anticuerpo de referencia, y/o unirse con una afinidad particular o competir en un grado particular, en algunos casos, se refiere a la capacidad con respecto a la proteína CD19 humana y muchos de los anticuerpos no tienen esta característica con respecto a un CD19 de otra especie, como el mono o el ratón.

[0160] En algunos casos, los anticuerpos proporcionados, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, se unen a CD19 humano, tales como a un epítopo o región de CD19 humana, como al CD19 humano expuesto en 92 (N° de Acceso P15391), o una variante alélica o una variante de empalme de la misma. En ciertos casos, el anticuerpo anti-CD 19 se une a un epítopo de CD19 que se conserva entre CD19 de diferentes especies. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD19 se une a un epítopo de CD19 que no está conservado o no está completamente conservado entre CD19 de diferentes especies, como entre humanos y Macaca mulatta (macaco rhesus (rhesus)) CD19.

[0161] En algunos casos, se une el anticuerpo a un epítopo que contiene uno o más aminoácidos dentro de (o es totalmente dentro de) un dominio extracelular de un CD19 y/o dentro de (o es totalmente dentro de) una región proximal a la membrana de la extracelular porción de CD19. En algunos casos, el anticuerpo se une a un epítopo que contiene uno o más aminoácidos dentro, o está completamente dentro, del dominio 2 similar a Ig de CD19, una porción codificada por el cuarto exón de CD19, una porción correspondiente a las posiciones 176-277 de la secuencia de CD19 humana establecida en SEQ ID NO: 92, y/o la membrana más próxima a 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 44, 43, 43, 41 o 40 aminoácidos de la porción extracelular del CD19. En algunos casos, se requiere dicha porción o dominio para la unión del anticuerpo a CD19. En algunos casos, el epítopo contiene (o además contiene) uno o más aminoácidos que están dentro, o están completamente dentro, del dominio 1 similar a Ig de CD19, una porción codificada por el segundo exón de CD19 y/o una porción correspondiente a las posiciones 20-117 de la secuencia de CD19 humana establecida en SEQ ID NO: 92. En algunos casos, dicha porción o dominio es necesaria para la unión del anticuerpo contra CD19. En algunos casos, el anticuerpo se une específicamente a un péptido que comprende o consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de tal porción y no contiene la secuencia completa de CD19 de longitud completa.

[0162] En algunos casos, el epítopo contiene uno o más aminoácidos en el interior, está dentro de, o incluye una porción de CD19 correspondiente a los residuos 218 a 249 de la humana conjunto secuencia de CD19 en la SEQ ID NO: 92, tal como una parte teniendo la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 143.

[0163] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido en una posición correspondiente a una o más de las posiciones de CD19 que corresponden a los siguientes aminoácidos en las siguientes posiciones de la secuencia de CD19 humana expuesta en SEQ ID NO: 92: la histidina (H) en la posición 218, la alanina (A) en la posición 236, la metionina (M) en la posición 242, el glutamato (E) en la posición 243, la prolina (P) en la posición 249, y/o la lisina (K) y/o la serina(s) en las posiciones 223 y 224. En algunos casos, un aminoácido en una o más de dichas posiciones es importante o necesario para la unión del anticuerpo contra CD19. En algunos casos, el aminoácido en el epítopo en una o más posiciones corresponde al aminoácido en la posición respectiva en la secuencia humana expuesta de CD19 en la SEQ ID NO: 92.

[0164] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido (tal como una histidina) en una posición de CD19 correspondiente a la histidina en la posición 218 de la secuencia de CD19 humana expuesta en SEQ ID NO: 92; en algunos casos, dicho aminoácido es importante para la unión del anticuerpo a CD19.

[0165] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido (p. ej., una alanina) en una posición de CD19 correspondiente a la alanina en la posición 236 de la secuencia humana CD19 expuesta en la SEQ ID NO: 92; en algunos casos, dicho aminoácido es importante para la unión del anticuerpo a CD19.

[0166] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido (p. ej., una metionina) en una posición de CD19 que corresponde a la metionina en la posición 242 de la secuencia humana CD19 expuesta en la SEQ ID NO: 92; en algunos casos, dicho aminoácido es importante para la unión del anticuerpo a CD19.

[0167] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido (tal como un glutamato) en una posición de CD19 correspondiente al glutamato en la posición 243 de la secuencia humana CD19 expuesta en la SEQ ID NO: 92; en algunos casos, dicho aminoácido es importante para la unión del anticuerpo a CD19.

[0168] En algunos casos, el epítopo incluye un aminoácido (tal como una prolina) en una posición de CD19 correspondiente a la prolina en la posición 249 de la secuencia humana CD19 expuesta en la SEQ ID NO: 92; en algunos casos, dicho aminoácido es importante para la unión del anticuerpo a CD19.

[0169] En algunos casos, el epítopo contiene aminoácido(s) (tales como la lisina y/o serina) en una o dos posiciones que corresponde a la lisina y/o serina en las posiciones 223 y 224 de la secuencia de CD19 humana expuesta en SEQ ID NO: 92; en algunos casos, tales aminoácidos son importantes para la unión del anticuerpo a CD19.

[0170] En algunos casos, el epítopo es el mismo que, similar a, la superposición con, o contiene uno o más de los mismos aminoácidos como un epítopo que se une específicamente por un anticuerpo de referencia, tales como FMC63 o SJ25C1. En algunos casos, el mismo uno o más aminoácidos es importante para la unión del anticuerpo proporcionado y el anticuerpo de referencia.

[0171] En algunos casos, el grado de unión de un anticuerpo anti-CD 19 a una proteína no CD19 no relacionada, tal como CD19 no humano u otra proteína no CD19, es menor que aproximadamente 40% de la unión del anticuerpo contra CD19 humano medido, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA). En algunos casos, entre los anticuerpos proporcionados se encuentran los anticuerpos en los que la unión a una proteína CD19 no humana u otra proteína no CD19 es menor o aproximadamente 30%, menor o aproximadamente 20% o menor o aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo contra CD19 humano.

[0172] En algunos casos, tales propiedades de anticuerpos proporcionados, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, se describen en relación con propiedades observadas para otro anticuerpo, p. ej., un anticuerpo de referencia. En algunos casos, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo anti-CD 19 no humano, tal como un anticuerpo anti-CD 19 murino o quimérico o humanizado. En algunos aspectos, el anticuerpo de referencia es el anticuerpo designado FMC63 o el anticuerpo designado SJ25C1 (véase, p. ej., Zola H et al., Immunol Cell Biol. 1991 Dec; 69 (Pt 6): 411-22; Patente de EE.UU. 7,446,190), y/o un fragmento derivado del mismo tal como un fragmento scFv del mismo, y/o un anticuerpo que contiene las secuencias Vh y Vl de tal anticuerpo y/o las CDR de cadena pesada y ligera de tal anticuerpo.

[0173] Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo de referencia tiene una región Vh que contiene el conjunto de secuencias expone en SEQ ID NO: 39 o 41, o comprende CDR1, CDR2 y/o CDR3 dentro de una secuencia tal, y/o tiene un Vl que contiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 40 o 42, o comprende CDR1, CDR2 y/o CDR3 dentro de dicha secuencia. Por tanto, en algunos casos, el anticuerpo compite por unirse y/o se une al mismo o un epítopo solapado de CD19 como FMC63 o SJ25C1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0174] En algunos casos, el anticuerpo de referencia tiene una secuencia presente en un anticuerpo o porción del mismo tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo de referencia tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (Vl) establecida en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 o 17 y/o establecida en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69 o 67, y/o tiene una región variable de cadena pesada (VH) establecida en SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 o 62. En algunos casos, el anticuerpo tiene CDR 1, 2 y/o 3 de cadena pesada y/o ligera presentes en dicho anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo de referencia puede ser un scFv que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51,53,55, 57, 59, 87 u 89.

[0175] No obstante, en algunos casos, el anticuerpo contiene CDR de cadena pesada y ligera que son distintas de las CDR presentes en el anticuerpo o anticuerpos de referencia., como FMC63 y SJ25C1. Por ejemplo, entre los anticuerpos proporcionados están los que compiten por unirse y/o se unen a los mismos epítopos de CD19 o superpuestos que los unidos por un anticuerpo o anticuerpo de referencia, pero que no obstante contienen CDR distintas, p. ej., distintas cadenas pesadas y/o ligeras de CDR1, CDR2 y CDR3. En algunos casos, el anticuerpo proporcionado contiene CDR de cadena pesada y ligera que son distintas de las CDR presentes en el anticuerpo designado FMC63, como las presentes en la región VH establecida en SEQ ID NO: 39 y/o la región VL establecida en SEQ ID NO: 40. En algunos casos, el anticuerpo proporcionado contiene CDR de cadena pesada y ligera que son distintas de las CDR presentes en el anticuerpo designado SJ25C1, como las presentes en la región VH establecida en SEQ ID NO: 41 y/o la región VL establecida en SEQ ID NO: 42.

[0176] Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo que se solapa con el epítopo de CD19 unido por un anticuerpo de referencia, como los anticuerpos que se unen al mismo o un epítopo similar que el anticuerpo de referencia. En algunos casos, el anticuerpo compite por unirse a CD19 con el anticuerpo de referencia.

[0177] En algunos casos, los anticuerpos muestran una preferencia de unión para las células que expresan CD19 en comparación con células CD19 negativas, tales como células particulares conocidas en la técnica y/o descritas en este documento. En algunos casos, se observa la preferencia de unión cuando se mide un grado significativamente mayor de unión a las células que expresan CD19, en comparación con las que no expresan. En algunos casos, el cambio en el grado de unión detectado, p. ej., medido por la intensidad de fluorescencia media en un ensayo basado en citometría de flujo y/o constante de disociación o CE50, a las células que expresan CD19 en comparación con las células que no son CD 19 que expresan células, es al menos de o aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6 o más, y/o es aproximadamente tan grande, aproximadamente lo mismo, al menos tan grande o al menos aproximadamente tan grande, o mayor que el cambio de veces observado para el anticuerpo de referencia, como la forma correspondiente del anticuerpo de referencia. En algunos casos, el grado total de unión observado a CD19 o a las células que expresan CD19 es aproximadamente el mismo, al menos tan grande o mayor que el observado para el anticuerpo de referencia. En cualquiera de los casos proporcionados, la comparación de las propiedades de unión, como las afinidades o la competencia, puede realizarse mediante la medición mediante el mismo ensayo o un ensayo similar.

[0178] Un anticuerpo "compite por la unión" a CD19 con un anticuerpo de referencia si inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a CD19, y/o si el anticuerpo de referencia inhibe de forma competitiva la unión del anticuerpo a CD19. Un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un antígeno si la presencia del anticuerpo en exceso inhibe (bloquea) de manera detectable la unión del otro anticuerpo a su antígeno. Puede especificarse un grado particular de inhibición.

[0179] En algunos casos, la adición del anticuerpo proporcionado en exceso, p. ej., un exceso de 1,2, 5, 10, 50 o 100 veces, en comparación con la cantidad o concentración del anticuerpo de referencia, inhibe unión al antígeno por el anticuerpo de referencia (o viceversa). En algunos casos, la inhibición de la unión es de al menos un 50% y, en algunos casos, de al menos un 75%, 90% o 99%. En algunos aspectos, la inhibición competitiva se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495-1502).

[0180] En algunos casos, cuando el anticuerpo de referencia está presente a una concentración de 10 nM, el anticuerpo proporcionado inhibe la unión del anticuerpo de referencia con una CI50 de menos de o de aproximadamente 100, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nM, o menos que en o aproximadamente 9, 8, 7, 6 o 5 nM. En algunos casos, cuando el anticuerpo proporcionado está presente a una concentración de 10 nM, el anticuerpo de referencia inhibe la unión del anticuerpo proporcionado con una CI50 de menos de o aproximadamente 100, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nM, o menos que en o aproximadamente 9, 8, 7, 6 o 5 nM.

[0181] En algunos casos, la inhibición competitiva de la unión del anticuerpo de referencia por el anticuerpo proporcionado (o viceversa) es en o aproximadamente o al menos en o aproximadamente el mismo grado que el grado de inhibición competitiva de la unión del anticuerpo de referencia por el anticuerpo de referencia en sí mismo, p. ej., anticuerpo de referencia no marcado. En algunos casos, el anticuerpo proporcionado inhibe la unión del anticuerpo de referencia, como la unión de FMC63 o SJ25C1, a CD19 humano en al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Los ensayos de inhibición competitiva son conocidos e incluyen ensayos basados en ELISA, basados en citometría de flujo y ensayos basados en RIA. En algunos aspectos, los ensayos de inhibición competitiva se llevan a cabo incorporando un exceso de una forma no marcada de uno de los anticuerpos y evaluando su capacidad para bloquear la unión del otro anticuerpo, que está marcado con un marcador detectable, tal que el grado de unión y reducción del mismo puede evaluarse mediante la detección de la etiqueta o el marcador.

[0182] En algunos casos, dos anticuerpos se unen específicamente al mismo epítopo si todas o esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro anticuerpo. En algunos casos, dos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo solapado si al menos algunas de las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen la unión o eliminan la unión al antígeno por un anticuerpo también reducen o eliminan la unión al antígeno por el otro anticuerpo.

[0183] En algunos casos, los anticuerpos proporcionados son capaces de unión a CD19, tal como CD19 humano, con al menos una cierta afinidad, medida por cualquiera de una serie de métodos conocidos. En algunos casos, la afinidad está representada por una constante de disociación (Kd); en algunos casos, la afinidad está representada por CE50. En ciertos casos, la afinidad de unión (CE50) y/o la constante de disociación del anticuerpo contra CD19 es igual o menor que 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 nM, como por ejemplo entre a o aproximadamente 1 nM y a o aproximadamente 15 nM, p. ej., entre a o aproximadamente 5 y a o aproximadamente 10 nM. En un caso, el grado de unión de un anticuerpo anti-CD 19 a una proteína no CD19 no relacionada es menor o aproximadamente al 10% de la unión del anticuerpo a CD19 medida, p. ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA).

[0184] En algunos aspectos, la afinidad está en o aproximadamente el mismo grado o sustancialmente el mismo grado de afinidad en comparación con el anticuerpo de referencia, tal como un anticuerpo CD19 murino, por ejemplo FMC63 o SJ25C1. En algunos aspectos, la afinidad es al menos 80, 85, 90, 95 o 99% igual que la del anticuerpo de referencia. En algunos casos, la afinidad de unión se compara con la forma correspondiente del anticuerpo de referencia.

[0185] En algunos casos, el anticuerpo tiene una afinidad, p. ej., CE50 o Kd, aproximadamente igual o menor que la del anticuerpo de referencia, como la forma correspondiente del anticuerpo de referencia, p. ej., no más de aproximadamente 1,5 veces o no más de aproximadamente 2 veces mayor, no más de 3 veces mayor y/o no más de 10 veces mayor que la CE50 del anticuerpo de referencia, p. ej., medida en el mismo ensayo o en un ensayo similar.

[0186] Los anticuerpos anti-CD19 proporcionados en el presente documento pueden identificarse, seleccionarse o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos. En un aspecto, el anticuerpo se prueba para determinar su actividad de unión al antígeno, p. ej., mediante métodos conocidos como ELISA, transferencia Western y/o ensayos de citometría de flujo, que incluyen ensayos de unión basados en células, p. ej., evaluando la unión del anticuerpo (p. ej., conjugado a un marcador fluorescente o marcado) a una célula que expresa el antígeno diana, p. ej., CD19, en algunos casos en comparación con los resultados que utilizan células que no expresan el antígeno diana, p. ej., CD19. La afinidad de unión se puede medir como Kd o CE50.

[0187] Los ensayos de competición se pueden utilizar para identificar un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. También pueden usarse y son conocidos ensayos para mapear epítopos unidos por los anticuerpos y anticuerpos de referencia.

Inmunoconjugados

[0188] En algunos casos, el anticuerpo es o es parte de un inmunoconjugado, en el que el anticuerpo está conjugado con una o más moléculas heterólogas, tales como, pero no limitado a, un agente citotóxico, un agente de formación de imágenes, un resto detectable un dominio de multimerización u otra molécula heteróloga. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (p. ej., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes quimioterapéuticos (p. ej., metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; toxinas antibióticas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas. En algunos casos, el anticuerpo se conjuga con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (p. ej., toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o isótopos radiactivos.

[0189] Entre los inmunoconjugados se encuentran conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs), en los que un anticuerpo está conjugado con uno o más fármacos, incluyendo pero no limitado a un maitansinoide (véase la Patente de EE.UU. Nos 5.208.020, 5.416.064 y Patente Europea EP 0425235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMa E y MMAF) (véanse las Patentes de Estados Unidos N° 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse las Patentes de EE.UU. Nos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701,5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res.

53: 3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58: 2925 - 2928 (1998)); una antraciclina como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov y col., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 829-834 (2000); Dubowchik y col., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King y col., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); y Patente de EE.UU. N° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

[0190] También entre los inmunoconjugados se encuentran aquellos en los que el anticuerpo se conjuga con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero no limitado a la cadena de difteria A, fragmentos activos no vinculantes de toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.

[0191] También entre los inmunoconjugados son aquellos en los que el anticuerpo se conjuga a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Los isótopos radiactivos ejemplares incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu.

[0192] Los conjugados de un anticuerpo y el agente citotóxico se pueden fabricar utilizando cualquiera de una serie de agentes de acoplamiento de proteínas conocidos, p. ej., enlazadores, (ver Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987)), WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula, como enlazadores lábiles al ácido, enlazadores sensibles a la peptidasa, enlazadores fotolábiles, enlazadores de dimetilo y enlazadores que contienen disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); Patente de EE.UU. N25.208.020).

[0193] Los conjugados también pueden incluir proteínas de fusión tales como fusiones Fc y moléculas quiméricas.

Anticuerpos multiespecíficos

[0194] En ciertos casos, las moléculas CD19 de unión, p. ej., los anticuerpos son multiespecíficos. Entre las moléculas de unión multiespecíficas se encuentran los anticuerpos multiespecíficos, incluidos, p. ej., biespecíficos. Los parejas de unión multiespecíficos, p. ej., los anticuerpos, tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes, que pueden estar en el mismo o en diferentes antígenos. En ciertos casos, una de las especificidades de unión es para CD19 y la otra es para otro antígeno. En ciertos casos, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de CD19. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan CD19. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. Entre los anticuerpos biespecíficos se encuentran los anticuerpos monocatenarios multiespecíficos, p. ej., diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem y tri-scFv en tándem. También se proporcionan receptores quiméricos multiespecíficos, tales como CAR multiespecíficos, que contienen los anticuerpos.

[0195] Los antígenos adicionales ejemplares incluyen otros antígenos específicos de células B y antígenos expresados en células T. Los antígenos ejemplares incluyen CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, B7, MUC-1, la, HM1.24, HLA-DR, tenascina, un factor de angiogénesis, VEGF, PIGF, ED-B fibronectina, un oncogén, un producto de oncogén, CD66a-d, antígenos de necrosis, li, IL-2, T101, TAC, IL-6, TRAIL-R1 (DR4) y TRAIL-R2 (DR5).

Variantes

[0196] En ciertos casos, los anticuerpos incluyen una o más variaciones de aminoácidos, p. ej., sustituciones, deleciones, inserciones y/o mutaciones, en comparación con la secuencia de un anticuerpo descrito en el presente documento. Las variantes ejemplares incluyen aquellas diseñadas para mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, p. ej., deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, p. ej., unión a antígeno.

[0197] En ciertos casos, los anticuerpos incluyen una o más sustituciones de aminoácidos, p. ej., en comparación con una secuencia de anticuerpo descrita en este documento y/o en comparación con una secuencia de un repertorio natural, p. ej., el repertorio humano. Los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDR y FR. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y los productos se pueden cribar en busca de una actividad deseada, p. ej., unión de antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, vida media mejorada y/o función efectora mejorada, como la capacidad de promover la dependencia de anticuerpos. citotoxicidad celular (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunos casos, la variante de anticuerpo exhibe una unión retenida o mejorada a CD19.

[0198] En algunos casos, uno o más residuos dentro de una CDR de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano) es/son sustituidos. En algunos casos, la sustitución se realiza para revertir una secuencia o posición en la secuencia a una secuencia de línea germinal, como una secuencia de anticuerpo que se encuentra en la línea germinal (p. ej., línea germinal humana), p. ej., para reducir la probabilidad de inmunogenicidad, p. ej., tras la administración a un sujeto humano.

[0199] En algunos casos, las alteraciones se realizan en CDR "puntos calientes", residuos codificados por codones que se someten a mutación en alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, p. ej., Chowdhury, Methods Mol Biol 207: 179-196 (2008)), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, con la variante resultante Vh o Vl sometida a prueba para determinar la afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, p. ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos casos de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (p. ej., PCR propensa a errores, barajado de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. A continuación, se criba la biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a CDR, en los que se aleatorizan varios residuos de CDR (p. ej., 4-6 residuos a la vez). Los residuos de CDR implicados en la unión de antígenos pueden identificarse específicamente, p. ej., usando mutagénesis de exploración de alanina o modelado. CDRH3 y CDR-L3 en particular a menudo son la diana.

[0200] En ciertos casos, sustituciones, inserciones o deleciones pueden ocurrir dentro de una o más CDR siempre que tales alteraciones no reducen sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unir antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadoras (p. ej., sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión pueden realizarse en las CDR. Tales alteraciones pueden, p. ej., estar fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las CDR. En ciertos casos de las secuencias variantes Vh y Vl proporcionadas anteriormente, cada CDR está inalterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

[0201] Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido que aumenta la media vida del suero del anticuerpo.

Modificaciones

[0202] En ciertos casos, el anticuerpo se altera para aumentar o disminuir el grado en que el anticuerpo está glicosilado, p. ej., mediante la eliminación o la inserción de uno o más sitios de glicosilación mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos y/o mediante la modificación del (de los) oligosacárido(s) unido(s) a los sitios de glicosilación, p. ej., usando ciertas líneas celulares. Los sitios de glicosilación incluyen asparagina 297 de la cadena pesada (según la numeración de Kabat).

[0203] Se describen ejemplos de modificaciones, variantes, y líneas celulares, p. ej., en la Publicación de Patente Nos US 2003/0157108, US 2004/0093621, US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki y col. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y col. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ripka y col. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Solicitud de patente de EE.UU. N° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y WO 2004/056312 A1, YamaneOhnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. y col., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680 - 688 (2006); y WO2003/085107); WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de EE.UU. N26.602.684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.); WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0204] Entre los anticuerpos modificados se encuentran aquellos que tienen una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc, tales como los que tienen una secuencia de región Fc humana u otra porción de una región constante (p. ej., una región Fc humana IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que comprende una modificación de aminoácidos (p. ej., una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

[0205] Tales modificaciones pueden realizarse, p. ej., para mejorar la vida media, alterar la unión a uno o más tipos de receptores Fc y/o alterar las funciones efectoras.

[0206] También entre las variantes son anticuerpos manipulados con cisteína tales como "thioMAbs" y otras variantes modificadas por cisteína, en las que uno o más residuos de un anticuerpo son sustituidos con residuos de cisteína, a fin de generar grupos reactivos tiol en los sitios accesibles, p. ej., para uso en la conjugación de agentes y agentes enlazadores, para producir inmunoconjugados. Los anticuerpos modificados con cisteína se describen, p. ej., en las Patentes de EE.UU. Nos 7.855.275 y 7.521.541.

[0207] En algunos casos, los anticuerpos se modifican para contener restos no proteicos adicionales, incluyendo polímeros solubles en agua. Los polímeros ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de prolipropileno óxido/óxido de etileno, polioxietilen polioles (p. ej., alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

B. Receptores recombinantes

[0208] Entre las moléculas de unión a CD19 proporcionadas son receptores recombinantes, tales como receptores de antígenos y otros receptores quiméricos, que específicamente se unen a CD19, como los receptores que contienen los anticuerpos anti-CD19 proporcionados, p. ej., fragmentos de anticuerpos. Entre los receptores de antígenos se encuentran los receptores de antígenos funcionales que no son TCR, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR). También se proporcionan células que expresan los receptores recombinantes y usos de los mismos en terapia celular adoptiva, como el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la expresión de CD19.

[0209] Los receptores de antígenos ejemplares, incluidos los CAR, y los métodos para manipular e introducir dichos receptores en las células, incluyen los descritos, p. ej., en las solicitudes de publicación de patente internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos US2002131960, US2013287748, US20130149337, la Patente de EE.UU. N2: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, y 8.479.118, y la solicitud de patente europea número EP2537416 y/o las descritas por Sadelain et al., Cancer Discov. Abril de 2013; 3 (4): 388-398; Davila y col. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338; Turtle y col., Curr. Opin. Immunol., Octubre de 2012; 24 (5): 633-39; Wu et al., Cancer, 18 de marzo de 2012 (2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígeno incluyen un CAR como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N°: WO/2014055668 A1. Ejemplos de los CAR incluyen los CAR que se describen en cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente, como WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente de EE.UU. N°: 7.446.190, Patente de EE.UU. N°: 8.389.282, p. ej., y en donde la porción de unión al antígeno, p. ej., scFv, se reemplaza por un anticuerpo, p. ej., como se proporciona en el presente documento.

[0210] Entre los receptores quiméricos son receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los receptores quiméricos, como los CAR, generalmente incluyen un dominio de unión al antígeno extracelular que incluye, es o está comprendido dentro de uno de los anticuerpos anti-CD19 proporcionados. Por tanto, los receptores quiméricos, p. ej., CAR, normalmente incluyen en sus porciones extracelulares una o más moléculas de unión a CD19, tales como uno o más fragmentos, dominios o porciones de unión a antígenos, o uno o más dominios variables de anticuerpo y/o moléculas de anticuerpo, tales como las descritas en este documento. En algunos casos, el CAR incluye una porción de unión a CD19 o porciones de la molécula de anticuerpo, como una región de cadena pesada variable (Vh) y/o región de cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo, p. ej., un fragmento de anticuerpo scFv.

[0211] Los CAR que se dirigen a CD19 se describen, p. ej., por Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang y col. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; y Brentjens y col., Sci Transl Med.

2013 5(177). Véanse también los documentos WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente de EE.UU. N°: 7.446.190 y Patente de EE.UU. N°: 8.389.282.

[0212] En algunos casos, el receptor recombinante, tal como un CAR, tal como la parte de anticuerpo del mismo, que además incluye un espaciador, que puede ser o incluir al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o una variante o versión modificada de la misma, tal como una región de bisagra, p. ej., una región de bisagra de IgG4 y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunos aspectos, la parte de la región constante sirve como región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, p. ej., scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una mayor capacidad de respuesta de la célula después de la unión del antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. En algunos ejemplos, el espaciador tiene aproximadamente 12 aminoácidos de longitud o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen aquellos que tienen al menos aproximadamente 10 a 229 aminoácidos, aproximadamente 10 a 200 aminoácidos, aproximadamente 10 a 175 aminoácidos, aproximadamente 10 a 150 aminoácidos, aproximadamente 10 a 125 aminoácidos, aproximadamente 10 a 100 aminoácidos, aproximadamente 10 a 75 aminoácidos, aproximadamente 10 a 50 aminoácidos, aproximadamente 10 a 40 aminoácidos, aproximadamente 10 a 30 aminoácidos, aproximadamente 10 a 20 aminoácidos o aproximadamente 10 a 15 aminoácidos, e incluyendo cualquier número entero entre los puntos finales de cualquiera de los rangos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene aproximadamente 12 aminoácidos o menos, aproximadamente 119 aminoácidos o menos, o aproximadamente 229 aminoácidos o menos. Los espaciadores ejemplares incluyen bisagra de IgG4 sola, bisagra de IgG4 unida a los dominios CH2 y CH3, o bisagra de IgG4 unida al dominio CH3. Los espaciadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, publicación de solicitud de patente internacional número WO2014031687, patente de EE.UU. N° 8.822.647 o aplicación publicada N° US2014/0271635.

[0213] En algunos casos, la región o porción constante es de una IgG humana, tal como IgG4 o IgG1. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (establecida en SEQ ID NO: 124), y está codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 125. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 126. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 127. En algunos casos, la región o porción constante es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 128. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOS: 124, 126, 127 o 128.

[0214] El dominio de reconocimiento de antígeno generalmente está unido a uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo receptor de antígeno, como un complejo TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. Por tanto, en algunos casos, el componente de unión específico de CD19 (p. ej., anticuerpo) se une a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelular. En algunos casos, el dominio transmembrana se fusiona con el dominio extracelular. En un caso, se usa un dominio transmembrana que naturalmente está asociado con uno de los dominios en el receptor, p. ej., CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de la superficie de la membrana o de diferentes proteínas para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

[0215] El dominio transmembrana en algunos casos se deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden al menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154 y/o regiones transmembrana que contienen variantes funcionales de las mismas tales como las que retienen una parte sustancial de las propiedades estructurales, p. ej., transmembrana de las mismas. En algunos casos, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana derivado de CD4, CD28 o CD8, p. ej., CD8alfa, o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace se realiza mediante enlazadores, espaciadores y/o dominio(s) transmembrana.

[0216] Entre los dominios de señalización intracelular son los que imitan o se aproximan a una señal a través de un entorno natural del receptor de antígeno, una señal a través de un receptor de este tipo en combinación con un receptor coestimulador, y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, un enlazador oligo o polipéptido corto, p. ej., un enlazador de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, tal como uno que contenga glicinas y las serinas, p. ej., el doblete de glicina-serina, está presente y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmico del CAR.

[0217] El receptor, p. ej., el CAR, generalmente incluye al menos un componente de señalización intracelular o componentes. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, tal como una cadena CD3 de TCR que media la activación y citotoxicidad de las células T, p. ej., la cadena zeta de CD3. Por tanto, en algunos aspectos, el anticuerpo de unión a CD19 está unido a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, los dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunos casos, el receptor, p. ej., CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales tales como el receptor y de Fc, CD8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CDS-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.

[0218] En algunos casos, después de la ligadura de la CAR, el dominio citoplásmico o dominio de señalización intracelular de la CAR activa al menos una de las funciones o las respuestas de la célula inmune, p. ej., efectores normales, células T diseñadas para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad Thelper, como la secreción de citocinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, p. ej., si transduce la señal de la función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y, en algunos aspectos, también las de los correceptores que en el contexto natural actúan en concierto con dicho receptor para iniciar la transducción de señales después del antígeno. acoplamiento del receptor y/o cualquier derivado o variante de tales moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

[0219] En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no solo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, un CAR adicional se expresa en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.

[0220] La activación de las células T es, en algunos aspectos descrita como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmáticas: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través de las TCR (secuencias de señalización citoplasmáticas primarias), y las que actúan de una manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmicas secundarias). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.

[0221] En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que actúan de manera estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas primarias incluyen las derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD8, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la(s) molécula(s) de señalización citoplásmica en el CAR contienen un dominio de señalización citoplásmico, una parte del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

[0222] En algunos casos, el coche incluye un dominio de señalización y/o la porción transmembrana de un receptor coestimulador, tal como CD28, 41BB, OX40, DAP10 o ICOS, o CD27. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador.

[0223] En algunos casos, el dominio de activación (p. ej., CD3 zeta) se incluye dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador (p. ej., CD28 o 4-1BB) lo proporciona otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimulantes, CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver WO2014/055668). En algunos aspectos, el CAR que se dirige a CD19 es el CAR estimulante o activador; en otros aspectos, es el CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, véase Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5 (215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto de CD19, por lo que una señal de activación entregada a través de la CAR orientada a CD19 se disminuye o se inhibe mediante la unión del CAR inhibidor a su ligando, p. ej., para reducir efectos fuera de diana.

[0224] En algunos casos, el componente de señalización intracelular del receptor recombinante, tal como CAR, comprende un dominio intracelular CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende una transmembrana CD28 y un dominio de señalización unidos a un dominio intracelular CD3 (p. ej., CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores quiméricos CD28 y/o CD137 (41BB, TNFRSF9), ligado al dominio intracelular de un CD3 zeta.

[0225] En algunos casos, el CAR abarca uno o más, p. ej., dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, p. ej., dominio de activación primario, en la porción citoplásmica. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1 BB.

[0226] En algunos casos, el receptor de antígeno de CAR u otro incluye además un marcador, tal como un marcador de superficie celular, que puede ser utilizado para confirmar la transducción o modificar la célula para expresar el receptor, tal como una versión truncada de un receptor de superficie de la célula, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (p. ej., forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico (p. ej., t EGFR) o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está operativamente unido a un polinucleótido que codifica una secuencia enlazadora, tal como una secuencia enlazadora escindible, p. ej., T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia enlazadora, puede ser cualquiera de los descritos en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, unido a una secuencia enlazadora, tal como una secuencia enlazadora escindible en T2A. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (p. ej., tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 138 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 138. Una secuencia de enlazador T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 137 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 137.

[0227] En algunos casos, el marcador es una molécula, p. ej., proteína de superficie celular, que no se encuentra de forma natural en las células T o no se encuentra naturalmente en la superficie de las células T, o una porción de las mismas.

[0228] En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, p. ej., proteína no autónoma, es decir, una que no es reconocida como "auto" por el sistema inmune del huésped en el que serán transferidas adoptivamente las células.

[0229] En algunos casos, el marcador no tiene ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto que no sea el de usarse como marcador para ingeniería genética, p. ej., para seleccionar células diseñadas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o molécula que de otro modo ejerce algún efecto deseado, tal como un ligando para una célula que se encuentra in vivo, tal como una molécula coestimuladora o puesto de control inmune para mejorar y/o controlar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

[0230] En algunos casos, los CAR se denominan CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que proporciona únicamente una señal inducida por la cadena CD3 al unirse al antígeno; en algunos aspectos, un CAR de segunda generación es uno que proporciona tal señal y señal coestimuladora, tal como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador tal como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación en algunos aspectos es uno que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

[0231] En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una parte extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento descrito en el presente documento. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento descrito en este documento y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que une el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. El dominio extracelular y el dominio transmembrana se pueden unir directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están unidos por un espaciador, como cualquiera de los descritos en este documento. En algunos casos, el receptor contiene una porción extracelular de la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana, como una porción extracelular de CD28. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional de la misma, tal como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.

[0232] Por ejemplo, en algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, p. ej., un fragmento de anticuerpo, como se proporciona en el presente documento, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una parte de señalización de CD28 o una variante funcional de la misma y una parte de señalización de CD3 zeta o una variante funcional de la misma. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, p. ej., un fragmento de anticuerpo, como se proporciona en el presente documento, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunos de estos casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una molécula de Ig humana, como una bisagra de Ig, p. ej., una bisagra de IgG4, como un espaciador de sólo bisagra.

[0233] En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor recombinante, p. ej., el coche, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano (p. ej., N° de Acceso P01747.1) o variante del mismo, tal como un dominio de transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 129 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 129; en algunos casos, la porción que contiene el dominio transmembrana del receptor recombinante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 130 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los mismos.

[0234] En algunos casos, el (los) componente(s) de señalización intracelular del receptor recombinante, p. ej., el CAR, contiene un dominio intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción de señalización coestimuladora de la misma, tal como un dominio con una LL a la sustitución GG en las posiciones 186-187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 131 o 132 o una secuencia de aminoácidos que exhibe en al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia para SEQ ID NO: 131 o 132. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimuladora intracelular de 4-1 BB (p. ej., (n° de acceso Q07011.1) o variante funcional o parte de la misma, como la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 133 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 133.

[0235] En algunos casos, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, p. ej., el CAR, comprende un dominio de señalización estimuladora humana CD3 zeta o variante funcional del mismo, como un dominio citoplásmico de 112 AA de isoforma 3 de CD3Z humano (N° de acceso: P20963.2) o un dominio de señalización zeta de CD3 como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 7.446.190 o en la Patente de EE.UU. N° 8.911.993. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos 134, 135 o 136 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con SEQ iD NO: 134, 135 o 136.

[0236] En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región de bisagra de una IgG, tal como solo una bisagra de IgG4 o IgG 1, tal como el espaciador de solo bisagra establecido en SEQ ID NO: 124. En otros casos, el espaciador es o contiene una bisagra de Ig, p. ej., una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente unida a dominios CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, p. ej., una bisagra de IgG4, unida a los dominios CH2 y CH3, tal como se establece en SEQ ID NO: 127. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, p. ej., una bisagra de IgG4, unida a un dominio CH3 solamente, tal como se establece en SEQ ID NO: 126. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro enlazador flexible como los enlazadores flexibles conocidos.

[0237] Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo anti-CD 19 tal como un fragmento de anticuerpo anti-CD19, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 humanos proporcionados, p. ej., anticuerpos monocatenarios que incluyen scFv, descritos en este documento, un espaciador, como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, como una región de bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, como un espaciador que contiene bisagra de Ig, un dominio transmembrana que contiene todos o una porción de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento anti-CD19, como cualquiera de los anticuerpos anti-CD 19 humanos, incluidos los scFv descritos en el presente documento, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra de Ig, una transmembrana derivada de CD28 dominio, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta.

[0238] En algunos casos, tales construcciones de CAR incluye además un elemento de T2A ribosomal y/o una secuencia tEGFR, p. ej., aguas abajo del coche, tal como se expone en SEQ ID NO: 137 y/o 138, respectivamente, o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SeQ ID NO: 137 o 138.

C. Células modificadas

[0239] También se proporcionan células, poblaciones celulares y composiciones que contienen las células, p. ej., las células manipuladas, p. ej. que contienen un receptor de antígeno modificado genéticamente, p.ej., que contiene un dominio extracelular que incluye el anticuerpo o fragmento anti-CD19, descrito en el presente documento. Entre las composiciones se encuentran composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración, tales como para terapia celular adoptiva. También se proporcionan métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos, p. ej., pacientes.

[0240] Por lo tanto, también se proporcionan células que expresan los receptores recombinantes que contienen los anticuerpos, p. ej., las células que contienen los CAR. Las células generalmente son células eucariotas, como células de mamífero, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, la médula ósea, la linfa o los órganos linfoides, son células del sistema inmunológico, tales como células de la inmunidad innata o adaptativa, p. ej., células mieloides o linfoides, incluidos linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otros ejemplos de células incluyen células madre, tales como células madre multipotentes y pluripotentes, incluidas células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células son típicamente células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial para capacidad de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcador o citoquina y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen los métodos listos para usar. En algunos aspectos, como en las tecnologías disponibles en el mercado, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, como se describe en el presente documento, y reintroducirlas en el mismo paciente, antes o después de la crioconservación.

[0241] Entre los sub-tipos y subpoblaciones de células T y/o de CD4+ y/o de las células T CD8+ son células T ingenuas (Tn), células T efectoras (Teff), células T de memoria y subtipos de las mismas, como la memoria de células T madre (Tscm), la memoria central T (Tcm), la memoria efectora T (Tem) o las células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T invariantes asociados a la mucosa (MAIT), linfocitos T reguladores adaptativos y naturales (Treg), linfocitos T auxiliares células, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.

[0242] En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos, p. ej., células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.

[0243] En algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidas a través de la ingeniería genética, y por lo tanto expresan productos recombinantes o modificados genéticamente de tales ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/o un organismo del que se deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no se encuentran en la naturaleza, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluido uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.

Vectores y métodos para la ingeniería genética

[0244] También se proporcionan métodos, ácidos nucleicos, composiciones y kits, para expresar las moléculas de unión, incluyendo los receptores que comprenden los anticuerpos, y para la producción de las células modificadas genética que expresan tales moléculas de unión. La ingeniería genética generalmente implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente recombinante o modificado en la célula, tal como por transducción, transfección o transformación retroviral.

[0245] En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero la célula, por ejemplo combinándola con un estímulo que induce una respuesta como proliferación, supervivencia y/o activación, p. ej., medida por la expresión de una citocina o marcador de activación, seguida de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta cantidades suficientes para aplicaciones clínicas.

[0246] En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulante (p. ej., una linfoquina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Por tanto, en algunos contextos, las células modificadas genéticamente incluyen segmentos de genes que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, tal como tras la administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están diseñadas para que puedan eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, p. ej., un compuesto. Los genes seleccionables negativos incluyen el gen de la timidina quinasa de tipo I del virus de1Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler y col., Cell II: 223, I977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT), la citosina desaminasa bacteriana, (Mullen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:33 (1992)).

[0247] En algunos aspectos, las células se diseñan además para promover la expresión de citocinas u otros factores. Se conocen bien varios métodos para la introducción de componentes modificados por ingeniería genética, p. ej., receptores de antígenos, p. ej., CAR, y se pueden usar con los métodos y composiciones proporcionados. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluidos los virales, p. ej., retrovirales o lentivirales, transducción, transposones y electroporación.

[0248] En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células utilizando partículas de virus infecciosas recombinantes, tal como, p. ej., vectores derivados de virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T utilizando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como los vectores gamma-retrovirales (ver, p. ej., Koste et al. (2014) Gene Therapy, 3 de abril de 2014, doi: 10.1038/gt. 2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 29 de noviembre (11): 550 - 557.

[0249] En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia repetida terminal larga (LTR), p. ej., un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de la leucemia murina de células madre embrionarias (MESV), virus de células madre murinas (MSCV), virus formador de focos del bazo (SFFV) o virus adenoasociados (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen aquellos derivados de cualquier fuente de células de aves o mamíferos. Los retrovirus son típicamente anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar las células huésped de varias especies, incluidos los humanos. En un caso, el gen que se va a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., Patentes de Estados Unidos N2 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa y col. (1991) Virology 180: 849-852; Burns y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.

[0250] Se conocen métodos de transducción lentiviral. Se describen métodos ejemplares en, p. ej., Wang et al (2012) J.. Immunother 35 (9): 689-701; Cooper et (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol.

506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.

[0251] En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación (ver, p. ej., Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431 1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes son transferidos a células T mediante transposición (véase, p. ej., Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma y col. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos de introducción y expresión de material genético en células inmunes incluyen transfección con fosfato de calcio (p. ej., como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN de fosfato de estroncio (Brash y col., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[0252] Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son las que se describen, p. ej., en la solicitud de patente internacional, publicación N° WO2014055668, y en la Patente de EE.UU. N° 7.446.190.

[0253] Entre los ácidos nucleicos adicionales, p. ej., genes para la introducción son aquellos para mejorar la eficacia de la terapia, tal como mediante la promoción de la viabilidad y/o la función de células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como para evaluar la supervivencia o localización in vivo; genes para mejorar la seguridad, p. ej., haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo, como describen Lupton SD et al., Mol. y Cell Biol., 11: 6 (1991); y Riddell y col., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992); véanse también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo. Véase, p. ej., Riddell et al., Patente de EE.UU. N° 6.040.177, en las columnas 14-17.

Preparación de células para la ingeniería

[0254] En algunos casos, la preparación de las células manipuladas incluye una o más etapas de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción de la molécula de unión a CD19, p. ej., CAR, pueden aislarse de una muestra, tal como una muestra biológica, p. ej., una obtenida o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que tiene la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se administrará la terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un ser humano que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o manipulan células.

[0255] Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, p. ej., células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética (p. ej., transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, tales como sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, fluido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de las mismas.

[0256] En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aislan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Ejemplos de muestras incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a mucosas, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdalas u otro órgano y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, p. ej., la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

[0257] En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares, p. ej., líneas de células T. En algunos casos, las células se obtienen de una fuente xenogénica, p. ej., de ratón, rata, primate no humano y cerdo.

[0258] En algunos casos, el aislamiento de las células incluye una o más etapas de preparación y/o separación de células no basadas en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, p. ej., para eliminar componentes no deseados, enriquecer para obtener componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan basándose en una o más propiedades, tales como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.

[0259] En algunos ejemplos, se obtienen las células de la sangre circulante de un sujeto, p. ej., mediante aféresis o leucaféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, que incluyen células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de los glóbulos rojos y plaquetas.

[0260] En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, p. ej., para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, una etapa de lavado se realiza con una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (p. ej., el procesador de células Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, un paso de lavado se logra mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se resuspenden en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, p. ej., PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertos casos, se extraen los componentes de una muestra de células sanguíneas y las células se resuspenden directamente en el medio de cultivo.

[0261] En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación de células basada en la densidad, tales como la preparación de las células blancas de la sangre de la sangre periférica mediante lisis de las células sanguíneas y centrifugación rojo a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

[0262] En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células en base a la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, tales como los marcadores de superficie, p. ej., proteínas de superficie, marcadores intracelulares, o ácido nucleico. En algunos casos, puede usarse cualquier método conocido para la separación basado en tales marcadores. En algunos casos, la separación es una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones de células basándose en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, p. ej., mediante incubación con un anticuerpo o pareja de unión que se une específicamente a dichos marcadores, seguidos generalmente por etapas de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o pareja de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o pareja de unión.

[0263] Tales etapas de separación se pueden basar en la selección positiva, en la que las células que han unido a los reactivos se conservan para su uso posterior, y/o de selección negativa, en la que las células quen no han unido al anticuerpo o pareja de unión son retenidas. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no está disponible ningún anticuerpo que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de modo que la separación se lleve a cabo mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.

[0264] No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia completa de células que no expresan el marcador. Asimismo, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado la eliminación completa de todas esas células.

[0265] En algunos ejemplos, múltiples rondas de etapas de separación se llevan a cabo, en las que la fracción positiva o negativamente seleccionada de una etapa se somete a otra etapa de separación, tal como una posterior selección positiva o negativa. En algunos ejemplos, una sola etapa de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o parejas de unión, cada uno específico para un marcador dirigido a la selección negativa. Asimismo, se pueden seleccionar de forma positiva múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o parejas de unión expresadas en los diversos tipos de células.

[0266] Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, p. ej., células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.

[0267] Por ejemplo, células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente utilizando cuentas magnéticas CD3/CD28 conjugadas (p. ej., Dynabeads® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

[0268] En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante el enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o el agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

[0269] En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC por selección negativa de marcadores expresados en células no T, como las células B, monocitos, u otras células blancas de la sangre, tales como CD14. En algunos aspectos, se utiliza un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las células T citotóxicas CD8+. Dichas poblaciones de CD4+ y CD8+ se pueden clasificar adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa de marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.

[0270] En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan en células madre de memoria central, memoria efectora y/o memoria central vírgenes, como por selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de las células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, p. ej., para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto después de la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusto en tales subpoblaciones. VerTerakura et al. (2012) Blood. 1: 72-82; Wang y col. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con Tcm y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.

[0271] En casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC pueden enriquecerse o reducirse en fracciones de CD62L- CD8+ y/o CD62L+ CD8+, como por ejemplo usando anticuerpos antiCD8 y anti-CD62L.

[0272] En algunos casos, el enriquecimiento de la memoria T central (Tcm) de células se basa en la superficie positiva o alta expresión de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o expresan en gran medida CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida para células Tcm se realiza mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA y selección positiva o enriquecimiento de células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento de las células T (Tcm) de memoria central se lleva a cabo a partir de una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Dichas selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 que se utiliza para preparar la población o subpoblación de células CD8+, también se utiliza para generar la población o subpoblación de células CD4+, de modo que las fracciones tanto positivas como negativas de la separación basada en CD4- se retiene y se usa en las etapas posteriores de los métodos, opcionalmente siguiendo una o más etapas de selección positiva o negativa adicionales.

[0273] En un ejemplo particular, una muestra de PBMCs u otra muestra de células blancas de la sangre se somete a la selección de CD4+ células, donde se conservan las fracciones tanto negativas como positivas. La fracción negativa luego se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positivas y negativas se llevan a cabo en orden.

[0274] Las células T auxiliares CD4+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ se pueden obtener mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.

[0275] En un ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o la pareja de unión se une a un soporte sólido o una matriz, como una cuenta magnética o una cuenta paramagnética, para permitir la separación de las células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones de células se separan o aíslan mediante técnicas de separación inmunomagnéticas (o de afinidad magnética) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p. 17-25 Editado por: SA Brooks y U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, Nueva Jersey).

[0276] En algunos aspectos, la muestra o composición de células a ser separadas se incuba con material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, tal como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, tales como esferas paramagnéticas (p. ej., como Dynalbeads o cuentas MACS). El material magnéticamente sensible, p. ej., una partícula, generalmente se une directa o indirectamente a una pareja de unión, p. ej., un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, p. ej., un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, p. ej., que se desea seleccionar negativa o positivamente.

[0277] En algunos casos, la partícula o cuenta magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo u otra pareja de unión. Hay muchos materiales de respuesta magnética bien conocidos que se utilizan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, patente de EE.UU. 4.452.773, y en la memoria descriptiva de la patente europea EP 452342 B. Partículas de tamaño coloidal, tales como las descritas en la patente de EE.UU. N° 4.795.698 y Liberti et al., Patente de EE.UU. 5.200.084 son otros ejemplos.

[0278] La incubación generalmente se lleva a cabo bajo condiciones en donde los anticuerpos o parejas de unión, o moléculas, tales como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o parejas de unión, que están unidos a la partícula magnética o cuenta, en concreto se unen a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células de la muestra.

[0279] En algunos aspectos, la muestra se coloca en un campo magnético, y las células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables fijadas al misma serán atraídas al imán y se separan de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células sin marcar). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positiva y negativa se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

[0280] En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles se recubren con anticuerpos primarios u otras parejas de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un revestimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las cuentas, se marcan con un anticuerpo primario o una pareja de unión, y luego se agregan partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico de tipo celular u otra pareja de unión (p. ej., estreptavidina). En ciertos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se utilizan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

[0281] En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan unidas a las células que van a ser posteriormente incubadas, cultivadas y/o modificadas; en algunos aspectos, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o que responden magnéticamente se eliminan de las células. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, p. ej., el uso de anticuerpos no marcados competidores, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con enlazadores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

[0282] En algunos casos, la selección basada en la afinidad es a través de células activadas por la clasificación magnética (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los sistemas de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertos casos, MACS funciona en un modo en el que las especies diana y no diana se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células unidas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no unidas. Luego, después de que se completa este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y se impidió que fueran eluidas se liberan de alguna manera para que puedan eluirse y recuperarse. En ciertos casos, las células no diana se marcan y se agotan de la población heterogénea de células.

[0283] En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo utilizando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación del método. En algunos aspectos, el sistema se utiliza para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, p. ej., para minimizar errores, manipulación por parte del usuario y/o contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1.

[0284] En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, p. ej., la totalidad, del aislamiento, el procesamiento, la ingeniería, y formulación de pasos en un sistema autónomo integrado y/o en un sistema automatizado o modo programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye una computadora y/o programa de computadora en comunicación con el sistema o aparato, que le permite al usuario programar, controlar, evaluar el resultado y/o ajustar varios aspectos del procesamiento, aislamiento, pasos de ingeniería y formulación.

[0285] En algunos aspectos, la separación y/o otros pasos se lleva a cabo utilizando el sistema de CliniMACs (Miltenyi biótico), p. ej., para la separación automatizada de las células en un nivel clínico a gran escala en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de manguito. En algunos aspectos, la computadora integrada controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para que realice procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. La unidad de separación magnética en algunos aspectos incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla la velocidad de flujo en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de manguito, asegura el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.

[0286] El sistema de CliniMACs en algunos aspectos utiliza partículas magnetizables de anticuerpo acoplado que se suministran en una solución estéril, no pirógena. En algunos casos, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. A continuación, se conecta una bolsa de preparación de células al conjunto de tubos, que a su vez se conecta a una bolsa que contiene tampón y una bolsa de recogida de células. El juego de tubos consta de tubos estériles preensamblados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son para un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra de la célula en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en este documento no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para su uso con los métodos descritos en este documento se marcan y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones de células para uso con los métodos descritos en este documento se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.

[0287] En ciertos casos, la separación y/o otros pasos se llevan a cabo utilizando el sistema de CliniMACs Prodigy (Miltenyi Biotec). El sistema CliniMACS Prodigy, en algunos aspectos, está equipado con una unidad de procesamiento de células que permite el lavado y el fraccionamiento automáticos de las células mediante centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final de fraccionamiento celular óptimo al discernir las capas macroscópicas del producto de la célula de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en eritrocitos, glóbulos blancos y capas de plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que logra protocolos de cultivo celular tales como, p. ej., diferenciación y expansión celular, carga de antígeno y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción estéril y el reabastecimiento de los medios y las células se pueden monitorear usando un microscopio integrado. Véase, p. ej., Klebanoff et al. (2012) J Immunother.

35 (9): 651-660, Terakura et al. (2012) Sangre. 1: 72-82 y Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

[0288] En algunos casos, una población de células descritas en este documento se recoge y se enriquece (o agota) a través de citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se llevan en una corriente de fluido. En algunos casos, una población celular descrita en el presente documento se recolecta y se enriquece (o se agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población celular descrita en este documento se recolecta y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (ver, p. ej., WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5): 355-376. En ambos casos, las células se pueden marcar con múltiples marcadores, lo que permite el aislamiento de subconjuntos de células T en alta pureza.

[0289] En algunos casos, los anticuerpos o parejas de unión se etiquetan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede estar basada en la unión a anticuerpos marcados fluorescentemente. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otras parejas de unión específicas para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), incluida la escala preparativa (FACS) y/o chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS), p. ej., en combinación con un sistema de detección de citometría de flujo. Dichos métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.

[0290] En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, p. ej., criopreservar las células, antes o después del aislamiento, incubación y/o ingenieria. En algunos casos, el paso de congelación y descongelación posterior elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, p. ej., después de una etapa de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. Puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos en algunos aspectos. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA) u otros medios de congelación de células adecuados. A continuación, se diluye 1:1 con medio de modo que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan a -80°C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

[0291] En algunos casos, los métodos proporcionados incluyen pasos de cultivo, incubación, cultivo y/o ingeniería genética. Por ejemplo, en algunos casos, se proporcionan métodos para incubar y/o manipular las poblaciones de células agotadas y las composiciones iniciadoras del cultivo.

[0292] Por lo tanto, en algunos casos, las poblaciones de células se incuban en una composición de cultivo iniciador. La incubación y/o la ingeniería pueden llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, tal como una unidad, cámara, pozo, columna, tubo, juego de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para cultivo o para cultivar las células.

[0293] En algunos casos, las células se incuban y/o cultivan antes o en conexión con la ingeniería genética. Las etapas de incubación pueden incluir cultivo, crecimiento, estimulación, activación y/o propagación. En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o un agente estimulante. Dichas condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o cebar las células para la ingeniería genética, tal como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.

[0294] Las condiciones pueden incluir uno o más de determinados medios, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, p. ej., los nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, tales como citocinas, quimiocinas, antígenos, parejas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

[0295] En algunos casos, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, p. ej., ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente enciende o inicia la cascada de señalización intracelular de TCR/CD3 en una célula T. Dichos agentes pueden incluir anticuerpos, tales como los específicos para un componente de TCR y/o receptor coestimulador, p. ej., anti-CD3, antiCD28, p. ej., unidos a un soporte sólido tal como una cuenta y/o una o más citocinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además la etapa de añadir anticuerpo anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (p. ej., a una concentración de al menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimulantes incluyen IL-2 y/o IL-15, p. ej., una concentración de IL-2 de al menos aproximadamente 10 unidades/ml.

[0296] En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas tales como las descritas en la Patente US N° 6,040,1 77 a Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakura et al. (2012) Sangre. 1: 72-82 y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.

[0297] En algunos casos, las células T se expanden mediante la adición a las células de cultivo de iniciación de la composición de alimentación, tales como las células mononucleares periféricas de la sangre que no se dividen (PBMC), (p. ej., de tal manera que la población resultante de células contiene al menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a expandir); e incubar el cultivo (p. ej., durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el rango de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se agregan al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

[0298] En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, p. ej., al menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente al menos aproximadamente 30 grados, y generalmente en o alrededor de 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides transformadas con EBV (LCL) que no se dividen como células alimentadoras. El LCL se puede irradiar con rayos gamma en el rango de aproximadamente 6000 a 10,000 rads. Las células alimentadoras de LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, tal como una proporción de células alimentadoras de LCL a linfocitos T iniciales de al menos aproximadamente 10:1.

[0299] En los casos, las células T específicas de antígeno, tales como el antígeno específico de células CD4+ y/o CD8+ T, se obtienen por la estimulación de linfocitos específicos T ingenuos o antígeno con el antígeno. Por ejemplo, se pueden generar líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.

II. Composiciones, métodos y usos

[0300] También se proporcionan composiciones que incluyen las moléculas y células modificadas, incluyendo las composiciones y formulaciones farmacéuticas, y métodos de uso y los usos de las moléculas y composiciones, tales como la unión CD19 en el tratamiento de enfermedades, condiciones y trastornos en los que se expresa CD19 y/o métodos de detección, diagnóstico y pronóstico.

A. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

[0301] Se proporcionan formulaciones farmacéuticas que incluyen la molécula de unión a CD19, p. ej., el receptor de anticuerpo o quimérico, y/o las células modificadas expresando las moléculas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas generalmente incluyen uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. En algunos casos, la composición incluye al menos un agente terapéutico adicional.

[0302] El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que se permita la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma para ser eficaz, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto para el que se administraría la formulación.

[0303] Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

[0304] En algunos aspectos, la elección del vehículo está determinada en parte por la célula, molécula de unión y/o anticuerpo particular, y/o por el método de administración. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, p. ej., metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se utiliza una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, p. ej., en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los vehículos farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG).

[0305] Los agentes tamponadores en algunos aspectos se incluyen en las composiciones. Los agentes tamponadores adecuados incluyen, p. ej., ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y varios otros ácidos y sales. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).

[0306] Las formulaciones de los anticuerpos pueden incluir formulaciones liofilizadas y soluciones acuosas.

[0307] La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad, o afección particular que se está tratando con las moléculas o células de unión, preferentemente aquellas con actividades complementarias a la molécula o célula de unión, donde las respectivas actividades no se afecten negativamente unas a otras. Dichos ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Por tanto, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, p. ej., asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina., vincristina, etc. En algunos casos, las células o anticuerpos se administran en forma de sal, p. ej., una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y los ácidos orgánicos, tales como tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, ácidos glucónico, succínico y arilsulfónico, p. ej., ácido ptoluenosulfónico.

[0308] Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (p. ej., liposomas, albúmina microesferas, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. En ciertos casos, la composición farmacéutica se formula como un complejo de inclusión, tal como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (p. ej., células T o células NK) a un tejido particular. Hay muchos métodos disponibles para preparar liposomas, tales como los descritos en, p. ej., Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), y las Patentes de Estados Unidos 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

[0309] La composición farmacéutica en algunos aspectos puede emplear tiempo liberado, liberación retardada, sostenida y sistemas de administración de liberación tal que el suministro de la composición se produce antes de, y con el tiempo suficiente para causar la sensibilización del sitio a tratar. Hay muchos tipos de sistemas de liberación disponibles y conocidos. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición, aumentando así la comodidad para el sujeto y el médico.

[0310] La composición farmacéutica en algunos casos contiene las moléculas de unión y/o células en cantidades efectivas para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica se controla mediante una evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y pueden determinarse. La dosis deseada se puede administrar mediante la administración de un solo bolo de la composición, mediante múltiples administraciones de bolo de la composición o mediante la administración de infusión continua de la composición.

[0311] En ciertos casos, en el contexto de células manipuladas genéticamente que contienen las moléculas de unión, a un sujeto se le administra el intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células, como, p. ej., 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (p. ej., alrededor de 5 millones de células, alrededor de 25 millones de células, alrededor de 500 millones de células, alrededor de 1 mil millones de células, alrededor de 5 mil millones de células, alrededor de 20 mil millones de células, alrededor de 30 mil millones de células, alrededor de 40 mil millones de células o un intervalo definido por dos de los anteriores valores), como alrededor de 10 millones a alrededor de 100 mil millones de células (p. ej., alrededor de 20 millones de células, alrededor de 30 millones de células, alrededor de 40 millones de células, alrededor de 60 millones de células, alrededor de 70 millones de células, alrededor de 80 millones de células, alrededor de 90 millones de células), alrededor de 10 mil millones de células, alrededor de 25 mil millones de células, alrededor de 50 mil millones de células, alrededor de 75 mil millones de células, alrededor de 90 mil millones de células o un rango definido por dos de los valores anteriores) y, en algunos casos, alrededor de 100 millones de células a alrededor de 50 mil millones de células (p. ej., alrededor de 120 millones de células, 250 millones de células, alrededor de 350 millones de células, alrededor de 450 millones de células, alrededor de 650 millones de células, alrededor de 800 millones de células, alrededor de 900 millones de células, alrededor de 3 mil millones de células, alrededor de 30 mil millones de células, alrededor de 45 mil millones de células) o cualquier valor entre estos rangos, y/o tal número de células por kilogramo de peso corporal del sujeto.

[0312] Puede administrarse usando técnicas estándar de administración, formulaciones, y/o dispositivos. Se proporcionan formulaciones y dispositivos, tales como jeringas y viales, para el almacenamiento y administración de las composiciones. La administración de las células puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, las células o progenitores inmunorespondedores pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto compatible diferente. Las células inmunorespuestas derivadas de sangre periférica o su progenie (p. ej., in vivo, ex vivo o derivadas in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluida la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (p. ej., una composición farmacéutica que contiene una célula inmunorespondedora modificada genéticamente), generalmente se formulará en una forma de dosis unitaria inyectable (solución, suspensión, emulsión).

[0313] Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunos casos, las poblaciones de células se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en este documento, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, las poblaciones de células se administran a un sujeto usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

[0314] Las composiciones en algunos casos se proporcionan como preparaciones estériles líquidas, p. ej., soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que pueden en algunos aspectos ser tamponadas a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Las composiciones viscosas, por otro lado, se pueden formular dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar períodos de contacto más largos con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender vehículos, que pueden ser un medio disolvente o dispersante que contenga, p. ej., agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, polioi (p. ej., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

[0315] Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de la molécula de unión en un disolvente, tal como en una mezcla con un vehículo adecuado, diluyente o excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa, o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (p. ej., metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. En algunos aspectos, los textos estándar pueden consultarse para preparar preparaciones adecuadas.

[0316] Se pueden añadir aditivos diversos que aumentan la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, p. ej., parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina.

[0317] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas.

[0318] Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, p. ej., mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

B. Métodos y usos terapéuticos y profilácticos

[0319] También se proporcionan métodos de uso y los usos de las moléculas de unión CD19, incluyendo los anticuerpos anti-CD19, p. ej., fragmentos de anticuerpos y/o células modificadas genéticamente que expresan los receptores recombinantes. Dichos métodos y usos incluyen métodos y usos terapéuticos, p. ej., que implican la administración de moléculas, células o composiciones que las contienen, a un sujeto que tiene una enfermedad, afección o trastorno que expresa o está asociado con la expresión de CD19, y/o en el que las células o tejidos expresan CD19. En algunos casos, la molécula, célula y/o composición se administra en una cantidad eficaz para efectuar el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Los usos incluyen usos de los anticuerpos y células en tales métodos y tratamientos, y en la preparación de un medicamento para llevar a cabo tales métodos terapéuticos. En algunos casos, los métodos se llevan a cabo administrando los anticuerpos o células, o composiciones que los comprenden, al sujeto que tiene o se sospecha que tiene la enfermedad o afección. En algunos casos, los métodos tratan así la enfermedad o afección o trastorno en el sujeto.

[0320] Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales de la misma, tales como "tratar1 o "tratamiento") se refiere a completar o mejora parcial o reducción de una enfermedad o condición o trastorno, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con el mismo. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejor pronóstico. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad o la eliminación completa de cualquier síntoma o efecto(s) en todos los síntomas o resultados.

[0321] Como se usa en este documento, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa aplazar, obstaculizar, ralentizar, retrasar, estabilizar, reprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede ser de diferentes períodos de tiempo, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo tratado. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en etapa tardía, como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.

[0322] "Prevención", como se usa aquí, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad. En algunos casos, las moléculas y composiciones proporcionadas se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o retrasar la progresión de una enfermedad.

[0323] Como se usa en este documento, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad cuando se compara con condiciones que de otro modo son las mismas excepto para una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otro estado. Por ejemplo, un anticuerpo o composición o célula que suprime el crecimiento tumoral reduce la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia del anticuerpo o composición o célula.

[0324] Una "cantidad eficaz" de un agente, p. e j, una formulación farmacéutica, molécula, anticuerpo, o células, o de unión a la composición, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones/cantidades y durante periodos de tiempo necesarios para lograr un resultado deseado, como un resultado terapéutico o profiláctico.

[0325] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, p. ej., un producto farmacéutico de formulación, anticuerpo, o células, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, tal como para tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno y/o efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y las poblaciones de células administradas. En algunos casos, los métodos proporcionados implican la administración de moléculas, células y/o composiciones en cantidades eficaces, p. ej., cantidades terapéuticamente eficaces.

[0326] Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

[0327] Como se usa en este documento, un "sujeto" es un mamífero, como un ser humano u otro animal, y típicamente es un ser humano. Las enfermedades y trastornos incluyen neoplasias malignas de células B, como leucemias y linfomas de células B, incluyendo leucemia linfocítica crónica de células B (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemias pro-linfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comunes, leucemias linfoblásticas nulas agudas, linfomas no Hodgkin, linfomas difusos de células B grandes (LDCBG), mielomas múltiples, linfoma folicular, linfoma esplénico de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolentes, linfoma de Hodgkin. También entre las enfermedades y afecciones se encuentran las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluidas las asociadas con números y/o activación inadecuados o mejorados de células B. Las enfermedades y afecciones ejemplares incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico (LES).

[0328] En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad persistente o en recaída, p. ej., después del tratamiento con otro anticuerpo específico de CD19 y/o células que expresan un receptor quimérico dirigido a CD19 y/u otra terapia, que incluye quimioterapia, radiación y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), p. ej., HSCT alogénico. En algunos casos, la administración trata eficazmente al sujeto a pesar de que el sujeto se ha vuelto resistente a otra terapia dirigida a CD19. En algunos casos, el sujeto no ha recaído, pero se determina que tiene riesgo de recaída, tal como un alto riesgo de recaída, y por lo tanto el compuesto o composición se administra profilácticamente, p. ej., para reducir la probabilidad de recaída o prevenirla.

[0329] En algunos casos, el tratamiento no induce una respuesta inmune por parte del sujeto a la terapia, y/o no induce tal respuesta en un grado que impide el tratamiento eficaz de la enfermedad o afección. En algunos aspectos, el grado de inmunogenicidad y/o respuesta de injerto contra huésped es menor que el observado con un tratamiento diferente pero comparable. Por ejemplo, en el caso de la terapia celular adoptiva que utiliza células que expresan CAR, incluidos los anticuerpos anti-CD19 proporcionados, el grado de inmunogenicidad se reduce en comparación con los CAR que incluyen un anticuerpo diferente que se une a un epítopo similar, p. ej., superpuesto y/o que compite para unirse a CD19 con el anticuerpo proporcionado, como un anticuerpo de ratón.

[0330] En algunos casos, los procedimientos incluyen la terapia celular adoptiva, con lo que las células modificadas genéticamente que expresan los receptores que contienen anti-CD19 proporcionados (p. ej., CARs dirigidos por CD19) se administran a los sujetos. Tal administración puede promover la activación de las células (p. ej., la activación de las células T) de una manera dirigida a CD19, de modo que las células de la enfermedad o trastorno se dirijan a la destrucción.

[0331] Por lo tanto, los métodos y usos proporcionados incluyen métodos y usos para la terapia celular adoptiva. En algunos casos, los métodos incluyen la administración de las células o una composición que contiene las células a un sujeto, tejido o célula, tal como uno que tiene, está en riesgo o se sospecha que tiene la enfermedad, afección o trastorno. En algunos casos, las células, poblaciones y composiciones se administran a un sujeto que tiene la enfermedad o afección particular que se va a tratar, p. ej., mediante terapia de células adoptivas, tal como terapia de células T adoptivas. En algunos casos, las células o composiciones se administran al sujeto, tal como un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer la enfermedad o afección. En algunos aspectos, los métodos de ese modo tratan, p. ej., mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, p. ej., disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa CD19.

[0332] Los métodos para la administración de células para la terapia celular adoptiva son conocidos y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones proporcionados. Por ejemplo, los métodos de terapia adoptiva de células T se describen, p. ej., en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de EE.UU. N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10): 577-85). Véase, p. ej., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara y col. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila y col. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.

[0333] En algunos casos, la terapia celular, p. ej., la terapia adoptiva de células, p. ej., la terapia adoptiva de células T, se lleva a cabo por transferencia autóloga, en la que se aíslan las células y/o preparados a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, p. ej., un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras el aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.

[0334] En algunos casos, la terapia celular, p. ej., la terapia adoptiva de células, p. ej., la terapia adoptiva de células T, se lleva a cabo por transferencia alogénica, en la que se aíslan las células y/o preparados de otro modo de un sujeto distinto de un sujeto que ha de recibir o que finalmente recibe la terapia celular, p. ej., un primer sujeto. En tales casos, las células luego se administran a un sujeto diferente, p. ej., un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, los sujetos primero y segundo son genéticamente idénticos. En algunos casos, los sujetos primero y segundo son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.

[0335] En algunos casos, el sujeto, al que se administran las células, poblaciones de células, o las composiciones es un primate, tal como un humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluidos sujetos lactantes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero que no es un primate, como un roedor. En algunos ejemplos, el paciente o sujeto es un modelo animal validado para enfermedad, terapia celular adoptiva y/o para evaluar resultados tóxicos como el síndrome de liberación de citocinas (SRC).

[0336] El CD19 de unión a moléculas, tales como anticuerpos y receptores quiméricos que contienen los anticuerpos y células que expresan los mismos, pueden administrarse por cualquier medio adecuado, p. ej., por inyección, p. ej., inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección trans-septal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjuntival, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunos casos, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, por administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación y la administración pueden depender en parte de si la administración es breve o crónica. Varios programas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, administraciones únicas o múltiples en varios puntos de tiempo, administración de bolo e infusión por pulsos.

[0337] Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de la molécula o célula de unión puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de molécula de unión, la gravedad y el curso de la enfermedad, si la molécula de unión es administrada con fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la molécula de unión, y la discreción del médico tratante. En algunos casos, las composiciones, moléculas y células se administran adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

[0338] Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, las dosis de anticuerpos pueden incluir aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (p. ej., 0,1 mg/kg-10 mg/kg), aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg. Pueden administrarse múltiples dosis de forma intermitente, p. ej., cada semana o cada tres semanas. Puede administrarse una dosis de carga inicial más alta, seguida de una o más dosis más bajas.

[0339] En ciertos casos, en el contexto de las células modificadas genéticamente que contienen las moléculas de unión, un sujeto se administra el intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal, como, p. ej., 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, alrededor de 20 mil millones de células, alrededor de 30 mil millones de células, alrededor de 40 mil millones de células o un rango definido por dos de los valores anteriores), como alrededor de 10 millones a alrededor de 100 mil millones de células (p. ej., alrededor de 20 millones de células, alrededor de 30 millones de células, alrededor de 40 millones de células, alrededor de 60 millones de células, alrededor de 70 millones de células, alrededor de 80 millones de células, alrededor de 90 millones de células, alrededor de 10 mil millones de células, alrededor de 25 mil millones de células, alrededor de 50 mil millones de células, alrededor de 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células, o un rango definido por dos de los valores anteriores), y en algunos casos alrededor de 100 millones de células a alrededor de 50 mil millones de células (p. ej., alrededor de 120 millones de células, alrededor de 250 millones de células, alrededor de 350 millones de células, alrededor de 450 millones de células, alrededor de 650 millones de células, alrededor de 800 millones de células, alrededor de 900 millones de células, alrededor de 3 mil millones de células, alrededor de 30 mil millones de células, alrededor de 45 mil millones de células) o cualquier valor entre estos rangos y/o por kilogramo de peso corporal. De nuevo, las dosis pueden variar dependiendo de los atributos particulares de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/u otros tratamientos.

[0340] En algunos casos, las células o anticuerpos se administran como parte de un tratamiento de combinación, tal como al mismo tiempo con o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, tal como otro anticuerpo o ingeniería celular o receptor o agente, tal como un agente citotóxico o terapéutico.

[0341] Las células o anticuerpos en algunos casos son co-administrados con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultáneamente o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cerca en el tiempo como para que las poblaciones de células mejoren el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células o los anticuerpos se administran antes del uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las células o los anticuerpos se administran después del uno o más agentes terapéuticos adicionales.

[0342] Una vez que las células se administran a un mamífero (p. ej., un humano), la actividad biológica de las poblaciones de células modificadas y/o anticuerpos en algunos aspectos se mide por cualquiera de una serie de métodos conocidos. Los parámetros para evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada por ingeniería genética u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, p. ej., mediante formación de imágenes, o ex vivo, p. ej., mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células manipuladas para destruir las células diana se puede medir usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, p. ej., Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) y Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25 - 40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células también se puede medir ensayando la expresión y/o secreción de ciertas citocinas, tales como CD 107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga o carga tumoral.

[0343] En ciertos casos, las células manipuladas se modifican de diversas formas, de modo que se incrementa su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, el CAR o TCR diseñado por ingeniería genética expresado por la población se puede conjugar directa o indirectamente a través de un enlazador a un resto de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, p. ej., el CAR o TCR, a fracciones de direccionamiento es conocida en la técnica. Véanse, p. ej., Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 11 1 (1995) y la patente de EE.UU. 5.087.616.

C. Métodos de diagnóstico y detección

[0344] También se proporcionan procedimientos que implican el uso de las moléculas de unión proporcionadas, p. ej., anticuerpos, incluyendo anticuerpos fragmentos, y moléculas (tales como conjugados y complejos) que contienen uno o más de dichos anticuerpos, para la detección, pronóstico, diagnóstico, estadificación, determinación de la unión de un tratamiento particular a uno o más tejidos o tipos de células, y/o información de decisiones de tratamiento en un sujeto, como por la detección de CD19 y/o la presencia de un epítopo del mismo reconocido por el anticuerpo. En algunos ca so s, los métodos son métodos de diagnóstico y/o pronóstico en asociación con una enferm edad o afección que expresa C D ¹⁹. Los métodos en algunos c a so s incluyen incubar y/o sondar una muestra biológica con el anticuerpo y/o adm inistrar el anticuerpo a un sujeto. En ciertos ca so s, una m uestra biológica incluye una célu la o tejido o parte del mismo, tal como tejido tumoral o canceroso o biopsia o sección de la m ism a. En ciertos ca so s, el contacto se realiza en condiciones perm isivas para la unión del anticuerpo a n ti-C D ¹⁹a C D ¹⁹presente en la muestra. En algunos ca so s, los métodos incluyen adem ás detectar si se forma un com plejo entre el anticuerpo a n ti-C D ¹⁹y C D ¹⁹en la m uestra, como detectar la presencia o a u se n cia o el nivel de d icha unión. T a l método puede ser un método in vitro o in vivo. En un caso , se usa un anticuerpo a n ti-C D ¹⁹para se leccio nar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo a n t i-C D ¹⁹o un receptor de antígeno modificado, p. ej., donde C D ¹⁹e s un biom arcador para la selección de pacientes.

[0345] En algunos ca so s, una muestra, como una célula, m uestra de tejido, lisado, com posición u otra muestra derivada de la m ism a, se pone en contacto con el anticuerpo a n t i-C D ¹⁹y se une o forma un com plejo entre el anticuerpo y la m uestra (p. ej., C D ¹⁹en la muestra) se determ ina o detecta. Cuando se dem uestra o detecta la unión en la m uestra de prueba en com paración con una célu la de referencia del mismo tipo de tejido, puede indicar la presencia de una enferm edad o afección asociada, y/o que un agente terapéutico que contiene el anticuerpo (p. ej., un fragmento de anticuerpo) se unen específicam ente a un tejido o célu la que e s el mismo o e s del mism o tipo que el tejido o célu la u otro material biológico del que se deriva la muestra. En algunos ca so s, la muestra e s de tejidos hum anos y puede provenir de tejido enfermo y/o normal, p. ej., de un sujeto que tiene la enferm edad o afección que se v a a tratar y/o de un sujeto de la m ism a esp ecie que dicho sujeto pero que no tiene la enferm edad o afección a tratar. En algunos ca so s, el tejido o célu la normal proviene de un sujeto que tiene la enferm edad o afección que se va a tratar, pero no e s en s í mismo una célu la o tejido enfermo, como un tejido normal del mismo órgano o de un órgano diferente al de un cá n ce r que está presente en un sujeto dado.

[0346] S e pueden u sar varios métodos conocidos en la técnica para detectar la unión e sp ecífica de anticuerpoantígeno. Los inm unoensayos ejem plares incluyen inm unoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), inm unoensayo de fluorescencia (FIA), inm unoensayo enzim ático (EIA), inm unoensayo de inhibición nefelométrica (NIA), ensayo inm unoabsorbente ligado a enzim as (E LISA ) y radioinm unoensayo (RIA). S e puede unir un resto indicador, o grupo m arcador, a los anticuerpos en cuestión y se seleccio na para satisfacer las n ecesid ad es de diversos usos del método que a menudo están determ inados por la disponibilidad del equipo de ensayo y procedim ientos de inm unoensayo com patibles. Etiquetas ejem plares incluyen radionucleidos (p. ej, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³H, o 32P y/o de cromo (⁵¹Cr), cobalto (⁵⁷Co), flúor (¹⁸F), gadolinio (¹⁵³G d, ¹⁵⁹Gd), germ anio (⁶⁸Ge), holmio (¹⁶⁶Ho), indio (¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In, ¹¹¹In), yodo (¹²⁵I, 123I ¹²¹I), lantano (¹⁴⁰La), lutecio (¹⁷⁷Lu), m anganeso (⁵⁴Mn), molibdeno (⁹⁹Mo), paladio (¹⁰³Pd), fósforo (³²p ), praseodim io (¹⁴²Pr), prometio (¹⁴⁹Pm), renio (^{1 8 6}Re, ^{1 8 8}Re), rodio (^{1 0 5}Rh), rutheroio (^{9 7}Ru), sam ario (¹⁵³Sm ), escandio (⁴⁷Sc), selenio (⁷⁵Se), (⁸⁵Sr), azufre (³⁵S), tecnecio (⁹⁹Tc), talio (²⁰¹Ti), estaño (¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn), tritio (³H), xenón (¹³³Xe), iterbio (¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb), itrio (⁹⁰Y), enzim as (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, luciferasa o p -g lactosidasa), restos o proteínas fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, G F P o B F P ) o restos lum iniscentes (p. ej., nanopartículas Q d o t™ sum inistradas por Quantum Dot Corporation, Palo Alto, California). Se conocen va ria s técnicas g enerales para u sar en la realización de los d iversos inm unoensayos indicados anteriormente.

[0347] Para los propósitos de diagnóstico, los anticuerpos se pueden m arcar con un resto detectable, incluyendo pero no limitado a radioisótopos, m arcadores fluorescentes, y varias etiquetas de sustrato de enzim a conocidos en la técnica. Los métodos para conjugar m arcadores con un anticuerpo se conocen en la técnica.

[0348] En algunos ca so s, los anticuerpos no necesitan m arcarse y la presencia de los m ism os puede detectarse usando un anticuerpo m arcado que se una a cualquiera de los anticuerpos.

[0349] Los anticuerpos proporcionados en este documento pueden em plearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como la unión competitiva, e n sayo s de sándw ich directos e indirectos, y en sayo s de inm unoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A M anual of Techniques, págs. ^{147 - 1 58}(C R C P ress, Inc. ^{198 7}).

[0350] Los anticuerpos y polipéptidos también se pueden utilizar para en sayo s de diagnóstico in vivo, tales como formación de im ágenes in vivo. Generalm ente, el anticuerpo se m arca con un radionúclido (tal como ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C , ¹³¹I, 125i o ³H) de modo que las cé lu las o el tejido de interés se pueden localizar in v ivo d esp ués de la adm inistración a un sujeto.

[0351] El anticuerpo también puede se r utilizado como la tinción de reactivo en la patología, p. ej., usando técnicas conocidas.

III. A rtículos de fabricación

[0352] Tam bién se proporcionan artículos de fabricación que contienen las m oléculas de unión proporcionadas, p. ej., anticuerpos y C A R y/o cé lu las y/o com posiciones m odificadas genéticam ente. Los artículos de fabricación pueden incluir un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con él. Los recipientes adecuado s incluyen, p. ej., botellas, v ia les, jeringas, bolsas de solución intravenosa, etc. Los recipientes pueden form arse a partir de una variedad de m ateriales tales como vidrio o plástico. En algunos ca so s, el recipiente contiene una com posición que es por s í m ism a o com binada con otra com posición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección. En algunos casos, el contenedor tiene un puerto de acceso estéril. Los recipientes ejemplares incluyen bolsas de solución intravenosa, viales, incluidos los que tienen tapones perforables con una aguja para inyección. La etiqueta o el prospecto puede indicar que la composición se usa para tratar la enfermedad o afección que expresa o asocia CD19. El artículo de fabricación puede incluir (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición incluye el anticuerpo o receptor de antígeno modificado por ingeniería genética; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición incluye un agente adicional, tal como un agente citotóxico o terapéutico. El artículo de fabricación puede incluir además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede incluir además otro o el mismo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable. Además, puede incluir otros materiales tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y/o jeringas.

[0353] Como se usa en el presente documento, la referencia a una "forma correspondiente" de un medio de anticuerpos significa que, al comparar una propiedad o actividad de dos anticuerpos, la propiedad se compara mediante la misma forma de anticuerpo. Por ejemplo, si se establece que un anticuerpo tiene mayor actividad en comparación con la actividad de la forma correspondiente de un primer anticuerpo, eso significa que una forma particular, como un scFv de ese anticuerpo, tiene mayor actividad en comparación con la forma scFv del primer anticuerpo.

[0354] Como se usa en el presente documento, la mención de que las posiciones de nucleótidos o aminoácidos "corresponden a" nucleótidos o posiciones de aminoácidos en una secuencia descrita, tal como se establece en el listado de secuencias, se refiere a nucleótidos o posiciones de aminoácidos identificadas tras la alineación con la secuencia descrita. secuencia para maximizar la identidad utilizando un algoritmo de alineación estándar, como el algoritmo GAP. Por ejemplo, en algunos casos, los residuos correspondientes ejemplares de una proteína CD19, tal como una proteína CD19 humana, pueden identificarse mediante el alineamiento de una secuencia con una secuencia Vpx ejemplar expuesta en SEQ ID NO: 92. Al alinear las secuencias, un experto en la técnica puede identificar los residuos correspondientes, p. ej., usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las secuencias de aminoácidos se alinean de modo que se obtenga la coincidencia de orden más alto (ver, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM, y Griffin, HG, eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).

[0355] "Funciones efectoras" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión de C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B); y activación de células B.

[0356] El término "región Fc" en el presente documento se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. En un caso, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración UE, también llamado índice UE, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D, 1991.

[0357] Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan aquí de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativa o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en este documento.

[0358] Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos casos, un anticuerpo se purifica a más del 95% o 99% de pureza según lo determinado, p. ej., mediante electroforesis (p. ej., SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficas (p. ej., Intercambio iónico o fase HPLC). Para una revisión de los métodos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, p. ej., Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79 - 87 (2007).

[0359] Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

[0360] "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CD 19" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula huésped.

[0361] Los términos "célula huésped", "línea de célula huésped", y "cultivo de células huésped" se usan indistintamente y se refieren a las células en que se ha introducido el ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones. Se incluye aquí la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula originalmente transformada.

[0362] Como se usa en este documento, "porcentaje (%) de identidad de secuencia aminoacídica" y "porcentaje de identidad", cuando se usan con respecto a una secuencia de aminoácidos (secuencia de polipéptido de referencia) se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata (ej., el anticuerpo o fragmento sujeto) que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje de máxima identidad de secuencia, y no considerar sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, p. ej., usando software de computadora disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

[0363] Una sustitución de aminoácidos puede incluir la sustitución de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido. Las sustituciones ejemplares se muestran en la Tabla 1. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en una molécula de unión, p. ej., un anticuerpo, de interés y los productos se seleccionan para una actividad deseada, p. ej., unión de antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorada.

[0364] Los aminoácidos generalmente pueden ser agrupados de acuerdo a las siguientes propiedades de cadena lateral común:

(1) hidrófobo: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácido: Asp, Glu;

(4) básico: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[0365] Las sustituciones de aminoácidos no conservadores implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

[0366] El término "vector", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

[0367] El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, la terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de tales productos terapéuticos.

[0368] Como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en este documento incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y variaciones.

[0369] A lo largo de esta descripción, varios aspectos del tema reivindicado se presentan en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en el formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance del objeto reivindicado. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles así como valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese rango y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese rango establecido es abarcado dentro del objeto reivindicado. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse independientemente en los rangos más pequeños, y también se engloban dentro del objeto reivindicado, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en el tema reivindicado. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

[0370] El término "aproximadamente" tal como se utiliza aquí se refiere a la gama de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido para la persona experta en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en este documento incluye (y describe) instancias que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

[0371] Como se usa en este documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.

[0372] Como se usa en este documento, una declaración de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, p. ej., mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectar dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable mediante citometría de flujo en un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones idénticas y/o en un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o en un nivel sustancialmente más alto que el para una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

[0373] Como se usa en este documento, una declaración de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia detectable sustancial sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, p. ej., mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectar dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o en un nivel sustancialmente más bajo que el de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o en un nivel sustancialmente similar en comparación con la de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

[0374] A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos técnicos y científicos o terminología usada en el presente documento están destinados a tener el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para mayor claridad y/o para una referencia rápida, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que se entiende generalmente en la técnica.

[0375] Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben considerarse como limitativos de la materia descrita.

V. EJEMPLOS

[0376] Los siguientes ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Generación y evaluación de anticuerpos anti-CD19

[0377] Se generaron y evaluaron anticuerpos anti-CD 19 ejemplares que se unen específicamente a células que expresan CD19 con propiedades de unión similares a los anticuerpos de referencia anti-CD 19 murinos, y/o compiten por la unión con anticuerpos anti-CD 19 de referencia murinos.

1A. Selección de la biblioteca, generación de anticuerpos

[0378] Los ejemplos de anticuerpos anti-CD19 (scFv) se generan a través de una serie de pasos de selección llevados a cabo en bibliotecas de anticuerpos ingenuos humanos codificados por dsADN mostrados en un sistema libre de células. Los miembros de una biblioteca Vh se seleccionaron para unirse a células vivas a través de tres rondas sucesivas, enriqueciendo los miembros que se unen específicamente a células HEK293 que expresan CD19 transfectadas de manera estable, pero no a células HEK293 parentales y/o a células CHOK1 que no expresan CD19. Al final de cada ronda de selección, se generaron tres grupos de elución separados mediante (a) separación de la superficie para recuperar los aglutinantes de las células diana, (b) elución competitiva usando un anticuerpo anti-CD19 murino, FMC63 IgG, y (c) elución competitiva usando otro anticuerpo anti-CD19 murino, SJ25C1 ((b) y (c) se llevaron a cabo para enriquecer los ligantes que compiten con FMC63 y/o SJ25C1 por unirse a CD19).

[0379] Al final de las 3 rondas de selecciones, estas bibliotecas Vh enriquecidas se conviertieron después en las bibliotecas de scFv por revolver miembros Vh de estos respectivos grupos y una biblioteca humana Vl ingenua en formato Vh-(G4S)3-Vl . Las bibliotecas de scFv resultantes se sometieron a una cuarta ronda, enriqueciendo los miembros que se unían específicamente a las células HEK293 que expresan CD19 y no a las células parentales, seguido de extracción superficial.

[0380] Una quinta ronda se llevó a cabo para enriquecer aún más para los miembros que se unieron a otras células que expresan CD19 (CD19/K562). Las selecciones fueron seguidas por la generación de mezclas de elución separadas usando (a) separación de superficie, (b) elución competitiva FMC63 o (c) elución competitiva SJ25C1. En una sexta ronda, estos tres grupos se enriquecieron individualmente mediante la selección negativa de los miembros que no se unieron a las células parentales (HEK293, dos veces, K562), seguida de una selección positiva de los miembros que se unieron a las células HEK293 que expresan CD19 y la inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-Myc que reconoció una etiqueta C-terminal en CD19 expresada en células HEK293.

[0381] En un estudio, cuarenta y ocho (48) clones de cada uno de los tres grupos resultantes R6 scFv fueron secuenciados utilizando cebadores directo e inverso para determinar secuencias de aminoácidos. 130 de las secuencias de scFv determinadas mostraron una lectura de longitud completa. Se observó convergencia entre las secuencias. Se identificaron dieciocho (18) réplicas entre las 130 secuencias scFv (que representan cuarenta y seis (46) de los 130 clones). En este estudio, una secuencia de porción de Vh que contiene CDR 1-3 y FR 1-3 se detectó catorce (14) veces en dos de los diferentes grupos (10 copias de una y 4 copias de otra), emparejados con 5 Vls diferentes. Otras réplicas se identificaron entre 2 y 5 veces en diferentes grupos; otras eran secuencias de una sola copia. En otro estudio, se identificaron y secuenciaron clones de unión a CD19 adicionales. La misma porción Vh apareció entre ellos, con diferentes secuencias Vl .

1B. La unión específica a células que expresan CD19

[0382] La unión de los clones secuenciados a células que expresan CD19 y células de contro1HEK293, en comparación con células que no expresan CD19, se evaluó por citometría de flujo, ya sea con lisado celular crudo traducido in vitro o con sobrenadante producido por baterias. Brevemente, el ARN de cada clon se normalizó y se tradujo in vitro como scFv crudo con una etiqueta FLAG C-terminal. En el ensayo se utilizaron células HEK293 que expresaban CD19 y células HEK293 de control (transfectadas de forma simulada). La unión de los scFv individuales a CD19 y células de control se midió con un conjugado secundario anti-FLAG-Alexa647. Alternativamente, los conjuntos de unión de scFv se clonaron en vectores de expresión de E. co liy se produjeron como scFv marcados con HIS que se detectaron con el conjugado anti-HIS-Alexa647 en ensayos de citometría de flujo. Se usaron anticuerpos murinos anti-CD19 (FMC63 scFv y FMC63 IgG) como controles positivos; también se utilizó un scFv de control. La intensidad de fluorescencia media (IFM) se evaluó mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en las Figuras 1A y 1B, que demuestran la unión de clones identificados a células que expresan CD19. Entre los clones evaluados se encontraban scFv, incluidos los clones 5, 17, 18 (identificados con lisados traducidos in vitro) y 76 (identificados con sobrenadante bacterianos), que mostraban una clara preferencia de unión por células que expresan CD19 en comparación con células negativas para CD19.

[0383] Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, para algunos clones, la unión detecta el cambio de fold en el grado de unión, en este caso tal como se mide por la intensidad de fluorescencia media, a las células que expresan CD19 en comparación con las células que no expresan CD 19, fue aproximadamente tan grande, al menos tan grande o mayor que el cambio de fold observado para los anticuerpos de referencia de control positivo, anticuerpos murinos anti-CD19 FMC63 scFv y/o FMC63 IgG. En algunos casos, el grado total de unión observada a las células que expresan CD19 fue aproximadamente el mismo, al menos tan grande o mayor que el observado para uno o más de los anticuerpos de referencia de control positivo.

[0384] Se analizaron más a fondo cuatro (4) clones scFv que mostraban una clara preferencia de unión por las células que expresan CD19 en comparación con las células que no expresan CD19 ("clon 18", "clon 17", "clon 5" y "clon 76").. La secuenciación reveló que los clones compartían secuencias CDR comunes dentro de sus secuencias Vh, con diferentes secuencias Vl y diferentes CDR-L. Los identificadores de secuencia correspondientes a las secuencias, que incluyen secuencias de aminoácidos ejemplares de scFv, Vh, Vl y CDR (Kabat) y secuencias de nucleótidos que codifican scFv, para los cuatro clones se enumeran en la Tabla 2. Una variante de la línea germinal del clon 18 (considerado "clon 18B ") se generó mediante una sustitución de cisteína (C) por serina(s) en la posición 89 de Kabat; las secuencias de este clon también se enumeran en la Tabla 2. Cada uno de los clones tenía una secuencia de cadena Vh3. El clon 18 incluía una estructura de cadena ligera derivada de una secuencia VA2 (teniendo el clon 18B la secuencia de estructura de la línea germinal VA2); los clones 17 y 76 tenían secuencias VA1 y el clon 5 incluía una secuencia VA3. Los clones 18 y 17 se obtuvieron de múltiples ramas y bibliotecas, incluida la mezcla de Vh-Vl y scFv. El clon 76 se derivó de la elución competitiva Vh-Vl SJ25C1 (Ronda 6); el clon 5 se derivó de la elución competitiva Vh-Vl FMC63 (Ronda 6).

1C. Afinidades de unión, competencia con los anticuerpos de referencia

[0385] Los clones 5, 17, 18, 18B, y 76, se purificaron mediante purificación de una sola etapa y la purificación evaluada mediante gel SDS. En la Figura 2 se muestra un gel de un estudio ejemplar (carriles 1 y 2 = clon 5, no reducido, reducido; carriles 3 y 4 = clon 17, no reducido, reducido; carriles 5 y 6 = clon 18, no reducido y reducido; carriles 7 y 8 = clon 76, no reducido y reducido). En este estudio, los puntos isoeléctricos se midieron como 5,36, 5,32, 7,11, y 5,32, respectivamente para los clones 5, 17, 18, y 76.

[0386] Las mediciones de emperatura de fusión (Tm) se realizaron usando un instrumento BioTad CFX96 para analizar la incorporación de proteína de sypro naranja a temperaturas incrementales, revelando valores Tm similares a los observados para el anticuerpo de referencia FMC63 scFv. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

[0387] Los clones se titularon, y se evaluaron sus afinidades de unión (CE50) a células K562 que expresaban CD19 evaluadas por citometría de flujo, con un anticuerpo CD19 murino de referencia, FMC63 scFv, utilizado como control positivo. Resultados de tres ensayos separados, cada uno de los cuales incluye y compara otras afinidades de unión con las del clon 18, se muestran en las Figuras 3A-3C.

[0388] En el ensayo, cuyos resultados se muestran en la Figura 3A, se midieron como 3,79 nM, 14,86 nM, 12,80 nM y 7,37 nM, respectivamente, los valores CE50 para el clon 18, clon 17, otro clon identificado por el estudio (clon 192; ver secuencias de la Tabla 6), y el anticuerpo de referencia (FMC63 scFv). En el ensayo, cuyos resultados se muestran en la Figura 3B, los valores CE50 para el clon 18, clon 18B, y el clon 76 se midieron como 7,1 nM y 9,3 nM, y 7,9 nM, respectivamente. En el ensayo de los resultados de los que se muestran en la Figura 3C, los valores CE50 para el clon 18 y el clon 76 se midieron como 4,1 nM y 8,8 nM respectivamente.

[0389] Por tanto, cada uno de los clones ensayados se unió específicamente a las células que expresan CD19 con afinidades similares a las del anticuerpo de referencia, p. ej., teniendo CE50 aproximadamente igual o inferior a la del anticuerpo de referencia, o no más de aproximadamente 1,5 veces o no más de aproximadamente 2 veces, o no más de aproximadamente mayor de 3 veces que la CE50 de la referencia de anticuerpo.

[0390] En otro ensayo, los clones 18, 5, 17, otros clones identificados (161, 170, 1 (ver información de secuencia en la Tabla 6)), y el anticuerpo de referencia de control positivo FMC63 scFv (una placa) y el clon 18, otros clones identificados (177, 184, 192, 198) y el anticuerpo de referencia de control positivo FMC63 scFv (otra placa) se evaluaron mediante el mismo ensayo. Los resultados se presentan en la Figura 4. Los valores CE50 observados para las dos placas se presentan en las Tablas 4A y 4B. Como se muestra, se observó que los clones tenían afinidades de unión comparables con las del anticuerpo de referencia.

[0391] Se llevaron a cabo ensayos de competición de unión para evaluar la competencia de diversos anticuerpos por la unión a células que expresan CD19. En un ensayo, la unión de 0,5 nM (~ CE50) SJ25C1 marcado con FITC a las células Ramos se evaluó en la presencia o ausencia de diversas concentraciones de competidor FMC63 IgG no conjugado o un control de IgG; la unión se evaluó mediante citometría de flujo (intensidad media de fluorescencia). Los resultados se muestran en la Figura 5A, lo que indica que FMC63 IgG compitió por la unión a CD19 con SJ25C1 IgG1 en este estudio, lo que sugiere que SJ25C1 y FMC63 se unieron a epítopos superpuestos, p. ej., un epítopo común, de CD19. En otro ensayo, se incubaron células que expresaban CD19 con IgG FMC63 marcada en presencia de diversas concentraciones de (o ausencia de) scFv del clon 18, scFv de FMC63 (control positivo) y un scFv de control (control negativo). Los resultados se muestran en la Figura 5B. Como se muestra, tanto el clon 18 scFv y FMC63 scFv (pero no el scFv control negativo) se observaron para competir con el FMC63 IgG para la unión a células que expresan CD19, con valores CI50 comparables (24,0 nM y 19,8 nM, respectivamente), indicando que el clon 18 se unió a un epítopo de CD19 que se solapa con el epítopo reconocido por FMC63, y compitió por unirse con el anticuerpo de referencia en un grado similar.

[0392] En otro ensayo, 10 nM (CE50 marcado con Alexa647) FMC63 scFv se incubó con células que expresaban CD19-K562 en presencia o ausencia de concentraciones variables de clon 18 scFv, clon 18B scFv, clon 17 scFv, clon 76 scFv, un anticuerpo de referencia (FMC63 scFv) y un anticuerpo de control negativo (R12). Los resultados se presentan en la Figura 6. Los clones y el anticuerpo de referencia, pero no el anticuerpo de control negativo, mostraron competencia por la unión a CD19 con el scFv FMC63, y la competencia por el anticuerpo de referencia consigo mismo fue similar a la competencia observada para los clones probados.

[0393] En conjunto, en una serie de estudios, los siguientes valores CE50 (afinidad de unión) y CI50 (competencia) fueron observados para los diversos clones, que se enumeran en la Tabla 5. Como se muestra, entre los anticuerpos CD19 humanos identificados eran aquellos que tienen grados similares de afinidad de unión por CD19 y grados similares de inhibición competitiva para un anticuerpo de referencia antiCD 19 murino, en comparación con el anticuerpo de referencia en sí mismo, p. ej., aproximadamente igual, menor o no más de 1,5 veces, 2 veces o 3 veces mayor CE50 y/o CI50.

ID. Cromatografía de exclusión por tamaño

[0394] Las propiedades biofísicas del clon 18B se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se calibró una columna HiLoad 16/600 Superdex 200 y se inyectaron proteínas estándar de filtración en gel Bio-Rad de 150-1901 kDa, y se recogieron las fracciones a 1,5 ml/min para generar referencias. Se inyectaron 770 ug de scFv del clon 18B en la columna y se recogió la fracción en las mismas condiciones. Los resultados se muestran en la Figura 7 (Figura 7A = estándar; Figura 7B = Clon 18B). Los resultados para el clon 18B scFv revelaron un solo pico, observándose agregados de gran tamaño mínimos.

Ejemplo 2: Generación y evaluación de anticuerpos adicionales contra la CD19

[0395] Entre los anticuerpos ejemplares adicionales anti-CD19 (fragmentos scFv) que tienen propiedades de unión similares a (y/o que compiten por la unión con) anticuerpos de referencia murinos anti-CD19 se generaron y evaluaron.

2A. Selección de la biblioteca, generación de anticuerpos

[0396] Adicionales ejemplos de anti-CD 19 scFv fueron generados por dos enfoques de selección diferentes, cada uno que implica una serie de pasos de selección llevados a cabo en bibliotecas de anticuerpos humanos codificados por dsADN que se muestran en un sistema libre de células.

[0397] En un enfoque (considerado "injerto de clon 18 CDR3"), una secuencia de CDR3 de cadena pesada (CDR-H3) presente en clones identificados en el Ejemplo 1 (SEQ ID n O: 20, DQGYHYYDSAEHAFDI) se injertó en marcos de biblioteca Vh ingenuos humanos. Los miembros de la biblioteca Vh injertada con CDR3 resultante se barajaron con miembros de una biblioteca Vl humana ingenua para generar una biblioteca scFv como formato Vh-(G4S)3-Vl. La biblioteca scFv resultante se sometió a tres rondas de selección, para enriquecer los miembros que se unían específicamente a las células HEK293 que expresan CD19 y no a las células parentales, seguido de la eliminación de la superficie para la ronda (R1), inmunoprecipitación y fuera de velocidad para la ronda 2 (R2).

[0398] En otro enfoque (considerado "selección guiada por FMC63"), se generaron dos bibliotecas scFv iniciales, respectivamente, (a) barajando miembros de una biblioteca Vh ingenua con la región Vl de FMC63 y (b) barajando miembros de una biblioteca Vl ingenua con la región Vh de FMC63. Después de dos y tres rondas de selección, respectivamente, para enriquecer los miembros de la biblioteca de (a) y (b) para la unión de CD19 con la guía del FMC63 Vh o Vl parental. Las moléculas de unión se eluyeron por separación de la superficie de las células CD19/HEK293 (R1) y elución de FMC63 de las células CD19/K562 (R2 y R3). Se generó una tercera biblioteca scFv mezclando las secuencias Vh de la selección en (a) con las secuencias Vl resultantes de la selección en (b). Se llevaron a cabo tres rondas adicionales de selección en células CD19/HEK293 con separación de superficie (R1), seguidas de células CD19/K562 con elución FMC63 (R2) y células CD19/HEK293 con inmunoprecipitación (R3). La unión de los clones scFv seleccionados a las células que expresan CD19 se confirmó mediante citometría de flujo usando sobrenadante producido por bacterias. Los conjuntos de scFv seleccionados se clonaron en vectores de expresión de E. co liy se produjeron como scFv marcados con HIS. La unión de clones individuales a células HEK293 transfectadas con CD19 se detectó con anti-HIS-Alexa647 conjugado mediante citometría de flujo. El clon 18 o el clon 18B se utilizaron como controles positivos, junto con varios controles negativos. Los resultados se muestran en las Figuras 8A-C (IFM = intensidad media de fluorescencia).

[0399] Los resultados mostrados en la Figura 8D confirman unión específica a CD19 por un veintitrés (23) ejemplar de los accesos (marcados con asteriscos en las Figuras 8A-C, que representan 4 prototipos identificados a través del enfoque de injerto de CDR3 y 19 a través de selección guiada por FMC63). La unión de scFv etiquetados con FLAG traducidos in vitro a células K562 que expresan CD19, en comparación con células K562 de control (transfectadas de forma simulada), se evaluó mediante citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 1. Como se muestra, los clones se unieron específicamente a células que expresan CD19.

[0400] Estos y clones de scFv específicos a CD19 adicionales generados por los enfoques de selección en los Ejemplos 1 y 2 se evaluaron más. La secuenciación reveló varios anticuerpos de unión específicos de CD19 (scFv) con varias secuencias de cadena ligera diferentes y que comparten una secuencia de CDR-H3 común (SEQ ID NO: 20) también presente en los scFv descritos en el Ejemplo 1. Identificadores de secuencia correspondientes a varias secuencias de scFv adicional de unión a CD19 se enumeran en la Tabla 6, que incluye secuencias de aminoácidos de scFv, Vh, Vl y CDR (Kabat) (y las secuencias de nucleótidos que codifican scFv). Entre los clones de scFv específicos de CD19 se encontraban los que tenían varias secuencias de CDR y variables de cadena ligera diferentes, algunas de las cuales tenían CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3 presentes en SEQ ID NO: 11, CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3 que tienen secuencias de SEQ ID NO: 18, 19 y/o 20, y/o CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3 que tienen secuencias de 18, 72 y 20. Cada uno de los clones enumerados en la Tabla 6 se deriva de un marco humano Vh3 (con segmentos V de genes kappa y lambda de los que se derivan los clones).

2B. Purificación y evaluación

[0401] Los clones descritos anteriormente, incluyendo clones enumerados en la Tabla 6 y/o descritos en el Ejemplo 1, se purificaron por purificación de una sola etapa y la purificación evaluada mediante gel SDS. Los resultados se presentan en la Figura 9 (carril 1 = marcador de MW; carriles 2, 9 y 10 = clon 5 (1530, 2880, 1130 pg/mL); carril 3 = clon 18B (660 pg/mL); carriles 4, 11, 12 y 13 = clon 17 (300, 1060, 180, 1440 pg/mL); carril 5 = clon 192B (1580 pg/mL); carriles 6 y 14 = clon 76 (1340, 3220 pg/mL); carril 7 = clon 835 (470 pg/mL); carril 8 = clon 488 (340 pg/mL)). Se hicieron mediciones de temperatura de fusión (T m) como se describe en el Ejemplo 1, revelando valores T m similares como los observados para el anticuerpo de referencia y los clones en el Ejemplo 1 (Tabla 7).

[0402] Varios clones se titularon y su afinidad de unión (CE50) para diversas células que expresan CD19 evaluadas por citometría de flujo. El anticuerpo de referencia FMC63 scFv se utilizó como control positivo. Los resultados de cinco ensayos separados que evalúan las afinidades de unión para diversos clones scFv específicos de CD19 se muestran en las Figuras 10A-10E. Como se muestra, las selecciones dieron como resultado varios clones scFv específicos de CD19 con diversas afinidades de unión y un rango de actividad de unión saturable.

[0403] Se llevaron a cabo ensayos de competición de unión como se describe en el Ejemplo 1 para evaluar la capacidad de diversos anticuerpos identificados (clones scFv) para competir por la unión con un anticuerpo de referencia murino por la unión a células que expresan CD19. En un ejemplo, se incubaron células que expresan CD19 con scFv de FMC63 marcado 10 nM en presencia de diversas concentraciones de los clones de scFv indicados que tienen diferentes secuencias de cadena ligera y comparten una CDR3 de cadena pesada común (o scFv de FMC63 (control positivo)). Los resultados, mostrados en la Figura 11, demostraron que los clones compitieron con FMC63 scFv para la unión a células que expresan CD19, con varios valores CI50. Estudios similares se llevaron a cabo para evaluar las propiedades de otros clones identificados en los enfoques de cribado descritos en los Ejemplos 1 y 2. CE50 (afinidad de unión) y valores CI50 (competencia) observados para diversos anticuerpos de unión a CD19 (scFv) se enumeran en la Tabla 8. Las secuencias de CDR-L3 para los clones 79, 835, 184, 505, 506 y 305 se establecen como SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 120, 121 y respectivamente.

[0404] Entre los anticuerpos CD19 humanos identificados (fragmentos scFv), muchos demostraron grados similares o mayores de afinidad de unión (p. ej., valores de CE50 similares o inferiores) para CD19 en comparación con un anticuerpo de referencia anti-CD 19 murino, FMC63. Muchos también demostraron grados similares o mayores de la competencia (p. ej., valores CI50 similares o inferiores) con un anticuerpo de referencia murino anti-CD19 para CD19 de unión, en comparación con la capacidad del anticuerpo de referencia para competir con sí mismo.

[0405] Por ejemplo, se observaron clones con valores CE50 que eran menos de, aproximadamente iguales a, o no más de o aproximadamente 1,5 veces mayor, mayor de 2 veces, o mayor de 3 veces que los del anticuerpo de referencia. Asimismo, se observó que varios de los anticuerpos anti-CD19 identificados (scFv) compiten con el scFv FMC63 marcado por la unión a células que expresan CD19 con valores de CI50 que eran inferiores a los valores de CI50 observados para scFv de FMC63, aproximadamente los mismos que los valores de CI50 observados para FMC63, o no más de 1,5 veces o 2 veces o 3 veces más altos (p. ej., un grado de competencia que no es más de 1,5 veces o 2 veces o 3 veces más bajo que la competencia por el anticuerpo de referencia). Los resultados indicaron que estos estudios identificaron una pluralidad de anticuerpos que se unen a un epítopo de CD19 que se solapa con el epítopo unido específicamente por FMC63.

Ejemplo 3: Generación de receptores de antígeno quiméricos (CARs) contra CD19 e ingeniería de células que expresan tales CARs

[0406] Se generaron varios receptores de antígenos quiméricos ejemplares (CAR), con regiones de unión a antígenos que contienen anti-CD 19 scFv humano como se describe en el Ejemplo 1. Específicamente, se generaron moléculas de ácido nucleico que codificaban CAR con scFv (en el formato VH-VL) derivadas de los siguientes clones y que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en los identificadores de secuencia indicados: Clon 18 (SEQ ID NO: 2), Clon 18B (SEQ ID NO: 4), Clon 17 (SEQ ID NO: 6), Clon 76 (SEQ ID NO: 8) y Clon 5 (SEQ ID NO: 10). Además, para cada clon, también se generaron construcciones que codifican un CAR que tiene las mismas secuencias VH y VL, pero presentes en la orientación inversa (VL-VH). Se usó como control un CAR que contenía un scFv anti-CD19 murino derivado de FMC63 (en la orientación VH-VL). Cada CAR contenía además un espaciador derivado de Ig; un dominio transmembrana derivado de CD28 humano; un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB humano; y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta humano, una secuencia de EGFR truncada (EGFRt), para su uso como marcador de transducción, separada de la secuencia CAR por una secuencia de T2A autoescindible.

[0407] Se generaron poblaciones de células T humanas primarias que expresan los diversos CARs. Las moléculas de ácido nucleico que codifican cada CAR se clonaron individualmente en un vector lentiviral, que se utilizó para transducir células T CD4+ y CD8+ en poblaciones aisladas de muestras de PBMC humanas obtenidas de donantes sanos (esencialmente como se describe por Yam et al. (2002) Mol. Ther 5: 479; WO2015/095895).

[0408] Después de la transducción y la expansión, la tinción con anticuerpo anti-EGFR se utilizó para verificar la expresión del marcador de transducción de EGFRt en la superficie de las células T CD4+ y CD8+ por citometría de flujo. La Figura 12A proporciona resultados representativos para la expresión de los diversos CAR en células CD8+; se observaron resultados similares para las células CD4+. La expresión de la proteína CAR se confirmó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-CD247 (CD3 zeta) (que en cada caso detectó una banda de aproximadamente 50 kD, que representa el CAR, y una banda de aproximadamente 18 kDa, que representa la cadena zeta de CD3 endógena presente en las células) (Figura 12B). Los resultados demostraron grados comparables de transducción y expresión de la proteína CAR para cada una de las diversas construcciones CAR que contienen scFv humano (incluidas las orientaciones VH-VL y VL-VH) y construcciones CAR de control (murinas, derivadas de FMC63) en poblaciones primarias de células T. No se detectó expresión de EGFRt en células no sometidas a transducción. Los resultados de la transferencia Western confirmaron que el CAR derivado del clon 76, en la orientación VH-VL, estaba presente en diferentes formas de glicosilación.

[0409] Como se muestra en la Figura 12A, poblaciones de células T fueron enriquecidas con éxito para las células transducidas (en o cerca de 100 % EGFRt+ como se confirma por citometría de flujo) por tinción con un anticuerpo anti-EGFR, la clasificación en un citómetro de flujo, y la estimulación en la presencia de células irradiadas (8.000 rad) de una línea de células linfoblastoides B CD19+ (B-LCL) esencialmente como se describe por Yam et al. (2002) Mol. Ther. 5:479; WO2015/095895.

Ejemplo 4: Evaluación de las funciones efectoras de las células T diseñadas para expresar el receptor de antígeno quimérico anti-CD19 (CAR) in vitro

[0410] Células T humanas modificadas genéticamente (CD8+ o CD4+) que expresan varios CAR que contienen scFv antiCD19 humanos, producidas como se describe en el Ejemplo 3, se evaluaron para diversas respuestas después de cocultivo con células que expresan CD19.

A. Actividad citolítica

[0411] Se incubaron células diana que expresan CD19 con células T CD8+ que expresan los diversos CAR y por separado con células transducidas con EGFRt solo (control negativo). Después de la incubación, se controló la lisis de las células diana. Específicamente, lisis de células K562 transducidas por CD19 (K562/CD19), células Raji (línea de linfoma de células B CD19+) y células de control K562 no transducidas (control negativo) (Figura 13A) y fueron probadas células de leucemia linfocítica crónica humana primaria (LLC; Figura 13B).

[0412] Las células diana (K562/CD19 Raji células de control no transducidas K562 o CLL) se marcaron durante la noche con 51Cr. Las células marcadas se lavaron y se incubaron por triplicado con células T efectoras (células CD8+ de control negativo y que expresan CAR) a una relación de efector a diana (E:T) de 30:1. Para medir la lisis espontánea, las células diana se incubaron con un volumen igual de medio pero sin células efectoras y se determinó la lisis máxima después de la incubación de las células diana con detergente para lisar completamente las células diana. Los sobrenadantes se recogieron para el recuento y después de una incubación de 4 horas. El porcentaje de lisis específica para las condiciones experimentales se calculó como:

[(Liberación experimental - liberación espontánea)/ (liberación máxima - liberación espontánea)] x 100.

[0413] Los resultados se muestran en la Figura 13A y 13B. Como se muestra en la Figura 13A, las células T CD8+ modificadas genéticamente que expresan los diversos CAR que contienen scFv anti-CD 19 humanos mostraron actividad citolítica específica de antígeno contra las células CD19+, en un grado comparable a las células que expresan CAR que contienen el scFv anti-CD19 murino (FMC63). Esta actividad citotóxica no se observó frente a células K562 de control que no expresaban CD19. Se observó que el grado de actividad citolítica observado para las células que expresan CAR con los scFv humanos en la orientación VH-VL (HL) era comparable o mayor que el observado para las células que expresan el CAR que contiene scFv murino. El grado de actividad citolítica observado para las células que expresan un CAR con un scFv humano dado en la orientación VH-VL (HL) fue generalmente mayor que el observado para las células que expresan un CAR con el scFv correspondiente en la orientación VL-VH inversa (LH). Como se muestra en la Figura 13B, los resultados también demostraron actividad citolítica específica de antígeno contra las células CLL humanas primarias por las células CD8+ manipuladas que expresan los diversos CAR que contienen scFv anti-CD19 humanos (orientación VH-VL).

B. Liberación de citoquinas

[0414] La liberación de citoquinas se evaluó después de la incubación de las células que expresan CAR con células que expresan el antígeno y diana de control. Se cultivaron conjuntamente células T CD8+ y CD4+ transducidas por triplicado con células diana (K562, K562/CD19, Raji) en una relación de efector a diana (E:T) de 2:1. También se ensayó de manera similar la secreción de citocinas después del cocultivo de células CD8+ transducidas con células de leucemia linfocítica crónica (CLL) humana primaria. Las células cocultivadas se incubaron durante aproximadamente 24 horas, y luego se recogieron los sobrenadantes para la medición de IFN-y (células CD8+) o IFN-Y, TNF-a o IL-2 (células CD4+) utilizando un inmunoensayo de citocinas multiplex (Luminex®).

[0415] Los resultados para las células CD8+ se exponen en las Figuras 14A y 14B. Se observó que las células T CD8+ manipuladas que expresan los diversos CAR que contienen scFv anti-CD19 humano secretan IFN-y de una manera específica de antígeno después de la incubación con células CD19+, en un grado comparable al observado para las células que expresan CAR que contienen el anti-CD19 (FMC63) scFv. La secreción de citoquinas no se observó después de la incubación de células K562 de control que no expresaban CD19. Los niveles de secreción de citocinas observados para células que expresan CAR con los scFv anti-CD19 humanos probados en la orientación VH-VL fueron comparables y en algunos casos mayores que los observados para las células que expresan el CAR que contiene scFv anti-CD19 murino. El grado de secreción de IFNy observado para las células que expresan un CAR con un scFv humano dado en la orientación VH-VL fue generalmente mayor que el observado para las células que expresan un CAR con el scFv correspondiente en la orientación inversa (VL-VH). Como se muestra en la Figura 14B, también se observó la secreción de citocinas específicas de antígeno por células T modificadas CD8+ que expresan los diversos CAR que contienen scFv anti-CD19 humanos (orientación VH-VL) después de cocultivo con las células CLL.

[0416] Los resultados para las células T CD4+ que expresan CAR se exponen en la Figura 15. Las células T CD4+ modificadas que expresan los diversos CAR humanos anti-CD19 que contienen scFv (orientación VH-VL) se observaron a las citoquinas secretadas por un antígeno específico de manera posterior a la incubación con células diana CD19+, a niveles comparables y, en general, superiores a los observados para las células que expresan el CAR que contiene scFv murino (FMC63). No se observó secreción de citocinas después de las células de control negativas para CD19.

C. Proliferación de células T

[0417] La proliferación de las diversas células T que expresan CAR después de la incubación con las células diana que expresan CD19 fue evaluada por citometría de flujo. Células T CD8+ o CD4+ que expresan CAR se marcaron con 0,2 pM de éster de succinmidilo de carboxifluoresceína (CFSE). Las células se lavaron e incubaron durante 72 horas por triplicado con células diana (K562, K562/CD19 o Raji) en medio que contenía suero sin citocinas exógenas. La división de las células T vivas se indicó mediante dilución de CFSE, según se evaluó mediante citometría de flujo.

[0418] Los resultados se exponen en la Figura 16A y 16B para células T que expresan CAR CD8+ y células T que expresan CAR CD4+, respectivamente. Como se muestra en la Figura 16A, las células T CD8+ que expresan cada una de las construcciones CAR que contienen scFv anti-CD 19 humano ensayadas proliferaron después de cocultivo con células diana K562/CD19 o Raji que expresan CD19, pero generalmente no con células de control K562. El grado de proliferación observado para las células T que expresan CAR con el scFv anti-CD 19 humano probado fue comparable al observado para las células que expresan el CAR que contiene scFv anti-CD19 murino. Se observó generalmente que el grado de proliferación de células que expresan un CAR con un scFv humano dado en la orientación VH-VL era mayor que el observado para las células que expresan un CAR con el correspondiente scFv en la orientación inversa (VL-VH).

[0419] La proliferación específica de antígeno de las células T que expresan CAR también se observó para las células CD4+. Como se muestra en la Figura 16B, las células T CD4+ que expresan cada una de las construcciones CAR que contienen scFv anti-CD19 humano ensayadas proliferaron después del cocultivo con células diana K562/CD19 o Raji que expresan CD19. El grado de proliferación observado para las células T CD4+ que expresan CAR con el scFv anti-CD19 humano probado fue comparable al observado para las células que expresan el scFv anti-CD19 murino que contiene CAR.

Ejemplo 5: Efecto antitumoral de células T que expresan CAR después de la transferencia adoptiva in vivo

[0420] Se evaluaron los efectos antitumorales de las células T humanas primarias manipuladas que expresan CAR controlando los tumores después de la transferencia adoptiva de células a sujetos animales de modelo de tumor de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Ratones hembra de seis a ocho semanas de edad NOD.Cg.PrkdcscidIL2RGtmrw1|/SZJ (NSG) se inyectaron por vía intravenosa (iv) con 0,5 x 106 Raji células tumorales del linfoma transfectadas con luciferasa de luciérnaga (Raji-ffluc). Se dejó que ocurriera el injerto del tumor durante 6 días y se verificó usando imágenes de bioluminiscencia. En el día 7, los ratones recibieron una única inyección (i.v.) intravenosa de una dosis sub-óptima (1 x 106 células T de expresión de CAR en este estudio) de las diversas células T primarias humanas manipuladas genéticamente (células CD8+ solas (Figura 17A) o células CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1 (Figura 17B)) descritas en el Ejemplo 3. Como control, se administraron a los ratones células que se transdujeron con EGFRt solo (control negativo). Se utilizó la dosis subóptima para visualizar mejor las diferencias en los efectos antitumorales.

[0421] La actividad anti-tumoral de las células que expresan CAR transferidas de manera adoptiva se controló por imágenes de bioluminiscencia en los días 6, 9, 13, 20 27 y 34. Para imágenes de bioluminiscencia, los ratones recibieron vía intraperitoneal (i.p.) del sustrato de luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) resuspendido en PBS (15 pg/g de peso corporal). Los ratones se anestesiaron y se obtuvieron imágenes esencialmente como se describe en el documento WO2015/095895. Se determinó la luminosidad media (p/s/cm2/sr).

[0422] Como se muestra en las Figuras 17A y 17B, los tumores en ratones de control continuaron creciendo durante el transcurso del estudio después de la transferencia adoptiva de células T de control (células CD8+ solas (Figura 17A) o combinación de células CD4+ y CD8+ (Figura 17B) transducidas con EGFRt solo). En comparación con los ratones de control, se observó que los ratones a los que se les había administrado transferencia adoptiva de células T manipuladas que expresaban cada uno de los diversos CAR que contienen scFv anti-CD19 probados tenían un grado más bajo de señal de bioluminiscencia, lo que indica una reducción en el tamaño del tumor con el tiempo y/o un menor grado de crecimiento tumoral en los animales tratados. En general, como se muestra en la Figura 17A, la transferencia adoptiva de células T CD8+ que expresan los CARs scFv anti-CD 19 humanos probados solos condujo a una reducción comparativa en el tamaño del tumor al menos en el mismo grado que la transferencia adoptiva de células que expresan un CAR que contiene el scFv anti-CD19 de ratón (FMC63). Como se muestra en la Figura 17B, se observó que la transferencia adoptiva de la combinación de células T CD8+ y CD4+ que expresan las CAR anti-CD19 humanas probadas reduce el tamaño del tumor con el tiempo. Se observó que el tamaño del tumor (indicado por la señal de bioluminiscencia) después de la transferencia adoptiva de tales células humanas que expresan CAR anti-CD19 era comparativamente menor que el detectado después de la transferencia adoptiva de las células que expresan CAR derivadas de scFv de ratón.

EJEMPLO 6: Identificación de la región en CD19 humana reconocida por anticuerpos anti-CD19

[0423] Se evaluaron los CAR que contenían ciertos anticuerpos anti-CD19 (scFv) descritos en el Ejemplo 1, o el scFv anti-CD19 murino (FMC63), para determinar la unión a varias moléculas CD19. Las células K562 se diseñaron para expresar (a) un CD19 humano (que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 92), (b) un CD19 de Macaca mulatta (macaco rhesus (rhesus)) (que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 139; número de acceso F7F486), o (c) una de las tres moléculas CD19 quiméricas humanas/rhesus diferentes, V1, V2 y V3, que contenían regiones proximales a la membrana que tenían las secuencias representadas en la Figura 18A. Aparte de la región representada en la Figura 18A, las regiones restantes de cada molécula quimérica eran idénticas en secuencia a las regiones correspondientes del rhesus CD19.

[0424] CD19 V1 quimérico: La región proximal a la membrana de 74 aminoácidos representada en la Figura 18A de la molécula quimérica designada V1 tenía la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 140, que era idéntica a la secuencia de la región correspondiente. (residuos 218 a 291) de la molécula de CD19 humana que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 92.

[0425] CD19 quimérico V2: La región próxima a la membrana de 75 aminoácidos representada en la Figura 18A de la molécula de CD19 quimérica designada V2 tenía la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 141. Dentro de esta región, la porción próxima a la membrana de 27 aminoácidos era idéntica en secuencia a la porción correspondiente (residuos 265 a 291) de CD19 humana. La porción restante de la región mostrada era idéntica en secuencia a la porción correspondiente de la secuencia de CD19 rhesus expuesta en SEQ ID NO: 139. Las posiciones en esta porción restante que tiene una sustitución o una inserción en comparación con la secuencia humana correspondiente están subrayadas.

[0426] CD19 V3 quimérico: La región de 74 aminoácidos representada en la Figura 18A de la molécula de CD19 quimérica designada V3 tenía la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 142. Dentro de esta región representada, se incluyó una porción de 47 aminoácidos. idéntica en secuencia a la porción correspondiente (residuos 218-264) de la secuencia de CD19 humana establecida en SEQ ID NO: 92. La porción restante de 27 aminoácidos proximal a la membrana era idéntica en secuencia a la porción correspondiente del conjunto de secuencias de CD19 rhesus en SEQ ID NO: 139. Las posiciones en esta porción restante de 27 aminoácidos que tiene una sustitución en comparación con la secuencia humana correspondiente están subrayadas.

[0427] Las células T humanas primarias que expresan varios CARs humanos que contienen anti-CD19 scFv o un CAR que contiene anti-CD19 scFv (FMC63) murino se generaron tal como se describe en el Ejemplo 3 y se co-cultivaron con las diversas células diana K562 transfectadas con moléculas de ácido nucleico que codifican las diversas moléculas de CD19, en una relación de efector a diana (E:T) de 2:1. Las células se incubaron durante 24 horas y se recogieron los sobrenadantes para la medición de IFN-y , utilizando un inmunoensayo de citocinas, como indicador de la unión funcional de los CAR que contienen scFv anti-CD 19 a las moléculas de CD19 respectivas en la superficie de las células diana. Los resultados se muestran en la Figura 18B.

[0428] Cada uno de los CARs anti CD19 probados exhibieron niveles detectables de citocinas después de co-cultivo con células que expresan la molécula humana CD19 (indicando unión funcional a la misma), pero no después de co cultivo con células que expresan el CD19 rhesus. Para cada uno de los CAR anti-CD19 probados, se observaron niveles detectables de secreción después del cocultivo con células que expresan las moléculas quiméricas rhesus/humanas designadas V1 (derivadas de humanos de la región proximal de 74 aminoácidos a la membrana completa) y V3 (derivadas de rhesus de la porción proximal de 27 aminoácidos a la membrana), pero no a las células que expresan la molécula quimérica humana/rhesus designada V2 (derivadas de humanos de la región proximal de 27 aminoácidos de la membrana).

[0429] Estos resultados indicaron que al menos parte de una porción de 32 aminoácidos (SEQ ID NO: 143 (HPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLP) de la molécula humana CD19 (correspondiente a los residuos 218 249 de SEQ ID NO: 92), fue importante para unión funcional a CD19 por cada uno de los CAR anti-CD19 probados. Específicamente, mientras que cada uno de V1 y V3 contenía esta secuencia de 32 aminoácidos (que se muestra en negrita en la Figura 18A), la porción correspondiente de V2 contenía esta secuencia de aminoácidos de 33 residuos expuesta en SEQ ID NO: 144 (RPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLT), que era idéntica en secuencia a la porción correspondiente de la molécula de rhesus CD19, pero contenía cinco sustituciones de aminoácidos (en las posiciones 218, 236, 242, 243 y 249 de la Secuencia de c D19 de SEQ ID NO: 92) y una inserción (entre las posiciones 223 y 224 de la secuencia de CD19 humana de SEQ ID NO: 92) en comparación con la secuencia humana correspondiente, cada una subrayada en la Figura 18A. Por lo tanto, los resultados indican que los aminoácidos presentan al menos una de estas posiciones en la secuencia humana (posiciones 218, 236, 242, 243, 249 y/o 223 224 de SEQ ID NO: 92) fue importante para la capacidad de cada CAR probado para unirse específicamente al CD19 humano. Por tanto, los resultados apoyan la conclusión de que cada uno de los CAR que contienen scFv humano ensayados se unió a un epítopo similar y/o superpuesto en comparación con el CAR que contiene el scFv de ratón, FMC63.

v ^'o0₌

O

vO '0o3 =3 O

O

v "0o3 =3 O

vO 'o03 =3 O

O

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de unión a CD19 o su fragmento de unión a antígeno de unión a D19 que comprende:

una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; o

una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; o

una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o

una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; o

una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o antígeno su fragmento de unión se une específicamente a CD19 humano.

3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es humano.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es monoclonal.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de cadena sencilla que comprende un scFv.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, en donde el scFv comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o una secuencia que exhibe al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10.

7. Un conjugado, que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una molécula o resto heterólogo.

8. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende una porción extracelular que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un dominio de señalización intracelular, en donde opcionalmente el anticuerpo o fragmento comprende un scFv y el dominio de señalización intracelular comprende un ITAM, en donde opcionalmente el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización de una cadena CD3-zeta (CD3Z).

9. El receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 8, que comprende además un dominio transmembrana que une el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular y/o que comprende además un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora de células T, opcionalmente en donde la molécula coestimuladora de células T se selecciona del grupo que consta de 4-1BB o CD28.

10. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, conjugado de la reivindicación 7 o el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 8 o reivindicación 9.

11. Células modificadas genéticamente que expresan un receptor que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, conjugado de la reivindicación 7 o el receptor antigénico quimérico de la reivindicación 8 o reivindicación 9.

12. Las células modificadas genéticamente de la reivindicación 11, en donde las células modificadas genéticamente son células T, opcionalmente donde las células T son células T CD4+ y/o CD8+.

13. Una composición, que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, conjugado de la reivindicación 7 o el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 8 o la reivindicación 9 o las células de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con CD19, en donde la enfermedad o trastorno es una neoplasia maligna de células B.

15. La composición de la reivindicación 13 para su uso según la reivindicación 14, en la que la neoplasia maligna de células B se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica (LLC) de células B, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemias prolinfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas, leucemias linfoblásticas agudas nulas, linfomas no Hodgkin, linfomas difusos de células B grandes (DLBCL), mielomas múltiples, linfoma folicular, linfoma esplénico de zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolentes y linfoma de Hodgkin.